WO2015029790A1

WO2015029790A1 - 多孔性セルロース粒子の製造方法および多孔性セルロース粒子

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Publication number: WO2015029790A1
Application number: PCT/JP2014/071394
Authority: WO
Inventors: 徹倉林; 茂之青山; 昭博内田
Original assignee: Jnc株式会社
Priority date: 2013-09-02
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2015-03-05
Also published as: EP3042925B1; JPWO2015029790A1; EP3042925A1; JP6369467B2; EP3042925A4; US20160200835A1; US11685793B2; CN105518059A; CN105518059B

Abstract

　一実施形態によると、　（ａ）二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、ニ酢酸セルロース溶液を調製することと、　（ｂ）前記二酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質中に分散させて、分散系を得ることと、　（ｃ）前記分散系を冷却することと、　（ｄ）冷却された前記分散系に貧溶媒を添加することにより、ニ酢酸セルロース粒子を析出させることと　（ｅ）前記二酢酸セルロース粒子を鹸化することとを含む、多孔性セルロース粒子の製造方法が提供される。

Description

多孔性セルロース粒子の製造方法および多孔性セルロース粒子

　本発明は、多孔性セルロース粒子の製造方法および該方法により製造され得る多孔性セルロース粒子に関する。

　多孔性セルロース粒子は、酸性溶媒および塩基性溶媒に耐性があり、また、修飾することで様々な置換基を付加させることができる。そのため、様々な物質に対する吸着体として、各種物質の分離、精製、脱塩等の広い分野で利用されている。多孔性セルロース粒子の利用分野として、例えば、ゲル濾過法（分子サイズの差によって物質を分別する方法）が挙げられる。ゲル濾過法は、水溶液および有機溶媒のいずれに対しても応用でき、また、どのような分子量の化合物に対しても適用できる。そのため、実験室的のみならず工業的規模でも広く利用されている（特許文献１）。

　また、多孔性セルロース粒子は、吸着特性に優れ、機械的強度が比較的大きいことから、工業的に利用可能な抗体医薬品精製用吸着体（特許文献２）や、インフルエンザなどのウイルス吸着体（特許文献３）への応用も注目されている。

　多孔性セルロース粒子を製造する際の原料としては、結晶性セルロースまたは三酢酸セルロースが使用されるのが一般的である。しかしながら、これら原料を溶解できる溶媒は限られるため、製造工程においてセルロース溶液を調製する際、有害性の高い溶媒を使用せざるを得ないのが現状である。例えば、結晶性セルロースの溶媒としてはチオシアン酸カルシウム水溶液が挙げられ（特許文献４）、三酢酸セルロースの溶媒としては塩素化炭化水素が挙げられるが（特許文献５）、これら溶媒はいずれも有害性が高い。

　このような状況に鑑み、近年、原料セルロースの溶媒としてイオン性液体などを使用する方法も報告されている（特許文献６）。しかしながら、新たに提案されている溶媒は、高価であり、取り扱いも困難である。
　さらに、原料セルロースとして二酢酸セルロースを使用した製造方法も報告されている（特許文献５、７、８）。しかしながら、特許文献５に記載の方法は、酢酸セルロースの溶媒として有害性の高い物質を使用している。特許文献７に記載の方法は、特殊な設備や特殊な条件を必要とする。また、特許文献８に記載の方法も、セルロースエステルで作られたフィラメントを非常に高い温度で溶融しており、特殊な設備を必要とする。このように、従来の方法は、コストや環境負荷の点で問題を有するため、設備化が容易ではないのが現状である。

特開昭５６－２４４３０号公報国際公開第０８／１４６９０６号特開２０１１－２２０９９２号公報特開昭５５－４４３１２号公報特開平６－２５４３７３号公報特開２０１２－８７２０２号公報特開平１－２７７５７０号公報特開昭５５－４０６１８号公報

　上記のような背景のもと、有害な溶媒を使用することなく、より簡便に多孔性セルロース粒子を製造することができる方法が求められている。さらに、様々な物質に対して適用可能な吸着体を得るためには、多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を容易に制御し得る方法であることが望ましい。

　本発明は、例えば以下の通りである。
［１］　（ａ）二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、二酢酸セルロース溶液を調製することと、
　（ｂ）前記二酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質中に分散させて、分散系を得ることと、
　（ｃ）前記分散系を冷却することと、
　（ｄ）冷却された前記分散系に貧溶媒を添加することにより、二酢酸セルロース粒子を析出させることと、
　（ｅ）前記二酢酸セルロース粒子を鹸化することと
を含む、多孔性セルロース粒子の製造方法。
［２］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は、酢酸水溶液、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の水性溶媒；シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル等の有機溶媒；およびこれらの混合物からなる群より選択される［１］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［２－１］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は、酢酸水溶液またはシクロヘキサノンである［２］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［３］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は酢酸水溶液であり、前記酢酸水溶液における酢酸の含量は、前記酢酸水溶液に対して８０～９５重量％である［２－１］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［４］　（ｄ）において、前記貧溶媒は、水、アルコール類、グリコール類またはこれらの混合液である、［１］～［３］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［５］　（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は、水または有機媒質である［１］～［４］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［６］　（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は有機媒質であり、前記有機媒質は、トルエンまたはｏ－ジクロロベンゼンである［５］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［６－１］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は、酢酸水溶液、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の水性溶媒であり、（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は、トルエン、ｏ－ジクロロベンゼン、キシレン等の有機媒質である［５］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［６－２］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は、シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル等の有機溶媒であり、（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は、水等の水性媒質である［５］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［７］　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、酢化度が４５～５７％である［１］～［６－２］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［８］　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液における二酢酸セルロースの含量は、前記二酢酸セルロース溶液に対して３～２０重量％である［１］～［７］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［９］　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、２５℃～１００℃の温度で前記溶媒に溶解される、［１］～［８］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［１０］　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、４０℃～１００℃の温度で前記溶媒に溶解される、［９］に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［１０－１］　（ｂ）において、前記分散媒の温度は４０～１００℃である、［１］～［１０］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［１１］　（ｃ）において、前記冷却は、０～４０℃の温度に冷却することにより行う［１］～［１０－１］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
［１２］　［１］～［１１］のいずれかに記載の多孔性セルロース粒子の製造方法により製造され得る多孔性セルロース粒子。
［１３］　（ａ）における前記二酢酸セルロース溶液中の二酢酸セルロースの含量は、前記二酢酸セルロース溶液に対して６～１２重量％であり、（ｃ）における前記冷却は、０～３０℃の温度に冷却することにより行われ、分子量８０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．０１以上０．５２以下であり、かつ分子量１２０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．００１以上０．４５以下である［１２］に記載の多孔性セルロース粒子。
［１４］　［１２］または［１３］に記載の多孔性セルロース粒子または修飾された前記多孔性セルロース粒子を含む、クロマトグラフィー用充填剤。
［１４－１］　前記修飾は、硫酸基またはスルホン酸基含有基によって行われる［１４］に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［１５］　ウイルス粒子を分離精製するために使用される、［１４］または［１４－１］に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［１６］　硫酸基またはスルホン酸基含有基によって修飾され、且つ修飾された多孔性セルロース粒子に対するＳ含量が８００～５０００μｇ／ｇである修飾された多孔性セルロース粒子を含む、インフルエンザウイルス粒子またはＢ型肝炎ウイルス粒子の分離精製用の［１５］に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［１６－１］　（ａ）二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、二酢酸セルロース溶液を調製することと、
　（ｂ）前記二酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質中に分散させて、分散系を得ることと、
　（ｃ）前記分散系を冷却することと、
　（ｄ）冷却された前記分散系に貧溶媒を添加することにより、二酢酸セルロース粒子を析出させることと、
　（ｅ）前記二酢酸セルロース粒子を鹸化して多孔性セルロース粒子を得ることと、
　（ｆ）前記多孔性セルロース粒子を硫酸基またはスルホン酸基含有基によって修飾することと
を含む、［１６］に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。

　本発明によれば、多孔性セルロース粒子を、有害な溶媒を使用することなく、より簡便な方法で得ることができる。また、本発明の方法によれば、多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を容易に制御することが可能である。

図１は、実施例１～３で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。図２は、実施例６～９で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。図３は、冷却温度と多孔性セルロース粒子の粒径との関係を示す図である。図４は、実施例２、６、８および９で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。図５は、実施例２ならびに比較例１および２で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。

　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。　
　まず、本発明の１つの態様に係る多孔性セルロース粒子の製造方法について説明する。本発明の多孔性セルロースの製造方法は、以下の（ａ）～（ｅ）の工程を、この順で含む：
　（ａ）二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、二酢酸セルロース溶液を調製することと、
　（ｂ）前記二酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質中に分散させて、分散系を得ることと、
　（ｃ）前記分散系を冷却することと、
　（ｄ）冷却された前記分散系に貧溶媒を添加することにより、酢酸セルロース粒子を析出させることと
　（ｅ）前記酢酸セルロース粒子を鹸化すること。
　以下、上記各工程について順に説明する。

　［（ａ）の工程］
　（ａ）においては、原料の二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、二酢酸セルロース溶液を調製する。酢酸セルロースは、天然の高分子であるセルロースを酢酸エステル化することにより得られる半合成高分子である。工業的に広く使用されている酢酸セルロースは、二酢酸セルロースと三酢酸セルロースの２種類に大きく分けられ、その一般的な酢化度は、それぞれ約５０～５７％および約６０～６２％である。本発明の方法では、原料として、二酢酸セルロースを使用する。本発明において使用される二酢酸セルロースは、一般的に二酢酸セルロースと定義され得るものであれば特に限定されないが、酢化度が４５～５７％であることが好ましく、５３～５６％であることがより好ましい。酢化度が４５～５７％である二酢酸セルロースを使用することにより、より多くの種類の溶剤に溶解させることができる。

　具体的には、リンターパルプ、木材パルプ等を酢酸および／または無水酢酸で酢化し、さらに部分鹸化することにより得られる二酢酸セルロースを使用することができる。この場合、酢化度が上記範囲になるよう、エステル化の程度を適宜調節することができる。例えば、特開昭６２－０００５０１号公報を参照されたい。

　二酢酸セルロースを溶解する溶媒としては、二酢酸セルロースを溶解できるものであれば特に限定されないが、有害性の低い溶媒が好ましい。二酢酸セルロースは、三酢酸セルロースと異なり、使用可能な溶媒の範囲が広く、その中から有害性の低い溶媒を選択して使用することができる。溶媒は、１種類を単独で使用しても、２種類以上の溶媒を混合して使用してもよい。具体的には、酢酸水溶液、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の水性溶媒；シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル等の有機溶媒；およびこれらの混合物を挙げることができる。中でも、入手のし易さおよび取扱い易さ等の理由により、酢酸水溶液またはシクロヘキサノンが特に好ましい。

　二酢酸セルロースの溶媒として酢酸水溶液を使用する場合、酢酸の含量は、酢酸水溶液に対して８０～９５重量％であることが好ましい。酢酸水溶液の濃度を上記範囲にすることは、溶解性および作業時の温度管理などの点で好ましい。すなわち、酢酸水溶液の濃度を上記範囲とすることにより、二酢酸セルロースを首尾よく溶解することができる。

　上記のように、本発明によると、有害性の低い溶媒を使用することが可能であるため、より安全に多孔性セルロース粒子を製造することができる。また、有害性の低い溶媒を使用することは、環境保護の観点からも好ましいと言える。

　ニ酢酸セルロース溶液における二酢酸セルロースの量は、最終生成物である多孔性セルロース粒子の所望の粒径、細孔径および強度に応じて決定される。所望の粒径、細孔径および強度は、多孔性セルロース粒子の用途によって異なる。例えば、ニ酢酸セルロース溶液１００重量％に対して、二酢酸セルロースの量が３～２０重量％であることが好ましく、４～１５重量％であることがより好ましく、４～１２重量％であることが特に好ましい。二酢酸セルロースの含量を上記範囲にすることにより、機械的強度があり、多孔性を有した粒子を得ることができる。また、球状粒子を得られやすい。

　二酢酸セルロース溶液中の二酢酸セルロースの量が多いほど、溶液の粘度は高くなるが、固形分含量および得られるセルロース粒子の強度は高くなる。しかしながら、二酢酸セルロースの含量が高すぎると、粘度が高くなりすぎて操作性が悪化したり、球状ではなくフレーク状のセルロース粒子が析出したりする問題が生じ得る。一方、二酢酸セルロースの含量が低すぎると、セルロースが粒子として析出しなかったり、セルロース粒子の機械的強度が小さくなる場合がある。

　（ａ）において、二酢酸セルロースは、２５～１００℃の温度で溶媒に溶解されることが好ましく、より好ましくは４０～１００℃であり、特に好ましくは４０～９０℃である。２５℃以上とすることにより、二酢酸セルロースを溶媒に迅速に溶解することができる。一方、１００℃を超えると、溶媒の沸点に近くなってしまうため、使用する溶媒によっては好ましくない場合がある。また、操作温度を２５～１００℃にすることにより、多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を制御しやすいという利点もある。

　［（ｂ）の工程］
　（ｂ）においては、（ａ）で得られたニ酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質（以下、分散媒とも称する）中に加え、撹拌する。それにより、分散媒中に二酢酸セルロース溶液の液滴が分散した分散系が得られる。

　分散媒としては、（ａ）で得られたニ酢酸セルロース溶液と混和することなく、ニ酢酸セルロース溶液を分散させることができる媒質であれば、いずれの媒質も使用することができる。使用可能な分散媒は、（ａ）で使用される二酢酸セルロースに対する溶媒によって左右される。すなわち、二酢酸セルロースに対する溶媒として水性溶媒（例えば、酢酸水溶液）を使用した場合には、これと混和しない有機媒質を分散媒として使用する。ここでの有機媒質としては、例えば、トルエン、ｏ－ジクロロベンゼン、キシレン、などを挙げることができ、トルエンまたはｏ－ジクロロベンゼンであることが好ましい。トルエンおよびｏ－ジクロロベンゼンは入手しやすく、また、分散媒としてこれら媒質を使用することにより球状粒子を得やすくなる。２種類以上の有機媒質を混合して使用することもできる。

　一方、二酢酸セルロースに対する溶媒として有機溶媒（例えば、シクロヘキサノン）を使用した場合には、これと混和しない媒質である水性媒質を分散媒として使用する。水性媒質としては、水等を挙げることができ、また分散媒の粘度調節などの目的からポリビニルアルコールなどを含む水溶液を使用することもできる。これらの水性媒質は、入手が容易であり、環境負荷の点からも好ましい。２種類以上の水性媒質を混合して使用することもできる。

　分散媒の温度は、４０～１００℃であることが好ましく、６０～９５℃であることがより好ましい。上記温度範囲とすることが、ニ酢酸セルロース溶液の分散媒中での分散性の観点から好ましい。また、上記温度範囲とすることにより、分散媒中におけるニ酢酸セルロース溶液の形態を球形に保持できるため、好ましい。一方、操作温度が１００℃を超えると、分散媒の沸点近くになってしまうため、使用する分散媒によっては好ましくない場合がある。

　（ｂ）において、任意に、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することにより、ニ酢酸セルロース溶液の液滴をより球形に維持することができ、また粒径を制御することが出来る。界面活性剤であれば、特に制限なく使用することができるが、非イオン性界面活性剤、シリコーン系界面活性剤であることが好ましい。例えば、ソルビタンモノオレエート、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、アルキルグリコシド、ポリオキシエチレン－メチルポリシロキサン共重合体等が挙げられる。

　使用する界面活性剤の種類および／または量により、ニ酢酸セルロース溶液の液滴のサイズを制御することもできる。例えば、ニ酢酸セルロース溶液の液滴のサイズを小さくしたい場合には、ソルビタンモノオレエートを添加することが好ましく、液滴のサイズを大きくしたい場合には、ポリオキシエチレン－メチルポリシロキサン共重合体を添加することが好ましい。また、界面活性剤の添加量は、媒質に対して０．０３～３．０重量％であることが好ましく、０．０５～１．０重量％であることがより好ましく、０．０６～０．６重量％であることが特に好ましい。ここで、二酢酸セルロース溶液の液滴のサイズを大きくしたい場合には、界面活性剤の添加量を少なくし、液滴のサイズを小さくしたい場合には、界面活性剤の添加量を多くすればよい。

　［（ｃ）の工程］
　（ｃ）においては、上記（ｂ）で得られた分散系を冷却する。冷却することにより、得られるセルロース粒子の細孔径および粒径を制御することができる。

　冷却温度は、以下に説明する（ｄ）において貧溶媒を添加することにより、二酢酸セルロースが析出する温度であれば特に限定されない。しかし、最終生成物である多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を制御しやすいという観点から、冷却温度は４０℃以下であることが好ましい。また、０～４０℃であることがより好ましく、０～３０℃であることが特に好ましい。０℃より低い温度まで冷却した場合、分散系全体が凍結してしまう可能性がある。

　［（ｄ）の工程］
　（ｄ）においては、上記（ｃ）で冷却した分散系に貧溶媒を添加する。それにより、ニ酢酸セルロース粒子を析出させることができる。

　ここで使用される貧溶媒は、二酢酸セルロースに対する溶解性が低く、添加することによりニ酢酸セルロース粒子が析出する溶媒であれば、特に限定されない。具体的には、例えば、水、アルコール類、グリコール類およびこれらの混合液を使用することができる。アルコール類としては、低級アルコール類が好ましく、炭素数１～３のアルコール類がより好ましい。具体的には、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール等が挙げられる。グリコール類としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、トリメチレングリコール等が挙げられる。

　貧溶媒として混合溶媒を使用する場合、水とアルコール類との混合液または水とグリコール類との混合液であることが好ましい。より好ましくは、水とアルコール類との混合液であり、特に好ましくは、水とメタノールとの混合液、水とエタノールとの混合液、または水と２－プロパノールとの混合液である。
　析出したニ酢酸セルロース粒子は、当業者に周知のいずれかの方法により分離され、次の（ｅ）に供される。分離は、例えば、ろ過等により行うことができる。

　［（ｅ）の工程］
　（ｅ）においては、上記（ｄ）で析出させたニ酢酸セルロース粒子を鹸化する。それにより、ニ酢酸セルロースのエステル部分が加水分解して、セルロース粒子が得られる。ここで得られるセルロース粒子は、多孔性を有する。

　鹸化は、当業者に周知の方法により行うことができるが、例えば、アルカリおよびアルコールを用いて行うことができる。アルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液を用いることが好ましい。また、アルコールとしては、低級アルコールが好ましく、例えば、メタノール、エタノールなどがより好ましい。具体的には、（ｄ）で得られたニ酢酸セルロース粒子を、例えばアルカリとアルコールとの混合液中で一定時間撹拌することにより、鹸化を行うことができる。

　鹸化の前に、（ｄ）で得られたニ酢酸セルロース粒子を洗浄することが望ましい。洗浄に使用する溶液は、ニ酢酸セルロース粒子の構造を破壊することなく洗浄できる溶液であれば特に限定されないが、例えば、メタノール、水等を使用することができる。

　本発明の方法は、原料として二酢酸セルロースを使用するため、セルロース溶液を調製する際の溶媒として有害性の低いものを選択することが可能である。従って、より安全であり、環境保護の観点においても好ましい方法で多孔性セルロース粒子を製造することができる。また、特殊な設備や特殊な条件を使用する必要がないため、より簡便に、低コストで多孔性セルロース粒子を製造することもできる。さらに、本発明の実施形態に係る方法によれば、得られる多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を容易に制御することができるため、各用途に最適な粒径および細孔径を有するセルロース粒子を得ることができる。本発明の実施形態に係る方法によると、広いサイズ範囲の粒径および細孔径を有する多孔性セルロース粒子を得ることができる。すなわち、小さいサイズ、中間のサイズ、大きいサイズのいずれのサイズ領域の粒径および細孔径を有する多孔性セルロース粒子であっても、得ることが可能である。

　多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径は、本発明の方法における種々の条件を変化させることにより、容易に制御することができる。例えば、各工程の操作温度、使用する二酢酸セルロース原料の量、使用する溶媒および貧溶媒の種類、界面活性剤の種類および添加量等によって制御することができる。

　具体的には、（ａ）において、セルロース溶液における二酢酸セルロース濃度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は大きく、細孔径は小さくなる傾向にある。
　また、二酢酸セルロースを溶解する溶媒として酢酸水溶液等の水性溶媒を使用した場合、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は大きくなる傾向にある。一方、二酢酸セルロースを溶解する溶媒として有機溶媒を使用した場合、得られる多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径は、小さくなる傾向にある。

　また、（ｂ）において得られる分散系の粘度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は小さくなる傾向にある。しかしながら、分散系の粘度は、多孔性セルロース粒子の細孔径には影響をさほど及ぼさない。
　また、使用する界面活性剤の添加量を多くすると、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は小さくなり、逆に界面活性剤の量を少なくすれば、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は大きくなる傾向にある。また、使用する界面活性剤の種類を変更することで、得られる多孔性セルロース粒子の粒径分布を変えることが可能である。ただし、界面活性剤の量や種類を変えても、多孔性セルロース粒子の細孔径には影響をさほど及ぼさない。

　さらに、（ｃ）における冷却温度が低いほど、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は小さくなる傾向にあり、細孔径は大きくなる傾向にある。反対に、冷却温度が相対的に高い場合は、得られる多孔性セルロース粒子の粒径は大きくなる傾向にあり、細孔径は小さくなる傾向にある。

　また、（ｄ）で添加する貧溶媒の二酢酸セルロースに対する溶解性が低いほど、得られる多孔性セルロース粒子の細孔径は大きくなる傾向にある。しかしながら、貧溶媒の種類は、多孔性セルロース粒子の粒径にはさほど影響を及ぼさない。これらのことより、ニ酢酸セルロースを急激に結晶化することにより細孔径は小さくなり、ゆっくりと結晶化することにより細孔径は大きくなる傾向にある。

［多孔性セルロース粒子または修飾された多孔性セルロース粒子］
　本発明の１つの実施形態によると、上記製造方法により製造され得る多孔性セルロース粒子が提供される。この多孔性セルロース粒子は、各種物質の分離精製において使用することができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー等のゲル濾過法において、分子サイズの異なる物質を分別するために使用することができる。この際、本発明により得られる多孔性セルロース粒子をそのまま適用してもよいし、さらに置換基により修飾したり、架橋反応させた形態で適用してもよい。

　また、本発明の多孔性セルロース粒子の反応性官能基の少なくとも一部にリガンドを付加することによって、種々の物質を吸着可能な吸着剤を容易に得ることができる。例えば、インフルエンザウイルスやＢ型肝炎などに対するウイルス吸着体、抗体医薬品精製用吸着体、ＬＤＬコレステロール吸着体等において利用され得る。本発明の実施形態に係る方法によると、上記の通り、多孔性セルロース粒子の粒径および細孔径を広い範囲で容易に制御できるため、吸着特性に優れ且つ非特異的吸着の少ない吸着剤を、用途に応じて適切に製造することが可能である。

　具体的には、本発明の多孔性セルロース粒子が有する水酸基の少なくとも一部を硫酸化処理して、該多孔性セルロース粒子に硫酸基（－ＯＳＯ_３Ｈ）を導入することにより、リゾチーム、免疫グロブリン、血液凝固因子などのタンパク質の分離または精製に好適なクロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。

　本発明の多孔性セルロース粒子に硫酸基を導入する方法、すなわち、硫酸化多孔性セルロース粒子を得る方法は、特に限定されるものではないが、例えば、次のようにして行うことができる。
　まず、反応容器に硫酸化剤を準備する。本発明に用いる硫酸化剤は、セルロース粒子中の水酸基と反応して、多孔性セルロース粒子に硫酸基を導入できるものであれば特に限定されなく、そのような硫酸化剤としては、例えば、クロルスルホン酸－ピリジン錯体、ピペリジン－Ｎ－硫酸、無水硫酸－ジメチルホルムアミド錯体、三酸化硫黄－ピリジン錯体、三酸化硫黄－トリメチルアミン錯体、硫酸－トリメチルアミン複合体等を挙げることができる。硫酸化剤の使用量は、目的とする硫酸基の導入率及び反応条件によって任意に選択すればよく、例えば、多孔性セルロース粒子中の水酸基に対し、０．００１～１当量を用いるのが適当である。

　次に、乾燥させた多孔性セルロース粒子を硫酸化剤中に加え、硫酸化反応を行う。反応温度及び反応時間は、溶媒や硫酸化剤の種類によっても異なるが、不活性ガス中で、通常０～１００℃、好ましくは２０～８５℃で、好ましくは０．５～２４時間、より好ましくは０．５～１０時間行う。
　反応終了後、反応混合物にアルカリ水溶液、例えば水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和してもよい。
　その後、得られた反応混合物を濾過または遠心分離することにより、生成物を回収し、水で中性になるまで洗浄して、目的の硫酸化多孔性セルロース粒子を得ることができる。硫酸化多孔性セルロース粒子中の硫酸基の導入量は、硫酸化剤の使用量を変更することなどによって調整することができ、クロマトグラフィー充填剤の用途などに応じて適宜決定すればよい。

　また、本発明の多孔性セルロース粒子中の水酸基の少なくとも一部をスルホン化処理して、該粒子中にスルホン酸基含有基を導入することにより、免疫グロブリン、リゾチームなどのタンパク質の分離または精製に好適な強カチオンイオン交換クロマトグラフィー用充填剤も提供することができる。

　本発明の多孔性セルロース粒子中に導入することができるスルホン酸基含有基は、スルホン酸基（－ＳＯ_３Ｈ）を含有する炭化水素基であれば特に制限されなく、スルホン酸含有基に含まれる水素原子が、水酸基、ハロゲン原子、エポキシなどの置換基で更に置換されていてもよい。中でも、導入されるスルホン酸基含有基としては、置換基を有していてもよい炭素数１～５のスルホアルキル基であることが好適である。

　本発明の多孔性セルロース粒子中にスルホン酸基含有基を導入する方法は、多糖類のスルホン化処理に一般に用いられるものであれば特に制限されない。例えば、本発明の多孔性セルロース粒子を、３－クロロ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム、３－ブロモプロパンスルホン酸ナトリウムなどのハロアルカンスルホン酸塩、あるいは１，４－ブタンスルトン、１，３－プロパンスルトンまたは１，２－エポキシエタンスルホン酸などのエポキシドを有するスルホン酸などのスルホン化剤を用いて処理する方法が挙げられる。

　スルホン酸化多孔性セルロース粒子中のスルホン酸基含有基の導入量は、スルホン化剤やアルカリの使用量を変更することなどによって調整することができ、クロマトグラフィー充填剤の用途などに応じて適宜決定すればよい。
　多孔性セルロース粒子のスルホン化処理は、特開２００１－３０２７０２号公報または特開平９－２３５３０１号公報などを参照して行うことができる。実験条件を適宜設計変更することにより、目的のスルホン酸基含有基を目的の量だけ導入することができる。

　上記のように、本発明の一態様によると、本発明により得られる多孔性セルロース粒子または修飾された前記多孔性セルロース粒子を含むクロマトグラフィー用充填剤または吸着剤が提供される。本発明によるクロマトグラフィー用充填剤または吸着剤は、特に、リゾチーム、免疫グロブリン、血液凝固因子等のタンパク質、およびインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎等のウイルス粒子を分離精製するために使用することができる。

　様々な物質の吸着体として利用できるという観点からは、多孔性セルロース粒子の平均粒径は、１μｍ～２ｍｍであることが好ましく、２０μｍ～１ｍｍであることがより好ましく、３５μｍ～６００μｍであることが特に好ましい。しかしながら、これらに限定されるものではない。なお、平均粒径は、粒度分布測定装置：ＨＯＲＩＢＡ製　Laser　Scattering　Particle　Size　distribution　Analyzer　Partica　ＬＡ－９５０を使用してメジアン径を測定することにより算出した。

　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の内容がこれにより限定されるものではない。また、以下の実施例において「％」は、特段の説明が無い限り「重量％」を意味するものとする。

［実施例１］
　８５重量％酢酸水溶液３５２．５ｇに、二酢酸セルロース４８．１ｇ（和光純薬試薬、酢化度：５３～５６％）を加えて攪拌した。さらに、昇温して６０℃で１時間撹拌することにより二酢酸セルロースを溶解し、ニ酢酸セルロース濃度が１２重量％である透明な溶液を得た。該溶液を、界面活性剤ソルビタンモノオレート１．９７ｇを含む、１００℃のｏ－ジクロロベンゼン１．５Ｌ中に素早く注ぎ、回転数４００ｒｐｍにて１０分間攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を冷却し、３０℃になったところで、貧溶媒である純水６２０ｍｌを滴下した。その結果、ニ酢酸セルロースが析出し、球状の二酢酸セルロース粒子が得られた。その後、得られたニ酢酸セルロース粒子を大量のメタノール、次いで水で十分に洗浄した。そして、洗浄後のニ酢酸セルロース球状粒子を、目開き６００μｍの篩を用いて分級した。

　篩を通過したニ酢酸セルロース粒子を、５５％メタノール水溶液３６０ｍｌと２０重量％水酸化ナトリウム水溶液１７７ｇとの混合液中、３５℃で、２０時間撹拌することにより、鹸化した。その結果、最終生成物である多孔性セルロース粒子が得られた。

　（試験例１：粒度分布の測定）
　上記実施例１で得られた多孔性セルロース粒子について、粒度分布を測定し、平均粒径を求めた。測定に使用した装置は、以下の通りである。
　装置：Laser Scattering Particle Size distribution Analyzer Partica　ＬＡ－９５０（ＨＯＲＩＢＡ製）
　上記装置を使用してメジアン径を測定することにより、平均粒径を算出した。

　（試験例２：ゲル分配係数Ｋａｖの測定）
　上記実施例１で得られた多孔性セルロース粒子について、Ｋａｖ値を測定した。測定方法は、以下の通りである。
　（１）使用機器及び試薬
　カラム：エンプティカラム１／４×４．０ｍｍ　Ｉ．Ｄ×３００ｍｍ、１０Ｆ（東ソー）
　リザーバー：パッカ・３/８（東ソー）
　ポンプ：ＰＯＭＰ　Ｐ－５００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
　圧力計：ＡＰ－５３Ａ（ＫＥＹＥＮＣＥ）

　（２）カラム充填法
　カラムとリザーバーとを接続し、カラム下部にエンドフィッティングを接続した。Ｋａｖを測定するセルロース粒子を減圧濾過した湿ゲルの状態で１５ｇ計りとり、５０ｍＬビーカーへ入れた。そこへ超純水２０ｍＬを加えて軽く攪拌した。これを、セルロース粒子が超純水に分散した状態でリザーバーの壁を伝わるようにカラムにゆっくりと加えた。ビーカーに残ったセルロース粒子を少量の超純水ですすぎ、ゆっくりとカラムに加えた。その後、リザーバーの上部ぎりぎりまで超純水を加え、リザーバーの蓋をした。リザーバーの上部にアダプターを接続し、ポンプで超純水を送液した。送液ラインの途中には、圧力計を接続しておき、圧力をモニターした。圧力が０．３ＭＰａになるまで流速を上げ、その後３０分間超純水を流しながら充填した。充填が終わったらポンプを止め、アダプターとリザーバーの蓋を外した。次に、リザーバーの中の超純水をピペットで吸い出した。リザーバーを外し、カラムからはみ出したセルロース粒子を除いて、エンドフィッティングを接続した。

　（３）Ｋａｖ測定装置（商品名）
　システム　　　　　　　：　ＳＣＬ－１０ＡＰＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　ワークステーション　　：　ＣＬＡＳＳ－ＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　ＲＩ検出器　　　　　　：　ＲＩＤ－１０Ａ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　ポンプ　　　　　　　　：　ＬＣ－１０ＡＴ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
　オートインジェクター　：　ＳＩＬ－１０ＡＤＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）

　（４）Ｋａｖ測定サンプル（商品名）
　以下の表Ａに示すＫａｖ測定サンプルを用いた。

　これらのＫａｖ測定サンプルを純水に溶解して、濃度５０ｍｇ／ｍＬの溶液としたものを測定に使用した。

　（５）Ｋａｖ測定
　セルロース粒子を充填したカラムをＫａｖ測定装置にセットした。流量０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で６０分間、超純水を通液した。Ｋａｖ測定サンプル１０μＬをカラムにアプライして、４５分間超純水を通液した。Ｋａｖ測定サンプルの検出はＲＩ検出器を用いて行い、測定チャートを記録した。これらの操作を各Ｋａｖ測定サンプルごとに実施した。得られた測定チャート（縦軸：ＲＩ検出強度、横軸：時間）は、正規分布を示した。ＲＩ検出強度が極大になるような時間を記録した。

　（６）Ｋａｖ導出式
　Ｋａｖ測定で得られた、ＲＩ検出強度が極大になるような時間と、そのときの通液量から、Ｋａｖ測定サンプルの保持容量（ｍＬ）を算出した。
　Ｋａｖは、以下の式にて算出した。
　Ｋａｖ＝（Ｖｅ－Ｖ_０）／（Ｖｔ－Ｖ_０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）、Ｖ_０はデキストランＴ２０００保持容量（ｍＬ）である。］
　縦軸をＫａｖ値、横軸を分子量としてプロットしたときに、Ｋａｖ値がゼロになる分子量が排除限界分子量である。

［実施例２および３］
　二酢酸セルロース溶液における二酢酸セルロース濃度を１０重量％（実施例２）および４重量％（実施例３）としたことを除き、実施例１と同様にして多孔性セルロース粒子を製造した。得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。

　実施例１～３の結果を、以下の表１に示す。表１に示すＫａｖ値は、ＰＥＧ４１２０（ＰＯＬＹＭＥＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）の場合の値である。

　表１から、ニ酢酸セルロース濃度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子の平均粒径は大きくなる傾向にあると言える。図１に、実施例１～３で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す。図１より、ニ酢酸セルロース濃度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子のＫａｖ値が小さくなる傾向、すなわち細孔径が小さくなる傾向にあると言える。また、実施例１～３で得られたセルロース粒子の排除限界分子量は、１０万Ｄａ以下であった。

［実施例４］
　ニ酢酸セルロース溶液におけるニ酢酸セルロース濃度を１０重量％としたこと、および貧溶媒として５０％メタノール水溶液６２０ｍＬを使用したことを除き、実施例１と同様にして多孔性セルロース粒子を製造した。得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。

［実施例５］
　ニ酢酸セルロース溶液におけるニ酢酸セルロース濃度を６重量％としたことを除き、実施例４と同様にして多孔性セルロース粒子を製造した。得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。

　実施例４および５の結果を、以下の表２に示す。

［実施例６］
　８５重量％酢酸水溶液３５２．５ｇに、二酢酸セルロース３９．２ｇ（和光純薬試薬、酢化度：５３～５６％）を加えて攪拌した。さらに、昇温して６０℃で１時間撹拌することにより二酢酸セルロースを溶解し、ニ酢酸セルロース濃度が１０重量％である透明な溶液を得た。該溶液を、界面活性剤ソルビタンモノオレート１．９７ｇを含む、１００℃のｏ－ジクロロベンゼン１．５Ｌ中に素早く注ぎ、回転数４００ｒｐｍにて１０分間攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を０℃まで冷却し、そのまま０℃で１時間撹拌した後、貧溶媒である５℃以下の純水６２０ｍｌを滴下した。その結果、ニ酢酸セルロースが析出し、球状のニ酢酸セルロース粒子が得られた。その後の洗浄および鹸化の工程は、実施例１と同様に行った。
　得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。

［実施例７～９］
　ニ酢酸セルロース溶液におけるニ酢酸セルロース濃度を８重量％（実施例７）、６重量％（実施例８）および４重量％（実施例９）としたことを除き、実施例６と同様にして多孔性セルロース粒子を製造した。得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。

　実施例６～９の結果を、以下の表３に示す。

　表３より、ニ酢酸セルロース濃度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子の平均粒径は大きくなる傾向にあると言える。また、図２に、実施例６～９で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す。図２より、ニ酢酸セルロース濃度が高いほど、得られる多孔性セルロース粒子のＫａｖ値が低くなる傾向、すなわち細孔径が小さくなる傾向にあると言える。

　図３は、冷却温度と多孔性セルロース粒子の粒径との関係を示す図である。実施例２（冷却温度３０℃）および実施例６（冷却温度０℃）の場合について、多孔性セルロース粒子の粒度分布を比較している。図３より、冷却温度が低い方が、多孔性セルロース粒子の粒径は小さくなる傾向があると言える。

　図４は、実施例２、６、８および９で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。図４の実施例２（冷却温度３０℃）と実施例６（冷却温度０℃）の結果を比較すると、冷却温度が低い方が、得られる多孔性セルロース粒子のＫａｖ値が大きくなる傾向、すなわち細孔径が大きくなる傾向にあると言える。

［実施例１０］
　シクロヘキサノン３５２．５ｇに、二酢酸セルロース３９．２ｇ（和光純薬試薬、酢化度：５３～５６％）を加えて攪拌した。さらに、昇温して９０℃で１時間撹拌することにより二酢酸セルロースを溶解し、二酢酸セルロース濃度が１０重量％である透明な溶液を得た。該溶液を、界面活性剤ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム１．９７ｇを含む、９０℃の水１．５Ｌ中に素早く注ぎ、回転数４００ｒｐｍにて１０分間攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を冷却し、３０℃になったところで、貧溶媒であるメタノール６２０ｍｌを滴下した。その結果、ニ酢酸セルロースが析出し、球状のニ酢酸セルロース粒子が得られた。その後の洗浄および鹸化の工程は、実施例１と同様に行った。
　得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。

［実施例１１］
　実施例１０と同様に、ニ酢酸セルロース分散系を調製した。その後、この分散系を０℃まで冷却し、そのまま０℃で１時間撹拌した後、貧溶媒である冷メタノール６２０ｍｌを滴下した。その結果、ニ酢酸セルロースが析出し、球状のニ酢酸セルロース粒子が得られた。その後の洗浄および鹸化の工程は、実施例１と同様に行った。
　得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。

　実施例１０および１１の結果を、以下の表４に示す。

　表１～３と表４とを比較すると、二酢酸セルロースに対する溶媒として水性溶媒（酢酸水溶液）を使用した実施例１～９のセルロース粒子の平均粒径の方が、有機溶媒（シクロヘキサノン）を使用した実施例１０および１１よりも大きい傾向があると言える。また、有機溶媒を使用した場合（実施例１０および１１）は、Ｋａｖ値が小さくなる傾向、すなわち細孔径が小さくなる傾向にあると言える。

［比較例１］
　三酢酸セルロースを原料に用いて製造されている市販セルファインサルフェート（ＪＮＣ社製、Ｓ含量９５０μｇ／ｇ）を比較例に用いた。該品の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。

［比較例２］
　６０重量％チオシアン酸カルシウム水溶液に、結晶性セルロース（旭化成：セオラスＰＨ－１０１）を加えて１１０℃で撹拌し、セルロース濃度６重量％の溶液を調製した。該溶液を、界面活性剤ソルビタンモノオレエートを含む１３０℃のｏ－ジクロロベンゼン１．５Ｌ中に撹拌しながら注ぎ、分散系を得た。続いて、この分散系を冷却し、４０℃になったところで、貧溶媒であるメタノールを滴下した。その結果、セルロースが析出し、球状のセルロース粒子が得られた。その後、多量のメタノールおよび水で洗浄を行った。
　得られた多孔性セルロース粒子の粒度分布およびＫａｖ値を、実施例１と同様に測定した。

　比較例１および２の結果を、以下の表５に示す。

　図５は、実施例２ならびに比較例１および２で得られた多孔性セルロース粒子のＫａｖ値を示す図である。図５から、本発明の一態様によると、中間のＫａｖ値（すなわち中間の細孔径）を有する多孔性セルロース粒子が得られることが分かる。

［実施例１２：クロマトグラフィー用充填剤としての使用］
　以下に、本発明の多孔性セルロース粒子の好ましい使用形態の一つであるクロマトグラフィー用充填剤に関する実施例を示す。
　実施例６で製造した多孔性セルロース粒子を用い、以下の試料１～３のそれぞれの溶出時間（インジェクションから溶出ピークの最大値までの時間）を測定した。この測定は、移動相及び試料の溶剤として０．０５Ｍリン酸ｐＨ８．０＋０．５ＭＮａＣｌを用いた以外は、前述のゲル分配係数Ｋａｖの測定と同様に行った。
　試料１．ヒトγグロブリン、血清由来（和光純薬社製）；分子量１６．０×１０^４
　試料２．ウシ血清アルブミン、ウシ血清由来（和光純薬社製）；分子量６．６×１０^４
　試料３．リゾチーム、鶏卵白由来（和光純薬社製）；分子量１．４３×１０^４

　各試料の溶出時間は、試料１が１６．９分であり、試料２が１７．１分であり、試料３が２０．６分であった。この結果から、本発明の実施形態に係る多孔性セルロース粒子を使用することにより、異なる分子量を有するタンパク質を溶出時間の差によって分離することが可能であることが明らかとなった。従って、本発明の多孔性セルロース粒子は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー用のカラム充填剤として利用できると言える。

［実施例１３：吸着剤としての使用］
　以下に、本発明の多孔性セルロース粒子の好ましい使用形態の一つである吸着剤に関する実施例を示す。
　実施例２、実施例６、および比較例２により得られた多孔性セルロース粒子を、目開き１２５μｍ、目開き５３μｍの篩に通し、粒径１２５～５３μｍのセルロース粒子を分取した。得られたセルロース粒子を１ｍｏｌ当量のクロロスルホン酸と６５℃で反応させ、硫酸化セルロース粒子を得た（以下、実施例２Ａ、実施例６Ａ、比較例２Ａとする）。各硫酸化セルロース粒子のＳ含量（すなわち、硫酸化セルロース粒子１ｇに対する硫黄含量）をイオンクロマトグラフィー法により求めたところ（詳細は以下の試験例３に示す）、実施例２Ａ：１４０００μｇ／ｇ、実施例６Ａ：１８０００μｇ／ｇであった。比較例２Ａについては、多孔性セルロース粒子を上記方法により硫酸化しようとしたところ粒子が崩壊してしまったため、使用できなかった。

　（試験例３：Ｓ含量の分析）
　Ｓ含量は、イオンクロマトグラフィー法により求めることが出来る。具体的には、以下に記載の方法によって求めた。６０℃で１６～２０時間真空乾燥したサンプルを乳鉢ですりつぶし、更に、１０５℃にて２時間乾燥した。この乾燥試料０．０５gに２Ｍの塩酸２．５ｍｌを加え、１１０℃にて１６時間加水分解した。氷冷後、上澄液を１ｍｌ採取し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で中和し、２５ｍｌにメスアップした。カラムに横河電機社製ＩＣＳ－Ａ－２３を用い、オーブン温度４０℃、溶離液に３ｍＭ　Ｎａ_２ＣＯ_３溶液、除去液に１５ｍＭ硫酸をそれぞれ１ｍｌ／ｍｉｎの流量の条件で使用し、横河電機社製ＩＣ７０００イオンクロマトアナライザーを用いて分析し、さらに後述の標準溶液から作成した検量線をもとにＳＯ_４濃度を求めた。ブランク値は乾燥試料を加えずに同様に操作した時の値とした。ＳＯ_４標準液（関東化学社製　陰イオン混合標準液ＩＶ）の２μｇ／ｍｌ液を本測定法の標準溶液とし、これを更に段階希釈したものを同様の条件でイオンクロマトアナライザーにて分析し、検量線を作成した。硫黄含有割合は下記式にて求めた。なお、Ｘ試料、ＸブランクはＳＯ_４標準溶液による検量線から求めた濃度（×１０^－４％）である。
　　硫黄含有割合（×１０^－４％）＝
　　　　　（Ｘ試料－Ｘブランク）×２５×２．５×０．３３３３／０．０５
　上記式により算出した硫黄含有割合に基づいて、修飾されたセルロース粒子（例えば、硫酸化セルロース粒子またはスルホン酸化セルロース粒子）の乾燥重量１ｇ当りの硫黄含量（重量）を算出した。

　上記で作製した硫酸化セルロース粒子（実施例２Ａ、実施例６Ａ、比較例２Ａ）および比較例１のセルロース粒子（市販品）を用いて、タンパク質の吸着量を測定した。
　各セルロース粒子を、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．５）で十分に洗浄した。測定対象であるタンパク質を６５０ｍｇ用意し、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．５）１３０ｍＬに溶解してタンパク質溶液を調製した。タンパク質としては、以下のものを使用した。
　（１）ヒトγグロブリン、血清由来（和光純薬社製）
　（２）リゾチーム、鶏卵白由来（和光純薬社製）

　セルロース粒子１ｍＬに対し、上記で調製したタンパク質溶液１００ｍＬを２時間かけて通液した。セルロース粒子に吸着されたタンパク質量を求めるために、回収された液を波長２８０ｎｍの吸光度測定に供し、未吸着のタンパク質量を求めた。使用したタンパク質溶液中のタンパク質量から、回収液中に存在する未吸着のタンパク質量を差し引くことで、セルロース粒子に吸着されたタンパク質量を算出した。その結果を、以下の表６に示す。

　表６の結果の通り、本発明の実施形態に係る多孔性セルロース粒子に適切なリガンドを導入することで、市販品と同等以上の吸着量を有する吸着剤としての利用が可能であることが判った。

［実施例１４：ウイルス吸着試験（インフルエンザウイルス）］
　文献：Microbiol Immunol 2012;56: 490-495を参考に、以下の手順で、インフルエンザウイルス吸着試験を行った。
　（不活化ウイルス含有液の調製）
　インフルエンザウイルスA/duck/Hokkaido/Vac-2/2004(H7N7)株を、発育鶏卵を用いて増殖させた。しょう尿液を回収して遠心し、上清を回収した。これに終濃度０．１％となるようβ-プロピオラクトンを加え、ウイルスを不活性化した。この不活性化ウイルス液を孔径０．４５μｍセルロースアセテート製メンブレンフィルターでろ過し、不活化ウイルス含有液として試験に供した。

　（ウイルス吸着能の評価）
　実施例２、６および１０により得られた多孔性セルロース粒子を、目開き１２５μｍ、目開き５３μｍの篩に通し、粒径１２５～５３μｍのセルロース粒子を分取した。得られたセルロース粒子を１ｍｏｌ当量のクロロスルホン酸と６５℃で反応させ、硫酸化セルロース粒子を得た（以下、実施例２Ａ、実施例６Ａ、実施例１０Ａとする）。また、実施例１０により得られた多孔性セルロース粒子を１ｍｏｌ当量のクロロスルホン酸と７５℃で反応させ硫酸化セルロース粒子を得た（以下、実施例１０Ｂとする）。各硫酸化セルロース粒子のＳ含量（すなわち、硫酸化セルロース粒子１ｇに対する硫黄含量）をイオンクロマトグラフィー法により求めたところ、実施例２Ａ：１４０００μｇ／ｇ、実施例６Ａ：１８０００μｇ／ｇ、実施例１０Ａ：１４００μｇ／ｇ、実施例１０Ｂ：４０００μｇ／ｇであった。

　上記で得られた硫酸化セルロース粒子の各々を水に分散させ、減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した各々の分散液を、ガラスカラム（Φ３×５０ｍｍ）に充填した。このカラムをクロマトグラフィーシステムに接続し、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した。以下の通液は流速０．４７ｍｌ／ｍｉｎの速度で行い、流出液は１ｍＬずつ回収した。まず、上記で調製したウイルス含有液１５ｍＬを通液し、その後０．０１Ｍのリン酸塩と０．１５Ｍの塩化ナトリウムとを含む緩衝液（ｐＨ７．０）で非吸着分を洗浄した。続いて、塩化ナトリウム水溶液の濃度を１．５Ｍまで直線勾配であげて通液し、溶出画分を回収した。回収した各フラクションのＨＡ価を測定し、１０％動的吸着量（ＤＢＣ）を求めた。１０％ＤＢＣは、使用したウイルス含有液の活性の強さの１／１０以上が流出した手前のフラクションまでに吸着されたウイルスのウイルス活性とした。なお、ウイルス活性（ＨＡ価）の測定は、以下のように行った。

　（ウイルス活性の測定）
　丸底９６ウェルプレートの各ウェルに生理食塩水５０μＬを加え、縦１列目に評価サンプル（すなわち、上記で得られた溶出画分および参照としての不活化ウイルス含有液）５０μＬを加えてよく混合した。この２倍希釈されたサンプルのうち５０μＬを横隣のウェルに加えよく混合した。同様の操作を繰り返し、１２番目のウェルまで２～４０９６倍の希釈サンプルを調製した。各サンプルに０．５％鶏赤血球浮遊液５０μｍＬを加えて混合した後、室温で３０分間放置した。３０分後、血球が凝集して底に沈殿していないものをウイルス活性有りとし、活性が認められなくなる一つ前までの希釈倍率をサンプル５０μＬあたりのＨＡ価（ＨＡＵ／５０μＬ）とした。また、ネガティブコントロールには生理食塩水を用いた。

　結果を表７に示す。

　上記結果より、本発明の実施形態に係る多孔性セルロース粒子を硫酸化することによりインフルエンザウイルスを吸着できることが確認された。ただし、Ｓ含量の多い実施例２の硫酸化セルロース粒子（Ｓ含量１４０００μｇ／ｇ）および実施例６の硫酸化セルロース粒子（Ｓ含量１８０００μｇ／ｇ）はインフルエンザウイルスの動的吸着量が低い結果を示している。このことよりウイルス吸着に適した硫酸基の導入量があると考えられる。
　例えば、多孔性セルロース粒子が硫酸基またはスルホン酸基含有基によって修飾され、且つ修飾された多孔性セルロース粒子に対するＳ含量（すなわち、修飾された多孔性セルロース粒子１ｇに対する硫黄含量）が８００～５０００μｇ／ｇであることが好ましく、８００～４０００μｇ／ｇであることがより好ましく、８００～２０００μｇ／ｇであることが特に好ましい。多孔性セルロース粒子に対するＳ含量が７００μｇ／ｇ以下の場合には、十分なウイルス吸着量を得られないことが実証されている。従って、Ｓ含量が上記範囲となるように多孔性セルロース粒子を修飾することにより、十分なウイルス吸着量を得られる。

［実施例１５：ウイルス吸着試験（Ｂ型肝炎ウイルス）］
　（ウイルス含有液の調製）
　Ｂ型肝炎ウイルスＨＢｓＡｇ－ＸＴ（Ｂｅａｃｌｅ　Ｉｎｃ．）を、１５０μｇ／ｍｌとなるよう、以下に示すクロマトグラフィーカラムの平衡化に用いる緩衝液に懸濁した。
　（ウイルス吸着能の評価）
　実施例１４で調製した硫酸化セルロース粒子（実施例１０Ａおよび１０Ｂ）を使用した。実施例１０Ａの硫酸化セルロース粒子（Ｓ含量：１４００μｇ/ｇ）、および実施例１０Ｂの硫酸化セルロース粒子（Ｓ含量：４０００μｇ/ｇ）の各々を水に分散させ、減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した各々の分散液を、ガラスカラム（Φ３×５０ｍｍ）に充填した。このカラムをクロマトグラフィーシステムに接続し、それぞれ０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）および０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した。平衡化したカラムに、上記で調製したウイルス含有液を２ｍｌ通液した。通液は０．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速で行い、流出液は１ｍＬずつ回収した。ウイルス含有液の通液後は、平衡化で用いた緩衝液を通液して非吸着分を洗浄した。続いて塩化ナトリウム水溶液の濃度を１．５Ｍまで直線勾配で上げて通液し、溶出画分を回収した（吸着分）。各フラクションは１ｍＬずつ回収し、ＢＣＡアッセイ法で各フラクションにおけるタンパク質濃度を測定することで、ウイルスの回収量（すなわち吸着量）を求めた。なおこのＢＣＡアッセイは、Ｔｈｅｒｍｏ社マニュアルに従い、ＢＳＡを標準として行った。

　結果を以下の表８に示す。表８において、「ウイルス負荷」は、カラムに通液したウイルス含有液中に含まれるウイルスの量を意味する。「流出液中のウイルス量」は、ウイルス含有液の通液後および緩衝液の通液後の流出液中に含まれるウイルスの量（非吸着分）を意味し、その割合（％）は、ウイルス負荷量に対する非吸着ウイルス量の割合を意味する。「溶出画分中のウイルス量」は、塩化ナトリウム水溶液を通液することにより回収された溶出画分中に含まれるウイルスの量（吸着分）を意味し、その割合（％）は、ウイルス負荷量に対する吸着ウイルス量の割合を意味する。

　表８より、硫酸化セルロース粒子は、ｐＨ５．０の条件で、６２．２％という高いＢ型肝炎ウイルスに対する吸着および回収能を示したことが分かる。また、中性域のｐＨ７．０の条件下でも、３０％以上のＢ型肝炎ウイルスに対する吸着および回収能を示した。

　本発明において、例えば、ニ酢酸セルロース溶液中の二酢酸セルロースの含量がニ酢酸セルロース溶液に対して６～１２重量％であり、冷却は０～３０℃の温度に冷却することにより行い、分子量８０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．５２以下であり、かつ分子量１２０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．４５以下である多孔性セルロース粒子が好ましい。タンパク質、ウイルス等は、それぞれ固有の分子量や大きさを持っており、それらとセルロース粒子の細孔径（Ｋａｖ値）の大きさとの関係が吸着量に影響すると一般的に考えられる。上記の特性（製造方法およびＫａｖ値）を有する多孔性セルロース粒子（または上記セルロース粒子をリガンドで修飾したもの）は、特に、リゾチーム、免疫グロブリン、血液凝固因子等のタンパク質、およびインフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎等のウイルスを分離および精製するためのクロマトグラフィー用充填剤または吸着剤として好適である。

　本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。

Claims

　（ａ）二酢酸セルロースを溶媒に溶解して、二酢酸セルロース溶液を調製することと、
　（ｂ）前記二酢酸セルロース溶液を、該二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質中に分散させて、分散系を得ることと、
　（ｃ）前記分散系を冷却することと、
　（ｄ）冷却された前記分散系に貧溶媒を添加することにより、二酢酸セルロース粒子を析出させることと、
　（ｅ）前記二酢酸セルロース粒子を鹸化することと
を含む、多孔性セルロース粒子の製造方法。
　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は、酢酸水溶液またはシクロヘキサノンである請求項１に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液の溶媒は酢酸水溶液であり、前記酢酸水溶液における酢酸の含量は、前記酢酸水溶液に対して８０～９５重量％である請求項２に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
　（ｄ）において、前記貧溶媒は、水、アルコール類、グリコール類またはこれらの混合液である、請求項１～３のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
　（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は、水または有機媒質である請求項１～４のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
　（ｂ）において、前記二酢酸セルロース溶液と混和しない媒質は有機媒質であり、前記有機媒質は、トルエンまたはｏ－ジクロロベンゼンである請求項５に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、酢化度が４５～５７％である請求項１～６のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
　（ａ）において、前記二酢酸セルロース溶液における二酢酸セルロースの含量は、前記二酢酸セルロース溶液に対して３～２０重量％である請求項１～７のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、２５℃～１００℃の温度で前記溶媒に溶解される、請求項１～８のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
　（ａ）において、前記二酢酸セルロースは、４０℃～１００℃の温度で前記溶媒に溶解される、請求項９に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
　（ｃ）において、前記冷却は、０～４０℃の温度に冷却することにより行う請求項１～１０のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法。
　請求項１～１１のいずれか１項に記載の多孔性セルロース粒子の製造方法により製造され得る多孔性セルロース粒子。
　（ａ）における前記二酢酸セルロース溶液中の二酢酸セルロースの含量は、前記二酢酸セルロース溶液に対して６～１２重量％であり、（ｃ）における前記冷却は、０～３０℃の温度に冷却することにより行われ、分子量８０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．０１以上０．５２以下であり、かつ分子量１２０００のＰＥＧを用いて測定したＫａｖ値が０．００１以上０．４５以下である請求項１２に記載の多孔性セルロース粒子。
　請求項１２または１３に記載の多孔性セルロース粒子または修飾された前記多孔性セルロース粒子を含む、クロマトグラフィー用充填剤。
　ウイルス粒子を分離精製するために使用される、請求項１４に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
　硫酸基またはスルホン酸基含有基によって修飾され、且つ修飾された多孔性セルロース粒子に対するＳ含量が８００～５０００μｇ／ｇである修飾された多孔性セルロース粒子を含む、インフルエンザウイルス粒子またはＢ型肝炎ウイルス粒子の分離精製用の請求項１５に記載のクロマトグラフィー用充填剤。