JP7488544B2

JP7488544B2 - 浮遊培養装置及び浮遊培養方法

Info

Publication number: JP7488544B2
Application number: JP2019191368A
Authority: JP
Inventors: 俊之矢口; 聡井上
Original assignee: Tokyo Denki University
Current assignee: Tokyo Denki University
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2024-05-22
Anticipated expiration: 2039-10-18
Also published as: JP2021065118A

Description

本発明は、浮遊培養装置及び浮遊培養方法に関する。

近年、医療分野において、細胞を用いて人工的に組織や臓器を作製し、傷害を受けた組織や臓器の機能を回復させる再生医療が注目されている。ヒトを含む多細胞生物の組織や臓器は、複数の細胞からなる３次元構造を有する。そこで、生体外で３次元構造を有する細胞組織を培養する技術が提案されている。

米国特許出願公開第２０１６／００９１４８７号明細書

特許文献１に開示された技術は、浸水性ポリマー相（ａｎｉｍｍｅｒｓｉｏｎａｑｕｅｏｕｓｐｏｌｙｍｅｒｐｈａｓｅ）と液滴ポリマー相（ａｄｒｏｐｌｅｔａｑｕｅｏｕｓｐｏｌｙｍｅｒｐｈａｓｅ）とからなる水性二相系の培養液を用い、該液滴ポリマー相中で細胞の３次元凝集体を培養する技術である。このような技術によれば、液滴の蒸発を防ぎ、また培地交換による悪影響を受けずに細胞を培養できる。しかし、浸水性ポリマー相の底部に沈降した液滴ポリマー相中で培養を行うため、培養時に細胞が平面状に広がってしまい、十分に厚みのある細胞を培養できない問題がある。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、十分な厚みを有する３次元組織の培養が可能な培養装置及び培養方法を提供することを目的とする。

本発明は、外相と、前記外相中で浮遊する培養相としての内相と、を含む水性二相培養液と、前記水性二相培養液を収容する培養槽と、前記内相の浮遊状態を維持する浮遊手段と、を備える、浮遊培養装置に関する。

前記浮遊手段は、前記培養槽中で前記外相を流動させることで、前記内相の浮遊状態を維持してもよい。

前記培養槽中で前記外相が流動する流速は、前記培養槽における前記内相の浮遊状態に応じて制御されてもよい。

前記浮遊培養装置は、前記培養槽から流出した前記外相を回収し、再び前記培養槽に流入させて循環させる循環機構を備えていてもよい。

前記内相の比重は、前記外相の比重よりも大きく、前記浮遊手段は、前記培養槽の下方から前記外相を流入させると共に、前記培養槽の上方から前記外相を流出させることで、前記内相の浮遊状態を維持してもよい。

前記浮遊手段は、前記培養槽を回転させることで、前記内相の浮遊状態を維持してもよい。

前記水性二相培養液は、デキストラン相と、ポリエチレングリコール相と、からなるものでもよい。

前記外相は、ポリエチレングリコール相であり、前記内相は、デキストラン相であってもよい。

また、本発明は、培養液中で細胞を培養する浮遊培養方法であって、前記培養液は、外相と、前記外相中で浮遊する培養相としての内相と、を含む水性二相培養液であり、前記内相の浮遊状態を維持して培養を行う、浮遊培養方法に関する。

前記浮遊培養方法は、前記培養槽中で前記外相を流動させることで、前記内相の浮遊状態を維持してもよい。

前記浮遊培養方法は、前記培養槽から流出した前記外相を回収し、再び前記培養槽に流入させて循環させてもよい。

前記内相の比重は、前記外相の比重よりも大きく、前記培養槽の下方から前記外相を流入させると共に、前記培養槽の上方から前記外相を流出させることで、前記内相の浮遊状態を維持してもよい。

前記浮遊培養方法は、前記培養槽を回転させることで、前記内相の浮遊状態を維持してもよい。

本発明によれば、十分な厚みを有する３次元組織の培養が可能な培養装置及び培養方法を提供できる。

第１実施形態に係る浮遊培養装置を示す模式図である。第２実施形態に係る浮遊培養装置を示す模式図である。実施例に係る浮遊培養方法で培養した細胞の蛍光画像を示す図である。比較例に係る培養方法で培養した細胞の蛍光画像を示す図である。実施例に係る浮遊培養方法で培養した細胞の蛍光画像を示す図である。

以下、本発明の実施形態に係る浮遊培養装置及び浮遊培養方法について説明する。本発明は以下の実施形態に限定されない。

［第１実施形態］
本実施形態に係る浮遊培養装置１は、図１に示すように、培養液１０と、培養槽１１と、ポンプ２０と、インキュベータ３０と、流路４０と、位置検出機器５０と、を有する。

培養液１０は、外相１０１及び培養相としての内相１０２を含む水性二相培養液である。水性二相培養液を培養に用いることで、被培養物に与える悪影響を低減できる。水性二相培養液は、例えば２つの化学構造が異なる水性ポリマーを組み合わせることで生成される、二相に分離した培養液である。このような水性ポリマーの組み合わせとしては、特に制限されないが、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、デキストラン、デキストラン硫酸塩、ポリエーテル、ポリアスパルテート、ポリアミン、ポリリジン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、エチレン／プロピレンコポリマー、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される２種類のポリマーの組み合わせが挙げられる。
本実施形態に係る培養液１０は、ポリエチレングリコールとデキストランの組み合わせにより得られるポリエチレングリコール相（以下、「ＰＥＧ相」と記載する場合がある）及びデキストラン相（以下、「ＤＥＸ相」と記載する場合がある）からなる水性二相培養液であることが好ましい。更に、外相１０１をＰＥＧ相とし、培養相としての内相１０２をＤＥＸ相とすることが好ましい。

水性二相培養液には、被培養物である細胞の培養に適した培地が含まれる。培地としては特に制限されず、従来公知のものが用いられる。例えば、基礎培地に血清や血清代替物を添加した培地が用いられる。

水性二相培養液は、上記２種類のポリマーを、培地に溶解させて混合し、自然に、又は遠心力を印加して分離させることで調製される。
水性二相培養液の調製方法について、ＰＥＧ相及びＤＥＸ相からなる水性二相培養液を例に挙げて以下説明する。まず、ポリエチレングリコールを、培地に溶解することでＰＥＧ溶液が調製される。ポリエチレングリコールの分子量及び濃度は特に制限されないが、例えば、分子量８０００～２０００００、濃度２．５～１４重量％のものを用いることができる。同様に、デキストランを、培地に溶解することでＤＥＸ溶液が調製される。デキストランの分子量及び濃度は特に制限されないが、例えば、分子量２００００～５０００００、濃度３．２～１４重量％のものを用いることができる。上記調製されたＰＥＧ溶液及びＤＥＸ溶液に対し、オートクレーブ滅菌を行った後、ＰＥＧ溶液及びＤＥＸ溶液を混合し、遠心分離等により二相に分離させる。これにより、ポリエチレングリコールが多く含まれるＰＥＧ相と、デキストランが多く含まれるＤＥＸ相との二相に分離した溶液が得られる。そして、例えば上記作製したＰＥＧ相で満たされた容器に、ＤＥＸ相を滴下することで、ＰＥＧ相を外相、ＤＥＸ相を内相とする水性二相培養液が得られる。

外相１０１は、培養槽１１中において内相１０２の周囲に存在する。また、外相１０１は、リザーバ３２に貯留される。図１に示すように、培養槽１１における外相１０１とリザーバ３２における外相１０１とは、ポンプ２０により流路４０を通じて循環する。これにより、内相１０２の環境は、外相１０１を通じてインキュベータ３０内と同様の環境に維持される。また、外相１０１が培養槽１１内で流動することにより、内相１０２の浮遊状態が維持される。

内相１０２は、細胞を培養する培養相として用いられ、細胞の懸濁液として調製される。例えば、ＤＥＸ相を内相１０２として用いる場合、内相１０２は、ＤＥＸ相に細胞を懸濁させることで調製される。
内相１０２は、培養槽１１において外相１０１中で浮遊する。内相１０２は、図１に示すように、球状又は長球状の液滴を形成して浮遊する。内相１０２の大きさや数は特に制限されない。内相１０２は、例えば、外相１０１よりも比重が大きく、内相１０２に働く重力は浮力よりも大きい。この場合、内相１０２は培養槽１１内で徐々に沈降する。しかし、外相１０１がポンプ２０等の浮遊手段により培養槽１１内で流動することで、内相１０２に対し上向きの抗力が働き、内相１０２の浮遊状態が維持される。

内相１０２中で培養される被培養物としては、ヒトを含む哺乳類の細胞が挙げられる。細胞の種類としては、特に制限されず、例えば、体細胞、その前駆細胞、及びこれらの混合細胞が挙げられる。具体的には、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞等の幹細胞や、心筋細胞、心臓壁細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、肝前駆細胞、間葉系細胞、膵島細胞、軟骨細胞、上皮細胞等、がん細胞、及びがん由来細胞株等が挙げられる。被培養物である細胞は、接着性細胞であることが好ましい。接着性細胞を平面培養すると、平面上に広がり２次元的な組織が形成されるが、接着性細胞を浮遊培養することで、３次元的な細胞の凝集塊を形成することができる。

培養槽１１は、培養液１０を収容する容器である。培養槽１１には、外相１０１が流入する流入口１１１と、外相１０１が流出する流出口１１２が設けられる。流入口１１１は、培養槽１１の下方に設けられ、流出口１１２は培養槽１１の上方に設けられる。培養槽１１の形状は特に制限されず、例えば円筒状や角筒状のものが用いられる。培養槽１１の材質は、光透過性部材であることが好ましい。培養槽１１を光透過性部材で構成することで、培養槽１１における内相１０２の位置を外部から容易に把握できる。上記光透過性部材としては、特に制限されないが、例えばガラスや塩化ビニル等の透明樹脂が用いられる。

ポンプ２０は、一定流速で液体の輸送が可能な装置である。ポンプ２０は、培養槽１１の下方から外相１０１を供給し上方から回収することで、培養槽１１内で内相１０２の浮遊状態を維持する浮遊手段である。また、ポンプ２０は、後述する流路４０と共に外相１０１を循環させる循環機構を構成する。具体的には、ポンプ２０及び流路４０は、培養槽１１から流出した外相１０１を、リザーバ３２に回収し、再び培養槽１１に供給して循環させるように構成される。ポンプ２０は、インキュベータ３０の外部に配置されることが好ましい。
ポンプ２０としては、例えばローラーポンプが用いられる。ローラーポンプは、内部にローラーと、ローラーが取り付けられた回転体と、回転体を回転させるモーターと、ハウジングを有する（図示省略）。ローラーポンプは、該回転体が回転する際に、ローラーにより液体が流通するチューブをしごいてハウジングに押し付け、チューブ内の液体を送液する。このようなローラーポンプとしては、特に制限されず、従来公知のものが用いられる。

インキュベータ３０は、細胞等の被培養物を収容し、培養に適した環境を維持、制御する装置である。インキュベータ３０は、チャンバ３１と、リザーバ３２と、を備える。

チャンバ３１は、開閉可能な扉を有する。チャンバ３１の内部では、例えば温度、湿度、ＣＯ_２濃度等が所定の条件に調整される。チャンバ３１の内部には、上記条件を調整するため、温水ヒータ、電気ヒータ、加湿皿、炭酸ガスボンベや温湿度センサ、ＣＯ_２濃度センサ等が設けられる（図示省略）。上記所定の条件としては、培養される組織の種類によって異なるが、例えば、ヒトを含む哺乳類の細胞の培養を行う場合、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ_２濃度５％という条件が適用される。

リザーバ３２は、チャンバ３１内に配置され、外相１０１が貯留される容器である。リザーバ３２は、一部がチャンバ３１内に向けて開口した容器であり、チャンバ３１内の雰囲気とガス交換可能に構成される。リザーバ３２は、第２流路４３を介して培養槽１１と連結され、第３流路４４を介してポンプ２０と連結される。また、気泡除去部４２を介して第１流路４１と連結される。

流路４０は、培養液としての外相１０１が流通する流路である。流路４０は、第１流路４１と、気泡除去部４２と、第２流路４３と、第３流路４４と、からなる。これらの流路は、例えば、シリコーン樹脂等の可撓性樹脂により構成される。

第１流路４１は、ポンプ２０と培養槽１１との間に配置される。第１流路４１の上流側端部はポンプ２０に接続され、下流側端部は培養槽１１の流入口１１１に接続される。
気泡除去部４２は、第１流路４１とリザーバ３２との間に配置されるベント配管である。気泡除去部４２の上流側端部は第１流路４１の途中の任意箇所に接続され、下流側端部はリザーバ３２に接続される。気泡除去部４２の内径は、第１流路４１の内径よりも大きいことが好ましい。これにより、気泡除去部４２内の流速が低下し、第１流路４１中の気泡をより確実に除去できる。
第２流路４３は、培養槽１１とリザーバ３２との間に配置される。第２流路４３の上流側端部は培養槽１１の流出口１１２に接続され、下流側端部はリザーバ３２に接続される。
第３流路４４は、リザーバ３２とポンプ２０との間に配置される。第３流路４４の上流側端部はリザーバ３２に接続され、下流側端部はポンプ２０に接続される。

位置検出機器５０は、培養槽１１における内相１０２の位置等の浮遊状態を検出する。また、内相１０２の浮遊状態に応じて、培養槽１１に流入及び流出する外相１０１の流速を自動的に制御する。位置検出機器５０は、画像センサ５１と、制御部５２と、通信部５３と、を備える。

画像センサ５１は、レンズ等の光学部品を通して光を読み取るイメージセンサを備えたカメラ装置であり、撮影した物体の画像をデジタル信号に変換する機能を有する。画像センサ５１には、予め培養槽１１中における内相１０２の形状や色彩が登録されており、撮影した画像中における内相１０２の位置座標データを取得できる。

制御部５２は、画像センサ５１により取得した内相１０２の位置座標データを元に、通信部５３を通じてポンプ２０を制御する。例えば、内相１０２の中心位置が培養槽１１の上下方向における中間位置よりも下方である場合、ポンプ２０の流速を増加させるような制御を行う。また、内相１０２の中心位置が培養槽１１の上下方向における中間位置よりも上方である場合、ポンプ２０の流速を低下させるような制御を行う。制御部５２は、上記制御を行うことで、内相１０２を培養槽１１中で一定位置となるように安定して浮遊させることができる。

以上説明した浮遊培養装置１を用い、外相１０１を装置内で流通させ、内相１０２内で被培養物を浮遊培養する方法は以下の通りである。
ポンプ２０を用いて外相１０１を圧送すると、外相１０１は矢印１３２の方向に流れ、第１流路４１を通じて培養槽１１に流入する。この際、外相１０１に混入した気泡は、培養槽１１に流入する前に気泡除去部４２に流入して除去される。なお、気泡除去部４２はインキュベータ３０内のリザーバ３２に通じており、気泡と共に回収された外相１０１はリザーバ３２に流入する。培養槽１１の下方に設けられた流入口１１１から培養槽１１に流入した外相１０１は、重力方向１２１に逆らって、下方から上方に向けて流動し、培養槽１１中の内相１０２を浮遊させる。外相１０１は、培養槽１１の上方に設けられた流出口１１２から流出する。培養槽１１から流出した外相１０１は、第２流路４３を通じて矢印１３１の方向に流れ、インキュベータ３０内のリザーバ３２に流入する。リザーバ３２に流入した外相１０１は、リザーバ３２内で所定の条件に保たれ、貯留される。リザーバ３２内に貯留された外相１０１は、第３流路４４を通じてポンプ２０に供給される。
ポンプ２０から培養槽１１に流入する外相１０１の流速は、培養槽１１中の内相１０２の浮遊状態に応じて制御する。これにより、内相１０２の浮遊状態を維持できる。この際、外相１０１の流速を、位置検出機器５０を用いて制御してもよい。

以上説明した第１実施形態に係る浮遊培養装置１及び培養方法によれば、以下の効果が奏される。
浮遊培養装置１を、外相１０１と、外相１０１中で浮遊する培養相としての内相１０２を含む水性二相培養液１０と、培養槽１１と、浮遊手段と、を備えて構成した。これにより、内相１０２の浮遊状態を維持でき、十分な厚みを有する３次元組織を培養できる。

内相１０２の浮遊手段を、外相１０１を培養槽１１内で流動させるポンプ２０とした。これにより、内相１０２の浮遊状態を維持できる。

培養槽１１に流入及び流出する外相１０１の流速は、培養槽１１における内相１０２の浮遊状態に応じて制御されることとした。これにより、培養槽１１における内相１０２の浮遊状態を安定して維持でき、被培養物の長期培養が可能となる。

外相１０１が流通する流路４０を設け、培養槽１１から流出した外相１０１は、インキュベータ３０内に配置されたリザーバ３２を介し、再び培養槽１１に流入するよう、外相１０１が循環するように構成した。循環機構としてはポンプ２０及び流路４０を用いた。これにより、培養槽１１から流出した外相１０１を再利用できる。また、リザーバ３２を介して外相１０１が培養槽１１に供給されるため、培養槽１１内の環境を、インキュベータ３０内と同様の環境に維持できる。従って、内相１０２の浮遊状態と共に、培養環境を維持できる。

内相１０２の浮遊手段を、培養槽１１の下方から外相１０１を流入させ、培養槽１１の上方から外相１０１を流出させるポンプ２０とした。これにより、内相１０２の比重が外相１０１よりも大きく、内相１０２が培養槽１１内で徐々に沈降する場合において、内相１０２の浮遊状態を維持できる。

［第２実施形態］
第２実施形態に係る浮遊培養装置１Ａは、図２に示すように、培養液１０と、培養槽１１Ａと、回転機構１２と、インキュベータ３０と、を有する。
以下、本実施形態の各構成について説明するが、第１実施形態と共通の箇所については記載を省略する場合がある。

培養槽１１Ａは、培養液１０を収容する容器であり、インキュベータ３０内に配置される。培養槽１１Ａは、外部からの培養液１０の出入りが無く、密閉された容器である。培養槽１１Ａの形状は特に制限されず、例えば第１実施形態と同様、円筒状や角筒状の形状である。培養槽１１Ａの材質は、Ｏ_２やＣＯ_２等の気体に対して透過性を有し、培養液１０等の液体に対しては非透過性である、ガス透過性樹脂を用いることが好ましい。これにより、培養液１０の環境をチャンバ３１内と同様にすることができる。
このようなガス透過性樹脂としては、特に制限されず、従来公知のものを用いることができる。例えば、低密度ポリエチレン、低密度ポリスチレン、シリコーン樹脂、ポリイソプレン、ポリブタジエン、エチレン－酢酸ビニル共重合体等が挙げられる。これらのガス透過性樹脂は、厚さが増すとガス透過性が低下する。このため、培養槽１１Ａの少なくとも一部を厚さの薄いガス透過性樹脂で構成することが好ましい。また、一部を強度確保用に任意の材料で構成してもよい。又は、強度確保用の枠体等の支持体を別途設けてもよい。

回転機構１２は、インキュベータ３０内で培養槽１１Ａを回転可能に支持する。このような回転機構１２の構成としては特に制限されない。例えば、回転機構１２に自立可能な脚部を設け、培養槽１１Ａの両側端部を回転可能に支持してもよいし、インキュベータ３０内で培養槽１１Ａを吊り下げて回転可能に支持してもよい。
回転機構１２は、更に、モーター等の駆動装置を備える。回転機構１２は、該駆動装置により培養槽１１Ａを回転できる。

以上説明した浮遊培養装置１Ａを用い、培養槽１１Ａを回転させ、内相１０２内で被培養物を浮遊培養する方法は以下の通りである。
内相１０２は、外相１０１との比重差により、例えば外相１０１中で徐々に沈降する。内相１０２が培養槽１１Ａの底面に到達する前に、回転機構１２を用い、培養槽１１Ａを回転させる。これにより、内相１０２が培養槽１１Ａの壁面に到達すること無く、内相１０２の浮遊状態を維持できる。回転機構１２の回転数は、内相１０２の浮遊状態が維持されるように制御される。

以上第２実施形態に係る浮遊培養装置１Ａによれば、以下の効果が奏される。
浮遊培養装置１Ａを、培養槽１１Ａを回転させる回転機構１２を備えて構成した。これにより、培養槽１１Ａが回転されることで、培養槽１１Ａにおける内相１０２の浮遊状態を維持できる。上記構成は、内相１０２内での撹拌が起こり難いため、細胞同士の接着が促進される。従って十分な厚みを有する３次元組織を培養できるため好ましい。

本発明は、上記実施形態に制限されるものではなく、適宜変更が可能である。

第１実施形態に係る培養槽１１を、下方に外相１０１の流入口１１１が形成され、上方に流出口１１２が形成されるものとして説明したが、この構成に限定されない。内相１０２の比重が外相１０１よりも小さく、内相１０２に働く浮力が重力よりも大きい場合、内相１０２は培養槽１１中で徐々に浮上する。この場合、外相１０１の流入口を培養槽１１の上方に形成し、流出口を培養槽１１の下方に形成してもよい。これにより、外相１０１は培養槽１１内で下向きに流動し、内相１０２に下向きの効力が働く。このような構成によっても、内相１０２の培養槽１１内での浮遊状態を維持できる。

上記実施形態において、外相１０１としてＰＥＧ相を用い、培養相である内相１０２としてＤＥＸ相を用いるものとして説明したが、この構成に限定されない。外相１０１としてＤＥＸ相を用い、内相１０２としてＰＥＧ相を用いることもできる。また、ＰＥＧ相を培養相として用いることもできる。

上記実施形態において、内相１０２中で培養される被培養物を、ヒトを含む哺乳類の細胞として説明したが、この構成に限定されない。内相１０２中で哺乳類以外の細胞や、大腸菌や緑膿菌等のバクテリアを培養することもできる。

第１実施形態に係る浮遊培養装置１を、位置検出機器５０を有するものとして説明したが、この構成に限定されない。培養槽１１中で流動する外相１０１の流速は、他の構成により制御されてもよい。

第２実施形態に係る浮遊培養装置１Ａを、培養液１０と、培養槽１１Ａと、回転機構１２と、インキュベータ３０と、を有するものとして説明したが、この構成に限定されない。浮遊培養装置１Ａは、第１実施形態に係る浮遊培養装置１と同様、位置検出機器５０を備えて構成してもよい。
この場合、位置検出機器５０は回転機構１２と通信可能に構成され、内相１０２の浮遊状態に応じて回転機構１２の回転数が制御されるように構成できる。これにより、内相１０２の浮遊状態を安定して維持できる。

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

＜培養液の作製（実施例及び比較例）＞
溶質としてＰＥＧ（分子量３５０００）とＤＥＸ（分子量５０００００）について、それぞれ培養液を媒体とした溶液（各濃度５重量％および濃度１０重量％）を作製し、これらを混合して二相に分離させ、ＰＥＧ相及びＤＥＸ相からなる二相培養液を作製した。

＜培養条件＞
（実施例）
上記作製したＤＥＸ相に対し、２．０×１０^６（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）となるようにマウス線維芽細胞（ＮＩＨ－３Ｔ３）を懸濁させた。次に、上記懸濁させたＤＥＸ相のうち１０μｌを、上記作製したＰＥＧ相で満たされた円筒形の培養槽（タイゴンチューブ、内径４ｍｍ）中に滴下した。更に、ＰＥＧ相に対し下方から上方に向かう流れを付与することでＤＥＸ相をＰＥＧ相中で３時間浮遊させた。流通するＰＥＧ相はインキュベータを用い、３７℃、５％ＣＯ_２となるように調整した。

（比較例）
上記作製したＤＥＸ相に対し、２．０×１０^６（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）となるようにマウス線維芽細胞（ＮＩＨ－３Ｔ３）を懸濁させた。次に、上記懸濁させたＤＥＸ相のうち１０μｌを、上記作製したＰＥＧ相で満たされたディッシュに滴下し、インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）内に３時間静置した。

［共焦点顕微鏡撮像による厚み評価］
上記条件で培養した実施例及び比較例のＤＥＸ相中に内在する細胞塊のうち、ＤＥＸ相の中央部付近に存在する細胞塊を任意にそれぞれ５個選択し、共焦点顕微鏡を用いて撮像した。
図３は実施例の培養方法で培養した細胞塊を撮像したＺスタック画像であり（１２８Ｓｌｉｃｅ、１μｍ／Ｓｌｉｃｅ）同様に図４は比較例の細胞塊を撮像したＺスタック画像である（３０Ｓｌｉｃｅ、１μｍ／Ｓｌｉｃｅ）。詳しくは、図３（Ａ）、図４（Ａ）は、細胞塊をＺ軸方向からそれぞれ撮像した画像であり、図３（Ｂ）、図４（Ｂ）はＸ軸方向、図３（Ｃ）、図４（Ｃ）はＹ軸方向からそれぞれ細胞塊のＺ軸方向の厚みを撮影したＺスタック画像である。
上記撮像した画像を分析した結果、実施例の細胞塊のＺ軸方向の大きさの平均値は７８．８μｍ（Ｎ＝５）であった。また、比較例の細胞塊のＺ軸方向の大きさの最大値は１２μｍ（Ｎ＝５）であった。

図３及び図４に示す通り、実施例に係る培養方法で培養した細胞塊は、比較例に係る培養方法で培養した細胞塊よりもＺ軸方向の大きさが大きく、３次元的な組織が形成されていることが確認された。

［ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ（ＰＩ）による死細胞の染色］
実施例に係る培養方法で培養した細胞塊に対し、ヨウ化プロピジウム（ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ；ＰＩ）を用いて死細胞を染色し、顕微鏡を用いて撮像した。図５（Ａ）は明視野像であり、図５（Ｂ）はＰＩにより死細胞を染色した蛍光画像である。図５（Ｂ）中の点線部は、明視野像における細胞塊の位置に対応する箇所を示す。

図５に示す通り、実施例に係る培養方法で培養した細胞塊をＰＩで染色したところ、大部分で蛍光染色が確認されず、実施例に係る培養方法で培養した細胞塊の大半が生細胞であることが確認された。

１、１Ａ浮遊培養装置、１０水性二相培養液（培養液）、１０１外相（ポリエチレングリコール相）、１０２内相（デキストラン相）、１１、１１Ａ培養槽、１２回転機構（浮遊手段）、２０ポンプ（浮遊手段）

Claims

外相と、前記外相中で浮遊する培養相としての内相と、を含む水性二相培養液と、
前記水性二相培養液を収容する培養槽と、
前記内相の浮遊状態を維持する浮遊手段と、
位置検出機器と、を備え、
前記外相は、ポリエチレングリコール相であり、前記内相は、デキストラン相であり、
前記浮遊手段は、ポンプであり、前記培養槽中で前記外相を流動させ、前記外相に対し下方から上方に向かう流れを付与し、
前記位置検出機器は、前記内相の浮遊状態を検出する画像センサと、前記内相の浮遊状態に応じて、前記浮遊手段を制御する制御部と、を備え、
前記制御部は、前記画像センサにより取得した前記内相の浮遊状態に応じて、前記浮遊手段による前記外相の流速を変化させ、前記内相の前記培養槽中の位置が安定化するように、前記浮遊手段を制御する、浮遊培養装置。
前記培養槽から流出した前記外相を回収し、再び前記培養槽に流入させて循環させる循環機構を備える、請求項１に記載の浮遊培養装置。
前記浮遊手段は、前記培養槽の下方から前記外相を流入させると共に、
前記培養槽の上方から前記外相を流出させることで、前記内相の浮遊状態を維持する、請求項１又は２に記載の浮遊培養装置。
培養液中で細胞を培養する浮遊培養方法であって、
前記培養液は、培養槽に収容され、
前記培養液は、外相と、前記外相中で浮遊する培養相としての内相と、を含む水性二相培養液であり、
前記外相は、ポリエチレングリコール相であり、前記内相は、デキストラン相であり、
ポンプにより、前記培養槽中で前記外相を流動させ、前記外相に対し下方から上方に向かう流れを付与し、
前記内相の浮遊状態を画像として検出すると共に、前記検出された前記内相の浮遊状態に応じて、前記ポンプによる前記外相の流速を変化させ、前記内相の前記培養槽中の位置が安定化するように、前記内相の浮遊状態を維持して培養を行う、浮遊培養方法。
前記培養槽から流出した前記外相を回収し、再び前記培養槽に流入させて循環させる、請求項４に記載の浮遊培養方法。
前記培養槽の下方から前記外相を流入させると共に、
前記培養槽の上方から前記外相を流出させることで、前記内相の浮遊状態を維持する、請求項４又は５に記載の浮遊培養方法。