CN115505556A - 一种利用惯性微流制备三维细胞模型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用惯性微流制备三维细胞模型的方法，属于三维细胞模型制备技术领域。本发明将细胞悬液滴在基底表面，在所述基底表面形成细胞液滴；将附着有所述细胞液滴的基底倒置，在所述基底表面形成细胞悬滴；将附着有所述细胞悬滴的基底进行旋转运动产生惯性微流，使所述细胞悬滴中细胞聚集，之后在静置条件下进行培养，得到三维细胞模型。本发明利用惯性微流制备三维细胞模型，不需要使用非生物材料，不会损害细胞结构，对其活性影响较小；将细胞聚集后再进行培养，可缩短三维细胞模型制备时间；且本发明方法操作简单、对细胞种类要求低、通用性强、可行性高、成本低，不需要使用昂贵的设备，对操作人员技术要求低，适于大规模推广应用。

Description

一种利用惯性微流制备三维细胞模型的方法
技术领域
本发明涉及三维细胞模型制备技术领域，尤其涉及一种利用惯性微流制备三维细胞模型的方法。
背景技术
传统细胞培养方法是在培养皿中进行细胞二维培养，但是有研究显示，二维培养细胞生长在二维平面上，细胞的蛋白分泌、基因表达以及形态结构与体内真实环境均存在较大差异。因此细胞二维培养不能真实反应细胞生长环境，导致二维细胞实验结果误差较大。
为了解决二维细胞培养的缺陷，三维细胞培养方法在近几十年不断发展。三维细胞模型可以有效模拟细胞在真实组织中的生长环境，例如细胞与细胞之间、细胞与细胞质基质之间的相互作用，细胞生长的力学信号与生物信号等。现有制备三维细胞模型的方法主要有悬滴法、低粘附培养法以及生物反应器法等。其中，悬滴法是将细胞悬液直接滴在培养皿底部，倒置后形成悬滴，经过一段时间培养后，细胞在微重力的作用下向中心聚集，并在细胞自组装之后形成球形三维细胞模型。悬滴法具有操作简单且生物相容性好的特点，在制备球形三维细胞模型方面得到了广泛应用。但是悬滴法在制备三维细胞模型过程中往往存在制备时间较长的问题，例如基于人肝癌细胞系HepG2制备三维细胞球需要持续培养48h以上。这是由于细胞在自组装成球形三维细胞模型的过程中，需要相邻细胞表面的钙黏蛋白和整合素相互作用。而且由于不同种类细胞表面的钙黏蛋白和整合素分泌量不同，传统悬滴法也不能将所有类型的细胞制备成球形三维细胞模型，适用性受到一定限制，例如不适用于将黑色素肿瘤细胞制备成球形三维细胞模型。
为了加快细胞自组装成球的过程，现有研究人员使用电场、磁场和超声等外力的方法促使细胞聚集成团，以改善细胞与细胞之间的相互作用。但是电场、磁场和超声等外力的方法需要使用电泳液和磁纳米颗粒等非生物材料，生物相容性较差，在一定程度上会影响生物功能和生物活性。另外，这些方法也需要专用设备，对操作人员的技术要求较高，不利于三维细胞模型的大批量制备。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用惯性微流制备三维细胞模型的方法，本发明提供的方法不需要使用非生物材料，不会损害细胞结构，对细胞活性影响较小，且操作简单，适用性强。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用惯性微流制备三维细胞模型的方法，包括以下步骤：
将细胞悬液滴在基底表面，在所述基底表面形成细胞液滴；
将附着有所述细胞液滴的基底倒置，在所述基底表面形成细胞悬滴；
将附着有所述细胞悬滴的基底进行旋转运动产生惯性微流，使所述细胞悬滴中细胞聚集，之后在静置条件下进行培养，得到三维细胞模型。
优选地，所述细胞悬液中细胞的浓度为1×103～1×108个/mL。
优选地，所述细胞悬液中细胞包括肿瘤细胞、成纤维细胞、皮脂腺细胞和软骨细胞中的一种或几种。
优选地，所述细胞悬液中液态基质为含生物基质材料的料液。
优选地，进行所述旋转运动产生惯性微流的方式包括：将附着有所述细胞悬滴的基底置于离心设备上进行离心。
优选地，所述离心的转速为50～200r/min，时间为5～30min。
优选地，所述离心设备包括水平圆周式摇床或离心机。
优选地，所述培养的温度为35～40℃，时间为8～24h；所述培养在二氧化碳体积百分含量为5～30％的气氛中进行。
优选地，所述基底为亲水性基底；所述基底使用前进行灭菌处理。
优选地，所述三维细胞模型呈球形，所述三维细胞模型的直径为50～1000μm。
本发明提供了一种利用惯性微流制备三维细胞模型的方法，包括以下步骤：将细胞悬液滴在基底表面，在所述基底表面形成细胞液滴；将附着有所述细胞液滴的基底倒置，在所述基底表面形成细胞悬滴；将附着有所述细胞悬滴的基底进行旋转运动产生惯性微流，使所述细胞悬滴中细胞聚集，之后在静置条件下进行培养，得到三维细胞模型。本发明利用惯性微流制备三维细胞模型，不需要使用非生物材料，不会损害细胞结构，对细胞活性影响较小；将细胞聚集后再进行培养，有利于缩短三维细胞模型制备时间(可缩短至8h)；且本发明提供的方法操作简单、对细胞种类要求低、通用性强、可行性高、成本低，不需要使用昂贵的设备，对操作人员的技术要求低，适用于大规模推广应用，对生物医学的发展具有重要意义。
进一步地，本发明可以通过控制细胞悬液中的细胞浓度来精确调控三维细胞模型的尺寸大小，从而模拟不同尺寸、不同病理状态的器官或组织，有利于进一步提高三维细胞模型的适用性。
进一步地，采用本发明提供的方法制备三维细胞模型，可以连续培养数天，如在实施例条件下连续培养5天仍能够保持较好的结构稳定性，适合生物医学研究。
附图说明
图1为本发明利用惯性微流制备三维细胞模型的流程示意图；
图2为实施例1中利用水平圆周式摇床对附着有细胞悬滴的基底进行离心的实物图；
图3为采用实施例1方法在惯性微流作用10min、培养12h以及24h时细胞的光学显微镜表征图；
图4为采用对比例1方法在静置10min、培养12h以及24h时细胞的光学显微镜表征图；
图5为采用实施例2方法在不同细胞浓度条件下培养得到的三维细胞模型的荧光染色图；
图6为采用实施例2方法在不同细胞浓度条件下培养得到的三维细胞模型的尺寸定量图；
图7为采用实施例3方法在培养24h、2天、3天、4天和5天时细胞的光学显微镜表征图；
图8为采用实施例3方法在培养24h、2天、3天、4天和5天时细胞的尺寸定量图；
图9为采用实施例4方法在培养12h时细胞的光学显微镜表征图；
图10为采用对比例2方法在培养12h时细胞的光学显微镜表征图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用惯性微流制备三维细胞模型的方法，包括以下步骤：
将细胞悬液滴在基底表面，在所述基底表面形成细胞液滴；
将附着有所述细胞液滴的基底倒置，在所述基底表面形成细胞悬滴；
将附着有所述细胞悬滴的基底进行旋转运动产生惯性微流，使所述细胞悬滴中细胞聚集，之后在静置条件下进行培养，得到三维细胞模型。
本发明将细胞悬液滴在基底表面，在所述基底表面形成细胞液滴；将附着有所述细胞液滴的基底倒置，在所述基底表面形成细胞悬滴。在本发明中，所述细胞悬液中细胞的浓度优选为1×103～1×108个/mL，具体可以为1×103个/mL、4×103个/mL、2×104个/mL、1×105个/mL、5×105个/mL、2.5×106个/mL、1×108个/mL。在本发明中，所述细胞悬液中细胞优选包括肿瘤细胞、成纤维细胞、皮脂腺细胞和软骨细胞中的一种或几种；在本发明的实施例中，具体以人皮肤成纤维细胞和黑色素肿瘤细胞为例进行说明。在本发明中，所述细胞悬液中液态基质优选为含生物基质材料的料液；本发明对所述生物基质材料的种类没有特殊限定，本领域技术人员熟知的适于培养细胞的生物基质材料均可，例如可以包括胶原、明胶、明胶衍生物、蛋白多糖、糖蛋白、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、透明质酸、纤连蛋白和层连蛋白中的一种或几种；在本发明中，所述细胞悬液中液态基质更优选为细胞培养液，也可以根据实际需要在所述细胞培养液中添加其它功能性成分，以辅助制备三维细胞模型，例如黑色素肿瘤细胞表面钙黏蛋白和整合素分泌量不足，本身不容易形成三维细胞模型，可以在细胞培养液中加入少量功能性成分(如鼠尾胶原蛋白I型溶液)制备三维细胞模型；所述如鼠尾胶原蛋白I型溶液的体积优选为细胞培养液体积的1％。在本发明中，所述基底优选为亲水性基底，具体可以为玻璃基底、金属基底或塑料基底，也可以为表面涂覆有亲水性涂层的复合基底，例如在非亲水性基底的表面涂覆亲水性涂层以满足亲水性要求；在本发明中，所述塑料基底优选为聚苯乙烯基底；制备所述亲水性涂层采用的基体材料为聚合物，所述聚合物优选包括多聚赖氨酸(PLL)或壳聚糖；上述基底在具有较好亲水性的同时还具有良好生物相容性；在本发明的实施例中，所述基底具体为聚苯乙烯培养皿；所述基底使用前优选进行灭菌处理，所述灭菌处理优选包括气体灭菌、射线灭菌或紫外灭菌。
得到细胞悬滴后，本发明将附着有所述细胞悬滴的基底进行旋转运动产生惯性微流，使所述细胞悬滴中细胞聚集，之后在静置条件下进行培养，得到三维细胞模型。本发明通过旋转运动可以在细胞悬滴内部产生惯性微流，细胞在惯性微流的作用下向细胞悬滴的中心聚集，从而促进细胞经自组装过程形成三维细胞模型。在本发明中，进行所述旋转运动产生惯性微流的方式优选包括：将附着有所述细胞悬滴的基底置于离心设备上进行离心。在本发明中，所述离心的转速优选为50～200r/min，具体可以为50r/min、100r/min、150r/min或200r/min；时间优选为5～30min，具体可以为5min、10min、20min或30min。在本发明中，所述离心设备优选为能够产生水平圆周运行的任意设备，更优选包括水平圆周式摇床或离心机，所述离心机可以为自动离心机，也可以为手动离心机，本发明对此没有特殊限定。本发明优选通过离心运动细胞悬滴内部产生惯性微流，不需要使用昂贵的设备，也不需要复杂的操作，可以简化三维细胞培养流程，缩短三维细胞模型制备时间。
使所述细胞悬滴中细胞聚集后，本发明停止旋转运动，将所得细胞悬滴在静置条件下进行培养，得到三维细胞模型。在本发明中，所述培养的温度优选为35～40℃，具体可以为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃；时间优选为8～24h，具体可以为8h、10h、12h、15h、20h或24h；所述培养优选在二氧化碳体积百分含量为5～30％的气氛中进行，具体可以为5％、10％、15％、20％、25％或30％。在本发明中，所述培养优选在培养装置中进行，所述培养装置优选为细胞培养箱。本发明优选在所述培养装置底部的水盘中放置无菌水，来调节培养装置中的湿度，以保证培养过程中细胞悬滴不会干燥。
在本发明中，所述三维细胞模型呈球形，所述三维细胞模型的直径优选为50～1000μm，具体可以为50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm。
图1为本发明利用惯性微流制备三维细胞模型的流程示意图，下面将结合图1以及本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例和对比例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料或试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所使用的离心设备为水平圆周式摇床(大龙DLAB，SK-0180E)；所用培养皿的材质为聚苯乙烯。
实施例1
(1)将人皮肤成纤维细胞收集到培养液中，将细胞浓度调整为1×105个/mL，用移液器吹打，充分混匀，得到细胞悬液；
(2)将培养皿进行紫外杀菌，然后取10μL细胞悬液滴在培养皿的皿盖上，在皿盖上形成细胞液滴；
(3)将带有细胞液滴的皿盖倒置放在培养皿的皿底上形成悬滴，然后整体放在水平圆周式摇床上，以100r/min的转速离心10min(如图2所示)，然后将培养皿从摇床取下来(此时在光学显微镜下观察细胞聚集情况具体如图3中10min所示)；
(4)在上述培养皿内滴加0.5mL无菌超纯水，放入37℃、二氧化碳体积百分含量为5％的培养箱中培养，得到三维细胞模型；其中，在培养12h以及24h时，在光学显微镜下观察细胞情况。
对比例1
采用传统悬滴法制备三维细胞模型，具体是将10μL实施例1中所述细胞悬液滴在培养皿的皿盖上，在皿盖上形成细胞液滴；将带有细胞液滴的皿盖倒置放在培养皿的皿底上形成悬滴，静置10min后在光学显微镜下观察细胞情况；然后按照实施例1的条件在培养箱中培养，在培养12h以及24h时，在光学显微镜下观察细胞情况。
图3为采用实施例1方法在惯性微流作用10min、培养12h以及24h时细胞的光学显微镜表征图(标尺为100μm)，结果显示，细胞在惯性微流的作用下，10min后可以形成细胞团簇；经过12h培养，单个三维细胞模型即可制备完成。图4为采用对比例1方法在静置10min、培养12h以及24h时细胞的光学显微镜表征图(标尺为100μm)，结果显示，采用传统悬滴法方法，10min后不能形成单一的细胞团簇，12h甚至24h后也不能形成三维细胞模型。这说明本发明提供的方法可以快速有效制备三维细胞模型，缩短模型制备时间，提高制备效率。
实施例2
(1)将人皮肤成纤维细胞收集到培养液中，将细胞浓度分别调整为4×103个/mL、2×104个/mL、1×105个/mL、5×105个/mL、2.5×106个/mL，用移液器吹打，充分混匀，得到细胞悬液；
(2)将培养皿进行紫外杀菌，然后取10μL细胞悬液滴在培养皿的皿盖上，在皿盖上形成细胞液滴；
(3)将带有细胞液滴的培养皿倒置放在培养皿的皿底上形成悬滴，然后整体放在水平圆周式摇床上，以75r/min的转速离心15min，然后将培养皿从摇床取下来；
(4)在上述培养皿内滴加0.5mL无菌超纯水，放入37℃、二氧化碳体积百分含量为5％的培养箱中培养12h，得到三维细胞模型。
原位检测不同细胞浓度条件下培养得到的三维细胞模型的尺寸，所需试剂为DIO细胞膜染料(货号：C1038)和DAPI细胞核染料(货号：C1002)，具体是将不同细胞浓度条件下培养的三维细胞模型从培养箱取出，吸取上清液，加入PBS缓冲液清洗3次，之后分别按照DIO细胞膜染料和DAPI细胞核染料使用说明书中规定的浓度配制染色液；取10μL DIO细胞膜染色液滴加到每个三维细胞模型表面，37℃避光染色20min，染色结束后加入PBS缓冲液清洗2次；然后取10μLDAPI细胞核染色液滴加到每个三维细胞模型表面，37℃避光染色30min，染色结束后加入PBS缓冲液清洗3次，在荧光显微镜下观察三维细胞模型情况。
图5为采用实施例2方法在不同细胞浓度条件下培养得到的三维细胞模型的荧光染色图(标尺为200μm)，由图5可知，所述三维细胞模型可以被细胞膜和细胞核染料染色。使用显微镜标尺测量所述三维细胞模型的直径，结果如图6所示；由图6可知，三维细胞模型的尺寸随着细胞浓度的增加而增加。这说明采用本发明制备三维细胞模型的方法可以通过控制细胞浓度，来精准控制三维细胞球的尺寸。
实施例3
(1)将人皮肤成纤维细胞收集到培养液中，将细胞浓度调整为1×105个/mL，用移液器吹打，充分混匀，得到细胞悬液；
(2)将培养皿进行紫外杀菌，然后取10μL细胞悬液滴在培养皿的皿盖上，在皿盖上形成细胞液滴；
(3)将带有细胞液滴的培养皿倒置放在培养皿的皿底上形成悬滴，然后整体放在水平圆周式摇床上，以100r/min的转速离心10min，然后将培养皿从摇床取下来；
(4)在上述培养皿内滴加0.5mL无菌超纯水，放入37℃、二氧化碳体积百分含量为5％的培养箱中培养，在培养24h、2天、3天、4天和5天时，在光学显微镜下观察细胞情况，并使用显微镜标尺测量三维细胞模型的直径。
图7为采用实施例3方法在培养24h、2天、3天、4天和5天时细胞的光学显微镜表征图(标尺为100μm)，图8为采用实施例3方法在培养24h、2天、3天、4天和5天时细胞的尺寸定量图，由图7和图8可知，随着培养时间的延长，三维细胞模型的直径逐渐增大，说明采用本发明提供的方法所制备的三维细胞模型可以在长时间连续培养过程中保持结构稳定性。
实施例4
(1)将黑色素肿瘤细胞收集到培养液中，将细胞浓度调整为1×105个/mL，用移液器吹打，充分混匀，然后加入鼠尾胶原蛋白I型(Corning，354236)溶液，用移液器吹打，充分混匀，得到细胞悬液；所述细胞悬液中鼠尾胶原蛋白I型溶液的体积分数为1％；
(2)将培养皿进行紫外杀菌，然后取10μL细胞悬液滴在培养皿的皿盖上，在皿盖上形成细胞液滴；
(3)将带有细胞液滴的皿盖倒置放在培养皿的皿底上形成悬滴，然后整体放在水平圆周式摇床上，以100r/min的转速离心10min，然后将培养皿从摇床取下来；
(4)在上述培养皿内滴加0.5mL无菌超纯水，放入37℃、二氧化碳体积百分含量为5％的培养箱中培养12h，得到三维细胞模型。
对比例2
采用传统悬滴法制备三维黑色素肿瘤模型，具体是将10μL实施例4中所述含有1％鼠尾胶原蛋白I型(Corning，354236)溶液的细胞悬液滴在培养皿的皿盖上，在皿盖上形成细胞液滴；将带有细胞液滴的皿盖倒置放在培养皿的皿底上形成悬滴，然后按照实施例4的条件在培养箱中培养，在培养12h时，在光学显微镜下观察细胞情况。
图9为采用实施例4方法在培养12h时细胞的光学显微镜表征图(标尺为100μm)，结果显示，采用本发明提供的方法可以制备得到黑色素肿瘤细胞球。图10为采用对比例2方法在培养12h时细胞的光学显微镜表征图(标尺为100μm)，结果显示，采用传统悬滴法，12h后不能形成黑色素肿瘤细胞球。这说明本发明提供的方法可以快速有效制备黑色素肿瘤细胞球。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用惯性微流制备三维细胞模型的方法，包括以下步骤：
将细胞悬液滴在基底表面，在所述基底表面形成细胞液滴；
将附着有所述细胞液滴的基底倒置，在所述基底表面形成细胞悬滴；
将附着有所述细胞悬滴的基底进行旋转运动产生惯性微流，使所述细胞悬滴中细胞聚集，之后在静置条件下进行培养，得到三维细胞模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞悬液中细胞的浓度为1×103～1×108个/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞悬液中细胞包括肿瘤细胞、成纤维细胞、皮脂腺细胞和软骨细胞中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞悬液中液态基质为含生物基质材料的料液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述旋转运动产生惯性微流的方式包括：将附着有所述细胞悬滴的基底置于离心设备上进行离心。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为50～200r/min，时间为5～30min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述离心设备包括水平圆周式摇床或离心机。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为35～40℃，时间为8～24h；所述培养在二氧化碳体积百分含量为5～30％的气氛中进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基底为亲水性基底；所述基底使用前进行灭菌处理。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三维细胞模型呈球形，所述三维细胞模型的直径为50～1000μm。
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