KR20160111511A - 세포 배양 장치 - Google Patents
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Abstract
간이한 구성을 실현하면서 세포의 배양을 양호하게 행할 수 있는 세포 배양 장치를 제공한다. 세포 배양 장치(5)는, 세포를 포함하는 배양액을 수용하는 배양조(15)와, 배양조(15) 내에 적어도 일부가 배치된 축부재(17)와, 축부재(17)에 지지되어 배양조(15) 내에 배치되고, 축부재(17)를 회전 중심으로 하여 회전 가능하게 설치된 적어도 한쌍의 교반 날개(27)를 갖는 교반 기구(19)와, 축부재(17)에 접하도록 설치되고, 배양조(15)로부터 배양액의 흡인 및/또는 배양조(15)에 대한 배양액의 공급을 행하는 필터(21)를 구비하고, 축부재(17)는, 적어도 일부가 중공이고, 그 내부에 배양액을 도입 또는 내부로부터 배양액을 도출하는 개구부(17a, 17b)가 설치되어 있음과 더불어, 회전 불가능하게 되어 있고, 필터(21) 및 축부재(17)의 내부를 통해, 배양조(15)로부터 배양액의 흡인 및/또는 배양조(15)에 대한 배양액의 공급을 행한다.
Description
본 발명은 세포 배양 장치에 관한 것이다.
최근, 세포 배양 분야, 재생 의료 분야에서는, 세포를 장기간 자동으로 안정적으로 대량 배양하여, 생물 제제 등에 이용 가능한 세포의 생산물이나, 재생 조직 구축에 이용하는 세포 그 자체를 얻기 위한 기술(세포 배양 장치)이 요구되고 있다. 세포를 장기간 안정적으로 배양하기 위해서는, 배양 기간 동안에 배양액을 교환 및/또는 정화 등을 행하여, 필요 성분의 보급이나 불필요 성분의 제거를 해야 하는 경우가 많고, 그 때, 세포의 상태에 영향을 주지 않기 위해, 세포와 배양액을 분리하고, 배양액만을 취출하는 기술이 필요해지고 있다. 그것을 위한 종래의 세포 배양 장치로서, 예컨대 특허문헌 1에 기재된 것이 알려져 있다. 특허문헌 1에 기재된 세포 배양 장치는, 배양액은 투과시키지만 세포는 투과시키지 않는 필터 영역을 적어도 부분적으로 갖는 반상체를 갖고 있다. 이 반상체는, 배양액을 외부로 취출하는 도관을 가지며, 도관과 동축으로 회전 가능하게 설치되어 있다.
세포 배양 장치에서 배양되는 세포로서는, 예컨대 인간 iPS(induced pluripotent stem) 세포가 있다. 인간 iPS 세포는, 세포를 단세포의 상태로 하거나, 높은 전단 응력에 노출시키거나 하면 사멸되기 쉬운 특성을 갖는다. 그 때문에, 인간 iPS 세포를 배양할 때에는, 세포 배양 장치에서는 가능한 한 세포에 전단 응력을 주지 않도록 해야 한다. 상기 특허문헌에 기재된 장치에서는, 배양액을 흡인하는 필터가 교반 수단인 반상체에 장착되어 있다. 그 때문에, 종래의 장치는, 배양액의 흡인을 위한 설비를 별도로 구비하는 구성에 비교해서, 액류를 어지럽히는 장애물이 없기 때문에, 세포에 대한 응력을 경감하는 것에는 유효하다. 그러나, 종래의 장치에서는, 흡인하는 기구와 교반하는 기구가 동시에 회전하는 구성이므로, 회전 기구에 있어서 시일성을 확보하기 위한 구성이 필요해져, 구성이 복잡해진다고 하는 문제가 있다.
본 발명은, 간이한 구성을 실현하면서 세포의 배양을 양호하게 행할 수 있는 세포 배양 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일측면에 따른 세포 배양 장치는, 세포를 포함하는 배양액을 수용하는 배양조와, 배양조 내에 적어도 일부가 배치된 축부재와, 축부재에 지지되어 배양조 내에 배치되고, 축부재를 회전 중심으로 하여 회전 가능하게 설치된 교반 날개를 갖는 교반 수단과, 축부재에 접하도록 설치되고, 배양액은 투과시키지만 세포는 투과시키지 않는 필터를 구비하고, 축부재는, 적어도 일부가 중공이고, 그 내부에 배양액을 도입 또는 내부로부터 배양액을 도출하는 개구부가 설치되어 있음과 더불어, 회전 불가능하게 되어 있고, 필터는, 축부재를 회전 중심으로 하여 회전하는 교반 날개의 가동 영역보다 내측에 위치하고, 교반 날개와는 독립적으로 축부재에 설치되어 있고, 필터 및 축부재의 내부를 통해, 배양조로부터 배양액의 흡인 및/또는 배양조에 대한 배양액의 공급을 행한다.
이 세포 배양 장치에서는, 회전 불가능하게 되어 있는 축부재에 필터가 설치되어 있다. 교반 수단의 교반 날개는, 축부재를 회전 중심으로 하여 회전 가능하게 설치되어 있다. 이와 같이, 세포 배양 장치에서는, 교반 날개가 축부재에 대하여 회전하고, 축부재 및 필터는 회전하지 않는다. 따라서, 세포 배양 장치에서는, 배양액의 흡인 및/또는 공급을 위한 기구를 회전시키지 않기 때문에, 구성의 간이화를 도모할 수 있다. 또한, 세포 배양 장치에서는, 배양조로부터 배양액의 흡인 및/또는 배양조에 대한 배양액의 공급을 행하는 필터가 교반 날개의 회전 중심인 축부재에 있어서 교반 날개의 가동 영역보다 내측에 위치하여 설치되어 있고, 필터 및 축부재의 내부를 통해, 배양조로부터 배양액의 흡인 및/또는 배양조에 대한 배양액의 공급을 행한다. 그 때문에, 세포 배양 장치에서는, 교반 날개의 회전에 의해 생기는 액류(층류)에 대하여 필터가 흐트러짐을 발생시키는 것이 억제되고, 배양액의 흡인 및/또는 공급에 관해, 세포에 대한 응력의 경감을 도모할 수 있다. 따라서, 세포 배양 장치에서는, 간이한 구성을 실현하면서 세포의 배양을 양호하게 행할 수 있다.
일 실시형태에 있어서는, 축부재는 배양조의 바닥부에 지지되어 있어도 좋다.
일 실시형태에 있어서는, 축부재는, 하단부에 개구부가 설치되어 있음과 더불어, 상단부가 폐색되어 있고, 축부재의 측면부에는, 내부와 연통하는 개구부가 설치되어 있고, 필터는, 측면부의 개구부를 덮도록 축부재의 외표면에 설치되어 있어도 좋다. 이와 같이, 세포 배양 장치에서는, 배양액의 흡인 및/또는 공급의 기구가 축부재에 집약되고, 또한 축부재는 회전하지 않기 때문에, 장치의 간이화를 도모할 수 있다.
일 실시형태에 있어서는, 필터는, 통형상을 이루고 있고, 측면부의 개구부를 덮도록 축부재의 외측에 삽입 관통되어 있어도 좋다. 이 구성에 의하면, 세포 배양 장치에서는, 필터의 표면적(막면적)을 확보할 수 있다.
일 실시형태에 있어서는, 축부재는, 하단부에 개구부가 설치되어 있음과 더불어, 상단부에 내부와 연통하는 개구부가 설치된 통형상을 이루고 있고, 필터는, 상단부의 개구부를 덮도록 축부재에 설치되어 있어도 좋다. 이와 같이, 세포 배양 장치에서는, 배양액의 흡인 및/또는 공급의 기구가 축부재에 집약되고, 또한 축부재는 회전하지 않기 때문에, 장치의 간이화를 도모할 수 있다.
일 실시형태에 있어서는, 필터는, 바닥이 있는 통형상을 이루고 있고, 상단부의 개구부를 덮도록 축부재의 외측에 삽입 관통되어 있어도 좋다. 이 구성에 의하면, 세포 배양 장치에서는, 필터의 표면적(막면적)을 확보할 수 있다.
일 실시형태에 있어서는, 축부재는 배양조의 덮개부에 지지되어 있어도 좋다.
일 실시형태에 있어서는, 축부재는, 상단부에 개구부가 설치되어 있음과 더불어, 하단부에 내부와 연통하는 개구부가 설치된 통형상을 이루고 있고, 필터는, 하단부의 개구부를 덮도록 축부재에 설치되어 있어도 좋다. 이와 같이, 세포 배양 장치에서는, 배양액의 흡인 및/또는 공급의 기구가 축부재에 집약되고, 또한 축부재는 회전하지 않기 때문에, 장치의 간이화를 도모할 수 있다.
일 실시형태에 있어서는, 필터는, 바닥이 있는 통형상을 이루고 있고, 하단부의 개구부를 덮도록 축부재의 외측에 삽입 관통되어 있어도 좋다. 이 구성에 의하면, 세포 배양 장치에서는, 필터의 표면적(막면적)을 확보할 수 있다.
일 실시형태에 있어서는, 축부재는, 상단부에 개구부가 설치되어 있음과 더불어, 하단부가 폐색되어 있고, 축부재의 측면부에는, 내부와 연통하는 개구부가 설치되어 있고, 필터는, 측면부의 개구부를 덮도록 축부재의 외표면에 설치되어 있어도 좋다. 이와 같이, 세포 배양 장치에서는, 배양액의 흡인 및/또는 공급의 기구가 축부재에 집약되고, 또한 축부재는 회전하지 않기 때문에, 장치의 간이화를 도모할 수 있다.
일 실시형태에 있어서는, 필터는, 통형상을 이루고 있고, 측면부의 개구부를 덮도록 축부재의 외측에 삽입 관통되어 있어도 좋다. 이 구성에 의하면, 세포 배양 장치에서는 필터의 표면적(막면적)을 확보할 수 있다.
일 실시형태에 있어서는, 필터는 다공질체여도 좋다.
본 발명에 의하면, 간이한 구성을 실현하면서 세포의 배양을 양호하게 행할 수 있다.
도 1은, 제1 실시형태에 따른 세포 배양 장치를 구비한 세포 배양 시스템을 나타내는 도면이다.
도 2는, 세포 배양 장치를 나타내는 사시도이다.
도 3은, 도 2에 나타내는 배양조의 측면도이다.
도 4는, 도 3에서의 IV-IV선을 따른 단면 구성을 나타내는 도면이다.
도 5는, 세포 배양 장치의 사용 상태를 나타내는 측면도이다.
도 6은, 제1 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 7은, 세포 배양 장치를 구비한 세포 배양 시스템의 다른 형태를 나타내는 도면이다.
도 8은, 세포 배양 장치를 구비한 세포 배양 시스템의 다른 형태를 나타내는 도면이다.
도 9는, 제2 실시형태에 따른 세포 배양 장치의 단면 구성을 나타내는 도면이다.
도 10은, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 11은, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 12는, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 13은, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 14는, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 15는, 실시예 1에 따른 세포 배양 장치를 나타내는 도면이다.
도 16은, 실시예 2에 따른 세포 배양 장치를 나타내는 도면이다.
도 17은, 비교예 1에 따른 세포 배양 장치를 나타내는 도면이다.
도 2는, 세포 배양 장치를 나타내는 사시도이다.
도 3은, 도 2에 나타내는 배양조의 측면도이다.
도 4는, 도 3에서의 IV-IV선을 따른 단면 구성을 나타내는 도면이다.
도 5는, 세포 배양 장치의 사용 상태를 나타내는 측면도이다.
도 6은, 제1 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 7은, 세포 배양 장치를 구비한 세포 배양 시스템의 다른 형태를 나타내는 도면이다.
도 8은, 세포 배양 장치를 구비한 세포 배양 시스템의 다른 형태를 나타내는 도면이다.
도 9는, 제2 실시형태에 따른 세포 배양 장치의 단면 구성을 나타내는 도면이다.
도 10은, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 11은, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 12는, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 13은, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 14는, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다.
도 15는, 실시예 1에 따른 세포 배양 장치를 나타내는 도면이다.
도 16은, 실시예 2에 따른 세포 배양 장치를 나타내는 도면이다.
도 17은, 비교예 1에 따른 세포 배양 장치를 나타내는 도면이다.
이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태에 관해 상세히 설명한다. 또, 도면의 설명에 있어서 동일 또는 상당 요소에는 동일 부호를 붙이고, 중복되는 설명은 생략한다.
[제1 실시형태]
도 1은, 제1 실시형태에 따른 세포 배양 장치를 구비한 세포 배양 시스템을 나타내는 도면이다. 도 1에 나타내는 세포 배양 시스템(1)에서는 세포가 배양된다. 세포는 포유 동물 세포 등의 유용 세포이다. 세포로서는, 배양의 결과, 세포의 생산물을 이용하는 것이라면, 그 물질을 생산하기 쉬운 세포나 목적으로 하는 물질을 생산하기 쉽도록, 특정한 유전자를 도입한 세포도 선택할 수 있다. 또한, 세포로서는, 배양의 결과, 특정한 세포를 이용하는 것이라면, 그 세포가 증식하기 쉬워지도록 유전자를 개변한 세포 등도 이용할 수 있다.
또한, 세포로서는, 그 성숙도에 관해서도 어떠한 제약도 없고, 성숙 세포, 미분화 세포를 이용하는 것이 가능하다. 따라서, 생체 조직으로부터 효소 처리를 하여 채취한 세포, 혈액에서 유래하는 세포, 간엽계 줄기 세포, ES(Embryonic stem) 세포, iPS(induced pluripotent stem) 세포나, 이들 세포로부터 분화 유도시킨 세포 등이 예시된다. 또한, 접착 세포, 부유 세포인 것이나, 배양의 방법에도 한정되지 않는다. 따라서, 부유 배양에서는, 단세포의 부유 배양, 세포 응축 덩어리의 부유 배양, 미소 담체에 세포를 담지하여 하는 부유 배양 등이 예시된다. 또한, 세포는 단일 종류의 세포에도 한정되지 않는다. 목적으로 하는 세포가 생육하기 쉬운 물질을 생산하는 다른 세포를 혼합시켜 공배양하는 것에도 이용될 수 있다.
계속해서, 세포 배양 시스템(1)의 구성에 관해 설명한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 세포 배양 시스템(1)은, 성분 조정액조(3)와, 세포 배양 장치(5)와, 송액 회로(7)를 구비하고 있다. 성분 조정액조(3)와 세포 배양 장치(5)는, 송액 회로(7)에 의해 접속되어 있다. 송액 회로(7)는, 성분 조정액조(3)와 세포 배양 장치(5) 사이에 있어서 후술하는 배양액을 송액한다. 송액 회로(7)는, 2개의 튜브(8, 9)와 송액 펌프(10, 11)를 구비하고 있다. 튜브(8, 9)는, 중공 구조를 갖고 있고, 배양액을 무균적으로 송액하는 것이 가능하게 되어 있다. 튜브(8, 9)는, 예컨대 실리콘, 우레탄, 불소 수지, 폴리염화비닐 등의 재질로 형성되어 있다.
송액 펌프(10, 11)는, 각 튜브(8, 9)의 송액 경로 상에 각각 설치되어 있고, 배양액을 연속적으로 송액 가능한 펌프이다. 송액 펌프(10, 11)로서는, 일반적인 펌프이면 되며, 예컨대 페리스타 펌프, 다이어프램 펌프 등을 예시할 수 있다. 송액 회로(7)는, 송액 펌프(10, 11)의 구동에 의해, 성분 조정액조(3)와 세포 배양 장치(5) 사이에서 튜브(8, 9)를 통해 배양액을 송액한다.
송액 회로(7)의 튜브(8, 9)에는 배양액 성분 조정막(13)이 설치되어 있다. 상세하게는, 배양액 성분 조정막(13)은, 튜브(8)의 일단부와 튜브(9)의 일단부에 접속되어 있고, 성분 조정액조(3) 내에 배치되어 있다. 배양액 성분 조정막(13)은, 배양액 성분의 막투과성이 그 분자량에 의존하는 반투성의 막이다. 배양액 성분 조정막(13)의 구멍 직경은, 세포 배양 장치(5)에 유지하고자 하는 성분의 분자량에 의해 설계된다. 즉, 배양액 성분 조정막(13)은, 세포 배양 장치(5)에 유지하고자 하는 성분 중, 최소 분자량 물질이 막을 투과하지 않도록 선택된다. 배양액 성분 조정막(13)의 형상은, 평막 형상, 중공사 형상을 이용할 수 있지만, 배양액을 반송하는 목적에서는 중공사 형상인 것이 바람직하다. 성분 조정을 효율적으로 행하기 위해, 중공사를 복수개 다발형으로 하여 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 도 1에서는, 중공사 형상의 배양액 성분 조정막(13)을 도시하고 있다.
배양액 성분 조정막(13)의 재질은, 특별히 한정되지 않지만, 세포 배양 장치(5) 내에 유지하고자 하는 성분이 흡착, 분해 등이 되지 않는 재질인 것이 바람직하다. 배양액 성분 조정막(13)의 재질이 상기 성분을 흡착하기 쉬운 특성을 갖고 있는 경우에는, 이들을 별도의 재료로 코팅하거나, 표면 개질제를 이용하거나 함으로써, 표면을 개질하여 성분의 흡착을 억제하는 것도 가능하다.
성분 조정액조(3)는 성분 조정액을 수용하는 조이다. 성분 조정액조(3)는, 성분 조정액 성분에 불활성이며 세포 독성을 갖지 않고, 또한, 감균(제염, 제균 또는 무균을 포함) 처리에 대하여 내성을 갖는 재료로 형성되어 있는 것이 바람직하고, 예컨대 유리, 합성 수지, 스테인리스강 등을 들 수 있다. 성분 조정액조(3)의 내용량 및 형상 등은 성분 조정액의 양에 따라서 적절하게 결정된다. 본 실시형태에서는, 성분 조정액조(3)는, 예컨대 유리제이며, 바닥이 있는 원통 형상을 이루고 있다. 성분 조정액조(3)에는, 상부에 설치된 개구부(도시하지 않음)를 막는 덮개부(3c)가 부착되어 있다.
성분 조정액조(3)에 수용되는 성분 조정액은, 배양액 성분 조정막(13)을 실질적으로 투과 가능한 성분 중의 적어도 하나의 성분을 갖는 용액이다. 배양액 및 성분 조정액이 각각 함유하는 성분은, 그 분자량과 양액 사이의 농도차에 의해 막을 통해 조정된다.
분자량이 배양액 성분 조정막(13)의 구멍 직경보다 커서 실질적으로 막을 투과할 수 없는 성분은, 양액 사이를 이동하지 않는다. 이에 대해, 분자량이 배양액 성분 조정막(13)의 구멍 직경보다 작아 실질적으로 막을 투과할 수 있는 성분은, 그 농도차가 적어지도록 양액 사이에서 농도 조정된다. 세포에 의해 생산되어 배양액 중에 축적된 대사물은, 성분 조정액측으로 이동함으로써 배양액 중의 농도를 저하시킨다. 동시에, 세포 생육에 필요하며 배양 기간 중에 농도가 저하된 성분에 관해서는, 성분 조정액으로부터 배양액으로 이동하여 보충된다. 이상의 원리로부터, 성분 조정액의 내용과 농도를 적절하게 설정함으로써, 배양액 중의 환경이 유지되고 세포의 양호한 생육 환경이 유지된다. 물론, 배양액을 그대로 사용할 수도 있다. 따라서, 성분 조정액은, 세포 배양 기간 중에 배양액 중에서 소실되어 가는 성분을 전부 갖는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 이들 성분의 농도가 배양 기간 중에 고갈되지 않도록 농도 설정된다.
성분 조정액의 양은, 세포 대사물의 축적 방지의 관점에서 많이 설정하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 배양액의 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상으로 설정된다. 성분 조정액의 양은 배양 비용에 영향을 미치기 때문에, 배양 기간과 필요 세포수에 의해 결정된다. 성분 조정액은, 생리적인 pH를 유지하기 쉽게 완충능을 갖도록 설계되어도 좋고, pH의 변화를 색으로 판별하기 쉽게 pH 지시 색소가 혼합되어 있어도 좋다.
성분 조정액조(3)의 내부에는 교반 회전자(4)가 설치되어 있다. 교반 회전자(4)는, 성분 조정액조(3) 내의 성분 조정액을 교반하는 부재이며, 성분 조정액조(3)의 하부에 배치된 도시하지 않은 구동원에 의해 구동된다. 구동원은, 예컨대 자력체를 회전 구동시키는 것이다. 교반 회전자(4)는, 자력체의 회전 구동에 따라서 회전하여 성분 조정액을 교반한다. 또한, 성분 조정액조(3)의 덮개부(3c)에는, 공기의 급기ㆍ배기 포트(6)나, 성분 조정액을 샘플링하기 위한 샘플링 포트(도시하지 않음) 등이 설치되어 있어도 좋다.
세포 배양 장치(5)는 세포를 배양하는 장치이다. 도 2는, 세포 배양 장치를 나타내는 사시도이다. 도 3은, 세포 배양 장치의 측면도이다. 도 4는, 도 3에서의 IV-IV선을 따른 단면 구성을 나타내는 도면이다. 도 2∼도 4에 도시된 바와 같이, 세포 배양 장치(5)는, 배양조(15)와, 축부재(17)와, 교반 기구(교반 수단)(19)와, 필터(21)를 구비하고 있다.
배양조(15)는, 세포가 배양되는 배양액을 수용(저류)한다. 여기서, 배양액은, 각종 세포 등과, 그 세포의 생육 가능한 용액 성분 및 환경을 적어도 갖는 용액이다. 배양액의 성분 및 농도는 세포의 성질에 의해 설계된다. 또한, 배양액은, 생리적인 pH를 유지하기 쉽게 완충능을 갖도록 설계되어도 좋고, pH의 변화를 색으로 판별하기 쉽게 pH 지시 색소가 혼합되어 있어도 좋다. 배양액은, 일반적으로 시판되고 있는 각종 배양액을 그대로 사용해도 좋고, 이들에 목적 세포의 성질에 따라서 추가 성분을 첨가해도 좋다.
배양조(15)는, 배양액 성분에 불활성이며 세포 독성을 갖지 않고, 또한, 감균 처리에 대하여 내성을 갖는 재료로 형성되어 있는 것이 바람직하고, 예컨대 유리, 합성 수지, 스테인리스강 등을 들 수 있다. 배양조(15)의 내용량 및 형상 등은, 배양액의 양에 따라서 적절하게 결정된다. 본 실시형태에서는, 배양조(15)는, 예컨대 유리제이며, 바닥이 있는 원통 형상을 이루고 있다. 배양조(15)는, 세포 등을 포함하는 배양액을 취출하기 위한 취출부(16)를 갖고 있다. 취출부(16)는, 배양조(15)의 측면부(15a)(도 4 참조)에 설치되어 있고, 비스듬히 상방으로 연장되는 통형상체이다. 취출부(16)에는 덮개부(16c)가 부착되어 있다. 배양조(15)에는, 상부에 설치된 개구부(15o)를 막는 덮개부(15c)가 설치되어 있다. 덮개부(15c)에는, 공기의 급기ㆍ배기 포트(12), 배양액을 배양조(15)에 공급하는 배양액 공급부, pH 센서의 삽입 포트 등이 설치되어 있다. 배양액 공급부의 상단부에는 튜브(9)의 타단부가 접속되어 있다.
축부재(17)는, 직선형의 부재이며, 중공 구조를 갖고 있다. 축부재(17)는, 배양액 성분에 불활성이며 세포 독성을 갖지 않고, 또한, 감균 처리에 대하여 내성을 갖는 재료인 것이 바람직하고, 예컨대 합성 수지, 스테인리스강 등을 들 수 있다. 축부재(17)는, 양쪽 단부에 개구부(17a, 17b)를 각각 갖고 있다.
축부재(17)는, 그 일단부측이 배양조(15) 내에 배치되어 있다. 구체적으로는, 축부재(17)는 축지지부(23)에 고정되어 있다. 축지지부(23)는 덮개부(15c)에 설치되어 있다. 축지지부(23)는, 덮개부(15c)의 대략 중앙부에 배치되어 있고, 덮개부(15c)에 세워져 설치되어 있다. 축지지부(23)는, 중공 구조를 갖고 있고, 내부에 축부재(17)를 삽입 관통시켜 축부재(17)를 회전 불가능하게 유지한다. 축부재(17)의 타단부는 축지지부(23)의 상단면보다 돌출되어 있다. 축부재(17)의 상단부에는 튜브(8)의 타단부가 접속되어 있다. 이에 의해, 축부재(17)의 내부와 튜브(8)가 연통해 있다.
교반 기구(19)는, 부착부(25)와 교반 날개(27)를 구비하고 있다. 부착부(25)는 축부재(17)에 회전 가능하게 부착되어 있다. 부착부(25)는, 축부재(17)를 삽입 관통하고 있고, 축부재(17)의 소정 높이 위치에 있어서 회전 가능하게 지지되어 있다.
교반 날개(27)는 배양액을 교반한다. 교반 날개(27)는, 축부재(17)를 회전 중심으로 하여 회전 가능하게 설치되어 있다. 상세하게는, 교반 날개(27)의 상단부에 부착부(25)가 연결되어 있고, 부착부(25)가 축부재(17)에 회전 가능하게 되어 있는 것에 의해, 교반 날개(27)가 축부재(17)를 회전 중심으로 하여 회전한다. 교반 날개(27)는, 배양액에 불활성이고, 또한, 내성을 갖는 판재로 형성되어 있는 것이 바람직하며, 예컨대 박판형의 합성 수지, 스테인리스강(예컨대 1 mm 두께의 SUS316) 등을 들 수 있다. 교반 날개(27)의 수는, 교반 기구(19)의 회전수에 의해 설정되지만, 축부재(17)를 중심으로 등간격으로 구비하는 것이 교반시에 있어서의 밸런스의 점에서 바람직하고, 예컨대 2∼4장이 적합하다. 본 실시형태에서는, 교반 날개(27)가 2장인 구성을 예시하고 있다.
교반 날개(27)는, 배양조(15)의 바닥부(15b)(도 4 참조)의 내면과의 간극이 작아지도록 형성되어 있다. 그 때문에, 교반 날개(27)는, 교반 기구(19)가 회전할 때에 바닥부(15b)의 내면을 따른다. 이에 의해, 바닥부(15b)의 내면 부근의 배양액을 교반하여 세포 및 세포 응집 덩어리 등을 배양액 중에 있어서 계속적으로 부유시키기 때문에, 바닥부(15b)의 내면에 침전하는 것을 방지할 수 있다. 또한, 교반 날개(27)는, 배양조(15)의 측면부(15a)의 내면과의 간극이 작아지도록 형성되어 있다. 그 때문에, 교반 날개(27)는, 교반 기구(19)가 회전할 때에 측면부(15a)의 내면을 따른다. 이에 의해, 측면부(15a)의 내면 부근의 배양액을 교반하여 균일한 층류로 할 수 있고, 세포 증식에 따라 비중이 증대된 세포 응집 덩어리 등이 침전하는 것을 방지할 수 있다.
교반 날개(27)에는 자력체(30)가 설치되어 있다. 자력체(30)는 교반 날개(27)의 하단에 배치되어 있다. 자력체(30)는, 테트라플루오로에틸렌 등으로 피복된 영구 자석 등이다. 자력체(30)는, 교반 날개(27)의 하단부에 있어서 자력체(30)를 둘러싸도록 절곡 가공된 부분에 고정되어 있다. 교반 날개(27)는 자력체(30)의 구동에 의해 회전한다. 구체적으로는, 도 5에 도시된 바와 같이, 배양조(15)의 하부에는, 한쌍의 자력체(32)를 지지체(33)를 통해 회전 구동시키는 구동 모터(34)가 배치되어 있고, 자력체(30)에 대향 배치된 자력체(32)의 회전에 따라 교반 날개(27)가 회전한다. 구동 모터(34)의 축은, 축부재(17)와 동축이 되도록 배치되어 있다.
필터(21)는, 배양액과 접하는 부분이며, 배양액을 투과시키지만 배양액 중의 세포 및 세포 응집 덩어리 등은 투과시키지 않는다. 필터(21)는, 세포 등과 배양액을 분리할 수 있는 것이면 되며, 재질, 형상, 수 등은 특별히 한정되지 않고, 설계에 맞춰 적절하게 설정되면 되지만, 예컨대 다공질체이고, 바람직하게는 소결체이고, 원기둥 형상을 이루고 있다. 필터(21)의 재질로서는, 금속, 세라믹, 유리, 수지, 섬유 등이 예시되고, 바람직하게는, 불소 수지, 폴리올레핀계 수지를 예시할 수 있다. 필터(21)는, 어느 정도 물을 투과시키고, 세포 그 자체나 미소 담체의 흡착, 세포 배양 장치(5) 내에 유지하고자 하는 성분의 분해, 흡착이 일어나지 않는 재질인 것이 바람직하고, 필터(21)의 재질이 이러한 특성을 갖고 있는 경우에는, 별도의 재료로 코팅하거나, 표면 개질제를 이용하거나 함으로써 친수화하거나, 상기 흡착이나 분해를 방지하거나 하는 것도 가능하다. 필터(21)는 축부재(17)에 접하도록 설치되어 있다. 상세하게는, 필터(21)는, 바닥이 있는 원통 형상을 이루고 있고, 축부재(17)의 하단부가 삽입되어 있다. 이에 의해, 필터(21)는, 축부재(17)와 동축 상에 연장되고, 교반 기구(19)의 교반 날개(27) 사이에 위치하고 있다. 즉, 필터(21)는, 축부재(17)를 회전 중심으로 하여 회전하는 교반 날개(27)의 가동 영역보다 내측에 위치하고, 교반 날개(27)와는 독립적으로 축부재(17)에 설치되어 있다. 필터(21)를 투과한 배양액은 축부재(17)의 내부로 도출된다.
세포 배양 장치(5)에서는, 필터(21)를 투과하여 흡인된 배양액은, 축부재(17)의 개구부(17b)로부터 그 내부에 도입되고, 개구부(17a)로부터 도출되어 튜브(8)로 도출된다. 그리고, 배양액은, 튜브(8)를 통해 성분 조정액조(3) 내의 배양액 성분 조정막(13)에 송출되어, 튜브(9)를 통해 배양조(15)로 복귀된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 실시형태의 세포 배양 장치(5)는, 회전 불가능하게 되어 있는 축부재(17)에 필터(21)가 설치되어 있다. 교반 기구(19)의 교반 날개(27)는, 축부재(17)를 회전 중심으로 하여 회전 가능하게 설치되어 있다. 이와 같이, 세포 배양 장치(5)에서는, 교반 날개(27)가 축부재(17)에 대하여 회전하고, 축부재(17) 및 필터(21)는 회전하지 않는다. 따라서, 세포 배양 장치(5)에서는, 배양액의 흡인을 위한 기구를 회전시키지 않기 때문에, 구성의 간이화를 도모할 수 있다. 또한, 세포 배양 장치(5)에서는, 배양조(15)로부터의 배양액의 흡인을 행하는 필터(21)가 교반 날개(27)의 회전 중심인 축부재(17)에 있어서 교반 날개(27)의 가동 영역보다 내측에 위치하여 설치되어 있고, 필터(21) 및 축부재(17)의 내부를 통해, 배양조(15)로부터 배양액의 흡인을 행한다. 그 때문에, 세포 배양 장치(5)에서는, 교반 날개(27)의 회전에 의해 생기는 액류(층류)에 대하여 필터(21)가 흐트러짐을 발생시키는 것이 억제되고, 배양액의 흡인에 관해 세포에 대한 응력의 경감을 도모할 수 있다. 따라서, 세포 배양 장치(5)에서는, 간이한 구성을 실현하면서 세포의 배양을 양호하게 행할 수 있다.
본 실시형태에서는, 축부재(17)가 덮개부(15c)에 설치된 축지지부(23)에 지지되어 있고, 축부재(17)의 하단부가 필터(21)에 삽입되어 있다. 이와 같이, 세포 배양 장치(5)에서는, 배양액을 흡인하는 기구가 축부재(17)에 집약되고, 또한 축부재(17)는 회전하지 않기 때문에, 장치의 간이화를 도모할 수 있다.
본 실시형태에서는, 필터(21)가 기둥형을 이루고 있기 때문에, 필터(21)에 있어서 막면적을 확보할 수 있다. 따라서, 필터(21)에서는 배양액의 흡인을 안정적으로 행할 수 있다.
또, 제1 실시형태에 따른 세포 배양 장치(5)의 구성은, 배양조(15)의 덮개부(15c)에 축부재가 지지되는 구성이면 되고, 축부재나 필터, 교반 기구의 구성은 다른 형태여도 좋다.
도 6은, 제1 실시형태에 따른 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다. 도 6의 (a)에 도시된 바와 같이, 필터(21A)는 축부재(17A)에 삽입 관통되는 구성이어도 좋다. 상세하게는, 축부재(17A)는, 중공 구조를 갖고 있고, 상단부에 개구부(17Aa)를 가짐과 더불어 하단부가 폐색되어 있다. 축부재(17A)의 측면부에는, 내부와 외부를 연통하는 개구부(17h)가 설치되어 있다. 또, 도 6에서는, 개구부(17h)를 1개만 도시하고 있지만, 개구부(17h)의 수, 크기, 형상은, 설계에 맞춰 적절하게 설정되면 된다. 필터(21A)는 원통 형상을 이루고 있다. 필터(21A)는, 축부재(17A)에 삽입 관통되어 있고, 축부재(17A)의 개구부(17h)를 덮도록 축부재(17A)의 외표면(외측)에 설치되어 있다. 이에 의해, 필터(21A) 및 축부재(17A)의 내부를 통해, 배양조(15)로부터 배양액의 흡인을 행한다.
또한, 필터(21)는 원기둥 형상 이외의 형상이어도 좋다. 도 6의 (b)에 도시된 바와 같이, 필터(21B)는 하단부가 원뿔대 형상을 이루고 있어도 좋다. 또한, 필터(21)는, 각기둥 형상이어도 좋고, 삼각기둥 형상이어도 좋다. 필터(21)는, 표면적을 확보하기 위해 표면 형상이 요철이어도 좋다.
또한, 필터(21)는 배양조(15)의 바닥부(15b)에 접해 있어도 좋다. 필터(21)가 바닥부(15b)에 접함으로써, 바닥부 중심 근방을 필터(21)가 차지한다. 이에 의해, 배양액의 회전에 의한 바닥부 중심 근방의 액류의 정체가 생길 여지가 없어, 세포 증식에 따라 비중이 증대된 세포 응집 덩어리 등의 바닥부 중심 근방으로의 침전을 방지할 수 있다.
도 7 및 도 8은, 세포 배양 장치를 구비한 세포 배양 시스템의 다른 형태를 나타내는 도면이다. 도 7에 도시된 바와 같이, 세포 배양 시스템(1A)은, 세포 배양 장치(5)와, 배양액조(3A)와, 폐기조(3B)를 구비하고 있다. 배양액조(3A)와 세포 배양 장치(5)는, 송액 펌프(10)가 설치된 튜브(8)에 의해 접속되어 있다. 세포 배양 장치(5)와 폐기조(3B)는, 송액 펌프(11)가 설치된 튜브(9)에 의해 접속되어 있다. 세포 배양 시스템(1A)에서는, 배양액조(3A)로부터 세포 배양 장치(5)에 배양액이 공급되고, 세포 배양 장치(5)로부터 대사물 등을 포함한 배양액이 폐기조(3B)에 공급된다.
도 8에 도시된 바와 같이, 세포 배양 시스템(1B)은, 세포 배양 장치(5)와, 배양액조(3A)와, 폐기조(3B)를 구비하고 있다. 배양액조(3A) 및 폐기조(3B)와 세포 배양 장치(5)는, 송액 회로(7A)에 의해 접속되어 있다. 상세하게는, 튜브(8A)에는 삼방활전(14)이 설치되어 있다. 세포 배양 장치(5)에는, 삼방활전(14)을 통해 배양액조(3A)로부터 배양액이 공급되고, 세포 배양 장치(5)로부터는, 삼방활전(14)을 통해 대사물 등을 포함한 배양액이 폐기조(3B)에 공급된다.
삼방활전(14)은, 세포 배양 장치(5)에 대한 배양액의 공급, 및, 세포 배양 장치(5)로부터의 배양액의 흡인에 따라서 유로가 전환된다. 즉, 삼방활전(14)은, 배양액조(3A)로부터 배양액이 공급되는 경우에는, 배양액조(3A)와 세포 배양 장치(5) 사이의 유로를 확립하고, 폐기조(3B)에 배양액이 공급되는 경우에는, 세포 배양 장치(5)와 폐기조(3B) 사이의 유로를 확립한다. 세포 배양 장치(5)에서는, 필터(21)에 있어서, 배양조(15)로부터 배양액의 흡인 및 배양조(15)에 대한 배양액의 공급을 행한다.
[제2 실시형태]
계속해서, 제2 실시형태에 관해 설명한다. 도 9는, 제2 실시형태에 따른 세포 배양 장치의 단면 구성을 나타내는 도면이다. 도 9에 도시된 바와 같이, 세포 배양 장치(40)는, 배양조(42)와, 축부재(44)와, 교반 기구(46)와, 필터(48)를 구비하고 있다.
배양조(42)는, 배양액 성분에 불활성이며 세포 독성을 갖지 않고, 또한, 감균(제염, 제균 또는 무균을 포함) 처리에 대하여 내성을 갖는 재료로 형성되어 있는 것이 바람직하고, 예컨대, 유리, 합성 수지, 스테인리스강 등을 들 수 있다. 배양조(42)의 내용량 및 형상 등은, 배양액의 양에 따라서 적절하게 결정된다. 본 실시형태에서는, 배양조(42)는, 예컨대 합성 수지제이며, 바닥이 있는 원통 형상을 이루고 있다. 배양조(42)에는, 상부에 설치된 개구부(42o)를 막는 덮개부(42c)가 설치되어 있다. 덮개부(42c)에는, 세포 등을 포함하는 배양액을 취출하기 위한 취출부(43), 공기의 급기ㆍ배기 포트, pH 센서(58) 등이 설치되어 있다.
축부재(44)는 배양조(42)의 바닥부(42a)에 지지되어 있다. 축부재(44)는, 도관부(44a)와 지지부(44b)를 구비하고 있다. 도관부(44a)는, 직선형의 부재이며, 중공 구조를 갖고 있다. 도관부(44a)는, 배양액 성분에 불활성이며 세포 독성을 갖지 않고, 또한, 감균 처리에 대하여 내성을 갖는 재료인 것이 바람직하고, 예컨대, 합성 수지, 스테인리스강 등을 들 수 있다. 도관부(44a)는 배양조(42)의 바닥부(42a)에 지지되어 있다. 상세하게는, 도관부(44a)는, 바닥부(42a)에 설치된 지지대(42d)에 삽입 관통되어 지지 고정되어 있다. 도관부(44a)의 내부는, 배양조(42)의 바닥부(42a)에 설치된 흡인 포트(42e)에 연통하고 있다. 도관부(44a)의 측벽부에는, 내부와 외부를 연통하는 개구부(44h)가 설치되어 있다. 또, 도 9에서는, 개구부(44h)를 1개만 도시하고 있지만, 개구부(44h)의 수, 크기, 형상은, 설계에 맞춰 적절하게 설정되면 된다.
지지부(44b)는 도관부(44a)의 상부에 설치되어 있다. 지지부(44b)는 도관부(44a)의 상단부의 개구부를 막도록 배치되어 있다. 지지부(44b)는 도관부(44a)와 동축 상에 연장되어 있다.
교반 기구(46)는, 부착부(50)와 교반 날개(52)를 구비하고 있다. 부착부(50)는, 축부재(44)의 지지부(44b)에 회전 가능하게 부착되어 있다. 상세하게는, 부착부(50)는 지지부(44b)의 상단부가 삽입되어 있다.
교반 날개(52)는, 축부재(44)를 회전 중심으로 하여 회전 가능하게 설치되어 있다. 상세하게는, 교반 날개(52)의 상단부에 부착부(50)가 연결되어 있고, 부착부(50)가 축부재(44)에 회전 가능하게 되어 있는 것에 의해, 교반 날개(52)가 축부재(44)를 회전 중심으로 하여 회전한다. 교반 날개(52)는, 배양액에 불활성이고, 또한, 내성을 갖는 판재로 형성되어 있는 것이 바람직하고, 예컨대, 박판형의 합성 수지, 스테인리스강(예컨대 1 mm 두께의 SUS316) 등을 들 수 있다. 교반 날개(52)의 수는, 교반 기구(46)의 회전수에 의해 설정되지만, 축부재(44)를 중심으로 등간격으로 구비하는 것이 교반시에 있어서의 밸런스의 점에서 바람직하고, 예컨대 2∼4장이 적합하다. 본 실시형태에서는, 교반 날개(52)가 2장인 구성을 예시하고 있다.
교반 날개(52)에는 자력체(54)가 설치되어 있다. 자력체(54)는 교반 날개(52)의 하단에 배치되어 있다. 자력체(54)는, 테트라플루오로에틸렌 등으로 피복된 영구 자석 등이다. 자력체(54)는, 교반 날개(52)의 하단부에 있어서 자력체(54)를 둘러싸도록 절곡 가공된 부분에 고정되어 있다. 교반 날개(52)는 자력체(54)의 구동에 의해 회전한다. 구체적으로는, 배양조(42)의 하부에는, 도 5에 도시된 바와 같이, 한쌍의 자력체(32)를 지지체(33)를 통해 회전 구동시키는 구동 모터(34)가 배치되어 있고, 자력체(54)에 대향 배치된 자력체(32)의 회전에 따라 교반 날개(52)가 회전한다. 구동 모터(34)의 축은, 축부재(44)와 동축이 되도록 배치되어 있다.
필터(48)는, 세포 등과 배양액을 분리할 수 있는 것이면 되며, 재질, 형상, 수 등은 특별히 한정되지 않고, 설계에 맞춰 적절하게 설정되면 되지만, 예컨대 다공질체이고, 바람직하게는 소결체이며, 원통 형상을 이루고 있다. 필터(48)는, 축부재(44)의 도관부(44a)에 삽입 관통되어 있고, 도관부(44a)의 개구부(44h)를 덮도록 도관부(44a)의 외표면(외측)에 설치되어 있다. 즉, 필터(48)는, 축부재(44)를 회전 중심으로 하여 회전하는 교반 날개(52)의 가동 영역보다 내측에 위치하고, 교반 날개(52)와는 독립적으로 축부재(44)에 설치되어 있다. 세포 배양 장치(40)에서는, 필터(48) 및 도관부(44a)의 내부를 통해, 배양조(42)로부터 배양액의 흡인을 행한다.
이상 설명한 바와 같이, 본 실시형태의 세포 배양 장치(40)는, 회전 불가능하게 되어 있는 축부재(44)에 필터(48)가 설치되어 있다. 교반 기구(46)의 교반 날개(52)는, 축부재(44)를 회전 중심으로 하여 회전 가능하게 설치되어 있다. 이와 같이, 세포 배양 장치(40)에서는, 교반 날개(52)가 축부재(44)에 대하여 회전하고, 축부재(44) 및 필터(48)는 회전하지 않는다. 따라서, 세포 배양 장치(40)에서는, 배양액의 흡인을 위한 기구를 회전시키지 않기 때문에, 구성의 간이화를 도모할 수 있다. 또한, 세포 배양 장치(40)에서는, 배양조(42)로부터 배양액의 흡인을 행하는 필터(48)가 교반 날개(52)의 회전 중심인 축부재(44)에 있어서 교반 날개(52)의 가동 영역보다 내측에 위치하여 설치되어 있고, 필터(48) 및 축부재(44)의 내부를 통해, 배양조(42)로부터 배양액의 흡인을 행한다. 그 때문에, 세포 배양 장치(40)에서는, 교반 날개(52)의 회전에 의해 생기는 액류(층류)에 대하여 필터(48)가 흐트러짐을 발생시키는 것이 억제되고, 배양액의 흡인에 관해 세포에 대한 응력의 경감을 도모할 수 있다. 따라서, 세포 배양 장치(40)에서는, 간이한 구성을 실현하면서 세포의 배양을 양호하게 행할 수 있다.
본 실시형태에서는, 축부재(44)가 배양조(42)의 바닥부(42a)에 지지되어 있고, 축부재(44)가 필터(48)에 삽입되어 있다. 이와 같이, 세포 배양 장치(40)에서는, 배양액을 흡인하는 기구가 축부재(44)에 집약되고, 또한 축부재(44)는 회전하지 않기 때문에, 장치의 간이화를 도모할 수 있다.
또, 제2 실시형태에 따른 세포 배양 장치(40)의 구성은, 배양조(42)의 바닥부(42a)에 축부재가 지지되는 구성이면 되며, 축부재나 필터, 교반 기구의 구성은 다른 형태여도 좋다.
도 10∼도 14는, 제2 실시형태의 세포 배양 장치의 변형예를 나타내는 도면이다. 도 10에 도시된 바와 같이, 축부재(60)는, 도관부(60a)와 지지부(60b)를 구비하고 있다. 도관부(60a)는, 직선형의 부재이며, 중공 구조를 갖고 있다. 도관부(60a)는, 배양조(42)의 바닥부(42a)에 설치된 지지대(42d)에 삽입 관통되어, 배양조(42)의 바닥부(42a)에 지지되어 있다. 도관부(60a)의 상단부에는 개구부(60h)가 설치되어 있다. 필터(62)는, 이 도관부(60a)의 개구부(60h)를 덮도록 도관부(60a)에 설치되어 있다. 구체적으로는, 필터(62)는, 바닥이 있는 원통 형상을 이루고 있고, 도관부(60a)의 상단부가 삽입되어 있다. 즉, 도관부(60a)는, 상기 실시형태의 도관부(44a)와는 구성이 상이하고, 필터(62)의 내부를 관통하지 않는다. 지지부(60b)는 필터(62)의 상단부에 설치되어 있다. 지지부(60b)는, 도관부(60a) 및 필터(62)와 동축 상에 연장되어 있다. 교반 기구(46)의 부착부(50)는 지지부(60b)에 부착된다.
도 11에 도시된 바와 같이, 축부재(70)는 배양조(42)의 바닥부(42a)에 지지되어 있다. 축부재(70)의 상단부에는 개구부(70h)가 설치되어 있다. 필터(71)는, 이 축부재(70)의 개구부(70h)를 덮도록 축부재(70)에 설치되어 있다. 구체적으로는, 필터(71)는, 바닥이 있는 원통 형상을 이루고 있고, 축부재(70)의 상단부가 삽입되어 있다. 교반 기구(72)는, 부착부(74)와 교반 날개(76)를 구비하고 있다. 부착부(74)는 축부재(70)에 회전 가능하게 부착되어 있다. 상세하게는, 부착부(74)는, 필터(71)의 하단부보다 하방의 위치에 있어서 축부재(70)에 부착되어 있다. 교반 날개(76)는, 그 하단부측이 부착부(74)에 연결되어 있고, 필터(71)를 사이에 두고 배치되어 있다.
교반 날개(76)에는 자력체(78)가 설치되어 있다. 자력체(78)는 교반 날개(76)의 하단에 배치되어 있다. 자력체(78)는, 테트라플루오로에틸렌 등으로 피복된 영구 자석 등이다. 교반 날개(76)는 자력체(78)의 구동에 의해 회전한다. 구체적으로는, 배양조(42)의 하부에는, 도 5에 도시된 바와 같이, 한쌍의 자력체(32)를 지지체(33)를 통해 회전 구동시키는 구동 모터(34)가 배치되어 있고, 자력체(78)에 대향 배치된 자력체(32)의 회전에 따라 교반 날개(76)가 회전한다. 구동 모터(34)의 축은, 축부재(70)와 동축이 되도록 배치되어 있다. 또, 교반 날개(76)의 구성은, 도 11에 나타내는 구성(형상)에 한정되지 않는다.
도 12에 도시된 바와 같이, 축부재(80)는, 도관부(80a)와 밀봉부(80b)를 구비하고 있다. 도관부(80a)는, 직선형의 부재이며, 중공 구조를 갖고 있다. 도관부(80a)는, 배양조(42)의 바닥부(42a)에 설치된 지지대(42d)에 삽입 관통되어, 배양조(42)의 바닥부(42a)에 지지되어 있다. 도관부(80a)의 측벽부에는, 내부와 외부를 연통하는 개구부(81a, 81b)가 설치되어 있다. 개구부(81a, 81b)는, 축부재(80)의 길이 방향에 있어서 이격되고, 후술하는 제1 필터(82a) 및 제2 필터(82b)의 각각의 위치에 대응하여 배치되어 있다. 또, 도 12에서는, 개구부(81a, 81b)를 각각 1개씩 나타내고 있지만, 개구부(81a, 81b)의 수, 크기, 형상은, 설계에 맞춰 적절하게 설정되면 된다. 밀봉부(80b)는, 도관부(80a)의 상단부에 설치된 개구부를 밀봉(폐색)하고 있다.
필터(82)는, 제1 필터(82a)와 제2 필터(82b)를 갖는다. 즉, 필터(82)는, 2개의 파트로 분할되어 있다. 제1 필터(82a) 및 제2 필터(82b)는 원통 형상을 이루고 있다. 제1 필터(82a)는, 도관부(80a)의 하단부측에 삽입 관통되어 있고, 개구부(81a)를 덮도록 도관부(80a)의 외표면(외측)에 설치되어 있다. 제2 필터(82b)는, 도관부(80a)의 상단부측에 삽입 관통되어 있고, 개구부(81b)를 덮도록 도관부(80a)의 외표면(외측)에 설치되어 있다. 제1 필터(82a)의 상단부와 제2 필터(82b)의 하단부는, 소정의 간격을 두고 이격되어 있다. 부착부(74)는, 제1 필터(82a)와 제2 필터(82b) 사이에 배치되고, 도관부(80a)(축부재(80))에 회전 가능하게 부착되어 있다. 교반 날개(76)는, 부착부(74)에 연결되어 있고, 필터(82)를 사이에 두고 배치되어 있다. 또, 도 12에 나타내는 교반 날개(76)의 하단부의 내측은, 지지대(42d)의 형상을 따른 형상으로 되어 있다.
도 13에 도시된 바와 같이, 축부재(90)는, 직선형의 부재이며, 중공 구조를 갖고 있다. 축부재(90)는, 배양조(42)의 바닥부(42a)에 설치된 지지대(42d)에 삽입 관통되어, 배양조(42)의 바닥부(42a)에 지지되어 있다. 축부재(90)에는, 그 상단부에 개구부(90a)가 설치되어 있고, 측벽부의 하단부측에는 내부와 외부를 연통하는 개구부(90b)가 설치되어 있다. 필터(92)는, 제1 필터(92a)와 제2 필터(92b)를 갖고 있다. 제1 필터(92a)는 원통 형상을 이루고 있다. 제1 필터(92a)는, 축부재(90)의 하단부측에 삽입 관통되어 있고, 개구부(90b)를 덮도록 축부재(90)의 외표면(외측)에 설치되어 있다. 제2 필터(92b)는, 축부재(90)의 개구부(90a)를 덮도록 축부재(90)에 설치되어 있다. 구체적으로는, 제2 필터(92b)는, 바닥이 있는 원통 형상을 이루고 있고, 축부재(90)의 상단부가 삽입되어 있다. 제1 필터(92a)의 상단부와 제2 필터(92b)의 하단부는, 소정의 간격을 두고 이격되어 있다. 또, 도 13에서는, 개구부(90b)를 1개 나타내고 있지만, 개구부(90b)의 수, 크기, 형상은, 설계에 맞춰 적절하게 설정되면 된다. 부착부(74)는, 제1 필터(92a)와 제2 필터(92b) 사이에 배치되고, 축부재(90)에 회전 가능하게 부착되어 있다. 교반 날개(76)는, 부착부(74)에 연결되어 있고, 필터(92)를 사이에 두고 배치되어 있다. 또, 도 13에 나타내는 교반 날개(76)의 하단부의 내측은, 지지대(42d)의 형상을 따른 형상으로 되어 있다.
도 14에 도시된 바와 같이, 축부재(100)는, 제1 도관부(110)와 제2 도관부(120)를 갖고 있다. 제1 도관부(110) 및 제2 도관부(120)는, 직선형의 부재이며, 중공 구조를 갖고 있다. 제1 도관부(110)는, 배양조(42)의 바닥부(42a)에 설치된 지지대(42d)에 삽입 관통되어, 배양조(42)의 바닥부(42a)에 지지되어 있다. 제1 도관부(110)의 상단부에는 개구부(110a)가 설치되어 있다. 제2 도관부(120)는, 그 하단부 및 상단부의 각각에 개구부(120a) 및 개구부(120b)가 설치되어 있다.
필터(130)는, 제1 필터(130a)와 제2 필터(130b)를 갖고 있다. 제1 필터(130a)는, 제1 도관부(110)의 개구부(110a) 및 제2 도관부(120)의 개구부(120a)를 덮도록, 제1 도관부(110) 및 제2 도관부(120)에 설치되어 있다. 구체적으로는, 제1 필터(130a)는, 양쪽 단부에 삽입 구멍이 형성된 원기둥 형상을 이루고 있고, 제1 도관부(110)의 상단부 및 제2 도관부(120)의 하단부가 삽입 구멍에 삽입되어 있다. 제2 필터(130b)는, 제2 도관부(120)의 개구부(120b)를 덮도록 제2 도관부(120)에 설치되어 있다. 제2 필터(130b)는, 바닥이 있는 원통 형상을 이루고 있고, 제2 도관부(120)의 상단부가 삽입되어 있다. 제1 필터(130a)와 제2 필터(130b)는, 제2 도관부(120)에 의해 연결되어 있고, 소정의 간격을 두고 이격되어 있다. 부착부(74)는, 제1 필터(130a)와 제2 필터(130b) 사이에 배치되고, 제2 도관부(120)에 회전 가능하게 부착되어 있다. 교반 날개(76)는, 부착부(74)에 연결되어 있고, 필터(130)를 사이에 두고 배치되어 있다. 또, 도 14에 나타내는 교반 날개(76)의 하단부의 내측은, 지지대(42d)의 형상을 따른 형상으로 되어 있다.
본 발명은, 전술한 실시형태에 한정되지 않고, 본 발명의 요지를 일탈하지 않는 범위에서 여러가지 변형이 가능하다.
상기 실시형태에서는, 교반 날개(27, 52, 76)를 일례로 설명했지만, 교반 날개의 형상은 이것에 한정되지 않는다. 교반 날개의 형상은, 세포에 대한 응력의 경감을 도모할 수 있는 구성인 것이 바람직하다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 실시형태를 더욱 상세히 설명하지만, 본 실시형태는 이들에 한정되는 것이 아니다.
[실시예 1]
(세포 배양 시스템의 제어 장치)
세포 배양 시스템의 제어 장치로서는, 8연동 동물 배양 장치 BioJr.8(BJR-25NA1S-8C, 에이블 가부시키가이샤)를 사용했다. 본 제어 장치는, 1대로 8개의 100 mL 용량의 세포 배양 장치를 제어 가능하다. 측정 및 제어 항목은, 교반 속도, 온도, pH 및 용존 산소 농도(DO)로 했다. 본 제어 장치에서는, 각 세포 배양 장치를 독립적으로 제어 가능하다.
(인간 iPS 세포의 준비)
배양 세포로서는, 인간 iPS 세포(253G1)를 이용했다. 세포는, 비트로넥틴(라이프테크놀로지사)을 코팅한 배양 디쉬(코닝사)에 파종하고, 배양액으로서 Essential-8을 이용하여 배양했다. 배양액의 교환은 매일 실시하고, 3∼4일에 1회의 빈도로 계대를 실시했다.
(인간 iPS 세포의 배양)
실시예 1에 있어서는, 도 15에 도시되는 세포 배양 장치를 제작했다. 배양조(15)로서 유리제의 전용조(에이블 가부시키가이샤)를 사용하고, 배양액을 100 mL로 했다. 준비한 인간 iPS 세포를, 세포수 2×107개(밀도 2×105개/mL)로 파종하고 배양을 시작했다. 이 시점을 배양 0일째로 했다. 배양액으로서는, Essential-8 배지(라이프테크놀로지사)에 이하의 성분을 첨가하여 사용했다. 즉, ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho 결합 키나아제) 저해제로서 Y-27632(와코쥰야쿠공업 가부시키가이샤)를 10 μM, 헤파린(시그마알드리치사)을 750 ng/mL의 농도로 첨가했다. 배양조(15)에는 교반 날개(22)를 설치하고, 회전수는 60 rpm으로 했다. 배양조(15)에는, 온도, pH, 용존 산소 농도를 각각 계측 가능한 센서(에이블 가부시키가이샤)를 설치했다. 또한, 용존 산소 농도는 40%로 제어되는 설정으로 하고, 이를 위해, 산소, 질소 및 공기의 혼합 가스가 배양조(15) 내의 배양액에 대하여 상면 통기가 되도록 가스 도입 라인을 설치했다. 또한, 가스를 배양조(15)로부터 배출하는 도출 라인을 설치했다. 온도는 37℃로 설정했다.
축부재(17)로서는, 스테인레스제의 중공 파이프(외경 3 mm, 내경 1.8 mm)를 사용했다. 필터(21)로서는, 폴리에틸렌의 소결체로 이루어진 직경 8 mm, 길이 15 mm, 평균 구멍 직경 30 ㎛의 바닥이 있는 원통형 필터를 사용했다. 축부재(17)는, 배양조(15)의 덮개부의 중심에 고정하고, 필터(21)를 통과한 배양액이 이 축부재(17)의 중공 부분을 통과하여 배양조(15)로부터 취출할 수 있는 구조로 했다. 또한, 배양조(15)에 배양액을 반환 가능한 입구를 설치했다. 교반 날개(22)는, 상기 축부재(17)를 중심으로 회전 가능하게 설치했다. 필터(21)는, 그 원통 상면과 배양액의 액면이 가까워지는 높이에 설치했다.
성분 조정액조는, 용량 1 L의 유리제 멸균병을 사용했다. 성분 조정액조의 덮개의 부분에, 통기 라인, 배양액의 입구 및 출구 라인을 설치했다. 성분 조정액조 내에는, 아사히 폴리술폰 다이얼라이저 APS(아사히카세이메디컬 가부시키가이샤)의 중공사를 400개 묶어 유효 길이 20 cm가 되도록, 중공사 양쪽 단부의 관강 구조가 해방되도록 우레탄 접착제로 고정한 것을 배양액 성분 조정막으로서 설치했다. 중공사 다발은, 성분 조정액조의 내부에 배치하고, 중공사 다발의 양쪽 단부와 배양액의 입구, 출구 라인을 회로에서 접속했다. 성분 조정액으로는, Essential-6(라이프테크놀로지사)에 배양액과 동일한 농도가 되도록 Y-27632와 헤파린을 첨가한 용액을 1 L 사용했다.
송액 회로로서는, 실리콘제 튜브(내경 1 mmφ, 외경 4 mmφ)를 이용했다.
배양액의 송액 펌프로서는, 페리스타 펌프 RP-23(에이블 가부시키가이샤)을 2대 사용했다. 2대의 펌프는, 배양조(15)와 성분 조정액조를 접속하는 송액 회로의 각각에 접속하여, 송액 가능한 상태로 설치했다.
폐쇄계 회로 내에 배양조(15) 및 성분 조정액조와는 독립적으로 10 mL 시린지(테루모 가부시키가이샤)에 bFGF(라이프테크놀로지사)를 10 μg/mL, 헤파린(시그마알드리치사)을 250 μg/mL의 농도로 배양액 DMEM/F12(라이프테크놀로지사)에 용해하여 2 mL 설치했다.
이상 설명한 방법에 의해, 도 1에 도시되는 세포 배양 시스템을 제작했다. 본 시스템을 이용하여, 이하의 방법에 의해 iPS 세포로 이루어진 세포 덩어리를 제조했다.
배양액의 송액 펌프에 의한 순환은, 배양 1일째부터 시작했다. 순환 속도는, 1일째는 100 mL/일, 2일째는 200 mL/일, 3일째는 400 mL/일, 4일째 이후는 600 mL/일로 했다. 배양조(15)의 액용량이 실질적으로 동일한 레벨을 유지할 수 있도록 2대의 펌프 유속을 미조정하고, 6일째까지 연속적으로 배양액을 관류하면서 배양을 실시했다. bFGF와 헤파린의 혼합액은, 배양 2일째 및 4일째에 10 mL 시린지로부터 1 mL 투여했다. 배양 6일째에 세포 배양을 종료하고, 세포수의 측정과 미분화율의 측정을 이하와 같이 행했다.
(세포수의 측정)
배양 6일째에 세포 덩어리를 배양조(15)로부터 회수하고, 세포 분리/분산 용액 Accumax(이노베이티브 셀 테크놀로지사)로 10분간 처리하여 단세포의 상태로 한 후, 트리판 블루법으로 사세포를 염색하고, 생세포만을 계산반을 이용하여 카운트했다.
(미분화율 측정)
인간 iPS 세포가 미분화 상태를 유지하고 있는 것을 확인하기 위해, 미분화 마커인 SSEA-4의 양성율을 플로우 사이토메트리법으로 측정했다. 항체로서는, 항인간/마우스 SSEA-4 모노클로날 항체 FAB1435F(R&D 시스템사)를 이용하고, 측정 장치로서는, Cell Lab QuantaSC(베크만ㆍ코울터 가부시키가이샤)를 이용했다. SSEA-4의 양성율을 미분화율로 했다.
[실시예 2]
실시예 2에서는, 도 16에 도시된 바와 같이, 필터(21)의 설치 높이를, 배양조(15)의 바닥면과 액면 높이의 중간에 설치한 것 외에는, 실시예 1의 세포 배양 장치와 동일한 구조로 했다.
[비교예 1]
비교예 1에서는, 도 17에 도시된 바와 같이, 필터(21)와 축부재(17)의 설치를, 교반 날개(22)의 회전 범위의 외측으로 하고, 배양액의 입구 라인 및 출구 라인을 변경한 것 외에는, 실시예 1의 세포 배양 장치와 동일한 구조로 했다.
상기 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 배양 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 비교예 1의 세포 배양 장치에서는, 세포의 증식이 보이지 않았던 데 비해, 실시예 1 및 실시예 2의 세포 배양 장치에서는, 배양 개시시와 비교하여 20배 이상의 증식이 실현되었다. 또한, 실시예 1 및 실시예 2의 세포 배양 장치에서는, SSEA-4 양성의 미분화 상태의 세포의 비율은, 모두 95% 이상의 높은 미분화율을 그대로 유지했다. 이러한 점에서, 본 실시형태의 방법은, 인간 다능성 줄기 세포의 세포 배양 장치로서 유효하다는 것이 나타났다.
5, 40 : 세포 배양 장치, 15, 42 : 배양조, 15c : 덮개부, 17, 44 : 축부재, 17a, 17b, 17Aa : 개구부, 17h, 44h : 개구부, 19, 46 : 교반 기구, 21, 48 : 필터, 27, 52, 76 : 교반 날개, 42a : 바닥부.
Claims (12)
- 세포를 포함하는 배양액을 수용하는 배양조와,
상기 배양조 내에 적어도 일부가 배치된 축부재와,
상기 축부재에 지지되어 상기 배양조 내에 배치되고, 상기 축부재를 회전 중심으로 하여 회전 가능하게 설치된 교반 날개를 갖는 교반 수단과,
상기 축부재에 접하도록 설치되고, 상기 배양액은 투과시키지만 상기 세포는 투과시키지 않는 필터를 구비하고,
상기 축부재는, 적어도 일부가 중공이고, 그 내부에 상기 배양액을 도입 또는 상기 내부로부터 상기 배양액을 도출하는 개구부가 설치되어 있음과 더불어, 회전 불가능하게 되어 있고,
상기 필터는, 상기 축부재를 회전 중심으로 하여 회전하는 상기 교반 날개의 가동 영역보다 내측에 위치하고, 상기 교반 날개와는 독립적으로 상기 축부재에 설치되어 있고,
상기 필터 및 상기 축부재의 상기 내부를 통해, 상기 배양조로부터 상기 배양액의 흡인 및/또는 상기 배양조에 대한 상기 배양액의 공급을 행하는 세포 배양 장치. - 제1항에 있어서, 상기 축부재는 상기 배양조의 바닥부에 지지되어 있는 세포 배양 장치.
- 제2항에 있어서, 상기 축부재는, 하단부에 상기 개구부가 설치되어 있음과 더불어, 상단부가 폐색되어 있고,
상기 축부재의 측면부에는, 상기 내부와 연통하는 개구부가 설치되어 있고,
상기 필터는, 상기 측면부의 상기 개구부를 덮도록 상기 축부재의 외표면에 설치되어 있는 세포 배양 장치. - 제3항에 있어서, 상기 필터는, 통형상을 이루고 있고, 상기 측면부의 상기 개구부를 덮도록 상기 축부재의 외측에 삽입 관통되어 있는 세포 배양 장치.
- 제2항에 있어서, 상기 축부재는, 하단부에 상기 개구부가 설치되어 있음과 더불어, 상단부에 상기 내부와 연통하는 개구부가 설치된 통형상을 이루고 있고,
상기 필터는, 상기 상단부의 상기 개구부를 덮도록 상기 축부재에 설치되어 있는 세포 배양 장치. - 제5항에 있어서, 상기 필터는, 바닥이 있는 통형상을 이루고 있고, 상기 상단부의 상기 개구부를 덮도록 상기 축부재의 외측에 삽입 관통되어 있는 세포 배양 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 축부재는 상기 배양조의 덮개부에 지지되어 있는 세포 배양 장치.
- 제7항에 있어서, 상기 축부재는, 상단부에 상기 개구부가 설치되어 있음과 더불어, 하단부에 상기 내부와 연통하는 개구부가 설치된 통형상을 이루고 있고,
상기 필터는, 상기 하단부의 상기 개구부를 덮도록 상기 축부재에 설치되어 있는 세포 배양 장치. - 제8항에 있어서, 상기 필터는, 바닥이 있는 통형상을 이루고 있고, 상기 하단부의 상기 개구부를 덮도록 상기 축부재의 외측에 삽입 관통되어 있는 세포 배양 장치.
- 제7항에 있어서, 상기 축부재는, 상단부에 상기 개구부가 설치되어 있음과 더불어, 하단부가 폐색되어 있고,
상기 축부재의 측면부에는, 상기 내부와 연통하는 개구부가 설치되어 있고,
상기 필터는, 상기 측면부의 상기 개구부를 덮도록 상기 축부재의 외표면에 설치되어 있는 세포 배양 장치. - 제10항에 있어서, 상기 필터는, 통형상을 이루고 있고, 상기 측면부의 상기 개구부를 덮도록 상기 축부재의 외측에 삽입 관통되어 있는 세포 배양 장치.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터는 다공질체인 세포 배양 장치.
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