WO2023013485A1 - 培養装置および培養方法 - Google Patents

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WO2023013485A1
WO2023013485A1 PCT/JP2022/028831 JP2022028831W WO2023013485A1 WO 2023013485 A1 WO2023013485 A1 WO 2023013485A1 JP 2022028831 W JP2022028831 W JP 2022028831W WO 2023013485 A1 WO2023013485 A1 WO 2023013485A1
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WO
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culture
suction
aggregates
flow rate
suction tube
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/028831
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
文彦 北川
陽一 神保
洋輔 渡辺
Original Assignee
日機装株式会社
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Filing date
Publication date
Application filed by 日機装株式会社 filed Critical 日機装株式会社
Priority to JP2023540279A priority Critical patent/JPWO2023013485A1/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a culture apparatus and a culture method.
  • Patent Document 1 discloses a cell culture apparatus equipped with an aspirator for sucking a culture solution. By aspirating the culture solution with an aspirator and exchanging the culture solution, etc., the efficiency of cell culture can be improved.
  • the aspirator of Patent Document 1 has a double tube structure consisting of an outer tube and an inner tube.
  • the outer tube has a filter through which the culture solution passes, and the inner tube sucks the culture solution that has passed through the filter.
  • the outer tube is provided with an air hole that communicates between the inner lumen of the outer tube and the outside, so that excessive negative pressure inside the outer tube can be released to the outside.
  • the present invention was made in view of this situation, and one of its purposes is to provide a technique for improving the efficiency of cell culture.
  • a culture apparatus comprises a culture vessel containing cell aggregates and a culture medium, a suction tube for sucking the culture medium in the culture vessel, a suction section for generating a suction force in the suction tube, and a coagulation tube.
  • a control unit for controlling the aspirator in accordance with a competitive aspirating flow rate of the agglomerates, which is a speed at which the settling of the agglomerates and the floating of the agglomerates accompanying the aspiration of the culture medium are at a competitive rate;
  • the aggregation of aggregates is at a speed at which the settling of the aggregates and the floating of the aggregates due to the suction of the culture medium are at a competitive rate. It includes aspirating the culture medium at a flow rate that corresponds to the competitive aspiration flow rate.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a culture apparatus according to Embodiment 1.
  • FIG. FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the particle size of aggregates and the sedimentation velocity.
  • FIG. 10 is a diagram showing states of aggregates when culture fluid is aspirated at various aspiration flow rates.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the sedimentation velocity of aggregates and the competitive suction flow velocity. It is a figure which shows the relationship between 1/W * and 1/S * . It is a figure which shows a sedimentation velocity prediction curve. It is a figure which shows a competitive suction flow velocity prediction curve.
  • FIG. 4 is a diagram showing predicted sedimentation velocity values, predicted competitive suction flow velocities, and competitive flow rates at each tube diameter for each particle size of aggregates.
  • FIG. 4 is a diagram showing predicted sedimentation velocity values, predicted competitive suction flow velocities, and competitive flow rates at each tube diameter for each particle size of aggregates.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of a culture apparatus according to Embodiment 2;
  • FIG. 10 is a schematic diagram of a culture apparatus according to Embodiment 3;
  • FIG. 10 is a schematic diagram of a culture apparatus according to Embodiment 4;
  • 12A is an optical microscope image of the culture solution according to Comparative Example 1.
  • FIG. 12B is an optical microscope image of the filter according to Comparative Example 1.
  • FIG. 12C is an optical microscope image of the culture solution according to Example 1.
  • FIG. FIG. 3 is a diagram showing the particle size distribution of aggregates; It is an optical microscope image of the aggregates deposited on the bottom of the collection suction tube.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a culture apparatus 1 according to Embodiment 1.
  • the culture apparatus 1 of this embodiment includes a culture container 2, a suction tube 4, an auxiliary filter 6, a suction section 8, a management section 10, a discharge tube 12, and a control section .
  • the culture vessel 2 is a bioreactor that accommodates the cell aggregate S and the culture solution W.
  • the culture container 2 is not particularly limited as long as the aggregate S can be cultured in suspension.
  • the culture vessel 2 as an example is a so-called spinner flask having stirring blades 16 for stirring the culture solution W.
  • the culture vessel 2 may be a culture tank, a cell culture bottle, a cell culture bag, or the like.
  • the volume of the culture container 2 is, for example, 100 mL to 100 L.
  • the culture vessel 2 of the present embodiment may be a closed system into which the atmosphere does not substantially enter from the outside, or an open system into which the atmosphere can enter from the outside. When the culture vessel 2 is a closed system, it is necessary to control the concentrations of oxygen and carbon dioxide in the culture vessel 2 .
  • This concentration control is performed by, for example, the management unit 10, a gas supply/exhaust unit (not shown), or the like.
  • Oxygen concentration is controlled at, for example, 1-6 ppm.
  • the carbon dioxide concentration is controlled, for example, so that the pH of the culture solution W is 6.8-7.6.
  • the concentration control described above is not essential, but is preferably implemented.
  • cells that make up the aggregate S are not particularly limited.
  • cells include pluripotent stem cells such as human iPS cells, human ES cells, and human Muse cells; differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells, such as human iPS cell-derived nephron progenitor cells; and mesenchymal stem cells (MSC).
  • pluripotent stem cells such as human iPS cells, human ES cells, and human Muse cells
  • differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells such as human iPS cell-derived nephron progenitor cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • somatic stem cells such as; progenitor cells derived from somatic stem cells such as nephron progenitor cells; tissue cells such as human proximal tubular epithelial cells, human distal tubular epithelial cells, human collecting duct epithelial cells; human embryonic kidney cells (HEK293 cells) and other antibody-producing cell lines; non-human animal-derived antibody-producing cell lines such as Chinese hamster ovary cells (CHO cells) and insect cells (SF9 cells);
  • the culture solution W is not particularly limited, and can be appropriately selected from known culture solutions according to the type of cells to be cultured. For example, when culturing proximal tubular cells, REGM (Lonza), EpiCM (ScienCell), Keratinocyte SFM (Life Technologies), etc. can be used.
  • the suction tube 4 sucks the culture solution W in the culture container 2 .
  • One end of the suction tube 4 is inserted into the culture vessel 2 and comes into contact with the culture medium W in the culture vessel 2 .
  • the other end of the suction tube 4 is connected to the inlet port of the management section 10 .
  • the tube diameter of the suction tube 4 is not particularly limited as long as it is a size that allows the suction portion 8 to suction the culture medium W.
  • An auxiliary filter 6 is provided in the middle of the suction pipe 4 .
  • Auxiliary filter 6 is arranged at a predetermined distance from one end of suction tube 4 .
  • the suction flow rate of the culture solution W in at least the region in front of the auxiliary filter 6 is not affected by the flow of the culture solution W caused by stirring in the culture vessel 2. , or a length that is as small as possible to the extent that the invention can be carried out.
  • the aspirating flow rate of the culture medium W is adjusted to a flow rate according to the later-described competitive aspirating flow rate.
  • the flow velocity adjustment region can be appropriately set based on the designer's empirical knowledge or the designer's experiments.
  • the flow rate adjustment region is the region from the tip of the suction tube 4, and the suction flow rate of the culture medium W is the same as the flow rate of the culture medium W caused by stirring in the culture vessel 2. Defined as the area that is unaffected or minimally affected.
  • the length from the auxiliary filter 6 to the tip is preferably 1 cm or more.
  • the auxiliary filter 6 as an example is arranged in a region of the suction tube 4 that extends above the liquid surface of the culture solution W or a region that extends outside the culture container 2 . Note that the auxiliary filter 6 may be omitted. Moreover, the pore diameter of the auxiliary filter 6 is preferably at least smaller than the particle size of the aggregate S to be cultured, that is, the aggregate S to be finally collected, and is, for example, 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • a suction section 8 is provided between the auxiliary filter 6 and the management section 10 in the suction tube 4 .
  • the suction unit 8 causes the suction tube 4 to generate a suction force.
  • a pump such as a peristaltic pump or a diaphragm pump, or a known suction device such as an aspirator can be used.
  • the culture solution W is sucked from one end of the suction tube 4 by driving the suction unit 8 .
  • the aspirator 8 can aspirate the culture solution W at a flow rate of, for example, 0.1 mL/min to 1 L/min.
  • the arrangement of the suction unit 8 is not particularly limited as long as the suction tube 4 can generate a suction force.
  • the culture medium W sucked from the culture container 2 flows through the suction tube 4 toward the other end side, and flows into the management section 10 via the auxiliary filter 6 and the suction section 8 .
  • the management unit 10 executes at least one of analysis and adjustment of the components of the aspirated culture medium W.
  • the management unit 10 has known analyzers such as a pH meter, a dissolved oxygen meter (DO meter), and a spectrometer, and can analyze the components of the culture solution W.
  • the management unit 10 has a module for supplementing the culture solution W with medium components such as glucose and protein, and with oxygen.
  • the management unit 10 has a column filled with an adsorbent for waste products such as lactic acid and ammonia, and is capable of removing waste products in the culture solution W.
  • One end of the discharge pipe 12 is connected to the outlet port of the management unit 10 .
  • the other end of the discharge tube 12 is inserted into the culture vessel 2 .
  • the culture solution W that has undergone analysis processing and regeneration processing in the management unit 10 is returned to the culture container 2 through the discharge pipe 12 .
  • the control unit 14 controls driving of the suction unit 8 .
  • the control unit 14 is implemented by elements and circuits such as a CPU and memory of a computer as a hardware configuration, and is implemented by a computer program etc. as a software configuration. It is drawn as a functional block that It should be understood by those skilled in the art that this functional block can be implemented in various ways by combining hardware and software.
  • the user of the culture device 1 can select the operation mode of the culture device 1 via an operation panel (not shown) or the like.
  • the operating modes include a medium regeneration mode.
  • the control unit 14 receives a signal indicating the selected operation mode from the operation panel and controls the suction unit 8 according to the operation mode.
  • the control unit 14 controls the suction unit 8 according to the competitive suction flow rate of the aggregate S.
  • the competitive suction flow rate is a speed at which the sedimentation of the aggregate S due to its own weight or the like and the floating of the aggregate S due to the suction of the culture medium W compete with each other. That is, the control unit 14 selects the magnitude of the suction flow rate of the culture solution W with respect to the competitive suction flow rate of the aggregate S according to the purpose of the operation mode.
  • the particle size of the aggregate S increases.
  • the suction velocity that matches the sedimentation velocity also increases. Therefore, there is a positive correlation between the particle size of the aggregate S and the competitive suction flow rate.
  • the particle size of the aggregate S has a positive correlation with the number of culture days (culture time). The relationship between the particle size of the aggregate S and the number of culture days can be appropriately set based on the designer's empirical knowledge or the designer's experiments, etc., depending on the cell type, culture conditions, and the like.
  • the control unit 14 can specify the particle size of the aggregate S contained in the culture vessel 2 and, in turn, the competitive suction flow rate that serves as a reference for adjusting the suction force.
  • the control unit 14 incorporates a timer, and can count the number of culture days by inputting a signal indicating the start timing of culture from an operation panel or the like.
  • the control unit 14 holds in advance a conversion table that associates the number of culture days with competitive aspiration flow rates, and can determine the competitive aspiration flow rate from the number of culture days using this conversion table.
  • the particle size of the aggregates S in the culture solution W may be measured by a known optical method or the like.
  • the particle size of the aggregate S can also be determined based on parameters other than the number of culture days that have a correlation with the particle size. Examples of such parameters include the glucose consumption rate, the lactic acid production rate, the oxygen consumption rate, and the like.
  • the control unit 14 can determine the competitive suction flow rate by using a conversion table that associates the actual measurement value or parameter of the particle size with the competitive suction flow rate.
  • the particle size of the aggregate S is understood as the average of the maximum value and the minimum value of the distance between two points located on the outline of the aggregate S in a microscopic image of the aggregate S, for example.
  • the control unit 14 controls the suction unit 8 to suck the culture solution W at a flow rate equal to or lower than the competitive suction flow rate of the aggregates S contained in the culture container 2 .
  • the control unit 14 may constantly execute the analysis processing and regeneration processing of the culture solution W regardless of the mode selection.
  • the control unit 14 receives a signal indicating the analysis result of the culture fluid W from the management unit 10 and aspirates the culture fluid W based on the analysis result in both the execution of the culture fluid regeneration mode and the constant execution. Feedback control may be performed to switch between suspension and resumption of.
  • the competitive aspiration flow rate of aggregate S is specified according to the number of culture days.
  • the particle size of the aggregate S may be distributed.
  • the control unit 14 sucks the culture solution W at a flow rate equal to the competitive suction flow rate corresponding to the particle size of the main group, or at a flow rate with a small difference from the competitive suction flow rate, aggregates S having smaller particle sizes, etc.
  • the auxiliary filter 6 prevents the aggregates S and the like sucked into the suction tube 4 from advancing toward the management section 10 .
  • the pore size of the auxiliary filter 6 is preferably smaller than the target particle size of aggregates S in cell culture, and is, for example, 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • the target particle size of aggregates S is, for example, 100 ⁇ m to 1500 ⁇ m.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the particle size of aggregates S and the sedimentation velocity. As shown in FIG. 2, it was confirmed that the sedimentation velocity increased as the particle size increased.
  • FIG. 3 is a diagram showing the state of the aggregate S when the culture solution W is sucked at various suction flow rates.
  • FIG. 3 it was confirmed that aggregates S with similar particle diameters had similar competitive suction flow rates regardless of the tube diameter of the suction tube 4 . Therefore, it was confirmed that regardless of the tube diameter of the suction tube 4, the aggregates S could be sedimented, brought into an antagonistic state, or floated by adjusting the suction flow rate of the culture medium W. In other words, it was shown that the culture solution W can be taken out of the culture vessel 2 by adjusting the suction flow rate of the culture solution W without sucking the aggregate S to be cultured.
  • the suction flow rate of the culture solution W is a value obtained by multiplying the suction flow rate by the tube diameter (inner diameter) of the suction tube 4 . Therefore, by increasing the tube diameter of the suction tube 4, the suction flow rate can be increased while suppressing the suction of the aggregate S to be cultured.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the sedimentation velocity of the aggregate S and the competitive suction flow velocity. As shown in FIG. 4, the sedimentation velocity is set on the first axis (horizontal axis) and the competitive suction flow velocity is set on the second axis (vertical axis). By linear approximation, a linear approximation formula showing the relationship between the settling velocity and the competitive suction flow velocity was obtained.
  • the aggregate S should be in a state of antagonism without settling or rising.
  • the competitive suction flow velocity was lower than the sedimentation velocity. It is presumed that this is due to the influence of the pulsation of the pump that constitutes the suction unit 8 and the like.
  • Equation (1) is a modification of the first equation (balance equation) in the paper, and is the second equation in the paper.
  • Equation (2) is the fourth equation in the paper.
  • Equation (3) is Equation 6 in the paper. Specifically, as shown in FIG. 5, the value of the aggregate S of each particle size is plotted on the coordinates where 1/S * is set on the first axis and 1/W * is set on the second axis.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between 1/S * and 1/W * .
  • the gravitational acceleration g is 9.80655 m/s 2
  • the density ⁇ s of the aggregate S is 1030 kg/m 3
  • the density ⁇ w of the culture solution W at 25° C. is 1005.294 kg/m 3.
  • the viscosity ⁇ of the culture solution W at 25° C. was set to 1.027 mPa ⁇ s.
  • the viscosity ⁇ of the aggregate S can be measured using a tuning fork vibration viscometer (SV-A, AND). As a result, in the example shown in FIG. 5, A in Equation (3) was 0.89 and B was 3.82.
  • the specific gravity sw of the culture solution W at t°C was calculated by the following method. That is, the weight W 1 [g] of the dry pycnometer (1-4566-01, AS ONE), the weight W 2 [g] of the pycnometer filled with pure water at t°C, and the culture medium at t°C The weight W 3 [g] of the pycnometer containing W was measured with an electronic balance (HR251-AZ, AND). Then, let the density of air at t ° C. be ⁇ air [g/cm 3 ] and the density of water at 4 ° C. be ⁇ 0 [g/cm 3 ], liquid specific gravity measurement method (JIS) (draft), measurement, The following formula (F1) published in Vol. 9, No. 10 was used to calculate the specific gravity sw of the culture medium W.
  • JIS liquid specific gravity measurement method
  • the specific gravity s s of the aggregate S was calculated by the following method. Specifically, the weight W 4 [g] of a dry microtube (130-806C, WATSON) was measured with an electronic balance (HR251-AZ, AND). Then, a plurality of aggregates S were collected in a microtube. After centrifuging the microtube, the supernatant medium was removed and the weight W 5 [g] was measured. The area occupied by the cells was replaced with pure water at t° C., and the weight W 6 [g] was measured. Assuming that the density of water at t ° C. is ⁇ 1 [g/cm 3 ], the following formula (F2) was used to calculate the specific gravity ss of the aggregate S.
  • FIG. 6 is a diagram showing a sedimentation velocity prediction curve. As shown in FIG. 6, when the actual sedimentation velocity obtained in the sedimentation test of the aggregate S described above was compared with the sedimentation velocity prediction curve, it was confirmed that the two approximated each other with high accuracy. .
  • FIG. 7 is a diagram showing a competitive suction flow velocity prediction curve.
  • FIG. 8 is a diagram showing the predicted sedimentation velocity, the predicted competitive suction flow rate, and the competitive flow rate at each tube diameter for each particle size of the aggregate S. In FIG. When the actual measured value of the competitive suction flow rate obtained in the suction test of the aggregate S described above was compared with the competitive suction flow rate prediction curve, it was confirmed that the two approximate each other with high accuracy.
  • the culture apparatus 1 includes the culture container 2 that accommodates the cell aggregate S and the culture solution W, the suction tube 4 that sucks the culture solution W in the culture container 2, Sucking is performed according to the competitive suction flow rate of the aggregate S, which is the speed at which the suction unit 8 that generates a suction force in the suction tube 4 and the settling of the aggregate S and the floating of the aggregate S accompanying the suction of the culture medium W compete. and a control unit 14 that controls the unit 8 .
  • operations such as aspiration of only the culture solution W (that is, separation of the culture solution W and the aggregates S) and classification of the aggregates S can be performed without using a filter. Therefore, it is possible to suppress the aggregate S from adhering to the filter, so that the efficiency of cell culture can be improved.
  • control unit 14 of the present embodiment controls the aspirating unit 8 so as to aspirate the culture solution W at a flow rate equal to or lower than the competitive aspirating flow rate.
  • the aggregate S and the culture solution W can be separated without using a filter. Therefore, the efficiency of cell culture can be improved.
  • the competitive suction flow velocity is determined based on the sedimentation velocity prediction curve of the aggregate S obtained from the above equations (1) to (4). This makes it possible to aspirate the culture solution W while suppressing the aspiration of the aggregates S of any particle size. Further, a more suitable suction flow rate of the culture solution W can be set according to the purpose of sucking the culture solution W. FIG.
  • the culture apparatus 1 of the present embodiment includes a management unit 10 that is connected to the aspiration tube 4 and performs at least one of analysis and adjustment of the components of the aspirated culture fluid W.
  • a management unit 10 that is connected to the aspiration tube 4 and performs at least one of analysis and adjustment of the components of the aspirated culture fluid W.
  • Embodiment 2 has the same configuration as Embodiment 1, except for a part of the configuration of culture apparatus 1 and control contents of control unit 14 .
  • FIG. 9 is a schematic diagram of the culture device 1 according to the second embodiment.
  • the culture apparatus 1 of the present embodiment includes a culture vessel 2, a suction tube 4, a suction section 8, a management section 10, a discharge tube 12, a control section 14, a switching valve 18, a recovery tube 20, a recovery vessel 22, and a and Auxiliary filter 6 is omitted.
  • the switching valve 18 is composed of, for example, a known electromagnetic valve, and can switch the destination of the culture solution W flowing out from the outlet port of the management unit 10 between the discharge pipe 12 and the recovery pipe 20 .
  • the switching valve 18 sets the destination of the culture solution W to the discharge pipe 12 , the culture solution W that has passed through the management section 10 is returned to the culture vessel 2 via the discharge pipe 12 .
  • the culture vessel 2 and collection vessel 22 of the present embodiment may be a closed system in which the atmosphere does not substantially enter from the outside, or may be an open system in which the atmosphere can enter from the outside.
  • the culture container 2 and the collection container 22 are a closed system, the oxygen and carbon dioxide in the culture container 2 and the collection container 22 are controlled as described above.
  • the concentration control described above is not essential, but is preferably implemented.
  • the culture apparatus 1 also has a pipe 24 that connects the culture container 2 and the recovery container 22 .
  • the supernatant of the culture solution W that does not contain the aggregate S and is stored in the recovery container 22 is returned to the culture container 2 via the pipe 24 .
  • the amount of culture solution W in the culture vessel 2 can be secured.
  • the movement from the collection container 22 to the culture container 2 via the pipe 24 may be realized by utilizing the height difference between the liquid surface of the culture solution W in the collection container 22 and the culture container 2 as shown in FIG.
  • the pipe 24 may be provided with a suction unit such as a pump.
  • the arrangement of the pipe 24 is not limited to the illustrated one.
  • the control unit 14 controls driving of the suction unit 8 and switching of the switching valve 18 .
  • the culture apparatus 1 of the present embodiment can select, for example, a medium regeneration mode, an aggregate disposal mode, and an aggregate collection mode.
  • the control unit 14 controls the suction unit 8 and the switching valve 18 according to each operation mode.
  • the control unit 14 sucks the culture medium W at a flow rate equal to or lower than the competitive suction flow rate of the aggregates S contained in the culture container 2, as described in the first embodiment. It controls the suction unit 8 . Also, the control unit 14 controls the switching valve 18 so that the culture medium W flows into the discharge pipe 12 . As a result, the culture solution W that has been regenerated by the management unit 10 is returned to the culture container 2 .
  • the control unit 14 exceeds the competitive suction flow rate for aggregates S having a predetermined first particle size and for aggregates S having a second particle size larger than the first particle size
  • the aspirator 8 is controlled to aspirate the culture solution W at a first flow rate that is equal to or less than the competitive aspiration flow rate.
  • the first particle size is the particle size of the largest aggregate S among the aggregates S to be discarded.
  • the second particle size is the particle size of the aggregate S to be cultured.
  • the control unit 14 controls the switching valve 18 so that the culture medium W flows into the recovery pipe 20 .
  • the aggregate S to be cultured and the aggregate S to be discarded can be sorted (classified), and the aggregate S to be discarded can be moved from the culture container 2 to the collection container 22 .
  • Aggregate S to be discarded, which is stored in collection container 22, is discarded outside the apparatus.
  • the control unit 14 holds in advance a predetermined first margin M1 and a second margin M2 smaller than the first margin M1 regarding the flow velocity. Then, the flow rate to be generated by the suction unit 8 is determined by subtracting a margin selected according to the mode to be executed from the reference competitive suction flow rate determined from the number of culture days or the like.
  • the aspirator 8 is controlled to aspirate the culture fluid W at a flow rate obtained by subtracting the larger first margin M1 from the competitive aspiration flow rate. As a result, the amount of aspirated aggregates S to be discarded can be reduced.
  • the aspirator 8 is controlled to aspirate the culture solution W at a flow rate obtained by subtracting the smaller second margin M2 from the competitive aspiration flow rate. That is, the first flow velocity is determined by subtracting the second margin M2 from the competitive suction flow velocity. Thereby, the aggregate S to be discarded can be more reliably sucked.
  • the first margin M1 and the second margin M2 can be appropriately set based on the designer's empirical knowledge or the designer's experiments.
  • the control unit 14 sucks the culture solution W at the first flow rate, and then sucks the culture solution W at a second flow rate exceeding the competitive suction flow rate for the aggregates S having the second particle size.
  • the suction unit 8 is controlled to suck the .
  • the aggregate collection mode partially includes the processing executed in the aggregate disposal mode.
  • the control unit 14 controls the switching valve 18 so that the culture medium W flows into the recovery pipe 20 .
  • the aggregates S having the second particle size can be isolated.
  • Aggregate S stored in collection container 22 is used for the purpose.
  • the second flow rate is set to a value obtained by adding a predetermined third margin M3 to the competitive suction flow rate corresponding to the aggregates S to be collected so that the aggregates S to be collected are more reliably sucked.
  • the third margin M3 can be appropriately set based on the designer's empirical knowledge or the designer's experiments.
  • the culture solution W is preferably sucked by the aspirator 8, which is not a pump but an aspirator.
  • the diameter of the suction tube 4 is preferably larger.
  • the suction resolution of the aggregate S can be improved.
  • the sedimentation velocity of aggregates S with a particle size of several tens of ⁇ m to 2 mm is approximately 0.01 cm/sec to 2 cm/sec.
  • the diameter of the tube is preferably ⁇ 4 or more. Further, when classifying with other aggregates S at a flow rate of 1 L/min or less, the tube diameter is preferably ⁇ 50 or less.
  • the channel structure for sending the sucked culture solution W to the collection container 22 is not limited to that shown in FIG.
  • the auxiliary filter 6 may be provided in the suction tube 4 without being omitted.
  • the culture apparatus 1 as an example separately includes a suction tube 4 used in the culture solution regeneration mode, a suction tube 4 used in the aggregate disposal mode, and a suction tube 4 used in the aggregate collection mode.
  • Each suction tube 4 is provided with an auxiliary filter 6 having a hole diameter corresponding to the operation mode.
  • the suction tube 4 used in the culture fluid regeneration mode is provided with the auxiliary filter 6 similar to that of the first embodiment.
  • the suction tube 4 used in the aggregate disposal mode is provided with an auxiliary filter 6 through which aggregates S to be discarded can pass.
  • the pore diameter of the auxiliary filter 6 is set in the range of 100 ⁇ m to 1500 ⁇ m, for example.
  • the suction tube 4 used in the aggregate collection mode is provided with an auxiliary filter 6 through which aggregates S to be collected can pass.
  • the pore diameter of the auxiliary filter 6 is set in the range of 100 ⁇ m to 1500 ⁇ m, for example.
  • the control unit 14 exceeds the competitive suction flow rate for aggregates S having a predetermined first particle size and for aggregates S having a second particle size larger than the first particle size
  • the aspirator 8 is controlled to aspirate the culture solution W at a first flow rate that is equal to or less than the competitive aspiration flow rate.
  • the aggregates S having the first particle size and the aggregates S having the second particle size can be classified. Therefore, if the aggregates S with the first particle size are set as objects to be discarded and the aggregates S with the second particle size are set as objects to be cultured, the aggregates S to be discarded can be discarded more easily. As a result, the aggregate S to be cultured can be cultured in a better environment, and the efficiency of cell culture can be improved.
  • control unit 14 controls the suction unit 8 to suck the culture medium W at a second flow rate that exceeds the competitive suction flow rate for the aggregates S of the second particle size. .
  • the target aggregate S can be collected more easily. Therefore, the efficiency of cell culture can be improved.
  • Embodiment 3 has the same configuration as Embodiment 1, except that culture apparatus 1 includes a plurality of culture vessels 2 and a plurality of suction tubes 4 .
  • FIG. 10 is a schematic diagram of the culture device 1 according to the third embodiment.
  • the culture apparatus 1 of the present embodiment includes a first culture vessel 2a, a second culture vessel 2b, a third culture vessel 2c, a first suction tube 4a, a second suction tube 4b, a third suction tube 4c, a suction section 8,
  • a management unit 10 , a discharge pipe 12 and a control unit 14 are provided.
  • Auxiliary filter 6 is omitted.
  • first suction tube 4a is inserted into the first culture container 2a.
  • the other end of the first suction tube 4a is inserted into the second culture vessel 2b.
  • One end of the second suction tube 4b is inserted into the second culture vessel 2b.
  • the other end of the second suction tube 4b is inserted into the third culture vessel 2c.
  • One end of the third suction tube 4c is inserted into the third culture vessel 2c.
  • the other end of the third suction tube 4 c is connected to the inlet port of the management section 10 .
  • a suction portion 8 is provided in the middle of the third suction tube 4c.
  • Each culture vessel is a closed system in which the atmosphere does not substantially enter from the outside.
  • suction force can be generated in the first suction tube 4a to the third suction tube 4c.
  • One end of a discharge pipe 12 is connected to the outlet port of the management unit 10 .
  • the other end of the discharge tube 12 is inserted into the first culture vessel 2a. Since each culture vessel is a closed system, the concentration control described above is performed for oxygen and carbon dioxide in each culture vessel.
  • the first suction tube 4a sucks the culture solution W from the first culture container 2a.
  • the culture medium W sucked from the first culture container 2a moves to the second culture container 2b through the first suction tube 4a.
  • the second suction tube 4b sucks the culture medium W from the second culture container 2b.
  • the culture medium W sucked from the second culture container 2b moves to the third culture container 2c through the second suction tube 4b.
  • the third suction tube 4c sucks the culture medium W from the third culture container 2c.
  • the culture medium W sucked from the third culture container 2c flows into the management section 10 through the third suction tube 4c.
  • the culture solution W that has passed through the management unit 10 returns to the first culture vessel 2a through the discharge pipe 12.
  • the suction section 8 and the management section 10 may be provided in the first suction tube 4a and the second suction tube 4b.
  • the first suction tube 4a, the second suction tube 4b, and the third suction tube 4c have different tube diameters at least in the flow velocity adjustment region. Therefore, different suction flow velocities (or linear velocities) are generated in the suction tubes 4 by driving the suction unit 8 .
  • the suction tube 4 located on the upstream side of the flow of the culture solution W has a smaller tube diameter. That is, the diameter of the first suction tube 4a is the smallest, the diameter of the second suction tube 4b is intermediate, and the diameter of the third suction tube 4c is the largest.
  • the fastest suction flow velocity is generated in the first suction tube 4a
  • the intermediate suction flow velocity is generated in the second suction tube 4b
  • the slowest suction flow velocity is generated in the third suction tube 4c.
  • the first suction tube 4a can suck aggregates S having a particle size larger than those of the second suction tube 4b and the third suction tube 4c.
  • the second suction tube 4b can suck aggregates S having a particle size larger than that of the third suction tube 4c.
  • aggregates S with relatively large particle sizes gather in the first culture vessel 2a, aggregates S with relatively intermediate particle sizes gather in the second culture vessel 2b, and aggregates S with relatively intermediate particle sizes gather in the third culture vessel 2c. Aggregates S with relatively small particle sizes are gathered.
  • the particle size of the aggregates S aggregated in each culture vessel 2 can be appropriately changed by adjusting the tube diameter of each suction tube 4, the output of the suction device that constitutes the suction section 8, and the like.
  • the culture device 1 of the present embodiment has a plurality of combinations of culture vessels 2 and suction tubes 4.
  • the multiple combinations are connected in series with each other. Further, the tube diameter of each suction tube 4 is different from each other. Then, by driving the suction unit 8, the culture solution W is sucked by each suction tube 4 and moved from the culture container 2 on the upstream side to the culture container 2 on the downstream side in order.
  • aggregates S having a particle size corresponding to the diameter of the corresponding suction tube 4 can be aggregated in each of the plurality of culture vessels 2 . Therefore, the efficiency of cell culture can be further improved.
  • the number of sets of culture container 2 and suction tube 4 may be two or four or more.
  • Embodiment 4 has the same configuration as Embodiment 1, except that it includes a collection unit configured by a suction tube 4 .
  • FIG. 11 is a schematic diagram of the culture device 1 according to the fourth embodiment.
  • the culture apparatus 1 of this embodiment includes a culture container 2, a suction unit 8, a management unit 10, a discharge pipe 12, a control unit 14, a connection pipe 26 and a collection unit 28 (trap chamber).
  • the connection pipe 26 connects the culture vessel 2 and the recovery section 28 .
  • One end of the connection pipe 26 is inserted into the culture container 2 .
  • the culture vessel 2 of the present embodiment may be a closed system into which the atmosphere does not substantially enter from the outside, or an open system into which the atmosphere can enter from the outside.
  • the culture vessel 2 is a closed system, the oxygen and carbon dioxide in the culture vessel 2 are controlled as described above.
  • the culture container 2 is an open system, the concentration control described above is not essential, but is preferably implemented.
  • the other end of the connection pipe 26 is connected to the inlet port of the recovery section 28 .
  • One end of the discharge pipe 12 is connected to the outlet port of the recovery unit 28 .
  • the other end of the discharge tube 12 is inserted into the culture vessel 2 .
  • a management unit 10 is provided in the middle of the connection pipe 26 .
  • a suction part 8 is provided in the middle of the discharge pipe 12 .
  • an auxiliary filter 6 is provided on the downstream side of the suction portion 8
  • the suction unit 8 By driving the suction unit 8 , the culture solution W in the culture vessel 2 moves to the collection unit 28 through the connection pipe 26 .
  • the management unit 10 subjects the culture solution W to regeneration treatment and the like.
  • the culture solution W that has reached the collection unit 28 is subjected to collection processing of the aggregates S described later in the collection unit 28 .
  • the culture solution W is returned to the culture container 2 through the discharge pipe 12 .
  • the suction unit 8 and the management unit 10 can be changed as appropriate.
  • the suction unit 8 may be provided on the connection pipe 26 and the management unit 10 may be provided on the discharge pipe 12 .
  • the suction unit 8 be provided downstream of the recovery unit 28, that is, in the discharge pipe 12. This can prevent the aggregate S from passing through the suction unit 8 .
  • the suction unit 8 In the flow path structure in which the aggregates S pass through the suction unit 8 , there is a risk that some aggregates S will be broken when passing through the suction unit 8 .
  • the suction unit 8 by arranging the suction unit 8 downstream of the collection unit 28 , it is possible to avoid destruction of the aggregates S by the suction unit 8 .
  • the suction unit 8 is arranged downstream of the collection unit 28. By doing so, the countermeasure can be omitted.
  • the collection unit 28 has a suction tube 4 .
  • the collection unit 28 of the present embodiment has a first suction tube 4a, a second suction tube 4b and a third suction tube 4c.
  • Each suction tube 4 is oriented so as to extend vertically, and its upper and lower ends are closed with caps. Further, on the side surface of each suction tube 4, an inlet port 30 is provided near the lower end, and an outlet port 32 is provided near the upper end. Therefore, outlet port 32 is positioned above inlet port 30 .
  • the other end of the connecting pipe 26 is connected to the inlet port 30 of the first suction pipe 4a. Therefore, the inlet port 30 of the first suction tube 4a corresponds to the inlet port of the collecting section 28. As shown in FIG.
  • the outlet port 32 of the first suction tube 4a is connected via piping to the inlet port 30 of the second suction tube 4b.
  • the outlet port 32 of the second suction tube 4b is connected via piping to the inlet port 30 of the third suction tube 4c.
  • One end of the discharge tube 12 is connected to the outlet port 32 of the third suction tube 4c. Therefore, the outlet port 32 of the third suction tube 4c corresponds to the outlet port of the recovery section 28. As shown in FIG.
  • the first suction tube 4a, the second suction tube 4b, and the third suction tube 4c have different tube diameters at least in the flow velocity adjustment region. Therefore, different magnitudes of suction flow velocities are generated in the respective suction tubes 4 by driving the suction portion 8 .
  • the suction tube 4 located on the upstream side of the flow of the culture solution W has a smaller tube diameter. That is, the diameter of the first suction tube 4a is the smallest, the diameter of the second suction tube 4b is intermediate, and the diameter of the third suction tube 4c is the largest.
  • the fastest suction flow velocity is generated in the first suction tube 4a
  • the intermediate suction flow velocity is generated in the second suction tube 4b
  • the slowest suction flow velocity is generated in the third suction tube 4c.
  • aggregates S having relatively large particle sizes are trapped at the bottom of the first suction tube 4a, and aggregates S having relatively intermediate particle sizes are trapped at the bottom of the second suction tube 4b.
  • aggregates S with relatively small particle sizes are trapped.
  • the particle size of the aggregates S to be trapped in each suction tube 4 can be appropriately changed by adjusting the tube diameter of each suction tube 4, the output of the suction device that constitutes the suction section 8, and the like.
  • the culture device 1 of the present embodiment includes the collection section 28 including the aspiration tube 4 .
  • the suction tube 4 has an inlet port 30 and an outlet port 32 arranged above the inlet port 30 , and the inlet port 30 is connected to the culture vessel 2 .
  • the culture medium W is sucked by the suction tube 4 , flows into the suction tube 4 from the inlet port 30 , rises inside the suction tube 4 , and is discharged from the outlet port 32 .
  • aggregates S having a particle size corresponding to the tube diameter are collected in the suction tube 4 .
  • the recovery section 28 of the present embodiment includes a plurality of suction tubes 4 with different tube diameters.
  • One outlet port 32 and the other inlet port 30 of two adjacent suction tubes 4 are connected to connect the plurality of suction tubes 4 in series.
  • the inlet port 30 of the most upstream suction tube 4 is connected to the culture vessel 2 . Then, by driving the suction unit 8, the culture medium W is sucked by each suction tube 4 from the suction tube 4 on the upstream side to the suction tube 4 on the downstream side and moves in order. The culture medium W rises in each suction tube 4 from the inlet port to the outlet port and moves to the suction tube 4 on the downstream side.
  • the number of suction tubes 4 included in the collection unit 28 is not particularly limited, and may be one or more.
  • Embodiments may be specified by items described below.
  • (Item 1) a culture vessel (2) containing a cell aggregate (S) and a culture solution (W); a suction tube (4) for sucking the culture medium (W) in the culture vessel (2); a suction part (8) for generating a suction force in the suction tube (4);
  • the aspirator (8) is controlled in accordance with the competitive suction flow rate of the aggregate (S), which is the speed at which the sedimentation of the aggregate (S) and the floating of the aggregate (S) accompanying the suction of the culture solution (W) are competitive.
  • the competitive suction flow velocity is determined based on the sedimentation velocity prediction curve of the aggregate (S) obtained from the above formula (1), the above formula (2), the above formula (3) and the above formula (4), Incubation device (1) according to item 1.
  • the controller (14) controls the aspirator (8) to aspirate the culture solution (W) at a flow rate equal to or lower than the competitive aspirate flow rate.
  • Incubation device (1) according to the first or second item.
  • the controller (14) exceeds a predetermined competitive suction flow rate for aggregates (S) having a first particle size and is equal to or less than the competitive suction flow rate for aggregates (S) having a second particle size larger than the first particle size.
  • the control unit (14) After aspirating the culture solution (W) at the first flow rate, the control unit (14) aspirates the culture solution (W) at a second flow rate exceeding the competitive aspiration flow rate for aggregates (S) having a second particle size.
  • An aggregate (S) collection unit (28) including a suction tube (4) including a suction tube (4) is provided,
  • the suction tube (4) has an inlet port (30) and an outlet port (32) arranged above the inlet port (30), the inlet port (30) being connected to the culture vessel (2),
  • the culture solution (W) is sucked by the suction tube (4), flows into the suction tube (4) from the inlet port (30), rises in the suction tube (4), and exits. It is discharged from the port (32), and the suction tube (4) collects aggregates (S) having a particle size according to the tube diameter.
  • Incubation device (1) according to any one of items 1 to 6.
  • the recovery section (28) includes a plurality of suction tubes (4a, 4b, 4c) with different tube diameters, One outlet port (32) and the other inlet port (30) of two adjacent suction tubes (4a, 4b, 4c) are connected to connect the plurality of suction tubes (4a, 4b, 4c) to each other,
  • the inlet port (30) of the most upstream suction tube (4a) is connected to the culture vessel (2),
  • the culture solution (W) is sucked by the suction tubes (4a, 4b, 4c) from the upstream side suction tube (4a) to the downstream side suction tube (4c) and moves in order.
  • Each suction tube (4a, 4b, 4c) collects aggregates (S) having a particle size corresponding to the respective tube diameter, Incubation device (1) according to item 8.
  • the sedimentation of the aggregate (S) from the culture container (2) containing the cell aggregate (S) and the culture medium (W) and the floating of the aggregate (S) accompanying the suction of the culture medium (W) are antagonistic. aspirating the culture medium (W) at a flow rate corresponding to the competitive aspirating flow rate of the aggregate (S), which is the speed at which culture method.
  • the competitive suction flow rate is determined based on the sedimentation prediction curve of the aggregate (S) obtained from the above formula (1), the above formula (2), the above formula (3) and the above formula (4), The culture method according to item 10.
  • Cell culture test (Comparative example 1) Using a known culture vessel with a suction tube, mNPCs were stirred and suspended at an initial cell density of 1 ⁇ 10 5 cells/mL. The diameter of the suction tube was ⁇ 10. On the second day of culture, when most aggregates had a particle size of 200 ⁇ m or more, a filter with a pore size of 100 ⁇ m was placed at the tip of the suction tube. Then, the aspiration of the culture medium was started at a flow rate of 1 mL/min, and the culture was continued while returning the aspirated culture medium to the culture vessel. As shown in FIG.
  • FIG. 12A is an optical microscope image of the culture solution according to Comparative Example 1.
  • FIG. 12B is an optical microscope image of the filter according to Comparative Example 1.
  • FIG. 12(A) in Comparative Example 1, the number of aggregates floating in the culture medium was small.
  • the cell density in the culture vessel was 9.4 ⁇ 10 4 cells/mL.
  • FIG. 12(B) many aggregates adhered to the filter.
  • Comparative Example 1 Although the flow rate of the culture solution was lower than the competitive suction flow rate, the filter was clogged with aggregates. This is because a filter was installed at the tip of the suction tube. That is, it is considered that the aggregates riding on the flow of the stirred culture solution came into contact with the filter and were captured. Thus, when the filter is exposed in the culture vessel and is in contact with the culture medium, even if the flow rate of the culture medium is lower than the competitive aspiration flow rate, aggregates are captured by the filter and the viability of cells is significantly reduced. can.
  • Example 1 Using the culture apparatus shown in FIG. 1, mNPCs were stirred and floating cultured at an initial cell density of 1 ⁇ 10 5 cells/mL. The diameter of the suction tube was ⁇ 4. From the 5th day of culture when most of the aggregates had a particle size of 400 ⁇ m or more, aspiration of the culture medium was started at a flow rate of 1 mL/min, and the culture was continued while returning the aspirated culture medium to the culture vessel. As shown in FIG. 8, when the suction tube has a diameter of ⁇ 4 and the flow rate is 1.1 mL/min, the flow rate of the culture solution is a competitive suction flow rate for aggregates with a particle size of 400 ⁇ m.
  • Example 1 where the flow rate is 1 mL/min, the medium flow rate is below the competitive aspiration flow rate.
  • a mesh filter with a pore size of 100 ⁇ m was installed in the upper part of the suction pipe in order to prevent suction of aggregates and debris of less than 400 ⁇ m.
  • FIG. 12C is an optical microscope image of the culture solution according to Example 1.
  • Example 1 As shown in FIG. 12(C), in Example 1, as compared with Comparative Example 1, no decrease in aggregates was observed. In addition, the culture was continued with the target number of days set at 8 days. As a result, it was confirmed that the aggregates could be cultured in good condition for at least 8 days.
  • the cell density in the culture vessel on day 8 of culture was 4.1 ⁇ 10 6 cells/mL. Moreover, the viability of the cells was 91%. From the above, it can be understood that according to the culture apparatus and the culture method according to the embodiment, the culture solution can be aspirated without aspirating the aggregates to be cultured, thereby improving the efficiency of cell culture. can.
  • a suction tube with a tube diameter of ⁇ 10 was installed in the culture apparatus.
  • a mesh filter with a pore size of 100 ⁇ m was placed at the top of the suction tube to remove aggregates and debris with a particle size smaller than the target particle size.
  • Aspiration of the culture medium was started at a flow rate of 8.0 mL/min, and the perfusion treatment of returning the aspirated culture medium to the culture vessel was continued for 6 hours.
  • the suction tube has a diameter of ⁇ 10 and the flow rate is 8.0 mL/min
  • the flow rate of the culture solution is a competitive suction flow rate for aggregates with a particle size of 450 ⁇ m. Therefore, aggregates smaller than 450 ⁇ m are expected to be aspirated by the aspiration tube and removed by the mesh filter.
  • the flow rate of the culture solution is a competitive suction flow rate for aggregates with a particle size of 650 ⁇ m. Therefore, aggregates smaller than 650 ⁇ m are expected to be aspirated by the aspiration tube and removed by the mesh filter.
  • the culture solution was imaged with an optical microscope (BZ-X500, KEYENCE CORPORATION) after stirring floating culture, after perfusion treatment at a flow rate of 8.0 mL/min, and after perfusion treatment at a flow rate of 14.1 mL/min. An optical microscope image was obtained. Then, using measurement software (BZ-X Analyzer, Keyence Corporation), the particle size of each aggregate reflected in the optical microscope image was measured to obtain the particle size distribution of the aggregate. The results are shown in FIG.
  • FIG. 13 is a diagram showing the particle size distribution of aggregates.
  • A in FIG. 13 is the result after stirring floating culture.
  • B in FIG. 13 is the result after perfusion treatment at a flow rate of 8.0 mL/min.
  • C in FIG. 13 is the result after perfusion treatment at a flow rate of 14.1 mL/min.
  • the percentage of aggregates with a particle size of less than 450 ⁇ m was 15.3%, and the percentage of aggregates with a particle size of 450 ⁇ m or more was 84.7%.
  • a suction tube with a tube diameter of ⁇ 10 was installed in the culture apparatus.
  • a mesh filter with a pore size of 100 ⁇ m was placed at the top of the suction tube to remove aggregates and debris with a particle size smaller than the target particle size.
  • Aspiration of the culture fluid was started at a flow rate of 6.7 mL/min, and the perfusion treatment of returning the aspirated culture fluid to the culture vessel was continued for 10 hours.
  • the suction tube has a diameter of ⁇ 10 and the flow rate is 6.7 mL/min
  • the flow rate of the culture solution becomes a competitive suction flow rate for aggregates with a particle size of 400 ⁇ m. Therefore, aggregates smaller than 400 ⁇ m are expected to be sucked by the suction tube and removed by the mesh filter.
  • the mesh filter was checked after perfusion treatment, fine aggregates and debris were deposited on the surface of the mesh filter.
  • a suction tube with a tube diameter of ⁇ 10 was newly installed in the culture apparatus.
  • a circulation channel for returning the culture medium to the culture container was connected to the suction tube.
  • a recovery suction tube was provided as an aggregate recovery section.
  • the recovery suction tube has an inlet port and an outlet port on the side, and has a tube diameter of ⁇ 20.
  • Aspiration of the culture fluid was started at a flow rate of 15.7 mL/min, and the perfusion treatment of returning the aspirated culture fluid to the culture vessel was continued for 12 hours.
  • the flow rate of the culture solution is the competitive suction flow rate of aggregates with a particle size of 700 ⁇ m. Therefore, aggregates of less than 700 ⁇ m are expected to be sucked by the suction tube and flow into the collection section.
  • the suction tube with a diameter of ⁇ 20 has a cross-sectional area four times as large as that of the suction tube with a diameter of ⁇ 10. Therefore, the flow rate of the culture solution is reduced to 1/4. In this case, the flow rate of the culture solution is lower than the competitive suction flow rate of aggregates flowing into the collection suction tube. Therefore, aggregates of 400 ⁇ m or more and less than 700 ⁇ m are expected to settle at the bottom of the collection suction tube.
  • FIG. 14 is an optical microscope image of the aggregates deposited on the bottom of the collection suction tube. As shown in FIG. 14, it was confirmed that a large number of agglomerates having an assumed particle size were deposited on the bottom of the collection suction tube. From the above, it was confirmed that, according to the culture apparatus and the culture method according to the embodiment, aggregates with a target particle size can be recovered from aggregates with various particle sizes. It can be seen that this can increase the yield of aggregates having the desired particle size.
  • the present invention can be used for culture devices and culture methods.

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Abstract

培養装置１は、細胞の凝集体Ｓおよび培養液Ｗを収容する培養容器２と、培養容器２中の培養液Ｗを吸引する吸引管４と、吸引管４に吸引力を発生させる吸引部８と、凝集体Ｓの沈降、および培養液Ｗの吸引に伴う凝集体Ｓの浮上が拮抗する速度である凝集体Ｓの拮抗吸引流速に応じて吸引部８を制御する制御部１４とを備える。

Description

培養装置および培養方法
　本発明は、培養装置および培養方法に関する。
　従来、細胞を大量培養する方法として、培養槽を用いた細胞凝集体の浮遊攪拌培養が知られている。このような培養方法に関して、特許文献１には、培養液を吸引するためのアスピレータを備えた細胞培養装置が開示されている。アスピレータで培養液を吸引して培養液の交換等を行うことで、細胞培養の効率化を図ることができる。
　特許文献１のアスピレータは、外管と内管とからなる二重管構造を有している。また、外管は培養液を通すフィルタを備え、内管はフィルタを通過した培養液を吸引する。さらに、外管には外管の内腔と外部とを連通する空気孔が設けられており、外管内の過剰な陰圧を外部に逃がすことができる。特許文献１ではこのような構造を備えることで、メッシュサイズ以上の細胞凝集体がフィルタに目詰まりすることを抑制していた。
国際公開第２０１９／１２４５４０号
　外管内に過剰な陰圧が生じないようにしても、外管にフィルタが設けられている以上は、凝集体がフィルタに接触することは避けられない。凝集体がフィルタに接触する機会がある限りは、凝集体がフィルタに付着してしまうおそれがある。凝集体がフィルタに付着すると、培養液の吸引が阻害されてしまい、細胞培養の効率が低下し得る。また、細胞の成長や増殖も阻害されてしまい、この点でも細胞培養の効率が低下し得る。
　本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的の１つは、細胞培養の効率の向上を図る技術を提供することにある。
　本発明のある態様の培養装置は、細胞の凝集体および培養液を収容する培養容器と、培養容器中の培養液を吸引する吸引管と、吸引管に吸引力を発生させる吸引部と、凝集体の沈降、および培養液の吸引に伴う凝集体の浮上が拮抗する速度である凝集体の拮抗吸引流速に応じて吸引部を制御する制御部と、を備える。
　本発明の他の態様の培養方法は、細胞の凝集体および培養液を収容する培養容器から、凝集体の沈降、および培養液の吸引に伴う凝集体の浮上が拮抗する速度である凝集体の拮抗吸引流速に応じた流速で培養液を吸引することを含む。
　なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を方法、装置、システムなどの間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。
　本発明によれば、細胞培養の効率の向上を図ることができる。
実施の形態１に係る培養装置の模式図である。 凝集体の粒径と沈降速度との関係を示す図である。 様々な吸引流速で培養液を吸引した際の凝集体の状態を示す図である。 凝集体の沈降速度と拮抗吸引流速との関係を示す図である。 １／Ｗ＊と１／Ｓ＊との関係を示す図である。 沈降速度予測曲線を示す図である。 拮抗吸引流速予測曲線を示す図である。 凝集体の各粒径における、沈降速度の予測値、拮抗吸引流速の予測値、各管径での拮抗流量を示す図である。 実施の形態２に係る培養装置の模式図である。 実施の形態３に係る培養装置の模式図である。 実施の形態４に係る培養装置の模式図である。 図１２（Ａ）は、比較例１に係る培養液の光学顕微鏡画像である。図１２（Ｂ）は、比較例１に係るフィルタの光学顕微鏡画像である。図１２（Ｃ）は、実施例１に係る培養液の光学顕微鏡画像である。 凝集体の粒径分布を示す図である。 回収用吸引管の底部に堆積した凝集体の光学顕微鏡像である。
　以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。各図面に示される同一又は同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、各図に示す各部の縮尺や形状は、説明を容易にするために便宜的に設定されており、特に言及がない限り限定的に解釈されるものではない。また、本明細書または請求項中に「第１」、「第２」等の用語が用いられる場合には、この用語はいかなる順序や重要度を表すものでもなく、ある構成と他の構成とを区別するためのものである。また、各図面において実施の形態を説明する上で重要ではない部材の一部は省略して表示する。
（実施の形態１）
　図１は、実施の形態１に係る培養装置１の模式図である。本実施の形態の培養装置１は、培養容器２と、吸引管４と、補助フィルタ６と、吸引部８と、管理部１０と、吐出管１２と、制御部１４とを備える。
　培養容器２は、細胞の凝集体Ｓおよび培養液Ｗを収容するバイオリアクターである。培養容器２は、凝集体Ｓの浮遊培養が可能であれば、特に限定されない。一例としての培養容器２は、培養液Ｗを攪拌するための攪拌羽１６を有する、いわゆるスピナーフラスコである。なお、培養容器２は、培養槽、細胞培養ボトル、細胞培養バック等であってもよい。培養容器２の容量は、例えば１００ｍＬ～１００Ｌである。本実施の形態の培養容器２は、外部から雰囲気が実質的に進入しない閉鎖系であってもよいし、外部から雰囲気が進入可能な開放系であってもよい。培養容器２が閉鎖系である場合、培養容器２中の酸素および二酸化炭素の濃度制御が必要である。この濃度制御は、例えば管理部１０や図示しないガス給排部等によって実施される。酸素濃度は、例えば１‐６ｐｐｍに制御される。二酸化炭素濃度は、例えば培養液ＷのｐＨが６．８－７．６となるように制御される。培養容器２が開放系である場合、上述の濃度制御は必須ではないが、実施する方が好ましい。
　凝集体Ｓを構成する細胞は、特に限定されない。例えば細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞；ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞等の、多能性幹細胞由来の分化誘導細胞；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）等の体性幹細胞；ネフロン前駆細胞等の、体性幹細胞由来の前駆細胞；ヒト近位尿細管上皮細胞、ヒト遠位尿細管上皮細胞、ヒト集合管上皮細胞等の組織細胞；ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）等の抗体産生細胞株；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（ＳＦ９細胞）等のヒト以外の動物由来の抗体産生細胞株等が挙げられる。
　培養液Ｗは、特に限定されず、培養する細胞の種類等に応じて、公知の培養液から適宜選択することができる。例えば近位尿細管細胞を培養する場合であれば、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）、ＥｐｉＣＭ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）、ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳＦＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等を用いることができる。
　吸引管４は、培養容器２中の培養液Ｗを吸引する。吸引管４の一端は、培養容器２に挿入されて、培養容器２中の培養液Ｗに接する。吸引管４の他端は、管理部１０の入口ポートに接続される。吸引管４の管径は、吸引部８で培養液Ｗを吸引できる大きさであれば特に限定されない。
　吸引管４の途中には、補助フィルタ６が設けられる。補助フィルタ６は、吸引管４の一端から所定の間隔をあけて配置される。吸引管４における補助フィルタ６から先端までの長さは、少なくとも補助フィルタ６の手前の領域における培養液Ｗの吸引流速が、培養容器２内での攪拌による培養液Ｗの流れの影響を受けない、あるいは発明を実施可能な程度に極力小さくなる長さであることが好ましい。少なくとも吸引管４の先端から当該長さの領域において、培養液Ｗの吸引流速が後述する拮抗吸引流速に応じた流速に調整される。以下ではこの領域を流速調整領域という。流速調整領域は、設計者の経験的知見または設計者による実験等に基づき適宜設定することが可能である。また、補助フィルタ６が省略される場合には、流速調整領域は、吸引管４の先端からの領域であって培養液Ｗの吸引流速が培養容器２内での攪拌による培養液Ｗの流れの影響を受けない、あるいは極力小さくなる領域と定義される。例えば、回転撹拌方式の培養容器２である場合、補助フィルタ６から先端までの長さは例えば１ｃｍ以上であることが好ましい。一例としての補助フィルタ６は、吸引管４のうち培養液Ｗの液面よりも上に延在する領域、あるいは培養容器２の外部に延在する領域に配置される。なお、補助フィルタ６は省略されてもよい。また、補助フィルタ６の孔径は、少なくとも培養対象の凝集体Ｓ、つまり最終的に回収対象となる凝集体Ｓの粒径未満であることが好ましく、例えば１μｍ～１０００μｍである。
　吸引管４における補助フィルタ６と管理部１０との間には、吸引部８が設けられる。吸引部８は、吸引管４に吸引力を発生させる。吸引部８としては、ペリスタポンプやダイヤフラムポンプ等のポンプ、あるいはアスピレータといった、公知の吸引装置を用いることができる。吸引部８が駆動することで、吸引管４の一端から培養液Ｗが吸引される。吸引部８は、例えば０．１ｍＬ／分～１Ｌ／分の流量で培養液Ｗを吸引することができる。なお、吸引管４に吸引力を発生させることができれば、吸引部８の配置は特に限定されない。
　培養容器２から吸引された培養液Ｗは、吸引管４内を他端側に向かって流れ、補助フィルタ６および吸引部８を経由して管理部１０に流入する。管理部１０は、吸引された培養液Ｗの成分の解析および調整の少なくとも一方を実行する。例えば管理部１０は、ｐＨ計、溶存酸素計（ＤＯ計）、分光装置といった公知の分析器を有し、培養液Ｗの成分を解析することができる。また、例えば管理部１０は、グルコース、タンパク質等の培地成分や酸素を培養液Ｗに補充するためのモジュールを有する。また、例えば管理部１０は、乳酸やアンモニアといった老廃物の吸着剤を充填したカラムを有し、培養液Ｗ中の老廃物を除去可能である。
　管理部１０の出口ポートには、吐出管１２の一端が接続される。吐出管１２の他端は、培養容器２に挿入される。管理部１０で解析処理や再生処理が施された培養液Ｗは、吐出管１２を介して培養容器２に戻される。
　制御部１４は、吸引部８の駆動を制御する。制御部１４は、ハードウェア構成としてはコンピュータのＣＰＵやメモリをはじめとする素子や回路で実現され、ソフトウェア構成としてはコンピュータプログラム等によって実現されるが、図１では適宜、それらの連携によって実現される機能ブロックとして描いている。この機能ブロックはハードウェア、ソフトウェアの組合せによっていろいろなかたちで実現できることは、当業者には理解されるところである。
　例えば、培養装置１の使用者は、操作パネル（図示せず）等を介して、培養装置１の動作モードを選択することが可能である。一例として、動作モードには、培養液再生モードが含まれる。制御部１４は、選択された動作モードを示す信号を操作パネルから受信して、動作モードに応じて吸引部８を制御する。制御部１４は、凝集体Ｓの拮抗吸引流速に応じて吸引部８を制御する。拮抗吸引流速とは、自重等による凝集体Ｓの沈降と、培養液Ｗの吸引に伴う凝集体Ｓの浮上とが拮抗する速度である。つまり、制御部１４は、動作モードの目的に応じて、凝集体Ｓの拮抗吸引流速に対する培養液Ｗの吸引流速の大きさを選択する。
　一般に凝集体Ｓの粒径の増大に伴って、凝集体Ｓの沈降速度は増加する。また、沈降速度の増加に伴って、沈降速度と釣り合う吸引速度も増加する。よって、凝集体Ｓの粒径と拮抗吸引流速とは正の相関を有する。また、凝集体Ｓの粒径は、培養日数（培養時間）と正の相関を有する。凝集体Ｓの粒径と培養日数との関係は、細胞の種類や培養条件等に応じて、設計者の経験的知見または設計者による実験等に基づき適宜設定することが可能である。
　したがって、制御部１４は、培養日数をカウントすることで培養容器２に収容されている凝集体Ｓの粒径、ひいては吸引力調整の基準となる拮抗吸引流速を特定することができる。例えば制御部１４は、タイマーを内蔵しており、操作パネル等から培養の開始タイミングを示す信号が入力されることで、培養日数をカウントすることができる。また、制御部１４は、培養日数と拮抗吸引流速とを対応付けた変換テーブルを予め保持しており、この変換テーブルを用いて培養日数から拮抗吸引流速を定めることができる。
　なお、公知の光学的手法等により、培養液Ｗ中の凝集体Ｓの粒径を計測してもよい。また、凝集体Ｓの粒径は、粒径と相関を有する培養日数以外のパラメータに基づいて定めることもできる。このようなパラメータとしては、グルコースの消費速度、乳酸の生成速度、酸素の消費速度等が例示される。制御部１４は、粒径の実測値やパラメータと拮抗吸引流速とを対応付けた変換テーブルを用いて、拮抗吸引流速を定めることができる。一例として、凝集体Ｓの粒径は、例えば凝集体Ｓの顕微鏡画像において、凝集体Ｓの輪郭上に位置する２点間の距離における最大値と最小値との平均と把握される。
　培養液再生モードが選択された場合、制御部１４は、培養容器２に収容されている凝集体Ｓの拮抗吸引流速以下の流速で培養液Ｗを吸引するよう吸引部８を制御する。これにより、培養液Ｗは管理部１０に送られる一方で、培養容器２に収容されている凝集体Ｓは吸引管４内への吸引が抑制される。なお、制御部１４は、モード選択に依らずに培養液Ｗの解析処理や再生処理を常時実行してもよい。また、制御部１４は、培養液再生モードの実行と常時実行とのいずれの場合でも、管理部１０から培養液Ｗの解析結果を示す信号を受信し、解析結果に基づいて培養液Ｗの吸引の中断と再開とを切り替えるフィードバック制御を実行してもよい。
　上述のように、凝集体Ｓの拮抗吸引流速は培養日数に応じて特定される。一方、凝集体Ｓの粒径には分布が生じている場合もある。つまり、ある培養日数での培養容器２内には、当該培養日数でとるべき粒径を有する、凝集体Ｓのメインの群だけでなく、より小さい粒径の凝集体Ｓ、より大きい粒径の凝集体Ｓ、単体の細胞、デブリ等も混在し得る。制御部１４がメインの群の粒径に対応する拮抗吸引流速に等しい流速で、あるいは当該拮抗吸引流速との差が小さい流速で培養液Ｗを吸引した場合、より小さい粒径の凝集体Ｓ等は吸引管４内に吸引され得る。吸引管４内に吸引された凝集体Ｓ等は、補助フィルタ６によって管理部１０側への進行が抑制される。補助フィルタ６の孔径は、細胞培養における凝集体Ｓの目標粒径よりも小さいことが好ましく、例えば１μｍ～１０００μｍである。凝集体Ｓの目標粒径は、例えば１００μｍ～１５００μｍである。
　続いて、吸引力調整の基準となる拮抗吸引流速について詳細に説明する。本発明者らは、以下の手順により拮抗吸引流速を特定した。
（凝集体Ｓの沈降試験）
　まず、凝集体Ｓの沈降試験を実施し、凝集体Ｓの沈降速度を測定した。具体的には、９６ウェルプレート（PrimeSurface（登録商標）プレート９６Ｕ、住友ベークライト社）にマウス胎児由来ネフロン前駆細胞（ｍＮＰＣ）を５０μｌ（５０００個）播種し、ｍＮＰＣ用培地を用いて培養した。これにより、様々な粒径の凝集体Ｓを得た。得られた凝集体Ｓの粒径を顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０、キーエンス社）を用いて計測した。その後、ｍＮＰＣ用培地に凝集体Ｓを静かに沈降させ、所定落差Ｌを通過する時間ｔを測定した。そして、凝集体Ｓの沈降速度ｗｓ（ｗｓ＝Ｌ／ｔ）を算出した。図２は、凝集体Ｓの粒径と沈降速度との関係を示す図である。図２に示すように、粒径の増大に伴って沈降速度が増加することが確認された。
（凝集体Ｓの吸引試験）
　次に、凝集体Ｓの吸引試験を実施し、凝集体Ｓの拮抗吸引流速を測定した。具体的には、試験１で得られた様々な粒径の凝集体Ｓを吸引管４内に配置した状態で、様々な吸引流速で培養液Ｗを吸引した。吸引管４には、管径φ６、φ８、φ１０（６ｍｍ、８ｍｍ、１０ｍｍ）のものを用いた。培地温度は２５℃とした。吸引にはペリスタポンプ（ＷＰＸ１、ＷＥＬＣＯ社）を用いた。そして、培養液Ｗを吸引している間の凝集体Ｓの状態を目視で観察して評価した。状態の評価において、凝集体Ｓが沈降した場合を「Ａ」、凝集体Ｓが留まった場合、つまり沈降と浮上とが拮抗した場合を「Ｂ」、凝集体Ｓが浮上した場合を「Ｃ」と評価した。評価Ｂの得られた吸引流速が、凝集体Ｓの各粒径における拮抗吸引流速に相当する。
　図３は、様々な吸引流速で培養液Ｗを吸引した際の凝集体Ｓの状態を示す図である。図３に示すように、吸引管４の管径がいずれの場合にも、同様の粒径の凝集体Ｓは同様の拮抗吸引流速となることが確認された。よって、吸引管４の管径がいずれの場合にも、培養液Ｗの吸引流速を調整することで、凝集体Ｓを沈降あるいは拮抗状態にしたり、浮上させたりできることが確認された。つまり、培養液Ｗの吸引流速を調整することで、培養対象の凝集体Ｓを吸引することなく、培養液Ｗを培養容器２の外部に取り出すことが可能であることが示された。なお、培養液Ｗの吸引流量は、吸引流速に吸引管４の管径（内径）を乗じた値となる。よって、吸引管４の管径を大きくすることで、培養対象の凝集体Ｓの吸引を抑制しながら、吸引流量を大きくすることができる。
（沈降速度と拮抗吸引流速との対比）
　上述した沈降試験および吸引試験の結果から、凝集体Ｓの沈降速度と拮抗吸引流速との関係を導出した。図４は、凝集体Ｓの沈降速度と拮抗吸引流速との関係を示す図である。図４に示すように、沈降速度を第１軸（横軸）に設定し、拮抗吸引流速を第２軸（縦軸）に設定した座標に、各粒径の凝集体Ｓの結果をプロットして線形近似することで、沈降速度と拮抗吸引流速との関係を示す線形近似式が得られた。
　理論的には、培養液Ｗの吸引流速と凝集体Ｓの沈降速度とが同じ値であれば、凝集体Ｓは沈降も浮上もせず拮抗状態となるはずである。しかしながら、実際には、凝集体Ｓの沈降速度と拮抗吸引流速とは正の相関を有するものの、拮抗吸引流速は沈降速度よりも低くなることが確認された。これは、吸引部８を構成するポンプの脈動等の影響によるものと推測される。
（沈降速度予測曲線の作成）
　粒径毎の凝集体Ｓの沈降速度を予測し、これに基づいて拮抗吸引流速を予測することができれば、いずれの粒径の凝集体Ｓについても、目的に見合った培養液Ｗの吸引流速を精度よく定めることができる。そこで、ｍＮＰＣの凝集体Ｓを球状粒子と見立てて、凝集体Ｓの沈降速度予測曲線を作成した。当該作成には、論文：Jimenez, J. A. and Madsen, O. S. , A simple formula to estimate settling velocity of natural sediments. Journal of Waterway, Port,Coastal, and Ocean Engineering Vol.129, No. 2, pp.70-78,2003で提案されている方法を用いた。
　まず、以下の式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
 ［式（１）中、Ｗ＊は無次元沈降速度であり、ｗｓは凝集体Ｓの沈降速度［ｍ／ｓ］であり、ｓはρｓ／ρｗで与えられる比重であり、ρｓは凝集体Ｓの密度［ｋｇ／ｍ３］であり、ρｗは培養液Ｗの密度［ｋｇ／ｍ３］であり、ｇは重力加速度［ｍ／ｓ２］であり、ｄは凝集体Ｓの粒径［ｍ］である］
を用いて、上述した沈降試験で得られた各粒径の沈降速度を無次元沈降速度Ｗ＊に変換した。なお、式（１）は、論文における第１式（釣り合いの式）を変形したものであり、論文における第２式である。
　また、以下の式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
 ［式（２）中、Ｓ＊は無次元粒子パラメータであり、νはμ／ρｗで与えられる培養液Ｗの動粘度[ｍ２／ｓ]であり、μは培養液Ｗの粘度［Ｐａ・ｓ］であり、ρｗは培養液Ｗの密度［ｋｇ／ｍ３］であり、ｄ、ｓおよびｇは式（１）と同様である］
を用いて、各粒径の凝集体Ｓについて無次元粒子パラメータＳ＊を算出した。なお、式（２）は、論文における第４式である。
　そして、以下の式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
 ［式（３）中、Ｗ＊は式（１）と同様であり、Ｓ＊は式（２）と同様であり、ＡおよびＢは、１／Ｗ＊を第１軸に設定し１／Ｓ＊を第２軸に設定した座標に凝集体Ｓの粒径毎の値をプロットして得られる直線から定まる定数である］
を用い、式（３）に各粒径の凝集体ＳのＷ＊およびＳ＊を代入して、定数ＡおよびＢを得た。なお、式（３）は、論文における第６式である。具体的には、図５に示すように、１／Ｓ＊を第１軸に設定し１／Ｗ＊を第２軸に設定した座標に、各粒径の凝集体Ｓの値をプロットして線形近似することで線形近似式を得る。そして、線形近似式の切片から定数Ａを得ることができ、線形近似式の傾きから定数Ｂを得ることができる。図５は、１／Ｓ＊と１／Ｗ＊との関係を示す図である。
　上述した一連の計算において、重力加速度ｇを９．８０６５５ｍ／ｓ２とし、凝集体Ｓの密度ρｓを１０３０ｋｇ／ｍ３とし、２５℃における培養液Ｗの密度ρｗを１００５．２９４ｋｇ／ｍ３とし、２５℃における培養液Ｗの粘度μを１．０２７ｍＰａ・ｓとした。凝集体Ｓの粘度μは、音叉振動式粘度計（ＳＶ－Ａ、ＡＮＤ）を用いて測定することができる。この結果、図５に示す例では、式（３）のＡが０．８９、Ｂが３．８２となった。
　なお、培養液Ｗの密度ρｗの算出にあたり、ｔ℃における培養液Ｗの比重ｓｗを以下の方法で算出した。すなわち、乾いた比重瓶（１－４５６６－０１、アズワン）の重さＷ１［ｇ］と、ｔ℃の純水をいれた比重瓶の重さＷ２［ｇ］と、ｔ℃の培養液Ｗを入れた比重瓶の重さＷ３［ｇ］とを、電子天秤（ＨＲ２５１－ＡＺ、ＡＮＤ）で測定した。そして、ｔ℃の空気の密度をρａｉｒ［ｇ／ｃｍ３］とし、４℃における水の密度をρ０［ｇ／ｃｍ３］として、液体比重測定法（ＪＩＳ）（案）、計測、第９巻１０号に掲載の以下の式（F１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
 を用いて培養液Ｗの比重ｓｗを算出した。
　また、凝集体Ｓの密度ρｓの算出にあたり、凝集体Ｓの比重ｓｓを以下の方法で算出した。すなわち、乾いたマイクロチューブ（１３０－８０６Ｃ、ＷＡＴＳＯＮ）の重さＷ４［ｇ］を電子天秤（ＨＲ２５１－ＡＺ，ＡＮＤ）で測定した。そして、マイクロチューブに複数個の凝集体Ｓを集めた。マイクロチューブを遠心分離にかけた後、上澄み培地を除去して、重さＷ５［ｇ］を測定した。細胞が占める領域をｔ℃の純水に置換し、重さＷ６［ｇ］を測定した。ｔ℃の水の密度をρ１［ｇ／ｃｍ３］として、以下の式（F２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
 を用いて凝集体Ｓの比重ｓｓを算出した。
　式（Ｆ２）は、基本的な比重の求め方である、（物体の比重）＝（物体の質量）／（物体の体積と同じ体積となる量で４℃の水の質量）という関係式に基づく。４℃に管理した状態で水の重量を測定することは困難である。このため、室温で安定化させた状態で測定した水の重量を、同温度の水の密度で割ることで、室温における水の体積を算出する。そして、凝集体Ｓの重量を室温における水の体積で割った後に４℃の水の密度で割ることで、凝集体Ｓの比重ｓｓを算出することができる。
　続いて、式（３）に式（１）および式（２）を代入して得られる、以下の式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
 ［式（４）中、ｗｓ、ｓ、ｇ、ｄは式（１）と同様であり、νは式（２）と同様であり、ＡおよびＢは式（３）と同様である］
を用い、式（４）にＡおよびＢの値を代入することで、凝集体Ｓの沈降速度予測曲線が得られる。図６は、沈降速度予測曲線を示す図である。図６に示すように、上述した凝集体Ｓの沈降試験で得られた沈降速度の実測値と、沈降速度予測曲線とを対比したところ、両者は高精度に近似していることが確認された。
（拮抗吸引流速予測曲線の作成）
　そして、上述した沈降速度と拮抗吸引流速との関係を示す線形近似式を用いて、式（４）から得られた沈降速度予測曲線を拮抗吸引流速予測曲線に変換する。制御部１４は、この沈降速度予測曲線に基づいて定まる拮抗吸引流速を基準として、吸引部８が発生させる培養液Ｗの吸引流速力を調整する。図７は、拮抗吸引流速予測曲線を示す図である。また、図８は、凝集体Ｓの各粒径における、沈降速度の予測値、拮抗吸引流速の予測値、各管径での拮抗流量を示す図である。上述した凝集体Ｓの吸引試験で得られた拮抗吸引流速の実測値と、拮抗吸引流速予測曲線とを対比したところ、両者は高精度に近似していることが確認された。
　以上説明したように、本実施の形態に係る培養装置１は、細胞の凝集体Ｓおよび培養液Ｗを収容する培養容器２と、培養容器２中の培養液Ｗを吸引する吸引管４と、吸引管４に吸引力を発生させる吸引部８と、凝集体Ｓの沈降、および培養液Ｗの吸引に伴う凝集体Ｓの浮上が拮抗する速度である凝集体Ｓの拮抗吸引流速に応じて吸引部８を制御する制御部１４とを備える。これにより、フィルタを用いずに、培養液Ｗのみの吸引（つまり培養液Ｗと凝集体Ｓとの分離）や、凝集体Ｓの分級といった作業を実施することができる。よって、凝集体Ｓがフィルタに付着することを抑制できるため、細胞培養の効率を向上させることができる。
　また、本実施の形態の制御部１４は、拮抗吸引流速以下の流速で培養液Ｗを吸引するよう吸引部８を制御する。これにより、フィルタを用いることなく、凝集体Ｓと培養液Ｗとの分離が可能となる。よって、細胞培養の効率を向上させることができる。
　また、本実施の形態において、拮抗吸引流速は、上記式（１）～式（４）から得られる凝集体Ｓの沈降速度予測曲線に基づいて定まる。これにより、いずれの粒径の凝集体Ｓについても、凝集体Ｓの吸引を抑制しながら培養液Ｗの吸引が可能となる。また、培養液Ｗの吸引目的に応じて、より適した培養液Ｗの吸引流速を設定することができる。
　また、本実施の形態の培養装置１は、吸引管４に接続され、吸引された培養液Ｗの成分の解析および調整の少なくとも一方を実行する管理部１０を備える。これにより、細胞や培養液Ｗの状態をより簡単に把握することができ、またより良好な培養環境を作り出すことができる。よって、細胞培養の効率をさらに向上させることができる。
（実施の形態２）
　実施の形態２は、培養装置１の構成の一部と制御部１４の制御内容とを除き、実施の形態１と共通の構成を有する。以下、本実施の形態について実施の形態１と異なる構成を中心に説明し、共通する構成については簡単に説明するか、あるいは説明を省略する。図９は、実施の形態２に係る培養装置１の模式図である。本実施の形態の培養装置１は、培養容器２、吸引管４、吸引部８、管理部１０、吐出管１２および制御部１４に加えて、切替弁１８と、回収管２０と、回収容器２２とを備える。補助フィルタ６は省略される。
　管理部１０の出口ポートには、切替弁１８を介して吐出管１２の一端と、回収管２０の一端とが接続される。吐出管１２の他端は、培養容器２に挿入される。回収管２０の他端は、回収容器２２に挿入される。切替弁１８は、例えば公知の電磁弁で構成され、管理部１０の出口ポートから流出する培養液Ｗの進む先を吐出管１２と回収管２０との間で切り替えることができる。切替弁１８が培養液Ｗの進む先を吐出管１２に設定した場合、管理部１０を通過した培養液Ｗは、吐出管１２を介して培養容器２に戻される。切替弁１８が培養液Ｗの進む先を回収管２０に設定した場合、管理部１０を通過した培養液Ｗは、回収管２０を介して回収容器２２に送られる。本実施の形態の培養容器２および回収容器２２は、外部から雰囲気が実質的に進入しない閉鎖系であってもよいし、外部から雰囲気が進入可能な開放系であってもよい。培養容器２および回収容器２２が閉鎖系である場合、培養容器２中および回収容器２２中の酸素および二酸化炭素について、上述の濃度制御が実施される。培養容器２および回収容器２２が開放系である場合、上述の濃度制御は必須ではないが、実施する方が好ましい。
　また、培養装置１は、培養容器２と回収容器２２とをつなぐ配管２４を有する。回収容器２２に収容されている、培養液Ｗにおける凝集体Ｓを含まない上澄みは、配管２４を介して培養容器２に戻される。これにより、培養容器２中の培養液Ｗの量を確保することができる。回収容器２２から培養容器２への配管２４を介した移動は、図９に示すように回収容器２２および培養容器２における培養液Ｗの液面の高低差を利用して実現してもよいし、配管２４にポンプなどの吸引部を設けることで実現してもよい。配管２４に吸引部を設ける場合は、配管２４の配置は図示したものに限定されない。
　制御部１４は、吸引部８の駆動と、切替弁１８の切り替えとを制御する。本実施の形態の培養装置１は、一例として培地再生モード、凝集体廃棄モードおよび凝集体回収モードを選択することが可能である。制御部１４は、各動作モードに応じて吸引部８および切替弁１８を制御する。
　培養液再生モードが選択された場合、制御部１４は実施の形態１で説明したように、培養容器２に収容されている凝集体Ｓの拮抗吸引流速以下の流速で培養液Ｗを吸引するよう吸引部８を制御する。また、制御部１４は、培養液Ｗが吐出管１２に流れるように切替弁１８を制御する。これにより、管理部１０で再生処理が施された培養液Ｗが培養容器２に戻される。
　また、凝集体廃棄モードが選択された場合、制御部１４は、所定の第１粒径の凝集体Ｓに対する拮抗吸引流速を超え、且つ第１粒径より大きい第２粒径の凝集体Ｓに対する拮抗吸引流速以下である第１流速で培養液Ｗを吸引するよう吸引部８を制御する。第１粒径は、廃棄対象となる凝集体Ｓの中で最大の凝集体Ｓの粒径である。第２粒径は、培養対象の凝集体Ｓの粒径である。また、制御部１４は、培養液Ｗが回収管２０に流れるように切替弁１８を制御する。これにより、培養対象の凝集体Ｓと廃棄対象の凝集体Ｓとを選り分けて（分級して）、廃棄対象の凝集体Ｓを培養容器２から回収容器２２に移動させることができる。回収容器２２に収容された廃棄対象の凝集体Ｓは、装置外に廃棄される。
　培養液再生モードでは、たとえ廃棄対象の凝集体Ｓであっても極力吸引しないことが望ましい。一方、凝集体廃棄モードでは、廃棄対象の凝集体Ｓを積極的に吸引したい。そこで、一例としての制御部１４は、流速に関して所定の第１マージンＭ１と、第１マージンＭ１よりも小さい第２マージンＭ２とを予め保持している。そして、培養日数等から定まる基準の拮抗吸引流速に対し、実行するモードに応じて選択したマージンを減じて、吸引部８により発生させるべき流速を定める。
　具体的には、培養液再生モードが選択された場合は、より大きい第１マージンＭ１を拮抗吸引流速から減じた流速で培養液Ｗを吸引するよう吸引部８を制御する。これにより、吸引される廃棄対象の凝集体Ｓの量を減らすことができる。一方、凝集体廃棄モードでは、より小さい第２マージンＭ２を拮抗吸引流速から減じた流速で培養液Ｗを吸引するよう吸引部８を制御する。つまり、拮抗吸引流速から第２マージンＭ２を減じて第１流速を定める。これにより、廃棄対象の凝集体Ｓをより確実に吸引することができる。第１マージンＭ１および第２マージンＭ２は、設計者の経験的知見または設計者による実験等に基づき適宜設定することが可能である。
　また、凝集体回収モードが選択された場合、制御部１４は、第１流速で培養液Ｗを吸引した後、第２粒径の凝集体Ｓに対する拮抗吸引流速を超える第２流速で培養液Ｗを吸引するよう吸引部８を制御する。つまり、凝集体回収モードは、その一部に凝集体廃棄モードで実行する処理を含んでいる。また、制御部１４は、培養液Ｗが回収管２０に流れるように切替弁１８を制御する。これにより、回収対象となるまで成長した凝集体Ｓ（第２粒径の凝集体Ｓ）を培養容器２から回収容器２２に移動させることができる。なお、第１流速で吸引した培養液Ｗと、第２流速で吸引した培養液Ｗとを別々の回収容器２２に移動させることで、第２粒径の凝集体Ｓを単離することができる。回収容器２２に収容された凝集体Ｓは、目的の使用に供される。第２流速は、回収対象の凝集体Ｓがより確実に吸引されるように、回収対象の凝集体Ｓに対応する拮抗吸引流速に所定の第３マージンＭ３を加えた値に定められる。第３マージンＭ３は、設計者の経験的知見または設計者による実験等に基づき適宜設定することが可能である。
　なお、凝集体回収モードでは、ポンプではなくアスピレータで構成される吸引部８によって、培養液Ｗを吸引することが好ましい。これにより、回収対象の凝集体Ｓが回収容器２２への移動中に崩れてしまうことを抑制することができる。また、凝集体の廃棄や回収を実施する培養装置１においては、吸引管４の管径はより太い方が好ましい。これにより、凝集体Ｓの吸引分解能を高めることができる。例えば、粒径が数十μｍ～２ｍｍの凝集体Ｓの沈降速度は、おおよそ０．０１ｃｍ／秒～２ｃｍ／秒である。これを０．１ｍＬ／分以上の流量で他の凝集体Ｓと分級する場合には、φ４以上の管径であることが好ましい。また、流量１Ｌ／分以下の流量で他の凝集体Ｓと分級する場合にはφ５０以下の管径であることが好ましい。
　吸引した培養液Ｗを回収容器２２に送る流路構造は、図９に示すものに限定されない。また、補助フィルタ６は、省略されずに吸引管４に設けられてもよい。この場合、一例としての培養装置１は、培養液再生モードで用いる吸引管４と、凝集体廃棄モードで用いる吸引管４と、凝集体回収モードで用いる吸引管４とを別個に備える。そして、各吸引管４には、動作モードに応じた孔径の補助フィルタ６が設けられる。培養液再生モードで用いる吸引管４には、実施の形態１と同様の補助フィルタ６が設けられる。凝集体廃棄モードで用いる吸引管４には、廃棄対象の凝集体Ｓが通過可能な補助フィルタ６が設けられる。この補助フィルタ６の孔径は、例えば１００μｍ～１５００μｍの範囲で設定される。凝集体回収モードで用いる吸引管４には、回収対象の凝集体Ｓが通過可能な補助フィルタ６が設けられる。この補助フィルタ６の孔径は、例えば１００μｍ～１５００μｍの範囲で設定される。
　以上説明したように、本実施の形態に係る制御部１４は、所定の第１粒径の凝集体Ｓに対する拮抗吸引流速を超え、且つ第１粒径より大きい第２粒径の凝集体Ｓに対する拮抗吸引流速以下である第１流速で培養液Ｗを吸引するよう吸引部８を制御する。これにより、第１粒径の凝集体Ｓと第２粒径の凝集体Ｓとを分級することができる。したがって、第１粒径の凝集体Ｓを廃棄対象に定め、第２粒径の凝集体Ｓを培養対象に定めれば、廃棄対象の凝集体Ｓをより簡単に廃棄することができる。これにより、培養対象の凝集体Ｓをより良好な環境で培養できるようになるため、細胞培養の効率を向上させることができる。
　また、制御部１４は、第１流速で培養液Ｗを吸引した後、第２粒径の凝集体Ｓに対する拮抗吸引流速を超える第２流速で培養液Ｗを吸引するよう吸引部８を制御する。これにより、目的の凝集体Ｓをより簡単に回収することができる。よって、細胞培養の効率を向上させることができる。
（実施の形態３）
　実施の形態３は、培養装置１が複数の培養容器２および複数の吸引管４を備える点を除き、実施の形態１と共通の構成を有する。以下、本実施の形態について実施の形態１と異なる構成を中心に説明し、共通する構成については簡単に説明するか、あるいは説明を省略する。図１０は、実施の形態３に係る培養装置１の模式図である。本実施の形態の培養装置１は、第１培養容器２ａ、第２培養容器２ｂ、第３培養容器２ｃ、第１吸引管４ａ、第２吸引管４ｂ、第３吸引管４ｃ、吸引部８、管理部１０、吐出管１２および制御部１４を備える。補助フィルタ６は省略される。
　第１培養容器２ａには、第１吸引管４ａの一端が挿入される。第１吸引管４ａの他端は、第２培養容器２ｂに挿入される。また、第２培養容器２ｂには、第２吸引管４ｂの一端が挿入される。第２吸引管４ｂの他端は、第３培養容器２ｃに挿入される。また、第３培養容器２ｃには、第３吸引管４ｃの一端が挿入される。第３吸引管４ｃの他端は、管理部１０の入口ポートに接続される。第３吸引管４ｃの途中には、吸引部８が設けられる。各培養容器は、外部から雰囲気が実質的に進入しない閉鎖系とされる。したがって、吸引部８の駆動により、第１吸引管４ａ～第３吸引管４ｃに吸引力を発生させることができる。管理部１０の出口ポートには、吐出管１２の一端が接続される。吐出管１２の他端は、第１培養容器２ａに挿入される。なお、各培養容器は閉鎖系であるため、各培養容器中の酸素および二酸化炭素について、上述の濃度制御が実施される。
　吸引部８の駆動により、第１吸引管４ａが第１培養容器２ａから培養液Ｗを吸引する。第１培養容器２ａから吸引された培養液Ｗは、第１吸引管４ａを通って第２培養容器２ｂに移動する。また、吸引部８の駆動により、第２吸引管４ｂが第２培養容器２ｂから培養液Ｗを吸引する。第２培養容器２ｂから吸引された培養液Ｗは、第２吸引管４ｂを通って第３培養容器２ｃに移動する。また、吸引部８の駆動により、第３吸引管４ｃが第３培養容器２ｃから培養液Ｗを吸引する。第３培養容器２ｃから吸引された培養液Ｗは、第３吸引管４ｃを通って管理部１０に流入する。管理部１０を通過した培養液Ｗは、吐出管１２を通って第１培養容器２ａに戻る。なお、吸引部８および管理部１０の配置は、適宜変更可能である。例えば、吸引部８および管理部１０は、第１吸引管４ａや第２吸引管４ｂに設けられてもよい。
　第１吸引管４ａ、第２吸引管４ｂおよび第３吸引管４ｃは、少なくとも流速調整領域において管径が互いに異なる。したがって、吸引部８の駆動により各吸引管４には異なる大きさの吸引流速（あるいは線速度）が発生する。例えば、培養液Ｗの流れの上流側に位置する吸引管４ほど管径が小さい。つまり、第１吸引管４ａの管径は最も小さく、第２吸引管４ｂの管径は中間であり、第３吸引管４ｃの管径は最も大きい。したがって、第１吸引管４ａには最も早い吸引流速が発生し、第２吸引管４ｂには中間の吸引流速が発生し、第３吸引管４ｃには最も遅い吸引流速が発生する。これにより、第１吸引管４ａは、第２吸引管４ｂおよび第３吸引管４ｃよりも大きい粒径の凝集体Ｓを吸引することができる。また、第２吸引管４ｂは、第３吸引管４ｃよりも大きい粒径の凝集体Ｓを吸引することができる。
　したがって、第１培養容器２ａには相対的に大きい粒径の凝集体Ｓが集まり、第２培養容器２ｂには相対的に中間の粒径の凝集体Ｓが集まり、第３培養容器２ｃには相対的に小さい粒径の凝集体Ｓが集まる。各培養容器２に集約させる凝集体Ｓの粒径は、各吸引管４の管径や吸引部８を構成する吸引装置の出力等を調整することで適宜変更することができる。
　つまり、本実施の形態の培養装置１は、培養容器２および吸引管４の組み合わせを複数有する。この複数の組み合わせは、互いに直列に接続される。また、各吸引管４の管径は互いに異なる。そして、吸引部８の駆動により、培養液Ｗが上流側の培養容器２から下流側の培養容器２まで、各吸引管４により吸引されて順に移動する。これにより、複数の培養容器２のそれぞれに、対応する吸引管４の管径に応じた粒径の凝集体Ｓを集約させることができる。よって、細胞培養の効率をさらに向上させることができる。なお、培養容器２および吸引管４の組みは、２組みでもよいし４組以上でもよい。
（実施の形態４）
　実施の形態４は、吸引管４で構成される回収部を備える点を除き、実施の形態１と共通の構成を有する。以下、本実施の形態について実施の形態１と異なる構成を中心に説明し、共通する構成については簡単に説明するか、あるいは説明を省略する。図１１は、実施の形態４に係る培養装置１の模式図である。本実施の形態の培養装置１は、培養容器２、吸引部８、管理部１０、吐出管１２、制御部１４、接続配管２６および回収部２８（トラップチャンバ）を備える。
　接続配管２６は、培養容器２および回収部２８を接続する。培養容器２には、接続配管２６の一端が挿入される。本実施の形態の培養容器２は、外部から雰囲気が実質的に進入しない閉鎖系であってもよいし、外部から雰囲気が進入可能な開放系であってもよい。培養容器２が閉鎖系である場合、培養容器２中の酸素および二酸化炭素について、上述の濃度制御が実施される。培養容器２が開放系である場合、上述の濃度制御は必須ではないが、実施する方が好ましい。接続配管２６の他端は、回収部２８の入口ポートに接続される。回収部２８の出口ポートには、吐出管１２の一端が接続される。吐出管１２の他端は、培養容器２に挿入される。接続配管２６の途中には、管理部１０が設けられる。吐出管１２の途中には、吸引部８が設けられる。また、吐出管１２における吸引部８より下流側には、補助フィルタ６が設けられる。
　吸引部８の駆動により、培養容器２中の培養液Ｗが接続配管２６を通って回収部２８に移動する。この過程で、管理部１０により培養液Ｗに再生処理等が施される。回収部２８に到達した培養液Ｗは、回収部２８において後述する凝集体Ｓの回収処理が施される。その後、培養液Ｗは、吐出管１２を通って培養容器２に戻される。なお、吸引部８および管理部１０の配置は、適宜変更可能である。例えば、吸引部８は接続配管２６に設けられてもよいし、管理部１０は吐出管１２に設けられてもよい。
　ただし、吸引部８は回収部２８より下流側、つまり吐出管１２に設けられることが好ましい。これにより、凝集体Ｓが吸引部８を通過することを回避することができる。凝集体Ｓが吸引部８を通過する流路構造では、吸引部８を通過する際に一部の凝集体Ｓが破壊されるおそれがある。これに対し、吸引部８を回収部２８より下流側に配置することで、吸引部８による凝集体Ｓの破壊を回避することができる。あるいは、凝集体Ｓが吸引部８を通過する流路構造では、吸引部８による凝集体Ｓの破壊への対策が必要となる場合もあるが、吸引部８を回収部２８より下流側に配置することで当該対策を省略することができる。
　回収部２８は、吸引管４を有する。本実施の形態の回収部２８は、第１吸引管４ａ、第２吸引管４ｂおよび第３吸引管４ｃを有する。各吸引管４は、鉛直方向に延びるように姿勢が定められた状態で、上端および下端がキャップで閉塞されている。また、各吸引管４の側面には、下端寄りに入口ポート３０が設けられ、上端寄りに出口ポート３２が設けられている。したがって、出口ポート３２は、入口ポート３０よりも上方に配置される。第１吸引管４ａの入口ポート３０には、接続配管２６の他端が接続される。よって、第１吸引管４ａの入口ポート３０は、回収部２８の入口ポートに相当する。第１吸引管４ａの出口ポート３２は、配管を介して第２吸引管４ｂの入口ポート３０に接続される。第２吸引管４ｂの出口ポート３２は、配管を介して第３吸引管４ｃの入口ポート３０に接続される。第３吸引管４ｃの出口ポート３２には、吐出管１２の一端が接続される。よって、第３吸引管４ｃの出口ポート３２は、回収部２８の出口ポートに相当する。
　実施の形態３と同様に、第１吸引管４ａ、第２吸引管４ｂおよび第３吸引管４ｃは、少なくとも流速調整領域において管径が互いに異なる。したがって、吸引部８の駆動により各吸引管４には異なる大きさの吸引流速が発生する。例えば、培養液Ｗの流れの上流側に位置する吸引管４ほど管径が小さい。つまり、第１吸引管４ａの管径は最も小さく、第２吸引管４ｂの管径は中間であり、第３吸引管４ｃの管径は最も大きい。したがって、第１吸引管４ａには最も早い吸引流速が発生し、第２吸引管４ｂには中間の吸引流速が発生し、第３吸引管４ｃには最も遅い吸引流速が発生する。これにより、第１吸引管４ａでは、相対的に中間の粒径の凝集体Ｓと、相対的に小さい粒径の凝集体Ｓとが培養液Ｗとともに出口ポート３２まで吸い上げられ、第２吸引管４ｂに送られる。また、第２吸引管４ｂでは、相対的に小さい粒径の凝集体Ｓが培養液Ｗとともに出口ポート３２まで吸い上げられ、第３吸引管４ｃに送られる。第３吸引管４ｃでは、相対的に小さい粒径の凝集体Ｓであっても出口ポート３２まで吸い上げられず、培養液Ｗのみが吐出管１２に流入する。
　このため、第１吸引管４ａの底部には相対的に大きい粒径の凝集体Ｓがトラップされ、第２吸引管４ｂの底部には相対的に中間の粒径の凝集体Ｓがトラップされ、第３吸引管４ｃの底部には相対的に小さい粒径の凝集体Ｓがトラップされる。各吸引管４にトラップさせる凝集体Ｓの粒径は、各吸引管４の管径や吸引部８を構成する吸引装置の出力等を調整することで適宜変更することができる。
　つまり、本実施の形態の培養装置１は、吸引管４を含む回収部２８を備える。吸引管４は入口ポート３０と、入口ポート３０よりも上方に配置される出口ポート３２とを有し、入口ポート３０は培養容器２に接続される。そして、吸引部８の駆動により、培養液Ｗが吸引管４により吸引されて入口ポート３０から吸引管４に流入し、吸引管４内を上昇して出口ポート３２から排出される。この結果、管径に応じた粒径の凝集体Ｓが吸引管４に回収される。
　さらに、本実施の形態の回収部２８は、管径の異なる複数の吸引管４を含む。隣り合う２つの吸引管４における一方の出口ポート３２と他方の入口ポート３０とが接続されて、複数の吸引管４が互いに直列に接続される。また、最上流の吸引管４の入口ポート３０は、培養容器２に接続される。そして、吸引部８の駆動により、培養液Ｗが上流側の吸引管４から下流側の吸引管４まで各吸引管４により吸引されて順に移動する。培養液Ｗは、各吸引管４内を入口ポートから出口ポートまで上昇して、下流側の吸引管４に移動していく。この結果、管径に応じた粒径の凝集体Ｓが各吸引管４に回収される。これにより、所望の粒径の凝集体Ｓをより簡単に回収でき、細胞培養の効率をさらに向上させることができる。なお、回収部２８が備える吸引管４の数は特に制限されず、１本以上であればよい。
　以上、本発明の実施の形態について詳細に説明した。前述した実施の形態は、本発明を実施するにあたっての具体例を示したものにすぎない。実施の形態の内容は、本発明の技術的範囲を限定するものではなく、請求の範囲に規定された発明の思想を逸脱しない範囲において、構成要素の変更、追加、削除等の多くの設計変更が可能である。設計変更が加えられた新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態および変形それぞれの効果をあわせもつ。前述の実施の形態では、このような設計変更が可能な内容に関して、「本実施の形態の」、「本実施の形態では」等の表記を付して強調しているが、そのような表記のない内容でも設計変更が許容される。以上の構成要素の任意の組み合わせも、本発明の態様として有効である。
　実施の形態は、以下に記載する項目によって特定されてもよい。
（第１項目）
　細胞の凝集体（Ｓ）および培養液（Ｗ）を収容する培養容器（２）と、
　培養容器（２）中の培養液（Ｗ）を吸引する吸引管（４）と、
　吸引管（４）に吸引力を発生させる吸引部（８）と、
　凝集体（Ｓ）の沈降、および培養液（Ｗ）の吸引に伴う凝集体（Ｓ）の浮上が拮抗する速度である凝集体（Ｓ）の拮抗吸引流速に応じて吸引部（８）を制御する制御部（１４）と、を備える、
培養装置（１）。
（第２項目）
　拮抗吸引流速は、上記式（１）、上記式（２）、上記式（３）および上記式（４）から得られる凝集体（Ｓ）の沈降速度予測曲線に基づいて定まる、
第１項目に記載の培養装置（１）。
（第３項目）
　制御部（１４）は、拮抗吸引流速以下の流速で培養液（Ｗ）を吸引するよう吸引部（８）を制御する、
第１項目または第２項目に記載の培養装置（１）。
（第４項目）
　制御部（１４）は、所定の第１粒径の凝集体（Ｓ）に対する拮抗吸引流速を超え、且つ第１粒径より大きい第２粒径の凝集体（Ｓ）に対する拮抗吸引流速以下である第１流速で培養液（Ｗ）を吸引するよう吸引部（８）を制御する、
第１項目または第２項目に記載の培養装置（１）。
（第５項目）
　制御部（１４）は、第１流速で培養液（Ｗ）を吸引した後、第２粒径の凝集体（Ｓ）に対する拮抗吸引流速を超える第２流速で培養液（Ｗ）を吸引するよう吸引部（８）を制御する、
第４項目に記載の培養装置（１）。
（第６項目）
　吸引管（４）に接続され、吸引された培養液（Ｗ）の成分の解析および調整の少なくとも一方を実行する管理部（１０）を備える、
第１項目乃至第５項目のいずれかに記載の培養装置（１）。
（第７項目）
　培養容器（２ａ，２ｂ，２ｃ）および吸引管（４ａ，４ｂ，４ｃ）の組み合わせを複数有し、
　複数の組み合わせは互いに接続され、
　各吸引管（４ａ，４ｂ，４ｃ）の管径は互いに異なり、
　吸引部（８）の駆動により、培養液（Ｗ）が上流側の培養容器（２ａ）から下流側の培養容器（２ｃ）まで各吸引管（４ａ，４ｂ，４ｃ）により吸引されて順に移動する、
第１項目乃至第６項目のいずれかに記載の培養装置（１）。
（第８項目）
　吸引管（４）を含む凝集体（Ｓ）の回収部（２８）を備え、
　吸引管（４）は入口ポート（３０）と、入口ポート（３０）よりも上方に配置される出口ポート（３２）とを有し、入口ポート（３０）は培養容器（２）に接続され、
　吸引部（８）の駆動により、培養液（Ｗ）が吸引管（４）により吸引されて入口ポート（３０）から吸引管（４）に流入し、吸引管（４）内を上昇して出口ポート（３２）から排出され、吸引管（４）が管径に応じた粒径の凝集体（Ｓ）を回収する、
第１項目乃至第６項目のいずれかに記載の培養装置（１）。
（第９項目）
　回収部（２８）は、管径の異なる複数の吸引管（４ａ，４ｂ，４ｃ）を含み、
　隣り合う２つの吸引管（４ａ，４ｂ，４ｃ）における一方の出口ポート（３２）と他方の入口ポート（３０）とが接続されて複数の吸引管（４ａ，４ｂ，４ｃ）が互いに接続され、最上流の吸引管（４ａ）の入口ポート（３０）は培養容器（２）に接続され、
　吸引部（８）の駆動により、培養液（Ｗ）が上流側の吸引管（４ａ）から下流側の吸引管（４ｃ）まで各吸引管（４ａ，４ｂ，４ｃ）により吸引されて順に移動し、各吸引管（４ａ，４ｂ，４ｃ）がそれぞれの管径に応じた粒径の凝集体（Ｓ）を回収する、
第８項目に記載の培養装置（１）。
（第１０項目）
　細胞の凝集体（Ｓ）および培養液（Ｗ）を収容する培養容器（２）から、凝集体（Ｓ）の沈降、および培養液（Ｗ）の吸引に伴う凝集体（Ｓ）の浮上が拮抗する速度である凝集体（Ｓ）の拮抗吸引流速に応じた流速で培養液（Ｗ）を吸引することを含む、
培養方法。
（第１１項目）
　拮抗吸引流速は、上記式（１）、上記式（２）、上記式（３）および上記式（４）から得られる凝集体（Ｓ）の沈降予測曲線に基づいて定まる、
第１０項目に記載の培養方法。
　以下、本発明の実施例を説明するが、実施例は本発明を好適に説明するための例示に過ぎず、なんら本発明を限定するものではない。
［細胞培養試験］
（比較例１）
　公知の吸引管付き培養容器を用いて、初期細胞密度１×１０５個／ｍＬでｍＮＰＣの撹拌浮遊培養を実施した。吸引管の管径はφ１０とした。多くの凝集体の粒径が２００μｍ以上となる培養２日目に、吸引管の先端に孔径１００μｍのフィルタを設置した。そして、流量１ｍＬ／分での培養液の吸引を開始し、吸引した培養液を培養容器に戻しながら培養を継続した。図８に示すように、吸引管の管径がφ１０である場合、流量が２．２ｍＬ／分であるときに、培養液の流速は粒径２００μｍの凝集体の拮抗吸引流速となる。したがって、流量が１ｍＬ／分である比較例１では、培養液の流速は拮抗吸引流速を下回る。
　培養４日目で、培養用期中の凝集体の成長および増殖が確認できなくなったため、培養を停止して細胞を観察した。図１２（Ａ）は、比較例１に係る培養液の光学顕微鏡画像である。図１２（Ｂ）は、比較例１に係るフィルタの光学顕微鏡画像である。図１２（Ａ）に示すように、比較例１では、培養液中に浮遊する凝集体の数は少なかった。培養容器内の細胞密度は、９．４×１０４個／ｍＬであった。また、図１２（Ｂ）に示すように、フィルタには多くの凝集体が付着していた。
　比較例１では、培養液の流速が拮抗吸引流速を下回っているにもかかわらず、凝集体によりフィルタが目詰まりを起こしていた。これは、吸引管の先端にフィルタが設置されていたためである。すなわち、攪拌による培養液の流れに乗った凝集体がフィルタに接触し、捕捉されたと考えられる。このように、フィルタが培養容器中で露出して培養液と接している場合は、培養液の流速が拮抗吸引流速を下回るとしても、凝集体がフィルタに捕捉されて細胞の生存率が著しく低下し得る。
（実施例１）
　図１に示す培養装置を用いて、初期細胞密度１×１０５個／ｍＬでｍＮＰＣの撹拌浮遊培養を実施した。吸引管の管径はφ４とした。多くの凝集体の粒径が４００μｍ以上となる培養５日目から、流量１ｍＬ／分での培養液の吸引を開始し、吸引した培養液を培養容器に戻しながら培養を継続した。図８に示すように、吸引管の管径がφ４である場合、流量が１．１ｍＬ／分であるときに、培養液の流速は粒径４００μｍの凝集体の拮抗吸引流速となる。したがって、流量が１ｍＬ／分である実施例１では、培養液の流速は拮抗吸引流速を下回る。なお、４００μｍ未満の凝集体やデブリの吸引を防ぐために、孔径１００μｍのメッシュフィルタを吸引管内の上部に設置した。
　図１２（Ｃ）は、実施例１に係る培養液の光学顕微鏡画像である。図１２（Ｃ）に示すように、実施例１では、比較例１に比べて凝集体の減少が見られなかった。また、目標日数を８日間に設定して培養を継続した。その結果、少なくとも８日間は、凝集体を良好な状態のまま培養できることが確認された。培養８日における培養容器内の細胞密度は、４．１×１０６個／ｍＬであった。また、細胞の生存率は９１％であった。以上より、実施の形態に係る培養装置および培養方法によれば、培養対象の凝集体を吸引することなく培養液を吸引することができ、よって細胞培養の効率が向上することを理解することができる。
［凝集体の除去試験］
　実施の形態に係る培養装置および培養方法によって培養液中の様々な粒径の凝集体から特定粒径の凝集体を除去し得ることを本試験により検証した。すなわち、図１に示す培養装置を用いて、初期細胞密度１×１０５個／ｍＬでｍＮＰＣの撹拌浮遊培養を実施した。培養期間は８日間とした。培養液の交換では、培養液の攪拌を止めて凝集体が沈降したことを確認した後に、上清を吸引するとともに新鮮な培養液を追加した。培養液の交換は、毎日実施した。
　８日間の攪拌浮遊培養が終了した後、管径φ１０の吸引管を培養装置に設置した。狙った粒径より小さい粒径の凝集体やデブリを除去するために、孔径１００μｍのメッシュフィルタを吸引管内の上部に設置した。流量８．０ｍＬ／分での培養液の吸引を開始し、吸引した培養液を培養容器に戻す灌流処理を６時間継続した。図８に示すように、吸引管の管径がφ１０である場合、流量が８．０ｍＬ／分であるときに、培養液の流速は粒径４５０μｍの凝集体の拮抗吸引流速となる。したがって、４５０μｍ未満の凝集体は吸引管により吸引され、メッシュフィルタにより除去されることが予想される。
　また、流量８．０ｍＬ／分で６時間の灌流処理が終了した後、流量を１４．１ｍＬ／分に引き上げて、灌流処理を６時間継続した。図８に示すように、吸引管の管径がφ１０である場合、流量が１４．１ｍＬ／分であるときに、培養液の流速は粒径６５０μｍの凝集体の拮抗吸引流速となる。したがって、６５０μｍ未満の凝集体は吸引管により吸引され、メッシュフィルタにより除去されることが予想される。
　攪拌浮遊培養後と、流量８．０ｍＬ／分での灌流処理後と、流量１４．１ｍＬ／分での灌流処理後とのそれぞれにおいて、培養液を光学顕微鏡（ＢＺ－Ｘ５００、キーエンス社）で撮像して光学顕微鏡像を得た。そして、計測ソフト（ＢＺ－Ｘ　Ａｎａｌｙｚｅｒ、キーエンス社）を用いて、光学顕微鏡像に写る各凝集体の粒径を計測し、凝集体の粒径分布を得た。結果を図１３に示す。
　図１３は、凝集体の粒径分布を示す図である。図１３における「Ａ」は、攪拌浮遊培養後の結果である。図１３における「Ｂ」は、流量８．０ｍＬ／分での灌流処理後の結果である。図１３における「Ｃ」は、流量１４．１ｍＬ／分での灌流処理後の結果である。図１３に示すように、攪拌浮遊培養後では、粒径４５０μｍ未満の凝集体の割合は１５．３％であり、粒径４５０μｍ以上の凝集体の割合は８４．７％であった。一方、流量８．０ｍＬ／分での灌流処理後では、粒径４５０μｍ未満の凝集体の割合は２．１％であり、粒径４５０μｍ以上の凝集体の割合は９７．９％であった。
　また、流量８．０ｍＬ／分での灌流処理後では、粒径６５０μｍ未満の凝集体の割合は５２．６％であり、粒径６５０μｍ以上の凝集体の割合は４７．４％であった。一方、流量１４．１ｍＬ／分での灌流処理後では、粒径６５０μｍ未満の凝集体の割合は１０．８％であり、粒径６５０μｍ以上の凝集体の割合は８９．２％であった。以上より、実施の形態に係る培養装置および培養方法によれば、様々な粒径の凝集体集団から目的の粒径未満の凝集体を吸引して除去できることが確認された。これにより、所望の粒径を有する凝集体の収率を高められることを理解することができる。
［凝集体の回収試験］
　実施の形態に係る培養装置および培養方法によって培養液中の様々な粒径の凝集体から特定粒径の凝集体を回収し得ることを本試験により検証した。すなわち、図１に示す培養装置を用いて、初期細胞密度１×１０５個／ｍＬでｍＮＰＣの撹拌浮遊培養を実施した。培養期間は８日間とした。培養液の交換では、培養液の攪拌を止めて凝集体が沈降したことを確認した後に、上清を吸引するとともに新鮮な培養液を追加した。培養液の交換は、毎日実施した。
　８日間の攪拌浮遊培養が終了した後、管径φ１０の吸引管を培養装置に設置した。狙った粒径より小さい粒径の凝集体やデブリを除去するために、孔径１００μｍのメッシュフィルタを吸引管内の上部に設置した。流量６．７ｍＬ／分での培養液の吸引を開始し、吸引した培養液を培養容器に戻す灌流処理を１０時間継続した。図８に示すように、吸引管の管径がφ１０である場合、流量が６．７ｍＬ／分であるときに、培養液の流速は粒径４００μｍの凝集体の拮抗吸引流速となる。したがって、４００μｍ未満の凝集体は吸引管により吸引され、メッシュフィルタにより除去されることが予想される。灌流処理後にメッシュフィルタを確認したところ、微小な凝集体やデブリがメッシュフィルタの表面に堆積していた。
　流量６．７ｍＬ／分での１０時間の灌流処理が終了した後、管径φ１０の吸引管を新たに培養装置に設置した。また、この吸引管に、培養液を培養容器に戻す循環流路を接続した。循環流路の途中には、凝集体の回収部として回収用吸引管を設けた。回収用吸引管は、側面に入口ポートおよび出口ポートを備え、管径はφ２０である。流量１５．７ｍＬ／分での培養液の吸引を開始し、吸引した培養液を培養容器に戻す灌流処理を１２時間継続した。
　図８に示すように、吸引管の管径がφ１０である場合、流量が１５．７ｍＬ／分であるときに、培養液の流速は粒径７００μｍの凝集体の拮抗吸引流速となる。したがって、７００μｍ未満の凝集体は吸引管により吸引され、回収部に流入することが予想される。また、管径がφ２０の吸引管は、管径φ１０の吸引管に比べて断面積が４倍になる。よって、培養液の流速は１／４に低下する。この場合、培養液の流速は、回収用吸引管に流入する凝集体の拮抗吸引流速を下回る。したがって、回収用吸引管の底部には、４００μｍ以上７００μｍ未満の凝集体が沈降することが予想される。
　１２時間の灌流処理が終了した後、回収用吸引管の底部から２４ウェルプレートに凝集体の一部を回収し、光学顕微鏡（ＢＺ－Ｘ５００、キーエンス社）で撮像して光学顕微鏡像を得た。図１４は、回収用吸引管の底部に堆積した凝集体の光学顕微鏡像である。図１４に示すように、回収用吸引管の底部には、想定した粒径の凝集体が多数堆積していることが確認された。以上より、実施の形態に係る培養装置および培養方法によれば、様々な粒径の凝集体集団から目的の粒径の凝集体を回収できることが確認された。これにより、所望の粒径を有する凝集体の収率を高められることを理解することができる。
　本発明は、培養装置および培養方法に利用することができる。
　１　培養装置、　２　培養容器、　４　吸引管、　８　吸引部、　１０　管理部、　１４　制御部、　Ｓ　凝集体、　Ｗ　培養液。

Claims (11)

  1. 　細胞の凝集体および培養液を収容する培養容器と、
    　前記培養容器中の培養液を吸引する吸引管と、
    　前記吸引管に吸引力を発生させる吸引部と、
    　前記凝集体の沈降、および前記培養液の吸引に伴う凝集体の浮上が拮抗する速度である前記凝集体の拮抗吸引流速に応じて前記吸引部を制御する制御部と、を備える、
    培養装置。
  2. 　前記拮抗吸引流速は、以下の式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     ［式（１）中、Ｗ＊は無次元沈降速度であり、ｗｓは凝集体の沈降速度［ｍ／ｓ］であり、ｓはρｓ／ρｗで与えられる比重であり、ρｓは凝集体の密度［ｋｇ／ｍ３］であり、ρｗは培養液の密度［ｋｇ／ｍ３］であり、ｇは重力加速度［ｍ／ｓ２］であり、ｄは凝集体の粒径［ｍ］である］、
    　以下の式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
     ［式（２）中、Ｓ＊は無次元粒子パラメータであり、νはμ／ρｗで与えられる培養液の動粘度[ｍ２／ｓ]であり、μは培養液の粘度［Ｐａ・ｓ］であり、ρｗは培養液の密度［ｋｇ／ｍ３］であり、ｄ、ｓおよびｇは式（１）と同様である］、
    　以下の式（３）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
     ［式（３）中、Ｗ＊は式（１）と同様であり、Ｓ＊は式（２）と同様であり、ＡおよびＢは、１／Ｗ＊を第１軸に設定し１／Ｓ＊を第２軸に設定した座標に前記凝集体の粒径毎の値をプロットして得られる直線から定まる定数である］、および、
    　以下の式（４）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
     ［式（４）中、ｗｓ、ｓ、ｇ、ｄは式（１）と同様であり、νは式（２）と同様であり、ＡおよびＢは式（３）と同様である］
    から得られる前記凝集体の沈降速度予測曲線に基づいて定まる、
    請求項１に記載の培養装置。
  3. 　前記制御部は、前記拮抗吸引流速以下の流速で培養液を吸引するよう前記吸引部を制御する、
    請求項１または２に記載の培養装置。
  4. 　前記制御部は、所定の第１粒径の前記凝集体に対する前記拮抗吸引流速を超え、且つ前記第１粒径より大きい第２粒径の前記凝集体に対する前記拮抗吸引流速以下である第１流速で培養液を吸引するよう前記吸引部を制御する、
    請求項１または２に記載の培養装置。
  5. 　前記制御部は、前記第１流速で培養液を吸引した後、前記第２粒径の前記凝集体に対する前記拮抗吸引流速を超える第２流速で培養液を吸引するよう前記吸引部を制御する、
    請求項４に記載の培養装置。
  6. 　前記吸引管に接続され、吸引された培養液の成分の解析および調整の少なくとも一方を実行する管理部を備える、
    請求項１乃至５のいずれか１項に記載の培養装置。
  7. 　前記培養容器および前記吸引管の組み合わせを複数有し、
    　複数の前記組み合わせは互いに接続され、
    　各吸引管の管径は互いに異なり、
    　前記吸引部の駆動により、前記培養液が上流側の前記培養容器から下流側の前記培養容器まで各吸引管により吸引されて順に移動する、
    請求項１乃至６のいずれか１項に記載の培養装置。
  8. 　前記吸引管を含む前記凝集体の回収部を備え、
    　前記吸引管は入口ポートと、前記入口ポートよりも上方に配置される出口ポートとを有し、前記入口ポートは前記培養容器に接続され、
    　前記吸引部の駆動により、前記培養液が前記吸引管により吸引されて前記入口ポートから前記吸引管に流入し、前記吸引管内を上昇して前記出口ポートから排出され、前記吸引管が管径に応じた粒径の前記凝集体を回収する、
    請求項１乃至６のいずれか１項に記載の培養装置。
  9. 　前記回収部は、管径の異なる複数の前記吸引管を含み、
    　隣り合う２つの前記吸引管における一方の前記出口ポートと他方の前記入口ポートとが接続されて複数の前記吸引管が互いに接続され、最上流の前記吸引管の前記入口ポートは前記培養容器に接続され、
    　前記吸引部の駆動により、前記培養液が上流側の前記吸引管から下流側の前記吸引管まで各吸引管により吸引されて順に移動し、各吸引管がそれぞれの管径に応じた粒径の前記凝集体を回収する、
    請求項８に記載の培養装置。
  10. 　細胞の凝集体および培養液を収容する培養容器から、前記凝集体の沈降、および前記培養液の吸引に伴う凝集体の浮上が拮抗する速度である前記凝集体の拮抗吸引流速に応じた流速で培養液を吸引することを含む、
    培養方法。
  11. 　前記拮抗吸引流速は、以下の式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
     ［式（１）中、Ｗ＊は無次元沈降速度であり、ｗｓは凝集体の沈降速度［ｍ／ｓ］であり、ｓはρｓ／ρｗで与えられる比重であり、ρｓは凝集体の密度［ｋｇ／ｍ３］であり、ρｗは培養液の密度［ｋｇ／ｍ３］であり、ｇは重力加速度［ｍ／ｓ２］であり、ｄは凝集体の粒径［ｍ］である］、
    　以下の式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
     ［式（２）中、Ｓ＊は無次元粒子パラメータであり、νはμ／ρｗで与えられる培養液の動粘度[ｍ２／ｓ]であり、μは培養液の粘度［Ｐａ・ｓ］であり、ρｗは培養液の密度［ｋｇ／ｍ３］であり、ｄ、ｓおよびｇは式（１）と同様である］、
    　以下の式（３）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
     ［式（３）中、Ｗ＊は式（１）と同様であり、Ｓ＊は式（２）と同様であり、ＡおよびＢは、１／Ｗ＊を第１軸に設定し１／Ｓ＊を第２軸に設定した座標に前記凝集体の粒径毎の値をプロットして得られる直線から定まる定数である］、および、
    　以下の式（４）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
     ［式（４）中、ｗｓ、ｓ、ｇ、ｄは式（１）と同様であり、νは式（２）と同様であり、ＡおよびＢは式（３）と同様である］
    から得られる前記凝集体の沈降予測曲線に基づいて定まる、
    請求項１０に記載の培養方法。
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