DE10019520A1

DE10019520A1 - Apparatur als Einsatz für Kulturgefäße zur optimierten Begasung und Dosierung von geschüttelten oder gerührten Dreiphasensystemen

Info

Publication number: DE10019520A1
Application number: DE2000119520
Authority: DE
Inventors: Christoph Erhardt; Ursula Erhardt
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-04-20
Filing date: 2000-04-20
Publication date: 2001-10-25

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine aufblasbare oder auffaltbare Apparatur, die in geschüttelte oder gerührte Kulturgefäße für biologische und (bio)chemische Reaktionen eingesetzt wird oder das Kulturgefäß selbst darstellt und über geeignete Vorrichtungen zum Erzeugen einer turbulenten Durchmischung und/oder zum Begasen und/oder zum Dosieren in dieses Kulturgefäß und/oder für die Fixierung vom Meßwertaufnehmern (Sondenarmatur) in dem Kulturgefäß verfügt. DOLLAR A Technisches Problem DOLLAR A Kulturgefäße für biologische oder biochemische Reaktionen weisen gegenüber Bioreaktoren erhebliche verfahrenstechnische und prozesstechnische Nachteile auf, so dass Verfahren beim Scale Up in den Produktionsmaßstab oftmals aufwendigt nachentwickelt werden müssen. DOLLAR A Lösung des Problems DOLLAR A Durch einen auffaltbaren oder aufblasbaren Einsatz, der speziell auf die Anwendung angepasst, in konventionelle Kulturgefäße eingesetzt wird oder ein komplettes Kulturgefäß ausbildet, wird erstmals eine Verfahrensentwicklung und -simulation unter optimierten Begasungs- und Dosierungsbedingungen ermöglicht, ebenso wie blasenfreie Begasung von Zellkulturen, spezielle aufwendige Verfahren wie Fed Batch oder Dialysefermentationen. DOLLAR A Die Ausbeute von Vorkulturen wird erheblich gesteigert, die mit der erfindungsgemäßen Apparatur durchgeführten Prozesse sind meß- und regeltechnisch sowie verfahrentechnisch mit Produktionsprozessen vergleichbar. DOLLAR A Anwendungsgebiet...

Description

Stand der Technik

Die Fermentationstechnologie hat vorwiegend auf dem Gebiet der Kultivierung von (genneukombinierten) Mikroorganismen und Zellen in den letzten 20 Jahren erhebliche Fortschritte gemacht.

Ziel ist, Produktionsverfahren und Verfahrensentwicklungen zur Kultivierung von Zellen und Mikroorganismen durch maximale Ausbeuten so kostengünstig wie möglich zu gestalten. Der limitierende Faktor ist dabei meist nicht der Gehalt des Nährmediums, sondern die technische Ausrüstung der Kulturgefäße, die den Nachschub und die Durchmischung von Gasen und Flüssigkeiten gewährleisten. Die Kultivierung beginnt meist mit einer Beimpfung von kleinen Kulturflaschen mit 10 ml Maßstab und wird in Anlagen bis 1000 m^∧3 mit hoher technischer Ausrüstung weitergeführt.

Die Verfahrensentwicklung, auch für große Anlagen wird aus Kostengründen in kleinen Kulturflaschen soweit wie möglich betrieben.

Die Verfahrensentwicklung in kleinen Kulturgefäßen betrifft jedoch meist nur die Optimierung der Medienbestandteile, nicht der Mengen- und Nachfütterintervalle, da die Kulturgefäße und deren technische Ausrüstung sehr stark differieren. Die Kulturbedingungen sind so unterschiedlich und keineswegs vergleichbar, daß beim Scale up in jedem Falle nachoptimiert werden muß.

Stand der Technik von Anlagen (Reaktoren) im Maßstab 0,001 m^∧3 bis 1000 m^∧3

Fermenter sind Reaktionskessel aus Glas oder meist Edelstahl im Maßstab von 1 Liter bis mehrere 100 Kubikmeter Arbeitsvolumen. Sie dienen im Produktionsmaßstab der kontrollierten Durchführung von biologischen oder biochemischen Reaktionen in der Biotechnologie, der Lebensmittelindustrie und der Abwasserreinigung.

Es lassen sich drei wesentliche Bauelemente darstellen:

1. a.) der Reaktionsbehälter
Der Behälter ist meist ein Rührkessel mit eingebauter Rührwelle und Rührblättern, mit oder ohne Wirbelstrombrechem (Schikanen). Weiterhin kann die Durchmischung des Mediums über äußere oder innere Flüssigkeitsschlaufen erfolgen, die mit Luft oder Pumpen angetrieben werden. Die Begasung erfolgt über Luftausströmerrohre oder Luftausströmerringe. Messonden werden über seitliche oder im Deckel angebrachte Gewindestutzen eingebracht.
2. b.) Versorgungstechnik
Über eine neben dem Reaktionsbehälter angebrachte Versorgungstechnik wird die Einhaltung der Reaktionsbedingungen gewährleistet. Hierzu zählen u. a. der Rührantrieb, die Temperierung, die Dosierstrecken für pH Regelung oder Substratdosierung und für die Regelung der Belüftung
3. c.) Mess- und Regeltechnik
In einem neben dem Reaktionsbehälter und der Versorgungstechnik angebrachten Schaltschrank befindet sich die Mess- und Regeltechnik oder ein EDV gestütztes Prozessleitsystem, das die Einhaltung der Reaktionsbedingungen im Reaktor gewährleistet und dokumentiert.

Um im Produktionsmaßstab einen Fermenter wirtschaftlich betreiben zu können, müssen die optimalen Reaktionsbedingungen in einer Vielzahl von Vorversuchen ermittelt werden. Der hohe technische und wirtschaftliche Aufwand schließt den Einsatz von Fermentern für diese Vorversuche (z. B. Medienoptimierung) aus, so daß auf die nachfolgend beschriebenen Kulturgefäße, überwiegend geschüttelte Erlenmeyerkolben zurückgegriffen wird.

Stand der Technik Kulturgefäße im Labormaßstab

Die für Mikroorganismen verwendeten Kulturgefäße werden im Maßstab 10 ml bis 5000 ml Volumen unter temperierten Bedingungen entweder auf geeigneten Schüttelapparaturen geschüttelt oder auf Magnetrührern gerührt. Das neben einer Vielzahl von Kulturgefäßen am häufigsten verwendete Kulturgefäß ist der Erlenmeyerkolben (s. Katalog Fisher Scientific, S. 249 ff) im Maßstab 10 ml bis 1000 ml. Es handelt sich um reine 2 Phasensysteme, da eine Begasung des Kulturgefäßes nicht stattfindet. Durch die Kreisbewegung des Schüttlers bildet sich in der Reaktionsflüssigkeit eine meist laminare Kreisströmung aus, die nur eine mangelnde Durchmischung gewährleistet.

Obwohl Erlenmeyerkolben mit im Glas eingepressten Wirbelstrombrechern (Schikanen) verwendet werden können, um eine turbulente Mischung der Reaktionsflüssigkeit zu erzeugen, ist immer noch der Gasaustausch in der Reaktionsflüssigkeit eingeschränkt, da der Gasaustausch nur an der Phasengrenzfläche zwischen Flüssigkeit und head space (darüber liegender Luft) diffusionskontrolliert erfolgen kann. Eine Zuführung der dritten Phase (Gas) fehlt. Die Effektivität gegenüber einem Dreiphasensystem liegt unter 1 Prozent.

Die Nachlieferung von unverbrauchter Zuluft erfolgt durch Diffusion über statische Filtersysteme oder durch Diffusion unter einer Stahlkappe und ist somit ebenfalls ein limitierender Schritt.

Ebensowenig existieren Möglichkeiten für eine geregelte Flüssigkeitendosierung oder das Einbringen von Messsonden. Bedingt durch die Geometrie der Erlenmeyerkolben (Enghals) ist das Einbringen fester Einbauten in den Reaktionsraum stark eingeschränkt.

Die Leistungen großer Reaktoren lassen sich nicht annähernd simulieren und definierte und reproduzierbare Bedingungen, wie sie zur Dokumentation der Reaktion oder für ein Scale up in große Reaktoren benötigt werden, lassen sich hiermit nicht erzielen.

Weiterhin verwendet werden sog. Blasensäulen in Form von Kulturflaschen (s. Katalog Fisher Scientific, S. 248), bei denen der Glasboden durch eine poröse Platte ersetzt ist, durch die Luft in die Kulturflasche eingeblasen wird. Diese Art der Begasung (Dreiphasensystem) ist effektiver als das o. g. 2 Phasensystem, jedoch limitiert die Einblasrichtung (Blasen durchströmen die Flüssigkeit auf kürzeren Weg) nach oben auf Grund der kürzeren Kontaktzeit und der Förderung der Schaumbildung die Belüftungsrate, die fehlende Kreisbewegung durch Schütteln oder Rühren, sowie die fehlenden Wirbelstrombrecher (Schikanen) vermindern ebenfalls die Effektivität der Mischung der Reaktionsflüssigkeit (Infors Homepage www.infors.ch/d/d5a.htm). Strömungstechnisch sind Blasensäulen somit äußerst ungünstig, da häufig nur eine laminare Aufwärtsbewegung der Flüssigkeit erzeugt wird.

Durch einen seitlichen Glasstutzen kann ggf. eine pH Sonde zur Messung des pH Wertes eingebracht werden, sowie eine Probenahme der Reaktionsflüssigkeit erfolgen.

Im Bereich der Kultivierung von Zellen werden gerührte "Spinner", d. h. Glasgefäße mit einem am Deckel eingehängten Magnetrührstab verwendet (s. Katalog Fisher Scientific, S. 251). Der Antrieb erfolgt über einen Magnetrührer, der unter dem Gefäß steht, von unten. Wirbelstrombrecher (Schikanen) oder Belüftungssysteme in Form von Einbauten sind nicht vorhanden und auf Grund der Geometrie, ähnlich wie beim Erlenmeyerkolben auch nicht möglich.

Somit wird vom Rührstab nur eine äußerst uneffektive, häufig laminare Kreisströmung erzeugt mit dem Nachteil mangelnder Durchmischung.

Die Verwendung von Kulturgefäßen weist folgende Probleme und Nachteile auf:

- keine Vergleichbarkeit mit großen Fermentern
- keine optimale Versorgung mit Gasen oder Flüssigkeiten
- keine Dokumentation des Prozesses
- keine Reproduzierbarkeit

In keinem der im Labormaßstab verwendeten, bekannten Gefäße werden Einbauten gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, die eine effiziente, turbulente Durchmischung der Reaktionsflüssigkeit mit Wirbelstrombrechern (Schikanen) unter Ausnutzung der Kreisbewegung des Schüttlers gewährleistet und gleichzeitig die Möglichkeit für eine effektive Begasung (Ausströmrichtung des Gases nach unten, daraus folgt, die Blasen bewegen sich von unten Richtung Kreisbewegung und werden an den Wirbelstrombrechern turbulent vermischt, die Neigung zur Schaumbildung minimiert) und die Möglichkeit für Dosierstrecken, Probenahme und den Einbau von Messsonden ermöglicht. Weiterhin neu ist die Technik des Aufblasens oder des Auffaltens, die es ermöglicht, die Apparatur durch enge Öffnungen in beliebige Gefäße einzubringen und an beliebige Gefäße anzupassen.

Die Erfindung ermöglicht somit, mit geringsten Aufwand äußerst effiziente und beliebig optimierte Reaktionsgefäße zu verwenden, die den Stand der bisherigen Technik um Größenordnungen übertreffen.

Mehrere Firmen (z. B. Infors AG, www.infors.ch/d/d5a.html oder Das GIP GmbH, www.dasgip.de) bieten neuerdings "Zwitterlösungen" an, bei denen eine Versorgungstechnik und eine EDV gestützte Mess- und Regeleinheit parallel mehrere Kleinfermenter oder bis zu 16 Kulturgefäße betreibt. Dies ermöglicht, den wirtschaftlichen und technischen Aufwand zu verkleinern und den Zeitraum für die Vorversuche durch paralleles Arbeiten zu verkleinern. Nachteilig ist auch hier, daß die Reaktionsbedingungen, insbesondere durch die Kulturgefäße, nicht mit den Reaktionsbedingungen der Fermenter verglichen werden können und so die Optimierung nur unzulänglich durchgeführt wird. Eine Sauerstoffeintragsrate, die im Fermenter durchaus 100 mal höher sein kann als im geschüttelten Erlenmeyerkolben führt zu vollkommen anderen Stoffwechselbedingungen des Organismus und macht die vorher optimierte Medienzusammensetzung und Produktionsrate zunichte.

Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme, da es die erfindungsgemäße Apparatur für Kulturgefäße ermöglicht, Reaktions-, Mess-, und regeltechnische Bedingungen analog zu Fermentern zu schaffen und so eine direkte Vergleichbarkeit der Ergebnisse der Vorversuche für die spätere Produktion gegeben ist. Dies schafft drastische Zeit- und Kostenvorteile bei der Erarbeitung von neuen Produktionsverfahren und ermöglicht hohe Ausbeutesteigerungen der Vorkulturen.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Apparatur, die als aufblasbarer oder auffaltbarer Einsatz in beliebige Kulturgefäße, (z. B. in Enghalskolben), eingesetzt wird und die durch Ihren Aufbau, der durch Aufblasen oder Auffalten entsteht und der durch den Zuschnitt der Folien an beliebige Kulturgefäße angepasst wird und die die Reaktionsbedingungen im Kulturgefäß erstmalig optimal gestaltet und mit den Reaktionsbedingungen großer Reaktoren auf einfache Weise vergleichbar macht.

Die Volumenzunahme von der nicht aufgeblasenen oder aufgefalteten Apparatur bis zur endgültigen Verwendungsform kann bis um das 100 fache des Volumens betragen. Das Handling und die Lagerfähigkeit der Apparatur wird so wesentlich vereinfacht.

Die vorliegende Erfindung kann, muß aber nicht, hierbei mehrere Funktionen im Kulturgefäß übernehmen:
Eine Übersicht über den Aufbau gibt die beiliegende Schemazeichung 1.

Wirbelstrombrecher (Schikanen)

Die Apparatur besteht aus dehnbaren oder nicht dehnbaren synthetischen oder natürlichen Polymeren und mindestens einer, bevorzugt zwei, maximal 16 im definierten Winkel, 0 Grad bis 180 Grad, bevorzugt 90 Grad, zur vom Schüttelgerät oder Rührer erzeugten Kreisströmung, angebrachten Schikanen. Sie erzeugt eine turbulente Durchmischung der Reaktionsflüssigkeit im Bereich der Schikane(n). Zur Erhöhung der Turbulenzen können die Schikane(n) gelocht sein (Düsenwirkung) (Lochgröße 1% bis 20% des Schikanendurchmessers, bevorzugt 5%) und/oder über einen Hinterschnitt verfügen, d. h. etwas Abstand zur Gefäßwand haben (Abstand 1% bis 20% des Schikanendurchmessers, bevorzugt 5%).

Die Schikane(n) bestehen aus einer entsprechend der gewünschten Gefäßgeometrie geschnittenen Folie, die oben in den Aufblasschlauch übergeht (PK in).

Der optimale Durchmesser der Schikane beträgt 10% bis 30%, bevorzugt 15% des Durchmesser des Kulturgefäßes.

Am Boden des Gefäßes wird zur besseren Fixierung der Apparatur ein ebenfalls aufblasbarer Fixierring mit einem Durchmesser von 2-16 mm, bevorzugt 4 mm, oder ein der Gefäßform angepaßtes Doppel T Fixierstück, angebracht. Dieser sorgt zusätzlich für den Druckausgleich in den einzelnen Schikanen.

Zur Verbesserung der Stabilität sind mehrere Schikanen durch einen oder mehrere Stege, die ebenfalls aufblasbar sind, verbunden. Diese Stege verhindern ein "Umklappen" der Schikanen bei zu hoher Anströmkraft durch die Reaktionsflüssigkeit.

Zur weiteren Versteifung der Schikanen kann an der Rückseite eine Schiene in die Folie der Schikane eingeschweißt sein oder ein wiederverwendbarer Einsatz zur Fixierung der Apparatur verwendet werden.

Die Wirbelstrombrecher werden vor Start der Reaktion an einer Öffnung verschlossen und an der anderen Öffnung mit Prozessgas, bevorzugt Luft, mit einem Druck von 0,1 bis 3 bar, bevorzugt 0,5 bar, aufgeblasen und dann die andere Öffnung verschlossen, um die durch den Druck erfolgte Formgebung konstant zu halten.

Weiterhin ermöglichen die Wirbelstrombrecher die bei der Kultivierung von Zellen oftmals gewünschte blasenfreie Begasung und Entgasung der Reaktionsflüssigkeit. Hierbei erfolgt die Be/Entgasung nicht mit in den Reaktionsraum eingeströmte Luft (s. u.), sondern durch Diffusion des Gases aus dem Hohlraum des Wirbelstrombrechers durch die Kunststoffolie oder definierte Teile davon, für diese Anwendung bevorzugt Silikon, in die Reaktionsflüssigkeit oder aus der Reaktionsflüssigkeit. Bei dieser Anwendung werden die Aufblas- und Auslaßöffnung nicht verschlossen, sondern durch die Aufblasöffnung kontinuierlich Gas nachgeliefert und durch einen Druckregler an der Auslaßöffnung konstant unter einem Überdruck von 0,2 bis 3 bar, bevorzugt 0,5 bar, gehalten.

Eine weitere Sonderform der blasenfreien Begasung stellt der Ersatz des Gases durch Flüssigkeiten mit sonst identischen Aufbau dar.

Manche Flüssigkeiten verfügen über wesentlich höhere Gaslöslichkeiten als Wasser. Benutzt man nun eine solche Flüssigkeit als Träger für ein Gas, z. B. verfügen perfluouierte Kohlenwasserstoffe über sehr hohe Sauerstofflöslichkeiten, entsteht gegenüber der Reaktionsflüssigkeit ein Diffusionsgradient, der zum Eindiffundieren des gewünschten Gases, z. B. O2 oder im umgekehrten Fall zur Abdiffusion von in der Reaktionsflüssigkeit entstandenen Gasen, z. B. CO2, führt.

Weiterhin ist es möglich, die Folien der Wirbelstrombrecher oder Teile davon aus Polymeren herzustellen, die für Substanzen definierter Molekülgröße durchlässig sind. Auf diese Weise kann von der Flüssigkeit aus, die die Wirbelstrombrecher auf oben genannte Weise in Form hält, ein Zu- oder Abtransport von Substanzen zur oder aus der Reaktionsflüssigkeit erfolgen. Als Beispiel sei hier die Nachfütterung von Zellkulturen mit Glucose bei gleichzeitiger Entfernung des störenden Lactats genannt.

Bei Einsatz mehrerer Apparaturen in ein Kulturgefäß ist es möglich, z. B. über die eine Apparatur eine blasenfreie Begasung durchzuführen und über eine andere Apparatur durch ein integriertes Molekularsieb Substrat nachzuliefern, wobei beide Apparaturen erfindungsgemäß die Funktion der Wirbelstrombrecher erfüllen.

Zur Erhöhung der dem Diffusionsvorgang zugänglichen Austauschfläche kann die sonst glatte Oberfläche der Apparatur durch Zotten, Fasern, Falten, Lamellen oder sonstigen, die Oberfläche erhöhenden Geometrieformen, vergrößert werden.

Wird das durch die Apparatur fließende Fluid temperiert, funktioniert die Apparatur wie ein Wärmetauscher und ermöglicht so eine exakte Temperaturregelung des Kulturgefäßes an Stelle sonst üblicher Temperiereinheiten.

Begasungssystem

In die Folie, aus der die Wirbelstrombrecher geformt sind, ist neben den Wirbelstrombrechern ein Kanal von 1 mm bis 5 mm Stärke, bevorzugt 2 mm, eingeschweißt, der oben an der Deckeldurchführung mit einem Sterilfilter zur sterilen Begasung des Systems bestückt werden kann und der unten, zum Boden des Kulturgefäßes gerichtet, in die Reaktionsflüssigkeit mündet. Die untere Öffnung ist am unteren Steg befestigt. Durch diesen Kanal wird die dritte Phase, das Gas (PI in), in den Reaktionsraum eingebracht. An Stelle der Kanalerzeugung durch Einschweißen kann ein geeigneter Schlauch ein- oder angeschweißt werden.

Probenahmesystem

Analog zum Begasungssystem ist neben den Wirbelstrombrechern ein Kanal mit geeigneten Abmessungen eingeschweißt, der am Boden des Kulturgefäßes mündet und nach der Deckeldurchführung offen ist. Durch diesen Kanal kann mit einer Einmalspritze beliebig oft ein Aliquot der Reaktionsflüssigkeit entnommen werden (Probe out).

An Stelle der Kanalerzeugung durch Einschweißen kann ein geeigneter Schlauch ein- oder angeschweißt werden.

Abluftsystem

Analog zum Begasungssystem ist neben den Wirbelstrombrechern ein Kanal mit geeigneten Abmessungen eingeschweißt, der im oberen Luftraum des Kulturgefäßes mündet und nach der Deckeldurchführung offen ist. Durch diesen Kanal kann Abluft aus dem Luftraum über der Reaktionsflüssigkeit entnommen werden, z. B. um die Gaswechselrate der Reaktion zu bestimmen.

Dosierstecken

Analog zum Begasungssystem sind am gegenüberliegenden Wirbelstrombrecher drei Kanäle mit geeigneten Abmessungen eingeschweißt, über die beliebige Flüssigkeiten, wie Substrat, Lauge, Schaumbekämpfungsmittel in die Reaktionsflüssigkeit dosiert werden können. Außerhalb der Deckeldurchführung kann ein beliebiges Dosiergerät angeschlossen werden, die Kanäle münden am oberen Steg kurz über oder unterhalb des Flüssigkeitspiegels.

Sondenarmatur

Die Sondenarmatur ist ein Rohr, das an der Durchführung der Deckelöffnung und durch Ösen an den Stegen befestigt ist. Der Durchmesser beträgt 2 bis 25 mm, bevorzugt 8 mm. Durch die Armatur können geeignete Messonden, wie pH Sonden, pO2 Sonden, Trübungsmessung, Levelsensor für Flüssigkeitsvolumen oder Schaumdetektion direkt in die Reaktionsflüssigkeit eingebracht werden. Die Abdichtung zur Armatur hin erfolgt durch O- Ringe oder durch Einschweißen der Sonden.

Ist ein direkter Sondenkontakt mit der Reaktionsflüssigkeit nicht gewünscht, können die Sonden durch eine Membran von der Reaktionsflüssigkeit getrennt werden. Die Membran muß die Diffusion der zu messenden Substanzen ermöglichen, jedoch eine sterile Absperrung zur Reaktionsflüssigkeit hin darstellen. Beispielsweise wird hierdurch die Messung von gelösten Sauerstoff in sterilen Reaktionsflüssigkeiten mit unsterilen pO2 Sonden ermöglicht.

Die Beschreibung der Erfindung erfolgt beispielhaft an einem 1000 ml Erlenmeyerkolben mit einem Reaktionsvolumen von 500 ml. Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß diese Beschreibung auf andere Kulturgefäße mit anderen Geometrien und Volumina (10 ml bis 5000 ml) einfach übertragen werden kann. Den schematischen Aufbau zeigt die Schemazeichnung 1.

Aus einer Kunststoffolie mit einer Stärke zwischen 0,1 mm bis 4 mm, bevorzugt 1 mm, werden zwei spiegelgleiche Teile gemäß Schnittzeichnung 2 und der zugehörige Fixierring und die beiden Stege geschnitten.

Die Auswahl der Art des Kunststoffs, bevorzugt Polyurethan, und die Art des Verbindens (Heißsiegeln, Kaltsiegeln, Kleben, Schweißen, Ultraschallschweißen), bevorzugt Heißsiegeln, ist abhängig von der Vorbehandlung (z. B. Sterilisieren) und Beschaffenheit der Reaktionsflüssigkeit. Es kommen alle Kunststoffe in Frage, die bezüglich Temperaturbeständigkeit und chemischer Beständigkeit mit der Vorbehandlung und Beschaffenheit der Reaktionsflüssigkeit verträglich sind und die durch geeignete Techniken miteinander verbunden werden können.

Der Einsatz kann auch, wie die Formen von Luftballons, als aufblasbare Kunststofform, aus einem Stück bestehen.

Zusätzlich ist es möglich, die Apparatur nicht nur als Einsatz für Kulturgefäße zu verwenden, sondern mit der auffaltbaren oder aufblasbaren Apparatur die Wandungen und Geometrie eine Kulturgefäßes auszubilden. Es entsteht ein aufblasbares oder auffaltbares Kulturgefäß aus Polymeren, das die erfindungsgemäßen Eigenschaften der Apparatur beinhaltet. Es lassen sich auf diese Weise Einsätze oder ganze Kulturgefäße mit Volumina von 2 ml bis 20000 ml erfindungsgemäß herstellen.

Als Kulturgefäß wird ein 1000 ml Erlenmeyerkolben mit einem Reaktionsvolumen von 500 ml benutzt.

In die Abdeckkappe des Kolbens (Kappsenberg Kappe) werden zur Durchführung der Zuleitungen zur erfindungsgemäßen Apparatur entsprechende Löcher gebohrt, die Zuleitungen eingefädelt und dann mit Klebstoff dicht eingeklebt. Der Kolben wird mit der Reaktionsflüssigkeit befüllt, die Apparatur im nicht aufgeblasenen Zustand durch die Deckelöffnung in das Kulturgefäß eingeführt. Anschließend wird der Kolben mit der Kappe verschlossen.

Soll die Reaktion unter sterilen Bedingungen stattfinden, wird auf die Belüftungsleitung (PL in) und die Abluftleitung (Abgas out) ein sterilisierbarer Luftfilter aufgesetzt und die anderen Zu- und Ableitungen der Apparatur, sowie die Sondenarmatur verschlossen und das gesamte Gefäß im Autoklaven sterilisiert.

Anschließend wird der Kolben durch Zugabe einer Reinkultur des zu kultivierenden Mikroorganismus beimpft.

Das Kulturgefäß wird in eine Schüttelapparatur eingesetzt.

Erfindungsgemäß werden die Wirbelstrombrecher über die Einlassöffnung Pkin mit Luft aufgeblasen und nehmen ihre vorbestimmte Form im Kulturgefäß an. Die Ein- und Auslaßöffnungen der Wirbelstrombrecher werden anschließend verschlossen, so daß der aufgeblasene Zustand erhalten bleibt.

An den Sterilfilter der Belüftungsstrecke wird eine über Durchflußmesser geregelte Begasung angeschlossen.

Über das Probenahmesystem kann jetzt z. B. mittels Einmalspritze ein Aliquot der Reaktionsflüssigkeit zur externen Analytik entnommen werden.

An die Abluftstrecke kann ein Analyser für die Analyse von CO2 und O2 in der Abluft angeschlossen werden.

An die Dosierstrecken werden Dosierpumpen für Prozeßreagenzien, wie Lauge, Antischaummittel oder Substrat angeschlossen.

In die Sondenarmatur wird eine zuvor in 1 n Natronlauge kalt sterilisierte pH Elektrode, z. B. Typ Orion pH 9126 unter sterilen Bedingungen eingeführt. Die pH Sonde wird mit O-Ringen zur Reaktionsflüssigkeit hin abgedichtet, so daß nur das für die pH Messung nötige Diaphragma der Sonde mit der Reaktionsflüssigkeit in Verbindung steht. Die Sonde wird anschließend mit einem pH Messgerät verbunden.

Anschließend wird die biologische oder biochemische Reaktion unter kulturspezifischen Bedingungen durchgeführt.

Während der Kultivierung ermöglicht die erfindungsgemäße Apparatur nun die Durchführung einer Fermentation, die von den verfahrenstechnischen Gegebenheiten her mit einem hochtechnisierten Fermenter vergleichbar ist und zusätzlich die Registrierung, Regelung und Berechnung folgender Messwerte ermöglicht:

Tabelle 1

Online Messwerte (d. h. kontinuierlich gemessen)

Offline Messwerte (d. h. aus Aliquots bestimmt)

Berechnete Parameter aus Online- und Offlinewerten

Die Berechnungsformeln für diese Werte sind in der einschlägigen Literatur hinreichend beschrieben.

Insbesondere die Online gemessenen Parameter und die daraus berechenbaren Parameter sind wesentliche Voraussetzung für eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse im Kulturgefäß mit den Ergebnissen der späteren Produktionsfermenter.

Erfindungsgemäß ermöglicht der Aufbau der Apparatur nicht nur die Erfassung dieser Parameter, sondern ermöglicht erst auf Grund seines Aufbaus, diese Parameter in Größenordnungen in einem einfachen Kulturgefäß zu erreichen, wie sie später im Produktionsfermenter vorliegen werden.

Der relative Stoffübergangskoeffizient KLA stellt zum Beispiel einen der wichtigsten Vergleichs- und Scale up Parameter für Reaktoren dar. Je größer der KLA Wert ist desto größer ist das Produkt aus Gasaustauschfläche A und Stoffübergangskoeffizient KL. Hält man diesen Wert in verschiedenen Reaktoren konstant, sind der Zu- und Abtransport von Gasen zur Reaktionsflüssigkeit und damit die Reaktoren vergleichbar. Voraussetzung hierfür ist, daß alle zu vergleichenden Reaktoren diese KLA Werte auch realisieren können. Für kurze und effektive Prozesse werden hohe KLA Werte gewünscht, da diese hohe Stoffwechselraten und damit Produktausbeute ermöglichen.

Vergleicht man die KLA Werte verschiedener Kulturgefäße und Reaktoren, so ergeben sich, abhängig von der Schüttelfrequenz und Belüftungsrate folgende Bereiche (relativer Vergleich).

Aufzählung 2

Erlenmeyerkolben ohne Schikanen	KLA 1% bis 3%
Erlenmeyerkolben mit Schikanen	KLA 1% bis 6%
begaste Kulturflasche	KLA 1% bis 30%
1 Liter Fermenter	KLA 1% bis 800%
1 m^∧3 Fermenter	KLA 1% bis 600%
erfindungsgemäße Apparatur in Erlenmeyerkolben	KLA 1% bis 800%

Analoge Vergleiche werden für andere Parameter, wie Sauerstoffeintragsrate oder CO2 Abtransportrate bei Einsatz der erfindungsgemäßen Apparatur erreicht. Gegenüber dem Stand der Technik ermöglicht diese somit optimale Reaktionsbedingungen, wie sie später im Produktionsmaßstab vorliegen, und damit eine wesentliche Effektivitätssteigerung und Kostenersparnis im Bereich der Verfahrensentwicklung für biologische oder biochemische Dreiphasensysteme.

Ausführungsbeispiel 1

Die erfindungsgemäße Apparatur wird aus Polypropylenfolien mit 0,5 mm Stärke hergestellt. Entlang der Strichlinien gemäß Schemazeichung 1 wird auf ein Schnitteil gleichmäßig Klebstoff (z. B. UHU endfest plus 300, 2 Komponenten Epoxidharzkleber) aufgetragen und dann das andere Schnitteil exakt aufgelegt. Es ist dabei darauf zu achten, daß die Ein- und Auslaßöffnungen der Dosierkanäle nicht, und die Ränder des aufblasbaren Teils exakt und dicht verklebt werden. Nach einer Trockenzeit von 12 Stunden kann der untere Teil des Fixierrings aufgeklebt werden.

Ebenso werden die beiden Stege (in diesem Schnittmuster nicht aufblasbar) eingeklebt und die Dosierkanäle für Belüftung, Dosierstrecken und die beiden Ösen für die Sondenarmatur auf die Stege aufgeklebt.

Nach einer weiteren Trockenzeit von 12 Stunden ist die Apparatur einsetzbar.

Die erfindungsgemäße Apparatur kann auch von spezialisierten Herstellern als ein mit Gas formbarer Kunststoffkörper aus einem Stück hergestellt werden.

Als Kulturgefäß wird ein 1000 ml Erlenmeyerkolben (Enghals) mit Kappsenberg Kappe verwendet. In die Kappe werden Durchführungsöffnungen für die jeweiligen Zuführungen der Apparatur gemäß Schemazeichung 1 gebohrt, die jeweiligen Kanäle durch die Kappe gefädelt und mit Klebstoff (z. B. UHU endfest plus 300, 2 Komponenten Epoxidharzkleber) dicht eingeklebt. Nach einer Trockenzeit von 12 Stunden wird die Apparatur, nach Befüllen des Kulturgefäßes mit 500 ml Medium, im nicht aufgeblasenen Zustand, in das Kulturgefäß eingesetzt und alle Zuführungen mit Schlauchklemmen verschlossen.

Nach Aufsetzen der Kappe kann das Kulturgefäß im Autoklaven sterilisiert werden. Für das Durchführen der Kanäle kann auch ein Adapter oder Kupplungsstück in die Kappe eingearbeitet werden.

Als Referenzkulturgefäß wird ein Erlenmeyerkolben ohne die erfindungsgemäße Apparatur und ebenfalls ohne Schikanen (Ref. 1), sowie ein Erlenmeyerkolben mit Schikanen, aber ohne die erfindungsgemäße Apparatur (Ref. 2) verwendet. Beide werden ebenfalls mit 500 ml Medium befüllt, mit einer Kappe verschlossen und im Autoklaven sterilisiert.

Mediumszusammensetzung

Hefeextrakt für die Mikrobiologie: 12 g/l
Glucose für die Mikrobiologie: 10 g/l
Ammoniumsulfat: 1,5 g/l
Kochsalz: 0,1 molar
Magnesiumchlorid: 0,5 g/l
Kaliumphosphatpuffer: 0,1 molar, pH 7,2 als Lösungsmittel
Olivenöl, extravirgine: 1 ml/l

Die Medienbestandteile sind beim einschlägigen Fachhandel in gleicher Qualität erhältlich. Die Bestandteile Glucose und Magnesiumchlorid werden als geeignete Aliquots separat sterilisiert und anschließend unter sterilen Bedingungen zugegeben.

Nach der Sterilisation und dem Abkühlen der drei Kulturgefäße erfolgt die Beimpfung mit einer Reinkultur des Mikroorganismus mit je einem Milliliter unter sterile Bedingungen. Die Reinkultur wurde aus einem Röhrchen mit E. coli, K12, erhältlich bei der deutschen Stammsammlung (DSM Hannover) und Kultivierung des Inhalts dieses Röhrchens in 10 ml Standard 1 Medium (Merck Darmstadt) bei 37 Grad über 12 Stunden unter sterilen Bedingungen hergestellt. Die optische Dichte der Reinkultur betrug zum Zeitpunkt der Überimpfung 1,2 OD (546 nm).

Dieses Beispiel soll nur die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Apparatur gegenüber dem Stand der Technik in einem Dreiphasensystem mit turbulenter Durchmischung gegenüber 2 Phasensystemen zeigen. Daher wurden in diesem Beispiel die Dosierstrecken und die Abluftstrecke nicht benutzt.

Die erfindungsgemäße Apparatur wurde mit Luft, 0,5 bar, über den Anschluß Pkin aufgeblasen, bis die endgültige Form erreicht war, und der Anschluß mit einer Schlauchklemme verschlossen, um den Druck und damit die Form zu erhalten.

Alle drei Kulturgefäße wurden in einen Schüttler (B. Braun CERTOMAT BS-T) deponiert, die erfindungsgemäße Apparatur am Anschluß PLin mit einer Begasungseinheit (Vordruck 0,5 bar, Luftstrom 5 Liter/h) gekoppelt und kontinuierlich begast. Die drei Kulturgefäße wurden für 16 Stunden bei 37 Grad Celsius und einer Schüttelfrequenz von 250 RPM kultiviert. Zur Bestimmung des Wachstums der Kultur (und damit der Effektivität des Systems) wurde stündlich ein Aliquot der Kultur entnommen und die optische Dichte (OD) bei 546 nm in einem Photometer bestimmt. Ab OD = 1,0 sind entsprechende Verdünnungen durchzuführen, um Unlinearitäten des Photometers zu kompensieren.

Tabelle 2 und Diagramm 1 zeigen deutlich die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Apparatur gegenüber dem Stand der Technik. In Tabelle 2a und Diagramm 1a sind die OD Werte logarithmisch aufgetragen.

Die optische Dichte im Kulturgefäß liegt nach derselben Zeit um das 5,7 fache höher als in Ref. 1 (Zweiphasensystem ohne Schikanen) und um das 3,7 fache höher als in Ref. 2 (Zweiphasensystem mit Schikanen). Nachdem die optische Dichte direkt die Wachstumsrate des Organismus und damit indirekt seine Stoffwechselrate wiedergibt, zeigt sie als messbarer Parameter hier eindeutig die Effektivitätssteigerung in Kulturgefäßen durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Apparatur.

Ausführungsbeispiel 2

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Apparatur erfolgt analog dem Ausführungsbeispiel 1.

Als Kulturgefäß wird ein 1000 ml Erlenmeyerkolben (Enghals) mit Kappsenberg Kappe verwendet. In die Kappe werden Durchführungsöffnungen für die jeweiligen Zuführungen der Apparatur gemäß Schemazeichung 1 gebohrt, die jeweiligen Kanäle durch die Kappe gefädelt und mit Klebstoff (UHU endfest plus 300, 2 Komponenten Epoxidharzkleber) dicht eingeklebt. Nach einer Trockenzeit von 12 Stunden wird die Apparatur, nach Befüllen des Kulturgefäßes mit 450 ml Medium, im nicht aufgeblasenen Zustand, in das Kulturgefäß eingesetzt und alle Zuführungen mit Schlauchklemmen verschlossen. Nach Aufsetzen der Kappe und Einführung einer sterilisierbaren, geeichten pH Elektrode in die Sondenarmatur kann das Kulturgefäß im Autoklaven sterilisiert werden.

Als Referenz (Ref. 3) wird eine Minifermenter Typ LABFORS der Firma Infors verwendet. Dieser repräsentiert ebenfalls ein Dreiphasensystem mit eingebauten Schikanen, wird aber nicht geschüttelt, sondern ist mit einem Rührwerk versehen. Er stellt im Gegensatz zu den in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Kulturgefäßen die kleinst mögliche Einheit eines Fermenters dar. Die mit dieser Anlage erhaltenen Daten können für ein Scale up des Prozesses in den Produktionsmaßstab verwendet werden. Mit diesem Ausführungsbeispiel soll gezeigt werden, daß die erfindungsgemäße Apparatur bei einem Einsatz in einfachen Kulturgefäßen in der Lage ist, die Leistungsdaten dieser hochtechnisierten Fermenteranlage zu erreichen und zu übertreffen.

Das Fermentationsgefäß wird mit 450 ml Medium befüllt und nach Herstellervorschrift im Autoklaven sterilisiert.

Mediumszusammensetzung

Hefeextrakt für die Mikrobiologie: 20 g/l
Ammoniumsulfat: 1,5 g/l,
Kochsalz: 0,1 molar
Magnesiumchlorid: 0,5 g/l
Kaliumphosphatpuffer: 0,1 molar, pH 7,2 als Lösungsmittel
Antischaummittel (Silikonöl Dow Corning) = 1 ml/l

Die Medienbestandteile sind beim einschlägigen Fachhandel in gleicher Qualität erhältlich. Der Bestandteil Magnesiumchlorid wird als geeignetes Aliquot separat sterilisiert und anschließend unter sterilen Bedingungen zugegeben.

Als Substratvorlage dient Glucose (20 g in 50 ml), als Laugenvorlage dient 25%ige Ammoniaklösung (Ammonikzugabe unter sterile Bedingungen nach der Sterilisation des Vorlagegefäßes), Inhalt 50 ml und als Antischaumvorlage dient 10% Silikonöl (Dow Corning), Inhalt 50 ml.

Nach der Sterilisation und dem Abkühlen der zwei Kulturgefäße erfolgt die Beimpfung mit einer Reinkultur des Mikroorganismus mit je einem Milliliter unter sterilen Bedingungen. Die Reinkultur wurde aus einem Röhrchen mit E. coli, K12, erhältlich bei der deutschen Stammsammlung (DSM Hannover) und Kultivierung des Inhalts dieses Röhrchens in 10 ml Standard 1 Medium (Merck Darmstadt) bei 37 Grad über 12 Stunden unter sterilen Bedingungen hergestellt. Die optische Dichte der Reinkultur betrug zum Zeitpunkt der Überimpfung 1,36 OD (546 nm).

Die erfindungsgemäße Apparatur wird wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, vorbereitet und in einen Schüttier (B. Braun CERTOMAT BS-T) deponiert, am Anschluß PLin mit einer Begasungseinheit gekoppelt (Vordruck 1 bar, Luftstrom 15 l/h) gekoppelt und kontinuierlich begast. Die pH Elektrode wird mit einem pH Mess-und Regelgerät verbunden. An die Dosierstrecken werden die Substratvorlage, die Laugenvorlage und die Antischaumvorlage angeschlossen. An die Abluftleitung Abgas out wird ein Messgerät zur Bestimmung des O2 und CO2 Gehaltes der Abluft angeschlossen, um den KLA Wert des Systems berechnen zu können. Die Schüttelfrequenz für diesen Versuch beträgt 350 RPM. Das Gefäß wird auf 37 Grad Celsius temperiert.

Der Referenzfermenter Ref. 3 wird gemäß Herstellervorschrift mit der pH Mess- und Regeltechnik, der Substratdosage, der Laugendosage und Antischaumdosage verbunden und an der Abgasstrecke ebenfalls an eine O2 und CO2 Messung angeschlossen. Die Drehzahl des Rührwerks beträgt 600 RPM, der Luftstrom zur Belüftung ebenfalls 15 l/h. Der Fermenter wird auf 37 Grad Celsius temperiert.

Dosageparameter für beide Ansätze

Substratdosage: kontinuierlich mit 2,5 ml/h (1 g Glucose pro h)
Laugendosage: zur Regelung des pH Wertes, Soll pH < 7,0
Antischaumdosage: nur bei Bedarf, d. h. Überschäumen der Kultur

Beide Ansätze wurden jeweils für 20 Stunden kultiviert. Zur Bestimmung des Wachstums der Kultur (und damit der Effektivität des Systems) wurde stündlich ein Aliquot der Kultur entnommen und die optische Dichte (OD) bei 546 nm in einem Photometer bestimmt. Ab OD = 1,0 sind entsprechende Verdünnungen durchzuführen, um Unlinearitäten des Photometers zu kompensieren.

Die KLA Werte wurden nach der dynamischen Methode ((Bandyopadhyay, B, Humphrey, A, and Taguchi, H, 1967, Biotechnol. and Bioeng. 9, 533) berechnet.

Tabelle 3 und Diagramm 2 zeigen deutlich die Vergleichbarkeit, bzw. die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Apparatur gegenüber dem Stand der Technik bei Fermentern. In Tabelle 3a und Diagramm 3a sind die OD Werte logarithmisch aufgetragen.

Wie in Ausführungsbeispiel 1 wird die optische Dichte als Maß für die Effektivität des Reaktors verwendet.

Ein Vergleich der dynamisch bestimmten KLA Werte zeigt gut die Vergleichbarkeit der verfahrenstechnischen und biologischen Bedingungen zwischen beiden Ansätzen.

KLA Wert Referenzkultur Ref. 3	210 +- 24 (1/h)
KLA Wert Erfindung	218 +- 27 (11 h)

Die Wachstumskurven und absoluten OD Werte sind praktisch identisch (bei der Erfindung geringfügig höher), was eine ausgezeichnete Vergleichbarkeit der beiden Systeme beweist, und somit zeigt, daß die erfindungsgemäße Apparatur herkömmlichen, bisher verwendeten Kulturgefäßen weit überlegen und mit hochwertigen Fermenationsanlagen mindestens vergleichbar ist.

Claims

1. Einsetzbare Apparatur für Gefäße bzw. Apparatur mit Gefäß zur Begasung und/oder Dosierung, bestehend aus mindestens einem Wirbelstrombrecher (Schikane), mindestens einem Fixierungsteil und mindestens einer Gas- oder Flüssigkeitszuleitung, gekennzeichnet dadurch, daß die Apparatur ihre endgültige Form erst nach dem Einsetzen in das Gefäß oder zusammen mit dem Gefäß erst unmittelbar vor der Verwendung erreicht.

2. Apparatur nach Anspruch 1, deren Volumenzunahme zur endgültigen Verwendungsform das bis zu 100fache, bevorzugt bis zu 30fache, besonders bevorzugt bis zu 10fache beträgt.

3. Apparatur nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch ein Fixierungsteil in Form eines Fixierringes oder eines der Gefäßform angepaßten Doppel-T-Fixierstückes, das sich nach Erreichen der endgültigen Form bevorzugt in der Nähe des Gefäßbodens befindet und die Apparatur so fixiert.

4. Apparatur nach Anspruch 1, 2 oder 3, bestehend aus dehnbaren oder nicht dehnbaren synthetischen oder natürlichen Polymeren.

5. Apparatur nach Anspruch 4, wobei das verwendete Polymer ganz oder in Teilen gasundurchlässig ist oder durchlässig für bestimmte Gase.

6. Apparatur nach Anspruch 5, wobei das Polymer ganz oder in Teilen nur Substanzen in bestimmten Molekülgrößenbereichen durchläßt, insbesondere zwischen dem Innenraum der Apparatur und der Reaktionsflüssigkeit.

7. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-6, bestehend aus nur einem Folienteil nach Art eines geformten Ballons.

8. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-6, bestehend aus mehreren Folienteilen, die formgebend miteinander verklebt oder verschweißt werden.

9. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Apparatur auch die Wandungen und die Form eines Kulturgefäßes gebildet wird und so ein aufblasbares oder auffaltbares Kulturgefäß entsteht.

10. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-10, gekennzeichnet dadurch, daß die endgültige Form im Gefäß oder mit dem Gefäß durch Aufblasen erreicht wird.

11. Apparatur entsprechend Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß die endgültige Form durch kontinuierliches Durchströmen mit einer Flüssigkeit oder einem Gas unter Überdruck von mindestens 0,2 bar erreicht wird, wobei das durchströmende Fluid dem System im Gefäß kontinuierlich insgesamt, zum Teil oder nicht zugeführt wird.

12. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-11, gekennzeichnet dadurch, daß die endgültige Form im Gefäß oder mit dem Gefäß durch Auffalten erreicht wird.

13. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-12, gekennzeichnet dadurch, daß sie mindestens 1, höchstens 16 Wirbelstrombrecher enthält.

14. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-13, gekennzeichnet durch die Fixierung von einem oder mehreren Wirbelstrombrechern je durch einen oder mehrere Stege.

15. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-14, gekennzeichnet dadurch, daß die Wirbelstrombrecher gelocht sind und/oder einen Abstand zur Gefäßwand von 1-20% ihres Durchmessers haben.

16. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-15, gekennzeichnet durch eine Versteifung des der Gefäßwand zugewandten Teils durch eine eingeschweißte Schiene.

17. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-16, gekennzeichnet durch eine Gas- oder Flüssigkeitszufuhr ins untere Drittel der Reaktionsflüssigkeit mit nach unten gerichteter Ausströmrichtung.

18. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-17, gekennzeichnet durch eine Armatur zum Einführen von Messsonden, die durch eine für zu bestimmende Substanzen durchlässige Membran von der Reaktionsflüssigkeit abgetrennt ist.

19. Apparatur nach Anspruch 18, gekennzeichnet durch eine Fixierungsmöglichkeit für die Armatur, insbesondere an den Stegen.

20. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-19, gekennzeichnet durch darin eingeschweißte Kanäle oder darin eingelegte Schläuche zur Verbindung der Reaktionsflüssigkeit im Gefäß und/oder des darüberliegenden Gasraumes im Gefäß nach außen.

21. Apparatur nach einem der Ansprüche 1-20, gekennzeichnet durch eine vergrößerte Oberfläche zur Reaktionsflüssigkeit hin, hervorgerufen durch Lamellen, Zotten, Fasern, Falten o. ä.

22. Verwendung einer Apparatur nach einem der Ansprüche 1-21 in einem wiederverwendbaren Einsatz zur Fixierung im Kulturgefäß.

23. Verwendung von mehreren gleichen oder verschiedenen Apparaturen nach einem der Ansprüche 1-21 in einem Gefäß.

24. Verwendung einer Apparatur nach einem der Ansprüche 1-21 in einem oder als Reaktionsgefäß mit einem Volumen von 2-20 000 ml.

25. Verwendung nach Anspruch 24 in einem oder als Kulturgefäß für biologische und/oder biochemische Reaktionen, bevorzugt in Zwei- oder Dreiphasensystemen, bevorzugt zur Fermentation von Mikroorganismen, bevorzugt unter sterilen Bedingungen.

26. Verwendung einer Apparatur nach einem der Ansprüche 1-21 zur Zu- und Abführung von Flüssigkeiten und/oder Gasen in und aus der Reaktionsflüssigkeit sowie in den und aus dem darüber liegenden Gasraum.

27. Verwendung einer Apparatur nach einem der Ansprüche 1-21 zur ausführlichen Messdatenerfassung von Prozessparametern und zur Optimierung und Simulation von Verfahren, Medien und Upscaling.

28. Verwendung einer Apparatur nach Anspruch 5 oder 6 zur blasenfreien Be- und Entgasung und/oder zur definierten Zu- und Abführung von Molekülen in bestimmten Molekülgrößenbereichen.

29. Verwendung einer Apparatur nach einem der Ansprüche 1-21 zur Steigerung des Stoffübergangskoeffizienten KLA bis in die Bereiche großer Fermenter.