CN106029865A - 细胞培养装置 - Google Patents

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CN106029865A CN201580008813.8A CN201580008813A CN106029865A CN 106029865 A CN106029865 A CN 106029865A CN 201580008813 A CN201580008813 A CN 201580008813A CN 106029865 A CN106029865 A CN 106029865A
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cell culture
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小西佳奈子
岩元潮
和田昌宪
松浦胜久
清水达也
冈野光夫
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Toyko Women's Medical University
Asahi Kasei Corp
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Toyko Women's Medical University
Asahi Kasei Kogyo KK
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Abstract

本发明提供一种能够实现简单的结构并能够良好地进行细胞培养的细胞培养装置。细胞培养装置(5)具备：培养槽(15)，其用于容纳含有细胞的培养液；轴构件(17)，其至少一部分配置在培养槽(15)内；搅拌部件(19)，其支承于轴构件(17)并配置在培养槽(15)内，该搅拌部件(19)具有至少一对以能够以轴构件(17)为旋转中心进行旋转的方式设置的搅拌叶片(27)；以及过滤件(21)，其以与轴构件(17)相接触的方式设置，能够经由该过滤件(21)自培养槽(15)抽吸培养液和/或向培养槽(15)供给培养液，轴构件(17)的至少一部分为中空，轴构件设有用于将培养液导入该中空的部分的内部或将培养液自该内部导出的开口部(17a、17b)，且轴构件(17)被设成不能旋转，经由过滤件(21)和轴构件(17)的内部自培养槽(15)抽吸培养液和/或向培养槽(15)供给培养液。

Description

细胞培养装置
技术领域
本发明涉及一种细胞培养装置。
背景技术
近年来，在细胞培养领域、再生医学领域中，要求一种通过长期、自动且稳定地大量培养细胞来获得能够应用于生物制剂等的细胞产物、用于构建再生组织的细胞本身的技术(细胞培养装置)。为了长期稳定地培养细胞，在大多数情况下，要在培养期间中对培养液进行更换和/或净化等并且还必须进行必要成分的补给、不需要成分的去除，此时，为了不对细胞的状态造成影响，要求一种将细胞和培养液分离而仅取出培养液的技术。作为用于该技术的以往的细胞培养装置，公知有例如专利文献1所记载的细胞培养装置。专利文献1所记载的细胞培养装置具有盘状体，该盘状体至少在局部具有培养液能透过而细胞不能透过的过滤区域。该盘状体具有用于将培养液向外部引出的导管并被设成能够与导管同轴地旋转。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭60－224486号公报
发明内容
发明要解决的问题
作为在细胞培养装置中培养的细胞，存在例如人类iPS(inducedpluripotent stem)细胞。人类iPS细胞具有在细胞为单细胞的状态下或细胞暴露在较高的剪切应力(日文：シェアストレス)时容易死亡的特性。因此，在培养人类iPS细胞时，在细胞培养装置中，必须尽量不对细胞施加剪切应力。在所述专利文献所记载的装置中，对培养液进行抽吸的过滤件安装于作为搅拌部件的盘状体。因此，与额外备有用于抽吸培养液的设备的结构相比，在以往的装置中，不存在扰乱液流的障碍物，因此在减轻对细胞作用的应力方面是有效的。然而，在以往的装置中，由于进行抽吸的机构和进行搅拌的机构为同时旋转的结构，因此，在旋转机构中需要用于确保密封性的结构，从而存在使结构复杂化这样的问题。
本发明的目的在于，提供一种能够实现简单的结构并能够良好地进行细胞培养的细胞培养装置。
用于解决问题的方案
本发明的一技术方案提供一种细胞培养装置，其中，该细胞培养装置具备：培养槽，其用于容纳含有细胞的培养液；轴构件，其至少一部分配置在培养槽内；搅拌部件，其支承于轴构件并配置在培养槽内，该搅拌部件具有以能够以轴构件为旋转中心进行旋转的方式设置的搅拌叶片；以及过滤件，其以与轴构件相接触的方式设置，培养液能透过该过滤件，而细胞不能透过该过滤件，轴构件的至少一部分为中空，轴构件设有用于将培养液导入该中空的部分的内部或将培养液自该内部导出的开口部，且轴构件被设成不能旋转，过滤件位于比以轴构件为旋转中心进行旋转的搅拌叶片的可动区域靠内侧的位置，且过滤件相对于搅拌叶片独立地设于轴构件，经由过滤件和轴构件的内部自培养槽抽吸培养液和/或向培养槽供给培养液。
在该细胞培养装置中，在被设成不能旋转的轴构件上设有过滤件。搅拌机构的搅拌叶片以能够以轴构件为旋转中心进行旋转的方式设置。这样，在细胞培养装置中，搅拌叶片相对于轴构件旋转，轴构件和过滤件不旋转。因而，在细胞培养装置中，由于不使用于抽吸培养液和/或供给培养液的机构旋转，因此能够谋求结构的简化。另外，在细胞培养装置中，自培养槽抽吸培养液和/或向培养槽供给培养液的操作的过滤件以位于比搅拌叶片的可动区域靠内侧的位置的方式设置在作为搅拌叶片的旋转中心的轴构件上，经由过滤件和轴构件的内部自培养槽抽吸培养液和/或向培养槽供给培养液。因此，在细胞培养装置中，能够抑制过滤件使因搅拌叶片的旋转而产生的液流(层流)产生紊乱，关于对培养液的抽吸和/或供给，能够谋求减轻对细胞作用的应力。因而，在细胞培养装置中，能够实现简单的结构并能够良好地进行细胞培养。
在一技术方案中，也可以是，轴构件支承于培养槽的底部。
在一技术方案中，也可以是，在轴构件的下端部设有开口部，且轴构件的上端部闭塞，在轴构件的侧面部设有与内部相连通的开口部，过滤件以覆盖侧面部的开口部的方式设于轴构件的外表面。这样，在细胞培养装置中，对培养液进行抽吸的机构和/或供给培养液的机构集中于轴构件，且轴构件不旋转，因此能够谋求装置的简化。
在一技术方案中，也可以是，过滤件构成为筒状并以覆盖侧面部的开口部的方式套在轴构件的外侧。采用该结构，在细胞培养装置中，能够确保过滤件的表面积(膜面积)。
在一技术方案中，也可以是，轴构件构成为筒状，在轴构件的下端部设有开口部，且在轴构件的上端部设有与内部相连通的开口部，过滤件以覆盖上端部的开口部的方式设于轴构件。这样，在细胞培养装置中，对培养液进行抽吸的机构和/或供给培养液的机构集中于轴构件，且轴构件不旋转，因此能够谋求装置的简化。
在一技术方案中，也可以是，过滤件构成为有底的筒状并以覆盖上端部的开口部的方式套在轴构件的外侧。采用该结构，在细胞培养装置中，能够确保过滤件的表面积(膜面积)。
在一技术方案中，也可以是，轴构件支承于培养槽的盖部。
在一技术方案中，也可以是，轴构件构成为筒状，在轴构件的上端部设有开口部，且在轴构件的下端部设有与内部相连通的开口部，过滤件以覆盖下端部的开口部的方式设于轴构件。这样，在细胞培养装置中，对培养液进行抽吸的机构和/或供给培养液的机构集中于轴构件，且轴构件不旋转，因此能够谋求装置的简化。
在一技术方案中，也可以是，过滤件构成为有底的筒状并以覆盖下端部的开口部的方式套在轴构件的外侧。采用该结构，在细胞培养装置中，能够确保过滤件的表面积(膜面积)。
在一技术方案中，也可以是，在轴构件的上端部设有开口部，且轴构件的下端部闭塞，在轴构件的侧面部设有与内部相连通的开口部，过滤件以覆盖侧面部的开口部的方式设于轴构件的外表面。这样，在细胞培养装置中，对培养液进行抽吸的机构和/或供给培养液的机构集中于轴构件，且轴构件不旋转，因此能够谋求装置的简化。
在一技术方案中，也可以是，过滤件构成为筒状并以覆盖侧面部的开口部的方式套在轴构件的外侧。采用该结构，在细胞培养装置中，能够确保过滤件的表面积(膜面积)。
在一技术方案中，也可以是，过滤件为多孔体。
发明的效果
采用本发明，能够实现简单的结构并能够良好地进行细胞培养。
附图说明
图1是表示具有第1实施方式的细胞培养装置的细胞培养系统的图。
图2是表示细胞培养装置的立体图。
图3是图2所示的培养槽的侧视图。
图4是表示沿着图3中的IV－IV线剖切的剖面结构的图。
图5是表示细胞培养装置的使用状态的侧视图。
图6是表示第1实施方式的细胞培养装置的变形例的图。
图7是表示具有细胞培养装置的细胞培养系统的另一形态的图。
图8是表示具有细胞培养装置的细胞培养系统的又一形态的图。
图9是表示第2实施方式的细胞培养装置的剖面结构的图。
图10是表示第2实施方式的细胞培养装置的变形例的图。
图11是表示第2实施方式的细胞培养装置的变形例的图。
图12是表示第2实施方式的细胞培养装置的变形例的图。
图13是表示第2实施方式的细胞培养装置的变形例的图。
图14是表示第2实施方式的细胞培养装置的变形例的图。
图15是表示实施例1的细胞培养装置的图。
图16是表示实施例2的细胞培养装置的图。
图17是表示比较例1的细胞培养装置的图。
具体实施方式
以下，参照附图来详细说明本发明的优选实施方式。此外，在附图的说明中，对于相同或等同的要素标注同一附图标记并省略重复说明。
第1实施方式
图1是表示具有第1实施方式的细胞培养装置的细胞培养系统的图。在图1所示的细胞培养系统1中，对细胞进行培养。细胞是哺乳动物细胞等有用细胞。作为细胞，培养的结果发现，若要利用细胞的产物，则还能够选择易于产生目标物质的细胞、为了易于产生目标物质而导入有特定的基因的细胞。另外，作为细胞，培养的结果发现，若要利用特定的细胞，则还能够使用以使特定的细胞易于增殖的方式改变基因后的细胞等。
另外，作为细胞，对于其成熟度也没有任何限制，能够使用成熟细胞、未分化细胞。因此，能够例示出从生物体组织经酶处理而提取到的细胞、来自血液的细胞、间充质干细胞、ES(Embryonic stem)细胞、iPS(inducedpluripotent stem)细胞、自以上细胞中分化诱导而成的细胞等。另外，细胞不限定于贴壁细胞、悬浮细胞，也不限定培养方法。因此，对于悬浮培养，能够例示出单细胞的悬浮培养、细胞聚集体的悬浮培养、以使微小载体承载细胞的方式进行的悬浮培养等。并且，细胞也不限定于单一种类的细胞。也能够使细胞与产生易于使目标细胞生长的物质的其他细胞混合之后进行共同培养。
接着，说明细胞培养系统1的结构。如图1所示，细胞培养系统1具备成分调整液槽3、细胞培养装置5以及送液回路7。成分调整液槽3和细胞培养装置5通过送液回路7连接起来。送液回路7用于在成分调整液槽3与细胞培养装置5之间输送后述的培养液。送液回路7包括两根管8、9和送液泵10、11。管8、9具有中空构造并能够无菌地输送培养液。管8、9能够由例如硅、聚氨酯、氟树脂、聚氯乙烯等材质形成。
送液泵10、11分别设置在各管8、9的送液路径上，是能够连续地输送培养液的泵。作为送液泵10、11，其为通常的泵即可，能够例示出例如蠕动泵、隔膜泵等。在送液回路7中，利用送液泵10、11的驱动并借助管8、9而在成分调整液槽3与细胞培养装置5之间输送培养液。
在送液回路7的管8、9上设有培养液成分调整膜13。详细而言，培养液成分调整膜13分别连接于管8的一端部和管9的一端部并配置在成分调整液槽3内。培养液成分调整膜13是培养液成分的膜透过性取决于培养液成分的分子量的半透性的膜。培养液成分调整膜13的孔径根据欲保持在细胞培养装置5内的成分的分子量进行设计。即，以不使欲保持在细胞培养装置5内的成分中的最小分子量物质透过膜的方式选择培养液成分调整膜13。作为培养液成分调整膜13的形状，能够为平膜形状、中空纤维形状，但为了输送培养液，优选为中空纤维形状。为了高效地进行成分调整，进一步优选的是，使多根中空纤维形成束状来使用。在图1中，图示了中空纤维形状的培养液成分调整膜13。
培养液成分调整膜13的材质并没有特别限定，但优选使用不使欲保持在细胞培养装置5内的成分发生吸附、分解等的材质。另外，在培养液成分调整膜13的材质具有易于吸附所述成分的特性的情况下，也可以利用其他材料在所述材质上进行涂敷或使用表面改性剂来对表面进行改性从而抑制成分的吸附。
成分调整液槽3是用于容纳成分调整液的槽。成分调整液槽3优选由相对于成分调整液的成分而言非活性且不具有细胞毒性的、相对于灭菌(包含去除污染、除菌或无菌)处理具有耐性的材料形成，可列举出例如玻璃、合成树脂、不锈钢等。成分调整液槽3的内容量和形状等能够根据成分调整液的量来适当决定。在本实施方式中，成分调整液槽3例如由玻璃制成且构成有底的圆筒形状。在成分调整液槽3上安装有用于将设于上部的开口部(未图示)封堵的盖部3c。
容纳于成分调整液槽3的成分调整液是具有能够实质上透过培养液成分调整膜13的成分中的至少一种成分的溶液。对于培养液和成分调整液各自含有的成分，能够根据各自的分子量和两液间该成分的浓度差并借助膜来进行调整。
分子量大于培养液成分调整膜13的孔径而不能实质上透过膜的成分不在两液间移动。与此相对，对分子量小于培养液成分调整膜13的孔径而能够实质上透过膜的成分以使该成分的浓度差变小的方式在两液间进行浓度调整。通过使由细胞产生的、在培养液中积累的代谢物向成分调整液侧移动，从而使培养液中代谢物的浓度降低。同时，对于细胞生长所需的、在培养期间培养液中浓度降低的成分，使该成分自成分调整液向培养液移动来进行补充。根据以上原理，通过适当地设定成分调整液的组分和浓度，能够维持培养液中的环境，从而能够维持细胞的良好的生长环境。当然，也能够原封不动地使用培养液。因此，优选的是，成分调整液具有所有会在细胞培养期间自培养液中逐渐流失的成分，进一步优选的是，对成分调整液中的这些成分的浓度进行设定以确保这些成分在培养期间不会耗尽。
从防止细胞代谢物的积累的观点考虑，优选较多地设定成分调整液的量。优选将成分调整液的量设定为培养液的5倍以上，进一步优选将成分调整液的量设定为培养液的10倍以上。由于成分调整液的量影响培养成本，因此，根据培养期间和所需细胞数来决定成分调整液的量。既可以将成分调整液设计为具有缓冲能力从而易于维持生理性pH，也可以向成分调整液中混合pH指示色素从而易于利用颜色来判断pH的变化。
在成分调整液槽3的内部设有搅拌转子4。搅拌转子4是用于对成分调整液槽3内的成分调整液进行搅拌的搅拌构件，其被配置于成分调整液槽3下部的未图示的驱动源驱动。驱动源是例如能驱动磁力体而使其旋转的构件。搅拌转子4根据磁力体的旋转驱动而相应地旋转，以搅拌成分调整液。另外，也可以是，在成分调整液槽3的盖部3c设有空气的供气口/排气口6、用于对成分调整液进行采样的采样口(未图示)等。
细胞培养装置5是用于培养细胞的装置。图2是表示细胞培养装置的立体图。图3是细胞培养装置的侧视图。图4是表示沿着图3中的IV－IV线剖切的剖面结构的图。如图2～图4所示，细胞培养装置5包括培养槽15、轴构件17、搅拌机构(搅拌部件)19以及过滤件21。
培养槽15用于容纳(储存)培养有细胞的培养液。在此，培养液是至少具有各种细胞等以及能够供各种细胞生长的溶液成分以及环境的溶液。培养液的成分和浓度根据细胞的性质进行设计。另外，既可以将培养液设计为具有缓冲能力从而易于维持生理性pH，也可以向培养液中混合pH指示色素从而易于利用颜色来判断pH的变化。既可以原封不动地使用通常市场销售的各种培养液，也可以根据目标细胞的性质而相应地向培养液中添加追加成分。
培养槽15优选由相对于培养液成分而言非活性且不具有细胞毒性的、相对于灭菌处理具有耐性的材料形成，可列举出例如玻璃、合成树脂、不锈钢等。培养槽15的内容量和形状等能够根据培养液的量来适当决定。在本实施方式中，培养槽15例如由玻璃制成且构成为有底的圆筒形状。培养槽15具有用于将含有细胞等的培养液取出的取出部16。取出部16设于培养槽15的侧面部15a(参照图4)，是向斜上方延伸的筒状体。在取出部16安装有盖部16c。在培养槽15上安装有用于将设于上部的开口部15o封堵的盖部15c。在盖部15c上设有空气的供气口/排气口12、用于将培养液向培养槽15供给的培养液供给部、pH传感器的插入口等。在培养液供给部的上端部连接有管9的另一端部。
轴构件17是直线状的构件并具有中空构造。轴构件17优选为相对于培养液成分而言非活性且不具有细胞毒性的、相对于灭菌处理具有耐性的材料，可列举出例如合成树脂、不锈钢等。轴构件17在两端部分别具有开口部17a、17b。
轴构件17的一端部侧配置在培养槽15内。具体而言，轴构件17固定于轴支承部23。轴支承部23设于盖部15c。轴支承部23配置于盖部15c的大致中央部并竖立设置于盖部15c。轴支承部23具有中空构造并在内部贯穿有轴构件17，该轴支承部23以轴构件17不能旋转的方式保持该轴构件17。轴构件17的另一端部自轴支承部23的上端面突出。在轴构件17的上端部连接有管8的另一端部。由此，轴构件17的内部和管8相连通。
搅拌机构19包括安装部25和搅拌叶片27。安装部25可旋转地安装于轴构件17。安装部25被轴构件17贯穿，并且在轴构件17上的规定高度位置可旋转地被轴构件17支承。
搅拌叶片27用于搅拌培养液。搅拌叶片27设置为能够以轴构件17为旋转中心进行旋转。详细而言，在搅拌叶片27的上端部连结有安装部25，通过使安装部25能够在轴构件17上旋转，从而使搅拌叶片27能以轴构件17为旋转中心进行旋转。搅拌叶片27优选由相对于培养液而言非活性且具有耐性的板材料形成，可列举出例如薄板状的合成树脂、不锈钢(例如，1mm厚的SUS316)等。搅拌叶片27的数量根据搅拌机构19的转速进行设定，但从搅拌时的平衡的观点考虑，优选以轴构件17为中心等间隔地设置搅拌叶片27，搅拌叶片27优选为例如两片～四片。在本实施方式中，例示出搅拌叶片27为两片的结构。
搅拌叶片27与培养槽15的底部15b(参照图4)的内表面之间的间隙形成得较小。因此，在搅拌机构19旋转时，搅拌叶片27沿着底部15b的内表面转动。由此，对底部15b的内表面附近的培养液进行搅拌而使细胞和细胞聚集体等在培养液中继续悬浮，因此能够防止细胞和细胞聚集体等沉淀在底部15b的内表面上。另外，搅拌叶片27与培养槽15的侧面部15a的内表面之间的间隙形成得较小。因此，在搅拌机构19旋转时，搅拌叶片27沿着侧面部15a的内表面转动。由此，能够对侧面部15a的内表面附近的培养液进行搅拌而形成均匀的层流，从而能够防止随着细胞增殖而比重增大的细胞聚集体等发生沉淀。
在搅拌叶片27上设有磁力体30。磁力体30配置于搅拌叶片27的下端。磁力体30是被四氟乙烯等覆盖的永磁体等。磁力体30在搅拌叶片27的下端部被以包围磁力体30的方式进行弯折加工而成的部分所固定。搅拌叶片27通过磁力体30的驱动进行旋转。具体而言，如图5所示，在培养槽15的下部配置有驱动马达34，该驱动马达34借助支承体33来驱动一对磁力体32从而使一对磁力体32旋转，搅拌叶片27随着与磁力体30相对配置的磁力体32的旋转而旋转。驱动马达34的轴以与轴构件17为同轴的方式配置。
过滤件21是与培养液相接触的部分，培养液能透过该过滤件21，但培养液中的细胞和细胞聚集体等不能透过该过滤件21。过滤件21只要是能够使细胞等和培养液分离的构件即可，其材质、形状、数量等并不受特别限定，只要根据设计来适当设定材质、形状、数量等即可，过滤件21例如为多孔体，优选为烧结体且构成为圆柱形状。作为过滤件21的材质，例示出金属、陶瓷、玻璃、树脂、纤维等，能够优选例示出氟树脂、聚烯烃系树脂。过滤件21优选为在某种程度上水能透过，且不使细胞本身、微小载体发生吸附且不使欲保持在细胞培养装置5内的成分发生分解、吸附的材质，在过滤件21的材质具有这些特性的情况下，也可以是，通过利用其他材料进行涂敷或使用表面改性剂，来使过滤件21亲水化或防止发生上述的吸附、分解。过滤件21以与轴构件17接触的方式设置。详细而言，过滤件21构成为有底的圆筒形状并且轴构件17的下端部插入于该过滤件21。由此，过滤件21与轴构件17同轴地延伸并位于搅拌机构19的搅拌叶片27之间。即，过滤件21位于比以轴构件17为旋转中心进行旋转的搅拌叶片27的可动区域靠内侧的位置，并相对于搅拌叶片27独立地设于轴构件17。透过过滤件21后的培养液被导出到轴构件17的内部。
在细胞培养装置5中，透过过滤件21而被抽吸进来的培养液自轴构件17的开口部17b被导入到轴构件17的内部，然后自开口部17a导出，进而被导出到管8中。然后，培养液经由管8被输出到成分调整液槽3内的培养液成分调整膜13并经由管9返回到培养槽15。
如以上说明那样，在本实施方式的细胞培养装置5中，在被设成不能旋转的轴构件17上设有过滤件21。搅拌机构19的搅拌叶片27以能够以轴构件17为旋转中心进行旋转的方式设置。这样，在细胞培养装置5中，搅拌叶片27相对于轴构件17旋转，轴构件17和过滤件21不旋转。因而，在细胞培养装置5中，由于不使用于抽吸培养液的机构旋转，因此能够谋求结构的简化。另外，在细胞培养装置5中，自培养槽15抽吸培养液的过滤件21以位于比搅拌叶片27的可动区域靠内侧的位置的方式设置在作为搅拌叶片27的旋转中心的轴构件17上，经由过滤件21和轴构件17的内部自培养槽15抽吸培养液。因此，在细胞培养装置5中，能够抑制过滤件21使因搅拌叶片27的旋转而产生的液流(层流)产生紊乱，关于对培养液的抽吸，能够谋求减轻对细胞作用的应力。因而，在细胞培养装置5中，能够实现简单的结构并能够良好地进行细胞培养。
在本实施方式中，轴构件17支承于设置在盖部15c的轴支承部23，轴构件17的下端部插入到过滤件21中。这样，在细胞培养装置5中，对培养液进行抽吸的机构集中于轴构件17，且轴构件17不旋转，因此能够谋求装置的简化。
在本实施方式中，由于过滤件21构成为柱状，因此能够在过滤件21中确保膜面积。因而，在过滤件21中，能够稳定地抽吸培养液。
此外，第1实施方式的细胞培养装置5只要为轴构件支承于培养槽15的盖部15c的结构即可，轴构件、过滤件、搅拌机构的结构也可以为其他形态。
图6是表示第1实施方式的细胞培养装置的变形例的图。如图6的(a)所示，过滤件21A也可以为外套于轴构件17A的结构。详细而言，轴构件17A具有中空构造，其在上端部具有开口部17Aa且下端部闭塞。在轴构件17A的侧面部设有将内部和外部相连通的开口部17h。此外，在图6中，仅图示了一个开口部17h，但开口部17h的数量、大小、形状只要根据设计来适当设定即可。过滤件21A构成为圆筒形状。过滤件21A外套于轴构件17A且以覆盖轴构件17A的开口部17h的方式设于轴构件17A的外表面(外侧)。由此，经由过滤件21A和轴构件17A的内部自培养槽15抽吸培养液。
另外，过滤件21也可以为圆柱形状以外的形状。如图6的(b)所示，过滤件21B的下端部也可以构成为圆台形状。另外，过滤件21既可以为棱柱状，也可以为三棱柱状。为了确保表面积，过滤件21的表面形状也可以为凹凸。
另外，过滤件21也可以接触于培养槽15的底部15b。通过使过滤件21接触于底部15b，从而使底部中心附近被过滤件21占据。由此，没有因培养液的旋转而使底部中心附近的液流产生滞流的余地，能够防止随着细胞增殖而比重增大的细胞聚集体等向底部中心附近沉淀。
图7和图8是表示具有细胞培养装置的细胞培养系统的其他形态的图。如图7所示，细胞培养系统1A具备细胞培养装置5、培养液槽3A以及废弃槽3B。培养液槽3A和细胞培养装置5通过设有送液泵10的管8连接起来。细胞培养装置5和废弃槽3B通过设有送液泵11的管9连接起来。在细胞培养系统1A中，自培养液槽3A向细胞培养装置5供给培养液，自细胞培养装置5向废弃槽3B供给含有代谢物等的培养液。
如图8所示，细胞培养系统1B具备细胞培养装置5、培养液槽3A以及废弃槽3B。培养液槽3A、废弃槽3B以及细胞培养装置5通过送液回路7A连接起来。详细而言，在管8A上设有三通旋塞阀14。自培养液槽3A经由三通旋塞阀14向细胞培养装置5供给培养液，自细胞培养装置5经由三通旋塞阀14向废弃槽3B供给含有代谢物等的培养液。
三通旋塞阀14能够与向细胞培养装置5供给培养液和自细胞培养装置5抽吸培养液相对应地切换流路。即，在自培养液槽3A供给培养液的情况下，三通旋塞阀14使培养液槽3A与细胞培养装置5之间的流路确立，在向废弃槽3B供给培养液的情况下，三通旋塞阀14使细胞培养装置5与废弃槽3B之间的流路确立。在细胞培养装置5的过滤件21中，自培养槽15抽吸培养液和向培养槽15供给培养液。
第2实施方式
接着，说明第2实施方式。图9是表示第2实施方式的细胞培养装置的剖面结构的图。如图9所示，细胞培养装置40包括培养槽42、轴构件44、搅拌机构46以及过滤件48。
培养槽42优选由相对于培养液成分而言非活性且不具有细胞毒性的、相对于灭菌(包含去除污染、除菌或无菌)处理具有耐性的材料形成，可列举出例如玻璃、合成树脂、不锈钢等。培养槽42的内容量和形状等能够根据培养液的量来适当决定。在本实施方式中，培养槽42例如由合成树脂制成且构成为有底的圆筒形状。在培养槽42上设有用于将设于上部的开口部42o封堵的盖部42c。在盖部42c上设有空气的供气口/排气口、pH传感器58以及用于将含有细胞等的培养液取出的取出部43等。
轴构件44支承于培养槽42的底部42a。轴构件44包括导管部44a和支承部44b。导管部44a为直线状的构件并具有中空构造。导管部44a优选为相对于培养液成分而言非活性且不具有细胞毒性的、相对于灭菌处理具有耐性的材料，可列举出例如合成树脂、不锈钢等。导管部44a支承于培养槽42的底部42a。详细而言，导管部44a贯穿于在底部42a设置的支承台42d并被支承台42d支承固定。导管部44a的内部与在培养槽42的底部42a设置的抽吸口42e相连通。在导管部44a的侧壁部设有将内部和外部相连通的开口部44h。此外，在图9中，仅图示了一个开口部44h，但开口部44h的数量、大小、形状只要根据设计来适当设定即可。
支承部44b设于导管部44a的上部。支承部44b以将导管部44a的上端部的开口部封堵的方式配置。支承部44b与导管部44a同轴地延伸。
搅拌机构46包括安装部50和搅拌叶片52。安装部50可旋转地安装于轴构件44的支承部44b。详细而言，支承部44b的上端部插入于安装部50。
搅拌叶片52设置为能够以轴构件44为旋转中心进行旋转。详细而言，在搅拌叶片52的上端部连结有安装部50，通过使安装部50能够在轴构件44上旋转，从而使搅拌叶片52能以轴构件44为旋转中心进行旋转。搅拌叶片52优选由相对于培养液而言非活性且具有耐性的板材料形成，可列举出例如薄板状的合成树脂、不锈钢(例如，1mm厚的SUS316)等。搅拌叶片52的数量根据搅拌机构46的转速进行设定，但从搅拌时的平衡的观点考虑，优选以轴构件44为中心等间隔地设置搅拌叶片52，搅拌叶片52优选为例如两片～四片。在本实施方式中，例示出搅拌叶片52为两片的结构。
在搅拌叶片52上设有磁力体54。磁力体54配置于搅拌叶片52的下端。磁力体54是被四氟乙烯等覆盖的永磁体等。磁力体54在搅拌叶片52的下端部被以包围磁力体54的方式进行弯折加工而成的部分所固定。搅拌叶片52通过磁力体54的驱动进行旋转。具体而言，如图5所示，在培养槽42的下部配置有驱动马达34，该驱动马达34借助支承体33来驱动一对磁力体32从而使一对磁力体32旋转，搅拌叶片52随着与磁力体54相对配置的磁力体32的旋转而旋转。驱动马达34的轴以与轴构件44为同轴的方式配置。
过滤件48只要是能够使细胞等和培养液分离的构件即可，其材质、形状、数量等并不受特别限定，只要与设计相应地适当设定材质、形状、数量等即可，过滤件48例如为多孔体，优选为烧结体且构成为圆柱形状。过滤件48外套于轴构件44的导管部44a且以覆盖导管部44a的开口部44h的方式设于导管部44a的外表面(外侧)。即，过滤件48位于比以轴构件44为旋转中心进行旋转的搅拌叶片52的可动区域靠内侧的位置，并相对于搅拌叶片52独立地设于轴构件44。在细胞培养装置40中，经由过滤件48和导管部44a的内部自培养槽42抽吸培养液。
如以上说明那样，在本实施方式的细胞培养装置40中，在被设成不能旋转的轴构件44上设有过滤件48。搅拌机构46的搅拌叶片52以能够以轴构件44为旋转中心进行旋转的方式设置。这样，在细胞培养装置40中，搅拌叶片52相对于轴构件44旋转，轴构件44和过滤件48不旋转。因而，在细胞培养装置40中，由于不使用于抽吸培养液的机构旋转，因此能够谋求结构的简化。另外，在细胞培养装置40中，自培养槽42抽吸培养液的过滤件48以位于比搅拌叶片52的可动区域靠内侧的位置的方式设置在作为搅拌叶片52的旋转中心的轴构件44上，经由过滤件48和轴构件44的内部自培养槽42抽吸培养液。因此，在细胞培养装置40中，能够抑制过滤件48使因搅拌叶片52的旋转而产生的液流(层流)产生紊乱，关于对培养液的抽吸，能够谋求减轻对细胞作用的应力。因而，在细胞培养装置40中，能够实现简单的结构并能够良好地进行细胞培养。
在本实施方式中，轴构件44支承于培养槽42的底部42a，轴构件44插入到过滤件48中。这样，在细胞培养装置40中，对培养液进行抽吸的机构集中于轴构件44，且轴构件44不旋转，因此能够谋求装置的简化。
此外，第2实施方式的细胞培养装置40只要为轴构件支承于培养槽42的底部42a的结构即可，轴构件、过滤件、搅拌机构的结构也可以为其他形态。
图10～图14是表示第2实施方式的细胞培养装置的变形例的图。如图10所示，轴构件60包括导管部60a和支承部60b。导管部60a为直线状的构件并具有中空构造。导管部60a贯穿在培养槽42的底部42a设置的支承台42d并支承于培养槽42的底部42a。在导管部60a的上端部设有开口部60h。过滤件62以覆盖该导管部60a的开口部60h的方式设于导管部60a。具体而言，过滤件62构成为有底的圆筒形状，并且导管部60a的上端部插入于过滤件62。即，导管部60a的结构与所述实施方式的导管部44a不同，导管部60a未贯穿于过滤件62的内部。支承部60b设于过滤件62的上端部。支承部60b与导管部60a和过滤件62这两者同轴地延伸。搅拌机构46的安装部50安装于支承部60b。
如图11所示，轴构件70支承于培养槽42的底部42a。在轴构件70的上端部设有开口部70h。过滤件71以覆盖该轴构件70的开口部70h的方式设于轴构件70。具体而言，过滤件71构成为有底的圆筒形状，并且轴构件70的上端部插入于过滤件71。搅拌机构72包括安装部74和搅拌叶片76。安装部74可旋转地安装于轴构件70。详细而言，安装部74在比过滤件71的下端部靠下方的位置处安装于轴构件70。搅拌叶片76的下端部侧连结于安装部74，搅拌叶片76以隔着过滤件71的方式配置。
在搅拌叶片76上设有磁力体78。磁力体78配置于搅拌叶片76的下端。磁力体78是被四氟乙烯等覆盖的永磁体等。搅拌叶片76通过磁力体78的驱动进行旋转。具体而言，如图5所示，在培养槽42的下部配置有驱动马达34，该驱动马达34借助支承体33来驱动一对磁力体32从而使一对磁力体32旋转，搅拌叶片76随着与磁力体78相对配置的磁力体32的旋转而旋转。驱动马达34的轴以与轴构件70为同轴的方式配置。此外，搅拌叶片76的结构并不限定于图11所示的结构(形状)。
如图12所示，轴构件80包括导管部80a和密封部80b。导管部80a为直线状的构件并具有中空构造。导管部80a贯穿在培养槽42的底部42a设置的支承台42d并支承于培养槽42的底部42a。在导管部80a的侧壁部设有将内部和外部相连通的开口部81a、81b。开口部81a、81b在轴构件80的长度方向上分开并与后述的第1过滤件82a和第2过滤件82b各自的位置相对应地配置。此外，在图12中，分别示出一个开口部81a、一个开口部81b，但开口部81a、81b的数量、大小、形状只要与设计相应地适当设定即可。密封部80b将设于导管部80a的上端部的开口部密封(闭塞)。
过滤件82具有第1过滤件82a和第2过滤件82b。即，过滤件82被分割成两个零件。第1过滤件82a和第2过滤件82b构成为圆筒形状。第1过滤件82a外套于导管部80a的下端部侧并以覆盖开口部81a的方式设于导管部80a的外表面(外侧)。第2过滤件82b外套于导管部80a的上端部侧并以覆盖开口部81b的方式设于导管部80a的外表面(外侧)。第1过滤件82a的上端部和第2过滤件82b的下端部以隔开规定的间隔的方式分开。安装部74配置在第1过滤件82a与第2过滤件82b之间并可旋转地安装于导管部80a(轴构件80)。搅拌叶片76连结于安装部74并以隔着过滤件82的方式配置。此外，图12所示的搅拌叶片76的下端部的内侧为与支承台42d的形状相对应的形状。
如图13所示，轴构件90为直线状的构件并具有中空构造。轴构件90贯穿在培养槽42的底部42a设置的支承台42d并支承于培养槽42的底部42a。在轴构件90的上端部设有开口部90a，在轴构件90的侧壁部的下端部侧设有将内部和外部相连通的开口部90b。过滤件92具有第1过滤件92a和第2过滤件92b。第1过滤件92a构成为圆筒形状。第1过滤件92a外套于轴构件90的下端部侧并以覆盖开口部90b的方式设于轴构件90的外表面(外侧)。第2过滤件92b以覆盖轴构件90的开口部90a的方式设于轴构件90。具体而言，第2过滤件92b构成为有底的圆筒形状，并且轴构件90的上端部插入于第2过滤件92b。第1过滤件92a的上端部和第2过滤件92b的下端部以隔开规定的间隔的方式分开。此外，在图13中，示出了一个开口部90b，但开口部90b的数量、大小、形状只要与设计相应地适当设定即可。安装部74配置在第1过滤件92a与第2过滤件92b之间并可旋转地安装于轴构件90。搅拌叶片76连结于安装部74并以隔着过滤件92的方式配置。此外，图13所示的搅拌叶片76的下端部的内侧为与支承台42d的形状相对应的形状。
如图14所示，轴构件100具有第1导管部110和第2导管部120。第1导管部110和第2导管部120为直线状的构件并具有中空构造。第1导管部110贯穿在培养槽42的底部42a设置的支承台42d并支承于培养槽42的底部42a。在第1导管部110的上端部设有开口部110a。在第2导管部120的下端部和上端部分别设有开口部120a和开口部120b。
过滤件130具有第1过滤件130a和第2过滤件130b。第1过滤件130a以覆盖第1导管部110的开口部110a和第2导管部120的开口部120a的方式设于第1导管部110和第2导管部120。具体而言，第1过滤件130a构成为在两端部设有插入孔的圆柱形状，第1导管部110的上端部和第2导管部120的下端部插入到插入孔中。第2过滤件130b以覆盖第2导管部120的开口部120b的方式设于第2导管部120。第2过滤件130b构成为有底的圆筒形状，并且第2导管部120的上端部插入于第2过滤件130b。第1过滤件130a和第2过滤件130b通过第2导管部120连结起来并且彼此之间隔开规定的间隔。安装部74配置在第1过滤件130a与第2过滤件130b之间并可旋转地安装于第2导管部120。搅拌叶片76连结于安装部74并以隔着过滤件130的方式配置。此外，图14所示的搅拌叶片76的下端部的内侧为与支承台42d的形状相对应的形状。
本发明并不限定于所述实施方式，能够在不脱离本发明的主旨的范围内进行各种变形。
在所述实施方式中，以搅拌叶片27、52、76为例进行了说明，但搅拌叶片的形状并不限定于此。搅拌叶片的形状优选为能够谋求减轻对细胞作用的应力的结构。
实施例
以下，利用实施例来进一步详细说明本实施方式，但本实施方式并不限定于这些实施例。
实施例1
细胞培养系统的控制装置
作为细胞培养系统的控制装置而使用了八连动动物细胞培养装置Bio Jr.8(BJR－25NA1S－8C，エイブル株式会社)。能够利用1台本控制装置来控制8台100mL容量的细胞培养装置。测量、控制项目是搅拌速度、温度、pH以及溶解氧浓度(DO)。在本控制装置中，能够独立地控制各细胞培养装置。
准备人类iPS细胞
作为培养细胞，使用了人类iPS细胞(253G1)。将细胞接种在涂敷有玻连蛋白(Life Technologies公司)的培养皿(康宁公司)上，作为培养液而使用了Essential-8来进行细胞培养。每天更换培养液，并以每三至四天一次的频率来实施传代。
人类iPS细胞的培养
在实施例1中，制作了图15所示的细胞培养装置。作为培养槽15而使用了玻璃制的专用槽(エイブル株式会社)，使培养液为100mL。接种了细胞数为2×107个(密度2×105个/mL)的准备好的人类iPS细胞，并开始了培养。将该时刻作为培养第0天。在Essential-8培养基(Life Technologies公司)中添加了以下的成分而将其作为培养液使用。即，添加了作为ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho连接激酶)抑制剂的10μM的Y-27632(和光纯药工业株式会社)、750ng/mL浓度的肝素(Sigma-Aldrich公司)。在培养槽15中设置了搅拌叶片22，搅拌叶片22的转速为60rpm。针对培养槽15设置了能够分别测量温度、pH、溶解氧浓度的传感器(エイブル株式会社)。另外，进行了将溶解氧浓度控制为40％的设定，为此，设置了气体导入管线，以便相对于培养槽15内的培养液自上表面通入氧气、氮气、空气的混合气体。并且，设置了用于将气体自培养槽15排出的导出管线。将温度设定为37℃。
作为轴构件17，使用了不锈钢制的中空管(外径3mm，内径1.8mm)。作为过滤件21，使用了包含聚乙烯的烧结体的、直径8mm、长度15mm、平均孔径30μm的有底圆筒型过滤件。轴构件17固定于培养槽15的盖部的中心，轴构件17构成为如下构造：透过过滤件21后的培养液能够经由该轴构件17的中空部分自培养槽15被取出。另外，在培养槽15上设置了能够使培养液返回的口。搅拌叶片22设置为能够以所述轴构件17为中心进行旋转。过滤件21设置在过滤件21的圆筒上表面与培养液的液面接近的高度位置。
作为成分调整液槽，使用了容量为1L的玻璃制灭菌瓶。在成分调整液槽的盖的局部设置了通气管线、培养液的入口管线以及出口管线。在成分调整液槽内，作为培养液成分调整膜而设置了如下那样构成的部件，即，捆束400根旭化成聚砜透析器APS(旭化成医疗株式会社)的中空纤维，使其有效长度为20cm，并以使中空纤维两端部的管腔构造敞开的方式利用聚氨酯粘接剂将中空纤维固定。中空纤维束配置在成分调整液槽的内部并利用回路将中空纤维束的两端部和培养液的入口管线、出口管线连接起来。作为成分调整液，使用了1L以与培养液成为相同浓度的方式向Essential-6(Life Technologies公司)中添加Y-27632和肝素而成的溶液。
作为送液回路，使用了硅制管(内径外径)。
作为培养液的送液泵，使用了两台RP-23的蠕动泵(エイブル株式会社)。两台泵被设置成分别与将培养槽15和成分调整液槽连接起来的送液回路相连接，并处于能够进行送液的状态。
在封闭系回路内，向相对于培养槽15和成分调整液槽独立的10mL注射器(泰尔茂株式会社)中设置了2mL的以下溶液，即，向DMEM/F12(LifeTechnologies公司)培养液中以bFGF(Life Technologies公司)为10μg/mL、肝素(Sigma-Aldrich公司)为250μg/mL的浓度溶解bFGF和肝素而成的溶液。
利用以上说明的方法制作了图1所示的细胞培养系统。使用本系统并利用以下的方法制造了包含iPS细胞的细胞群。
自培养第1天就开始利用送液泵使培养液循环。循环速度如下：第1天为100mL/每天，第2天为200mL/每天，第3天为400mL/每天，第4天之后为600mL/每天。对两台泵的流速进行了微调，以便能够将培养槽15的液容量实质上维持在相同水平，一边连续地灌注培养液一边实施了培养，直到第6天。在培养第2天和第4天，自10mL注射器投放了1mL的bFGF与肝素的混合液。在培养第6天，完成细胞培养，如下那样进行了细胞数的测量和未分化率的测量。
测量细胞数
在培养第6天自培养槽15回收细胞群，在利用细胞分离/分散溶液Accumax(Innovative Cell Technologies公司)对细胞群进行10分钟处理而使其为单细胞的状态之后，利用台盼蓝拒染法将死细胞染色，使用计数板仅对活细胞进行计数。
测量未分化率
为了确认人类iPS细胞维持着未分化状态的情况，利用流式细胞术对作为未分化标记的SSEA-4的阳性率进行了测量。作为抗体，使用了抗人类/鼠类SSEA-4单克隆抗体FAB1435F(R&D Systems公司)，作为测量装置，使用了Cell Lab QuantaSC(贝克曼库尔特株式会社)。将SSEA-4的阳性率作为未分化率。
实施例2
在实施例2中，如图16所示，过滤件21的设置高度位置设置在培养槽15的底面和液面高度的中间，除此以外，为与实施例1的细胞培养装置相同的构造。
比较例1
在比较例1中，如图17所示，将过滤件21和轴构件17设置在了搅拌叶片22的旋转范围的外侧，改变了培养液的入口管线和出口管线，除此以外，为与实施例1的细胞培养装置相同的构造。
将所述实施例1、实施例2以及比较例1的培养结果表示在以下的表1中。
表1
细胞数(×108个) 未分化率(％)
实施例1 5.0 98.7
实施例2 5.8 99.1
比较例1 0.2 99.4
如表1所示，在比较例1的细胞培养装置中，未发现细胞的增殖，而在实施例1和实施例2的细胞培养装置中，与培养开始时相比，实现了20倍以上的增殖。另外，在实施例1和实施例2的细胞培养装置中，SSEA-4为阳性的未分化状态下的细胞比率均为95％以上，维持了较高的未分化率。由此示出了，本实施方式的方法对人类多功能干细胞的细胞培养装置是有效的。
附图标记说明
5、40、细胞培养装置；15、42、培养槽；15c、盖部；17、44、轴构件；17a、17b、17Aa、开口部；17h、44h、开口部；19、46、搅拌机构；21、48、过滤件；27、52、76、搅拌叶片；42a、底部。

Claims (12)

1.一种细胞培养装置，其中，
该细胞培养装置具备：
培养槽，其用于容纳含有细胞的培养液；
轴构件，其至少一部分配置在所述培养槽内；
搅拌部件，其支承于所述轴构件并配置在所述培养槽内，该搅拌部件具有以能够以所述轴构件为旋转中心进行旋转的方式设置的搅拌叶片；以及
过滤件，其以与所述轴构件相接触的方式设置，所述培养液能透过该过滤件，而所述细胞不能透过该过滤件，
所述轴构件的至少一部分为中空，所述轴构件设有用于将所述培养液导入该中空的部分的内部或将所述培养液自所述内部导出的开口部，且所述轴构件被设成不能旋转，
所述过滤件位于比以所述轴构件为旋转中心进行旋转的所述搅拌叶片的可动区域靠内侧的位置，且所述过滤件相对于所述搅拌叶片独立地设于所述轴构件，
经由所述过滤件和所述轴构件的所述内部自所述培养槽抽吸所述培养液和/或向所述培养槽供给所述培养液。
2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，
所述轴构件支承于所述培养槽的底部。
3.根据权利要求2所述的细胞培养装置，其中，
在所述轴构件的下端部设有所述开口部，且所述轴构件的上端部闭塞，
在所述轴构件的侧面部设有与所述内部相连通的开口部，
所述过滤件以覆盖所述侧面部的所述开口部的方式设于所述轴构件的外表面。
4.根据权利要求3所述的细胞培养装置，其中，
所述过滤件构成为筒状并以覆盖所述侧面部的所述开口部的方式套在所述轴构件的外侧。
5.根据权利要求2所述的细胞培养装置，其中，
所述轴构件构成为筒状，在所述轴构件的下端部设有所述开口部，且在所述轴构件的上端部设有与所述内部相连通的开口部，
所述过滤件以覆盖所述上端部的所述开口部的方式设于所述轴构件。
6.根据权利要求5所述的细胞培养装置，其中，
所述过滤件构成为有底的筒状并以覆盖所述上端部的所述开口部的方式套在所述轴构件的外侧。
7.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，
所述轴构件支承于所述培养槽的盖部。
8.根据权利要求7所述的细胞培养装置，其中，
所述轴构件构成为筒状，在所述轴构件的上端部设有所述开口部，且在所述轴构件的下端部设有与所述内部相连通的开口部，
所述过滤件以覆盖所述下端部的所述开口部的方式设于所述轴构件。
9.根据权利要求8所述的细胞培养装置，其中，
所述过滤件构成为有底的筒状并以覆盖所述下端部的所述开口部的方式套在所述轴构件的外侧。
10.根据权利要求7所述的细胞培养装置，其中，
在所述轴构件的上端部设有所述开口部，且所述轴构件的下端部闭塞，
在所述轴构件的侧面部设有与所述内部相连通的开口部，
所述过滤件以覆盖所述侧面部的所述开口部的方式设于所述轴构件的外表面。
11.根据权利要求10所述的细胞培养装置，其中，
所述过滤件构成为筒状并以覆盖所述侧面部的所述开口部的方式套在所述轴构件的外侧。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的细胞培养装置，其中，
所述过滤件为多孔体。
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