CN117120595A

CN117120595A - 细胞捕获和扩增

Info

Publication number: CN117120595A
Application number: CN202280024724.2A
Authority: CN
Inventors: 马克·E·琼斯; 达力普·塞提; 丹尼斯·J·赫拉文卡; 托马斯·J·费尔特
Original assignee: Terumo BCT Inc
Current assignee: Terumo BCT Inc
Priority date: 2021-03-23
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2023-11-24

Abstract

描述了涉及用于在中空纤维生物反应器中使细胞生长的方法和系统的实现方式。在实现方式中，细胞可暴露于若干生长因子，包括重组生长因子的组合。在其他实现方式中，细胞可与其他细胞(如hMSC)以共培养的方式来生长。在实现方式中，细胞可包括CD34+细胞。经涂覆的膜包括具有第一涂层和第二涂层的膜，其中第一涂层配置用于促进细胞粘附到该膜上，第二涂层包括可溶性蛋白部分。

Description

细胞捕获和扩增

相关申请的交叉引用

本申请基于35 U.S.C.§119(e)要求以下项的权益和优先权：U.S.临时专利申请序列号：63/165,060，2021年3月23日递交，名称为“细胞扩增”；63/169,173，2021年3月31日递交，名称为“细胞扩增”；63/183,591，2021年5月3日递交，名称为“细胞扩增”；63/227,293，2021年7月29日递交，名称为“细胞扩增”；63/228,561，2021年8月2日递交，名称为“细胞扩增”；63/275,389，2021年11月3日递交，名称为“使用多部分膜基底分离靶细胞的方法和系统”；63/275,793，2021年11月4日递交，名称为“使用多部分膜基底分离靶细胞的方法和系统”；63/304,467，2022年1月28日递交，名称为“使用多部分膜基底分离靶细胞的方法和系统”；它们披露的内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开大体上涉及分离及扩增活细胞，具体涉及使用膜分离靶细胞以及扩增经分离的细胞。

背景技术

细胞处理系统包括细胞收集系统和细胞扩增系统(CES)。细胞收集系统从供应源收集细胞，CES可用于扩增和分化各种类型的细胞。经扩增和/或分化的细胞可用于研究和/或治疗性目的。例如，造血干细胞(HSC)具有多潜能性，使得它们能够自我更新并产生成熟的血细胞，如红细胞(erythrocytes)、白细胞、血小板和淋巴细胞。CD34是人HSC的标志物，并且人骨髓(BM)细胞的所有集落形成活性都发现于表达CD34的细胞部分(即，“CD34+HSC”或“CD34+细胞”或“CD34+部分(fraction)”)。HSC可从骨髓、脐带血或外周血中收集，CD34+HSC已被确定为如血液癌症(如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤)等疾病的可能的治疗方法。脐带血(CB)越来越多地被用作骨髓(BM)的替代品，作为能移植的CD34+HSC的来源。使用CD34+HSC进行有效治疗或移植需要使用最低数量的HSC。因此，在从合适的来源(如CB)分离出CD34+HSC后，必须使CD34+HSC从初始量生长(即“扩增”)到至少可被认为对治疗或移植有效的量。

本公开提供了对分离、扩增和施用CD34+HSC有用的程序、装置和组合物。

发明内容

提供此内容旨在以简化的形式介绍本公开内容的各个方面，而不旨在确定关键或基本要素，也不旨在了限制权利要求的范围。

本公开提供了细胞捕获和扩增系统以及扩增可能是从混合细胞群中收集的靶细胞的方法。示例包括对捕捉(trapping)、收集和/或以其它方式“抓住”靶细胞(尤其是CD34+HSC)有用的膜。使用本公开的方法，可快速且有效地收集并显著扩增HSC，同时最大限度地降低或消除HSC的分化。在本公开的系统和方法中，HSC可被扩增至少50倍。这些细胞可以是从供体流体(如一种或多种血液组分)中收集的靶细胞。这些靶细胞可包括但不限于干细胞、CD34+HSC、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞等。膜可包括一个或多个层或涂层(即，膜)，配置用于吸引和收集靶细胞。膜可包括基底，其促进细胞粘附至基底至少一个表面。基底可具有第一表面和第二表面，以及位于第一表面和/或第二表面上的至少一个涂层。该至少一个涂层可对应于促进细胞粘附至基底的第一表面和/或第二表面的任何分子或材料。该至少一个涂层可包括第一涂层材料和第二涂层材料。第一涂层材料可以是纤连蛋白或纤连蛋白等同物，而第二涂层材料可以是可溶性蛋白部分(protein moiety)。第二涂层材料可靶向混合细胞群中的特定靶细胞。例如，第二涂层材料可以是趋化因子，如基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，它可用于强化CD34+HSC的收集。额外的涂层材料可用于从混合细胞群中收集相同或不同的细胞。膜可以以任何形式布置，如扁平片材(flat sheet)、过滤基质、中空纤维、它们的任意组合和/或它们的任意多种。

本公开还提供了在生物反应器(如中空纤维生物反应器)中扩增细胞(尤其是CD34+HSC)的方法。提供这些方法用于将细胞(如造血干细胞(HSC)，包括例如CD34+HSC)引入生物反应器，并使细胞暴露于扩增生物反应器中的细胞数量的生长条件下。生长条件可包括向生物反应器中引入一种生长因子或生长因子的组合。替代地或另外地，生长条件可包括在生物反应器中存在共培养的细胞。在生物反应器中扩增细胞后，可从生物反应器中移出多个经扩增的细胞，用于储存、移植或用于诸如癌症疗法的疗法中。

本公开提供了扩增细胞的方法，包括将含CD34+造血干细胞(HSC)的多个细胞引入中空纤维生物反应器的中空纤维中。生物反应器的每个中空纤维包括内部的内腔和毛细管外侧。此外，所述中空纤维包括位于内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层。表面上的涂层包括基质细胞衍生因子1(SDF-1)和纤连蛋白或其亚型，或其功能等同物。在这些方法中，中空纤维中的多个细胞暴露于生长条件下，并且多个细胞中的至少一部分在生物反应器的中空纤维中扩增，以生成多个经扩增的CD34+HSC。使用这些方法，引入生物反应器的中空纤维的多个细胞可被扩增至少50倍。

本公开还提供了在细胞扩增系统中通过灌注扩增细胞的方法。这些方法包括用第一流体涂覆中空纤维生物反应器，第一流体可包含信号传导因子和/或涂覆因子。在这些方法中，将多个细胞引入至中空纤维生物反应器的中空纤维膜。在这些方法中，可使中空纤维膜中的多个细胞暴露于第二流体，第二流体包含多种生长因子。在这些方法中，中空纤维生物反应器中的多个细胞可以单培养或共培养来生长。

本公开还提供了捕获细胞的方法，包括将靶细胞与非靶细胞的混合物引入至中空纤维生物反应器的中空纤维中。这些中空纤维的每个包括内部的内腔和毛细管外侧，以及位于中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层。表面上的涂层包含基质细胞衍生因子1(SDF-1)和纤连蛋白或其亚型，或其功能等同物。在这些方法中，可使中空纤维中的靶细胞与非靶细胞的混合物暴露于捕获条件下，以在中空纤维的内腔和毛细管外表面的至少一个上捕获靶细胞的至少一部分。至少一部分的非靶细胞可被冲洗出中空纤维，留下与中空纤维表面相关的靶细胞。

本公开还提供了捕获靶物质的方法。在这些方法中，将靶物质与非靶物质的混合物引入中空纤维，中空纤维具有内部的内腔和毛细管外侧。这些中空纤维可包括位于中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层。涂层可包括链霉亲和素、亲和素、生物素化分子和抗生物素抗体或其功能片段中的至少一种。在这些方法中，可使中空纤维中的靶物质与非靶物质的混合物暴露于捕获条件，以捕获在中空纤维的内腔和毛细管外表面的至少一个上的靶物质的至少一部分。在这些方法中，可将至少一部分的非靶物质从中空纤维冲洗出。

本公开还提供经涂覆的中空纤维膜。这些膜是具有内腔表面和毛细管外表面的中空纤维膜。这些膜可包括位于中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层。涂层可包括基质细胞衍生因子1(SDF-1)和纤连蛋白或其亚型，或其功能等同物。

本公开还提供了形成经涂覆的中空纤维膜的方法，包括提供具有内腔表面和毛细管外表面的中空纤维膜以及将第一涂层施加在中空纤维膜的内腔表面上。在这些方法中，第一涂层包括促进细胞粘附至中空纤维膜的内腔和中空纤维膜的毛细管外表面的至少一个的材料。在这些方法中，可将第二涂层施加在中空纤维膜的内腔表面上。第二涂层可包括可溶性蛋白部分。

本公开还提供了对扩增CD34+HSC有用的组合物。这些组合物包含胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和芳基烃受体(AHR)拮抗剂。

前文旨在对本公开的某些方面进行简化概述。这一概述既不是对本公开及其各个方面、实现方式和配置的广泛的也不是详尽的综述。其目的既不是确定本公开的关键或重要要素，也不是划定本公开的范围，而是以简化的形式呈现本公开的选定概念，作为下文更详细描述的引言。正如所理解的那样，本公开的其它方面、实现方式和配置可以单独或组合使用上述或下文详细描述的一个或多个特征，并且本领域技术人员在阅读以下详细描述并结合附图后将会明白本公开的其它方面、实现方式和配置。

附图说明

附图并入并构成本说明书的一部分，用于说明本公开的几个实例。这些附图与说明一起解释了本公开的原理。这些附图简单地示出了如何进行和使用本公开内容的优选和替代性示例，而不能理解为将本公开内容仅限于图示和描述的示例。

图1描绘了根据实现方式的中空纤维生物反应器的透视图。

图2示出了根据实现方式的带有预安装流体输送装置的细胞扩增系统的透视图。

图3描绘了根据实现方式的细胞扩增系统的壳体的透视图。

图4示出了根据实现方式的预安装的流体输送装置的透视图。

图5描绘了根据实现方式的细胞扩增系统的示意图。

图6示出了根据实现方式的细胞扩增系统另一实现方式的示意图。

图7示出了可用于实现方式的计算系统的组件。

图8示出了根据本公开的实现方式的中空纤维的示意图。

图9示出了根据本公开的实现方式的从中空纤维的内腔侧到毛细管外侧超滤的示意图。

图10示出了根据本公开的实现方式的用于分开混合细胞群的停止流动的示意图。

图11是示出了根据本公开的实现方式的细胞落在中空纤维底部的示意图。

图12是示出了涂覆有纤连蛋白与SDF-1的混合物的膜的示意图。

图13是示出经涂覆的膜中细胞悬浮的示意图。

图14示出了可在实施方式中进行来扩增细胞(如HSC)的流程1400。尽管下文描述了用于执行流程1400中各步骤的具体装置，但实施方式并不限于此。例如，某些步骤可被描述为由细胞扩增系统(如CES的500或600)的部件进行，或者由处理器(1100(图7))执行，其可根据以处理器可执行指令的方式提供的软件执行步骤。这样做只是出于说明性目的，而流程1400并不限于由任何特定装置执行。

图15是描绘靶物质和非靶物质在中空纤维的内腔中悬浮的示意图，该中空纤维的内腔表面有涂层。

图16是描绘在中空纤维的内腔上的涂层材料上捕获靶细胞的示意图。

图17是示出了单培养8天后三种不同供体细胞系的CD34⁺细胞收获量与70kg患者的单CBU和双CBU CD34+细胞最小剂量指南的比较的图。

图18是通过胰蓝染料排除法测定的收获细胞存活率的图。

图19是示出了冷冻保存前细胞存活率与脐带血来源的CD34⁺细胞收获量相关性的图，皮尔逊相关系数为R²＝0.8863。

图20是示出CD34+归一化葡萄糖消耗率(mmol/天)和乳酸生成率(mmol/天)的平均值的图。

图21A和图21B示出了FMO圈选策略(FSC-A vs SSC-A→单现(singlets)FSC-H vsFSC-A→活细胞SSC-A vs&-AAD-A →SSC-A vs CD45-APC-H7→SSC-A(图21A)vs CD34-APC→CD133-PE vs CD38-BB515(图21B))可通过Streck CD-Chex-CD34 3级外周血参考标准进行验证。每个样本采集10000个事件。

图22是量子-扩增的CD34+HSC收获后14天的分化的集落形成单位(CFU)图，其中每个供体细胞系重复6次。

图23示出了CFU-粒细胞、红细胞(erythroid)、巨噬细胞、巨核细胞、CFU-粒细胞和巨噬细胞，和BFU-红细胞系的代表性图像。

图24示出了可在实施方式中进行来捕获细胞(如HSC)的流程2400。尽管下文描述了用于执行流程2400中各步骤的具体装置，但实施方式并不限于此。例如，某些步骤可描述为由细胞处理系统(如CES的500或600)的部件来进行，或者通过处理器(1100(图7))执行，其可根据作为处理器可执行指令提供的软件执行步骤。这样做只是出于说明性目的，而流程2400并不限于由任何特定装置执行。

具体实施方式

参考以下详细说明和附图中描述的实现方式，可以进一步理解本公开的原理。应当理解的是，尽管下文显示并描述了有关详细实现方式的具体特征，但本公开并不局限于下文所述的实现方式。

现在将详细参考附图中示出并在下文中描述的实现方式。在可能的情况下，附图和描述中使用相同的参考数字来指代相同或相似的部件。

参见图1，其以示前侧立视图出了可用于本公开的中空纤维生物反应器100的示例。中空纤维生物反应器100具有纵向轴LA-LA并包括腔室壳体104。在至少一个实现方式中，腔室壳体104包括四个开口或端口：毛细管内(IC)进入端口108、IC排出端口120、毛细管外(EC)进入端口128和EC排出端口132。

根据本公开的实现方式，第一循环路径中的流体穿过中空纤维生物反应器100的第一纵向端部112处的IC进入端口108进入中空纤维生物反应器100，通过并穿过多个中空纤维116的毛细管内侧(在各种实现方式中称为中空纤维膜的内腔、毛细管内(“IC”)侧，或“IC空间”)，并穿过位于中空纤维生物反应器100的第二纵向端部124的IC排出端口120流出中空纤维生物反应器100。IC进入端口108与IC排出端口120之间的流体路径界定了中空纤维生物反应器100的IC部分126。第二循环路径中的流体穿过EC进入端口128流入中空纤维生物反应器100，与中空纤维116的毛细管外侧或外部(称为膜的“EC侧”或“EC空间”)接触，并经由EC排出端口132流出中空纤维生物反应器100。EC进入端口128与EC排出端口132之间的流体路径包括中空纤维生物反应器100的EC部分136。经由EC进入端口128进入中空纤维生物反应器100的流体可与中空纤维116的外部接触。小分子(例如离子、水、氧、乳酸等)可能会穿过中空纤维116从中空纤维的内部空间或IC空间扩散到外部或EC空间，或从EC空间扩散到IC空间。大分子量分子(诸如生长因子)，可能太大而无法穿过中空纤维膜，并且保留在中空纤维116的IC空间中。在实现方式中，可以根据需要更换培养基。培养基也可以通过氧合器(oxygenator)或气体传输模块进行循环，以根据需要交换气体(参见例如细胞扩增系统500(图5)和600(图6))。根据实现方式，细胞可以包含在如下所述的第一循环路径和/或第二循环路径内，并且可以在膜的IC侧和/或EC侧任意一侧。

用于制造中空纤维膜的材料可以是能够被制成中空纤维且对小分子(如离子、水、氧、葡萄糖和乳酸盐)具有合适渗透性的任何生物相容性聚合物材料。根据本发明的实现方式，可以使用的一种材料是合成的基于聚砜的材料。为了使细胞附着在中空纤维的表面，可以通过某些方式对表面进行修饰，通过至少在细胞生长表面涂覆蛋白质，如糖蛋白(纤连蛋白或胶原)，或通过使表面暴露于辐射。对膜表面进行伽马射线处理可使贴壁细胞附着，而无需在膜上额外涂上纤连蛋白等。根据本公开的实现方式，可以使用用于细胞附着的其他涂层和/或处理。

转到图2，根据本发明的一些实现方式示出了具有预安装的流体运输组件的细胞扩增系统200的实现方式。CES200包括细胞扩增机202，该细胞扩增机202包括用于与细胞扩增机202的后部206接合的舱口或可关闭的门204。细胞扩增机202内的内部空间208包括适于接收和接合预安装的流体运输组件210的特征。预安装的流体运输组件210可拆卸地附接到细胞扩增机202，以便于在细胞扩增机202处促进在同一细胞扩增机202处使用过的预安装的流体运输组件210相对快速地更换为新的或未使用的预安装的流体运输组件210。可以操作单细胞扩增机202以使用第一预安装的流体运输组件210而生长或扩增第一组细胞，并且然后可以使用第二预安装的流体运输组件210来生长或扩增第二组细胞，而不需要在第一预安装的流体运输组件210和第二预安装的流体运输组件210的更换之间进行消毒。预安装的流体运输组件包括生物反应器100和氧合器或气体传输模块212。根据一些实现方式，管道引导槽示为214，用于接收管接至预安装的流体运输组件210的各种培养基。

接下来，图3示出了根据本发明的一些实现方式的在可拆卸地附接预安装的流体运输组件210(图2)之前的细胞扩增机202的后部206。图3中省略了可关闭的门204(示出在图2中)。细胞扩增机202的后部206包括一些不同的结构，用于与预安装的流体运输组件210的元件配合工作。更具体地，细胞扩增机202的后部206包括多个用于与预安装的流体运输组件210上的泵回路配合的蠕动泵，包括IC循环泵218、EC循环泵220、IC进入泵222和EC进入泵224。此外，细胞扩增机202的后部206包括多个阀，包括IC循环阀226、试剂阀228、IC培养基阀230、空气移除阀232、细胞进入阀234、洗涤阀236、分配阀238、EC培养基阀240、IC废液阀242、EC废液阀244和收获阀246。多个传感器也与细胞扩增机202的后部206相关，包括IC排出压力传感器248、IC入口压力和温度组合传感器250、EC入口压力和温度组合传感器252以及EC排出压力传感器254。还示出了用于空气移除腔室的光学传感器256。

根据一些实现方式，图3示出了用于旋转生物反应器100的轴或摇杆控制器258。与轴或摇杆控制器258相关的轴配件260允许轴穿过孔的合适的对准，参见例如管道组织器的424(图4)、参见例如预安装的运输组件210的300(图4)或与细胞扩增机202的后部206一起的400。轴或摇杆控制器258的旋转赋予轴配件260和生物反应器100旋转运动。因此，当CES200的操作者或用户附加新的或未使用的预安装的流体运输组件400(图4)到细胞扩增机202时，对准是相对简单的事，其合适地通过孔424(图4)定向预安装的流体运输组件210或400的轴与配有轴配件260。

转到图4，示出了可拆卸地附接的预安装的流体运输组件400的透视图。预安装的流体运输组件400可以可拆卸地附接到细胞扩增机202，以便于在细胞扩增机202处促进在同一细胞扩增机202处使用过的预安装的流体运输组件400相对快速地更换为新的或未使用的预安装的流体运输组件400。如图4所示，生物反应器100可以附接到包括轴配件402的生物反应器联轴器(coupling)。轴配件402包括一个或多个轴紧固机械装置，诸如用于接合细胞扩增机202的轴(例如258(在图3示出))的偏置臂或弹簧构件404。

在实现方式中，轴配件402和弹簧构件404与细胞扩增系统的使生物反应器100旋转的机构连接。例如，在一些实现方式中，细胞扩增系统是细胞扩增系统(由CO，莱克伍德的Terumo BCT,Inc.制造)的一部分，其提供用于生物反应器的旋转。提供用于生物反应器旋转的细胞扩增系统的示例至少描述于：U.S.专利No.8,399,245，公布于2013年3月19日，名称为“用于细胞扩增系统的细胞生长腔室的旋转系统和使用其的方法”；U.S.专利No.8,809,043，公布于2013年2月13日，名称为“用于细胞扩增系统的细胞生长腔室的旋转系统和使用其的方法”；和U.S.专利No.9,057,045，公布于2015年6月16日，名称为“在细胞扩增系统的生物反应器中装载和分配细胞的方法”；上述三篇通过引用整体并入本文，如同全部阐述于本文中一样。

根据一些实现方式，预安装的流体运输组件400包括管道408A、408B、408C、408D、408E，以及各种管道配件，以提供如下所述如图5和图6所示的流体路径。还可以为泵提供泵回路406A和406B。在一些实现方式中，尽管可以在细胞扩增机202所在的位置处提供各种培养基，但是根据一些实现方式，预安装的流体运输组件400可以包括足够的管道长度以延伸到细胞扩增机202的外部并且能够焊接到与培养基袋相关的管道。

图5示出了细胞扩增系统500的实现方式的示意图，并且图6示出了细胞扩增系统600的另一个实现方式的示意图。如图5和图6中的实现方式所示，并且如下所述，细胞在IC空间中生长，并且在其他实现方式中可以提供细胞在EC空间中生长。在又一实现方式中，诸如共培养细胞时，第一细胞可在EC空间中生长，而第二细胞可在IC空间中生长。细胞的共培养还可通过在EC空间中使第一细胞和第二细胞生长或在IC空间中使第一细胞和第二细胞生长来进行。

图5示出了CES 500，其包括第一流体循环路径502(也称为“毛细管内回路”或“IC回路”)和第二流体循环路径504(也称为“毛细管外回路”或“EC回路”)，根据一些实现方式。第一流体流动路径506可以与中空纤维生物反应器501流体相关以至少部分地形成第一流体循环路径502。流体穿过IC进入端口501A流入中空纤维生物反应器501，穿过中空纤维生物反应器501中的中空纤维，并经由IC排出端口501B离开。压力计510测量离开中空纤维生物反应器501的培养基的压力。培养基流过可用于控制流体循环的培养基流动/流速的速率的IC循环泵512。IC循环泵512可以沿第一方向(如顺时针)或与第一方向相反的第二方向(如逆时针)泵送流体。排出端口501B可以用作反向的入口。进入IC回路的培养基可以随后通过阀514进入。如本领域技术人员将理解的，可以在各个位置放置额外的阀和/或其他装置以隔离和/或测量沿着流体路径的多个部分的培养基特征。因此，应该理解，所示的示意图表示CES 500的各种元件的一种可能的配置，并且所示的示意图的修改在一个或更多个现有实现方式的范围内。

关于IC回路502，可以在操作期间从样品端口516或样品线圈518获得培养基样品。设置在第一流体循环路径502中的压力/温度计520允许在操作期间检测培养基压力和温度。然后培养基返回到IC进入端口501A以完成流体循环路径502。在中空纤维生物反应器501中生长/扩增的细胞可以通过阀598从中空纤维生物反应器501冲洗到收获袋599中，或者在中空纤维内重新分配以进一步生长。

第二流体循环路径504中的流体经由EC进入端口501C进入中空纤维生物反应器501，并经由EC排出端口501D离开中空纤维生物反应器501。EC回路504中的培养基可以与中空纤维生物反应器501中的中空纤维的外部接触，从而允许小分子扩散进出中空纤维。

设置在第二流体循环路径504中的压力/温度计524允许在培养基进入中空纤维生物反应器501的EC空间之前测量培养基的压力和温度。压力计526允许在培养基离开中空纤维生物反应器501之后测量第二流体循环路径504中的培养基的压力。关于EC回路，可以在操作期间从样品端口530或样品线圈获得培养基样品。

在一些实现方式中，在离开中空纤维生物反应器501的EC排出端口501D之后，第二流体循环路径504中的流体通过EC循环泵528到达氧合器或气体传输模块532。EC循环泵528也可以相反的方向泵送流体。第二流体流动路径522可经由氧合器进入端口534和氧合器排出端口536与氧合器或气体传输模块532流体相关。在操作中，流体培养基经由氧合器进入端口534流入氧合器或气体传输模块532，并且经由氧合器排出端口536离开氧合器或气体传输模块532。氧合器或气体传输模块532向CES 500中的培养基添加氧气并从中去除二氧化碳和气泡。在各种实现方式中，第二流体循环路径504中的培养基可以与进入氧合器或气体传输模块532的气体处于平衡。氧合器或气体传输模块532可以是任何适当尺寸的氧合器或气体传输装置。空气或气体经由过滤器538流入氧合器或气体传输模块532，并通过过滤器540流出氧合器或气体传输装置532。过滤器538和540减少或防止氧合器或气体传输模块532和相关培养基的污染。在灌注事件(priming sequence)部分期间从CES 500净化的空气或气体可经由氧合器或气体传输模块532排放到大气中。

在针对CES 500描绘的配置中，第一流体循环路径502和第二流体循环路径504中的流体培养基沿相同方向(并流配置)流过中空纤维生物反应器501。CES 500还可以配置为以对流配置流动。

根据至少一个实现方式，可以经由第一流体流动路径506将含细胞(来自袋562)的培养基和来自袋546的流体培养基引入第一流体循环路径502。流体容器562(例如，用于将空气引出系统的细胞进入袋或盐水灌注液)可以经由阀564与第一流体流动路径506和第一流体循环路径502流体相关。

流体容器或培养基袋544(例如，试剂)和546(例如，IC培养基)可分别经由阀548和550与第一流体进入路径542流体相关，或经由阀548、550和570与第二流体进入路径574流体相关。还提供了第一和第二无菌可密封输入灌注路径508和509。空气移除室(ARC)556可以与第一循环路径502流体相关。空气移除室556可以包括在空气移除室556内的某些测量位置处的一个或更多个超声波传感器，该超声传感器包括上部传感器和下部传感器以检测空气、流体缺乏，和/或气体/流体界面(例如，空气/流体界面)。例如，可以在空气移除室556的底部附近和/或顶部附近使用超声波传感器来检测这些位置处的空气、流体和/或空气/流体界面。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，实现方式提供了许多其他类型的传感器的使用。例如，可以根据本发明的实现方式使用光学传感器。在灌注事件或其他方案的部分期间从CES 500净化的空气或气体可经由管线558排放到空气阀560外的大气，管线558可与空气移除室556流体相关。

可以将EC培养基(来自袋568)或洗涤溶液(来自袋566)添加到第一或第二流体流动路径中。流体容器566可与阀570流体相关，阀570可以经由分配阀572和第一流体进入路径542与第一流体循环路径502流体相关。替代地，通过打开阀570并关闭分配阀572，流体容器566可以经由第二流体进入路径574和EC进入路径584与第二流体循环路径504流体相关。同样地，流体容器568可与阀576流体相关，阀576可以经由第一流体进入路径542和分配阀572与第一流体循环路径502流体相关。替代地，通过打开阀576并关闭分配阀572，流体容器568可以与第二流体进入路径574流体相关。可以提供可选的热交换器552用于培养基试剂或洗涤溶液引入。

在IC回路中，流体可以最初由IC进入泵554推进。在EC回路中，流体可以最初由EC进入泵578推进。诸如超声波传感器的空气检测器580也可以与EC进入路径584相关。

在至少一个实现方式中，第一和第二流体循环路径502和504连接到废物管线588。当阀590打开时，IC培养基可以流过废物管线588并流到废物袋或排出袋586。同样，当阀582打开时，EC培养基可以通过废物管线588流到废物袋或排出袋586。

在一些实现方式中，可以通过细胞收获路径596收获细胞。此处，可以通过将含有细胞的IC培养基穿过细胞收获路径596和阀598泵送至细胞收获袋599来收获来自中空纤维生物反应器501的细胞。

CES 500的各种部件可以包含或容纳在机器或壳体内(诸如细胞扩增机202(图2和图3))，其中，该机器在预定温度下维持细胞和培养基。

转到图6，示出了细胞扩增系统600的另一实现方式的示意图。CES 600包括第一流体循环路径602(也称为“毛细管内回路”或“IC回路”)和第二流体循环路径604(也称为“毛细管外回路”或“EC回路”)。第一流体流动路径606可以与中空纤维生物反应器601流体相关以形成第一流体循环路径602。流体穿过IC进入端口601A流入中空纤维生物反应器601，穿过中空纤维生物反应器601中的中空纤维，并经由IC排出端口601B离开。压力传感器610测量离开中空纤维生物反应器601的培养基的压力。除了压力之外，在实现方式中，传感器610也可以是在操作期间检测培养基压力和温度的温度传感器。

培养基流过可用于控制循环的培养基流动或流速的速率的IC循环泵612。IC循环泵612可以沿第一方向(如逆时针)或与第一方向相反的第二方向(如顺时针)泵送流体。排出端口601B可以用作反向的入口。进入IC回路的培养基可流过阀614。如本领域技术人员将理解的，可以在各个位置放置额外的阀和/或其他装置以隔离和/或测量沿着流体路径的多个部分的培养基特征。可以在操作期间从样品线圈618获得培养基样品。然后培养基返回到IC进入端口601A以完成流体循环路径602。

在中空纤维生物反应器601中生长/扩增的细胞可以通过阀698和管线697从中空纤维生物反应器601冲洗出到收获袋699中。替代地，当阀698关闭后，细胞可以中空纤维生物反应器601中重新分配以进一步生长。应该理解，所示的示意图表示CES 600的各种元件的一种可能的配置，并且所示的示意图的修改在一个或更多个现有实现方式的范围内。

第二流体循环路径604中的流体经由EC进入端口601C进入中空纤维生物反应器601并经由EC排出端口601D离开中空纤维生物反应器601。根据实现方式，EC回路中的培养基可以与中空纤维生物反应器601中的中空纤维的外部接触，从而允许小分子扩散进入和离开可在腔室601内的中空纤维。

设置在第二流体循环路径604中的压力/温度传感器624允许在培养基进入中空纤维生物反应器601的EC空间之前测量培养基的压力和温度。传感器626允许在培养基离开中空纤维生物反应器601之后测量第二流体循环路径604中的培养基的压力和/或温度。关于EC回路，可以在操作期间从样品端口630或样品线圈获得培养基样品。

在离开中空纤维生物反应器601的EC排出端口601D之后，第二流体循环路径604中的流体通过EC循环泵628到达氧合器或气体传输模块632。根据一些实现方式，EC循环泵628也可以相反的方向泵送流体。第二流体流动路径622可以经由氧合器或气体传输模块632的进入端口632A和排出端口632B与氧合器或气体传输模块632流体相关。在操作中，流体培养基经由进入端口632A流入氧合器或气体传输模块632，并经由排出端口632B离开氧合器或气体传输模块632。氧合器或气体传输模块632向CES 600中的培养基添加氧气并从中去除二氧化碳和气泡。

在各种实现方式中，第二流体循环路径604中的培养基可以与进入氧合器或气体传输模块632的气体处于平衡。氧合器或气体传输模块632可以是适用于氧合或气体传输的任何适当尺寸的装置。空气或气体经由过滤器638流入氧合器或气体传输模块632，并通过过滤器640流出氧合器或气体传输装置632。过滤器638和640减少或防止氧合器或气体传输模块632和相关培养基的污染。在灌注事件的部分期间从CES 600净化(purged)的空气或气体可经由氧合器或气体传输模块632排放到大气中。

在针对CES 600描绘的配置中，第一流体循环路径602和第二流体循环路径604中的流体培养基沿相同方向(并流配置)流过中空纤维生物反应器601。CES 600还可以被配置为以对流配置流动。

根据至少一个实现方式，包括细胞(来自诸如细胞容器(如袋)的源)的培养基可以附着在附接点662，并且来自培养基源的流体培养基可以附着在附接点646。可以经由第一流体流动路径606将细胞和培养基引入第一流体循环路径602。附接点662可以经由阀664与第一流体流动路径606流体相关，并且附接点646可以经由阀650与第一流体流动路径606流体相关。试剂源可以流体地连接到点644并且经由阀648与流体进入路径642流体相关，或经由阀648和672与第二流体进入路径674流体相关。

空气移除室(ARC)656可以与第一循环路径602流体相关。空气移除室656可以包括在空气移除室656内的某些测量位置处的一个或更多个传感器，该超声传感器包括上部传感器和下部传感器以检测空气、流体缺乏，和/或气体/流体界面(例如，空气/流体界面)。例如，可以在空气移除室656的底部附近和/或顶部附近使用超声波传感器来检测这些位置处的空气、流体和/或空气/流体界面。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，实现方式提供了许多其他类型的传感器的使用。例如，可以根据本发明的实现方式使用光学传感器。在灌注事件或其他方案的部分期间从CES 600净化的空气或气体可经由管线658排放到空气阀660外的大气，管线658可与空气移除室656流体相关。

EC培养基源可以附接到EC培养基附接点668，并且洗涤溶液源可以附接到洗涤溶液附接点666，以将EC培养基和/或洗涤溶液添加到第一或第二流体流动路径。附接点666可与阀670流体相关，阀670可以经由阀672和第一流体进入路径642与第一流体循环路径602流体相关。替代地，通过打开阀670并关闭阀672，附接点666可以经由第二流体进入路径674和第二流体流动路径684与第二流体循环路径604流体相关。同样地，附接点668可与阀676流体相关，阀676可以经由第一流体进入路径642和阀672与第一流体循环路径602流体相关。替代地，通过打开阀676并关闭分配阀672，流体容器668可以与第二流体进入路径674流体相关。

在IC回路中，流体可以最初由IC进入泵654推进。在EC回路中，流体可以最初由EC进入泵678推进。诸如超声波传感器的空气检测器680也可以与EC进入路径684相关。

在至少一个实现方式中，第一和第二流体循环路径602和604连接到废物管线688。当阀690打开时，IC培养基可以流过废物管线688并流到废物袋或排出袋686。同样，当阀692打开时，EC培养基可以流到废物袋或排出袋686。

当细胞在中空纤维生物反应器601中生长之后，可经由细胞收获路径697来收获细胞。此处，可以在阀698打开的情况下，通过将含有细胞的IC培养基通过细胞收获路径697泵送至细胞收获袋699来收获来自中空纤维生物反应器601的细胞。

CES 600的各种部件可以包含或容纳在机器或壳体内(诸如细胞扩增机202(图2和图3))，其中，该机器在预定温度下维持细胞和培养基。进一步应注意，在一些实现方式中，可以组合CES 600和CES 500的组件。在其他实现方式中，CES可以包括比图5和图6中所示的组件更少或额外的组件，并仍然在本公开的范围内。在一些实现方式中，CES 500和600的部分可通过细胞扩增系统(CES)(由CO，莱克伍德的Terumo BCT,Inc.制造)的一个或多个特征实现。

在使用CES 600的一个具体实现方式中，在CES 600的实现方式中扩增造血干细胞(HSC)，如CD34+HSC。在该实现方式中，可使用白细胞去除法(leukapheresis)或人工过程(如脐带)收集的HSC(包括CD34+HSC)可被引入生物反应器601。HSC(包括CD34+HSC)可通过路径602引入至生物反应器601。

在一些实现方式中，在引入至生物反应器601之前，可对HSC(包括CD34+HSC)进行选择过程(如纯化过程)。该过程可能涉及使用离心机、纯化柱、磁选择或化学选择。细胞选择/纯化程序的一些例子包括使用例如德国Bergisch Gladbach的Miltenyi Biotec生产的分离柱。在一个例子中，在将细胞引入至生物反应器601之前，脐带血首先要经过细胞选择过程，选择出HSC(包括CD34+HSC)。其他例子还可以利用血液分离机来清除最初收集时可能与HSC(包括CD34+HSC)一起存在的其他细胞。例如，HSC可以来源自脐带血、骨髓或外周血。在初始采集后，但在引入生物反应器601之前，可对一定体积的包括CD34+HSC的HSC进行处理，以去除该体积中的红细胞(red blood cells)、特定白细胞、粒细胞和/或其他细胞。这些仅是一些示例，本发明的实现方式不限于此。

在其他实现方式中，HSC(包括CD34+HSC)可在收集后无需额外纯化直接加入至生物反应器601。例如，脐带血(有HSC)可加入至生物反应器。除了一些蛋白和其他生物活性分子，脐带血可包括HSC(包括CD34+HSC)、红细胞、血小板、粒细胞和/或白细胞。

值得注意的是，在一些实现方式中，HSC可在灌注步骤后加入至生物反应器601。可以理解，被扩增的细胞可能不是贴壁的，因此可能不需要它们附着在生物反应器601的中空纤维壁上进行扩增/增殖。在这些实现方式中，可能不必要在中空纤维内侧涂覆促进粘附的涂层，如纤连蛋白。在这些实现方式中，可在灌注步骤后将HSC(包括CD34+HSC)(纯化或未纯化)引入生物反应器601，而无需生物反应器涂覆步骤。如果细胞是贴壁细胞，则可在灌注步骤之后且在引入HSC之前进行涂覆步骤。

一旦在生物反应器601中，细胞便可暴露于生长因子、活化剂、激素、试剂、蛋白和/或有助于细胞扩增的其他生物活性分子。在一个示例中，可以在生物反应器601中在先生长/引入共培养细胞系，以优化使HSC(包括CD34+HSC)生长的条件。在一个具体的实现方式中，人间充质干细胞(hMSC)可与HSC(包括CD34+HSC)共培养，以促进CD34+HSC的生长。不希望受到理论的束缚，认为MSC可释放因子(如SDF-1因子)，其与HSC(如CD34+HSC)相互作用，促进这些细胞的增殖。在某些实现方式中，共培养hMSC的使用可能涉及生长过程，该过程在HSC(包括CD34+HSC)被引入生物反应器601之前，在使hMSC增殖的最佳条件下进行。在实现方式中，hHSC可来源于骨髓、外周血、脐带细胞、脂肪组织和/或臼齿(molar)组织。

除了共培养细胞外，还可向生物反应器601中添加包括一种或多种生长因子、活化剂、激素、试剂、蛋白和/或其他生物活性分子在内的补充物，以促进HSC的生长和扩增。补充物可以单一体积添加，也可以在一段时间内添加(如连续、间歇或定期)。在一种实现方式中，细胞因子和/或其他蛋白(如重组细胞因子、激素)的组合可作为补充物的一部分。例如，补充物可包括重组人Flt3配体(rhFlt-3L)、重组人干细胞因子(rhSCF)、重组人血小板生成素(rhTPO)、重组人(rh)胶质源性神经营养因子和/或它们组合中的一种或多种。实现方式中可使用的补充物的一个例子是STEMCELL2MAXTM补充物(stemcell2MAX，Cantanhede，葡萄牙)。

值得注意的是，在一些实现方式中，因子的组合可包含在细胞所悬浮于的培养基中。例如，可将HSC悬浮在培养基中，并在培养基中被引入至1406生物反应器。在一些实现方式中，培养基可包括有助于HSC增殖的生长因子的组合。

将细胞与补充物、共培养细胞和/或用于扩增细胞的其他材料一起引入生物反应器后，使细胞在生物反应器中扩增1410。在扩增过程中，可存在向生物反应器中添加或从生物反应器去除的材料。作为一个例子，可向生物反应器601中添加额外的蛋白(如细胞因子)。在某些实现方式中，可使用一种以上的蛋白或其他生物活性剂。额外材料可以同时、在不同时间独立地添加，或可组合并组合地添加。

值得注意的是，一些实现方式可以将材料更直接地加入生物反应器501中，例如通过端口516(图5)。不过，在其他实现方式中，材料可以添加到某个位置，例如穿过路径606，这样材料可以更缓慢地灌注到生物反应器601中。

除了用于有助于HSC(包括CD34+HSC)生长的材料外，还可以供养HSC，例如通过添加可包括多种营养物质的培养基。在某些实现方式中，培养基可以是含血清的市售培养基。在其他实现方式中，培养基可以不含血清但包括其他添加剂。培养基可以通过添加其他材料进行改良，一些非限制性的例子包括盐、血清、蛋白、试剂、生物活性分子、营养物质。可用于供养HSC(包括CD34+HSC)的培养基的一个例子包括无血清培养基(CellGenix，弗莱堡，德国)。

在一些实施方案中，当共培养细胞位于IC空间时，可在EC空间进行供养。在一些实现方式中，通过EC空间供养可降低细胞可能感受到的来自IC空间循环液体的力的大小。在一些实现方式中，EC空间中的培养基循环可为HSC(包括CD34+HSC)的扩增提供充足的营养物。

作为HSC(包括CD34+HSC)扩增的一部分，还可控制生物反应器601中的其他条件，如温度、pH、氧气浓度、二氧化碳浓度、废物浓度、代谢物浓度。在一些实现方式中，EC侧(如路径604)的流速可用于控制各种参数。例如，如果希望降低细胞生长的IC侧的废物或代谢物浓度，则可增加EC侧的流速，以确保废物和/或代谢物通过穿过中空纤维从IC侧迁移到EC侧，从而从IC侧清除。

CD34+HSC扩增后，可将细胞从生物反应器601中移出。可将CD34+HSC收集到容器699中。在一些实现方式中，可将收集的CD34+HSC给患者使用，以重建造血功能。一些非限制性示例包括正在接受可能会影响造血功能的各种癌症(如白血病、骨髓增生异常、非霍奇金淋巴瘤)治疗的患者。细胞可与其他化合物或分子一起施用。

在一些实施方式中，与传统工艺相比，使用CES 600可为HSC(包括CD34+HSC)的生长提供优势。例如，使用中空纤维可实现细胞间的密切通讯，从而促进CD34+HSC的生长，使其开始并继续增殖。此外，使用中空纤维生物反应器，如生物反应器601，可为细胞生长提供大的表面积，从而可产生更高浓度或更大体积的CD34+HSC。

此外，生物反应器601中的条件可通过CES 600的多个不同组件进行控制，包括IC流速和EC流速。此外，CES 600提供了各种添加材料的位置，可使细胞因子更直接或间接地，如灌注，进入生物反应器601。

此外，CES 600提供了封闭的系统。也就是说，使CD34+HSC生长的步骤可以在不直接暴露于周围环境的情况下进行，因为周围环境可能会污染细胞，或被细胞或用于使细胞生长的材料污染。还认为，与其他方法/系统相比，一些实现方式可提供使用较小起始浓度的CD34+HSC进行扩增。在这些实现方式中，与其他方法/系统相比，CD34+HSC还可扩增以产生更大的量。还认为，一些实现方式还提供了缩短生长有效剂量CD34+HSC的时间。

图7示出了可在其上实现本公开的实现方式的计算系统1100的示例组件。计算系统1100可用于一些实现方式中，如细胞扩增系统使用处理器执行任务，如作为流程(如上文所述流程)的一部分而执行的定制任务或预编程任务。

计算系统1100可包括用户界面1102、处理系统1104和/或存储器1106。用户界面1102可以包括输出装置1108和/或输入装置1110，如本领域技术人员所理解的。输出装置1108可以包括一个或更多个触摸屏，其中，触摸屏可以包括用于提供一个或更多个应用窗口的显示区域。触摸屏还可以是输入装置1110，其可以例如接收和/或捕获来自用户或操作者的物理触摸事件。如本领域技术人员所理解的，触摸屏可以包括具有电容结构的液晶显示器(LCD)，该电容结构使得处理系统1104能够推断出触摸事件的位置。处理系统1104则可以将触摸事件的位置映射到在应用窗口的预定位置中呈现的用户界面(UI)元素。根据实现方式，触摸屏还可以通过一个或多个其他电子结构来接收触摸事件。其他输出装置1108可以包括打印机、扬声器等。如本领域技术人员所理解的，其他输入装置1110可以包括键盘、其他触摸输入装置、鼠标、语音输入装置。

根据本发明的实现方式，处理系统1104可以包括处理单元1112和/或内存1114。处理单元1112可以是可操作以执行存储在内存1114中的指令的通用处理器。根据一些实现方式，处理单元1112可以包括单个处理器或多个处理器。进一步地，在一些实现方式中，每个处理器可以是具有一个或多个核心的多核处理器，以读取和执行单独的指令。如本领域技术人员所理解的，处理器可以包括通用处理器、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、其他集成电路等。

根据一些实现方式，内存1114可以包括用于数据和/或处理器可执行指令的任何短期或长期存储。如本领域技术人员所理解的，内存1114可以包括例如随机存取内存(RAM)、只读内存(ROM)或电可擦除可编程只读内存(EEPROM)。如本领域技术人员所理解的，其他储存介质可以包括例如CD-ROM、磁带(tape)、数字多功能盘(DVD)或其他光学储存器、磁带(tape)、磁盘储存器、磁带(magnetic tape)，其他磁储存装置。

储存器1106可以是任何长期数据储存装置或组件。根据一些实现方式，储存器1106可以包括结合内存1114描述的一个或更多个系统。储存器1106可以是永久的或可移动的。在一些实现方式中，储存器806储存由处理系统104生成或提供的数据。

本公开提供了扩增细胞(即增加生长于培养基中细胞的数量)的方法。特别是，这些方法对扩增人类造血干细胞(HSC)，包括表达CD34蛋白的HSC(CD34-阳性HSC，或CD34+HSC)是有用的。在这些方法中，CD34+HSC可以是CD45+/CD34+HSC和/或CD133+CD38-祖细胞。有利地，这些方法能快速且有效地扩增许多倍(例如至少50倍)HSC，同时最小化这些HSC的分化。

可在实施方式中可进行流程1400以单培养或共培养的方式扩增靶细胞，如CD34+HSC。流程1400从步骤1404开始，并进行到其中可从生物反应器中去除经扩增的细胞(如CD34+HSC)的步骤1412。

类似地，这些方法中要扩增的细胞可以是从供体流体(如一种或多种血液成分)中收集的细胞，供体流体包括干细胞、CD34+HSC、T细胞、单核细胞和/或自然杀伤(NK)细胞。在这些方法中，供体流体中的特定“靶”细胞(如CD34+HSC)可被扩增，同时供体流体中的其他细胞被去除或数量减少。

这些方法可包括在膜上培养扩增细胞。在这些细胞扩增方法中，膜对捕捉、收集和/或以其它方式抓住细胞是有用的。膜可以以任何形式布置，如平坦的片材、过滤基体、中空纤维、它们的任意组合和/或它们的任意多个。在这些方法中，膜可包括位于膜的至少一个表面上的涂层，其中涂层包括基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和纤连蛋白或其亚型，或其功能等同物。在本公开的方法中，特别有用的膜是中空纤维或多个中空纤维，因为它们出现在中空纤维生物反应器中。这种中空纤维包含中空纤维的内腔中的内部部分或表面，以及外部表面(“毛细管外”侧或表面)。中空纤维膜可包括多个中空纤维。中空纤维的示例可以如图8的示意图所示，图中描绘了中空纤维800的长度和中空纤维802的端部，中空纤维800具有内腔804和毛细管外侧808。如图8所示，内腔表面806可具有涂层810。

在这些方法的一些示例中，膜可与细胞处理装置结合使用。在一个示例中，细胞处理装置可以是SPECTRA血球采集系统、/>光谱血球采集系统和TRIMA自动采血系统，它们都是由科罗拉多州莱克伍德的Terumo BCT制造的。从供体收集细胞后，可使细胞通过膜以从中分离出靶细胞。

在这些方法的一些示例中，膜可与细胞扩增装置结合使用。在一个例子中，细胞扩增装置可以是科罗拉多州莱克伍德Terumo BCT制造的细胞扩增系统。在分离出靶细胞后(例如，如上所述)，可在膜中扩增靶细胞，以增加其中所含靶细胞的数量。

可以在膜上连续流动的基础上捕获小尺寸物质，如蛋白或外泌体。扩散动力学可以有效地帮助将这些物质运输到膜，通过在膜上沉积的它们的化学缀合物可以捕获这些物质。如图9的示意图所示(箭头表示超滤流的方向)，从内腔侧906到中空纤维900的毛细管外侧的适度超滤可进一步帮助向纤维壁的运输。超滤流动可通过中空纤维900的内腔表面906上存在的涂层910发生。如图10的示意图所示，可停止流动以分开混合的细胞群，其中中空纤维1000的内腔中的颗粒1002悬浮在内腔1004中，而穿过内腔1004的流动已停止。当没有流动时，颗粒1002(例如造血干细胞)可能会落到中空纤维1000的底部1006，如图11的示意图所示。此时，靶物质(如细胞)可能会附着在膜的表面，而非靶物质(如细胞或细胞碎片)可能会被从膜上冲洗下来，留下靶物质包含于膜上。在一个例子中，当非靶物质被除去后，可使用释放机制(包括但不限于改变pH、改变温度、置换粘合剂化学成分)来释放膜组分与靶物质之间(如，适体与细胞膜抗原之间)的缔合(如键)，使靶物质处于其天然、未改变的状态。例如，可以用适当的核酸酶切割适体，以破坏适体与细胞之间的结合，从而释放细胞。

膜可包括一个或多个涂层，该一个或多个涂层配置为吸引、收集和/或抓住靶细胞，然后可使其扩增。例如，当膜是中空纤维生物反应器的中空纤维时，中空纤维可包括位于中空纤维的内腔表面和毛细管外表面中的一者或两者上的涂层。本公开中提供的涂层可以是与膜化学连接的涂层(例如，通过疏水和亲水相互作用)。在一些示例中，基础涂层材料可作为第一涂覆层，次级(secondary)涂层材料可作为次级涂覆层。这些涂层材料可依次或一起施加到膜上。第一涂覆材料的示例可包括纤连蛋白、玻连蛋白、任何细胞外基质(ECM)糖蛋白、胶原、酶、其等同物和/或其组合，和/或任何能够使细胞粘附到膜或其他表面的分子或材料。次级涂覆材料的示例可包括可溶性蛋白部分、生物素化分子、抗生物素抗体、生物素结合肽和/或链霉亲和素结合肽、链霉亲和素、亲和素、单克隆抗体、适体(例如，靶向特定细胞表面标志物的适体)、细胞因子(如白介素(IL)-6、IL-21)、趋化因子(如基质细胞衍生因子(SDF)-1)、其等同物和/或其组合。

涂层可在单次化学操作中施加。例如，第一分子(如第一部分涂覆材料)和第二分子(如第二部分涂覆材料)可在膜外缀合，然后同时涂覆到膜上。当通过涂覆形成时，本公开的膜可用于(1)产生选择性生物反应器以扩增细胞；和/或(2)创建可捕获特定靶细胞或分子(如任何生物素化分子或细胞)的过滤器。

在一个例子中，膜可包括促进细胞粘附至基底的至少一个表面的一种或多种材料。例如，涂层可包括二聚糖蛋白纤连蛋白，或纤连蛋白的功能等同物，如通过其前-mRNA的替代剪接而产生的许多已知的纤连蛋白的亚型，或含有纤连蛋白的整合素-结合序列Arg-Gly-Asp(RGD)(提供了纤连蛋白的主要细胞粘附活性)的其他蛋白。

额外有用的涂层可包括一种或多种蛋白部分。可选择这些蛋白部分以靶向存在于供体流体中的特定靶细胞。例如，蛋白部分可以是趋化因子，如基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，它可用于增强从供体流体中收集CD34+HSC(例如，与未涂覆的膜或仅涂有纤连蛋白的膜相比)。这些涂层中另一有用的蛋白部分可能是白介素-21(IL-21)。这些涂层中另一有用的蛋白部分可能是SDF-1和IL-21的组合。这些涂层中另一有用的蛋白部分可能是纤连蛋白和SDF-1的组合，如图12所示，其中包含纤连蛋白和SDF-1组合的涂层1210与中空纤维1200的内腔表面相关联。可以选择膜的额外涂层以靶向、收集和/或抓住供体流体中相同或不同的细胞。

在这些方法中，如图5的示意图所示，膜可以涂覆有纤连蛋白和可溶性蛋白部分的混合物。

如图13所示，在这些方法中，可将多个细胞1302(如HSC的悬液)引入内腔表面1306上具有涂层1310的中空纤维膜1300。

在一些实现方式中，经涂覆的膜可涂覆有纤连蛋白和可溶性蛋白部分的混合物，以捕获生物素化分子，如链霉亲和素、亲和素和/或抗生物素抗体和/或其功能等同物。

如图15的示意图所示，在一些示例中，中空纤维1500的内腔表面1506可具有涂层1510，其例如可以是含生物素化分子的涂层。在一个示例中，这类膜涂层可以捕获非靶物质1503(如红细胞)的悬浮液中的靶物质1502(如HSC)。经涂覆的膜可用于从混合的细胞群中分离或捕获靶细胞。如图16所示，靶细胞1502例如可被中空纤维1500的内腔表面1506上涂层1510中存在的蛋白部分捕获。在冲洗1550中空纤维1500之后，非靶细胞1503会从中空纤维1500的内腔1504中去除，而靶细胞1502则会保持与中空纤维1500的内腔表面1506的结合。

在这些方法中，多个细胞被引导与膜接触，膜可以是本公开的经涂覆的膜，并在与膜接触时扩增。例如，在这些方法中使用中空纤维膜时，可将多个细胞引入1406中空纤维生物反应器的中空纤维中，该中空纤维各自包括内部的内腔和毛细管外侧，如上所述。多个细胞在与膜接触之前，可以通过各种手段进行在先纯化。替代地，多个细胞可以不经任何初始纯化直接被引导与膜接触，例如直接从细胞供体来源(如采集外周血、骨髓或脐带血(CB))中采集，这可能包括将多个细胞引入多个中空纤维中，而不进行任何预先纯化。细胞可被引导与膜接触，然后留在该位置与膜结合，然后再进行针对膜的额外循环或运动，以在膜上“接种”额外的细胞或从膜上去除残留细胞或细胞碎片。当膜包括中空纤维生物反应器的中空纤维时，该过程可有利地包括用泵使多个细胞在中空纤维的内腔中循环，然后停止泵，以使多个细胞的一部分附着在中空纤维的内腔的第一部分上，然后将中空纤维生物反应器从初始位置旋转180度，然后再次用泵使多个细胞在中空纤维腔的内腔中循环，然后停止泵，以使多个细胞的一部分附着到中空纤维的内腔的第二部分。

可通过将中空纤维中的细胞暴露1408于生长条件下，来扩增1410细胞。生长条件可包括将细胞暴露于一种或多种细胞生长培养基，例如，通过中空纤维生物反应器的中空纤维的内腔和/或通过中空纤维的毛细管外侧循环细胞生长培养基。替代地或另外地，生长条件还可以包括使细胞暴露于一种或多种生长因子。有用的生长因子可包括FMS-样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、IL-21、SDF-1或它们的组合。在生长培养基中存在GDNF的情况下，其在生长培养基中的浓度为0.5重量/体积％至2重量/体积％，例如浓度约为10ng/mL，可能是尤其有用的。

在这些使用中空纤维生物反应器的中空纤维的膜的方法中，第一培养基可用在中空纤维的内腔中，第二培养基可用于与中空纤维的毛细管外侧接触。在这些方法中，相对于所述中空纤维的毛细管外侧至少一种组分的浓度，所述内腔中的培养基的相同组分可能是被浓缩了的。在这些方法中，经浓缩的组分可以是GDNF、SR-1、SCF、TPO、Flt-3L、IL-3、IL-6、SDF-1、纤连蛋白或其组合。在这些方法中，经浓缩的成分可以被浓缩至少五倍或至少十倍。

另一种对扩增细胞的有用因子可包括芳基烃受体拮抗剂，如StemRegenin 1(SR1)或UM171，其由蒙特利尔大学开发，目前正由ExcellThera,Inc.用于细胞疗法的临床开发。

涂层可用于为细胞培养提供专门的环境(例如，当涂层包括基础涂覆材料(如纤连蛋白)和包括可溶性蛋白部分(如SDF-1、IL-21)的次级涂覆材料)。因此，本公开提供了对扩增CD34+HSC有用的组合物。这些组合物可包含胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)和芳基烃受体(AHR)拮抗剂(如SR-1)中的至少一种。这些组合物可还包含SCF、TPO、Flt-3L、IL-3、IL-6、SDF-1和纤连蛋白中的至少一种。在这些组合物中，GDNF可以0.5重量/体积％至2重量/体积％的浓度，或至少为10ng/mL的浓度存在。在这些组合物中，纤连蛋白和SDF-1可固定在细胞培养表面，如半透膜上。这些组合物可提高BCL2的水平并抑制HSC分化。

本公开的经涂覆的膜可用于提供专门的环境，以捕获生物素化分子，如链霉亲和素、亲和素、抗生物素(例如当涂层包括第一涂覆材料(如纤连蛋白)和次级涂覆材料(包括生物素捕获部分，如生物素化分子、靶向特定细胞表面标志物的适体或可溶性部分，如细胞因子(如IL-6)时)。

本文描述的化学涂层的至少一个益处是能够在无菌环境中制造具有涂层的膜(如中空纤维膜)。可以打开包括经化学涂覆、灭菌的经涂覆的膜的无菌包装，从包装中取出膜后即可使用(例如，无需进一步处理)。

在一个例子中，细胞扩增系统生物反应器中空纤维膜(HFM)可以涂覆有含链霉亲和素-纤连蛋白的涂覆材料。例如，当随后与生物素化细胞特异性单克隆抗体(mAb)偶联时，这种涂层材料可用于选择或分离特定细胞类型。

在一些例子中，纤连蛋白-链霉亲和素基础(foundation)可用作涂覆材料，用于附着生物素化分子，使聚醚砜HFM生物反应器或制备柱表面功能化，以进行细胞选择。纤连蛋白可通过诸如间充质基质/干细胞(MSC)、成纤维细胞和主动脉内皮细胞等的贴壁细胞的粘附和扩增，与细胞扩增系统生物反应器中的聚醚砜HFM结合。这种纤连蛋白-链霉亲和素缀合可利用链霉亲和素与生物素的高亲和力。在考虑现有的蛋白偶联生化技术时，重要的是保持方案的直接性和高效性，尽量减少残留物或反应物，以适应细胞疗法产品的生产。在一个例子中，可以混合和/或连接纤连蛋白-链霉亲和素混合物或缀合物，这样就可以在HFM生物反应器或柱中加入生物素化细胞因子、趋化因子和/或其他配体，以促进细胞选择和/或扩增。也可使用生物分子的其他亲和分离法。在任何情况下，这种蛋白-蛋白缀合都可被视为与细胞疗法相关的亲和过程的平台，它使用的是已有的技术。

在这些方法中，纤连蛋白和链霉亲和素的混合物可用作经涂覆的膜的涂覆材料。该过程可包括在环境温度下将冻干的纤连蛋白和链霉亲和素(例如，质量比为1:3.3)在水中重构约30分钟。纤连蛋白-链霉亲和素缀合后，用磷酸盐缓冲液w/o Ca2+-Mg2+将混合物的体积补至100mL，然后使用“涂覆生物反应器”任务将其引入细胞扩增系统中足够长的时间(如8小时)。在生物反应器涂覆后，可洗涤出多余的未结合缀合蛋的白，然后使用“涂覆生物反应器”任务将选定的生物素化分子，例如，细胞因子(白介素或生长因子)、表位、配体、单克隆抗体、染色质或适体引入/>细胞扩增系统生物反应器，来与纤连蛋白-链霉亲和素涂层偶联。完成后，得到的纤连蛋白-链霉亲和素-生物缀合蛋白就可用于细胞选择或细胞信号传导(包括分化)应用。其他应用还包括在将细胞引入/>细胞扩增系统之前，对可用于细胞选择或分化的预备HFM柱或基质进行涂覆。

在这些方法中，可以用重组或半合成的纤连蛋白或纤维蛋白原(fibrinogen)代替血浆来源的纤连蛋白。细胞外基质蛋白(如纤连蛋白)可通过极性键合和氢键与聚醚砜中空纤维膜结合。纤连蛋白因其糖蛋白结构和特定结构域而具有天然粘附性，可使纤连蛋白与聚醚砜和细胞膜整合素两者结合。

在一个例子中，可使用链霉亲和素缀合试剂盒，采用与上述相似的质量比，实现纤连蛋白与链霉亲和素的共价偶联。该试剂盒可利用特定的连接修饰剂和淬灭化学反应，在30分钟至24小时的时间段，在一些实现方式中在3小时至15小时的时间段内，在纤连蛋白和链霉亲和素之间生成共价连接。在一些例子中，在纤连蛋白和链霉亲和素之间生成共价连接的时间可为约4小时，加减30分钟。在共价涂覆法中，所选生物素化分子与链霉亲和素的亲和力可能与在纤连蛋白-链霉亲和素混合物涂覆法中生物素化分子的亲和力相似。共价法的一个优点可能包括改善了纤连蛋白-链霉亲和素偶联的稳定性。

使用例如1:3的摩尔比(纤连蛋白：链亲和素)将链亲和素-生物素化分子与纤连蛋白偶联可能是有用的。在一些例子中，将纤连蛋白-链霉亲和素生物素化分子偶联到HFM生物反应器可能是两步的过程。这种缀合涂覆化学可以为用于结合一系列生物素化分子以进行细胞选择、刺激、扩增或分化的平台。

可选择纤连蛋白-链霉亲和素蛋白缀合物可作为细胞扩增系统生物反应器的粘附分子。将生物素化的细胞特异性的mAb或蛋白表位与纤连蛋白-链霉亲和素缀合物在高达且包括1:4的特定比例下偶联可发挥出链霉亲和素对生物素的高亲和力，其中解离常数约为Kd＝10^-14至10^-15M。细胞特异性的生物素化抗体或表位的例子可包括针对亲本(parent)T细胞的抗-CD3 mAb、针对人T-reg细胞的抗-CD4/CD25 mAb、针对人T效应细胞的抗-CD8mAb、针对造血干细胞的抗-CD34 mAb，或针对NK细胞的抗-CD56 mAb。链霉亲和素-生物素连接可包括强的非共价连接，因此，只需改变生物素化mAb缀合物的特异性，就能利用这种功能特异性来选择几乎任何细胞类型。此外，也有可能采用相反的方法，即生物素化纤连蛋白与链霉亲和素-细胞特异性mAb结合，用于选择感兴趣的细胞。如果采用第一种方法，那么用小生物素分子(m.w.244.3道尔顿)的mAb的生物素化，不太可能影响mAb结合或细胞抗原识别。其次，链霉亲和素的净负电荷和缺乏糖基化可最大限度地减少与细胞的非特异性结合。这一概念可利用链霉亲和素-生物素相互作用的高度特异性和多功能性，提供更好的粘附体系。在一些例子中，可通过切割DNase敏感性接头，使细胞与链霉亲和素-纤连蛋白-生物素-MAb-细胞复合体酶法分离。

因此，本公开还提供了一种经涂覆的膜，及其制造和使用方法。这些经涂覆的膜可以是中空纤维，包括中空纤维生物反应器中使用的中空纤维。这些经涂覆的中空纤维膜可包括内腔表面和毛细管外表面，并且具有位于内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的第一涂层。第一涂层可包括促进细胞粘附到内腔表面和毛细管外表面中至少一个的材料。位于内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的第二涂层可包括可溶性蛋白部分。在这些经涂覆的中空纤维膜中，第一涂层可包括纤连蛋白。在这些涂层中，第二涂层可包含细胞因子、适体、趋化因子(如SDF-1或IL-21)、单克隆抗体、链霉亲和素、亲和素、生物素化分子和抗生物素抗体或其功能片段中的至少一种。这些膜可由聚砜或聚醚砜组成的材料组成。

在这些经涂覆的中空纤维膜中，涂覆在中空纤维上的纤连蛋白的量可以是0.001μg/cm²至2μg/cm²，或者可以是0.01μg/cm²至1.0μg/cm²，或者可以是0.10μg/cm²至0.50μg/cm²，或者可以是0.20μg/cm²至0.40μg/cm²，或者可以是0.23μg/cm²至0.24μg/cm²。在这些经涂覆的中空纤维膜中，涂覆在中空纤维上的SDF-1的量可以是0.001ng/cm²至0.30ng/cm²，或者可以是0.01ng/cm²至0.10ng/cm²，或者可以是0.05ng/cm²至0.09ng/cm²，或者可以是0.075ng/cm²。

本公开还提供了形成经涂覆的中空纤维膜的方法。这些方法包括提供具有内腔表面和毛细管外表面的中空纤维膜，以及将第一涂层施加在中空纤维膜的内腔表面上，以及将第二涂层施加在中空纤维膜的内腔表面上。在这些方法中，第一涂层可包括促进细胞粘附到中空纤维膜的内腔和中空纤维膜的毛细管外表面的至少一个的材料(如纤连蛋白)，而第二涂层可包括可溶性蛋白部分，如细胞因子、适体、趋化因子、单克隆抗体、链霉亲和素、亲和素、生物素化分子和抗生物素抗体或其功能片段中的一种或多种。在这些方法中，施加第一涂覆和第二涂覆材料可包括使第一涂层材料和第二涂层材料缀合成与中空纤维膜分开的缀合物，并将缀合物涂覆到中空纤维膜的内腔表面。这些方法可包括将第一涂层施加到中空纤维膜的毛细管外表面和/或将第二涂层施加到中空纤维膜的毛细管外表面。在这些方法中，第一涂层可以是纤连蛋白，而第二涂层可以是SDF-1或白介素-21IL-21。

如本文所述，生物反应器(例如，HFM、中空纤维装置和/或中空纤维)可循序地涂覆。循序地涂覆生物反应器可随时间增强SDF-1部分的暴露。例如，根据示例方案，在第-2天(如接种前两天)：可用纤连蛋白涂覆生物反应器HFM(如使用上述“涂覆生物反应器”任务)，在第-1天(如接种前一天)：可用SDF-1涂覆生物反应器HFM(如使用上述“涂覆生物反应器”任务)，及在第0天(例如，接种当天)：可用CB来源的CD34+HSC接种生物反应器。在一些示例中，每次涂覆可能需要8小时到24小时来完成。

在这些方法中，与膜接触的细胞(如多个中空纤维的内腔中的细胞)可以单培养(即基本上没有其他类型的细胞)或共培养(即存在其他类型的细胞)中生长而扩增。例如，在一些方法中，中空纤维中扩增的CD34+HSC可以单培养扩增，其中没有额外类型的细胞在中空纤维中与CD34+HSC共培养。在CD34+HSC以单培养在中空纤维中扩增的这些方法中，中空纤维可包括位于中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的包括SDF-1和纤连蛋白的涂层。在这些方法中，CD34+HSC有利地在SDF-1和纤连蛋白的存在下进行扩增，而不需要其他细胞共培养。

在这些方法中，多个细胞(如CD34+HSC)可通过以共培养的方式生长而扩增。CD34+HSC可与间充质干细胞共培养来扩增。在这些方法中，可先将以共培养生长的细胞(如间充质干细胞)引入中空纤维，然后再将用于扩增的多个细胞引入中空纤维。待共培养来生长的细胞(如间充质干细胞)可先在中空纤维中以单培养生长(如将中空纤维中的间充质干细胞暴露于生长条件下)，然后再引入待扩增的多个细胞(如CD34+HSC)。替代地或另外地，待扩增的多个细胞(如CD34+HSC)可先在静态生长室(如传统的细胞培养孔或瓶)中以共培养(如与间充质干细胞共培养)来生长，然后从静态生长室中去除全部或部分待扩增的多个细胞(如CD34+HSC)，并将静态生长室中的多个细胞引入中空纤维。

在这些方法中，细胞的扩增可有利地足以将从单个单位的血液或组织中获得的含CD34+HSC的多个细胞扩增为足以对人类受体进行至少一次移植过程的多个扩增细胞。在这些情况下，单个单位的血液可以是脐带血，或单个单位的组织可以是骨髓。

在这些方法中，含CD34+HSC的经扩增的细胞在扩增后至少有90％的存活率。在这些方法中，含CD34+HSC的经扩增的细胞可扩增至少50倍。

在一些例子中，本公开提供了一种从非靶物质的混合群体中分离靶物质(例如靶细胞或靶分子)的方法和装置。从混合细胞群中分离靶细胞可用于描述该方法和装置。细胞分离过程中可使用类似于血液透析器的中空纤维装置。如上所述，可在中空纤维的毛细管内(内腔)壁上进行涂覆，使特定的结合试剂(如涂覆材料)均匀地附着在中空纤维装置的毛细管内表面上。替代地或另外地，中空纤维的毛细管外壁可以用结合试剂处理，增加表面积(例如，用于分子捕获)。

例如，结合试剂可以是单克隆抗体(mAb)或经测序的适体。结合试剂的选择可以使结合试剂对要分离的靶细胞表面的受体分子具有特异性。例如，如果要从单核细胞(MNC)收集物中分离出T细胞，则可将对CD3、CD4、CD8和/或T细胞标志物的组合具有特异性的结合试剂固定(如施加、涂覆、沉积)到形成膜的中空纤维的毛细管内表面和/或毛细管外表面。从混合细胞群中分离T细胞的方法的一个例子可包括在将细胞引入膜之前，将抗体或适体附着在细胞上，然后通过链霉亲和素涂覆的膜，如链霉亲和素涂覆的中空纤维。在另一个例子中，使用了逆流封闭(CFC)方法，其中细胞收集物可流入中空纤维膜的内腔侧。一旦细胞被包含在膜的内腔侧，可将逆流最小化到足以将细胞保留在纤维内的水平。一旦靶细胞与内腔表面结合，纵向方向流动(内腔入口头到内腔出口头)和超滤流动都可用于从中空纤维的内腔中去除未结合的细胞。

在一些例子中，可使用释放剂促进靶细胞从其结合位点脱离(例如，促进靶细胞收获)。释放剂可以纵向方向流动，也可以超滤流动，或两者皆有。

尽管本文结合中空纤维装置(例如，生物反应器或包括作为中空纤维布置的经涂覆的膜的其他装置)对示例进行了描述，但应该理解的是，可以使用任何能够接收涂层的膜。例如，可使用以下任何一种或多种装置来接收各种涂层和/或执行本文所描述的方法：大表面积中空纤维装置、透析器(如血液透析器)、细胞捕获柱(如磁性细胞分选、磁性柱仪器)、聚砜膜过滤装置、细胞处理系统等。

在这些方法中，至少一部分的多个经扩增的细胞可以从膜(如中空纤维生物反应器的中空纤维)中去除1412。经扩增的细胞可储存起来，或用于移植或在患者的其他治疗程序(如癌症治疗方案)中的施用。在这些方法中，向患者施用多个经扩增的细胞可重建患者的造血功能。

人类白细胞抗原(HLA)-8-等位基因匹配的脐带血(CB)移植是用于治疗某些血液恶性肿瘤、血红蛋白病和自身免疫性疾病的异体程序。可以选择CB来源的CD34⁺干细胞和祖细胞来用于造血重建，因为它们的自我更新和增殖能力更强，端粒更长，异体反应T细胞的频率更低，所以移植物抗宿主疾病(GVHD)的发生率更低，以及它们在血液移植受体中实现快速植入的能力。然而，在这种情况下面临的挑战之一是提供足够数量的T细胞耗尽的造血干细胞和祖细胞，它们是支撑混合的异体造血干细胞移植(HSCT)所必需的。在CB库中储存的脐带血单位中，只有约4％-5％含有足够数量的CD34+HSC，可用于70kg患者的单单位移植(≥1.05x 10⁷CD34+HSC)或双单位移植(≥1.40x 10⁷CD34+HSC)。

在与间充质基质细胞共培养或与小分子结合各种细胞因子补充物的情况下，扩增脐带血来源的CD34+HSC的方法通常依赖于来自脐带血单位(CBU)的4-6x 10⁶或更高CD34+HSC的接种物。在一些实现方式中(例如，为了扩大储存的CBU的范围)，提供了一种单培养扩增方案，用于在细胞处理系统(例如，细胞扩增系统的基于灌注的，2腔室的，半透的中空纤维膜(HFM)生物反应器)中，进行2x 10⁶个预选择的脐带血来源的CD34+HSC的低初始接种，使用由重组人干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、fms-样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、白介素3(IL-3)和白介素6(IL-6)组成的基本细胞因子混合物，浓度为制造商推荐浓度的十分之一。这种细胞因子混合物可进一步补充有重组人胶质细胞源性神经营养因子(rhGDNF)，以例如维持细胞存活率，并与芳基烃受体(AHR)拮抗剂SR-1结合使用。GDNF可上调人CB-CD34+细胞祖细胞中抗凋亡基因BCL2的表达，而SR-1与HSC细胞因子一起使用时，可限制CD34+HSC扩增过程中的HSC的分化。间充质基质细胞(MSC)和造血干细胞和祖细胞(HSPC)在骨髓窦中的位置接近，加上来自CD146+MSC的SCF对HSPC的血管周围支持，可能有助于将它们纳入造血共培养过程。然而，MSC和HSPC的共培养增加了干细胞和祖细胞扩增过程的复杂性、时间和潜在的可变性。即便如此，MSC/HSPC共培养仍可为CB来源的CD34+HSC提供了替代性生产策略。造血细胞和祖细胞扩增过程的自动化可为治疗适应症提供可靠数量的经选择的细胞。

此外，系统还可通过基于灌注的HFM生物反应器支持贴壁MSC以及悬浮CD3+T细胞和调节性T细胞的扩增。在本文所描述的CB来源的CD34+细胞扩增方法中，生物反应器的毛细管间(IC)HFM内腔可在细胞接种前涂覆人纤连蛋白(Fn)和趋化因子基质衍生因子1(SDF-1)的混合物，以模拟骨髓来源或Wharton’s Jelly来源的间充质基质细胞的刺激和归巢效应。随后可在悬浮培养条件下繁殖预选择的CB来源CD34+HSC，并在此过程中使其附着到经涂覆的HFM IC-表面，例如，与Fn-SDF-1修饰的表面接在一起。在某些情况下，固定的SDF-1可能是CD34+HSC通过VLA-4整合素与小鼠内皮细胞形成整合素介导的细胞粘附所必需的。在这种情况下，水凝胶固定SCF和SDF1α，同时在细胞培养表面引入PEG-RGD整合素识别序列，可以再现骨髓微环境的某些方面。本文所描述的实现方式和示例提供了用修饰的细胞外基质蛋白扩增CB来源的CD34+HSC的方法。

在一个例子中，提供了一种方法和/或系统，用于从混合的、阳性选择的CB来源的CD34+HSC开始，自动单培养扩增CB来源的HSC和祖细胞。这些细胞可在无血清培养基中重悬，并补充确定的造血细胞因子混合物，并在程序化但可修改的灌注方案下扩增8天，以例如在涂覆有Fn-SDF-1的HFM生物反应器系统中最小化T细胞分化。系统扩增的CB来源的CD34+HSC可产生足够数量的细胞，以支持单单位和双单位最小CD34+剂量当量，同时保留CD34+表型并最小的淋巴细胞频率。此外，在甲基纤维素测定条件下，这些CB来源的经扩增的祖细胞可展现出分化为成熟造血集落形成单位(CFU)的能力。

在示例实现方式中，可在灌注培养容积约124mL的约2.1m² HFM生物反应器中扩增三个主批次(master lots)的脐带血来源的、预选择的、混合的CD34+HSC，并使用自动悬浮细胞方案进行收获。细胞可通过确定的灌注方案引入HFM生物反应器的毛细管内回路(如IC回路)，并通过定制的逆流流体力学程序保持在生物反应器的内腔中。

如上所述，本公开的膜可用于有效地创建能捕获特定靶细胞或分子的膜。因此，本公开还提供了捕获细胞的方法。流程2400可在实施方式中进行以捕获细胞，如CD34+HSC。流程2400从步骤2404开始，并进行到步骤2414，在该步骤2414中可从生物反应器中去除经捕获的靶细胞(如HSC)。这些方法包括将靶物质(如细胞或分子)和非靶物质的混合物引入2406至本公开的膜上(如引入至中空纤维生物反应器的中空纤维中，其中每个中空纤维包括内部的内腔和毛细管外侧)。如上所详细描述的，这些膜包括位于该膜的至少一个表面上的涂层，该涂层包括促进细胞粘附的材料和蛋白部分中的至少一种。在使用中空纤维膜的情况下，中空纤维的内腔表面和毛细管外表面中的一者或两者可以涂覆有促进细胞粘附的材料和/或蛋白部分。

可使与膜接触的物质的混合物暴露2408于增强靶物质与膜缔合的条件(即“捕获条件”)2410。捕获条件的例子可包括pH、温度、张力(tonicity)的变化，和/或添加或减少能增强靶物质与膜缔合的化合物。实现捕获条件可有效地捕获膜表面(如中空纤维的内腔和毛细管外表面中的至少一个)上的至少一部分靶细胞。此后，至少一部分非靶物质可被冲洗出2412膜(如中空纤维的内腔)。在这些捕获方法中，靶物质例如可以是CD34+HSC，而非靶物质例如可以是其他细胞类型或细胞碎片或血液蛋白。

在这些捕获方法中，膜上促进细胞粘附到膜表面的涂覆材料可包括纤连蛋白。在这些捕获方法中，蛋白部分可以是基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、白介素-21(IL-21)、链霉亲和素、亲和素和抗生物素抗体或其功能片段中的至少一种。在这些捕获方法中，涂层可包括纤连蛋白和SDF-1。在这些捕获靶细胞物质(如CD34+HSC)的方法中，在从膜上冲洗出至少一部分非靶细胞后，可对经捕获的靶细胞进行扩增，例如，通过改变膜处的培养基和/或其他条件来增强经捕获的细胞(如CD34+HSC)的生长和扩增。这些捕获方法可包括从膜上去除至少一部分经捕获的靶物质(如CD34+HSC)。如上所描述，在捕获靶物质并冲洗以去除非靶物质后，或在捕获靶细胞物质后扩增后，可从膜上去除2414这些经捕获的物质。

本公开还提供了利用生物素和亲和素的相互作用捕获细胞的方法。这些方法包括将靶物质和非靶物质的混合物引入中空纤维。在这些方法中，每个中空纤维包括内部的内腔和毛细管外侧，并且中空纤维可包括位于中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层。在这些方法中，涂层可包括链霉亲和素、亲和素、生物素化分子和抗生物素抗体或其功能片段中的至少一种。在这些方法中，靶物质和/或非靶物质可以是细胞(如HSC)或分子。在这些方法中，靶物质与非靶物质的混合物可暴露于捕获条件，以捕获在中空纤维的内腔和毛细管外表面的至少一个上的至少一部分的靶物质。可将至少一部分的非靶物质从中空纤维冲洗出。在这些方法中，引入至中空纤维中的靶细胞可包括与位于中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层结合的生物素化适体或生物素化抗体。

靶物质为细胞的这些方法可包括，在将至少一部分非靶细胞冲洗出中空纤维后，将在中空纤维表面上捕获的那部分靶细胞暴露在生长条件下，以扩增在中空纤维中捕获的那部分靶细胞，从而生成多个经扩增的靶细胞。在这些方法中，在捕获靶细胞和冲洗非靶细胞后，可从中空纤维中去除至少一部分经捕获的靶细胞。

本公开还提供了在细胞扩增系统中通过灌注扩增细胞的方法。这些方法可包括用第一流体涂覆中空纤维生物反应器，其中第一流体包含信号传导因子和/或涂覆因子。可将多个细胞引入中空纤维生物反应器，其中中空纤维生物反应器包括中空纤维膜。可将多个细胞暴露于第二流体，其中第二流体包含多种生长因子。中空纤维生物反应器中的多个细胞可以单培养或共培养来生长。在这些方法中，第一流体可包含纤连蛋白和SDF-1中的至少一种。在这些方法中，在涂覆中空纤维生物反应器前，可将纤连蛋白与SDF-1混合在一起。在这些方法中，可通过用纤连蛋白涂覆中空纤维生物反应器并随后用SDF-1涂覆中空纤维生物反应器，来依次涂覆中空纤维生物反应器。在这些方法中，可通过用SDF-1涂覆中空纤维生物反应器并随后用纤连蛋白涂覆中空纤维生物反应器，来依次涂覆中空纤维生物反应器。在这些方法中，用于涂覆中空纤维生物反应器的纤连蛋白的量可以是0.001μg/cm²至2μg/cm²，或者0.01μg/cm²至1.0μg/cm²，或者0.10μg/cm²至0.50μg/cm²，或者0.20μg/cm²至0.40μg/cm²，或者0.23μg/cm²至0.24μg/cm²。在这些方法中，用于涂覆中空纤维生物反应器的SDF-1的量可以是0.001ng/cm²至0.30ng/cm²，或者0.01ng/cm²至0.10ng/cm²，或者0.05ng/cm²至0.09ng/cm²，或者0.075ng/cm²。

在这些方法中，第二流体可包含GDNF。在这些方法中，第二流体中的GDNF的量可以是0.001ng/mL至40.0ng/mL，或0.01ng/mL至20ng/mL，或0.10ng/mL至15ng/mL，或1.0ng/mL至15ng/mL，或5.0ng/mL至15ng/mL，或10ng/mL。

在这些方法中，多种生长因子可包括SCF、TPO、Flt-3L、IL-3和IL-6中的至少一种。在这些方法中，第二流体可包含StemRegenin(SR-1)。在这些方法中，第二流体中SR-1的量可以是0.001μM至3.0μM，或0.01μM至2.0μM，或0.10μM至1.0μM，或0.75μM。

在这些方法中，在将多个细胞引入中空纤维生物反应器之前，用5mg人血浆来源的纤连蛋白或0.23至0.24μg/cm²的纤连蛋白与0.075ng/cm²的重组人干细胞来源的因子1(SDF-1)的混合物涂覆中空纤维生物反应器预定的时间段。在这些方法中，预定的时间段是4.0小时至16.0小时，或8.0小时至12.0小时。

实施例

实施例1.系统中脐带血来源的CD34+HSC的短期扩增策略

在人源化、免疫缺陷的小鼠模型中，扩增8天或更短时间的人脐带血来源的CD34+造血干细胞(HSC)比扩增多于8天的细胞更容易成功植入。将脐带血来源的CD34+HSC扩增8天或更短时间后，使得BALB/C-RAG2 null Il-2r-gamma null小鼠模型人源化小鼠(Clinical Immunology,140:102-116,2011)显示出更一致的人造血和淋巴细胞植入。

实现方式提供用于减少或缩短扩增细胞(如CD34+HSC和/或CB-CD34+HSC)的时间，同时提高例如细胞产量、表型和功能性。实现方式提供，CB-CD34+HSC与间充质干细胞(MSC)(SDF-1的原位来源)共培养约14天的HSC的接种物扩增和系统扩增。进一步的实现方式提供用于在缩短单培养方案下改善产量、表型和功能性。例如，人脐带血来源的CD34+HSC可分两个阶段扩增：(1)在T25烧瓶中接种约1百万CB-CD34+HSC预扩增约3天，然后(2)通过使用纤连蛋白固定的SDF-1和其他生长因子/细胞因子的单培养技术，在/>细胞扩增系统中通过灌注来扩增存活的CD34+HSC约5天，以维持CD34+CD38-CD133+的HSC表型和相关的植入功能。例如，实现方式提供：(1)使用缩短的细胞扩增时间约8天：在烧瓶中扩增约3天，例如使用(1)固定的SDF-1信号传导因子与(2)新型生长因子混合物的偶联，在/>系统中扩增约5天，该新型生长因子混合物例如利用SCF、TPO、Flt-3L、IL-3、IL-6、GNDF±SR-1和它们的组合的一种或多种。在实现方式中，单培养方案，例如缩短的单培养方案，例如可以使用/>系统中的双向细胞再接种任务。

CD34+混合的细胞扩增

烧瓶研究

在示例中，进行了为期七天的试验性烧瓶研究。脐带血来源的CD34+HSC在37℃下，CO₂ CD34完全培养基中生长，无需摇动。细胞在第1天以1×10⁵个细胞/mL接种于7mL中，并在第7天收获。最佳产量被认为是5700000个细胞。CD34培养基产生11800000个细胞，而在完全培养基中以1:10稀释的CD34培养基产生9200000个细胞，以1:20稀释的CD34培养基产生5900000个细胞。未稀释、1:10稀释和1:20稀释的CD34培养基的细胞存活率分别为86.2％、90.3％和90.1％(n＝2每配备(arm)，细胞计数一式三份地进行)。

冻融研究

对解冻的、混合的脐带血来源的CD34+HSC(Stem Cell Technologies,Lot1907519003)进行扩增可行性测试。细胞(1.1×10⁶和2.1×10⁶CB来源的CD34+HSC分别在两个独立的单培养Quantum运行中接种，在T25烧瓶中使用纤连蛋白固定的SDF-1涂覆的表面、用加有改良的补充物混合物(StemSpan CD34+补充物，以1体积％加GDNF和SR-1)的SCGM培养基(Cat.20802-0500,CellGenix GmbH,Freiburg，德国)培养。在细胞接种之前，烧瓶和Quantum CES都要在37℃温度下用纤连蛋白-SDF-1蛋白混合物涂覆过夜。流体学方面，烧瓶处于静止状态，而Quantum系统则使用Quantum CES“涂覆生物反应器”任务(IC入口@0mL/min；IC循环@20mL/min，用Fn/SDF-1；EC入口@0.1mL/min，用PS；和EC循环@30mL/min；EC出口)灌注过夜(12-15小时)。细胞培养3天，并在系统中空纤维膜(HFM)生物反应器中培养5天。

在可行性研究中，针对含SCF、TPO、Flt-3L、IL-3、IL-6和GNDF并且含或不含SR-1混合物的两种培养基配方，评估它们以单培养支持CB来源CD34+HSC扩增的能力。两个实验配备都在T25烧瓶中接种了1×10⁶个细胞。第3天，Q1893(不含SR-1)系统和Q1894(含SR-1)/>系统分别从各自的烧瓶培养物中接种细胞。

第8天，不含SR-1的收获产量为4.49×10⁷个细胞(存活率98.5％)和含SR-1的收获产量为5.57×10⁷个细胞(存活率98.8％)。对冷冻保存的造血干细胞系统收获表型进行的流式细胞术分析表明，不含SR-1的CD34+细胞级分为1.40×10⁷个细胞或占总收获的31.1％；含SR-1的为2.1×10⁷个细胞或占总收获的37.7％。CD34+的最小和最大剂量分别为7000000和10500000个细胞。

实施例2.系统中脐带血来源的CD34+HSC的单培养扩增策略

实现方式提供了CB来源的CD34+HSC在系统的基于动态灌流的、2腔室的、半透的中空纤维膜(HFM)生物反应器的自动扩增方案，使用新型细胞因子混合物和纤连蛋白-SDF-1涂覆的膜，其中混合物可由SCF、TPO、Flt-3L、IL-3、IL-6组成，并且混合物还可补充有GDNF和SR-1。此外，毛细管内(IC)HFM内腔可涂覆有人纤连蛋白和趋化因子SDF-1的混合物，以模拟骨髓间充质基质细胞的刺激和归巢作用。

在对这种自动扩增方案进行的一系列测试中，在约124mL IC体积的约2.1m²的HFM生物反应器中扩增了三个主要批次的解冻的脐带血(CB)来源的、预选择的、混合的CD34+HSC，初始细胞接种2.0×10⁶个CD34+HSC。首先，将细胞重悬于补充有生长因子混合物的SCGM基础培养基中。细胞在37℃水浴中解冻，用23mL完全培养基洗涤，然后重悬于50mL完全无血清GMP SCGM培养基(Cat.20802-0500,CellGenix GmbH,Freiburg,德国)中，该培养基补充StemSpan CD34补充物10X(Cat.2691,Stem Cell Technologies,Vancouver,BC,加拿大)，其含有浓度为1体积％的重组人FMS-样酪氨酸激酶3配体(Flt3l)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素3(IL-3)和白介素6(IL-6)；浓度为10ng/mL的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)(Cat.212-GD-050,R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)；0.75μM的StemRegenin 1(SR-1)(Cat.72342,Stem Cell Technologies,Vancouver,加拿大)；以及1体积％的青霉素-链霉素-新霉素(PSN)抗生素混合物100X(Cat.15640-055,ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)。基础培养基可用无血清GMP SCGM配制，补充有SR-1和PSN抗生素混合物。

在接种CD34+HSC接种物之前，在温度37℃，混合气体(5％CO₂，20％O₂，余量N₂)的条件下，用在100mL PBS w/o Ca²⁺-Mg²⁺(Cat.17-516Q，Lonza Group，Walkersville，MD，USA)中的5mg人血浆来源的纤连蛋白(或0.23-0.24μg/cm²，Cat.356008，Corning LifeSciences，Corning，NY，USA)和0.075ng/cm²的重组人干细胞衍生因子1(SDF-1)(Cat.6448-SD，R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)的混合物涂覆过夜系统HFM生物反应器(21000cm²的S.A.)。

随后通过确定的灌注方案将细胞引入HFM生物反应器的毛细管内回路(如IC回路)，并通过定制的逆流流体力学程序使其保持在生物反应器的内腔中。在内腔和毛细管外培养基交换并调整(细胞扩增培养基在Quantum CES中进行调整，方法是通过Quantum系统生物反应器的IE/EC回路灌注来循环培养基至少10分钟，使用Quantum嵌入的任务“调整培养基”，循环速率如下：IC循环@100mL/min，EC循环@250mL/min，EC入口@0.1mL/min)后，在50mL完全培养基(含有以下细胞因子混合物的无血清GMP SCGM基础培养基：SCF、TPO、Flt-3L、IL-3、IL-6、GDNF和SR-1)中，将CB来源的CD34+HSC悬浮地接种到经涂覆的HFM生物反应器中。通过气体传输模块在EC回路中进行气体交换，平衡了生物反应器培养基中的混合气体(20％O₂、5％CO₂和余量N₂)，以单培养进行扩增，并在细胞培养的第8天使用系统自动任务进行收获，自动任务设置如以下表1至表3所示：

表1(放大的部分1/3)Quantum CD34+细胞接种任务

表1(放大的部分2/3)Quantum CD34+细胞接种任务

表1(放大的部分3/3)Quantum CD34+细胞接种任务

表2：Quantum CD34+细胞重分布和增加供养任务

表3：Quantum CD34+细胞收获

默认任务用于系统灌注，IC培养基/EC培养基交换，和培养基调整任务。在此过程中，葡萄糖和乳酸(lactate)水平由i-STAT分析仪G和CG4+盒(Abbott Point-of-Care,Princeton,NJ)监测。在细胞扩增期间，/>系统IC和EC的入口流速根据葡萄糖消耗量和乳酸生成速率以及自动任务的性质进行调整。该程序在约37℃温度下用约5％CO₂、约20％O₂和余量N₂的混合气体，持续时间仅约8天，以减少(即最小化)细胞培养过程中的T细胞分化。使用自动悬浮细胞方案收获细胞。

例如，Quantum系统入口流速可在约+0.1至约100mL/min的范围，而IC循环流速可在约-40至约300mL/min的范围。在细胞培养过程期间，相应的Quantum系统EC入口流速可在约0至约148mL/min的范围，而EC循环流速可在约-1.7mL/min至约300mL/min的范围。在扩增期间，可使用i-STAT分析仪(例如，Abbott Point-of-Care,Princeton,NJ,USA)分析葡萄糖和/或乳酸水平，如使用G和CG4+盒。收获时，对细胞进行计数(例如，使用Vi-CELL XR细胞分析仪，Beckman Coulter,Indianapolis,IN,USA)(图17)，其中包括通过胰蓝对细胞存活率进行定量(图18)，在CryoStor CS10冷冻培养基(例如，Biolife Solutions,Bothell,WA,USA)中低温保存，并在液氮气相中储存，直至进一步分析。

扩增结果

平均收获产量约为1.02×10⁸个细胞(范围约4.02×10⁷个细胞到约1.61×10⁸个细胞)，用胰蓝通过细胞存活率计数器(Vi-CELL^TMXR,Beckman Coulter)测定得到的平均细胞存活率为95.5％(范围约93.3％到约96.8％)。细胞扩增产量为4.0×10⁷-1.6×10⁸个细胞，超过了用于单单位植入的1.5×10⁵个细胞/kg的最低CD34+细胞剂量和用于双单位植入1.0×10⁵个细胞/kg的最低CD34+细胞剂量。对于体重70kg的患者，这相当于单单位和双单位植入的最低剂量分别为1.1×10⁷个CD34⁺HSC和1.4×10⁷个CD34⁺HSC。

平均细胞群倍增约为5.4倍，平均细胞群倍增时间约为34.9小时，在扩增期间，平均倍增可能为51.0倍(范围约20.1倍到约80.5倍)。IC培养基输入灌注流速根据葡萄糖和乳酸代谢物进行调整，范围约0.1至约0.2mL/min。

中位脐带血单位(CBU)可包含约4.4×10⁶个CD34+HSC，最多可达约2.0×10⁷个CD34+HSC。使用本文所描述的方法和系统，单个CBU的平均扩增产量可达到2.2×10⁸至1.0×10⁹CB来源的干细胞或祖细胞的数量级，例如，在自动8天单培养细胞扩增方案中，只需将细胞接种物从2.0×10⁶个细胞增加到4.4×10⁶-2.0×10⁷个细胞，具有完全CBU CD34⁺细胞级分。此外，这种方法可将灌注生物反应器中的细胞接种密度从例如1.6×10⁴个细胞/mL提高到3.6×10⁴-1.6x 10⁵个细胞/mL，从而缩短扩增时间框，降低细胞分化的可能性。

冷冻保存

对比不同UCB供体的CD34⁺HSC收获量和冷冻保存前的存活率，发现扩增产量和冷冻保存前细胞存活率之间存在一定的关系(图19)。在收获时使用BC Vi-CELL XR细胞分析仪通过胰蓝染料排除法测量Quantum CES CD34+细胞存活率。冷冻保存前CD34+细胞存活率的范围很广。在我们的研究中，冷冻保存前的细胞存活率范围在84％到98％。在QuantumCES中扩增CB来源的CD34+HSC产生了95％的平均收获细胞存活率。

糖酵解代谢

对糖酵解代谢的监测显示，葡萄糖消耗率可能从0到第5天高至0.596，乳酸生成率可能从0到第8天高至0.650mmol/天(图20)。这两种代谢物峰值天数的差异可归因于培养基流速的调整、控制糖酵解通量的酶的不同表达以及细胞扩增期间对中心生物合成代谢物的需求。

免疫分型

将来自三(3)个自动的CB来源的CD34+细胞扩增中的每个的解冻细胞收获样品以1×10⁶个细胞在完全培养基中重悬和洗涤，500g离心5分钟，在100μL BD流动染色缓冲液中重悬，用5μL人BD Fc封闭10分钟，然后用以下缀合染色剂染色：BD Pharmingen抗人CD45-APC-H7(Cat.560178)、抗人CD34-APC(Cat.560940)、抗人CD133-PE(Cat.566593)、抗人CD38-BB515(Cat.564499)、抗人CD41a-APC-H7(Cat.561422)、抗人CD3-PE(Cat.555333)、抗人CD19-PE(Cat.555413)、抗人CD56(555516)、抗人CD15-BB515(Cat.565236)和7-AAD(Cat.559925)。在对经扩增的细胞进行免疫分型时，可参考流式细胞仪计CD34+HSC的ISHAGE-圈选指南，且CD34+HSC群可从属于CD45+母细胞群(Cytometry,34:61-70,1998)。此外，CD34+圈选策略还通过CD-Chex CD34外周血对照进行了验证(Streck，CD-Chex CD34，水平3)。使用BD FACSDiva v9.0软件(1000个事件/样品)在BD FACSCanto II流式细胞仪上采集细胞样品数据，随后使用FlowJo v10.7软件进行分析。

如表1及图21A和图21B所示，流式细胞仪表明，在自动培养第8天收获时，CD45+/CD34+免疫表型的平均频率为54.3％(范围为51.9至57.9％)，更原始的CD133⁺CD38^-免疫表型的平均频率为31.8％(范围为25.9至39.0％)。这些结果在UCB来源的细胞培养中使用SR-1(CD34⁺HSC 10-25％)培养基的其他CD34⁺HSC 7天扩增方案和使用烟酰胺(CD34+HSC 0.2-4.4％)培养基的21天CD34+CD38-扩增方案相比是有利的。分化细胞系的平均频率为：淋巴细胞(CD3⁺、CD19⁺、CD56⁺)0.5％，中性粒细胞(CD15⁺)27.7％，血小板(CD41a⁺)26.5％。中性粒细胞和血小板的生物标志物可能均存在于扩增的CB来源CD34+HSC群体中，这部分归因于扩增培养基的细胞因子组成，其含有白介素IL-3和IL-6。虽然这两种细胞因子用于支持CD34+细胞扩增，但它们也与髓系细胞系的发育有关。

表1.细胞群层次&统计

细胞类型	百分比
		HSC	56.0
单细胞	97.0
		活细胞	96.3
CD45+	99.5
		CD34+	51.9
CD133^高CD38^低	30.6

体外CB-CD34+克隆分化

MethoCult^TMCD34+细胞分化造血集落形成单位(CFU)测定是用MethoCult^TMH4034最佳培养基进行的，该最佳培养基可补充有rh-细胞因子SCF、GM-CSF、IL-3、G-CSF和EPO(Stem Cell Technologies,Vancouver,BC,加拿大)。细胞生成了GEMM、GM、BFU-E CFU的造血祖细胞系。

简言之，Quantum收获的UCB来源CD34+HSC可以洗涤、重悬于IMDM w/2％FBS中、稀释于基于甲基纤维素培养基、涡旋、并以1.1mL/35mm孔的培养基量接种于多孔板中，接种密度分别为150、500和1000细胞/孔。将CFU板放在37℃、5％ CO2、湿度条件下的静态孵育箱中孵育14天后，可使用Olympus CKX41倒置显微镜以4x物镜放大率并用cellSens2.2软件对每孔中的CFU进行人工计数和评分(n＝6)。

在MethoCult Optimum H4034细胞因子培养基中进行14天的基于甲基纤维素的细胞培养后，在三个经扩增的CB来源的CD34+细胞系中，CB来源的CD34+细胞分化的CFU占总CFU平均为：GM 56％、GEMM 23％，和BFU-E祖细胞系21％(参见例如图22和图23)。这些CFU例子的结果与之前对电穿孔、基因未修饰的CB来源的CD34+HSC的用甲基纤维素H4034细胞因子分化的研究结果相当，在这些研究中，大多数细胞系可能是GM-CFU(60％)克隆，其次是BFU-E(36％)和GEMM-CFU(10％)克隆，和/或大多数转基因和未转基因克隆也可能是GM-CFU(60％)，其次是BFU-E(18-20％)和GEMM-CFU(5％)克隆。这些研究中CFU克隆相对分布的差异可归因于供体CBU细胞来源、干细胞选择方法、某些情况下的基因修饰以及分化前扩增CB来源CD34+HSC时使用的细胞因子混合物配方的不同。除SR-1外，其他与细胞因子配制的小分子补充物可包括烟酰胺(一种SIRT1组蛋白去乙酰化酶和核糖核苷酸酶抑制剂)、丙戊酸(一种组蛋白HDAC1抑制剂)和UM171(一种组蛋白HDAC1去乙酰化和LSD1去甲基化抑制剂)，它们可作为造血干细胞培养的选择，以增加CB-来源CD34+细胞扩繁并改善植入。

对收获的细胞进行的MethoCult^TM分化测试，可生成GEMM、GM、BFU-E CFU的造血祖细胞系。这些结果从整体上证明，自动化系统单培养方案可支持预选择的CB来源CD34+HSC的扩增，达到单CBU和双CBU剂量当量，且淋巴细胞残留极少。

对于本领域的技术人员来说，显然可以对本发明的方法和结构进行各种修改和变型，而不会偏离其范围。因此，应该理解的是，本发明并不局限于所给出的具体实施例。相反，本发明旨在覆盖权利要求及其等同物范围内的修改和变化。

虽然已经对本发明的示例实现方式和应用进行了说明和描述，但应该理解的是，本发明并不局限于上述的精确构造和资源。在不脱离本发明范围的前提下，可以对本文所公开的本发明方法和系统的布置、操作和细节进行本领域技术人员显而易见的各种修改、变更和变化。

Claims

1.一种扩增细胞的方法，包括：

将含CD34+造血干细胞(HSC)的第一多个细胞引入至中空纤维生物反应器的中空纤维中，

其中，每个所述中空纤维包括内部的内腔和毛细管外侧，并且

其中，所述中空纤维包括位于所述中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层，其中所述涂层包括：

基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，和

纤连蛋白或其亚型，或其功能等同物；

使所述中空纤维中的第一多个细胞暴露于生长条件下；以及

使所述生物反应器的中空纤维中的所述第一多个细胞的至少一部分扩增，以生成扩增至少50倍的第二多个经扩增的CD34+HSC。

2.权利要求1所述的方法，其中，将所述第一多个细胞在未经任何在先纯化的情况下引入至多个中空纤维。

3.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述生长条件包括使所述第一多个细胞暴露于选自以下项组成的组的一种或多种生长因子：FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、胶质源性神经营养因子(GDNF)及它们的组合。

4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述中空纤维中的细胞暴露于生长条件下包括循环细胞生长培养基穿过所述中空纤维的内腔。

5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述中空纤维中的细胞暴露于生长条件下包括循环细胞生长培养基穿过所述中空纤维的毛细管外侧。

6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将细胞引入至所述中空纤维包括：

用泵使多个细胞在所述中空纤维的内腔中循环；

停止泵，以使所述多个细胞的一部分附着至所述中空纤维的内腔的第一部分；

将所述中空纤维生物反应器从初始位置旋转180度；

用泵使多个细胞在所述中空纤维的内腔中循环；以及

停止泵，以使所述多个细胞的一部分附着至所述中空纤维的内腔的第二部分。

7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述中空纤维的两端同时引入所述多个细胞。

8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，位于所述中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层进一步包括促进细胞粘附至所述中空纤维的表面的材料。

9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，位于所述中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层进一步包括蛋白部分。

10.权利要求9所述的方法，其中，所述蛋白部分是白介素-21(IL-21)。

11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，扩增所述中空纤维中的细胞包括使所述中空纤维中的CD34+HSC与含GDNF和芳基烃受体拮抗剂的培养基接触。

12.权利要求11所述的方法，其中，所述芳基烃受体拮抗剂是StemRegenin 1(SR1)和UM171中的至少一种。

13.权利要求11或12所述的方法，其中，所述培养基进一步包含SCF、TPO、Flt-3L、IL-3、IL-6、SDF-1和纤连蛋白中的至少一种。

14.权利要求11至13中任一项所述的方法，其中，GDNF在所述培养基中的浓度为0.5重量/体积％至2重量/体积％。

15.权利要求11至13中任一项所述的方法，其中，GDNF在所述培养基中的浓度为至少10ng/mL。

16.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述中空纤维包括所述内腔中的第一培养基和与所述中空纤维的毛细管外侧接触的第二培养基。

17.权利要求16所述的方法，其中，相对于所述中空纤维的毛细管外侧至少一种组分的浓度，所述内腔中的培养基的相同组分是被浓缩的。

18.权利要求17所述的方法，其中，所述组分是GDNF。

19.权利要求17所述的方法，其中，所述组分选自由SR-1、SCF、TPO、Flt-3L、IL-3、IL-6、SDF-1和纤连蛋白组成的组。

20.权利要求17至19中任一项所述的方法，其中，所述至少一种组分被浓缩至少五倍。

21.权利要求17至19中任一项所述的方法，其中，所述至少一种组分被浓缩至少十倍。

22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述中空纤维中的CD34+HSC以单培养扩增，并且没有额外类型的细胞在所述中空纤维中与CD34+HSC共培养。

23.权利要求22所述的方法，其中，所述中空纤维包括位于所述中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层，所述涂层包括SDF-1和纤连蛋白。

24.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，在将所述第一多个细胞引入所述中空纤维前，将间充质干细胞引入所述中空纤维；

使所述中空纤维中的间充质干细胞暴露于生长条件下；

随后将含CD34+HSC的多个细胞引入多个中空纤维，以在所述中空纤维中共培养含CD34+HSC的细胞和所述间充质干细胞。

25.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，在将细胞引入所述中空纤维前，使第一多个间充质干细胞在静态生长室中生长；

使与所述间充质干细胞共培养的CD34+HSC在所述静态生长室中生长；

从所述静态生长室中去除含CD34+HSC的多个细胞；以及

将所述含CD34+HSC的多个细胞从所述静态生长室引入所述中空纤维。

26.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述含CD34+HSC的多个细胞获得自脐带血、骨髓和外周血中的至少一种。

27.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，被扩增的CD34+HSC是CD45+/CD34+HSC。

28.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，被扩增的CD34+HSC是CD133+CD38-祖细胞。

29.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，含CD34+HSC的第一多个细胞来自单一单位的血液或组织，并且经扩增的CD34+HSC足以用于人类受体的至少一次植入过程。

30.权利要求29所述的方法，其中，所述单一单位的血液是脐带血。

31.权利要求30所述的方法，其中，所述单一单位的组织是骨髓。

32.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，CD34+HSC在扩增后有至少90％的存活率。

33.前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述中空纤维的内腔涂覆有糖蛋白。

34.前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括从所述中空纤维去除至少一部分的第二多个经扩增的细胞。

35.权利要求34所述的方法，进一步包括将从所述中空纤维去除的第二多个经扩增的细胞施用至患者。

36.权利要求35所述的方法，其中，所述施用在所述患者中重建造血功能。

37.一种捕获细胞的方法，所述方法包括：

将靶细胞与非靶细胞的混合物引入中空纤维生物反应器的中空纤维，其中，每个所述中空纤维包括内部的内腔和毛细管外侧，

基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和

纤连蛋白或其亚型，或其功能等同物；

使所述混合物暴露于捕获条件；

在所述中空纤维的内腔和毛细管外表面的至少一个上捕获所述靶细胞的至少一部分；以及

从所述中空纤维冲洗出所述非靶细胞的至少一部分。

38.权利要求37所述的方法，其中，所述涂层进一步包括蛋白部分，所述蛋白部分选自由白介素-21(IL-21)、链霉亲和素、亲和素和抗生物素抗体或其功能片段组成的组。

39.权利要求37或38所述的方法，进一步包括：在从所述中空纤维冲洗出所述非靶细胞的至少一部分后，使所捕获的所述靶细胞的部分暴露于生长条件；以及

扩增所述中空纤维中所捕获的所述靶细胞的部分，以生成多个经扩增的靶细胞。

40.权利要求37至39中任一项所述的方法，进一步包括：在扩增所述中空纤维中所捕获的所述靶细胞的部分后，从所述中空纤维去除至少一部分的所述多个经扩增的靶细胞。

41.一种经涂覆的中空纤维膜，包括：

中空纤维膜，具有内腔表面和毛细管外表面；

基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，和

纤连蛋白或其亚型，或其功能等同物。

42.权利要求41所述的经涂覆的中空纤维膜，其中，所述涂层进一步包括蛋白部分，所述蛋白部分选自由细胞因子、适体、趋化因子、单克隆抗体、链霉亲和素、亲和素、生物素化分子和抗生物素抗体或其功能片段组成的组。

43.权利要求42所述的经涂覆的中空纤维膜，其中，所述趋化因子是基质细胞衍生因子-1(SDF-1)或白介素-21(IL-21)。

44.权利要求41至43中任一项所述的经涂覆的中空纤维膜，其中，所述膜包括聚砜或聚醚砜中的至少一种。

45.一种形成经涂覆的中空纤维膜的方法，包括：

提供中空纤维膜，所述中空纤维膜具有内腔表面和毛细管外表面；

在所述中空纤维膜的内腔表面上施加第一涂层，其中，所述第一涂层包括促进细胞粘附至所述中空纤维膜的内腔和所述中空纤维膜的毛细管外表面的至少一个的材料；以及

在所述中空纤维膜的内腔表面上施加第二涂层，其中所述第二涂层包括可溶性蛋白部分。

46.权利要求45所述的方法，其中施加所述第一涂层和第二涂层材料包括：

使第一涂层材料和所述第二涂层材料缀合成所述中空纤维膜之外的缀合物；以及

将所述缀合物涂覆在所述中空纤维膜的内腔表面上。

47.权利要求45或46所述的方法，其中，所述第一涂层材料是纤连蛋白，或其亚型，或其功能等同物。

48.权利要求45至47中任一项所述的方法，其中，所述第二涂层材料包括细胞因子、适体、趋化因子、单克隆抗体、链霉亲和素、亲和素、生物素化分子和抗生物素抗体或其功能片段中的至少一种。

49.权利要求45至48中任一项所述的方法，其中，所述第一涂层是纤连蛋白，并且其中，所述第二涂层包括基质细胞衍生因子-1(SDF-1)或白介素-21(IL-21)。

50.一种用于扩增CD34+HSC的组合物，包含胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和芳基烃受体(AHR)拮抗剂。

51.权利要求50所述的组合物，进一步包含SCF、TPO、Flt-3L、IL-3、IL-6、SDF-1和纤连蛋白中的至少一种。

52.权利要求50或51所述的组合物，其中，所述AHR拮抗剂是SR-1和UM171中的至少一种。

53.权利要求50至52中任一项所述的组合物，其中，GDNF以0.5重量/体积％至2重量/体积％的浓度存在。

54.权利要求50至53中任一项所述的组合物，其中，GDNF以至少10ng/mL的浓度存在。

55.权利要求50至54中任一项所述的组合物，其中，纤连蛋白和SDF-1固定在细胞培养表面上。

56.权利要求55所述的组合物，其中，所述细胞培养表面是半透膜。

57.权利要求50至56中任一项所述的组合物，其中，所述组合物提高BCL2的水平并抑制HSC分化。

58.一种在细胞扩增系统中通过灌注来扩增细胞的方法，所述方法包括：

用第一流体涂覆中空纤维生物反应器，其中所述第一流体包含信号传导因子和/或涂覆因子；

将多个细胞引入所述中空纤维生物反应器，其中所述中空纤维生物反应器包括中空纤维膜；

使所述多个细胞暴露于第二流体，其中所述第二流体包含多种生长因子；以及

以单培养或共培养的方式使所述多个细胞在所述中空纤维生物反应器中生长。

59.权利要求58所述的方法，其中，所述第一流体包含纤连蛋白和SDF-1中的至少一种。

60.权利要求59所述的方法，其中，在涂覆所述中空纤维生物反应器前，将纤连蛋白与SDF-1混合在一起。

61.权利要求59所述的方法，其中，通过用纤连蛋白涂覆所述中空纤维生物反应器并随后用SDF-1涂覆所述中空纤维生物反应器，来依次涂覆所述中空纤维生物反应器。

62.权利要求59所述的方法，其中，通过用SDF-1涂覆所述中空纤维生物反应器并随后用纤连蛋白涂覆所述中空纤维生物反应器，来依次涂覆所述中空纤维生物反应器。

63.权利要求59至62中任一项所述的方法，其中，用于涂覆所述中空纤维生物反应器的纤连蛋白的量是0.001μg/cm²至2μg/cm²。

64.权利要求59至62中任一项所述的方法，其中，用于涂覆所述中空纤维生物反应器的纤连蛋白的量是0.01μg/cm²至1.0μg/cm²。

65.权利要求59至62中任一项所述的方法，其中，用于涂覆所述中空纤维生物反应器的纤连蛋白的量是0.10μg/cm²至0.50μg/cm²。

66.权利要求59至62中任一项所述的方法，其中，用于涂覆所述中空纤维生物反应器的纤连蛋白的量是0.20μg/cm²至0.40μg/cm²。

67.权利要求59至62中任一项所述的方法，其中，用于涂覆所述中空纤维生物反应器的纤连蛋白的量是0.23μg/cm²至0.24μg/cm²。

68.权利要求59至67中任一项所述的方法，其中，用于涂覆所述中空纤维生物反应器的SDF-1的量是0.001ng/cm²至0.30ng/cm²。

69.权利要求59至67中任一项所述的方法，其中，用于涂覆所述中空纤维生物反应器的SDF-1的量是0.01ng/cm²至0.10ng/cm²。

70.权利要求59至67中任一项所述的方法，其中，用于涂覆所述中空纤维生物反应器的SDF-1的量是0.05ng/cm²至0.09ng/cm²。

71.权利要求59至67中任一项所述的方法，其中，用于涂覆所述中空纤维生物反应器的SDF-1的量是0.075ng/cm²。

72.权利要求59至71中任一项所述的方法，其中，所述第二流体包含GDNF。

73.权利要求72所述的方法，其中，所述第二流体中GDNF的量是0.001ng/mL至40.0ng/mL。

74.权利要求72所述的方法，其中，所述第二流体中GDNF的量是0.01ng/mL至20ng/mL。

75.权利要求72所述的方法，其中，所述第二流体中GDNF的量是0.10ng/mL至15ng/mL。

76.权利要求72所述的方法，其中，所述第二流体中GDNF的量是1.0ng/mL至15ng/mL。

77.权利要求72所述的方法，其中，所述第二流体中GDNF的量是5.0ng/mL至15ng/mL。

78.权利要求72所述的方法，其中，所述第二流体中GDNF的量是10ng/mL。

79.权利要求58至78中任一项所述的方法，其中，所述多种生长因子包括SCF、TPO、Flt-3L、IL-3和IL-6中的至少一种。

80.权利要求58至78中任一项所述的方法，其中，所述第二流体包含StemRegenin(SR-1)。

81.权利要求80所述的方法，其中，所述第二流体中SR-1的量是0.001μM至3.0μM。

82.权利要求80所述的方法，其中，所述第二流体中SR-1的量是0.01μM至2.0μM。

83.权利要求80所述的方法，其中，所述第二流体中SR-1的量是0.10μM至1.0μM。

84.权利要求80所述的方法，其中，所述第二流体中SR-1的量是0.75μM。

85.权利要求58至84中任一项所述的方法，在将所述多个细胞引入所述中空纤维生物反应器之前，所述方法包括：

用5mg人血浆来源的纤连蛋白或0.23至0.24μg/cm²的纤连蛋白与0.075ng/cm²的重组人干细胞来源的因子1(SDF-1)的混合物涂覆所述中空纤维生物反应器预定的时间段。

86.权利要求85所述的方法，其中，所述预定的时间段是4.0小时至16.0小时。

87.权利要求85所述的方法，其中，所述预定的时间段是8.0小时至12.0小时。

88.一种包括中空纤维生物反应器的细胞扩增系统，所述中空纤维生物反应器配置为执行权利要求58至87中任一项所述的方法。

89.权利要求87所述的细胞扩增系统，进一步包括：

处理器；和

内存，其与所述处理器通信并可能够被所述处理器读取，并且包含一系列指令，当所述指令被所述处理器执行时，使所述处理器执行权利要求58至88中任一项所述的方法。

90.一种捕获靶物质的方法，所述方法包括：

将靶物质与非靶物质的混合物引入中空纤维中，其中，每个所述中空纤维包括内部的内腔和毛细管外侧，

其中，所述中空纤维包括位于所述中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层，其中所述涂层包括链霉亲和素、亲和素、生物素化分子和抗生物素抗体或其功能片段中的至少一种，

使所述混合物暴露于捕获条件；

在所述中空纤维的内腔和毛细管外表面的至少一个上捕获所述靶物质的至少一部分；以及

从所述中空纤维冲洗出所述非靶物质的至少一部分。

91.权利要求90所述的方法，其中，所述靶物质包括与位于中空纤维的内腔表面和毛细管外表面的至少一个上的涂层结合的生物素化适体或生物素化抗体。

92.权利要求90或91所述的方法，其中，所述靶物质是细胞并且所述方法进一步包括：在从所述中空纤维冲洗出所述非靶物质的至少一部分后，使所捕获的细胞部分暴露于生长条件；以及

所述中空纤维中扩增所捕获的细胞部分，以生成多个经扩增的靶细胞。

93.权利要求92所述的方法，进一步包括：在所述中空纤维中扩增所捕获的靶细胞部分后，从所述中空纤维去除至少一部分的所述多个经扩增的靶细胞。