JP7264397B2 - 乳酸吸着剤および乳酸の除去方法 - Google Patents

乳酸吸着剤および乳酸の除去方法 Download PDF

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Description

本発明は、乳酸吸着剤および乳酸の除去方法に関する。
近年、医薬品製造や再生医療などの分野において、細胞や微生物を人工的に効率よく大量培養することが求められている。大量培養が求められる細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等の抗体産生細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞等が挙げられる。これらの細胞を長期間安定的に大量培養できれば、モノクローナル抗体等の生体物質や多能性幹細胞由来の分化誘導組織を効率よく生産することができる。
細胞や微生物を工業的に大量培養する方法としては、スピナーフラスコ等の培養槽を用いた浮遊攪拌培養が考えられる。一方、浮遊攪拌培養では設備規模が大きくなる傾向がある。したがって、コストの削減を図るために、細胞等の培養密度を高めることが有効である。しかしながら、培養密度を高めていくと、細胞等の増殖が抑えられることが知られている。これは、細胞等の高密度化によって培養液（液体培地）中の老廃物（代謝物）の濃度が上昇し、これにより細胞等の増殖活性が低下するためである。細胞等に影響を与える老廃物の代表的なものとしては、乳酸が知られている。
したがって、細胞等を高密度状態で安定的に増殖させるためには、培養液中に蓄積する乳酸を除去することが望ましい。これに対し、例えば特許文献１には、濃度差に依存して成分を透過させる培養液成分調整膜を設けた送液ラインによって、細胞培養槽と成分調整液槽とを接続した細胞培養装置が開示されている。この細胞培養装置では、培養液中に蓄積した老廃物は、成分調整液側に移動することで培養液中での濃度が低下する。同時に、培養中に濃度が低下した栄養分は、成分調整液から培養液へ移動して補充される。これにより、培養液中の環境が細胞培養に適した状態に維持される。なお、成分調整液には、培養液そのものが用いられていた。
国際公開第２０１５／１２２５２８号
特許文献１に開示される細胞培養装置は、透析の原理を利用して培養液から老廃物を除去していた。したがって、十分な老廃物の除去を実現するために、成分調整液槽の容積を細胞培養槽の容積の１０倍以上に設定していた。このため、必要な液量が莫大でコストがかかるという課題があった。特に、成分調整液に培養液そのものを用いる場合には、高価な培地を大量に消費することになり、より一層のコストがかかってしまう。また、透析技術を利用して老廃物を除去する場合、培養装置の構造が複雑になるという課題もあった。
このため、透析技術以外の手法を用いた新規な乳酸除去技術が強く望まれる。また、透析技術以外の乳酸除去手法においても、より良好な細胞等の増殖環境を得るために、乳酸の除去効率の高さが当然に求められる。
本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的の１つは、乳酸の除去効率を高める技術を提供することにある。
上記課題を解決するために、本発明のある態様は乳酸吸着剤である。この乳酸吸着剤は、複数の金属水酸化物層と金属水酸化物層の層間に保持される陰イオンおよび水分子とを有する層状複水酸化物、ならびに層状複水酸化物の酸化物である層状複酸化物の少なくとも一方を含む。金属水酸化物層は、２価金属イオンＭ２＋および３価金属イオンＭ３＋を含み、層状複水酸化物における２価金属イオンＭ２＋と３価金属イオンＭ３＋とのモル比（Ｍ２＋／Ｍ３＋）は１．９～３．６であり、層状複酸化物におけるモル比は１．８～３．６である。この態様によれば、乳酸の除去効率を高めることができる。
上記態様において、２価金属イオンＭ２＋は、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋であってもよい。また、乳酸吸着剤は、乳酸を含有する溶液に接触して、溶液中の乳酸を吸着するものであってもよい。また、溶液は、グルコースを含有する、細胞または微生物の培養液であってもよい。
本発明の別の態様は、乳酸の除去方法である。当該除去方法は、上記いずれかの態様の乳酸吸着剤を乳酸に接触させることを含む。
なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を方法、装置、システムなどの間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。
本発明によれば、乳酸の除去効率を高めることができる。
図１（Ａ）～図１（Ｄ）は、実施の形態に係る乳酸の除去方法を説明するための模式図である。 各層状複水酸化物および層状複酸化物におけるＭｇ／Ａｌモル比の目標値と実測値とを示す図である。 乳酸およびグルコースの水溶液における層状複水酸化物および層状複酸化物の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。 細胞培養液における層状複水酸化物および層状複酸化物の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。 細胞培養液における層状複水酸化物および層状複酸化物の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。 層状複水酸化物または層状複酸化物を培地に添加した際の細胞増殖率を示す図である。
以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。各図面に示される同一又は同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、各図に示す各部の縮尺や形状は、説明を容易にするために便宜的に設定されており、特に言及がない限り限定的に解釈されるものではない。また、本明細書または請求項中に「第１」、「第２」等の用語が用いられる場合には、この用語はいかなる順序や重要度を表すものでもなく、ある構成と他の構成とを区別するためのものである。また、各図面において実施の形態を説明する上で重要ではない部材の一部は省略して表示する。
本実施の形態に係る乳酸吸着剤は、層状複水酸化物（Layered Double Hydroxide：ＬＤＨ）および層状複酸化物（Layered Double oxide：ＬＤＯ）の少なくとも一方を含む。層状複水酸化物は、複数の金属水酸化物層と、金属水酸化物層の層間に保持される陰イオンおよび水分子とを有する。金属水酸化物層は、構成金属として２価金属イオンＭ２＋および３価金属イオンＭ３＋を含む。具体的には、層状複水酸化物は、２価金属のＭ（ＯＨ）２におけるＭ２＋の一部がＭ３＋に置換されることにより正電荷を帯びた八面体層のホスト層（金属水酸化物層）と、ホスト層の正電荷を補償する陰イオンおよび層間水からなるゲスト層とで構成される。乳酸（乳酸イオン）は、ゲスト層の陰イオンとイオン交換されることで、層状複水酸化物に吸着される。
層状複水酸化物は、以下の化学式で表される。
［Ｍ２＋ １－ＸＭ３＋ ｘ（ＯＨ）２］［Ａｎ－ ｘ／ｎ・ｙＨ２Ｏ］
上記式中、Ｍ２＋は、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋およびＣｄ２＋からなる群から選択される２価の金属イオンである。Ｍ３＋は、Ａｌ３＋、Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ３＋、Ｉｎ３＋、Ｍｎ３＋およびＶ３＋からなる群から選択される３価の金属イオンである。Ａｎ－は、ＣＯ３ ２－、ＳＯ４ ２－、Ｃｌ－、ＯＨ－、ＳｉＯ４ ４－およびＮＯ３ －からなる群から選択されるｎ価の陰イオンである。ｎは１～３であり、ｙは１～１２である。ｘは以下に説明する２価金属イオンＭ２＋と３価金属イオンＭ３＋とのモル比（Ｍ２＋／Ｍ３＋）を満たす数である。
層状複水酸化物における２価金属イオンＭ２＋と３価金属イオンＭ３＋とのモル比は、１．９～３．６である。したがって、上記式中のｘは、０．２１７～０．３４５である。金属水酸化物層における当該モル比を調整することで、層状複水酸化物が有する電荷や金属水酸化物層の層間距離を変えることができ、これにより層状複水酸化物の乳酸吸着能を調整することができる。特に、モル比を１．９以上３．６以下とすることで、層状複水酸化物の乳酸吸着率を高めることができる。また、層状複水酸化物を効率よく合成することができる。モル比は、原子吸光光度計を用いて測定される。
層状複酸化物は、層状複水酸化物の酸化物である。層状複酸化物は、層状複水酸化物を例えば２００℃～５００℃で焼成して得られる。層状複酸化物を乳酸水溶液に接触させると、乳酸を層間に吸着した状態で層状複水酸化物の構造を再生する。層状複酸化物における２価金属イオンＭ２＋と３価金属イオンＭ３＋とのモル比は、１．８～３．６である。層状複酸化物についても、金属水酸化物層における当該モル比を調整することで、層状複酸化物が有する電荷や金属水酸化物層の層間距離を変えることができ、これにより層状複酸化物の乳酸吸着能を調整することができる。特に、モル比を１．８以上３．６以下とすることで、層状複酸化物の乳酸吸着率を高めることができる。また、層状複酸化物を効率よく合成することができる。
金属水酸化物層を構成する２価金属イオンＭ２＋は、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋であることが好ましく、Ｍｇ２＋であることがより好ましい。また、金属水酸化物層を構成する３価金属イオンＭ３＋は、Ａｌ３＋であることが好ましい。つまり、Ｍｇ－Ａｌ系ＬＤＨおよびＭｇ－Ａｌ系ＬＤＯがより好ましい。これにより、細胞等に対する層状複水酸化物および層状複酸化物の毒性を低減することができる。なお、金属水酸化物層を構成する金属イオンや陰イオンの種類が異なる複数種の層状複水酸化物および層状複酸化物を混合して用いてもよい。
上述の層状複水酸化物および層状複酸化物の少なくとも一方を含む乳酸吸着剤を乳酸に接触させることで、乳酸を層状複水酸化物あるいは層状複酸化物に吸着させることができる。特に、本実施の形態の乳酸吸着剤は、溶液中の乳酸を吸着除去する場合に、好適に用いることができる。この場合、乳酸吸着剤を乳酸含有溶液に接触させることで、溶液中の乳酸を吸着させることができる。また、乳酸吸着剤は、溶液が、グルコースを含有する細胞または微生物の培養液であった場合に、培養液中に残すべきグルコースに比べて除去対象である乳酸を高選択的に吸着することができる。なお、培養液の種類は特に限定されない。
また、溶液への乳酸吸着剤の添加量、言い換えれば溶液中の乳酸吸着剤の濃度は、好ましくは０．０００５ｇ／ｍＬ超であり、より好ましくは０．００５ｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは０．００５ｇ／ｍＬ超であり、さらに好ましくは０．０２５ｇ／ｍＬ以上である。また、当該添加量は、好ましくは０．２ｇ／ｍＬ未満であり、より好ましくは０．１ｇ／ｍＬ以下である。乳酸吸着剤の添加量を０．０００５ｇ／ｍＬ超とすることで、乳酸吸着率をより確実に高めることができる。また、乳酸吸着剤の添加量を０．２ｇ／ｍＬ未満とすることで、グルコース吸着率をより確実に抑制でき、より効率よく細胞等を培養することができる。乳酸吸着率は、溶液中の全乳酸量に対する吸着した乳酸量の割合である。グルコース吸着率は、溶液中の全グルコース量に対する吸着したグルコース量の割合である。
培養液を用いて培養される細胞および微生物は、特に限定されない。例えば培養細胞は、ヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞および分化誘導細胞；間葉系幹細胞（ＭＳＣ細胞）、ネフロン前駆細胞等の体性幹細胞；ヒト近位尿細管上皮細胞、ヒト遠位尿細管上皮細胞、ヒト集合管上皮細胞等の組織細胞；ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）等の抗体産生細胞株；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（ＳＦ９細胞）等のヒト以外の動物由来の抗体産生細胞株等が挙げられる。これらの細胞は、大量培養が特に望まれる細胞であるため、本実施の形態に係る乳酸吸着剤の使用対象としてより好ましい。
（乳酸の除去方法）
本実施の形態に係る乳酸の除去方法は、上述した乳酸吸着剤を乳酸（乳酸イオン）に接触させることを含む。好ましくは、乳酸を含有する溶液に乳酸吸着剤を接触させることを含む。乳酸吸着剤を乳酸に接触させる方法は特に限定されないが、以下の態様が例示される。図１（Ａ）～図１（Ｄ）は、実施の形態に係る乳酸の除去方法を説明するための模式図である。以下では、培養液からの乳酸除去を例に挙げて説明するが、他の溶液からの乳酸除去についても同様に実施することができる。
図１（Ａ）に示すように、第１の態様では、カラム等の容器２に乳酸吸着剤４が充填された吸着モジュール６が用意される。容器２は、容器２の内外を連通する入口２ａと出口２ｂとを有する。乳酸吸着剤４は、例えば粒子状である。吸着モジュール６は、循環路８を介して、スピナーフラスコ等の培養容器１０に接続される。循環路８は、培養容器１０と容器２の入口２ａとを接続する往路８ａと、容器２の出口２ｂと培養容器１０とを接続する復路８ｂとを含む。往路８ａの途中には、ポンプ１２が接続される。培養容器１０中には、培養液１４と、細胞１６とが収容される。なお、ポンプ１２は復路８ｂに配置されてもよい。
ポンプ１２が駆動すると、培養液１４は培養容器１０から吸引され、往路８ａを介して吸着モジュール６の容器２内に送られる。容器２内に送り込まれた培養液１４は、復路８ｂを介して培養容器１０内に戻される。培養液１４は、培養容器１０と吸着モジュール６との間を循環する過程で、容器２に充填された乳酸吸着剤４と接触する。このとき、培養液１４中の乳酸は、乳酸吸着剤４に吸着される。この結果、培養液１４中の乳酸が除去される。往路８ａにおける培養容器１０に接続される側の端部には、図示しないフィルタが設けられる。これにより、細胞１６が吸着モジュール６側に流れることが抑制される。なお、培養容器１０と吸着モジュール６との間で培養液１４を循環させる過程で、細胞１６の培養に必要なグルコースやタンパク質等の培地成分が培養液１４に補充されてもよい。
つまり、第１の態様では、乳酸吸着剤４を有する吸着モジュール６と、細胞または微生物、および培養液１４が収容される培養容器１０と、吸着モジュール６と培養容器１０とをつなぎ培養液１４を循環させる循環路８と、を備える培養装置を用いることで、培養液１４中の乳酸が除去される。
図１（Ｂ）に示すように、第２の態様では、培養容器１０の内壁面に乳酸吸着剤４が支持されている。培養容器１０中には、培養液１４と、細胞１６とが収容されている。したがって、培養液１４は、培養容器１０の内壁面において露出する乳酸吸着剤４に接触する。これにより、培養液１４中の乳酸を乳酸吸着剤４に吸着させることができる。培養容器１０としては、スピナーフラスコ、シャーレ、ウェルプレート、セルカルチャーインサート、マイクロスフェア等が例示される。
培養容器１０の内壁面に乳酸吸着剤４を支持させる方法としては、例えば、乳酸吸着剤４を培養容器１０の内壁面に接着させる方法や、培養容器１０が樹脂製である場合には、予め乳酸吸着剤４を混合した樹脂で培養容器１０を成形する方法等が挙げられる。つまり、第２の態様では、培養容器１０と、培養容器１０の内壁面に支持される乳酸吸着剤４と、を備える培養装置を用いることで、培養液１４中の乳酸が除去される。
図１（Ｃ）に示すように、第３の態様では、培養容器１０は、多孔質膜等の隔膜１８によって容器内部が上段１０ａと下段１０ｂに区切られた構造を有する。このような培養容器１０としては、セルカルチャーインサートが例示される。上段１０ａには培養液１４と細胞１６が収容され、下段１０ｂには培養液１４と乳酸吸着剤４が収容される。培養液１４は、隔膜１８を通過して上段１０ａと下段１０ｂとの間を行き来することができる。一方、細胞１６および乳酸吸着剤４は、隔膜１８を通過することができない。
このような構造において、培養液１４は、下段１０ｂに収容された乳酸吸着剤４に接触する。これにより、培養液１４中の乳酸を乳酸吸着剤４に吸着させることができる。つまり、第３の態様では、培養容器１０と、乳酸吸着剤４と、培養容器１０内を乳酸吸着剤４が収容される第１空間と細胞１６が収容される第２空間とに区画する隔膜１８と、を備える培養装置を用いることで、培養液１４中の乳酸が除去される。
図１（Ｄ）に示すように、第４の態様では、粒子状の乳酸吸着剤４を培養液１４中に分散、沈降あるいは浮遊させる。これにより、培養液１４中の乳酸を乳酸吸着剤４に吸着させることができる。なお、乳酸吸着剤４は、細胞１６に貪食されることを防ぐために、所定サイズ以上、例えば１０μｍ以上の大きさであることが好ましい。つまり、第４の態様では、培養容器１０と、培養容器１０内の培養液１４に添加される乳酸吸着剤４と、を備える培養装置を用いることで、培養液１４中の乳酸が除去される。
好ましくは、乳酸吸着剤は、ポリビニルアルコール等の樹脂、コラーゲンやアルギン酸、ゼラチン等の生体由来ゲル等で被覆される。これにより、細胞等に影響を与え得る微粒子が乳酸吸着剤から培養液中に流出することを抑制することができる。あるいは、乳酸吸着剤は、セラミックスバインダー、樹脂バインダー、生体由来ゲル等と層状複水酸化物とを混練して成形される。これによっても、微粒子の流出を抑制することができる。セラミックスバインダーとしては、アルミナバインダー、コロイダルシリカ等が例示される。樹脂バインダーとしては、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース等が例示される。生体由来ゲルとしては、コラーゲン、アルギン酸、ゼラチン等が例示される。
溶液中の乳酸濃度を検出する場合、その検出方法は特に限定されないが、培地成分アナライザーを使用することが好ましい。また、所定の測定試薬を用いた比色法、酵素の基質特異性を利用する酵素電極法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を利用して、乳酸濃度を検出することができる。
以上説明したように、本実施の形態に係る乳酸吸着剤は、複数の金属水酸化物層と金属水酸化物層の層間に保持される陰イオンおよび水分子とを有する層状複水酸化物、ならびに層状複水酸化物の酸化物である層状複酸化物の少なくとも一方を含む。金属水酸化物層は、２価金属イオンＭ２＋および３価金属イオンＭ３＋を含み、層状複水酸化物における２価金属イオンＭ２＋と３価金属イオンＭ３＋とのモル比（Ｍ２＋／Ｍ３＋）は１．９～３．６であり、層状複酸化物におけるモル比は１．８～３．６である。また、本実施の形態に係る乳酸の除去方法は、この乳酸吸着剤を乳酸に接触させることを含む。
層状複水酸化物および層状複酸化物における２価金属イオンＭ２＋と３価金属イオンＭ３＋とのモル比を上述の範囲に調整することで、乳酸の吸着率を高めることができる。これにより、乳酸の除去効率を高めることができる。
また、本実施の形態によれば、従来の透析技術を用いて乳酸を除去する場合とは異なり、莫大な量の溶液を使用せずに乳酸を除去することができる。よって、低コストに乳酸を除去することができる。特に、溶液が細胞等の培養液である場合には、従来の透析技術に比べて培養液の使用量を減らすことができる。一般的に培養液は高価であるため、より一層の低コスト化が可能である。また、乳酸吸着剤を乳酸含有溶液に接触させるだけで乳酸を除去できるため、本実施の形態によれば培養装置の構造の簡略化を図ることができる。
また、乳酸の除去により細胞等を高密度に大量培養することができる。また、乳酸によって培地のｐＨが低下することも抑制できるため、この点でも細胞を高密度に大量培養することが可能となる。さらに、細胞が多能性幹細胞である場合には、乳酸の除去によって細胞の高密度大量培養が可能となることに加え、細胞が未分化の状態、つまり細胞の多分化能（分化多能性）を維持することができる。したがって、生体物質生産や分化誘導組織作製に好適な細胞を大量に得ることができる。これにより、医薬品製造や再生医療に要するコストを削減することができる。
また、本実施の形態の乳酸吸着剤は、有用成分であるグルコースに対して乳酸を高選択的に吸着することができる。このため、より効率的な細胞培養が可能となる。よって、本実施の形態の乳酸吸着剤は、グルコースを含有する培養液における乳酸の除去に特に有用である。なお、本実施の形態の乳酸吸着剤は、他の細胞老廃物の吸着剤と併用してもよい。
また、好ましくは、金属水酸化物層を構成する２価金属イオンＭ２＋は、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋である。これにより、細胞等に対する層状複水酸化物および層状複酸化物の毒性を低減することができる。よって、乳酸吸着剤に起因して細胞や微生物の増殖率が低下することを抑制することができる。また、好ましくは、金属水酸化物層を構成する３価金属Ｍ３＋は、Ａｌ３＋である。
以上、本発明の実施の形態について詳細に説明した。前述した実施の形態は、本発明を実施するにあたっての具体例を示したものにすぎない。実施の形態の内容は、本発明の技術的範囲を限定するものではなく、請求の範囲に規定された発明の思想を逸脱しない範囲において、構成要素の変更、追加、削除等の多くの設計変更が可能である。設計変更が加えられた新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態および変形それぞれの効果をあわせもつ。前述の実施の形態では、このような設計変更が可能な内容に関して、「本実施の形態の」、「本実施の形態では」等の表記を付して強調しているが、そのような表記のない内容でも設計変更が許容される。以上の構成要素の任意の組み合わせも、本発明の態様として有効である。
以下、本発明の実施例を説明するが、実施例は本発明を好適に説明するための例示に過ぎず、なんら本発明を限定するものではない。
［乳酸吸着剤の合成］
（Ｍｇ／Ａｌモル比＝１．０のＭｇ／Ａｌ混合溶液を用いた第１化合物の合成）
まず、イオン交換水を入れた三口フラスコを用意した。そして、窒素雰囲気、３０℃の条件下で、Ｍｇ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｍｇ／Ａｌモル比＝１．０）をイオン交換水に滴下しながら３００ｒｐｍで攪拌した。滴下開始から１時間経過後、反応溶液をろ過、水洗して生成物を得た。得られた生成物を４０℃、減圧下で４０時間乾燥して、第１化合物を得た。この合成は、Ｍｇ／Ａｌモル比が１．０であるＮＯ３型Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＨの合成を目的としたものである。
（Ｍｇ／Ａｌモル比＝２．０のＭｇ／Ａｌ混合溶液を用いた第２化合物の合成）
Ｍｇ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｍｇ／Ａｌモル比＝２．０）を用いた点を除いて第１化合物の合成と同じ手順で、第２化合物を合成した。この合成は、Ｍｇ／Ａｌモル比が２．０であるＮＯ３型Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＨの合成を目的としたものである。
（Ｍｇ／Ａｌモル比＝３．０のＭｇ／Ａｌ混合溶液を用いた第３化合物の合成）
Ｍｇ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｍｇ／Ａｌモル比＝３．０）を用いた点を除いて第１化合物の合成と同じ手順で、第３化合物を合成した。この合成は、Ｍｇ／Ａｌモル比が３．０であるＮＯ３型Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＨの合成を目的としたものである。
（Ｍｇ／Ａｌモル比＝４．０のＭｇ／Ａｌ混合溶液を用いた第４化合物の合成）
Ｍｇ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｍｇ／Ａｌモル比＝４．０）を用いた点を除いて第１化合物の合成と同じ手順で、第４化合物を合成した。この合成は、Ｍｇ／Ａｌモル比が４．０であるＮＯ３型Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＨの合成を目的としたものである。
（Ｍｇ／Ａｌモル比＝５．０のＭｇ／Ａｌ混合溶液を用いた第５化合物の合成）
Ｍｇ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｍｇ／Ａｌモル比＝５．０）を用いた点を除いて第１化合物の合成と同じ手順で、第５化合物を合成した。この合成は、Ｍｇ／Ａｌモル比が５．０であるＮＯ３型Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＨの合成を目的としたものである。
（第６化合物の合成）
第１化合物を電気炉に入れ、５００℃で２時間仮焼して第６化合物を得た。この合成は、Ｍｇ／Ａｌモル比が１．０であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＯの合成を目的としたものである。
（第７化合物の合成）
第２化合物を電気炉に入れ、５００℃で２時間仮焼して第７化合物を得た。この合成は、Ｍｇ／Ａｌモル比が２．０であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＯの合成を目的としたものである。
（第８化合物の合成）
第３化合物を電気炉に入れ、５００℃で２時間仮焼して第８化合物を得た。この合成は、Ｍｇ／Ａｌモル比が３．０であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＯの合成を目的としたものである。
（第９化合物の合成）
第４化合物を電気炉に入れ、５００℃で２時間仮焼して第９化合物を得た。この合成は、Ｍｇ／Ａｌモル比が４．０であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＯの合成を目的としたものである。
（第１０化合物の合成）
第５化合物を電気炉に入れ、５００℃で２時間仮焼して第１０化合物を得た。この合成は、Ｍｇ／Ａｌモル比が５．０であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＯの合成を目的としたものである。
［ＬＤＨ合成およびＬＤＯ合成の確認］
Ｘ線回折装置（ＲＩＮＴ－２２００ＶＨＦ：理学社製）を用いた粉末Ｘ線回折によって、上述の合成手順で得られた第１～１０化合物の構造を確認した。Ｍｇ／Ａｌモル比が１．０である層状複水酸化物を狙って合成した第１化合物については、複数の化合物が混在しており、粉末Ｘ線回折によって層状複水酸化物に由来するピークのみを確認できなかった（つまり他の化合物由来のピークも混在していた）。同様に、Ｍｇ／Ａｌモル比が５．０である層状複水酸化物を狙って合成した第５化合物についても、粉末Ｘ線回折によって層状複水酸化物に由来するピークのみを確認できなかった。また、Ｍｇ／Ａｌモル比が１．０である層状複酸化物を狙って合成した第６化合物、およびＭｇ／Ａｌモル比が５．０である層状複酸化物を狙って合成した第１０化合物についても、層状複酸化物に由来するピークのみを確認できなかった。
つまり、Ｍｇ／Ａｌモル比が１．０である層状複水酸化物あるいは層状複酸化物を狙った合成、およびＭｇ／Ａｌモル比が５．０である層状複水酸化物あるいは層状複酸化物を狙った合成では、層状複水酸化物および層状複酸化物を単一相で合成できないことが確認された。Ｍｇ／Ａｌモル比１．０の層状複水酸化物や層状複酸化物を狙った合成では、Ｍｇ／Ａｌモル比が２付近の層状複水酸化物や層状複酸化物が合成されると考えられる。同様に、Ｍｇ／Ａｌモル比５．０の層状複水酸化物や層状複酸化物を狙った合成では、Ｍｇ／Ａｌモル比が４付近の層状複水酸化物や層状複酸化物が合成されると考えられる。また、これらの合成では、２価金属イオンの酸化物等の不純物が増加すると考えられる。
一方、Ｍｇ／Ａｌモル比２．０の層状複水酸化物を狙って合成した第２化合物については、粉末Ｘ線回折によって層状複水酸化物に由来する単一のピークを確認できた。同様に、Ｍｇ／Ａｌモル比３．０の層状複水酸化物を狙って合成した第３化合物、Ｍｇ／Ａｌモル比４．０の層状複水酸化物を狙って合成した第４化合物、Ｍｇ／Ａｌモル比２．０の層状複酸化物を狙って合成した第７化合物、Ｍｇ／Ａｌモル比３．０の層状複酸化物を狙って合成した第８化合物、およびＭｇ／Ａｌモル比４．０の層状複酸化物を狙って合成した第９化合物についても、層状複水酸化物あるいは層状複酸化物に由来する単一のピークを確認できた。つまり、Ｍｇ／Ａｌモル比２．０、Ｍｇ／Ａｌモル比３．０、およびＭｇ／Ａｌモル比４．０の層状複水酸化物あるいは層状複酸化物を狙った合成では、層状複水酸化物および層状複酸化物を単一相で合成できることが確認された。
ＩＣＰ発光分析装置（ｉＣＡＰ６５００ Ｄｕｏ：ThermoFisher Scientific社製）を用いて、合成した層状複水酸化物および層状複酸化物の組成を確認した。結果を図２に示す。図２は、各層状複水酸化物および層状複酸化物におけるＭｇ／Ａｌモル比の目標値と実測値とを示す図である。図２に示すように、Ｍｇ／Ａｌモル比２．０を狙って合成した、つまりＭｇ／Ａｌモル比の目標値が２．０であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＨは、Ｍｇ／Ａｌモル比の実測値は１．９であった。目標値３．０のＭｇ－Ａｌ ＬＤＨの実測値は３．３、目標値４．０のＭｇ－Ａｌ ＬＤＨの実測値は３．６であった。目標値２．０であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＯの実測値は１．８、目標値３．０のＭｇ－Ａｌ ＬＤＯの実測値は２．７、目標値４．０のＭｇ－Ａｌ ＬＤＯの実測値は３．６であった。
［乳酸およびグルコースの水溶液（水系溶液）における吸着剤性能の解析］
乳酸ナトリウム（関東化学社）とグルコース（富士フイルム和光純薬社）とを純水に添加し、グルコース濃度１０００ｐｐｍ、乳酸濃度１０ｍＭの水溶液を作製した。この水溶液２０ｍＬを複数の５０ｍＬ三角フラスコに分注した。また、各種の乳酸吸着剤０．５ｇを各三角フラスコの水溶液に添加した。したがって、乳酸吸着剤の濃度は０．０２５ｇ／ｍＬである。乳酸吸着剤には、上述のとおりＭｇ／Ａｌモル比を実測したＭｇ／Ａｌ ＬＤＨおよびＭｇ／Ａｌ ＬＤＯを用いた。
３７℃、１５０ｒｐｍで水溶液を２４時間攪拌した。２４時間経過後、０．１μｍフィルタで水溶液と乳酸吸着剤を分離した。そして、ＨＰＬＣ（日本分光社）を用いて水溶液中の乳酸濃度およびグルコース濃度を測定した。また、以下の数式に基づいて、各吸着剤における乳酸の吸着率およびグルコースの吸着率を算出した。
吸着率（％）＝［吸着前濃度（ｍＭまたはｐｐｍ）－吸着後濃度（ｍＭまたはｐｐｍ）］／吸着前濃度（ｍＭまたはｐｐｍ）×１００
結果を図３に示す。図３は、乳酸およびグルコースの水溶液における層状複水酸化物および層状複酸化物の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図３に示すように、Ｍｇ／Ａｌモル比が１．９～３．６であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＨと、Ｍｇ／Ａｌモル比が１．８～３．６であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＯとは、高い乳酸吸着能を有することが確認された。特に、Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＨにおいては、Ｍｇ／Ａｌモル比１．９のものが最も高い乳酸吸着率を示した。また、Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＯにおいては、Ｍｇ／Ａｌモル比１．８のものが最も高い乳酸吸着率を示した。また、いずれのＭｇ－Ａｌ ＬＤＨおよびＭｇ－Ａｌ ＬＤＯも、水溶液中のグルコースをほとんど吸着しないことが確認された。
以下に挙げる他の化合物についても、合成と吸着性能の解析とを実施した。
（Ｃｕ／Ａｌモル比＝３．０のＣｕ／Ａｌ混合溶液を用いた第１１化合物の合成）
イオン交換水を入れた三口フラスコを用意した。そして、窒素雰囲気、３０℃の条件下で、Ｃｕ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｃｕ／Ａｌモル比＝３．０）をイオン交換水に滴下しながら、且つｐＨ８．０に調整しながら３００ｒｐｍで攪拌した。滴下開始から１時間経過後、反応溶液をろ過、水洗して生成物を得た。得られた生成物を４０℃、減圧下で４０時間乾燥して、第１１化合物を得た。第１１化合物の金属モル比（Ｃｕ／Ａｌ）は３．０、乳酸吸着率は７２％、グルコース吸着率は４．２％であった。したがって、第１１化合物においても、高い乳酸吸着能を有することが確認された。
（Ｎｉ／Ａｌモル比＝３．０のＮｉ／Ａｌ混合溶液を用いた第１２化合物の合成）
イオン交換水を入れた三口フラスコを用意した。そして、窒素雰囲気、３０℃の条件下で、Ｎｉ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｎｉ／Ａｌモル比＝３．０）をイオン交換水に滴下しながら、且つｐＨ１０．５に調整しながら３００ｒｐｍで攪拌した。滴下開始から１時間経過後、反応溶液をろ過、水洗して生成物を得た。得られた生成物を４０℃、減圧下で４０時間乾燥して、第１２化合物を得た。第１２化合物の金属モル比（Ｎｉ／Ａｌ）は２．６、乳酸吸着率は７７％、グルコース吸着率は５．２％であった。したがって、第１２化合物においても、高い乳酸吸着能を有することが確認された。
（Ｃａ／Ａｌモル比＝３．０のＣａ／Ａｌ混合溶液を用いた第１３化合物の合成）
イオン交換水を入れた三口フラスコを用意した。そして、窒素雰囲気、３０℃、ｐＨ１２．５の条件下で、Ｃａ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｃａ／Ａｌモル比＝３．０）をイオン交換水に滴下しながら３００ｒｐｍで攪拌した。滴下開始から１時間経過後に滴下を終了し、条件を窒素雰囲気、８０℃、ｐＨ１２．５に変更した。条件変更から２時間経過後、反応溶液をろ過、水洗して生成物を得た。得られた生成物を４０℃、減圧下で４０時間乾燥して、第１３化合物を得た。第１３化合物の金属モル比（Ｃａ／Ａｌ）は２．５、乳酸吸着率は４８％、グルコース吸着率は２２％であった。したがって、第１３化合物においても、高い乳酸吸着能を有することが確認された。
［細胞培養液における吸着剤性能の解析１］
多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ：味の素社）に乳酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社）を添加し、グルコース濃度２５０ｍｇ／ｄＬ、乳酸濃度１０ｍＭの培地を作製した。この培地２０ｍＬを複数の５０ｍＬチューブ（ThermoFisher Scientific社）に分注した。また、各種の乳酸吸着剤０．５ｇを各チューブの培地に添加した。したがって、乳酸吸着剤の濃度は０．０２５ｇ／ｍＬである。乳酸吸着剤には、上述のとおりＭｇ／Ａｌモル比を実測したＭｇ／Ａｌ ＬＤＨおよびＭｇ／Ａｌ ＬＤＯを用いた。
３７℃、６０回／分で培地を２４時間振とうした。２４時間経過後、０．２２μｍフィルタで培地と乳酸吸着剤とを分離した。そして、血液ガス分析装置（ＡＢＬ８００ ＦＬＥＸ：ラジオメーター社）を用いて、培地中の乳酸濃度およびグルコース濃度を測定した。また、上記数式に基づいて、各乳酸吸着剤における乳酸の吸着率およびグルコースの吸着率を算出した。
結果を図４に示す。図４は、細胞培養液における層状複水酸化物および層状複酸化物の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図４に示すように、水系溶液の場合に比べて多少は吸着率が低下するものの、Ｍｇ／Ａｌモル比が１．９～３．６であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＨと、Ｍｇ／Ａｌモル比が１．８～３．６であるＭｇ－Ａｌ ＬＤＯとは、細胞培養液中でも乳酸を吸着できることが確認された。特に、Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＨにおいては、Ｍｇ／Ａｌモル比１．９のものが最も高い乳酸吸着率を示した。また、Ｍｇ－Ａｌ ＬＤＯにおいては、Ｍｇ／Ａｌモル比２．７のものが最も高い乳酸吸着率を示した。また、いずれのＭｇ－Ａｌ ＬＤＨおよびＭｇ－Ａｌ ＬＤＯも、乳酸吸着率に比べてグルコース吸着率が低いことが確認された。
［細胞培養液における吸着剤性能の解析２］
多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ：味の素社）に乳酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬社）を添加し、グルコース濃度２５０ｍｇ／ｄＬ、乳酸濃度１０ｍＭの培地を作製した。この培地２０ｍＬを複数の５０ｍＬチューブ（ThermoFisher Scientific社）に分注した。また、各種の乳酸吸着剤を各チューブの培地に添加した。乳酸吸着剤には、Ｍｇ／Ａｌモル比の実測値が１．９であるＭｇ／Ａｌ ＬＤＨと、Ｍｇ／Ａｌモル比の実測値が２．７であるＭｇ／Ａｌ ＬＤＯを用いた。乳酸吸着剤の添加量（濃度）は、０．１ｇ（０．００５ｇ／ｍＬ）、０．５ｇ（０．０２５ｇ／ｍＬ）、１．０ｇ（０．０５ｇ／ｍＬ）、２．０ｇ（０．１ｇ／ｍＬ）とした。
３７℃、６０回／分で培地を２４時間振とうした。２４時間経過後、０．２２μｍフィルタで培地と乳酸吸着剤とを分離した。そして、血液ガス分析装置（ＡＢＬ８００ ＦＬＥＸ：ラジオメーター社）を用いて、培地中の乳酸濃度およびグルコース濃度を測定した。また、上記数式に基づいて、各乳酸吸着剤における乳酸の吸着率およびグルコースの吸着率を算出した。
結果を図５に示す。図５は、細胞培養液における層状複水酸化物および層状複酸化物の乳酸吸着率およびグルコース吸着率を示す図である。図５に示すように、吸着剤濃度が増加するにつれて乳酸吸着率が上昇することが確認された。特に、吸着剤濃度が０．０２５ｇ／ｍＬ以上のときに、より良好な乳酸吸着率が得られることが確認された。同時にグルコース吸着率も上昇するが、いずれの吸着剤濃度においてもグルコース吸着率は乳酸吸着率に比べて低かった。
［乳酸吸着剤の毒性評価］
（ＮＯ３型Ｃｕ－Ａｌ ＬＤＨの合成）
イオン交換水を入れた三口フラスコを用意した。そして、窒素雰囲気、３０℃、ｐＨ１０．５の条件下で、Ｃｕ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｃｕ／Ａｌモル比＝３．０）をイオン交換水に滴下しながら３００ｒｐｍで攪拌した。滴下開始から１時間経過後、反応溶液をろ過、水洗して生成物を得た。得られた生成物を４０℃、減圧下で４０時間乾燥して、保持イオンがＮＯ ３ － であるＮＯ３型Ｃｕ－Ａｌ ＬＤＨを得た。
（Ｃｕ－Ａｌ ＬＤＯの合成）
ＮＯ３型Ｃｕ－Ａｌ ＬＤＨを電気炉に入れ、２００℃で４時間仮焼してＣｕ－Ａｌ ＬＤＯを得た。
（ＮＯ３型Ｎｉ－Ａｌ ＬＤＨの合成）
イオン交換水を入れた三口フラスコを用意した。そして、窒素雰囲気、３０℃、ｐＨ１０．５の条件下で、Ｎｉ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｎｉ／Ａｌモル比＝３．０）をイオン交換水に滴下しながら３００ｒｐｍで攪拌した。滴下開始から１時間経過後、反応溶液をろ過、水洗して生成物を得た。得られた生成物を４０℃、減圧下で４０時間乾燥して、保持イオンがＮＯ ３ － であるＮＯ３型Ｎｉ－Ａｌ ＬＤＨを得た。
（ＮＯ３型Ｃａ－Ａｌ ＬＤＨの合成）
イオン交換水を入れた三口フラスコを用意した。そして、窒素雰囲気、３０℃、ｐＨ１２．５の条件下で、Ｃａ（ＮＯ３）２－Ａｌ（ＮＯ３）３混合溶液（Ｃａ／Ａｌモル比＝３．０）をイオン交換水に滴下しながら３００ｒｐｍで攪拌した。滴下開始から１時間経過後に滴下を終了し、条件を窒素雰囲気、８０℃、ｐＨ１２．５に変更した。条件変更から２時間経過後、反応溶液をろ過、水洗して生成物を得た。得られた生成物を４０℃、減圧下で４０時間乾燥して、保持イオンがＮＯ３ －であるＮＯ３型Ｃａ－Ａｌ ＬＤＨを得た。
多能性幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ：味の素社）２０ｍＬを複数の容器に分注した。そして、各種の乳酸吸着剤０．５ｇを各培地に添加して混合し、４℃で２４時間静置した。したがって、乳酸吸着剤の濃度は０．０２５ｇ／ｍＬである。乳酸吸着剤には、ＮＯ３型Ｃｕ－Ａｌ ＬＤＨ、Ｃｕ－Ａｌ ＬＤＯ、ＮＯ３型Ｎｉ－Ａｌ ＬＤＨ、ＮＯ３型Ｃａ－Ａｌ ＬＤＨ、Ｍｇ／Ａｌモル比の実測値が３．３であるＮＯ３型Ｍｇ／Ａｌ ＬＤＨおよびＭｇ／Ａｌモル比の実測値が２．７であるＭｇ／Ａｌ ＬＤＯを用いた。２４時間経過後、０．２２μｍフィルタで培地と乳酸吸着剤とを分離した。
各培地に、ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株：Takahashi K, et al. (2007) Cell）を２００００個播種し、１２０時間培養した。培地は２４時間毎に交換した。１２０時間経過後、各培地における細胞数をＴＣ２０全自動セルカウンター（バイオラッド社）を用いて計測した。そして、以下の数式に基づいて、各培地における細胞増殖率を算出した。
細胞増殖率（％）＝［培養後細胞数－播種細胞数］／播種細胞数×１００
この結果、ＮＯ３型Ｃｕ－Ａｌ ＬＤＨを添加した培地における細胞増殖率が最も低かった。そこで、ＮＯ３型Ｃｕ－Ａｌ ＬＤＨの細胞増殖率を基準として、その他のＬＤＨを添加した培地における細胞増殖率の比率（以下では、単に細胞増殖率とする）を算出した。結果を図６に示す。図６は、層状複水酸化物または層状複酸化物を培地に添加した際の細胞増殖率を示す図である。図６に示すように、細胞増殖率は、ＮＯ３型Ｃｕ－Ａｌ ＬＤＨ、Ｃｕ－Ａｌ ＬＤＯ、ＮＯ３型Ｎｉ－Ａｌ ＬＤＨ、ＮＯ３型Ｃａ－Ａｌ ＬＤＨ、ＮＯ３型Ｍｇ／Ａｌ ＬＤＨ、Ｍｇ／Ａｌ ＬＤＯの順に高くなることが確認された。
以上より、２価金属イオンＭ２＋と３価金属イオンＭ３＋とのモル比（Ｍ２＋／Ｍ３＋）が１．９～３．６である層状複水酸化物、および当該モル比が１．８～３．６である層状複酸化物の少なくとも一方を含む乳酸吸着剤が、乳酸水溶液中および培地中のいずれにおいても、優れた乳酸吸着能を有することが確認された。また、グルコースに対して乳酸を高選択的に吸着することが確認された。本実施の形態の乳酸吸着剤によるグルコースの吸着量は、細胞等の培養に与える影響が無視し得るレベルであった。このことから、本実施の形態の乳酸吸着剤がグルコースを含む培地中の乳酸除去に好適であることが確認された。また、培地中に含まれる主要な金属イオンであるＭｇ２＋やＣａ２＋を金属水酸化物層の構成金属として用いることで、細胞等の増殖に与える悪影響を低減できることが確認された。
２ 容器、 ４ 乳酸吸着剤、 ６ 吸着モジュール、 ８ 循環路、 １０ 培養容器、 １２ ポンプ、 １４ 培養液、 １６ 細胞、 １８ 隔膜。

Claims (4)

  1. 複数の金属水酸化物層と前記金属水酸化物層の層間に保持される陰イオンおよび水分子とを有する層状複水酸化物、ならびに前記層状複水酸化物の酸化物である層状複酸化物の少なくとも一方を含み、
    前記金属水酸化物層は、２価金属イオンＭ２＋および３価金属イオンＭ３＋を含み、
    前記層状複水酸化物における前記２価金属イオンＭ２＋と前記３価金属イオンＭ３＋とのモル比（Ｍ２＋／Ｍ３＋）は１．９～３．６であり、
    前記層状複酸化物における前記モル比は１．８～３．６であり、
    乳酸およびグルコースを含有する溶液に接触して前記溶液中の乳酸を吸着する乳酸吸着剤。
  2. 前記２価金属イオンＭ２＋は、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋である請求項１に記載の乳酸吸着剤。
  3. 前記溶液は、細胞または微生物の培養液である請求項１または２に記載の乳酸吸着剤。
  4. 請求項１乃至３のいずれか１項に記載の乳酸吸着剤を、乳酸およびグルコースを含有する溶液に接触させることを含む乳酸の除去方法。
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