WO2012118189A1 - アミノ－カルボン酸により修飾されたヒアルロン酸誘導体 - Google Patents

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WO2012118189A1
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hyaluronic acid
diyl
hydrogen atom
acid derivative
alkyl
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朋子 八杉
佳弘 反保
健司 八杉
泰 平倉
剛 下房地
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中外製薬株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof

Definitions

  • the present invention relates to a compound having amino and carboxy such as alkylamine and amino acid (amino-carboxylic acid) or a hyaluronic acid derivative modified with an amide compound thereof (amino-carboxylic acid amide), and the hyaluronic acid derivative and the drug are bonded.
  • a pharmaceutical composition comprising the hyaluronic acid derivative, particularly a complex of the hyaluronic acid derivative and a drug.
  • PEG Polyethylene glycol
  • Non-patent Documents 1 and 2 a phenomenon in which clearance at the second administration is abnormally fast (Accelerated Blood Clearance phenomenon, hereinafter also referred to as “ABC phenomenon”) has been reported (Non-patent Documents 1 and 2). Therefore, it is difficult to say that the safety and effectiveness of PEGylated drugs are well established.
  • hyaluronic acid is an example of a polymer already used in clinical practice.
  • Hyaluronic acid (hereinafter also referred to as “HA”) It is a polysaccharide isolated from the vitreous body of cattle eyes by Meyer and has long been known as the main component of the extracellular matrix.
  • HA is a kind of glycosaminoglycan composed of a disaccharide unit in which D-glucuronic acid and N-acetylglucosamine are linked by a ⁇ (1 ⁇ 3) glycosidic bond as a repeating unit.
  • Hyaluronic acid has no species difference in its chemical and physical structure, and there exists a metabolic system of hyaluronic acid in humans.
  • hyaluronic acid is known as a very safe biomaterial in terms of immunity or toxicity.
  • hyaluronic acid as a physiologically active substance related to the induction of cell adhesion, proliferation, and migration has attracted attention.
  • high-molecular-weight hyaluronic acid can be mass-produced by microorganisms, and drug delivery systems using hyaluronic acid (hereinafter also referred to as “DDS”) have been actively studied.
  • DDS drug delivery systems using hyaluronic acid
  • a hyaluronic acid derivative has been developed and its usefulness has been demonstrated by highly modifying the carboxy of the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid to realize prolonged retention in blood (Patent Document 7).
  • Patent Document 7 the retention of the hyaluronic acid derivative in the blood is prolonged by increasing the carboxy modification rate of the glucuronic acid moiety.
  • the two do not correlate linearly and change abruptly at a certain threshold.
  • oligonucleotides such as antisense DNA / RNA and siRNA, which are being developed as nucleic acid pharmaceuticals, are susceptible to degradation by nucleolytic enzymes inside and outside the body, and are administered intravenously as a single nucleic acid (hereinafter also referred to as “iv”). Then, it is quickly decomposed.
  • nucleic acid drugs In order to express the efficacy of nucleic acid drugs, it is essential to deliver the nucleic acid into the cytoplasm or nucleus.
  • pharmaceuticals that have proteins and peptides as active ingredients have mainly been those that act on extracellular targets. In order to develop more innovative drugs, there is a need for means for allowing proteins and peptides to act on intracellular targets.
  • a method for delivering a protein or peptide into the cytoplasm that is, a method for efficiently releasing a pharmaceutically active ingredient from the endosome into the cytoplasm after being taken into the cell by endocytosis is required.
  • cationic synthetic polymers can electrostatically condense negatively charged genes and deliver genes into the cytoplasm, they have been effective as gene carriers.
  • examples of such cationic synthetic polymers include poly-L-lysine (Patent Document 8, Non-Patent Document 3), polyethyleneimine (Non-Patent Document 4), synthetic polymer having imidazolyl (Non-Patent Document 5), polyamidoamine dendrimer ( Synthetic polymers such as Non-Patent Document 6) have been reported.
  • a synthetic polymer having a secondary amine-containing polyethyleneimine or imidazolyl is taken into the cytoplasm with high introduction efficiency by exerting a proton sponge effect.
  • Non-patent Document 7 chitosan which is a cationic polymer of polysaccharide
  • Non-patent Document 8 a method of modifying with a cell-penetrating peptide (cpp) (Non-patent Document 8) and an attempt to introduce a protein or peptide complex into a cytoplasm by using a cationic liposome as a carrier have been reported. (Non-patent Document 9), the introduction efficiency is not necessarily high.
  • Non-patent Document 10 polyamine PEGylation, or an approach in which HA is modified with polyamine (Non-patent Document 10), or a polyamine is modified with a functional group that desorbs in a pH-responsive manner (for example, at low pH). By doing so, an approach to reduce its toxicity is underway. However, since polyamine is still inherent, further contrivance and examination are necessary for its toxicity (Non-patent Document 11).
  • Non-patent document 12 Poly (ethylacrylic acid) (Non-patent document 12) and poly (propylacrylic acid) (Non-patent document 13) are known as such anionic polymers, and a polycarboxylic acid polymer having a pKa of about 5 is a cell.
  • Non-patent Document 14 succinate-modified polyglycidol
  • Non-patent Document 15 pseudo-peptide in which the side chain of poly (L-lysine-isophthalamide) is modified with L-phenylalanine have pH responses.
  • anionic polymer exhibiting sex it has been reported that it is effective for gene / drug release from endosomes, that is, for the incorporation of drugs into the cytoplasm via endocytosis.
  • An example of modification of carboxy in hyaluronic acid with an amino acid is, for example, produced by using 2-chloro-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine in the presence of N-methylmorpholine.
  • Modification of glycine with ethyl ester using 4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine) -4-methylmorpholium (hereinafter also referred to as DMT-MM) as a condensing agent is possible. Is 20% at the maximum (Non-patent Document 16).
  • Non-patent Document 18 hyaluronic acid introduced with alanine has been reported as an example of using a triazine-based compound as a condensing agent. Modifications have also been reported for amino acids (Non-patent Document 19, Patent Document 10).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • leucine methyl ester hydrochloride valine methyl ester hydrochloride
  • Water-insoluble biocompatible modified with hydrochloride, proline methyl ester hydrochloride, phenylalanine methyl ester hydrochloride, arginine methyl ester hydrochloride and histidine methyl ester hydrochloride, gelled without deprotection
  • the modification rate is unknown (Patent Document 9).
  • the problem to be solved by the invention is to provide a hyaluronic acid derivative having both biodegradability and blood retention characteristics and / or a hyaluronic acid derivative capable of delivering a gene and a drug into the cytoplasm. It is. Another problem to be solved by the invention is to provide a conjugate in which the hyaluronic acid derivative and the drug are bound, and a pharmaceutical composition containing the hyaluronic acid derivative, particularly a complex of the hyaluronic acid derivative and the drug. It is.
  • the present inventor has intensively studied to solve such problems. As a result, the carboxy of the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid or a salt thereof is changed to a specific alkylamine, a specific amino-carboxylic acid or a specific amino-carboxylic acid.
  • the present inventors have found that the hyaluronic acid derivative obtained by reacting with an amide to convert to an amide has both biodegradability and blood retention properties, and completed the present invention. Further, the present inventors have found that a hyaluronic acid derivative modified with a specific amino-carboxylic acid is effective in releasing a gene / drug from the endosome into the cytoplasm, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to a hyaluronic acid derivative having both biodegradability and blood retention, and a hyaluronic acid that suppresses in vivo degradation of a compound having pharmacological activity, particularly a nucleic acid drug, and enables delivery into the cytoplasm. It relates to acid derivatives. Furthermore, the present invention relates to a method for producing the hyaluronic acid derivative, a drug and a pharmaceutical composition containing the hyaluronic acid derivative, and a method for producing the same.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl; R 8 is a hydrogen atom, formyl or C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X is a group represented by —NR x —AB—Z;
  • A is selected from —CR a R b —, and C 3-8 cycloalkylene, B is a direct bond, Z is —COOR y or —CONR ya R yb ; or —A—B—Z is , C 1-6 alkyl; or
  • A is —CH 2 — or —CH 2 —CH 2 —, B is phenylene (wherein phenylene is substituted with one or more groups selected from hydroxy and halogen atoms) Selected from C 3-8 cycloalkylene and phenylmethane-1,1-diyl;
  • A is C 3-8 cycloalkylene and B is a direct bond;
  • A is —CH 2 — or —CH 2 —CH 2 —, and B is phenylene (wherein phenylene may be substituted with one or more groups selected from hydroxy and halogen atoms), C 3- Selected from 8 cycloalkylene and phenylmethane-1,1-diyl; or
  • A is 2-cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1-diyl, 3-phenylpropane
  • the hyaluronic acid derivative according to the above (1) selected from -1,1-diyl, cyclohexylmethane-1,1-diyl and 4-hydroxyphenylmethane-1,1-diyl, wherein B is a direct bond.
  • A is —CH 2 — and B is cyclohexane-1,1-diyl, benzene-1,4-diyl, benzene-1,3-diyl, 2-chlorobenzene-1,4-diyl and phenylmethane Selected from -1,1-diyl;
  • A is —CH 2 CH 2 — and B is benzene-1,4-diyl; or Wherein A is selected from 2-cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1-diyl and 3-phenylpropane-1,1-diyl;
  • B is a direct bond,
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • R 8 is a hydrogen atom, formyl or C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X is a group represented by —NHCH 3 , —NH (CH 2 ) 2 CH 3 , —NR x —AB—COOR y or —NR x —CHR c —CONR ya R yb ;
  • R x and R y are each independently selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl;
  • A represents —CR a R b —, C 3-8 cycloalkylene, 2-cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1-diyl, 3-phenylpropane-1, Selected from 1-diyl,
  • B is selected from phenylene (wherein phenylene may be substituted with one or more groups selected from hydroxy and halogen atoms), C 3-8 cycloalkylene and phenylmethane-1,1-diyl Is;
  • R a is selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl;
  • R b is selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl (wherein C 1-6 alkyl may be substituted with one or more groups selected from hydroxy, carboxy and carbamoyl);
  • R c represents C 1-6 alkyl optionally substituted with carbamoyl;
  • R ya and R yb are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl and C 1-6 alkylcarbonyl]
  • X is —NHCH 3 , —NH (CH 2 ) 2 CH 3 or —NR x —CHR c —CONR ya R yb , or A is —CR a R b — or C 3-8 cyclo
  • A is C 3-8 cycloalkylene and B is a direct bond; A is —CH 2 — or —CH 2 —CH 2 —, and B is phenylene (wherein phenylene may be substituted with one or more groups selected from hydroxy and halogen atoms), C 3- Selected from 8 cycloalkylene and phenylmethane-1,1-diyl; or A is 2-cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1-diyl, 3-phenylpropane
  • the hyaluronic acid derivative according to (6) above selected from -1,1-diyl, cyclohexylmethane-1,1-diyl and 4-hydroxyphenylmethane-1,1-diyl, wherein B is a direct bond.
  • A is —CH 2 — and B is cyclohexane-1,1-diyl, benzene-1,4-diyl, benzene-1,3-diyl, 2-chlorobenzene-1,4-diyl and phenylmethane Selected from -1,1-diyl;
  • A is —CH 2 CH 2 — and B is benzene-1,4-diyl; or Wherein A is selected from 2-cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1-diyl and 3-phenylpropane-1,1-diyl;
  • B is a direct bond, The hyaluronic acid derivative according to (6) or (8).
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • R 8 is a hydrogen atom, formyl or C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X is a group represented by —NR x —AB—COOR y ;
  • R x and R y are each independently selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl;
  • A represents —CR a R b —, C 3-8 cycloalkylene, 2-cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1-diyl, and 3-phenylpropane-1 , 1-diyl and B is a direct bond; or
  • A is —CH 2 — and B is selected from phenylene and C 3-8 cycloalkylene;
  • R a is selected
  • A is —CR a R b — or C 3-8 cycloalkylene.
  • A is C 3-8 cycloalkylene and B is a direct bond;
  • A is —CH 2 — and B is selected from phenylene and C 3-8 cycloalkylene; or
  • A is 2-cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1
  • A is —CH 2 — and B is selected from cyclohexane-1,1-diyl and benzene-1,4-diyl; or Wherein A is selected from 2-cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl)
  • R 1a , R 2a , R 3a , and R 4a are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • R 8a is a hydrogen atom, formyl or C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X a is selected from hydroxy and —O ⁇ Q + ; where Q + represents a counter cation]
  • the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (13), further comprising a disaccharide unit represented by: (15) Formula (III):
  • R 1b , R 2b , R 3b , and R 4b are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • R 8b is a hydrogen atom, formyl or C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X b is a group represented by —NR e —Y b —R d ;
  • R e is a hydrogen atom or C 1-6 alkyl;
  • R d is a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, —CO—C (R 7 ) ⁇ CH 2 , or —CO—G 4 —X c ;
  • R 7 is a hydrogen atom or methyl;
  • G 4 is selected from phenylene, C 3-8 cycloalkylene, or -G 5- (C 1-10 alkylene) -G 6- , wherein the C 1-10 alkylene moiety is 1-3 phenylene or C 3-8 cyclo
  • a group represented by: Y b represents —CH 2 — (CHR 5 ) 1 -2 —CH 2 —NH—, —CH 2 — (CHR 6 ) p-2 —CH 2 —O—, — (CH 2 ) j —S— or -(CH 2 ) a- (Y 1- (CH 2 ) b ) c -G-; l, p, and j are each independently an integer selected from 2 to 10, and R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom or hydroxy; a is an integer selected from 2 to 10; b is an integer independently selected from 2 to 10; c is an integer selected from 1 to 200; Y 1 is an oxygen atom or —NR n —; G is an oxygen atom, a sulfur atom or —NH—; R n represents a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, —CO— (CH 2 ) d —R o , — (CH 2 ) e —R
  • the non-derivatized hyaluronic acid having a main chain structure corresponding to the hyaluronic acid derivative has a weight average molecular weight of 20 to 120 kilodaltons, and the non-derivatized hyaluronic acid has the formula (II) Wherein R 1a , R 2a , R 3a and R 4a are hydrogen atoms, R 8a is acetyl and Xa is hyaluronic acid consisting only of disaccharide units of —O ⁇ Na +.
  • a pharmaceutical composition comprising the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (17) as a carrier.
  • a hyaluronic acid derivative-drug conjugate in which one or more drugs are bound to the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (17) above.
  • biodegradable drug carrier comprising the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (17) above.
  • a carrier for introducing a drug into the cytoplasm comprising the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (17) above.
  • the hyaluronic acid according to any one of (1), (2), (5) to (7), (10), (11), and (14) to (17) Biodegradable drug carriers comprising the derivatives are provided.
  • the hyaluronic acid derivative according to any one of (1), (3) to (6), (8) to (10), and (12) to (17) is included.
  • Carriers for the cytoplasmic introduction of drugs are provided.
  • a method for administering a drug comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the drug together with the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (17) above.
  • a method for introducing a drug into the cytoplasm comprising administering a therapeutically effective amount of the drug together with the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (17) above.
  • the hyaluronic acid according to any one of (1), (2), (5) to (7), (10), (11), and (14) to (17)
  • a method of administering a drug comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the drug along with the derivative.
  • the therapeutic effect is effective together with the hyaluronic acid derivative according to any one of (1), (3) to (6), (8) to (10), and (12) to (17).
  • a method of introducing a drug into the cytoplasm comprising administering an amount of the drug is provided.
  • Example 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-TBA prepared in Example 1-2.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-FL / TBA prepared in Example 1-3.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ala / FL prepared in Example 1-4-1.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectra of HA-Ser / FL and HA-Ser-OEt / FL prepared in Example 1-4-2.
  • It is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Glu / FL prepared in Example 1-4-3.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectra of HA-Gly / FL and HA-Gly-OEt / FL prepared in Example 1-4-4.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Val / FL prepared in Example 1-4-5.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Leu / FL prepared in Example 1-4-6.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ile / FL prepared in Example 1-4-7.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Thr / FL prepared in Example 1-4-8.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Asp / FL prepared in Example 1-4-9.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-cACHCA / FL prepared in Example 1-4-10.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-tACHCA-OEt / FL prepared in Example 1-4-11.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Aib / FL prepared in Example 1-4-12.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-ACBuCA-OEt / FL prepared in Example 1-4-13.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Asn / Rh prepared in Example 1-4-14.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ala-NH 2 / Rh prepared in Example 1-4-15.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Val-NH 2 / Rh prepared in Example 1-4-16.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Asn-NH 2 / Rh prepared in Example 1-4-17.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectra of HA-Me and HA-Me / FL prepared in Example 1-4-18.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectra of HA-Pr and HA-Pr / FL prepared in Example 1-4-19.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-AMCHCA prepared in Example 1-5-1.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-pcACHCA prepared in Example 1-5-2.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Nal prepared in Example 1-5-3.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-APBA prepared in Example 1-5-4.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Cha prepared in Example 1-5-5.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-AMBA prepared in Example 1-5-6.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-3AMBA prepared in Example 1-5-7.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-APhPA prepared in Example 1-5-8.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-AEBA prepared in Example 1-5-9.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-AMClBA prepared in Example 1-5-10.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-AMSA prepared in Example 1-5-11.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-4AMCHCA prepared in Example 1-5-12.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Chg prepared in Example 1-5-13.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-pHPhg prepared in Example 1-5-14.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-FL prepared in Comparative Example 1-1-1 and HA-EDOBEA having a low modification rate.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectra of HA-EDOBEA-Ac / FL prepared in Comparative Example 1-1-2 and HA-EDOBEA having a high modification rate.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Phe / FL prepared in Comparative Example 1-1-3.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Tyr / FL prepared in Comparative Example 1-1-4.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-MePhe / FL prepared in Comparative Example 1-1-5.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Pro-OMe / FL prepared in Comparative Example 1-1-6.
  • 7 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Gly-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-7.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ser-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-8.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Leu-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-9.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ile-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-10.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Thr—NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-11.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Gln-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-12.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Nle prepared in Comparative Example 1-2-1.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-tLeu prepared in Comparative Example 1-2-2.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-pFPhe prepared in Comparative Example 1-2-3.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Phg prepared in Comparative Example 1-2-4.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of PEG-FL prepared in Comparative Example 1-3. It shows the group mean value of the sample concentration transition in rat plasma calculated in Example 3-2-2. It is the graph which plotted the group average value of the sample concentration transition in the rat plasma computed in Example 3-2-2. It is the graph which plotted the group average value of the sample concentration transition in the rat plasma computed in Example 3-2-2.
  • 2 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Ala / FL prepared in Example 1-4-1 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 2 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Ser / FL prepared in Example 1-4-2 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 3 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Glu / FL prepared in Example 1-4-3 to size exclusion chromatography.
  • FIG. FIG. 2 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Gly / FL prepared in Example 1-4-4 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 6 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Val / FL prepared in Example 1-4-5 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 6 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Leu / FL prepared in Example 1-4-6 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 3 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Ile / FL prepared in Example 1-4-7 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 6 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Thr / FL prepared in Example 1-4-8 to size exclusion chromatography.
  • FIG. FIG. 3 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Asp / FL prepared in Example 1-4-9 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 3 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-cACHCA / FL prepared in Example 1-4-10 to size exclusion chromatography.
  • 2 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-tACHCA-OEt / FL prepared in Example 1-4-11 to size exclusion chromatography.
  • 2 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Aib / FL prepared in Example 1-4-12 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 3 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-ACBuCA-OEt / FL prepared in Example 1-4-13 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 3 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Asn / Rh prepared in Example 1-4-14 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 6 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Ala-NH 2 / Rh prepared in Example 1-4-15 to size exclusion chromatography.
  • 6 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Val-NH 2 / Rh prepared in Example 1-4-16 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 3 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Asn-NH 2 / Rh prepared in Example 1-4-17 to size exclusion chromatography.
  • 2 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Me / FL prepared in Example 1-4-18 to size exclusion chromatography.
  • 2 is a chromatogram obtained by subjecting a rat urine sample administered with HA-Pr / FL prepared in Example 1-4-19 to size exclusion chromatography.
  • 2 is a chromatogram obtained by subjecting a rat urine sample administered with HA-FL prepared in Comparative Example 1-1-1 to size exclusion chromatography.
  • 2 is a chromatogram obtained by subjecting a rat urine sample administered with HA-EDOBEA-Ac / FL prepared in Comparative Example 1-1-2 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 3 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Phe / FL prepared in Comparative Example 1-1-3 to size exclusion chromatography.
  • 4 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Tyr / FL prepared in Comparative Example 1-1-4 to size exclusion chromatography.
  • 6 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-MePhe / FL prepared in Comparative Example 1-1-5 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 6 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Pro-OMe / FL prepared in Comparative Example 1-1-6 to size exclusion chromatography.
  • FIG. 7 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Gly-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-7 to size exclusion chromatography.
  • 6 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Ser-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-8 to size exclusion chromatography.
  • 10 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Leu-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-9 to size exclusion chromatography.
  • 2 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Ile-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-10 to size exclusion chromatography.
  • 2 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Thr-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-11 to size exclusion chromatography.
  • 2 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Gln-NH 2 / Rh prepared in Comparative Example 1-1-12 to size exclusion chromatography. It is a table
  • FIG. 6 is a chromatogram obtained by subjecting a urine sample of a rat administered with HA-Ala-PTH / Rh prepared in Example 5-5 to size exclusion chromatography.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is not particularly limited as long as it is a hyaluronic acid derivative containing one or more disaccharide units represented by the formula (I).
  • the ratio of the disaccharide unit of the formula (I) to the disaccharide repeating unit present in the hyaluronic acid derivative of the present invention is, for example, 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 90%. % Or more.
  • the upper limit may be 100% or less.
  • a hyaluronic acid derivative comprising one or more disaccharide units represented by the formula (I) and one or more disaccharide units represented by the formula (II) and / or (III): Provided.
  • the hyaluronic acid derivative is substantially composed of disaccharide units of the formulas (I) and (II).
  • the hyaluronic acid derivative is, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% of the disaccharide repeating units composed of D-glucuronic acid and N-acetylglucosamine contained in the derivative.
  • the above is the disaccharide unit of the formula (I) or (II). In one embodiment of the present invention, it is composed only of the disaccharide units represented by the above formulas (I) and (II).
  • the hyaluronic acid derivative is substantially composed of disaccharide units of the formulas (I), (II) and (III).
  • the hyaluronic acid derivative is, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% of the disaccharide repeating units composed of D-glucuronic acid and N-acetylglucosamine contained in the derivative.
  • the above is the disaccharide unit of the formula (I), (II) or (III). In one embodiment of the present invention, it is composed only of disaccharide units represented by the above formulas (I), (II) and (III).
  • the ratio of the specific disaccharide unit to the repeating unit of the disaccharide present in the hyaluronic acid derivative of the present invention is preferably included in the fixed amount of the hyaluronic acid derivative of the present invention which is a polysaccharide having the disaccharide unit as a repeating unit.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are all hydrogen atoms.
  • R 8 is preferably a hydrogen atom or C 1-6 alkylcarbonyl, more preferably a hydrogen atom or acetyl, and even more preferably acetyl.
  • R 1a , R 2a , R 3a and R 4a , and R 1b , R 2b , R 3b and R 4b are preferably all hydrogen atoms.
  • R 8a and R 8b are preferably a hydrogen atom or C 1-6 alkylcarbonyl, more preferably a hydrogen atom or acetyl, and more preferably acetyl.
  • R x is a hydrogen atom or C 1-6 alkyl such as methyl or ethyl, and is preferably a hydrogen atom.
  • R y is a hydrogen atom or C 1-6 alkyl such as methyl or ethyl, and is preferably a hydrogen atom, methyl or ethyl.
  • examples thereof include 1,1-cyclohexylene, 1,2-cyclohexylene, 1,3-cyclohexylene, 1,4-cyclohexylene.
  • examples include silene, 1,1-cyclopentylene, 1,2-cyclopentylene, 1,3-cyclopentylene, 1,1-cyclobutylene, 1,2-cyclobutylene, 1,3-cyclobutylene, and the like.
  • Preferred examples include 1,1-cyclohexylene, 1,2-cyclohexylene, 1,4-cyclohexylene and 1,1-cyclobutylene.
  • C 3-8 cycloalkylene is preferably 1,1-cyclohexylene, 1,2-cyclohexylene, or 1,1-cyclobutylene. From the viewpoint of delivering the drug into the cytoplasm, C 3-8 cycloalkylene is preferably 1,4-cyclohexylene.
  • B when B is phenylene, examples thereof include 1,2-phenylene, 1,3-phenylene, and 1,4-phenylene. Preferable examples include 1,4-phenylene and 1,3-phenylene.
  • B when B is phenylene, 1,4-phenylene is a particularly preferable example.
  • Phenylene may be substituted with one or more groups selected from hydroxy and halogen atoms.
  • substituted phenylene include 2-hydroxy-1,4-phenylene, 3-hydroxy-1,4-phenylene, 2,3-dihydroxy-1,4-phenylene, and 3,5-dihydroxy-1 , 4-phenylene, 5-hydroxy-1,3-phenylene, 3-hydroxy-1,2-phenylene, 4-hydroxy-1,2-phenylene; 2-chloro-1,4-phenylene, 2-iodo-1 , 4-phenylene, 3-bromo-1,4-phenylene, 2,6-difluoro-1,4-phenylene, 3,5-dichloro-1,4-phenylene, 5-chloro-1,3-phenylene, 3, -Bromo-1,2-phenylene, 4-chloro-1,2-phenylene, 6-fluoro-2-hydroxy-1,4-phenylene, 5-chloro-3-iodo-1,4-pheny 2-bromo-3-hydroxy-1,4
  • R c is C 1-6 alkyl optionally substituted with carbamoyl (—CONH 2 ), preferably methyl, isopropyl or carbamoylmethyl, more preferably isopropyl or carbamoylmethyl.
  • R ya and R yb are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl and C 1-6 alkylcarbonyl, preferably both are hydrogen atoms; one is a hydrogen atom and the other is C 1 -6 alkyl; one is a hydrogen atom and the other is a C 1-6 alkylcarbonyl, more preferably both are hydrogen atoms; one is a hydrogen atom and the other is methyl; one is a hydrogen atom and the other is ethyl, Preferably, both are hydrogen atoms.
  • Examples of X in the formula (I) include the following groups.
  • the exemplified groups are preferable groups from the viewpoint of having both biodegradability and blood retention properties.
  • R y , R ya , R yb are as defined herein].
  • a defined by formula (I) is -CR a R b- (R a is as defined above.
  • R b is selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl (C 1-6 alkyl may be substituted with a group selected from hydroxy and carboxy), and B is Preferably, it is a direct bond; or A is C 3-8 cycloalkylene and B is a direct bond.
  • X defined by formula (I) is —NHCH 3 , —NH (CH 2 ) 2 CH 3 or NR x is —CHR c —CONR ya R yb ;
  • A is —CR a R b — (R a is as defined above, R b is a hydrogen atom and a C 1-6 alkyl (C 1 -6 alkyl is optionally substituted with a group selected from hydroxy, carboxy and carbamoyl) and B is a direct bond; or A is C 3-8 cycloalkylene And B is preferably a direct bond.
  • R a a hydrogen atom and methyl are more preferable, and a hydrogen atom is more preferable.
  • R b is preferably a hydrogen atom and C 1-4 alkyl (C 1-4 alkyl may be substituted with a group selected from hydroxy and carboxy), and may be methyl optionally substituted with hydroxy Further preferred. Examples of preferred R b include a hydrogen atom and C 1-4 alkyl (C 1-4 alkyl may be substituted with a group selected from hydroxy, carboxy and carbamoyl).
  • B is preferably cyclohexane-1,2-diyl and cyclobutane-1,1-diyl, more preferably cyclohexane-1,2-diyl.
  • a steric configuration of —NR x — and —COOR y on the cyclohexane ring both cis configuration and trans configuration are preferable.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention may contain only the cis configuration or the trans configuration as the configuration of —NR x — and —COOR y on the cyclohexane ring, or the cis configuration and the trans configuration exist in an arbitrary ratio. May be. Or the stereochemistry of each group may be single and may exist in arbitrary ratios.
  • preferable X is, for example, a group represented by the following formula:
  • X include the following groups:
  • X include the following groups:
  • particularly preferred X include the following groups:
  • the proportion of the disaccharide unit of the formula (I) in the disaccharide repeating unit present in the hyaluronic acid derivative of the present invention is preferably 70% or more, More preferably, it is 75% or more, More preferably, it is 90% or more.
  • a as defined in formula (I) is C 3-8 cycloalkylene and B is a direct bond;
  • A is —CH 2- and B is selected from phenylene and C 3-8 cycloalkylene; or
  • A is 2-cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1-diyl and It is preferably selected from 3-phenylpropane-1,1-diyl and B is a direct bond.
  • a as defined in formula (I) is —CH 2 — and B is selected from cyclohexane-1,1-diyl and benzene-1,4-diyl; or A is 2- Selected from cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1-diyl and 3-phenylpropane-1,1-diyl.
  • a as defined by formula (I) is C 3-8 cycloalkylene and B is a direct bond; CH 2 — or —CH 2 —CH 2 —, wherein B is phenylene (wherein phenylene may be substituted with one or more groups selected from hydroxy and halogen atoms), C 3-8 cycloalkylene And phenylmethane-1,1-diyl; or A is 2-cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1-diyl, 3-phenylpropane-1 , 1-diyl, cyclohexylmethane-1,1-diyl and 4-hydroxyphenylmethane-1,1-diyl, preferably B is a direct bond.
  • a defined by formula (I) is —CH 2 —, and B is cyclohexane-1,1-diyl, benzene-1,4-diyl, benzene-1,3-diyl, 2-chlorobenzene.
  • A is —CH 2 CH 2 — and B is benzene-1,4-diyl; or
  • A is 2 Selected from cyclohexylethane-1,1-diyl, 2- (2-naphthyl) ethane-1,1-diyl and 3-phenylpropane-1,1-diyl;
  • X include the following groups:
  • each asymmetric point includes only the R configuration, only the S configuration, and the R configuration and the S configuration in an arbitrary ratio. May be.
  • Q + is not particularly limited as long as it is a counter cation that forms a salt with carboxy in water, and when it is divalent or more, it forms a plurality of salts with carboxy depending on the valence.
  • counter cations include metal ions such as lithium ion, sodium ion, rubidium ion, cesium ion, magnesium ion, calcium ion; formula: N + R j R k R l R m (where R j , R k , R 1 and R m are each independently selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl), preferably sodium ion, potassium ion, tetraalkylammonium ion ( For example, tetra n-butylammonium ion).
  • R j , R k , R 1 and R m are preferably the same group selected from C 1-6 alkyl, and are preferably n-butyl.
  • examples of Xb include the following groups: -HN- (CH 2 ) j -SH; —HN—CH 2 —CH 2 — (Y 1 —CH 2 —CH 2 ) c —SH; —HN— (CH 2 ) p —O—CO—C (R 7 ) ⁇ CH 2 ; —HN— (CH 2 ) 1 —NHCO—C (R 7 ) ⁇ CH 2 ; —HN—CH 2 —CH 2 — (Y 1 —CH 2 —CH 2 ) c —NHCO—C (R 7 ) ⁇ CH 2 ; or —HN—CH 2 —CH 2 — (Y 1 —CH 2 —CH 2 ) c— O—CO—C (R 7 ) ⁇ CH 2 [Wherein j, Y l , c, p, R 7 , and l are as previously defined herein].
  • C 1-6 alkyl means linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, “C 1-4 alkyl” such as s-butyl, i-butyl, t-butyl and the like, and n-pentyl, 3-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3-ethylbutyl, 2-ethylbutyl and the like.
  • C 1-6 alkylcarbonyl means an alkylcarbonyl having a linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms, such as acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, pivaloyl, valeryl. , Isovaleryl, hexanoyl and the like.
  • aryl means an aromatic carbocyclic group, for example, an aromatic carbocyclic group having 6 to 14 carbon atoms.
  • aryl include phenyl, naphthyl (1-naphthyl, 2-naphthyl and 3 -Naphthyl).
  • C 3-8 cycloalkyl means a cyclic alkyl having 3 to 8 carbon atoms and includes, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, and cyclooctyl.
  • C 3-8 cycloalkylene means a divalent cyclic alkyl having 3 to 8 carbon atoms, such as cyclopropylene, cyclobutylene, cyclopentylene, cyclohexylene, cycloheptylene, and cyclopropylene.
  • Octylene is included. More specific examples include 1,1-cyclohexylene, 1,2-cyclohexylene, 1,3-cyclohexylene, 1,4-cyclohexylene, 1,1-cyclopentylene, 1,2-cyclopentylene. And the like include 1,3-cyclopentylene, 1,1-cyclobutylene, 1,2-cyclobutylene, 1,3-cyclobutylene, and the like.
  • Preferred examples include 1,1-cyclohexylene, 1,2-cyclohexylene, 1,4-cyclohexylene and 1,1-cyclobutylene.
  • phenylene means a divalent group in which two hydrogen atoms of benzene are substituted. Benzene-1,2-diyl, benzene-1,3-diyl, benzene-1,4- Jile is included.
  • C 1-10 alkylene means a linear or branched alkylene group having 1 to 10 carbon atoms, such as methylene, ethane-1,2-diyl, propane-1.3- Diyl, butane-1,4-diyl, pentane-1,5-diyl, hexane-1,6-diyl, heptane-1,7-diyl, octane-1,8-diyl, nonane-1,9-diyl, Decane-1,10-diyl, propane-1,2-diyl, 2-methylpropane-1,3-diyl, butane-2,4-diyl, 3-methylbutane-1,4-diyl, 2-methylpentane- 1,5-diyl, 4-ethylhexane-1,6-diyl, 4-methylheptane-2,7-diyl, 5-ethyloctan
  • C 1-10 alkylene having 1 to 3 C 3-8 cycloalkylene or phenylene inserted refers to 1 to 3, preferably 1 phenylene or C 3-8 cycloalkylene inserted. Or a C 1-10 alkylene group.
  • G 4 include, for example, phenylene or a group represented by the following formula:
  • the “halogen atom” means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom.
  • Xc is a halogen atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom are preferable, and a bromine atom and an iodine atom are preferable from the viewpoint of reactivity with mercapto in a drug.
  • the drug carrier is biodegradable
  • the drug carrier detected in urine is reduced in molecular weight between 2 weeks after intravenous administration to rats and / or humans.
  • intracellular means the inside of a cell membrane including endosomes and cell nuclei.
  • intracytoplasm means the inside of the cell membrane excluding endosomes and cell nuclei from “intracellular”.
  • endosome means a vesicle formed of a biological membrane formed in the process of taking up a substance by a cell and a vesicle formed by fusing them with a lysosome.
  • “Making low molecular weight” can be determined by measuring the size of a drug carrier excreted in urine by subjecting it to size exclusion column chromatography (see Example 3-3 in this specification). reference). At this time, the peak top of the urine-derived drug carrier observed at any one time point during the period up to 2 weeks after administration or a period of 24 hours is derived from the urine sample collected at a previous time point or period. If the drug carrier has shifted to the low molecular weight side compared to the peak top of the drug carrier (that is, the retention time in the column chromatogram becomes longer), it is determined that the drug carrier is biodegradable.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention containing one or more disaccharide units represented by the formula (I) is, for example, a hyaluronic acid or a derivative thereof substantially consisting of a disaccharide unit represented by the formula (II), more preferably It is synthesized using hyaluronic acid (including salt and the like) composed only of the disaccharide unit represented by the formula (II) as a raw material.
  • the raw material hyaluronic acid has a weight average molecular weight of 20 to 120 kilodaltons, preferably 20 to 30 kilodaltons, and 50 to 120 kilodaltons.
  • Preferable weight average molecular weights include, for example, 25 kilodalton and 99 kilodalton. From the viewpoint of improving blood retention, the lower limit of the weight average molecular weight may be 5 kilodaltons or more, preferably 50 kilodaltons or more, and more preferably 99 kilodaltons or more. The upper limit of the weight average molecular weight is preferably 250 kilodaltons or less.
  • the preferred weight average molecular weight is 50 to 120 kilodaltons, for example, 99 kilodalton, and from the viewpoint of cytoplasmic transferability, the preferred weight average molecular weight is 20 to 120 kilodaltons, for example, 25 and 99 kilodaltons.
  • the weight average molecular weight of hyaluronic acid (including salt) composed of only a disaccharide unit represented by the formula (II) used as a raw material of 20 to 120 kilodaltons is the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • all of R 1a , R 2a , R 3a , and R 4a are hydrogen atoms
  • R 8a is acetyl
  • X a is —O ⁇ Na +. It means the weight average molecular weight when converted as.
  • the weight average molecular weight is 400 kilodaltons.
  • the weight average molecular weight calculated in accordance with the above is calculated to be 20 to 120 kilodaltons, it is included in one preferred embodiment of the present invention.
  • the method for measuring the HA weight average molecular weight is, for example, a light scattering method, an osmotic pressure method, a viscosity method described in Seiichi Nakahama et al., “Essential Polymer Science” (published by Kodansha, ISBN4-06-153310-X).
  • various known methods can be used.
  • the weight average molecular weight measured by the light scattering method shown in the present specification is usually used in the technical field to which the present invention belongs, such as using a multi-angle light scattering detector (SEC-MALLS) connected to a size exclusion chromatography apparatus. It can be measured by the method used.
  • SEC-MALLS multi-angle light scattering detector
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is substantially composed of a disaccharide unit represented by the formula (II) having a weight average molecular weight of 500 kilodaltons, preferably 250 kilodaltons or less.
  • the hyaluronic acid (including salts and the like) can be produced as a raw material.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is a hyaluronic acid derivative substantially composed of disaccharide units of formulas (I) and (II).
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention containing a disaccharide unit represented by the formula (I) can be produced by converting carboxy in the glucuronic acid moiety into an amide.
  • a raw material hyaluronic acid (including a salt) preferably a hyaluronic acid composed only of a disaccharide unit represented by the formula (II) is converted into a tetraalkylammonium salt (for example, a tetrabutylammonium (TBA) salt.
  • TSA tetrabutylammonium
  • the hyaluronate and the formula: HNR x -AB-COOR z (wherein R z is an ester-forming group for protecting carboxy). And R x , A and B are as defined herein) or a compound of formula: HNR x -A-CONR ya R yb is reacted with a protecting group A method of performing deprotection is mentioned.
  • the ester forming group is not particularly limited, and is not particularly limited as long as it is a group usually used for protecting carboxy. Examples of the ester forming group, C 1-6 alkyl, benzyl, C 1-6 alkoxy C 1-6 alkyl, and benzyloxy C 1-6 alkyl.
  • the groups in the formula (I): —NR x —AB—COOR z and —NR x —A—CONR ya R yb may be the same or different in each of a plurality of disaccharide units.
  • the above reaction may be performed using different types of compounds represented by formulas: HNR x -AB-COOR z and / or HNR x -A-CONR ya R yb .
  • the condensing agent that can be used in the above reaction is not particularly limited.
  • DMT-MM 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine) -4-methylmorpholium
  • CDI N , N′-carbonyldiimidazole
  • DCC N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
  • EEDQ N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline
  • PyBOP 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine) -4-methylmorpholium
  • CDI N , N′-carbonyldiimidazole
  • DCC N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
  • DMT-MM is preferable in that the reaction proceeds with high efficiency even in a mixed solvent of water and an organic solvent.
  • DMT-MM as a condensing agent, it is possible to highly selectively form an amide bond with amino and carboxy while suppressing the formation of an ester bond in a system in which many hydroxy groups coexist.
  • this condensing agent for example, alcohol as a solvent reacts with carboxy of the hyaluronic acid moiety, or carboxy and hydroxy simultaneously present in the hyaluronic acid moiety are bonded within the molecule or between the molecules, which is undesirable. It is possible to prevent the formation of a crosslink.
  • Solvents used in the above reaction include water, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMAc), 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI), sulfolane (SF), N- Mention may be made of methylpyrrolidone (NMP), dioxane (for example, 1,4-dioxane), methanol, ethanol, propanol, butanol, acetonitrile, tetrahydrofuran, dichloromethane, chloroform, hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and mixed solvents thereof. .
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF dimethylformamide
  • DMAc dimethylacetamide
  • DI 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone
  • SF sulfolane
  • NMP methylpyrrolidone
  • dioxane
  • DMSO dimethyl methacrylate
  • water / DMSO mixed solvent it is preferable to use DMSO alone or a water / DMSO mixed solvent.
  • amino-carboxylic acid it may be used in the reaction as a methanol solution or dioxane solution.
  • HNR x -AB-COOR z examples include, for example, alanine ester, serine ester, glutamic acid diester, glycine ester, valine ester, leucine ester, isoleucine ester, threonine ester, aspartic acid diester, cis- 2-amino-1-cyclohexylcarboxylic acid ester, trans-2-amino-1-cyclohexylcarboxylic acid ester, 2-aminoisobutanoic acid ester, 1-amino-1-cyclobutanoic acid ester, 1-aminomethyl-1-cyclohexane acid Esters, cis-4-aminocyclohexane ester, L-2-naphthylalanine ester, 2-aminophenylbutanoate ester, cyclohexyl-L-alanine ester, 4-aminomethylbenzoate ester, etc.
  • ester is, for example, C 1-6 alkyl ester, aryl ester, C 1-6 alkoxy C 1-6 alkyl ester, aryl C 1-6 alkyl ester, etc., preferably methyl ester, ethyl ester Benzyl ester and the like.
  • HNR x -A-CONR ya R yb examples include alanine amide, asparagine amide, aspartic acid amide, glutamine amide, glutamic acid amide, glycinamide, isoleucine amide, leucine amide, phenylalanine amide, serine amide, Examples include threonine amide, tyrosine amide, and valine amide.
  • a method for producing a derivative in which X is —NHCH 3 and —NH (CH 2 ) 2 CH 3 includes, for example, A method of reacting the tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid with the compound represented by NH 2 CH 3 and NH 2 (CH 2 ) 2 CH 3 in a solvent in the presence of a suitable condensing agent. Is mentioned.
  • the condensing agent and the solvent already described in the present specification can be used.
  • the modification rate by each amine can be adjusted by controlling, for example, the equivalent number of the condensing agent and / or amine for the HA unit, the reaction temperature, the reaction time, and the like.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention containing the disaccharide unit represented by the formula (III), for example, the above-mentioned tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid and a suitable condensing agent in the presence of the solvent.
  • R e , Y b , R 7 , G 4 , and X c are as previously defined herein
  • a method of reacting with a compound to be removed and deprotecting when a protecting group is present In the above reaction, the condensing agent and the solvent already described in the present specification can be used.
  • protecting group used in the above reaction include T.I. W. Greene, P.M. G. M.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc. , New York, 1999.
  • hydroxy protecting groups include C 1-6 alkylcarbonyl, arylcarbonyl, heteroarylcarbonyl, C 1-6 alkoxycarbonyl, C 1-6 alkoxy C 1-6 alkyl, C 1-6 alkylaminocarbonyl, di (C 1-6 alkyl) aminocarbonyl, aryl C 1-6 alkyl, heteroaryl C 1-6 alkyl, aryl C 1-6 alkylaminocarbonyl, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkylsulfonyl, ((amino C 1-6 alkyl) carbonyloxy) C 1-6 alkyl, unsaturated heterocyclic carbonyloxy C 1-6 alkyl, aryldi (C 1-6 alkyl) silyl, tri (C 1-6 alkyl) silyl and the like.
  • Preferred hydroxy protecting groups include acetyl and the like.
  • Examples of —NH— or amino protecting groups include C 1-6 alkylcarbonyl, aryl C 1-6 alkylcarbonyl, arylcarbonyl, heteroarylcarbonyl, C 1-6 alkoxycarbonyl, C 1-6 alkylaminocarbonyl, Examples include di (C 1-6 alkyl) aminocarbonyl, aryl C 1-6 alkyl, heteroaryl C 1-6 alkyl, (arylC 1-6 alkyl) aminocarbonyl, and the like.
  • Preferred amino protecting groups include acetyl, t-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethoxycarbonyl and the like.
  • amino may be protected to form a saturated or unsaturated heterocyclic group such as phthalic imide, succinimide, glutaric imide, and 1-pyrrolyl.
  • Examples of mercapto protecting groups include C 1-6 alkylthio such as ethylthio and t-butylthio, substituted phenylthio such as 2-nitrophenylthio and 2-carboxyphenylthio, and heteroarylthio such as 2-pyridylthio. .
  • a preferred example is 2-pyridylthio.
  • Examples of groups represented by —NR e —Y b —R d in the above formula (III) include those represented by the formula: -NH-CH 2- (CHR 5 ) 1-2 -CH 2 -NH 2 ; —NH—CH 2 —CH 2 — (Y 1 —CH 2 —CH 2 ) c —NH 2 ; —NH—CH 2 — (CHR 6 ) p-2 —CH 2 —OH; —NH—CH 2 —CH 2 — (Y 1 —CH 2 —CH 2 ) c —OH; —NH— (CH 2 ) j —SH; —NH—CH 2 —CH 2 — (Y 1 —CH 2 —CH 2 ) c —SH; —NH— (CH 2 ) p —O—CO—C (R 7 ) ⁇ CH 2 ; —NH— (CH 2 ) 1 —NHCO—C (R 7 ) ⁇ CH 2 ; —NH—CH
  • the number of CHR 5 and CHR 6 in which R 5 and R 6 are hydroxy contained in the molecule of the hyaluronic acid derivative is 0 to 8, preferably 0 to 3, more preferably 0 and 1.
  • the solubility of the hyaluronic acid derivative of the present invention in water can be adjusted.
  • l is preferably 2 to 6, and specific examples thereof include 2 and 6.
  • one of R 5 is hydroxy a specific example of 1 is 3.
  • Y 1 is an oxygen atom
  • 2 is given as a specific example of c.
  • specific examples of c include 1 to 3.
  • Specific examples of l and p include 3.
  • — (CH 2 ) a — (Y 1 — (CH 2 ) b ) c —G— include, for example, — (CH 2 ) 2 — (O—CH 2 —CH 2 ) c —O—, — (CH 2 ) 2 — (O—CH 2 —CH 2 ) c —NH—, — (CH 2 ) 3 — (O—CH 2 —CH 2 —CH 2 ) c —O—, — (CH 2 ) 3 — (O—CH 2 —CH 2 —CH 2 ) c —NH—, — (CH 2 ) 2 —NR n — (CH 2 ) 2 —O—, — (CH 2 ) 2 —NR n — (CH 2 ) 2 —NH—, — (CH 2 ) 3 —NR n — (CH 2 ) 4 —O—, — (CH 2 ) 3 —NR n — (CH 2 )
  • R d bonded to these — (CH 2 ) a — (Y 1 — (CH 2 ) b ) c —G— include, for example, a hydrogen atom, —CO—CH ⁇ CH 2 , —CO—C (CH 3 ) ⁇ CH 2 , —CO—CH 2 —Cl, —CO—CH 2 —Br, —CO—CH 2 —I, —CO—CH 2 —SH, —CO—CH 2 —CH 2 —SH Etc.
  • carboxy (—COOH) of the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid is represented by the formula: H 2 N—CH 2 — (CHR 5) is reacted with diamine represented by l-2 -CH 2 -NH 2 wherein: -CONH-CH 2 - (CHR 5) was converted to an amide represented by l-2 -CH 2 -NH 2, Further, there is a method in which the terminal amino is modified and converted to an amide represented by the group: —CONH—CH 2 — (CHR 5 ) 1 -2 —CH 2 —NHR d .
  • diamine examples include, for example, H 2 N— (CH 2 ) 2 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 3 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 4 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 5 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 6 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 7 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 8 —NH 2 H 2 N— (CH 2 ) 9 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 10 —NH 2 , H 2 N—CH 2 —CHOH—CH 2 —NH 2 , H 2 N—CH 2 —CHOH — (CH 2 ) 2 —NH 2 , H 2 N—CH 2 — (CHOH) 2 —CH 2 —NH 2 , H 2 N—CH 2 —CHOH— (CH 2 ) 3 —NH 2 , H 2 N— (CH 2) 2 -CHOH-CH-
  • carboxy (—COOH) of the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid is represented by the formula: H 2 N—CH 2 — (CHR 5) is reacted with hydroxylamine represented by p-2 -CH 2 -OH formula: -CONH-CH 2 - (CHR 5) was converted to an amide represented by p-2 -CH 2 -OH, further Examples thereof include a method in which a terminal amino is modified to convert it to an amide represented by a group: —CONH—CH 2 — (CHR 5 ) p-2 —CH 2 —OR d .
  • hydroxyamine examples include, for example, H 2 N— (CH 2 ) 2 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 3 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 4 —OH, H 2 N — (CH 2 ) 5 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 6 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 7 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 8 —OH, H 2 N— ( CH 2 ) 9 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 10 —OH, H 2 N—CH 2 —CHOH—CH 2 —OH, H 2 N—CH 2 —CHOH— (CH 2 ) 2 —OH, H 2 N—CH 2 — (CHOH) 2 —CH 2 —OH, H 2 N—CH 2 —CHOH— (CH 2 ) 3 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 2 —CHOH— (CH 2 ) 2- OH, H 2 N—CH 2 — (CHOH)
  • the group: —NR e —Y b —R d in formula (III) may be the same or different in each of a plurality of disaccharide units.
  • the above reaction may be performed using different types of compounds represented by the formula: HNR e —Y b —R d .
  • X in formula (I) is —NR x —AB—COOR y
  • X b is not only present at the position indicated in the disaccharide unit represented by formula (III), but also Part or all may be substituted with —OR y, and X may be —NR x —AB—CO—X b .
  • the non-derivatized hyaluronic acid having a main chain structure corresponding to the hyaluronic acid derivative of the present invention has a weight average molecular weight of 20 to 120 kilodaltons.
  • the non-derivatized hyaluronic acid (including a salt) is represented by the formula (II) wherein R 1a , R 2a , R 3a and R 4a are hydrogen atoms, R 8a is acetyl, and X a is ⁇ It is hyaluronic acid consisting only of disaccharide units that are O ⁇ Na + .
  • the non-derivatized hyaluronic acid has a main chain structure corresponding to the hyaluronic acid derivative of the present invention
  • the number of disaccharide units present in the non-derivatized hyaluronic acid is present in the hyaluronic acid derivative of the present invention. This is consistent with the number of disaccharide units
  • the hyaluronic acid derivative in this aspect can be produced, for example, by using hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 20 to 120 kilodalton or a sodium salt thereof as a raw material.
  • the ratio of the disaccharide unit represented by the formula (II) to the disaccharide repeating unit present is preferably 50% or less, more preferably 30% or less, and 20% or less. Is more preferable. The lower limit of the ratio may be 0% or more.
  • 50% or more of carboxy (—COOH) of the hyaluronic acid derivative is a group: —CONHCH 3 , —CONH (CH 2 ) 2 CH 3 , —CONR x —AB—COOR y , —CONR x —A -CONR ya R yb or -CONR e -Y b -R d .
  • a hyaluronic acid derivative containing a carbon-carbon double bond reactive in the disaccharide unit represented by the formula (III) is a crosslinking agent having two or more mercaptos (for example, dithiothreitol: DTT, butanedithiol, polyethylene glycol) Dithiol) can be subjected to a crosslinking reaction.
  • a hyaluronic acid derivative containing a mercapto in the disaccharide unit represented by the formula (III) is disulfide formed with a cross-linking agent having two or more mercaptos (for example, dithiothreitol: DTT, butanedithiol, polyethylene glycol dithiol).
  • a crosslinking reaction using a crosslinking agent containing two or more reactive carbon-carbon double bonds for example, divinylsulfone.
  • a hyaluronic acid derivative modified with amino and a crosslinking agent having succinimidyl ester or other imide ester at both ends of C 2-20 alkylene for example, bis [sulfosuccinimidyl] Crosslinking by condensation reaction with suberate (BS 3 ), ethylene glycol-bis [sulfosuccinimidyl] succinate (Sulfo-EGS), dimethyl adipimidate hydrochloride (DMA), etc .
  • Hyaluronic acid derivative modified with amino And a crosslinking agent having formyl at both ends of C 2-20 alkylene for example, glutaraldehyde
  • oxidation conditions of a hyaluronic acid derivative modified with mercapto for example, in the presence of sodium tetrathionate (STT))
  • STT sodium tetrathionate
  • the method for producing a hyaluronic acid derivative of the present invention includes a step of condensing a diamine with carboxy of a glucuronic acid moiety, and only a part of the diamine, for example, 10% remains unutilized by binding to a drug.
  • the hyaluronic acid derivative contains amino, it is treated with, for example, dicarboxylic anhydrides such as succinic anhydride, maleic anhydride, glutaric anhydride and adipic anhydride, or dicarboxylic acids such as maleic acid, glutaric acid and adipic acid.
  • the terminal functional group By reacting in the presence of a condensing agent, the terminal functional group can be returned to carboxy, and the cationic property of the remaining amino can be lost, or the total charge can be anionic.
  • the terminal functional group is converted to an amide by treating with carboxylic acid anhydrides such as acetic anhydride and benzoic anhydride, or by reacting carboxylic acids such as acetic acid and benzoic acid in the presence of a condensing agent.
  • carboxylic acid anhydrides such as acetic anhydride and benzoic anhydride
  • carboxylic acids such as acetic acid and benzoic acid
  • the chemical cross-linking structure of the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention may include a structure that decomposes in vivo.
  • a group having an ester bond and methacryloyl may be used as a group for the crosslinking reaction.
  • the crosslinking agent a compound having an ester bond, such as Sulfo-EGS or EDMA, or a compound having a peptide spacer that is degraded by an enzyme in a living body may be used.
  • the gel crosslinked by the disulfide bond formed by the oxidation of mercapto is decomposed in a living body by a disulfide exchange reaction or a reduction reaction.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention can be used as a carrier for a pharmaceutical composition.
  • a hyaluronic acid derivative containing a disaccharide unit represented by formula (I) and formula (III) or formula (I), formula (II) and formula (III) is used as a crosslinking agent.
  • low molecular weight compounds include, for example, anticancer agents (eg, alkylating agents, antimetabolites, alkaloids, etc.), immunosuppressive agents, anti-inflammatory agents (steroids, non-steroidal anti-inflammatory agents, etc.), antirheumatic agents. And antibacterial agents ( ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, sulfa drugs, etc.).
  • anticancer agents eg, alkylating agents, antimetabolites, alkaloids, etc.
  • immunosuppressive agents e.g., anti-inflammatory agents, steroids, non-steroidal anti-inflammatory agents, etc.
  • antirheumatic agents e.g., antirheumatic agents.
  • antibacterial agents ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, sulfa drugs
  • proteins and peptides include, for example, an anemia treatment agent, an organ protective agent erythropoietin (EPO), a neutropenia treatment granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), interferon- ⁇ , ⁇ , ⁇ , (INF- ⁇ , ⁇ , ⁇ ), thrombopoietin (TPO), serial neurotrophic factor (CNTF), tumour necrosis factor (TNF), tumour necrosis factor binding protein (TNFbp), interleukin-10 ( IL-10), FMS-like tyrosine kinase (Flt-3), growth hormone (GH), insulin, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), platelet-derived growth factor (PDGF), interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra), blur -Derived neurotrophic factor (BDNF), keratinocyte growth factor (KGF), stem cell factor (SCF), megacaryosite growth differentiation factor (MGDF), osteoprotegerin (OPG), leptin
  • nucleic acid examples include, for example, DNA, RNA, antisense, decoy, ribozyme, small interfering RNA, microRNA, RNA aptamer, and those chemically modified.
  • proteins, peptides and nucleic acids are preferable, and by encapsulating these drugs, the composition of the present invention containing proteins, peptides and nucleic acids can be obtained.
  • a hyaluronic acid derivative-drug conjugate in which one or more of the above drugs are bound to a hyaluronic acid derivative containing a disaccharide unit represented by the formula (I).
  • the hyaluronic acid derivative comprising a disaccharide unit represented by formula (I) and formula (III) or formula (I), formula (II) and formula (III) is used as the hyaluronic acid derivative.
  • a drug with a hydroxy, amino, mercapto or reactive carbon-carbon double bond (methacryloyl, acryloyl, etc.) contained in the group —NR e —Y b —R d of formula (III)
  • the hyaluronic acid derivative-drug conjugate can be prepared.
  • Part or all of the group —NR e —Y b —R d may be present in formula (I) as —NR x —AB—CO—NR e —Y b —R d. .
  • R s , R t and R u are independently selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl, i is an integer selected from 1 to 10 and q is selected from 2 to 10 An integer, k is an integer selected from 1 to 100, and r and m are independently an integer selected from 1 to 10) A spacer represented by may be inserted.
  • Glucuronic acid 4-position and hydroxy of acetylglucosamine 1-position existing at the end of the main chain of the hyaluronic acid derivative of the present invention may be converted to other groups, for example, C 1-6 alkoxy, formyloxy and C It may be 1-6 alkylcarbonyloxy.
  • the drug is encapsulated in the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention, or the hyaluronic acid derivative-drug conjugate of the present invention is one or more pharmaceutically acceptable diluents, wetting agents, emulsifiers.
  • a pharmaceutical composition containing a dispersing agent, adjuvant, preservative, buffer, binder, stabilizer and the like can be administered in any suitable form depending on the intended route of administration.
  • the route of administration may be a parenteral route or an oral route.
  • a highly safe sustained-release preparation capable of long-term sustained release of drugs such as proteins, peptides, nucleic acids, and low molecular weight compounds, which cannot be obtained by conventional sustained-release preparations, and having appropriate biodegradability
  • drugs such as proteins, peptides, nucleic acids, and low molecular weight compounds
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention has a function of promoting the release of the drug from the endosome into the cytoplasm in the pathway where the drug is taken into the cell via endocytosis, so that the drug is efficiently taken into the cytoplasm. It is also possible to provide pharmaceutical formulations and pharmaceutical compositions.
  • the HA unit means a repeating unit (1 unit) of N-acetylglucosamine-glucuronic acid in hyaluronic acid.
  • NMR measurement was performed using a nuclear magnetic resonance apparatus (JNM-ECA500, manufactured by JEOL Ltd.). NMR measurement conditions are shown below.
  • Example 1 Synthesis of hyaluronic acid derivative (Example 1-1) Tetrabutylammonium (TBA) chloride cation exchange resin DOWEX (registered trademark) 50WX-8-400 (manufactured by Sigma-Aldrich) in ultrapure water The suspension was suspended, and the resin was washed about 3 times with ultrapure water by decantation. A 40 wt% tetrabutylammonium hydroxide aqueous solution (TBA-OH) (manufactured by Sigma-Aldrich) was added in an amount of about 1.5 times the molar equivalent of the cation exchange capacity of the resin and stirred for 30 minutes. After the excess TBA-OH solution was removed by decantation, washing with excess ultrapure water was repeated, and finally filtration was performed using a 0.45 ⁇ m filter to obtain a cation exchange resin that had been TBA-chlorinated.
  • TBA-OH Tetrabutylammonium hydroxide aqueous solution
  • Example 1-2 Preparation of HA TBA salt (HA-TBA) Hyaluronic acid sodium salt (HA-Na, manufactured by Shiseido Co., Ltd.) having a molecular weight of 25 kDa and 99 kDa was dissolved in ultrapure water at a concentration of 15 mg / mL. did.
  • the TBA salified cation exchange resin obtained in Example 1-1 was added in an amount equivalent to 5 times the molar amount of the HA unit (unit molecular weight 401.3) in terms of the ion exchange capacity of the resin. After stirring for 15 minutes, filtration was performed using a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was freeze-dried to obtain HA-TBA as a white solid.
  • FIG. 1 shows a 1 H-NMR spectrum using 99 kDa HA—Na as a starting material and D 2 O as a solvent.
  • the amount ratio of TBA to the HA unit was calculated from the integral value of 1.7 ppm; 16H), and the unit average molecular weight of HA-TBA was calculated from this ratio.
  • the unit average molecular weight of HA-TBA starting from 99 kDa HA-Na was 752.6.
  • Example 1-3 Synthesis of HA Fluorescein (FL) Labeled TBA Salt (HA-FL / TBA) HA-Na (99 kDa) synthesized in Example 1-2 as a starting material
  • An anhydrous DMSO solution of TBA (10 mg / mL) was prepared. Thereafter, 5- (aminomethyl) fluorocein hydrochloride (manufactured by Invitrogen) was added in an amount of 0.05 molar equivalent to the HA unit.
  • 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM, manufactured by Kokusan Chemical Co., Ltd.) was added to the HA unit.
  • FIG. 2 shows a 1 H-NMR spectrum of a product using D 2 O as a measurement solvent.
  • the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integration of four methyl ((N (CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ) 4 , 1.0 ppm; 12H) of TBA From this value, the amount ratio of TBA to the HA unit was calculated, and the unit average molecular weight of HA-TBA was calculated from this ratio.
  • the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine and 3- (trimethylsilyl) propion used as an internal standard The HA unit content per weight was quantified from the integrated value of the methyl-derived peak (—Si (CH 3 ) 3 , 0.0 ppm; 9H) of sodium acid-d 4 (TSP-d 4 ). Dissolve in 50 mM carbonate buffer (pH 9.0) at 0.05 mg / mL, and determine FL content per weight from its absorbance at 491 nm , Modification ratio by .FL calculating the modification rate by FL at HA units was 3-6% in each lot.
  • Example 1-4 Synthesis of HA Derivative from HA-TBA or HA-FL / TBA
  • Example 1-4-1 HA derivative modified with L-alanine (Ala) (HA-Ala / FL)
  • An anhydrous DMSO solution (5 mg / mL) of HA-TBA synthesized in Example 1-2 using HA-Na (99 kDa) as a starting material was prepared. Thereafter, L-alanine ethyl ester hydrochloride (manufactured by Aldrich) was added in an amount equivalent to 3 times the molar amount of HA unit and 0.15 times the equivalent amount of 5- (aminomethyl) fluorocein hydrochloride.
  • a 6-fold molar equivalent of DMT-MM was added to the HA unit and stirred overnight at room temperature.
  • the reaction solution was dialyzed in the order of DMSO, 0.3 M NaCl aqueous solution, and ultrapure water (Spectrapore 4, fractional molecular weight (MWCO): 12 k-14 kDa).
  • MWCO fractional molecular weight
  • 2N NaOH was added to adjust the pH to 12.5 or higher, and the mixture was stirred for 1 hour to hydrolyze the ethyl ester, and carboxy was deprotected. Thereafter, the mixture was neutralized with 2N HCl, dialyzed, and lyophilized to obtain HA-Ala / FL as a yellow solid.
  • FIG. 3-1 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the peak derived from the acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methyl in alanine (—CH 3 , 1.4 ppm; 3H), The modification rate by alanine in the HA unit was calculated (Table 1).
  • Example 1-4-2 Synthesis of HA derivative (HA-Ser / FL) modified with L-serine (Ser) Except that L-serine ethyl ester hydrochloride (manufactured by Aldrich) was used instead of L-alanine ethyl ester hydrochloride, the same procedure as in Example 1-4-1 was carried out, and HA-Ser / FL was yellow. Obtained as a solid. A part of the dialysis solution before deprotection of carboxy was taken and freeze-dried to obtain a modification rate calculation sample (HA-Ser-OEt / FL).
  • L-serine ethyl ester hydrochloride manufactured by Aldrich
  • FIG. 3-2 shows the 1 H-NMR spectrum of the modification rate calculation sample measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (—CH 3 , 1.3 ppm; 3H) in the ethyl ester of serine, Example In the same manner as in 1-4-1, the modification rate by serine in the HA unit was calculated (Table 1). Further, FIG. 3-2 shows a 1 H-NMR spectrum obtained by measuring the deprotected sample under the same conditions as described in Example 1-3.
  • Example 1-4-3 Synthesis of HA derivative (HA-Glu / FL) modified with L-glutamic acid (Glu) L-glutamic acid diethyl ester hydrochloride (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) instead of L-alanine ethyl ester hydrochloride HA-Glu / FL was obtained as a yellow solid in the same manner as in Example 1-4-1 except that Co., Ltd. was used.
  • FIG. 3-3 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the peak derived from acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methylene of glutamic acid (—CH 2 CH 2 COOH, 2.3 ppm; 2H), Example 1 The modification rate of glutamic acid in the HA unit was calculated in the same manner as in 4-1 (Table 1).
  • the peak derived from acetyl of glucosamine is overlapped with another methylene-derived peak of glutamic acid (—CH 2 CH 2 COOH, 2.1 ppm; 2H), so that the integration of 1.7 to 2.2 ppm peak is integrated.
  • the value obtained by subtracting the integrated value of the peak at 2.3 ppm from the value was used as a peak derived from acetyl of glucosamine and used for calculation of the modification rate.
  • Example 1-4-4 Synthesis of HA derivatives (HA-Gly and HA-Gly / FL) modified with glycine (Gly)
  • An anhydrous DMSO solution of HA-TBA synthesized in Example 1-2 (5 mg / mL)
  • HA-FL / TBA synthesized in Example 1-3 was used as an ultrapure water / DMSO mixed solution (1: 3) solution (about 4 mg / mL) as a starting material.
  • Glycine ethyl ester hydrochloride manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was added at a 5-fold molar equivalent to the HA unit.
  • FIG. 3-4 shows the 1 H-NMR spectrum of the sample for calculating the modification rate measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (-COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (-CH 3 , 1.3 ppm; 3H) in the ethyl ester of glycine, The modification rate by glycine in the HA unit was calculated in the same manner as in 1-4-1 (Table 1). In addition, FIG. 3-4 shows a 1 H-NMR spectrum obtained by measuring the deprotected sample under the same conditions as described in Example 1-3.
  • Example 1-4-5 Synthesis of HA derivatives (HA-Val and HA-Val / FL) modified with L-valine (Val) L-valine ethyl ester hydrochloride (Watanabe) instead of glycine ethyl ester hydrochloride Except for using Chemical Industries, Ltd.), the same method as in Example 1-4-4 was performed to obtain HA-Val as a white solid and HA-Val / FL as a yellow solid.
  • FIG. 3-5 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the two methyl-derived peaks (—CH (CH 3 ) 2 , 0.9 ppm; 6H) in valine Then, the modification rate by valine in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-4-1 (Table 1).
  • acetyl peak of glucosamine is overlapped with the hydrogen peak at the 3rd position of valine (—CH (CH 3 ) 2 , 2.1 ppm; 1H), so the peak of 1.8 to 2.2 ppm A value obtained by subtracting a value obtained by multiplying the integral value of the 0.9 ppm peak by 1/6 from the integral value was used as a peak derived from acetyl of glucosamine to calculate the modification rate.
  • Example 1-4-6 Synthesis of HA Derivatives Modified with L-Leucine (Leu) (HA-Leu and HA-Leu / FL) L-leucine ethyl ester hydrochloride (Tokyo) instead of glycine ethyl ester hydrochloride Except for using Kasei Kogyo Co., Ltd., the same method as in Example 1-4-4 was performed to obtain HA-Leu as a white solid and HA-Leu / FL as a yellow solid.
  • FIG. 3-6 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the two methyl-derived peaks (—CH (CH 3 ) 2 , 0.9 ppm; 6H) in leucine In the same manner as in Example 1-4-1, the modification rate of leucine in the HA unit was calculated (Table 1).
  • Example 1-4-7 Synthesis of HA derivatives modified with L-isoleucine (Ile) (HA-Ile and HA-Ile / FL)
  • Anhydrous DMSO was used as a solvent, and instead of glycine ethyl ester hydrochloride Except that L-isoleucine methyl ester hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.) was used in the same manner as in Example 1-4-4.
  • HA-Ile was a white solid and HA-Ile / FL was Obtained as a yellow solid.
  • FIG. 3-7 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • acetyl-derived peak of glucosamine is overlapped with the hydrogen peak at the 3-position of isoleucine (—CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 , 1.9 ppm; 1H), so 1.8 to 2.2 ppm
  • a value obtained by subtracting a value obtained by multiplying the integrated value of the peak at 0.9 ppm by 1/6 from the integrated value of the peak was used as the peak derived from acetyl of glucosamine, and used for calculation of the modification rate.
  • Example 1-4-8 Synthesis of HA Derivatives Modified with L-Threonine (Thr) (HA-Thr and HA-Thr / FL) Hydrochloride of L-threonine methyl ester instead of glycine ethyl ester hydrochloride ( Except for using Bachem), the same procedure as in Example 1-4-4 was carried out to obtain HA-Thr as a white solid and HA-Thr / FL as a yellow solid.
  • FIG. 3-8 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (—CH 3 , 1.2 ppm; 3H) in threonine, Example 1-4 In the same manner as in -1, the modification rate of threonine in the HA unit was calculated (Table 1).
  • Example 1-4-9 Synthesis of HA derivatives (HA-Asp and HA-Asp / FL) modified with L-aspartic acid (Asp) L-aspartic acid diethyl ester hydrochloride instead of glycine ethyl ester hydrochloride Except for using Watanabe Chemical Co., Ltd., the same method as in Example 1-4-4 was carried out to obtain HA-Asp as a white solid and HA-Asp / FL as a yellow solid.
  • FIG. 3-9 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (-COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methylene-derived peak (-CH 2 COOH, 2.7, 2.8 ppm; 2H) in aspartic acid In the same manner as in Example 1-4-1, the modification rate of the HA unit with aspartic acid was calculated (Table 1).
  • Example 1-4-10 Synthesis of HA derivative (HA-cACHCA / FL) modified with cis-2-amino-1-cyclohexylcarboxylic acid (cACHCA) Hydrochloric acid of cACHCA ethyl ester instead of glycine ethyl ester hydrochloride
  • cACHCA cis-2-amino-1-cyclohexylcarboxylic acid
  • the HA-cACHCA / FL was converted to yellow using the same method as in Example 1-4-4, except that the salt (Acros) was used and carboxy deprotection was performed using 5N NaOH at pH 13.2. Obtained as a solid.
  • FIG. 3-10 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from the cyclohexane ring in cACHCA (—CHCOO—, 2.5 ppm; 1H), Example 1 The modification rate by cACHCA in the HA unit was calculated in the same manner as in 4-1 (Table 1).
  • Example 1-4-11 Synthesis of HA derivative (HA-tACHCA-OEt / FL) modified with trans-2-amino-1-cyclohexylcarboxylic acid ethyl ester (tACHCA-OEt) HA-tACHCA was carried out in the same manner as in Example 1-4-4, except that tACHCA-OEt hydrochloride (manufactured by Acros) was used in place of glycine ethyl ester hydrochloride and carboxy was not deprotected. -OEt / FL was obtained as a yellow solid.
  • FIG. 3-11 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3.
  • the integrated value of the peak from 1.2 to 2.1 ppm is changed to the integrated value of the peak of 2.2 ppm.
  • a value obtained by subtracting a value obtained by multiplying 11 was used as a peak derived from acetyl of glucosamine and used for calculation of the modification rate.
  • Example 1-4-12 Synthesis of HA derivative (HA-Aib / FL) modified with 2-aminoisobutanoic acid (Aib) Hydrochloride of Aib ethyl ester instead of glycine ethyl ester hydrochloride (Watanabe Chemical Co., Ltd.) HA-Aib / FL was obtained as a yellow solid in the same manner as in Example 1-4-4, except that carboxy was deprotected using 5N NaOH at pH 13.2. It was.
  • FIG. 3-12 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the dimethyl-derived peak (—C (CH 3 ) 2 —, 1.5 ppm; 6H) in Aib, The modification rate by Aib in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-4-1 (Table 1).
  • Example 1-4-13 Synthesis of HA derivative (HA-ACBuCA-OEt / FL) modified with 1-amino-1-cyclobutanoic acid ethyl ester (ACBuCA-OEt) ACBuCA- in place of glycine ethyl ester hydrochloride Except that OEt hydrochloride (manufactured by Sigma Aldrich) was used and carboxy was not deprotected, the procedure was the same as Example 1-4-4, and HA-ACBuCA-OEt / FL was converted into a yellow solid. Obtained.
  • FIG. 3-13 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3. Based on the integrated value of the acetyl-derived peak (-COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the peak (-CH 3 , 1.3 ppm; 3H) derived from ester-protected methyl in ACBuCA-OEt In the same manner as in Example 1-4-1, the modification rate by ACBuCA-OEt in the HA unit was calculated (Table 1).
  • Example 1-4-14 Synthesis of HA Derivatives Modified with L-Asparagine (Asn) (HA-Asn and HA-Asn / Rh) HA-Asn was synthesized as follows.
  • HA-TBA in anhydrous DMSO 5 mg / mL
  • L-asparagine methyl ester hydrochloride manufactured by Bachem
  • DMT-MM was added in a 3 to 6-fold molar equivalent with respect to the HA unit, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • the reaction solution was reprecipitated with diethyl ether, and the precipitate was dissolved in ultrapure water. After adding 5N NaOH solution to pH 12.5 or higher, the mixture was stirred for 1 hour to hydrolyze the ester and decarboxylate the carboxy. Went. Thereafter, neutralization was performed using a 5N HCl solution, followed by dialysis purification in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution, distilled water and ultrapure water, and lyophilization to obtain HA-Asn as a white solid.
  • HA-Asn / Rh was synthesized as follows.
  • L-asparagine methyl ester hydrochloride and DMT-MM were sequentially added to the HA unit in 5-fold molar equivalents and 3-6-fold molar equivalents, respectively, and stirred overnight at room temperature.
  • the reaction solution was purified by dialysis against DMSO. Piperidine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the resulting dialysate to a concentration of 20% and stirred for 2 hours to remove the Fmoc group. Then, it dialyzed and refined in order of DMSO, 0.3M NaCl aqueous solution, and distilled water.
  • a 5N NaOH solution was added to the resulting dialysate to adjust the pH to 12.5 or higher, and the mixture was stirred for 1 hour to hydrolyze the ester and decarboxylate. Thereafter, neutralization was performed using a 5N HCl solution, followed by dialysis purification in the order of distilled water and ultrapure water, and lyophilization to obtain HA-Asn / EDOBEA.
  • HA-Asn / EDOBEA 10 mg / mL was diluted 2-fold with 100 mM PB (pH 7.4), and NHS-rhodamine (5 / 6-carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester, manufactured by Thermo Fisher Scientific Inc.) was added in an amount of 0.05 times the molar equivalent of the HA unit and stirred overnight at room temperature. Subsequently, 40-fold molar equivalent of acetic anhydride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the HA unit, and the mixture was stirred for 1 hour to acetylate the excess terminal amino acid of EDOBEA.
  • NHS-rhodamine 5 / 6-carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester, manufactured by Thermo Fisher Scientific Inc.
  • 5N NaOH solution was added to the reaction solution to adjust the pH to 12.5 or higher, and the mixture was stirred for 1 hour, neutralized with 5N HCl solution, and purified by dialysis in the order of 0.3M NaCl aqueous solution, distilled water, and ultrapure water. Lyophilized to obtain HA-Asn / Rh as a red solid.
  • Spectrapore 4 fractionated molecular weight (MWCO): 12 to 14 kDa was used for all dialysis membranes.
  • FIG. 3-14 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the peak derived from acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methylene of asparagine (—CH 2 CONH 2 , 2.8 ppm; 2H), Example 1 The modification rate by asparagine in the HA unit was calculated in the same manner as in 4-1 (Table 1).
  • Example 1-4-15 Synthesis of HA derivatives (HA-Ala-NH 2 and HA-Ala-NH 2 / Rh) modified with L-alaninamide (Ala-NH 2 ) L-asparagine methyl ester hydrochloride Except that L-alaninamide hydrochloride (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) was used instead of and no operation related to reprecipitation and carboxy deprotection was performed. The method was performed to obtain HA-Ala-NH 2 as a white solid and HA-Ala-NH 2 / Rh as a red solid.
  • L-alaninamide hydrochloride manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.
  • FIG. 3-15 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the peak derived from acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methyl alanamide (—CH 3 , 1.5 ppm; 3H), Example 1-4 In the same manner as -1, the modification rate of alanine amide in the HA unit was calculated (Table 1).
  • Example 1-4-16 Synthesis of HA derivatives (HA-Val-NH 2 and HA-Val-NH 2 / Rh) modified with L-valine amide (Val-NH 2 ) Instead of L-alaninamide hydrochloride Except that L-valine amide hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used in the same manner as in Example 1-4-15, HA-Val-NH 2 was a white solid, HA-Val-NH 2 / Rh was obtained as a red solid.
  • L-valine amide hydrochloride manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • FIG. 3-16 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the two methyl-derived peaks of valineamide (—CH (CH 3 ) 2 , 1.0 ppm; 6H), In the same manner as in Example 1-4-1, the modification rate of the HA unit with valine amide was calculated (Table 1).
  • acetyl peak of glucosamine is overlapped with the hydrogen peak at the 3-position of valineamide (—CH (CH 3 ) 2 , 2.1 ppm; 1H), so that the peak of 1.8 to 2.2 ppm
  • a value obtained by subtracting a value obtained by multiplying the integral value of the 1.0 ppm peak by 1/6 from the integrated value was used as a peak derived from acetyl of glucosamine, and used for calculation of the modification rate.
  • Example 1-4-17 Synthesis of HA derivatives (HA-Asn-NH 2 and HA-Asn-NH 2 / Rh) modified with L-asparagine amide (Asn-NH 2 ) Instead of using L-asparaginamide hydrochloride (manufactured by Kokusan Kagaku Co., Ltd.), the same procedure as in Example 1-4-15 was carried out to prepare HA-Asn-NH 2 as a white solid, HA-Asn- the NH 2 / Rh was obtained as a red solid.
  • FIG. 3-17 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the methylene-derived peak of asparagine amide (—CH 2 CONH 2 , 2.8 ppm; 2H), Example 1 The modification rate by asparagine amide in the HA unit was calculated in the same manner as in 4-1 (Table 1).
  • Example 1-4-18 Synthesis of HA Derivatives Modified with Methylamine (Me) (HA-Me and HA-Me / FL) HA-Me was synthesized as follows. An anhydrous DMSO solution (5 mg / mL) of HA-TBA synthesized in Example 1-2 using HA-Na (99 kDa) as a starting material was prepared.
  • Methylamine Methylamine
  • reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and ultrapure water (Spectrapore 4, fractional molecular weight (MWCO): 12 k-14 kDa) and then lyophilized to obtain an intermediate as a white solid.
  • MWCO fractional molecular weight
  • the obtained intermediate was dissolved in ultrapure water so as to be 10 mg / mL, and then diluted 2-fold with 100 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) to prepare a 5 mg / mL solution.
  • NHS-fluorescein in an amount of 0.1-fold molar equivalent to the HA unit was added to this solution as a DMSO solution and stirred at room temperature for 1 hour, and then 40-fold molar equivalent of acetic anhydride (Wako Pure Chemical Industries) to the HA unit.
  • the terminal amino of excess ethylenediamine was acetylated by adding and stirring for 1 hour.
  • reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and ultrapure water (Spectrapore 4, molecular weight cut off (MWCO): 12 k-14 kDa) in the order of light, then freeze-dried and HA-Me / FL was obtained as a yellow solid.
  • MWCO molecular weight cut off
  • FIG. 3-18 shows the 1 H-NMR spectrum of each product measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (—CH 3 , 2.8 ppm; 3H), Example 1-4-1 Similarly, the modification rate by methyl in the HA unit was calculated (Table 1).
  • Pr Propylamine
  • reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and ultrapure water (Spectrapore 4, fractional molecular weight (MWCO): 12 k-14 kDa) and then freeze-dried to obtain HA-Pr as a white solid.
  • MWCO fractional molecular weight
  • reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and ultrapure water (Spectrapore 4, fractional molecular weight (MWCO): 12 k-14 kDa) and then lyophilized to obtain an intermediate as a white solid.
  • MWCO fractional molecular weight
  • the obtained intermediate was dissolved in ultrapure water so as to be 10 mg / mL, and then diluted 2-fold with 100 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) to prepare a 5 mg / mL solution.
  • 100 mM phosphate buffer solution pH 7.4
  • 0.06 times the molar equivalent of NHS-fluorescein with respect to the HA unit was added as a DMSO solution and stirred at room temperature for 1 hour, and then 40 times the molar equivalent of acetic anhydride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with respect to the HA unit.
  • the terminal amino of excess ethylenediamine was acetylated by adding and stirring for 1 hour.
  • reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and ultrapure water in the dark (Spectrapore 4, fractional molecular weight (MWCO): 12 k-14 kDa), freeze-dried, and HA-Pr / FL was obtained as a yellow solid.
  • MWCO fractional molecular weight
  • FIG. 3-19 shows the 1 H-NMR spectrum of each product measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the methyl-derived peak (—CH 3 , 0.9 ppm; 3H) belonging to propyl, Example 1-4 The modification rate by methyl in the HA unit was calculated in the same manner as in -1 (Table 1).
  • Example 1-5) Synthesis of HA derivative from HA-TBA (25 kDa or 99 kDa) (Example 1-5-1) HA derivative modified with 1-aminomethyl-1-cyclohexane acid (AMCHCA) (HA- Synthesis of AMCHCA)
  • AMCHCA 1-aminomethyl-1-cyclohexane acid
  • DMT-MM was added at a ratio shown in Table 2 with respect to the HA-TBA unit, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • the reaction solution was purified by dialysis against a large excess of 0.3 M NaCl aqueous solution (Spectrapore 4, fractional molecular weight (MWCO): 12 k-14 kDa), and the resulting dialysate was added with 5 N NaOH aqueous solution to adjust the pH to 13.
  • the mixture was stirred at room temperature for 1 hour and further neutralized by adding 5N HCl.
  • a 1 H-NMR spectrum using D 2 O as a solvent when the HA molecular weight is 99 kDa and the addition ratio of the reagent is HA-TBA unit / DMT-MM / AMCHCA-OMe ⁇ HCl 1/3/5. It is shown in Fig. 4-1. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from cyclohexane belonging to AMCHCA (C 6 H 10 , 1.2 to 1.9 ppm; 10H), The modification rate by AMCHCA in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-4-1 (Table 2).
  • Example 1-5-2 Synthesis of HA derivative (HA-pcACHCA) modified with cis-4-aminocyclohexane acid (pcACHCA) cis-4-amino-1-cyclohexylcarboxylic acid instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • pcACHCA cis-4-amino-1-cyclohexylcarboxylic acid instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • methyl ester hydrochloride pcACHCA-OMe ⁇ HCl, manufactured by Iris Biotech
  • the amount of reagent added is shown in Table 2.
  • Example 1-5-3 Synthesis of HA derivative (HA-Nal) modified with L-2-naphthylalanine (Nal) L-2-naphthylalanine benzyl ester paratosylate salt instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • Preparation was carried out in the same manner as in Example 1-5-1 except that (Nal-Obzl ⁇ p-Ts, manufactured by Bachem) was used, and the target product (HA-Nal) was obtained as a white solid.
  • the amount of reagent added is shown in Table 2.
  • Example 1-5-4 Synthesis of HA derivative (HA-APBA) modified with 2-amino-4-phenylbutanoic acid (APBA) 2-amino-4-phenylbutanoic acid instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • APBA 2-amino-4-phenylbutanoic acid instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • Example 1-5-5-5-5-5-5-5-5-5-5-5-5-5-5-5-5-5 Synthesis of HA derivative (HA-Cha) modified with cyclohexyl-L-alanine (Cha) Cyclohexyl-L-alanine methyl ester hydrochloride (Cha-OMe) instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl Preparation was performed in the same manner as in Example 1-5-1 except that HCl (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used to obtain the target product (HA-Cha) as a white solid. The amount of reagent added is shown in Table 2.
  • Example 1-5-6 Synthesis of HA derivative (HA-AMBA) modified with 4-aminomethylbenzoic acid (AMBA) 4-aminomethylbenzoic acid methyl ester hydrochloride (AMBA) instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • AMBA 4-aminomethylbenzoic acid methyl ester hydrochloride
  • the product (HA-AMBA) was obtained as a white solid by the same method as in Example 1-5-1 except that -OMe.HCl (manufactured by Sigma-Aldrich) was used.
  • the amount of reagent added is shown in Table 2.
  • the 1 H-NMR spectrum of this HA-AMBA is shown in FIG. 4-6.
  • Example 1-5-7 Synthesis of HA derivative (HA-3AMBA) modified with 3-aminomethylbenzoic acid (3AMBA) 3-aminomethylbenzoic acid methyl ester hydrochloride (AMBA) instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • 3-aminomethylbenzoic acid methyl ester hydrochloride (AMBA) instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • the product (HA-3AMBA) was obtained as a white solid by the same method as in Example 1-5-1 except that -OMe.HCl (manufactured by Fluorochem) was used.
  • the amount of reagent added is shown in Table 2.
  • Example 1-5-8 Synthesis of HA derivative (HA-APhPA) modified with 3-amino-2-phenylpropionic acid (APhPA) 3-amino-2-phenylpropionic acid instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • Preparation was carried out in the same manner as in Example 1-5-1 except that ethyl ester hydrochloride (APhPA-OEt ⁇ HCl, manufactured by Tyger) was used, and the target product (HA-APhPA) was obtained as a white solid.
  • the amount of reagent added is shown in Table 2.
  • Example 1-5-9 Synthesis of HA derivative (HA-AEBA) modified with 4- (2-aminoethyl) benzoic acid (AEBA) 4- (2-aminoethyl) instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • AEBA benzoic acid methyl ester hydrochloride
  • HA-AEBA target product
  • Example 1-5-10 Synthesis of HA derivative (HA-AMClBA) modified with 4-aminomethyl-3-chlorobenzoic acid (AMClBA) 4-aminomethyl-3-chloro instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • Preparation was performed in the same manner as in Example 1-5-1 except that benzoic acid methyl ester hydrochloride (AMClBA-OMe ⁇ HCl, manufactured by Anichem) was used, and the target product (HA-AMClBA) was converted into a white solid. Obtained.
  • the amount of reagent added is shown in Table 2.
  • Example 1-5-11 Synthesis of HA derivative (HA-AMSA) modified with 5-aminomethylsalicylic acid (AMSA) 5-aminomethylsalicylic acid methyl ester hydrochloride (AMSA-OMe) instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • HCl manufactured by Oakwood
  • the amount of reagent added is shown in Table 2.
  • Example 1-5-12 Synthesis of HA derivative (HA-4AMCHCA) modified with trans-4-aminomethylcyclohexane acid (4AMCHCA) trans-4-aminomethylcyclohexane acid methyl ester instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • Preparation was carried out in the same manner as in Example 1-5-1 except that hydrochloride (4 AMCHCA-OMe.HCl, manufactured by AK scientific) was used, and the target product (HA-4AMCHCA) was obtained as a white solid.
  • the amount of reagent added is shown in Table 2.
  • Example 1-5-13 Synthesis of HA derivative (HA-Chg) modified with L-cyclohexylglycine (Chg) L-cyclohexylglycine methyl ester hydrochloride (Chg-OMe ⁇ HCl instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl)
  • the product (HA-Chg) was obtained as a white solid by the same method as in Example 1-5-1 except that INDOFINE Chemical Company was used.
  • the amount of reagent added is shown in Table 2.
  • Example 1-5-14 Synthesis of HA derivative (HA-pHPhg) modified with (R) -amino- (4-hydroxyphenyl) acetic acid (pHPhg) (R) -amino instead of AMCHCA-OMe ⁇ HCl
  • Preparation was carried out in the same manner as in Example 1-5-1 except that-(4-hydroxyphenyl) acetic acid methyl ester hydrochloride (pHPhg-OMe ⁇ HCl, manufactured by Sigma-Aldrich) was used.
  • HA-pHPhg) was obtained as a white solid.
  • the amount of reagent added is shown in Table 2.
  • HA unit / BOP manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • EDOBEA 2,2 ′-(ethylenedioxy) bis (ethylamine)
  • EDOBEA 2,2 ′-(ethylenedioxy) bis (ethylamine)
  • BOP 2,2 ′-(ethylenedioxy) bis (ethylamine)
  • FIG. 5A shows the 1 H-NMR spectrum of HA-EDOBEA with a low modification rate measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the peak derived from acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methylene at the end of EDOBEA (—CH 2 NH 2, 3.2 ppm; 2H), Example 1-3 and Similarly, the modification rate by EDOBEA in the HA unit was calculated (Table 3).
  • the obtained low-modification HA-EDOBEA was dissolved in ultrapure water so as to be 10 mg / ml, and then diluted 2-fold with 100 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) to give 5 mg / ml.
  • a solution was prepared.
  • 0.1-fold molar equivalent of NHS-fluorescein (5 / 6-carboxyfluorocein succinimidyl ester, NHS-FL, manufactured by PIERCE) as a HA unit was added as a DMSO solution for 1 hour at room temperature.
  • FIG. 5-1 A 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3 is shown in FIG. 5-1.
  • the product was dissolved in 50 mM carbonate buffer (pH 9.0) at 0.05 mg / mL, the FL content per weight was determined from the absorbance at 491 nm, and the modification rate by FL in the HA unit was calculated (Table 3). .
  • FIG. 5-2 shows the 1H-NMR spectrum of HA-EDOBEA with a high modification rate measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • NaOD was added so that it might become 0.0046N in the case of a measurement solution, and it was made alkaline.
  • the obtained highly modified HA-EDOBEA was dissolved in ultrapure water so as to be 10 mg / ml, and then diluted 2-fold with 100 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) to obtain 5 mg / ml.
  • a solution was prepared.
  • 0.04 mole equivalent of NHS-fluorescein with respect to the HA unit was added as a DMSO solution and stirred at room temperature for 1 hour, and then 40 mole equivalent of acetic anhydride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with respect to the HA unit. Co., Ltd.) was added and the mixture was further stirred for 1 hour to acetylate the excess terminal amino acid of EDOBEA.
  • reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and ultrapure water in the dark (Spectrapore 4, fractional molecular weight (MWCO): 12 k-14 kDa), then freeze-dried and HA-EDOBEA-Ac. / FL was obtained as a yellow solid.
  • MWCO fractional molecular weight
  • FIG. 5-2 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • the modification rate by FL in the HA unit of the product was determined in the same manner as in Comparative Example 1-1-1 (Table 3).
  • FIG. 5-3 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the phenyl-derived peak (—C 6 H 5 , 7.2 to 7.4 ppm; 5H) in phenylalanine In the same manner as in Example 1-4-1, the modification rate of the HA unit with phenylalanine was calculated (Table 4).
  • FIG. 5-4 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3. Integration value of acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and integration of peak derived from hydroxyphenyl in tyrosine (—C 6 H 4 OH, 6.8, 7.2 ppm; 4H) From the value, the modification rate by tyrosine in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-4-1 (Table 4).
  • FIG. 5-5 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (—CH 3 , 1.5 ppm; 3H) in MePhe, Example 1-4 The modification rate by MePhe in the HA unit was calculated in the same manner as -1 (Table 4).
  • FIG. 5-6 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the peak derived from the acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak for 1H derived from the pyrrolidine ring in Pro-OMe (—CHCOO—, 2.4 ppm; 1H) In the same manner as in Example 1-4-1, the modification rate by Pro-OMe in the HA unit was calculated (Table 4).
  • FIG. 5-7 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the peak derived from acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methylene of glycinamide (—CH 2 —; 2H), Example 1-4-1 Similarly, the modification rate by glycinamide in the HA unit was calculated (Table 4).
  • FIG. 5-8 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. Similar to Example 1-4-1, from the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the methylene-derived peak of serine amide (—CH 2 —; 2H). Then, the modification rate with serine amide in the HA unit was calculated (Table 4).
  • FIG. 5-9 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the two methyl-derived peaks of leucine amide (—CH (CH 3 ) 2 , 0.9 ppm; 6H) In the same manner as in Example 1-4-1, the modification rate of leucine amide in the HA unit was calculated (Table 4).
  • FIG. 5-10 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3.
  • acetyl-derived peak of glucosamine is overlapped with the hydrogen peak at the 3-position of isoleucine amide (—CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 , 1.9 ppm; 1H).
  • a value obtained by subtracting a value obtained by multiplying the integral value of the 0.9 ppm peak by 1/6 from the integral value of the 2 ppm peak was used as a peak derived from acetyl of glucosamine, and used for calculation of the modification rate.
  • FIG. 5-11 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the peak derived from acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methyl of threonine amide (—CH 3 , 1.2 ppm; 3H), Example 1-4 In the same manner as in -1, the modification rate of threonine amide in the HA unit was calculated (Table 4).
  • FIG. 5-12 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the methylene-derived peak of glutamine amide (—CH 2 CH 2 CONH 2 , 2.4 ppm; 2H) In the same manner as in Example 1-4-1, the modification rate of glutamic amide in the HA unit was calculated (Table 4).
  • a 1 H-NMR spectrum using D 2 O as a solvent when the HA molecular weight is 99 kDa and the addition ratio of the reagent is HA-TBA unit / DMT-MM / Cha-OMe ⁇ HCl 1/3/5. It is shown in Fig. 6-1. From the integrated value of the acetyl-derived peak (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (—CH 3 , 0.9 ppm; 3H) in Nle, Example 1-4 The modification rate by Nle in the HA unit was calculated in the same manner as -1 (Table 5).
  • a 1 H-NMR spectrum using D 2 O as a solvent when the HA molecular weight is 99 kDa and the addition ratio of the reagent is HA-TBA unit / DMT-MM / Cha-OMe ⁇ HCl 1/3/5. It is shown in Fig. 6-2. Acetyl-derived peak of glucosamine; the integral value of the (-COCH3,2.0ppm 3H), 3 one methyl from peaks in tLeu (-C (CH 3) 3 , 1.0ppm; 9H) from the integrated value of, The modification rate by tLeu in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-4-1 (Table 5).
  • a 1 H-NMR spectrum using D 2 O as a solvent when the HA molecular weight is 99 kDa and the addition ratio of the reagent is HA-TBA unit / DMT-MM / Phe-OEt ⁇ HCl 1/3/5. It is shown in Fig. 6-3. Integral value of acetyl-derived peak (-COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and peak derived from aromatic ring (-C 6 H 4 F, 7.1, 7.3 ppm; 4H) in pFPhe From the value, the modification rate by pFPhe in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-4-1 (Table 5).
  • the reaction solution was reprecipitated with diethyl ether, and the precipitate was collected by filtration, dissolved again in ultrapure water, and then dialyzed against a large excess of ultrapure water (Spectrapore 4, molecular weight cut off (MWCO): 12 k). To 14 kDa) and lyophilized to obtain the target substance (PEG-FL) as a yellow solid.
  • MWCO molecular weight cut off
  • FIG. 7 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • a peak derived from one end of PEG (—OCH 3 , 3.4 ppm, 3H) and a peak derived from fluorescein (7-8 ppm) were observed, confirming that the PEG end was modified with FL. .
  • Example 1-4 and Comparative Example 1-1 A part of the product obtained in Example 1-4 and Comparative Example 1-1 was measured. A 5 mg / mL or 20 mg / mL aqueous solution of the product was used as a measurement target sample, and a 5 mg / mL aqueous solution of HA-Na was used as a standard sample. Samples were diluted 10-fold with PBS or rat plasma, PBS diluted samples were incubated at 37 ° C. for 0 hours, 24 hours, 1 week, plasma diluted samples for 24 hours.
  • Hyase-treated sample Hyase untreated sample, and calibration curve sample obtained by the above method
  • sample: 0.8M borate buffer (pH 9.1): 1N KOH was mixed at a mixing ratio of 25: 5: 2. Heated in a boiling water bath for 3 minutes and immediately placed on ice.
  • a reagent (10 mg / mL) in which p-dimethylaminobenzaldehyde is dissolved in a 10N HCl / acetic acid mixed solution (1:70) is mixed so that the mixing ratio of the above-mentioned sample: reagent becomes 32: 150, and 20 ° C. at 37 ° C. Incubated for minutes and immediately placed on ice.
  • HA-EDOBEA-Ac / FL (Comparative Example 1-1-2) is biodegradable because the low molecular weight administration compound is not observed in urine in the size exclusion chromatography analysis of Example 3-3-2. Although not confirmed, even in the results of this test, the degradability by hyase was not confirmed. On the other hand, all other HA derivatives showed degradability.
  • samples treated with rat plasma for 1 day showed improved degradability compared to samples treated with PBS for 1 day. It is considered that the release of glycine has changed to a form more susceptible to Hyase degradation.
  • Example 3 Confirmation of blood retention and biodegradability in vivo (Example 3-1) Rat biological sample administered with HA derivative 20 mg of the compound obtained in Example 1-4 and Comparative Example 1-1 The compound obtained in Comparative Example 1-3 was administered into a rat intravenously at a dose of 10 mg / kg at a dose of / kg, and 5 minutes after administration, 2, 7, 24, 48, 72, 168, 240 Blood was collected from the jugular vein using a syringe treated with sodium heparin at 336 hours, and plasma was obtained by centrifugation. This plasma sample was stored frozen at ⁇ 20 ° C. or lower until measurement.
  • urine was collected using a metabolic cage at 0 to 24 hours, 24 to 48 hours, 48 to 72 hours, 72 to 96 hours, 168 to 192 hours, 240 to 264 hours, and 336 to 360 hours after administration. A portion of the sample was stored frozen at -20 ° C. or lower until measurement.
  • Example 3-2 Analysis of rat plasma treated with HA derivative
  • Example 3-2-2 Concentration measurement The fluorescence intensity of the sample prepared in Example 3-2-1 was measured using a plate reader (SPECTRAmax GEMINI, manufactured by Molecular Devices) (FL label body: excitation wavelength) : 495 nm / fluorescence wavelength: 520 nm, Rh label: excitation wavelength: 552 nm / fluorescence wavelength: 595 nm).
  • a calibration curve is prepared for each compound from the measurement values of the calibration curve sample, the plasma concentration at each time point of each individual is calculated, the average value is shown in FIG. 8, and the graph of plasma concentration transition is shown in FIG.
  • Example 3-2-2 Pharmacokinetic parameter calculation Pharmacokinetic parameters were calculated using WinNonlin Ver 4.0.1 / Ver 6.1 (Pharsight). Model-independent analysis was performed on the average data of each group obtained in Example 3-2-2, and clearance (CL) was calculated (Table 7). As a result, as compared with PEG having practical blood retention, the HA derivatives of Examples 1-4-1 to 1-4-19 all had a smaller CL value, and practical blood retention. It was shown to have sex. In addition, CL of some of the comparative HA derivatives showed a larger value than that of PEG, and it was clarified that HA derivatives exhibiting various retention in blood can be synthesized depending on the type of compound to be modified.
  • Example 3-3 Analysis of rat urine administered with HA derivative (Example 3-3-1)
  • Example 3-3-2 Size Exclusion Chromatography Analysis The sample prepared in Example 3-3-1 was subjected to size exclusion chromatography, and changes in molecular weight distribution were observed. Size exclusion chromatography analysis was performed using an Alliance HPLC system (manufactured by Nippon Waters Co., Ltd.). The analysis conditions are shown below.
  • the administration compound reduced in molecular weight was not observed in the urine, whereas in the HA derivatives of the examples, the administration compound reduced in molecular weight was detected in the urine. It was done. This indicates that the HA derivative of the present invention is biodegradable and is excreted outside the body after administration.
  • Example 4 Verification of membrane damage using liposomes (Example 4-1) Preparation of liposome containing fluorescent substance and quenching substance 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt (Pyramine) ) (SIGMA-ALDRICH) was dissolved in distilled water at 60 ⁇ mol / mL, and p-xylene-bis (N-pyridinium bromide) (DPX) (SIGMA-ALDRICH) was dissolved in distilled water at 85.7 ⁇ mol / mL. Thereafter, the solution was mixed in an equal amount to prepare a Pyramine / DPX aqueous solution.
  • Pyramine 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt
  • DPX p-xylene-bis (N-pyridinium bromide)
  • a liposome solution was prepared by adding and mixing the Pyramine / DPX solution (2 mL) to COATSOME EL-11A vial (NOF Corporation).
  • PD-10 column purification and dialysis purification (Spectrapore 4, fractional molecular weight (MWCO): 12 k-14 kDa) against 500 mL of physiological saline were performed three times to obtain a liposome solution.
  • the liposome solution was diluted 5-fold with a phosphate buffer solution having an ionic strength of 0.15, pH 6 or 7.4 to prepare a liposome solution at each pH.
  • Example 4-2 Liposome membrane damage evaluation
  • the HA derivative obtained in Example 1-5 and Comparative Example 1-2 was dissolved in physiological saline so as to be 10 mg / mL as HA-Na. It diluted with the salt solution sequentially, and adjusted so that it might become 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 mg / mL.
  • 10 mg / mL physiological saline solution of Triton X was prepared as a positive target. Saline was used as a negative subject.
  • poly-L-lysine hydrobromide (PLL, MW 15 kDa to 30 kDa, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is selected as a positive control substance having membrane damage, and dissolved in physiological saline so as to be 10 mg / mL. I let you.
  • the index indicating membrane damage was calculated as the liposome degradation rate according to the following formula.
  • HA-Nle, HA-tLeu, and HA-pFPhe used as comparative examples did not show any membrane damage at any pH, but the samples used in the examples had more membrane damage than pH 7.4. It was shown that the membrane hindrance at pH 6.0 was high.
  • HA-pcACHCA, HA-Nal, HA-APBA, HA-Cha, HA-AMBA, HA-3AMBA, HA-APhPA, HA-AEB, HA-AMClBA, HA-AMSA, HA-4AMCHCA, HA-Chg and With HA-pHPhg no membrane damage was observed at pH 7.4, and membrane failure was first observed at pH 6.0.
  • the degradation rate of the liposome at pH 7.4 of PLL was 6.6%, it can be judged that if it exhibits a degradation rate of several percent, it can function sufficiently as a substance having membrane damage, and the HA derivative of the present invention was shown to have membrane damage at pH 6.0.
  • Example 5 Synthesis of HA-Ala Derivative-PTH Analog Conjugate
  • Example 5-1 Synthesis of HA-Ala TBA Salt (HA-Ala-TBA) HA-Na Synthesized in Example 1-2
  • An anhydrous DMSO solution (5 mg / mL) of HA-TBA starting from (99 kDa) was prepared. Thereafter, L-alanine ethyl ester hydrochloride was added in a 3-fold molar equivalent with respect to the HA unit.
  • DMT-MM was added in a 3-fold molar equivalent with respect to the HA unit and stirred overnight at room temperature.
  • reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and distilled water (Spectrapore 4, fractional molecular weight (MWCO): 12 k-14 kDa).
  • a 5N NaOH solution was added to the resulting dialysate to adjust the pH to 12.5 or more, and the mixture was stirred for 1 hour to hydrolyze the ethyl ester, and carboxy was deprotected. Thereafter, neutralization was performed using a 5N HCl solution, and dialysis was further performed with distilled water and ultrapure water.
  • Example 1-1 To the resulting dialysate, the suspension of the cation exchange resin TBA-chlorinated in Example 1-1 was added to the HA unit in an amount of 5 times the molar equivalent in terms of the ion exchange capacity of the resin. After stirring for 15 minutes, filtration was performed using a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was freeze-dried to obtain HA-Ala-TBA as a white solid. A part of the product was taken, dialyzed in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and distilled water, and freeze-dried to obtain a sample for calculating the alanine modification rate.
  • FIG. 12-1 shows the 1 H-NMR spectra of the sample for calculating the alanine modification rate and the product, measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • the modification rate with alanine in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-4-1 and found to be 98%.
  • the HA unit content per weight of HA-Ala-TBA was determined in the same manner as in Example 1-3.
  • Example 5-2 Synthesis of HA-Ala-EDOBEA
  • HA-Ala-TBA 5 mg / mL
  • 50 mol equivalent and 0.15 mol equivalent respectively were added, and it stirred at room temperature for 6 hours.
  • the reaction solution was purified by dialysis in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and distilled water (Spectrapore 4, fractional molecular weight (MWCO): 12 k-14 kDa) and lyophilized to obtain HA-Ala-EDOBEA as a white solid. It was.
  • Example 5-3 Synthesis of HA-Ala-EDOBEA-Rh
  • HA-Ala-EDOBEA 10 mg / mL
  • phosphate buffer pH 7.4
  • 0.07-fold molar equivalent of NHS-rhodamine with respect to HA unit was added in 5 mg / mL DMSO solution, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • the reaction solution is purified by applying it to a desalting column (PD-10, manufactured by GE Healthcare) equilibrated with ultrapure water, and the HA fraction is lyophilized to convert HA-Ala-EDOBEA-Rh into a red solid. Obtained.
  • a desalting column PD-10, manufactured by GE Healthcare
  • FIG. 12-3 shows the 1 H-NMR spectrum of a product using D 2 O as a measurement solvent.
  • the HA unit content per weight was quantified in the same manner as in Example 1-3. Further, the product was dissolved at 0.042 mg / mL in 100 mM carbonate buffer (pH 9.0), the Rh content per weight was determined from the absorbance at 552 nm, and the modification rate by Rh in the HA unit was calculated. It was 1%. Further, the molar extinction coefficient of the obtained product was calculated to be 2690 M ⁇ 1 cm ⁇ 1 .
  • Example 5-4 Synthesis of bromoacetyl derivative of HA (HA-Ala-EDOBEA-BA / Rh / Ac)
  • An aqueous solution (20 mg / mL) of HA-Ala-EDOBEA-Rh synthesized in Example 5-3 was used. Used as starting material.
  • the aqueous solution was diluted 2-fold with 100 mM phosphate buffer (pH 7.4), and NHS-bromoacetic acid (NHS-BA, Sigma-Aldrich) 0.5-fold molar equivalent to HA unit was 50 mg / mL.
  • NHS-bromoacetic acid NHS-bromoacetic acid
  • acetic anhydride was added to the HA unit and further stirred for 1 hour to acetylate excess terminal amino acid of EDOBEA.
  • the reaction solution was purified by subjecting it to a desalting column (PD-10) equilibrated with ultrapure water, and the fractionated HA fraction was subjected to centrifugal ultrafiltration (MacroSep, MWCO3000, manufactured by Pole Life Sciences) about 2
  • the resultant solution was concentrated twice to obtain HA-Ala-EDOBEA-BA / Rh / Ac as an aqueous solution.
  • the aqueous solution was frozen and stored at ⁇ 20 ° C. until next use, and a certain fixed volume was weighed after lyophilization to calculate the solid content concentration in the solution.
  • Example 5-5 Synthesis of HA-Ala-PTH Analog Conjugate (HA-Ala-PTH / Rh)
  • HA-Ala-EDOBEA-BA / Rh / Ac synthesized in Example 5-4 was used as a starting material. It was.
  • PTH analog PTH-Cys (SVSEIQLMMHNLKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFC, manufactured by American Peptide Company) obtained by introducing cysteine into the C-terminus of human PTH (1-34) was used.
  • PTH-Cys SVSEIQLMMHNLKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFC, manufactured by American Peptide Company
  • HA unit After dissolving PTH-Cys in 10 mM citrate buffer (pH 4.5) at a concentration of 5 mg / mL, 0.03-fold molar equivalent of HA unit is HA-Ala-EDOBEA-BA / Rh / Ac solution. And incubated overnight at 37 ° C. 1-fold molar equivalent of cysteine hydrochloride monohydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added as a 20 mg / mL aqueous solution to the HA unit, and further incubated at 37 ° C. for 3 hours, and then with a 1N sodium hydroxide aqueous solution. The pH was 4.5. The HA unit content per weight was set to 1.5 ⁇ mol / mg and used for the calculation of HA units.
  • reaction solution is purified by centrifugal ultrafiltration (Macrosep, MWCO10000) by repeating dilution and concentration four times with 2 mM citrate buffer (pH 4.5), and concentrating HA-Ala-PTH / Rh.
  • a liquid was prepared.
  • the concentrated solution was diluted 100-fold with 100 mM carbonate buffer (pH 9.0), the absorbance at 552 nm was measured, and the HA concentration was determined using the HA-Ala-EDOBEA-Rh extinction coefficient calculated in Example 5-3. The calculated value was 24.3 ⁇ mol / mL.
  • amino acid analysis was performed by the AccQ ⁇ Tag method (manufactured by Waters), and the PTH concentration was calculated to be 141.75 nmol / mL and the PTH modification rate was 0.58%.
  • Hydrolysis and derivatization operations in amino acid analysis were performed using a Pico Tag workstation and AccQ Tag chemistry package according to the manual accompanying the package.
  • the HPLC analysis used a Waters 2690 separation module and a Waters 474 fluorescence detector, and the analysis for calculating the amino acid concentration was based on the concentration of lysine residues.
  • Example 6 Confirmation of in vivo blood retention and biodegradability of HA-Ala derivative-PTH analog conjugate (Example 6-1) HA derivative-administered rat biological sample obtained in Example 5-5 Single dose administration of compound at a dose of 10 mg / kg into rat vein and jugular vein blood collection using syringes treated with sodium heparin at 5 minutes, 2, 7, 24, 48, 72, 168, 240 and 312 hours after administration Plasma was obtained by centrifugation. This plasma sample was stored frozen at ⁇ 20 ° C. or lower until measurement.
  • urine was collected using a metabolic cage at 0-24 hours, 24-48 hours, 48-72 hours, 72-96 hours, 144-168 hours, 216-240 hours, and 288-312 hours after administration. A portion of the sample was stored frozen at -20 ° C. or lower until measurement.
  • Example 6-2-1 Analysis of rat plasma treated with HA derivative
  • Example 6-2-1 Preparation of measurement sample A sample for measurement was prepared by the method described in Example 3-2-1.
  • Example 6-2-2 Concentration measurement Using the sample prepared in Example 6-2-1, the plasma concentration of each individual at each time point was calculated by the method described in Example 3-2-2. . The average value is shown in FIG. 13, and the graph of plasma concentration transition is shown in FIG.
  • Example 6-2-3 Calculation of pharmacokinetic parameters With respect to the average data obtained in Example 6-2-2, the clearance (CL) was calculated by the method described in Example 3-2-2. 0. Practical blood retention was also demonstrated in drug conjugates of biodegradable hyaluronic acid derivatives.
  • Example 6-3 Analysis of HA Derived Rat Urine (Example 6-3-1) Measurement Sample Preparation A measurement sample was prepared by the method described in Example 3-3-1.
  • FIG. 15 shows the result of analyzing the sample prepared in Example 6-3-1 by the method described in Example 3-3-2.
  • the chromatogram at each time point is shown in the same range on the left, and the chromatogram at each time point is normalized with the strongest peak on the right.
  • Example 5-5 In the urine of an individual administered with Example 5-5, a low molecular weight administration compound was detected. This indicates that the biodegradable hyaluronic acid derivative drug conjugate maintains biodegradability and is excreted outside the body after administration.

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Abstract

　本発明により、式（Ｉ）で表される二糖単位を含む、ヒアルロン酸誘導体、および当該ヒアルロン酸誘導体に、１以上の薬物が結合した、ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体が提供される。

Description

アミノ－カルボン酸により修飾されたヒアルロン酸誘導体
　本発明は、アルキルアミン、アミノ酸などのアミノおよびカルボキシを有する化合物（アミノ－カルボン酸）またはそのアミド化合物（アミノ－カルボン酸アミド）により修飾されたヒアルロン酸誘導体、該ヒアルロン酸誘導体と薬物とが結合したコンジュゲートおよび該ヒアルロン酸誘導体を含む医薬品組成物、特に、該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体に関する。
　ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」とも称す）は生体に対して不活性な化合物である。ＰＥＧを用いて修飾することによりタンパク質やリポソームの生体内での安定性および薬物動態特性が改善できることが知られており、ＰＥＧにより修飾されたタンパク質や、ＰＥＧで被覆されることにより血中滞留性が高められたリポソームは、医薬品として既に実用化の段階に入っている。しかし、動物実験においてＰＥＧ化タンパク質の長期、大量投与を行った場合に、腎臓への蓄積および腎臓の空胞化が起こることが報告されている。特に、ＰＥＧは生分解性ポリマーではなく、ヒトに長期間投与した場合の体内での蓄積および安全性等の問題はまだ明らかでない。更に、近年、ＰＥＧコンジュゲートやＰＥＧ化リポソームにおいて、投与２回目のクリアランスが異常に早い現象（Ａｃｃｅｒｅｌａｔｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｌｅａｒａｎｃｅ現象、以下「ＡＢＣ現象」とも称す）が報告されており（非特許文献１および２）、ＰＥＧ化医薬品の安全性、有効性は充分に確立されたとは言い難い。
　一方、臨床で既に使用されている高分子として、ヒアルロン酸が挙げられる。ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」とも称す）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された多糖であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位を繰り返し単位として構成されるグリコサミノグリカンの一種である。ヒアルロン酸は、その化学的および物理的構造に種差が無く、ヒトにおいてもヒアルロン酸の代謝系が存在する。さらに免疫性または毒性の点に関してもヒアルロン酸は非常に安全な生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）として知られている。
　上述の安全性という特性に加え、近年、細胞の接着、増殖、移動の誘導に関するヒアルロン酸の生理活性物質としての側面も注目されている。更に製造の観点からも、微生物による高分子量のヒアルロン酸の大量生産が可能となっており、ヒアルロン酸を用いた薬物送達システム（以下「ＤＤＳ」とも称す）の研究が盛んに行われている。薬物をヒアルロン酸とコンジュゲートすることで、薬物の癌組織へのターゲティング（特許文献１）、肝臓へのターゲティング（特許文献２）、抗原性の低減等（特許文献３）が達成できるという報告がなされている。
　ヒアルロン酸を滞留性延長やターゲティング用ＤＤＳ基材として用いる場合、その血中滞留性の短さが欠点となる。ヒアルロン酸の連続する６糖がレセプターの認識部位であると考えられており、カルボキシを修飾することで血中滞留時間の延長（特許文献４、５および６）を行う試みがなされている。
　ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシを高度に修飾することにより、血中滞留性の長期化を実現させたヒアルロン酸誘導体が開発され、その有用性が示されてきた（特許文献７）。一般にグルクロン酸部分のカルボキシの修飾率を高めることによりヒアルロン酸誘導体の血中滞留性も長期化する。しかし、両者は直線的に相関するわけではなく、ある閾値を境に急激に変化することが明らかになっている。
　近年、核酸医薬品として開発が進められているアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡやｓｉＲＮＡといったオリゴヌクレオチドは、生体内外の核酸分解酵素で分解を受けやすく、核酸単体で静脈内投与（以下、「ｉｖ」とも称す）すると、速やかに分解される。核酸医薬品の薬効発現には、核酸を細胞質内や核内に送達させることが必須である。タンパク質やペプチドを活性成分とする医薬品に関しても、これまでは細胞外のターゲットに作用するものが主であった。より革新的な医薬品を開発するためには、タンパク質やペプチドを細胞内のターゲットに作用させる手段が求められている。このためにはタンパク質やペプチドを細胞質内に送達させる方法、つまりエンドサイトーシスにより細胞に取り込ませた後、エンドソームから医薬活性成分を効率的に細胞質内へ放出させる方法が必要とされている。
　カチオン性の合成ポリマーは負に帯電する遺伝子を静電的に凝縮させて、遺伝子を細胞質内に送達することができるため、これまで遺伝子担体として有効とされてきた。このようなカチオン性合成ポリマーとして、ポリ－Ｌ－リジン（特許文献８、非特許文献３）やポリエチレンイミン（非特許文献４）、イミダゾリルを有する合成ポリマー（非特許文献５）、ポリアミドアミンデンドリマー（非特許文献６）といった合成ポリマーが報告されている。特に、二級アミンを有するポリエチレンイミンやイミダゾリルを有する合成ポリマーはプロトンスポンジ効果を発揮することにより、高い導入効率で細胞質内へ取り込まれることが示されている。しかしながら、これらの合成ポリマーは一般的に細胞毒性が高いとされるポリアミン類であり、安全性が確保されているとは言えない。多糖のカチオン性ポリマーであるキトサンを用いた例もあるが（非特許文献７）、遺伝子導入効率が低く実用化には至っていない。他には、メルカプト（チオール）を有する化合物でヒアルロン酸のカルボキシを修飾し、それを超音波照射により架橋して得られるナノゲルにより、ｓｉＲＮＡの細胞質内導入を試みた事例も報告されている（非特許文献１７）。
　タンパク質やペプチドの細胞質内導入に関しても、さまざまな報告がされている。例えば膜透過性ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ（ｃｐｐ））で修飾する方法（非特許文献８）や、カチオニックリポソームを担体としてタンパク質またはペプチドの複合体を形成して細胞質内導入を行う試みが報告されているが（非特許文献９）、その導入効率は必ずしも高いとは言えない。
　また、細胞毒性の低減のために、ポリアミンＰＥＧ化、またはＨＡをポリアミンで修飾するアプローチ（非特許文献１０）や、ポリアミンをｐＨ応答的に（例えば、低ｐＨにおいて）脱離する官能基で修飾することにより、その毒性を軽減させるアプローチが進められている。しかし、ポリアミンが依然として内在するため、その毒性に関しては更なる工夫、検討が必要である（非特許文献１１）。
　また、生理的環境下（ｐＨ７．４）では水溶性を示すが、エンドソーム内のｐＨに該当する弱酸性領域（ｐＨ５～６．８）において疎水化し、エンドソーム膜に断裂を与えることで、エンドソームから細胞質内への遺伝子／薬物の放出を可能とする弱アニオン性のポリカルボン酸ポリマーの研究が検討されている。このようなアニオン性ポリマーとしてポリ（エチルアクリル酸）（非特許文献１２）やポリ（プロピルアクリル酸）（非特許文献１３）が知られており、ｐＫａが５程度のポリカルボン酸ポリマーが、細胞毒性が低く、エンドソームからの核酸の放出に有効であることが示されている。他にも、コハク酸エステル化したポリグリシドール（非特許文献１４）や、ポリ（Ｌ－リジン－イソフタルアミド）の側鎖をＬ－フェニルアラニンで修飾した擬似ペプチド（非特許文献１５）が、ｐＨ応答性を示すアニオン性ポリマーとして、エンドソームからの遺伝子／薬物の放出、すなわちエンドサイトーシスを経ての薬物の細胞質内への取り込みに有効であることが報告されている。
　ヒアルロン酸中のカルボキシをアミノ酸で修飾した事例としては、例えば、Ｎ－メチルモルホリンの存在下、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジンを用いることにより生成する４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（以下、ＤＭＴ－ＭＭとも称す）を縮合剤として用いた、グリシンのエチルエステルによる修飾が挙げられるが、修飾率は、最大でも２０％となっている（非特許文献１６）。また本願の優先日以降に開示された文献において、トリアジン系化合物を縮合剤として利用した事例としてはアラニンを導入したヒアルロン酸が報告されており（非特許文献１８）、同様の手法で、他のアミノ酸に関しても、修飾が報告されている（非特許文献１９、特許文献１０）。また、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣとも称す）を縮合剤として用いて、ロイシンのメチルエステル塩酸塩、バリンのメチルエステル塩酸塩、イソロイシンのメチルエステル塩酸塩、プロリンのメチルエステル塩酸塩、フェニルアラニンのメチルエステル塩酸塩、アルギニンのメチルエステル塩酸塩およびヒスチジンのメチルエステル塩酸塩により修飾し、脱保護せずにゲル化させて、非水溶性の生体適合性フィルムを調製した事例もあるが、修飾率は不明である（特許文献９）。
　ヒアルロン酸中のカルボキシを脂肪族アミン、アリール脂肪族アミンでアミドに変換したヒアルロン酸の修飾の例として、１,１－カルボニルジイミダゾールを用いて、ベンジルアミンを６０％、オクチルアミンを２５％、ドデシルアミンを１５％、ヘキサデシルアミンを５％導入した例が報告されているが、修飾率は、最大でも６０％となっている（特許文献１１）。
国際公開ＷＯ９２／０６７１４号パンフレット 特開２００１－８１１０３号公報 特開平２－２７３１７６号公報 特開平５－８５９４２号公報 国際公開ＷＯ０１／０５４３４号パンフレット 国際公開ＷＯ０１／６０４１２号パンフレット 国際公開ＷＯ２００６／０２８１１０号パンフレット 国際公開ＷＯ１９９９／０２９８３９号パンフレット 国際公開ＷＯ９２／２０３４９号パンフレット 国際公開ＷＯ２０１１／１４８１１６号パンフレット 国際公開ＷＯ２０００／０１７３３号パンフレット
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．　第２５５巻、第１６７－１７４頁、２００３年 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．　第８８巻、第３５－４２頁、２００３年 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　第２６２巻、第４４２９－４４３２頁、１９８７年 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．　第６０巻、第１４９－１６０頁、１９９９年 Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　第１０巻、第４０６－４１１頁、１９９９年 Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　第４巻、第３７２－３７９頁、１９９３年 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．　第５６巻、第２５９－２７２頁、１９９８年 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　第２７２巻、第１６０１０－１６０１７頁、１９９７年 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　第２７６巻、第３５１０３－３５１１０頁、２００１年 Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　第８９巻、第６３５－６４２頁、２００８年 Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　第１４巻、第５１－５７頁、２００３年 Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．　第２５巻、第３３６－３４２頁、１９９２年 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．　第６１巻、第１３７－１４３頁、１９９９年 Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　第１９巻、第１０４０－１０４８頁、２００８年 Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　第３０巻、第１９５４－１９６１頁、２００９年 Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　第８巻、第２１９０－２１９５頁、２００７年 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．　第１１９巻、第２４５－２５２頁、２００７年 ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　第８６巻、第７４７- ７５２頁、２０１１年 ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　第８７巻、第２２１１-２２１６頁、２０１２年
　ヒアルロン酸誘導体の血中滞留性は、グルクロン酸部分のカルボキシの修飾率と相関するものの、ある閾値を境に急激に変化することも明らかになっており、ヒアルロン酸誘導体の血中滞留性を、カルボキシの修飾率を制御することのみによって望ましい範囲内にコントロールすることは困難である。よって、より簡便かつ確実な方法で血中滞留性をコントロールする方法が望まれている。また、ヒアルロン酸のレセプターによる認識が低下すると、生体内での代謝を受けにくくなり、ヒアルロン酸が元来もつ特徴である生分解性が低下することも予想される。したがって、生分解性（安全性）および血中滞留性の両方の特徴を兼ね備えた新規基材が求められている。
　また、エンドサイトーシスを経て医薬品の活性成分を細胞質内へ送達するために使用できる材料については報告されているが、より効率的に、および／または、より安全に活性成分を送達するための方法が求められている。
　発明が解決しようとする課題は、生分解性と血中滞留性の両方の特徴を兼ね備えたヒアルロン酸誘導体、および／または遺伝子及び薬物を細胞質内に送達することができるヒアルロン酸誘導体を提供することである。また発明が解決しようとするさらなる課題は、該ヒアルロン酸誘導体と薬物とが結合したコンジュゲートおよび該ヒアルロン酸誘導体を含む医薬品組成物、特に、該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体を提供することである。
　本発明者は、かかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、ヒアルロン酸またはその塩のグルクロン酸部分のカルボキシを、特定のアルキルアミン、特定のアミノ－カルボン酸または特定のアミノ－カルボン酸アミドと反応させてアミドに変換することにより得られたヒアルロン酸誘導体が、生分解性と血中滞留性の両方の特性を有することを見出し、本発明を完成させた。また、特定のアミノ－カルボン酸を用いて修飾したヒアルロン酸誘導体が、エンドソームから細胞質内への遺伝子/薬物の放出に有効であることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、生分解性と血中滞留性とを併せ持つヒアルロン酸誘導体、および、薬理活性を有する化合物、特に核酸医薬品の生体内における分解を抑制し、細胞質内へのデリバリーを可能とするヒアルロン酸誘導体に関する。さらに本発明は、該ヒアルロン酸誘導体の製造方法、ならびに薬物および該ヒアルロン酸誘導体を含む医薬品組成物およびその製造方法に関する。
　本発明の１つの側面において、以下の（１）～（１７）のヒアルロン酸誘導体が提供される。
　（１）式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｒ８は、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
　Ｘは、－ＮＲｘ－Ａ－Ｂ－Ｚで表される基であり；
　Ａは、－ＣＲａＲｂ－、およびＣ３－８シクロアルキレンから選択され、Ｂは直接結合であり、Ｚは－ＣＯＯＲｙまたは－ＣＯＮＲｙａＲｙｂであり；または
　－Ａ－Ｂ－Ｚは、Ｃ１－６アルキルを表し；または
　Ａは－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－であり、Ｂはフェニレン（ここでフェニレンは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の基で置換されていてもよい）、Ｃ３－８シクロアルキレンおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択され、Ｚは－ＣＯＯＲｙであり； 
　ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され；
　Ｒａは、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され；
　Ｒｂは、水素原子、Ｃ１－６アルキル（ここでＣ１－６アルキルは、ヒドロキシ、カルボキシ、Ｃ３－８シクロアルキル、アリールおよびカルバモイルから選択される１以上の基で置換されていてもよく、ここでアリールはヒドロキシにより置換されていてもよい）、Ｃ３－８シクロアルキル、およびアリール（ここでアリールはヒドロキシにより置換されていてもよい）から選択され；
　ＲｙａおよびＲｙｂは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択される］
で表される二糖単位を含み、前記式（Ｉ）のＡが－ＣＲａＲｂ－またはＣ３－８シクロアルキレンの場合、存在する二糖単位に対する式（Ｉ）の二糖単位の割合は７０％以上であるヒアルロン酸誘導体。
　（２）Ｘが－ＮＨＣＨ３、－ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、－ＮＲｘ－Ａ－Ｚであり；Ａが－ＣＲａＲｂ－またはＣ３－８シクロアルキレンである、上記（１）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（３）ＡがＣ３－８シクロアルキレンであり、Ｂが直接結合である；
　Ａが－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－であり、Ｂがフェニレン（ここでフェニレンは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の基で置換されていてもよい）、Ｃ３－８シクロアルキレンおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択される；または
　Ａが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイル、３－フェニルプロパン－１，１－ジイル、シクロヘキシルメタン－１，１－ジイルおよび４－ヒドロキシフェニルメタン－１，１－ジイルから選択され、Ｂが直接結合である、上記（１）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（４）Ａが－ＣＨ２－であり、Ｂがシクロヘキサン－１，１－ジイル、ベンゼン－１，４－ジイル、ベンゼン－１，３－ジイル、２－クロロベンゼン－１，４－ジイルおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択される；
　Ａが－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｂがベンゼン－１，４－ジイルである；または、
　Ａが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイルおよび３－フェニルプロパン－１，１－ジイルから選択され；Ｂが直接結合である、上記（１）または（３）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（５）Ｚが－ＣＯＯＲｙである、上記（１）～（４）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　（６）式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｒ８は、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
　Ｘは、－ＮＨＣＨ３、－ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、－ＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯＯＲｙまたは－ＮＲｘ－ＣＨＲｃ－ＣＯＮＲｙａＲｙｂで表される基であり；
　ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され；
　Ａは、－ＣＲａＲｂ－、Ｃ３－８シクロアルキレン、２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイル、３－フェニルプロパン－１，１－ジイル、シクロヘキシルメタン－１，１－ジイルおよび４－ヒドロキシフェニルメタン－１，１－ジイルから選択され、Ｂは直接結合であり；または
　Ａは－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－であり、Ｂはフェニレン（ここでフェニレンは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の基で置換されていてもよい）、Ｃ３－８シクロアルキレンおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択され；
　Ｒａは、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され；
　Ｒｂは、水素原子およびＣ１－６アルキル（ここでＣ１－６アルキルは、ヒドロキシ、カルボキシおよびカルバモイルから選択される１以上の基で置換されていてもよい）から選択され；
　Ｒｃは、カルバモイルで置換されていてもよいＣ１－６アルキルを表し；
　ＲｙａおよびＲｙｂは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択される］
で表される二糖単位を含み、前記式（Ｉ）のＡが－ＣＲａＲｂ－またはＣ３－８シクロアルキレンの場合、存在する二糖単位に対する式（Ｉ）の二糖単位の割合は７０％以上であるヒアルロン酸誘導体。
　（７）Ｘが－ＮＨＣＨ３、－ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３または－ＮＲｘ－ＣＨＲｃ－ＣＯＮＲｙａＲｙｂであるか、あるいは、Ａが－ＣＲａＲｂ－またはＣ３－８シクロアルキレンである、上記（６）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（８）ＡがＣ３－８シクロアルキレンであり、Ｂが直接結合である；
　Ａが－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－であり、Ｂがフェニレン（ここでフェニレンは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の基で置換されていてもよい）、Ｃ３－８シクロアルキレンおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択される；または
　Ａが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイル、３－フェニルプロパン－１，１－ジイル、シクロヘキシルメタン－１，１－ジイルおよび４－ヒドロキシフェニルメタン－１，１－ジイルから選択され、Ｂが直接結合である、上記（６）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（９）Ａが－ＣＨ２－であり、Ｂがシクロヘキサン－１，１－ジイル、ベンゼン－１，４－ジイル、ベンゼン－１，３－ジイル、２－クロロベンゼン－１，４－ジイルおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択される；
　Ａが－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｂがベンゼン－１，４－ジイルである；または、
　Ａが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイルおよび３－フェニルプロパン－１，１－ジイルから選択され；Ｂが直接結合である、上記（６）または（８）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（１０）式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｒ８は、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
　Ｘは、－ＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯＯＲｙで表される基であり；
　ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され；
　Ａは、－ＣＲａＲｂ－、Ｃ３－８シクロアルキレン、２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイル、および３－フェニルプロパン－１，１－ジイルから選択され、Ｂは直接結合であり；または
　Ａは－ＣＨ２－であり、ＢはフェニレンおよびＣ３－８シクロアルキレンから選択され；
　Ｒａは、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され；
　Ｒｂは、水素原子およびＣ１－６アルキル（ここでＣ１－６アルキルは、ヒドロキシおよびカルボキシから選択される１以上の基で置換されていてもよい）から選択される］
で表される二糖単位を含み、前記式（Ｉ）のＡが－ＣＲａＲｂ－またはＣ３－８シクロアルキレンの場合、存在する二糖単位に対する式（Ｉ）の二糖単位の割合が７０％以上である、ヒアルロン酸誘導体。
　（１１）Ａが－ＣＲａＲｂ－またはＣ３－８シクロアルキレンである、上記（１０）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（１２）ＡがＣ３－８シクロアルキレンであり、Ｂが直接結合である；
　Ａが－ＣＨ２－であり、ＢがフェニレンおよびＣ３－８シクロアルキレンから選択される；または
　Ａが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイルおよび３－フェニルプロパン－１，１－ジイルから選択され、Ｂが直接結合である、上記（１０）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（１３）Ａが－ＣＨ２－であり、Ｂがシクロヘキサン－１，１－ジイルおよびベンゼン－１，４－ジイルから選択される；または、
　Ａが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイルおよび３－フェニルプロパン－１，１－ジイルから選択され、Ｂが直接結合である、上記（１０）または（１２）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（１４）式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｒ８ａは、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
　Ｘａは、ヒドロキシおよび－Ｏ－Ｑ＋、から選択され；ここで、Ｑ＋は、カウンターカチオンを表す］
で表される二糖単位をさらに含む、上記（１）～（１３）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　（１５）式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｒ８ｂは、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
　Ｘｂは、－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄで表される基であり；ここで、
　Ｒｅは、水素原子またはＣ１－６アルキルであり；
　Ｒｄは、水素原子、Ｃ１－６アルキル、－ＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２、または－ＣＯ－Ｇ４－Ｘｃであり；
　Ｒ７は、水素原子またはメチルであり；
　Ｇ４は、フェニレン、Ｃ３－８シクロアルキレン、または－Ｇ５－（Ｃ１－１０アルキレン）－Ｇ６－から選択され、ここでＣ１－１０アルキレン部分は、１～３のフェニレンまたはＣ３－８シクロアルキレンが挿入されていてもよく；
　Ｇ５およびＧ６は、それぞれ独立に、直接結合、フェニレン、またはＣ３－８シクロアルキレンから選択され；
　Ｘｃは、メルカプト、ハロゲン原子または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で表される基であり；
　Ｙｂは、－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ－、－ＣＨ２－（ＣＨＲ６）ｐ－２－ＣＨ２－Ｏ－、－（ＣＨ２）ｊ－Ｓ－または－（ＣＨ２）ａ－（Ｙ１－（ＣＨ２）ｂ）ｃ－Ｇ－であり；
　ｌ、ｐ、およびｊは、それぞれ独立に２～１０から選択される整数であり、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子またはヒドロキシであり；
　ａは、２～１０から選択される整数であり；
　ｂは、それぞれ独立に２～１０から選択される整数であり；
　ｃは、１～２００から選択される整数であり；
　Ｙ１は、酸素原子または－ＮＲｎ－であり；
　Ｇは、酸素原子、硫黄原子または－ＮＨ－であり；
　Ｒｎは、水素原子、Ｃ１－６アルキル、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｄ－Ｒｏ、－（ＣＨ２）ｅ－Ｒｐまたは－（ＣＨ２）ｆ－（Ｙ２－（ＣＨ２）ｇ）ｈ－Ｒｑであり；
　ｇは、それぞれ独立に、２～１０から選択される整数であり；
　ｄ、ｅ、ｆおよびｈは、それぞれ独立に、２～１０から選択される整数であり；
　Ｒｏ，ＲｐおよびＲｑは、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ、カルボキシまたは－ＮＨＲｒであり；
　Ｙ２は、酸素原子または－ＮＨ－であり；
　Ｒｒは、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルである］
で表される二糖単位をさらに含む、上記（１）～（１４）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　（１６）Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの全てを水素原子とし、Ｒ８ａをアセチルとし、かつ、Ｘａを－Ｏ－Ｎａ＋とした場合の重量平均分子量が２０～１２０キロダルトンとなる、上記（１４）に記載の式（ＩＩ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を用いて製造される、上記（１）～（１５）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　（１７）前記ヒアルロン酸誘導体に主鎖構造が対応する誘導体化されていないヒアルロン酸の重量平均分子量が２０～１２０キロダルトンであり、ここで誘導体化されていないヒアルロン酸は、前記式（ＩＩ）においてＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａが水素原子であり、Ｒ８ａがアセチルであり、Ｘａが－Ｏ－Ｎａ＋である二糖単位のみからなるヒアルロン酸である、上記（１）～（１５）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　本発明の別の側面において、上記（１）～（１７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を担体として含む、医薬組成物が提供される。
　本発明のさらに別の側面において、上記（１）～（１７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体に、１以上の薬物が結合した、ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体が提供される。
　さらに本発明の別の側面において、上記（１）～（１７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含む、生分解性の薬物担体が提供される。
　本発明のさらに別の側面において、上記（１）～（１７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含む、薬物の細胞質内導入用の担体が提供される。
　さらに本発明の別の側面において、上記（１）、（２）、（５）～（７）、（１０）、（１１）、および（１４）～（１７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含む、生分解性の薬物担体が提供される。
　本発明のさらに別の側面において、上記（１）、（３）～（６）、（８）～（１０）、および（１２）～（１７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含む、薬物の細胞質内導入用の担体が提供される。
　さらに本発明の別の側面において、上記（１）～（１７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体と共に治療有効量の薬物を対象に投与することを含む、薬物の投与方法が提供される。
　本発明のさらに別の側面において、上記（１）～（１７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体と共に治療有効量の薬物を投与することを含む、薬物の細胞質内導入方法が提供される。
　さらに本発明の別の側面において、上記（１）、（２）、（５）～（７）、（１０）、（１１）、および（１４）～（１７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体と共に治療有効量の薬物を対象に投与することを含む、薬物の投与方法が提供される。
　本発明のさらに別の側面において、上記（１）、（３）～（６）、（８）～（１０）、および（１２）～（１７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体と共に治療有効量の薬物を投与することを含む、薬物の細胞質内導入方法が提供される。
実施例１－２で調製したＨＡ－ＴＢＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－３で調製したＨＡ－ＦＬ／ＴＢＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１で調製したＨＡ－Ａｌａ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－２で調製したＨＡ－Ｓｅｒ／ＦＬおよびＨＡ－Ｓｅｒ－ＯＥｔ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－３で調製したＨＡ－Ｇｌｕ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－４で調製したＨＡ－Ｇｌｙ／ＦＬおよびＨＡ－Ｇｌｙ－ＯＥｔ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－５で調製したＨＡ－Ｖａｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－６で調製したＨＡ－Ｌｅｕ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－７で調製したＨＡ－Ｉｌｅ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－８で調製したＨＡ－Ｔｈｒ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－９で調製したＨＡ－Ａｓｐ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１０で調製したＨＡ－ｃＡＣＨＣＡ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１１で調製したＨＡ－ｔＡＣＨＣＡ－ＯＥｔ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１２で調製したＨＡ－Ａｉｂ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１３で調製したＨＡ－ＡＣＢｕＣＡ－ＯＥｔ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１４で調製したＨＡ－Ａｓｎ／Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１５で調製したＨＡ－Ａｌａ－ＮＨ２／Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１６で調製したＨＡ－Ｖａｌ－ＮＨ２／Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１７で調製したＨＡ－Ａｓｎ－ＮＨ２／Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１８で調製したＨＡ－Ｍｅ及び、ＨＡ－Ｍｅ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４－１９で調製したＨＡ－Ｐｒ及び、ＨＡ－Ｐｒ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－１で調製したＨＡ－ＡＭＣＨＣＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－２で調製したＨＡ－ｐｃＡＣＨＣＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－３で調製したＨＡ－Ｎａｌの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－４で調製したＨＡ－ＡＰＢＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－５で調製したＨＡ－Ｃｈａの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－６で調製したＨＡ－ＡＭＢＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－７で調製したＨＡ－３ＡＭＢＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－８で調製したＨＡ－ＡＰｈＰＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－９で調製したＨＡ－ＡＥＢＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－１０で調製したＨＡ－ＡＭＣｌＢＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－１１で調製したＨＡ－ＡＭＳＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－１２で調製したＨＡ－４ＡＭＣＨＣＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－１３で調製したＨＡ－Ｃｈｇの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－５－１４で調製したＨＡ－ｐＨＰｈｇの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－１で調製したＨＡ－ＦＬおよび低修飾率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－２で調製したＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬおよび高修飾率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－３で調製したＨＡ－Ｐｈｅ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－４で調製したＨＡ－Ｔｙｒ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－５で調製したＨＡ－ＭｅＰｈｅ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－６で調製したＨＡ－Ｐｒｏ－ＯＭｅ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－７で調製したＨＡ－Ｇｌｙ－ＮＨ２／Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－８で調製したＨＡ－Ｓｅｒ－ＮＨ２／Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－９で調製したＨＡ－Ｌｅｕ－ＮＨ２／Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－１０で調製したＨＡ－Ｉｌｅ－ＮＨ２／Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－１１で調製したＨＡ－Ｔｈｒ－ＮＨ２／Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－１－１２で調製したＨＡ－Ｇｌｎ－ＮＨ２／Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－２－１で調製したＨＡ－Ｎｌｅの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－２－２で調製したＨＡ－ｔＬｅｕの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－２－３で調製したＨＡ－ｐＦＰｈｅの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－２－４で調製したＨＡ－Ｐｈｇの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－３で調製したＰＥＧ－ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例３－２－２で算出した、ラット血漿中の試料濃度推移の群平均値を示したものである。 実施例３－２－２で算出した、ラット血漿中の試料濃度推移の群平均値をプロットしたグラフである。 実施例３－２－２で算出した、ラット血漿中の試料濃度推移の群平均値をプロットしたグラフである。 実施例１－４－１で調製したＨＡ－Ａｌａ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－２で調製したＨＡ－Ｓｅｒ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－３で調製したＨＡ－Ｇｌｕ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－４で調製したＨＡ－Ｇｌｙ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－５で調製したＨＡ－Ｖａｌ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－６で調製したＨＡ－Ｌｅｕ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－７で調製したＨＡ－Ｉｌｅ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－８で調製したＨＡ－Ｔｈｒ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－９で調製したＨＡ－Ａｓｐ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－１０で調製したＨＡ－ｃＡＣＨＣＡ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－１１で調製したＨＡ－ｔＡＣＨＣＡ－ＯＥｔ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－１２で調製したＨＡ－Ａｉｂ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－１３で調製したＨＡ－ＡＣＢｕＣＡ－ＯＥｔ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－１４で調製したＨＡ－Ａｓｎ／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－１５で調製したＨＡ－Ａｌａ－ＮＨ２／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－１６で調製したＨＡ－Ｖａｌ－ＮＨ２／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－１７で調製したＨＡ－Ａｓｎ－ＮＨ２／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－１８で調製したＨＡ－Ｍｅ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例１－４－１９で調製したＨＡ－Ｐｒ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－１で調製したＨＡ－ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－２で調製したＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－３で調製したＨＡ－Ｐｈｅ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－４で調製したＨＡ－Ｔｙｒ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－５で調製したＨＡ－ＭｅＰｈｅ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－６で調製したＨＡ－Ｐｒｏ－ＯＭｅ／ＦＬを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－７で調製したＨＡ－Ｇｌｙ－ＮＨ２／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－８で調製したＨＡ－Ｓｅｒ－ＮＨ２／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－９で調製したＨＡ－Ｌｅｕ－ＮＨ２／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－１０で調製したＨＡ－Ｉｌｅ－ＮＨ２／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－１１で調製したＨＡ－Ｔｈｒ－ＮＨ２／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 比較例１－１－１２で調製したＨＡ－Ｇｌｎ－ＮＨ２／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。 実施例４－２での評価における本発明のＨＡ誘導体によるリポソーム分解率を示す表である。 実施例５－１で調製したアラニン修飾率算出用サンプル及び、ＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例５－２で調製したＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例５－３で調製したＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡ－Ｒｈの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例６－２－２で算出した、ラット血漿中の試料濃度推移の群平均値を示したものである。 実施例６－２－２で算出した、ラット血漿中の試料濃度推移の群平均値をプロットしたグラフである。 実施例５－５で調製したＨＡ－Ａｌａ－ＰＴＨ／Ｒｈを投与したラットの尿サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムである。
発明の実施の形態
　本発明のヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）で表される１以上の二糖単位を含むヒアルロン酸誘導体であれば特に限定されない。本発明の１つの態様において、本発明のヒアルロン酸誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する式（Ｉ）の二糖単位の割合は、例えば７０％以上、好ましくは７５％以上、更に好ましくは９０％以上である。上限は１００％以下であればよい。本発明の１つの態様において、式（Ｉ）で表される１以上の二糖単位と、式（ＩＩ）および／または（ＩＩＩ）で表される１以上の二糖単位を含むヒアルロン酸誘導体が提供される。
　本発明の一態様において、ヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の二糖単位から実質的に構成される。当該ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が式（Ｉ）または（ＩＩ）の二糖単位である。本発明の１つの態様において、上記式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される二糖単位のみから構成される。
　本発明の一態様において、ヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の二糖単位から実質的に構成される。当該ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の二糖単位である。本発明の１つの態様において、上記式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で表される二糖単位のみから構成される。
　本発明のヒアルロン酸誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する特定の二糖単位の割合は、好ましくは、二糖単位を繰り返し単位とする多糖類である本発明のヒアルロン酸誘導体の一定量に含まれる全ての二糖単位に対する特定の二糖単位の割合を意味する。
　本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、全て水素原子であるのが好ましい。Ｒ８は、水素原子またはＣ１－６アルキルカルボニルであるのが好ましく、水素原子またはアセチルであるのが更に好ましく、アセチルであるのが更に好ましい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａ、並びにＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、全て水素原子であるのが好ましい。Ｒ８ａおよびＲ８ｂは、水素原子またはＣ１－６アルキルカルボニルであるのが好ましく、水素原子またはアセチルであるのが更に好ましく、いずれもアセチルであるのが更に好ましい。
　式（Ｉ）において、－Ａ－Ｂ－ＺがＣ１－６アルキルの場合、Ｃ１－３アルキルが好ましく、特にメチル、ｎ－プロピルが好ましい。
　式（Ｉ）において、Ｒｘは、水素原子またはメチル、エチルなどのＣ１－６アルキルであり、水素原子であるのが好ましい。Ｒｙは、水素原子またはメチル、エチルなどのＣ１－６アルキルであり、水素原子、メチルまたはエチルであるのが好ましい。
　式（Ｉ）において、ＡまたはＢがＣ３－８シクロアルキレンである場合、その例として、１，１－シクロヘキシレン、１，２－シクロヘキシレン、１，３－シクロヘキシレン、１，４－シクロヘキシレン、１，１－シクロペンチレン、１，２－シクロペンチレン、１，３－シクロペンチレン、１，１－シクロブチレン、１，２－シクロブチレン、１，３－シクロブチレンなどが挙げられる。好ましい例として、１，１－シクロヘキシレン、１，２－シクロヘキシレン、１，４－シクロヘキシレン、１，１－シクロブチレンが挙げられる。生分解性及び血中滞留性の両方の特性を有する観点では、Ｃ３－８シクロアルキレンは、１，１－シクロヘキシレン、１，２－シクロヘキシレン、または１，１－シクロブチレンが好ましく、遺伝子および薬物を細胞質内に送達させる観点では、Ｃ３－８シクロアルキレンは１，４－シクロヘキシレンが好ましい。
　式（Ｉ）において、Ｂがフェニレンである場合、その例として、１，２－フェニレン、１，３－フェニレン、１，４－フェニレンが挙げられる。好ましい例として、１，４－フェニレン、１，３－フェニレンが挙げられる。またＢがフェニレンである場合、特に好ましい例として、１，４－フェニレンが挙げられる。
　フェニレンは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の基で置換されていてもよい。置換されているフェニレンの具体例としては、２－ヒドロキシ－１，４－フェニレン、３－ヒドロキシ－１，４－フェニレン、２，３－ジヒドロキシ－１，４－フェニレン、３，５－ジヒドロキシ－１，４－フェニレン、５－ヒドロキシ－１，３－フェニレン、３－ヒドロキシ－１，２－フェニレン、４－ヒドロキシ－１，２－フェニレン；２－クロロ－１，４－フェニレン、２－ヨード－１，４－フェニレン、３－ブロモ－１，４－フェニレン、２，６－ジフルオロ－１，４－フェニレン、３，５－ジクロロ－１，４－フェニレン、５－クロロ－１，３－フェニレン、３－ブロモ－１，２－フェニレン、４－クロロ－１，２－フェニレン、；６－フルオロ－２－ヒドロキシ－１，４－フェニレン、５－クロロ－３－ヨード－１，４－フェニレン、２－ブロモ－３－ヒドロキシ－１，４－フェニレン、５－ブロモ－３－クロロ－１，４－フェニレン、５－ヒドロキシ－６－ヨード－１，３－フェニレン、３－クロロ－４－ヒドロキシ－１，２－フェニレン、４－ブロモ－３－クロロ－１，２－フェニレン、が挙げられ、好ましくは３－ヒドロキシ－１，４－フェニレン、２－クロロ－１，４－フェニレンが挙げられる。
　Ｒｃは、カルバモイル（－ＣＯＮＨ２）で置換されていてもよいＣ１－６アルキルであり、好ましくは、メチル、イソプロピルまたはカルバモイルメチルであり、さらに好ましくはイソプロピルまたはカルバモイルメチルである。
　ＲｙａおよびＲｙｂは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され、好ましくは、両方が水素原子；一方が水素原子で他方がＣ１－６アルキル；一方が水素原子で他方がＣ１－６アルキルカルボニルであり、さらに好ましくは、両方が水素原子；一方が水素原子で他方がメチル；一方が水素原子で他方がエチルであり、さらに好ましくは、両方が水素原子である。　式（Ｉ）におけるＸとして、例えば以下の基が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式中、Ｒｙは本明細書に定義したとおりである］。
　例示した基は、生分解性及び血中滞留性の両方の特性を有する観点で好ましい基である。
　さらに、式（Ｉ）におけるＸの例として、以下の基が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式中、Ｒｙ、Ｒｙａ、Ｒｙｂは本明細書に定義したとおりである］。
　ここで、「＊」は、ヒアルロン酸誘導体中のカルボキシへの結合位置を表す（以下同じ）。
　本発明の一態様として、生分解性及び血中滞留性の両方の特性を有する観点では、式（Ｉ）で定義されるＡが－ＣＲａＲｂ－（Ｒａは、前記にて定義した通りであり、Ｒｂは、水素原子およびＣ１－６アルキル（Ｃ１－６アルキルは、ヒドロキシおよびカルボキシから選択される基で置換されていてもよい）から選択される）であり、Ｂが直接結合であるか；または、ＡがＣ３－８シクロアルキレンであり、Ｂが直接結合であるのが好ましい。
　本発明の別の態様として、生分解性及び血中滞留性の両方の特性を有する観点では、式（Ｉ）で定義されるＸが－ＮＨＣＨ３、－ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３またはＮＲｘ－ＣＨＲｃ－ＣＯＮＲｙａＲｙｂであるか；Ａが－ＣＲａＲｂ－（Ｒａは、前記にて定義した通りであり、Ｒｂは、水素原子およびＣ１－６アルキル（Ｃ１－６アルキルは、ヒドロキシ、カルボキシおよびカルバモイルから選択される基で置換されていてもよい）から選択される）であり、Ｂが直接結合であるか；あるいは、ＡがＣ３－８シクロアルキレンであり、Ｂが直接結合であるのが好ましい。
　Ｒａとしては、水素原子およびメチルがさらに好ましく、水素原子がさらに好ましい。Ｒｂとしては、水素原子およびＣ１－４アルキル（Ｃ１－４アルキルは、ヒドロキシおよびカルボキシから選択される基で置換されていてもよい）が好ましく、ヒドロキシで置換されていてもよいメチルがさらに好ましい。また好ましいＲｂの例として、水素原子およびＣ１－４アルキル（Ｃ１－４アルキルは、ヒドロキシ、カルボキシおよびカルバモイルから選択される基で置換されていてもよい）が挙げられる。
　Ｂとしては、シクロヘキサン－１，２－ジイルおよびシクロブタン－１，１－ジイルが好ましく、シクロヘキサン－１，２－ジイルがさらに好ましい。シクロヘキサン環上の－ＮＲｘ－および－ＣＯＯＲｙの立体配置としては、シス配置およびトランス配置のいずれも好ましい。本発明のヒアルロン酸誘導体では、シクロヘキサン環上の－ＮＲｘ－および－ＣＯＯＲｙの立体配置としてシス配置またはトランス配置のみを含んでいてもよく、またはシス配置およびトランス配置が任意の比で存在してもよい。または、各基の立体化学は単一であってもよく、任意の比で存在していてもよい。
　生分解性及び血中滞留性の両方の特性を有する観点で、好ましいＸの具体例としては、例えば以下の式で表される基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　生分解性及び血中滞留性の両方の特性を有する観点で、好ましいＸの別の具体例としては、例えば以下の式で表される基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　さらに好ましいＸの具体例としては、以下の基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　さらに好ましいＸの別の具体例としては、以下の基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　さらに好ましいＸの具体例としては、以下の基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　さらに好ましいＸの別の具体例としては、以下の基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　特に好ましいＸの具体例としては、以下の基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 　生分解性及び血中滞留性の両方の特性を有する観点で、本発明のヒアルロン酸誘導体に存在する二糖の繰り返し単位における式（Ｉ）の二糖単位の割合は、好ましくは７０％以上、更に好ましくは７５％以上、更に好ましくは９０％以上である。
　本発明の一態様として、遺伝子および薬物を細胞質内に送達させる観点では、式（Ｉ）で定義されるＡがＣ３－８シクロアルキレンであり、Ｂが直接結合であるか；Ａが－ＣＨ２－であり、ＢがフェニレンおよびＣ３－８シクロアルキレンから選択されるか；またはＡが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイルおよび３－フェニルプロパン－１，１－ジイルから選択され、Ｂが直接結合であるのが好ましい。さらに好ましくは、式（Ｉ）で定義されるＡが－ＣＨ２－であり、Ｂがシクロヘキサン－１，１－ジイルおよびベンゼン－１，４－ジイルから選択されるか；または、Ａが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイルおよび３－フェニルプロパン－１，１－ジイルから選択される。
　本発明の別の態様として、遺伝子および薬物を細胞質内に送達させる観点では、式（Ｉ）で定義されるＡがＣ３－８シクロアルキレンであり、Ｂが直接結合であるか；Ａが－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－であり、Ｂがフェニレン（ここでフェニレンは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の基で置換されていてもよい）、Ｃ３－８シクロアルキレンおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択されるか；またはＡが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイル、３－フェニルプロパン－１，１－ジイル、シクロヘキシルメタン－１，１－ジイルおよび４－ヒドロキシフェニルメタン－１，１－ジイルから選択され、Ｂが直接結合であるのが好ましい。さらに好ましくは、式（Ｉ）で定義されるＡが－ＣＨ２－であり、Ｂがシクロヘキサン－１，１－ジイル、ベンゼン－１，４－ジイル、ベンゼン－１，３－ジイル、２－クロロベンゼン－１，４－ジイルおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択されるか；Ａが－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｂがベンゼン－１，４－ジイルであるか；または、Ａが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイルおよび３－フェニルプロパン－１，１－ジイルから選択される。
　遺伝子および薬物を細胞質内に送達させる観点で、好ましいＸの具体例としては、例えば以下の式で表される基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 　遺伝子および薬物を細胞質内に送達させる観点で、好ましいＸの具体例としては、例えば以下の式で表される基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 　さらに好ましいＸの具体例としては、以下の基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 　さらに好ましいＸの別の具体例としては、以下の基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 　式（Ｉ）のＸが１以上の不斉点を含む場合、各不斉点の立体配置としては、Ｒ配置のみ、Ｓ配置のみ、およびＲ配置とＳ配置とが任意の比で存在していてもよい。
　なお、式（Ｉ）のＸから、以下の基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 　あるいは以下の基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 を除くことができる。
　式（ＩＩ）において、Ｑ＋はカルボキシと水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシと塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択される）で表されるアンモニウムイオンなどが挙げられ、好ましくは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、テトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ－ブチルアンモニウムイオンなど）が挙げられる。Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、Ｃ１－６アルキルから選択される同一の基であるのが好ましく、ｎ－ブチルであるのが好ましい。
　式（ＩＩＩ）において、Ｘｂの例として以下の基が挙げられる：
　－ＨＮ－（ＣＨ２）ｊ－ＳＨ；
　－ＨＮ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＳＨ；
　－ＨＮ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２；
　－ＨＮ－（ＣＨ２）ｌ－ＮＨＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２；
　－ＨＮ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２；または
　－ＨＮ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２
［式中、ｊ、Ｙｌ、ｃ、ｐ、Ｒ７、およびｌは、本明細書において既に定義されたとおりである］。
　本発明において「Ｃ１－６アルキル」とは、炭素数１～６の直鎖状、分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチルなどの「Ｃ１－４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ－ペンチル、３－メチルブチル、２－メチルブチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、４－メチルペンチル、３－メチルペンチル、２－メチルペンチル、１－メチルペンチル、３－エチルブチル、および２－エチルブチルなどが含まれる。
　本発明において「Ｃ１－６アルキルカルボニル」とは、炭素数１～６の直鎖状、分岐鎖状のアルキルを有するアルキルカルボニルを意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ピバロイル、バレリル、イソバレリル、ヘキサノイルなどが含まれる。
　本発明において「アリール」とは、芳香族炭素環基、例えば炭素数が６～１４の芳香族炭素環基を意味し、アリールの例としてはフェニル、ナフチル（１－ナフチル、２－ナフチルおよび３－ナフチル）などが挙げられる。
　本発明において「Ｃ３－８シクロアルキル」とは、炭素数３～８の環状アルキルを意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロへプチル、およびシクロオクチルが含まれる。
　本発明において「Ｃ３－８シクロアルキレン」とは、炭素数３～８の２価の環状アルキルを意味し、例えば、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロへプチレン、およびシクロオクチレンが含まれる。より具体的な例としては、１，１－シクロヘキシレン、１，２－シクロヘキシレン、１，３－シクロヘキシレン、１，４－シクロヘキシレン、１，１－シクロペンチレン、１，２－シクロペンチレン、１，３－シクロペンチレン、１，１－シクロブチレン、１，２－シクロブチレン、１，３－シクロブチレンなどが挙げられる。好ましい例として、１，１－シクロヘキシレン、１，２－シクロヘキシレン、１，４－シクロヘキシレン、１，１－シクロブチレンが挙げられる。
　本発明において「フェニレン」とは、ベンゼンの２つの水素原子が置換されている２価の基を意味し、ベンゼン－１，２－ジイル、ベンゼン－１，３－ジイル、ベンゼン－１，４－ジイルが含まれる。
　本発明において「Ｃ１－１０アルキレン」とは、炭素数１～１０の直鎖または分岐鎖状のアルキレン基を意味し、例えば、メチレン、エタン－１，２－ジイル、プロパン－１．３－ジイル、ブタン－１，４－ジイル、ペンタン－１，５－ジイル、ヘキサン－１，６－ジイル、ヘプタン－１，７－ジイル、オクタン－１，８－ジイル、ノナン－１，９－ジイル、デカン－１，１０－ジイル、プロパン－１，２－ジイル、２－メチルプロパン－１，３－ジイル、ブタン－２，４－ジイル、３－メチルブタン－１，４－ジイル、２－メチルペンタン－１，５－ジイル、４－エチルヘキサン－１，６－ジイル、４－メチルヘプタン－２，７－ジイル、５－エチルオクタン－１，８－ジイル、および６－メチルノナン－１，９－ジイルが含まれる。
　本発明において「１～３のＣ３－８シクロアルキレンまたはフェニレンが挿入されたＣ１－１０アルキレン」とは、１～３個、好ましくは１個のフェニレンまたはＣ３－８シクロアルキレンが挿入されたＣ１－１０アルキレン基を意味する。
　Ｇ４の好ましい例としては、例えば、フェニレン、または以下の式で表される基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （式中、ｘは、１～１０から選択される整数であり、ｙは、１～６から選択される整数であり、ｚは、１～５から選択される整数であり、＊＊は、Ｘｃとの結合部位を表す）。
　本発明において「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子を意味する。Ｘｃがハロゲン原子の場合、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が好ましく、薬物中のメルカプトとの反応性の観点では、臭素原子およびヨウ素原子が好ましい。
　本発明において、「薬物担体が生分解性である」とは、ラットおよび／またはヒトに静脈内投与後、２週間後までの間に、尿中において検出される薬物担体が低分子化を起こしていることを意味する。
　本発明において、「細胞内」とは、エンドソームおよび細胞核を含む、細胞膜の内側を意味する。
　本発明において、「細胞質内」とは、「細胞内」から、エンドソームおよび細胞核を除いた、細胞膜の内側を意味する。
　本発明において「エンドソーム」とは、細胞が物質を取り込む過程で形成される生体膜からなる小胞および、それらがライソゾームと融合してできた小胞を意味する。
　「低分子化を起こしていること」は、尿中に排出される薬物担体の大きさを、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに付して測定することで判定できる（本願明細書実施例３－３を参照）。この時、投与後２週間後までの間のいずれか１つの時点または２４時間の期間において観察される尿由来の薬物担体のピークトップが、それより前の時点または期間に採取された尿由来の薬物担体のピークトップと比較して低分子側に移行している（すなわち、カラムクロマトグラムにおける保持時間が長くなる）ならば、薬物担体が生分解性であると判定される。
　式（Ｉ）で表される二糖単位を１以上含む本発明のヒアルロン酸誘導体は、例えば式（ＩＩ）で表される二糖単位から実質的になるヒアルロン酸またはその誘導体、さらに好ましくは、式（ＩＩ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸（塩などを含む）を原料として合成される。本発明の１つの側面において、原料となるヒアルロン酸の重量平均分子量は２０～１２０キロダルトンであり、好ましくは、２０～３０キロダルトン、および５０～１２０キロダルトンが好ましい。好ましい重量平均分子量としては、例えば、２５キロダルトンおよび９９キロダルトン等が挙げられる。血中滞留性向上の観点では、重量平均分子量の下限は５キロダルトン以上であればよく、好ましくは、５０キロダルトン以上、更に好ましくは９９キロダルトン以上である。重量平均分子量の上限は２５０キロダルトン以下が好ましい。また、生分解性の観点では、好ましい重量平均分子量は、５０～１２０キロダルトン、例えば９９キロダルトンであり、細胞質内移行性の観点では、好ましい重量平均分子量は、２０～１２０キロダルトン、例えば、２５キロダルトンおよび９９キロダルトンである。
　なお、２０～１２０キロダルトンという、原料として用いられる、式（ＩＩ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸（塩を含む）の重量平均分子量とは、本発明のヒアルロン酸誘導体の主鎖構造を保持したまま、式（ＩＩ）における、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの全てを水素原子とし、Ｒ８ａをアセチルとし、かつ、Ｘａを－Ｏ－Ｎａ＋として換算した場合の重量平均分子量を意味する。従って、例えば、実際に用いる原料における一部又は全ての二糖単位においてＸａが－Ｏ－（テトラｎ－ブチルアンモニウムイオン）であり、その重量平均分子量が４００キロダルトンである場合であっても、上記に従って換算した重量平均分子量が２０～１２０キロダルトンと算出される場合は、本発明の好ましい１態様に含まれることになる。
　ＨＡ重量平均分子量の測定方法については、例えば、中浜精一他著「エッセンシャル高分子科学」（講談社発行、ＩＳＢＮ４－０６－１５３３１０－Ｘ）に記載された、光散乱法、浸透圧法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができる。本明細書において示される、光散乱法により測定した重量平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー装置を接続した多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ）を使用するなど、本発明が属する技術分野において通常用いられる方法により測定することができる。
　本発明の別の側面によれば、本発明のヒアルロン酸誘導体は、重量平均分子量が５００キロダルトン、好ましくは２５０キロダルトン以下である、式（ＩＩ）で表される二糖単位から実質的になるヒアルロン酸（塩などを含む）を原料として製造することができる。本発明の１つの態様において、本発明のヒアルロン酸誘導体は式（Ｉ）および（ＩＩ）の二糖単位から実質的に構成されるヒアルロン酸誘導体である。
　式（Ｉ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体は、グルクロン酸部分のカルボキシをアミドに変換することにより製造することができる。例えば、原料のヒアルロン酸（塩などを含む）、好ましくは、式（ＩＩ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯＯＲｚ（式中、Ｒｚは、カルボキシを保護するためのエステル形成基であり、Ｒｘ、ＡおよびＢは本明細書に既に定義されたとおりである）または式：ＨＮＲｘ－Ａ－ＣＯＮＲｙａＲｙｂで表される化合物とを反応させ、保護基が存在する場合は脱保護をおこなう方法が挙げられる。ここでエステル形成基は特に限定されず、カルボキシの保護に通常用いられる基であれば特に限定されない。エステル形成基の例としては、Ｃ１－６アルキル、ベンジル、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキル、およびベンジルオキシＣ１－６アルキルなどが挙げられる。
　式（Ｉ）における基：－ＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯＯＲｚおよび－ＮＲｘ－Ａ－ＣＯＮＲｙａＲｙｂは、複数存在する二糖単位の各々において同一であっても異なっていてもよい。例えば、異なる種類の式：ＨＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯＯＲｚおよび／またはＨＮＲｘ－Ａ－ＣＯＮＲｙａＲｙｂで表される化合物を用いて上記反応を行ってもよい。
　上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（ＤＭＴ－ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを挙げることができる。
　特に、限定はされないが、ＤＭＴ－ＭＭは水および有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ－ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシが共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノとカルボキシによるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシと反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシとヒドロキシとが、分子内もしくは分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。
　上記反応において用いる溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、スルホラン（ＳＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジオキサン（例えば１，４－ジオキサン）、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒を挙げることができる。出発物質、修飾物および生成物の溶解性と、縮合剤の反応性の観点からは、ＤＭＳＯ単独もしくは水／ＤＭＳＯ混合溶媒を使用するのが好ましい。修飾物であるアミノ－カルボン酸の種類によっては、それをメタノール溶液やジオキサン溶液として反応に用いてもよい。
　式：ＨＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯＯＲｚで表される化合物として、例えば、アラニンエステル、セリンエステル、グルタミン酸ジエステル、グリシンエステル、バリンエステル、ロイシンエステル、イソロイシンエステル、スレオニンエステル、アスパラギン酸ジエステル、シス－２－アミノ－１－シクロヘキシルカルボン酸エステル、トランス－２－アミノ－１－シクロヘキシルカルボン酸エステル、２－アミノイソブタン酸エステル、１－アミノ－１－シクロブタン酸エステル、１－アミノメチル－１－シクロヘキサン酸エステル、シス－４－アミノシクロヘキサン酸エステル、Ｌ－２－ナフチルアラニンエステル、２－アミノフェニルブタン酸エステル、シクロヘキシル－Ｌ－アラニンエステル、４－アミノメチル安息香酸エステルなどが挙げられる。ここで、上記のエステルは、例えばＣ１－６アルキルエステル、アリールエステル、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキルエステル、アリールＣ１－６アルキルエステルなどであり、好ましくは、メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステルなどである。
　式：ＨＮＲｘ－Ａ－ＣＯＮＲｙａＲｙｂで表される化合物として、例えば、アラニンアミド、アスパラギンアミド、アスパラギン酸アミド、グルタミンアミド、グルタミン酸アミド、グリシンアミド、イソロイシンアミド、ロイシンアミド、フェニルアラニンアミド、セリンアミド、スレオニンアミド、チロシンアミド、バリンアミドなどが挙げられる。
　式（Ｉ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体のうち、Ｘが、－ＮＨＣＨ３および－ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３である誘導体を製造する方法としては、例えば、上記のヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩と、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とＮＨ２ＣＨ３およびＮＨ２（ＣＨ２）２ＣＨ３で表される化合物とを反応させる方法が挙げられる。上記反応では本明細書に既に記載した縮合剤および溶媒を使用することができる。各々のアミンによる修飾率は、例えば、ＨＡユニットに対する縮合剤および／またはアミンの等量数、反応温度、反応時間等をコントロールすることで、調整できる。
　式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体を製造する方法としては、例えば、上記のヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩と、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｗ（式中、Ｒｗは、水素原子、Ｃ１－６アルキル、－ＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２、－ＣＯ－Ｇ４－Ｘｃ、ヒドロキシの保護基、アミノの保護基、またはメルカプトの保護基であり、Ｒｅ、Ｙｂ、Ｒ７、Ｇ４、およびＸｃは本明細書に既に定義されたとおりである）で表される化合物とを反応させ、保護基が存在する場合は脱保護をおこなう方法が挙げられる。上記反応では本明細書に既に記載した縮合剤および溶媒を使用することができる。
　－ＣＯ－Ｇ４－Ｘｃの具体例としては、以下の式で表される基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　上記反応において用いられる保護基の具体例は、例えばＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
　ヒドロキシの保護基の例としては、Ｃ１－６アルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、Ｃ１－６アルコキシカルボニル、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノカルボニル、アリールＣ１－６アルキル、ヘテロアリールＣ１－６アルキル、アリールＣ１－６アルキルアミノカルボニル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、（（アミノＣ１－６アルキル）カルボニルオキシ）Ｃ１－６アルキル、不飽和ヘテロ環カルボニルオキシＣ１－６アルキル、アリールジ（Ｃ１－６アルキル）シリル、トリ（Ｃ１－６アルキル）シリルなどが挙げられる。好ましいヒドロキシの保護基としては、アセチルなどが挙げられる。
　－ＮＨ－またはアミノの保護基の例には、Ｃ１－６アルキルカルボニル、アリールＣ１－６アルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、Ｃ１－６アルコキシカルボニル、Ｃ１－６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノカルボニル、アリールＣ１－６アルキル、ヘテロアリールＣ１－６アルキル、（アリールＣ１－６アルキル）アミノカルボニルなどが含まれる。好ましいアミノの保護基としては、アセチル、ｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメトキシカルボニルなどが挙げられる。また、アミノは保護されることにより、フタル酸イミド、コハク酸イミド、グルタル酸イミド、１－ピロリルなどの飽和または不飽和へテロ環基を形成していてもよい。
　メルカプトの保護基としては、例えば、エチルチオおよびｔ－ブチルチオ等のＣ１－６アルキルチオ、２－ニトロフェニルチオおよび２－カルボキシフェニルチオ等の置換フェニルチオ、並びに２－ピリジルチオ等のヘテロアリールチオが挙げられる。好ましい例は、２－ピリジルチオである。
　上記式（ＩＩＩ）の－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄで表される基の例としては、式：
　－ＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ２；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨ２；
　－ＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ６）ｐ－２－ＣＨ２－ＯＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＯＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｊ－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｌ－ＮＨＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｌ－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｂｒ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｉ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２；または
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２
［式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｙ１、ｃ、ｊ、ｌ、およびｐは、本明細書で定義されるとおりである］
で表される基が挙げられる。
　ここで、ヒアルロン酸誘導体の分子中に含まれる、Ｒ５およびＲ６がヒドロキシであるＣＨＲ５およびＣＨＲ６の個数は、それぞれ０～８であるが、好ましくは０～３、さらに好ましくは０および１である。Ｒ５およびＲ６がヒドロキシであるＣＨＲ５およびＣＨＲ６の個数を調節することで、本発明のヒアルロン酸誘導体の、水に対する溶解度を調節することができる。Ｒ５がすべて水素原子の場合、ｌとしては２～６が好ましく、その具体例として２および６が挙げられる。Ｒ５の１つがヒドロキシである場合、ｌの具体例としては３が挙げられる。Ｙ１が酸素原子の場合、ｃの具体例としては２が挙げられる。Ｙ１が－ＮＨ－の場合、ｃの具体例としては１～３が挙げられる。ｌおよびｐの具体例としては３が挙げられる。
　－（ＣＨ２）ａ－（Ｙ１－（ＣＨ２）ｂ）ｃ－Ｇ－の具体例としては、例えば、－（ＣＨ２）２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）３－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）４－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－、－（ＣＨ２）６－ＮＲｎ－（ＣＨ２）６－Ｏ－、－（ＣＨ２）６－ＮＲｎ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）４－ＮＲｎ－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）４－ＮＲｎ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（スペルミン型）、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、が挙げられる。ここで、Ｒｎとしては、全てが水素原子であるのが好ましい。
　これら－（ＣＨ２）ａ－（Ｙ１－（ＣＨ２）ｂ）ｃ－Ｇ－に結合するＲｄの具体例としては、例えば、水素原子、－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＣＯ－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、－ＣＯ－ＣＨ２－Ｃｌ、－ＣＯ－ＣＨ２－Ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ２－Ｉ、－ＣＯ－ＣＨ２－ＳＨ、－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ等が挙げられる。
　また、－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄで表される基の具体例として、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－Ｎ（－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨＣＯＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＳＨ、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨＣＯＣＨ３）－（ＣＨ２）３－ＳＨおよび－ＮＨ－（ＣＨ２）５－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨＣＯＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＳＨが挙げられる。
　式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体を製造する方法として、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシ（－ＣＯＯＨ）を、式：Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ２で表されるジアミンと反応させて式：－ＣＯＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ２で表されるアミドに変換し、さらに末端のアミノを修飾して基：－ＣＯＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨＲｄで表されるアミドに変換する方法が挙げられる。
　上記ジアミンの具体例としては、例えば、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）４－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）５－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）７－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）８－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）９－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）１０－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）３－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）３－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）３－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）３－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２およびＨ２Ｎ－（ＣＨ２）５－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ２が挙げられる。
　式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体を製造する方法として、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシ（－ＣＯＯＨ）を、式：Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｐ－２－ＣＨ２－ＯＨで表されるヒドロキシアミンと反応させて式：－ＣＯＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｐ－２－ＣＨ２－ＯＨで表されるアミドに変換し、さらに末端のアミノを修飾して基：－ＣＯＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｐ－２－ＣＨ２－ＯＲｄで表されるアミドに変換する方法が挙げられる。
　上記ヒドロキシアミンの具体例としては、例えば、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）３－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）４－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）５－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）６－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）７－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）８－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）９－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）１０－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）３－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）３－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）３－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）３－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）３－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）３－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）６－ＯＨおよびＨ２Ｎ－（ＣＨ２）５－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＯＨが挙げられる。
　なお、これらの化合物は例えばシグマ－アルドリッチ社などから市販されており、適宜購入して利用することができる。また、文献記載の方法に従い、もしくは文献記載の方法を参考にして合成してもよい。
　式（ＩＩＩ）における基：－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄは、複数存在する二糖単位の各々において同一であっても異なっていてもよい。例えば、異なる種類の式：ＨＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄで表される化合物を用いて上記反応を行ってもよい。
　式（Ｉ）におけるＸが－ＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯＯＲｙである場合、Ｘｂは、式（ＩＩＩ）で表される二糖単位中に示した位置に存在するばかりでなく、その一部又は全部が、－ＯＲｙと置換して、Ｘが、－ＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯ－Ｘｂとなってもよい。
　本発明の１つの側面において、本発明のヒアルロン酸誘導体に主鎖構造が対応する誘導体化されていないヒアルロン酸の重量平均分子量は２０～１２０キロダルトンである。ここで誘導体化されていないヒアルロン酸（塩を含む）は、上記式（ＩＩ）においてＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａが水素原子であり、Ｒ８ａがアセチルであり、Ｘａが－Ｏ－Ｎａ＋である二糖単位のみからなるヒアルロン酸である。
　当該誘導体化されていないヒアルロン酸は本発明のヒアルロン酸誘導体に主鎖構造が対応するので、当該誘導体化されていないヒアルロン酸に存在する二糖単位の数は、本発明のヒアルロン酸誘導体に存在する二糖単位の数と一致する。当該側面におけるヒアルロン酸誘導体は、例えば重量平均分子量は２０～１２０キロダルトンのヒアルロン酸またはそのナトリウム塩を原料として用いることにより製造することができる。
　本発明の１つの側面において、存在する二糖の繰り返し単位に対する式（ＩＩ）で表される二糖単位の割合は、５０％以下であるのが好ましく、３０％以下がさらに好ましく、２０％以下がさらに好ましい。その割合の下限は０％以上であればよい。ここでは、ヒアルロン酸誘導体のカルボキシ（－ＣＯＯＨ）の５０％以上が、基：－ＣＯＮＨＣＨ３、－ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、－ＣＯＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯＯＲｙ、－ＣＯＮＲｘ－Ａ－ＣＯＮＲｙａＲｙｂまたは－ＣＯＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄに変換されている。
　式（ＩＩＩ）で表される二糖単位において反応性の炭素－炭素二重結合を含むヒアルロン酸誘導体は、２以上のメルカプトを有する架橋剤（例えば、ジチオスレイトール：ＤＴＴ、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール）との架橋反応に供することができる。また、式（ＩＩＩ）で表される二糖単位においてメルカプトを含むヒアルロン酸誘導体は、２以上のメルカプトを有する架橋剤（例えば、ジチオスレイトール：ＤＴＴ、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール）とのジスルフィド形成による架橋反応、または反応性の炭素－炭素二重結合を２以上含む架橋剤（例えばジビニルスルホン）を使用する架橋反応に供することができる。架橋反応を行うことで、本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化することができる。
　架橋反応の他の事例としては、アミノにより修飾したヒアルロン酸誘導体と、Ｃ２－２０アルキレンの両端にスクシンイミジルエステルやその他のイミドエステルを有する架橋剤（例えば、ビス［スルフォスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）、エチレングリコール－ビス［スルフォスクシンイミジル］スクシネート（Ｓｕｌｆｏ－ＥＧＳ）、ジメチルアジピミデート塩酸塩（ＤＭＡ）など）とので縮合反応による架橋；アミノにより修飾したヒアルロン酸誘導体と、Ｃ２－２０アルキレンの両端にホルミルを有する架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドなど）との架橋；メルカプトにより修飾したヒアルロン酸誘導体の酸化条件下（例えば、テトラチオネートナトリウム（ＳＴＴ）存在下など）での酸化反応による架橋；メルカプトにより修飾したヒアルロン酸誘導体と、Ｃ２－２０アルキレンの両端にマレイミド（ＭＡＬ）やメタクリロイルなどの不飽和結合を有する架橋剤（例えば、１，４－ビス－マレイミドブタン（ＢＭＢ）、ジメタクリル酸エチレン（ＥＤＭＡ）など）とのマイケル付加反応による架橋；アルクロイルおよびメタクリロイルなどの不飽和結合により修飾したヒアルロン酸誘導体と各種重合開始剤（例えば、ペルオキソ二硫酸カリウム（ＫＰＳ）／Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９など）とのラジカル重合による架橋；ジアミン化合物（例えば、ＥＤＡ、２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチレンジアミン）など）共存下、縮合剤（例えば、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウムクロライド（ＤＭＴ-ＭＭ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）など）による架橋が挙げられる。上記の架橋形成は、ヒアルロン酸誘導体の分子内であっても、複数のヒアルロン酸誘導体の分子間であってもよい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体の製造方法が、ジアミンをグルクロン酸部分のカルボキシと縮合させる工程を含み、ジアミンの一部、例えば、１０％のみが薬物と結合することにより、利用されることなく残存したアミノを当該ヒアルロン酸誘導体が含む場合、例えば無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸および無水アジピン酸などのジカルボン酸無水物などで処理するか、マレイン酸、グルタル酸およびアジピン酸などのジカルボン酸を縮合剤共存下で反応させることで、末端の官能基をカルボキシに戻して、残存したアミノが有していたカチオン性を消失させたり、トータル電荷をアニオン性にすることもできる。また、無水酢酸および無水安息香酸などのカルボン酸無水物で処理するか、酢酸および安息香酸などのカルボン酸を縮合剤共存下で反応させることで、末端の官能基をアミドに変換して、残存したアミノ基が有していたカチオン性を消失させたり、トータル電荷をノニオン性にすることもできる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルが有する化学架橋構造は生体内で分解する構造を含んでいてもよい。特に限定されないが、例えば架橋反応に供する基として、エステル結合およびメタクリロイルを有する基を用いてもよい。また、架橋剤として、Ｓｕｌｆｏ－ＥＧＳやＥＤＭＡなど、エステル結合を有する化合物、または生体内の酵素によって分解されるペプチドスペーサーを有する化合物を用いてもよい。また、メルカプトの酸化によって形成するジスルフィド結合によって架橋したゲルは、ジスルフィド交換反応や還元反応によって、生体で分解される。分解性の化学架橋構造を有することで、本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルの生体内での分解速度を制御することができ、これによって薬物の放出速度も制御することが可能である。
　本発明のヒアルロン酸誘導体は医薬組成物の担体として使用することができる。本発明の１つの側面において、式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）、あるいは式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含むヒアルロン酸誘導体を、架橋剤を用いて架橋し、ゲル化して、薬物（低分子化合物、タンパク質、ペプチド、または核酸）を封入するための担体として使用することができる。薬物の例としては、以下のものを挙げることができる。
　低分子化合物の例としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤等）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β－ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤等）などを挙げることができる。
　タンパク質、ペプチドの例としては、例えば、貧血治療薬、臓器保護薬であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）、好中球減少症治療薬であるグラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターフェロン－α、β、γ、（ＩＮＦ－α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ－３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子－１（ＩＧＦ－１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン－１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ－ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、各種酵素補充療法薬、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体、およびこれらを化学的に修飾したもの等を挙げることができる。
　核酸の例としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、デコイ、リボザイム、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、およびこれらを化学的に修飾したもの等を挙げることができる。
　薬物としては、タンパク質、ペプチドおよび核酸が好ましく、これらの薬物を封入することで、タンパク質、ペプチドおよび核酸を含有する、本発明の組成物を得ることができる。
　本発明の別の側面において、式（Ｉ）で表される二糖単位を含むヒアルロン酸誘導体に、上記薬物の１以上が結合した、ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体が提供される。この側面の１つの態様において、ヒアルロン酸誘導体として式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）、あるいは式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含むヒアルロン酸誘導体を用いることができる。例えば、式（ＩＩＩ）の基－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄに含まれるヒドロキシ、アミノ、メルカプトまたは反応性の炭素－炭素二重結合（メタクリロイル、アクリロイルなど）と薬物を結合させることにより、上記のヒアルロン酸誘導体－薬物結合体を調製することができる。基－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄの一部または全部は、－ＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯ－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄとなって、式（Ｉ）中に存在してもよい。
　なお、基－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄと薬物との間に、更に、式－Ｇ１－Ｇ２－Ｇ３－Ｊ－＊＊＊
（式中、＊＊＊は、薬物との結合部位を表し、
　Ｇ１は、直接結合、－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＲｓ－および－Ｓ－から選択され、
　Ｇ２は、－（ＣＨ２）ｉ－および－（ＣＨ２）ｑ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｋ－から選択され、
　Ｇ３は、直接結合、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｔ－（ＣＨ２）ｒ－および－ＮＲｕ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｍ－から選択され、
　Ｊは、以下の式で表される基を表し、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 　Ｒｓ、ＲｔおよびＲｕは、独立して、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され、ｉは、１～１０から選択される整数であり、ｑは、２～１０から選択される整数であり、ｋは、１～１００から選択される整数であり、ｒおよびｍは、独立して、１～１０から選択される整数である）
で表されるスペーサーが挿入されていてもよい。
　式－Ｇ１－Ｇ２－Ｇ３－Ｊ－＊＊＊の具体例としては、例えば、以下の式が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　本発明のヒアルロン酸誘導体の主鎖の末端に存在するグルクロン酸４位およびアセチルグルコサミン１位のヒドロキシは、別の基に変換されていてもよく、例えば、Ｃ１－６アルコキシ、ホルミルオキシおよびＣ１－６アルキルカルボニルオキシなどであってもよい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体のゲル中に、薬物を封入して、あるいは、本発明のヒアルロン酸誘導体－薬物結合体は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む医薬組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
　本発明により、従来の徐放性製剤では得られない、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物といった薬物を長期間徐放でき、かつ適切な生分解性を有する安全性の高い徐放性製剤および医薬組成物を提供することが可能である。また、薬物がエンドサイトーシスを経て細胞内に取り込まれる経路において、本発明のヒアルロン酸誘導体はエンドソームから細胞質内への薬物の放出を促進する作用を有するため、薬物が細胞質内に効率的に取り込まれる医薬製剤および医薬組成物を提供することも可能である。
　以下、本発明の好適な具体的態様を実施例として説明する。
　以下に記載中のＨＡユニットとは、ヒアルロン酸中のＮ－アセチルグルコサミン－グルクロン酸の繰り返し単位（１ユニット）を意味する。ＮＭＲ測定は、核磁気共鳴装置（ＪＮＭ－ＥＣＡ５００　日本電子株式会社製）を用いて測定した。ＮＭＲの測定条件を以下に示す。
　１Ｈ－ＮＭＲ測定条件
　Ｄａｔａ　ｐｏｉｎｔ：１６３８４
　Ｓｐｅｃｔｒａｌ　ｗｉｄｔｈ（Ｘ　ｓｗｅｅｐ）：１５ｐｐｍ
　Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ（Ｘ　ａｃｑ　ｔｉｍｅ）：１．７４９ｓ
　Ｐｕｌｓｅ　ｄｅｌａｙ（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｄｅｌａｙ）：３０ｓ
　Ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ（Ｓｃａｎｓ）：６４
　〔実施例１〕ヒアルロン酸誘導体の合成
　（実施例１－１）カチオン交換樹脂のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩化
　ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ－８－４００（シグマ－アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０重量％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ－ＯＨ）（シグマ－アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量を加え、３０分間攪拌した。余剰のＴＢＡ－ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄を繰り返し、最後に０．４５μｍのフィルターを用いて濾過することによりＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
　（実施例１－２）ＨＡのＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）の調製
　分子量２５ｋＤａおよび９９ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ、資生堂株式会社製）をそれぞれ１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。実施例１－１で得たＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ＨＡ－ＴＢＡを白色固体として得た。
　代表例として９９ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とする生成物のＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１に示す。ＨＡのグルコサミンのアセチル由来のシグナル（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＴＢＡの４つのエチレン由来のシグナル（Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）４、１．４、１．７ｐｐｍ；１６Ｈ）の積分値より、ＨＡユニットに対するＴＢＡの量比を算出し、この比からＨＡ－ＴＢＡのユニット平均分子量を算出した。例えば、９９ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とするＨＡ－ＴＢＡのユニット平均分子量は７５２．６であった。
　（実施例１－３）ＨＡのフルオロセイン（ＦＬ）ラベル体のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＦＬ／ＴＢＡ）の合成
　実施例１－２で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、５－（アミノメチル）フルオロセインの塩酸塩（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＨＡユニットに対して０．０５倍モル等量添加した。次に、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ、国産化学株式会社製）をＨＡユニットに対して０．２倍モル等量を添加し、室温で６時間以上撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）した。得られた透析液に、実施例１－１でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニットに対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、目的物（ＨＡ－ＦＬ／ＴＢＡ）を黄色固体として得た。
　測定溶媒としてＤ２Ｏを用いた生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＴＢＡの４つのメチル（（Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）４、１．０ｐｐｍ；１２Ｈ）の積分値より、ＨＡユニットに対するＴＢＡの量比を算出し、この比からＨＡ－ＴＢＡのユニット平均分子量を算出し、グルコサミンのアセチル由来のピークの積分値と、内部標準として用いた３－（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム－ｄ４（ＴＳＰ－ｄ４）のメチル由来のピーク（－Ｓｉ（ＣＨ３）３，０．０ｐｐｍ；９Ｈ）の積分値から重量あたりのＨＡユニット含量を定量した。また、生成物を０．０５ｍｇ／ｍＬで５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その４９１ｎｍにおける吸光度から重量あたりのＦＬ含量を定量し、ＨＡユニットにおけるＦＬによる修飾率を算出した。ＦＬによる修飾率は各ロットで３～６％であった。
　（実施例１－４）ＨＡ－ＴＢＡもしくはＨＡ－ＦＬ／ＴＢＡからのＨＡ誘導体の合成
　（実施例１－４－１）Ｌ－アラニン（Ａｌａ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ａｌａ／ＦＬ）の合成
　実施例１－２で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）をＨＡユニットに対して３倍モル等量と、５－（アミノメチル）フルオロセインの塩酸塩を０．１５倍モル等量添加した。ＤＭＴ－ＭＭをＨＡユニットに対して６倍モル等量を添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）した。得られた透析液に２Ｎ　ＮａＯＨを添加しｐＨ１２．５以上として、１時間攪拌してエチルエステルを加水分解し、カルボキシの脱保護を行った。その後、２Ｎ　ＨＣｌを用いて中和を行い、さらに透析を行った後、凍結乾燥してＨＡ－Ａｌａ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アラニン中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．４ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるアラニンによる修飾率を算出した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　（実施例１－４－２）Ｌ－セリン（Ｓｅｒ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｓｅｒ／ＦＬ）の合成　
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－セリンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｓｅｒ／ＦＬを黄色固体として得た。また、カルボキシを脱保護する前の透析溶液の一部を採り凍結乾燥して修飾率算出用サンプルとした（ＨＡ－Ｓｅｒ－ＯＥｔ／ＦＬ）。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した修飾率算出用サンプルの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、セリンのエチルエステル中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるセリンによる修飾率を算出した（表１）。また、脱保護したサンプルを実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－２に示す。
　（実施例１－４－３）Ｌ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｇｌｕ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－グルタミン酸ジエチルエステル塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｇｌｕ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グルタミン酸のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、２．３ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるグルタミン酸による修飾率を算出した（表１）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、グルタミン酸の別のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、２．１ｐｐｍ；２Ｈ）が重なっているため、１．７～２．２ｐｐｍのピークの積分値から２．３ｐｐｍのピークの積分値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。
　（実施例１－４－４）グリシン（Ｇｌｙ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＧｌｙおよびＨＡ－Ｇｌｙ／ＦＬ）の合成
　実施例１－２で合成したＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）もしくは、実施例１－３で合成したＨＡ－ＦＬ／ＴＢＡを超純水／ＤＭＳＯ混液（１：３）溶液（約４ｍｇ／ｍＬ）を出発原料とした。グリシンエチルエステル塩酸塩（和光純薬株式会社製）をＨＡユニットに対して５倍モル等量添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡユニットに対して３倍モル等量を添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）した。得られた透析液に２Ｎ　ＮａＯＨを添加しｐＨ１２．５以上として、１時間攪拌してエステルを加水分解し、カルボキシの脱保護を行った。その後、２Ｎ　ＨＣｌを用いて中和を行い、さらに透析を行った後、凍結乾燥して、ＨＡ－Ｇｌｙを白色個体、ＨＡ－Ｇｌｙ／ＦＬを黄色固体として得た。また、カルボキシを脱保護する前の透析溶液の一部を採り凍結乾燥して修飾率算出用サンプルとした（ＨＡ－Ｇｌｙ－ＯＥｔ／ＦＬ）。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した修飾率算出用サンプルの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グリシンのエチルエステル中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるグリシンによる修飾率を算出した（表１）。また、脱保護したサンプルを実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－４に示す。　
　（実施例１－４－５）Ｌ－バリン（Ｖａｌ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＶａｌおよびＨＡ－Ｖａｌ／ＦＬ）の合成
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－バリンエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｖａｌを白色個体、ＨＡ－Ｖａｌ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－５に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、バリン中の２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるバリンによる修飾率を算出した（表１）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、バリンの３位の水素のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、２．１ｐｐｍ；１Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から０．９ｐｐｍのピークの積分値に１／６を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。
　（実施例１－４－６）Ｌ－ロイシン（Ｌｅｕ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＬｅｕおよびＨＡ－Ｌｅｕ／ＦＬ）の合成
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－ロイシンエチルエステル塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｌｅｕを白色個体、ＨＡ－Ｌｅｕ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－６に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ロイシン中の２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるロイシンによる修飾率を算出した（表１）。
　（実施例１－４－７）Ｌ－イソロイシン（Ｉｌｅ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＩｌｅおよびＨＡ－Ｉｌｅ／ＦＬ）の合成
　溶媒として無水ＤＭＳＯを用いたことと、グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－イソロイシンメチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｉｌｅを白色個体、ＨＡ－Ｉｌｅ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－７に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、イソロイシン中の２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるイソロイシンによる修飾率を算出した（表１）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、イソロイシンの３位の水素のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、１．９ｐｐｍ；１Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から０．９ｐｐｍのピークの積分値に１／６を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。
　（実施例１－４－８）Ｌ－スレオニン（Ｔｈｒ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＴｈｒおよびＨＡ－Ｔｈｒ／ＦＬ）の合成
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－スレオニンメチルエステルの塩酸塩（Ｂａｃｈｅｍ社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｔｈｒを白色個体、ＨＡ－Ｔｈｒ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－８に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、スレオニン中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．２ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるスレオニンによる修飾率を算出した（表１）。
　（実施例１－４－９）Ｌ－アスパラギン酸（Ａｓｐ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡｓｐおよびＨＡ－Ａｓｐ／ＦＬ）の合成
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－アスパラギン酸ジエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ａｓｐを白色固体、ＨＡ－Ａｓｐ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－９に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アスパラギン酸中のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＯＯＨ、２．７、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるアスパラギン酸による修飾率を算出した（表１）。
　（実施例１－４－１０）シス－２－アミノ－１－シクロヘキシルカルボン酸（ｃＡＣＨＣＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ｃＡＣＨＣＡ／ＦＬ）の合成
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにｃＡＣＨＣＡエチルエステルの塩酸塩（Ａｃｒｏｓ社製）を用い、カルボキシの脱保護を５Ｎ　ＮａＯＨを用いてｐＨ１３．２で行ったこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－ｃＡＣＨＣＡ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１０に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ｃＡＣＨＣＡ中のシクロヘキサン環由来のピーク（－ＣＨＣＯＯ－、２．５ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるｃＡＣＨＣＡによる修飾率を算出した（表１）。
　（実施例１－４－１１）トランス－２－アミノ－１－シクロヘキシルカルボン酸エチルエステル（ｔＡＣＨＣＡ－ＯＥｔ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ｔＡＣＨＣＡ－ＯＥｔ／ＦＬ）の合成　
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにｔＡＣＨＣＡ－ＯＥｔの塩酸塩（Ａｃｒｏｓ社製）を用い、カルボキシの脱保護を行わなかったこと以外は実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－ｔＡＣＨＣＡ－ＯＥｔ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ｔＡＣＨＣＡ－ＯＥｔ中のシクロヘキサン環のカルボニルに隣接する炭素上のプロトン由来のピーク（－ＣＨ（ＣＯＯＥｔ）－、２．２ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるｔＡＣＨＣＡ－ＯＥｔによる修飾率を算出した（表１）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、シクロヘキシルおよび保護基のメチルのピーク（１１Ｈ）が重なっているため、１．２～２．１ｐｐｍのピークの積分値から２．２ｐｐｍのピークの積分値に１１を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。
　（実施例１－４－１２）２－アミノイソブタン酸（Ａｉｂ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ａｉｂ／ＦＬ）の合成
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにＡｉｂエチルエステルの塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用い、カルボキシの脱保護を５Ｎ　ＮａＯＨを用いてｐＨ１３．２で行ったこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ａｉｂ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、Ａｉｂ中のジメチル由来のピーク（－Ｃ（ＣＨ３）２－、１．５ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＡｉｂによる修飾率を算出した（表１）。
　（実施例１－４－１３）１－アミノ－１－シクロブタン酸エチルエステル（ＡＣＢｕＣＡ－ＯＥｔ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡＣＢｕＣＡ－ＯＥｔ／ＦＬ）の合成
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにＡＣＢｕＣＡ－ＯＥｔの塩酸塩（シグマーアルドリッチ社製）を用い、カルボキシの脱保護を行わなかったこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－ＡＣＢｕＣＡ－ＯＥｔ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＡＣＢｕＣＡ－ＯＥｔ中のエステル保護メチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＡＣＢｕＣＡ－ＯＥｔによる修飾率を算出した（表１）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、ＡＣＢｕＣＡ－ＯＥｔに含まれるシクロブタンのピーク（６Ｈ）が重なっているため、１．８～２．８ｐｐｍのピークの積分値から１．３ｐｐｍのピークの積分値に２を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。
　（実施例１－４－１４）Ｌ－アスパラギン（Ａｓｎ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡｓｎおよびＨＡ－Ａｓｎ／Ｒｈ）の合成
　ＨＡ－Ａｓｎは以下のように合成した。実施例１－２で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）に、Ｌ－アスパラギンメチルエステル塩酸塩（Ｂａｃｈｅｍ社製）をＨＡユニットに対して５倍モル等量添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡユニットに対して３～６倍モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液はジエチルエーテルにより再沈殿を行い、沈殿を超純水に溶解させた後、５Ｎ　ＮａＯＨ溶液を添加してｐＨ１２．５以上として、１時間攪拌してエステルを加水分解し、カルボキシの脱保護を行った。その後、５Ｎ　ＨＣｌ溶液を用いて中和を行い、さらに０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、蒸留水、超純水の順で透析精製し、凍結乾燥して、ＨＡ－Ａｓｎを白色固体として得た。　ＨＡ－Ａｓｎ／Ｒｈは以下のように合成した。実施例１－２で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）に、１－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル－アミノ）－３、６－ジオキサ－８－オクタンアミン塩酸塩（Ｆｍｏｃ－ＥＤＯＢＥＡ、Ｉｒｉｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＧｍｂＨ社製）をＨＡユニットに対して０．１倍モル等量添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡユニットに対して０．２倍モル等量を添加し、室温で６時間撹拌した。続いて、Ｌ－アスパラギンメチルエステル塩酸塩およびＤＭＴ－ＭＭを順に、ＨＡユニットに対してそれぞれ５倍モル等量、３～６倍モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、ＤＭＳＯに対して透析精製を行った。得られた透析液にピペリジン（和光純薬株式会社製）を２０％の濃度になるよう添加し2時間攪拌してＦｍｏｃ基の除去を行った。その後、ＤＭＳＯ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、蒸留水の順で透析精製した。得られた透析液に５Ｎ　ＮａＯＨ溶液を添加しｐＨ１２．５以上として、１時間攪拌してエステルを加水分解し、カルボキシの脱保護を行った。その後、５Ｎ　ＨＣｌ溶液を用いて中和を行い、さらに蒸留水、超純水の順で透析精製し、凍結乾燥して、ＨＡ－Ａｓｎ／ＥＤＯＢＥＡを得た。
　ＨＡ－Ａｓｎ／ＥＤＯＢＥＡの水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７．４）で２倍希釈し、ＮＨＳ－ローダミン（５／６－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．製）をＨＡユニットに対して０．０５倍モル等量添加し、室温で一晩攪拌した。続いて、ＨＡユニットに対して４０倍モル等量の無水酢酸（和光純薬株式会社製）を添加し、１時間攪拌することにより、余分なＥＤＯＢＥＡの末端アミノをアセチル化した。反応溶液に５Ｎ　ＮａＯＨ溶液を添加しｐＨ１２．５以上として、１時間攪拌した後、５Ｎ　ＨＣｌ溶液を用いて中和を行い、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、蒸留水、超純水の順で透析精製し、凍結乾燥して、ＨＡ－Ａｓｎ／Ｒｈを赤色固体として得た。
　透析膜は全てスペクトラポア４（分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）を用いた。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アスパラギンのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるアスパラギンによる修飾率を算出した（表１）。
　（実施例１－４－１５）Ｌ－アラニンアミド（Ａｌａ－ＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ａｌａ－ＮＨ２およびＨＡ－Ａｌａ－ＮＨ２／Ｒｈ）の合成
　Ｌ－アスパラギンメチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－アラニンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと、再沈殿およびカルボキシの脱保護に関わる操作を行わなかったこと以外は、実施例１－４－１４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ａｌａ－ＮＨ２を白色固体、ＨＡ－Ａｌａ－ＮＨ２／Ｒｈを赤色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１５に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アラニンアミドのメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．５ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるアラニンアミドによる修飾率を算出した（表１）。
　（実施例１－４－１６）Ｌ－バリンアミド（Ｖａｌ－ＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｖａｌ－ＮＨ２およびＨＡ－Ｖａｌ－ＮＨ２／Ｒｈ）の合成
　Ｌ－アラニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－バリンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１５と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｖａｌ－ＮＨ２を白色固体、ＨＡ－Ｖａｌ－ＮＨ２／Ｒｈを赤色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１６に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、バリンアミドの２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、１．０ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるバリンアミドによる修飾率を算出した（表１）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、バリンアミドの３位の水素のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、２．１ｐｐｍ；１Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から１．０ｐｐｍのピークの積分値に１／６を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。
　（実施例１－４－１７）Ｌ－アスパラギンアミド（Ａｓｎ－ＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ａｓｎ－ＮＨ２およびＨＡ－Ａｓｎ－ＮＨ２／Ｒｈ）の合成
　Ｌ－アラニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－アスパラギンアミド塩酸塩（国産化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１５と同様の方法で行い、ＨＡ－Ａｓｎ－ＮＨ２を白色固体、ＨＡ－Ａｓｎ－ＮＨ２／Ｒｈを赤色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１７に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アスパラギンアミドのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるアスパラギンアミドによる修飾率を算出した（表１）。
　（実施例１－４－１８）メチルアミン（Ｍｅ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＭｅおよびＨＡ－Ｍｅ／ＦＬ）の合成
　ＨＡ－Ｍｅは以下のように合成した。実施例１－２で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、ＨＡユニット／ＢＯＰ（和光純薬株式会社製）／メチルアミン（４０％メタノール溶液、東京化成工業株式会社製）＝１／３／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の等量比でメチルアミン、ＢＯＰの順で添加し、室温で一晩攪拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）した後、凍結乾燥してＨＡ－Ｍｅを白色個体として得た。
　ＨＡ－Ｍｅ／ＦＬは以下のように合成した。実施例１－２で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、ＨＡユニット／ＢＯＰ／メチルアミン／エチレンジアミン（シグマ－アルドリッチ社製）＝１／２．５／４．５／０．２５（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の等量比でメチルアミン、エチレンジアミン、ＢＯＰの順で添加し、室温で一晩攪拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）した後、凍結乾燥して中間体を白色固体として得た。
　次に、得られた中間体を超純水で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた後、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で２倍希釈して５ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液にＨＡユニットに対して０．１倍モル等量のＮＨＳ－フルオレセインをＤＭＳＯ溶液として加えて室温で１時間攪拌した後、ＨＡユニットに対して４０倍モル等量の無水酢酸（和光純薬株式会社製）を添加してさらに１時間攪拌することにより、余分なエチレンジアミンの末端アミノをアセチル化した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で遮光下で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）を行った後、凍結乾燥してＨＡ－Ｍｅ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した各生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１８に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、メチル由来のピーク（－ＣＨ３、２．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるメチルによる修飾率を算出した（表１）。
　（実施例１－４－１９）プロピルアミン（Ｐｒ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＰｒおよびＨＡ－Ｐｒ／ＦＬ）の合成
　ＨＡ－Ｐｒは以下のように合成した。実施例１－２で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、ＨＡユニット／ＢＯＰ／プロピルアミン（シグマ－アルドリッチ社製）＝１／３／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の等量比でプロピルアミン、ＢＯＰの順で添加し、室温で一晩攪拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）した後、凍結乾燥してＨＡ－Ｐｒを白色個体として得た。
　ＨＡ－Ｐｒ／ＦＬは以下のように合成した。実施例１－２で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、ＨＡユニット／ＢＯＰ／プロピルアミン／エチレンジアミン＝１／２．５／４５／２．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の等量比でプロピルアミン、エチレンジアミン、ＢＯＰの順で添加し、室温で一晩攪拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）した後、凍結乾燥して中間体を白色固体として得た。
　次に、得られた中間体を超純水で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた後、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で２倍希釈して５ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液にＨＡユニットに対して０．０６倍モル等量のＮＨＳ－フルオレセインをＤＭＳＯ溶液として加えて室温で１時間攪拌した後、ＨＡユニットに対して４０倍モル等量の無水酢酸（和光純薬株式会社製）を添加してさらに１時間攪拌することにより、余分なエチレンジアミンの末端アミノをアセチル化した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で遮光下で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）を行った後、凍結乾燥してＨＡ－Ｐｒ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した各生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１９に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、プロピルに属するメチル由来のピーク（－ＣＨ３、０．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるメチルによる修飾率を算出した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　（実施例１－５）ＨＡ－ＴＢＡ（２５ｋＤａまたは９９ｋＤａ）からのＨＡ誘導体の合成
　（実施例１－５－１）１－アミノメチル－１－シクロヘキサン酸（ＡＭＣＨＣＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡＭＣＨＣＡ）の合成
　実施例１－２で調製したＨＡ－Ｎａ（２５ｋＤａおよび９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した後、１－アミノメチル－１－シクロヘキサン酸メチルエステル塩酸塩（ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、Ｂｉｏｎｅｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）をＨＡ－ＴＢＡユニットに対して表２に示す比率で各溶液に添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡ－ＴＢＡユニットに対して表２に示す比率で加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液は大過剰の０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液に対して透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）、得られた透析液を５Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨを１３．２にして１時間室温で攪拌し、さらに５Ｎ　ＨＣｌを加えて中和を行った。次に蒸留水、超純水の順で透析精製し（スペクトラポア４、ＭＷＣＯ：１２ｋ～１４ｋＤａ）、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－ＡＭＣＨＣＡ）を白色固体として得た。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＡＭＣＨＣＡに属するシクロヘキサン由来のピーク（Ｃ６Ｈ１０、１．２～１．９ｐｐｍ；１０Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＡＭＣＨＣＡによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－２）シス－４－アミノシクロヘキサン酸（ｐｃＡＣＨＣＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ｐｃＡＣＨＣＡ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりにシス－４－アミノ－１－シクロヘキシルカルボン酸メチルエステル塩酸塩（ｐｃＡＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、Ｉｒｉｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－ｐｃＡＣＨＣＡ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／ｐｃＡＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ｐｃＡＣＨＣＡに属するシクロヘキサンに含まれる２つのエチレン由来のピーク（１．５～１．８ｐｐｍ；８Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるｐｃＡＣＨＣＡによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－３）Ｌ－２－ナフチルアラニン（Ｎａｌ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｎａｌ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりにＬ－２－ナフチルアラニンベンジルエステルパラトシレート塩（Ｎａｌ－Ｏｂｚｌ・ｐ－Ｔｓ、Ｂａｃｈｅｍ製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－Ｎａｌ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／Ｎａｌ－Ｏｂｚｌ・ｐ－Ｔｓ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、Ｎａｌに属するナフチル由来のピーク（－Ｃ１０Ｈ７、７．４～７．９ｐｐｍ；７Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＮａｌによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－４）２－アミノ－４－フェニルブタン酸（ＡＰＢＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡＰＢＡ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりに２－アミノ－４－フェニルブタン酸エチルエステル塩酸塩（ＡＰＢＡ－ＯＥｔ・ＨＣｌ、シグマ－アルドリッチ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－ＡＰＢＡ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／ＡＰＢＡ－ＯＥｔ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＡＰＢＡに属するフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ５、７．２～７．４ｐｐｍ；５Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＡＰＢＡによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－５）シクロヘキシル－Ｌ－アラニン（Ｃｈａ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃｈａ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりにシクロヘキシル－Ｌ－アラニンメチルエステル塩酸塩（Ｃｈａ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－Ｃｈａ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／Ｃｈａ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－５に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、Ｃｈａに属するシクロヘキシルメチル由来のピーク（－ＣＨ２Ｃ６Ｈ１１、０．９～１．８ｐｐｍ；１３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＣｈａによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－６）４－アミノメチル安息香酸（ＡＭＢＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡＭＢＡ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりに４－アミノメチル安息香酸メチルエステル塩酸塩（ＡＭＢＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、シグマ－アルドリッチ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－ＡＭＢＡ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。このＨＡ－ＡＭＢＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－６に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＡＭＢＡに属するフェニル由来のピーク（－ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＯＯＨ、７．４、７．９ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＡＭＢＡによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－７）３－アミノメチル安息香酸（３ＡＭＢＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－３ＡＭＢＡ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりに３－アミノメチル安息香酸メチルエステル塩酸塩（ＡＭＢＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－３ＡＭＢＡ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／３ＡＭＢＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－７に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、３ＡＭＢＡに属するフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ４ＣＯＯＨ、７．４～７．９ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおける３ＡＭＢＡによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－８）３－アミノ－２－フェニルプロピオン酸（ＡＰｈＰＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡＰｈＰＡ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりに３－アミノ－２－フェニルプロピオン酸エチルエステル塩酸塩（ＡＰｈＰＡ－ＯＥｔ・ＨＣｌ、Ｔｙｇｅｒ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－ＡＰｈＰＡ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／ＡＰｈＰＡ－ＯＥｔ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－８に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＡＰｈＰＡに属するフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ５、７．４ｐｐｍ；５Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＡＰｈＰＡによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－９）４－（２－アミノエチル）安息香酸（ＡＥＢＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡＥＢＡ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりに４－（２－アミノエチル）安息香酸メチルエステル塩酸塩（ＡＥＢＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、Ｅｎａｍｉｎｅ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－ＡＥＢＡ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／ＡＰｈＰＡ－ＯＥｔ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－９に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＡＥＢＡに属するフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ４ＣＯＯＨ、７．３、７．９ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＡＥＢＡによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－１０）４－アミノメチル－３－クロロ安息香酸（ＡＭＣｌＢＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡＭＣｌＢＡ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりに４－アミノメチル－３－クロロ安息香酸メチルエステル塩酸塩（ＡＭＣｌＢＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、Ａｎｉｃｈｅｍ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－ＡＭＣｌＢＡ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／ＡＭＣｌＢＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－１０に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＡＭＣｌＢＡに属するフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ３（Ｃｌ）ＣＯＯＨ、７．５、７．８、７．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＡＭＣｌＢＡによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－１１）５－アミノメチルサリチル酸（ＡＭＳＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡＭＳＡ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりに５－アミノメチルサリチル酸メチルエステル塩酸塩（ＡＭＳＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、Ｏａｋｗｏｏｄ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－ＡＭＳＡ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／ＡＭＳＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－１１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＡＭＳＡに属するフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ３（ＯＨ）ＣＯＯＨ、６．９～７．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＡＭＳＡによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－１２）トランス－４－アミノメチルシクロヘキサン酸（４ＡＭＣＨＣＡ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－４ＡＭＣＨＣＡ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりにトランス－４－アミノメチルシクロヘキサン酸メチルエステル塩酸塩（４ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、ＡＫ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－４ＡＭＣＨＣＡ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　ＨＡ分子量が２５ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／４ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－１２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、４ＡＭＣＨＣＡに属するシクロヘキサン由来のピーク（－ＣＨ２ ＣＨ（ＣＨ ２ ＣＨ ２ ） ２ ＣＨ－、１．２～１．９ｐｐｍ；９Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおける４ＡＭＣＨＣＡによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－１３）Ｌ－シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃｈｇ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりにＬ－シクロヘキシルグリシンメチルエステル塩酸塩（Ｃｈｇ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、ＩＮＤＯＦＩＮＥ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－Ｃｈｇ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が２５ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／Ｃｈｇ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－１３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、Ｃｈｇに属するシクロヘキシル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ１１、１．０～１．８ｐｐｍ；１１Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＣｈｇによる修飾率を算出した（表２）。
　（実施例１－５－１４）（Ｒ）－アミノ－（４－ヒドロキシフェニル）酢酸（ｐＨＰｈｇ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ｐＨＰｈｇ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりに（Ｒ）－アミノ－（４－ヒドロキシフェニル）酢酸メチルエステル塩酸塩（ｐＨＰｈｇ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、シグマ－アルドリッチ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－ｐＨＰｈｇ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表２に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／ｐＨＰｈｇ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図４－１４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ｐＨＰｈｇに属するフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ４ＯＨ、６．９、７．３ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるｐＨＰｈｇによる修飾率を算出した（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　（比較例１－１）ＨＡ－ＴＢＡもしくはＨＡ－ＦＬ／ＴＢＡからのＦＬラベル化ＨＡ誘導体の合成
　（比較例１－１－１）ＨＡのＦＬラベル体（ＨＡ－ＦＬ）の合成
　実施例１－２で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、ＨＡユニット／ＢＯＰ（和光純薬株株式会社製）／２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＯＢＥＡ、シグマ－アルドリッチ社製）＝１／０．２／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の等量比でＥＤＯＢＥＡ、ＢＯＰの順で添加し、室温で一晩攪拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）した後、凍結乾燥して低修飾率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡを得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した低修飾率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＥＤＯＢＥＡ末端のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＮＨ２、３．２ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－３と同様にしてＨＡユニットにおけるＥＤＯＢＥＡによる修飾率を算出した（表３）。
　次に、得られた低修飾率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡを超純水で１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させた後、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で２倍希釈して５ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。この溶液にＨＡユニットに対して０．１倍モル等量のＮＨＳ－フルオレセイン（５／６－カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル、ＮＨＳ－ＦＬ、ＰＩＥＲＣＥ社製）をＤＭＳＯ溶液として加えて室温で１時間攪拌した後、ＨＡユニットに対して４０倍モル等量の無水コハク酸（和光純薬株式会社製）をＤＭＳＯ溶液として添加し、さらに１時間攪拌することにより、余分なＥＤＯＢＥＡの末端アミノをコハク酸処理した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で遮光下で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）を行った後、凍結乾燥してＨＡ－ＦＬ（低修飾率ＨＡ）を黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－１に示す。
　生成物を０．０５ｍｇ／ｍＬで５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その４９１ｎｍにおける吸光度から重量あたりのＦＬ含量を定量し、ＨＡユニットにおけるＦＬによる修飾率を算出した（表３）。
　（比較例１－１－２）ＥＤＯＢＥＡにより修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬ）の合成
　試薬の添加量比をＨＡユニット／ＢＯＰ／ＥＤＯＢＥＡ＝１／２．５／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）としたこと以外は比較例１－１－１と同様に行い、高修飾率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡを得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した高修飾率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－２に示す。なお測定溶液に際し、ＮａＯＤを０．００４６Ｎとなるように加え、アルカリ性となるようにした。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＥＤＯＢＥＡ末端のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＮＨ２、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－３と同様にしてＨＡユニットにおけるＥＤＯＢＥＡによる修飾率を算出した（表３）。
　次に、得られた高修飾率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡを超純水で１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させた後、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で２倍希釈して５ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。この溶液にＨＡユニットに対して０．０４倍モル等量のＮＨＳ－フルオレセインをＤＭＳＯ溶液として加えて室温で１時間攪拌した後、ＨＡユニットに対して４０倍モル等量の無水酢酸（和光純薬株式会社製）を添加してさらに１時間攪拌することにより、余分なＥＤＯＢＥＡの末端アミノをアセチル化した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で遮光下で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）を行った後、凍結乾燥してＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－２に示す。生成物のＨＡユニットにおけるＦＬによる修飾率は比較例１－１－１と同様の方法で求めた（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　（比較例１－１－３）Ｌ－フェニルアラニン（Ｐｈｅ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｐｈｅ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｐｈｅ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、フェニルアラニン中のフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ５、７．２～７．４ｐｐｍ；５Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるフェニルアラニンによる修飾率を算出した（表４）。
　（比較例１－１－４）Ｌ－チロシン（Ｔｙｒ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｔｙｒ／ＦＬ）の合成
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－チロシンエチルエステル塩酸塩（和光純薬株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｔｙｒ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、チロシン中のヒドロキシフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ４ＯＨ、６．８、７．２ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるチロシンによる修飾率を算出した（表４）。
　（比較例１－１－５）α－メチル－ＤＬ－フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＭｅＰｈｅ／ＦＬ）の合成
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにＭｅＰｈｅメチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業社製）を用い、カルボキシの脱保護を５Ｎ　ＮａＯＨを用いてｐＨ１３．２で行ったこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－ＭｅＰｈｅ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－５に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＭｅＰｈｅ中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．５ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＭｅＰｈｅによる修飾率を算出した（表４）。
　（比較例１－１－６）Ｌ－プロリンメチルエステル（Ｐｒｏ－ＯＭｅ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｐｒｏ－ＯＭｅ／ＦＬ）の合成
　グリシンエチルエステル塩酸塩の代わりにＰｒｏ－ＯＭｅの塩酸塩（シグマ－アルドリッチ社製）を用い、カルボキシの脱保護を行わなかったこと以外は、実施例１－４－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｐｒｏ－ＯＭｅ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－６に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、Ｐｒｏ－ＯＭｅ中のピロリジン環由来の１Ｈ分のピーク（－ＣＨＣＯＯ－、２．４ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＰｒｏ－ＯＭｅによる修飾率を算出した（表４）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、ピロリジン環の残りの水素のピーク（３Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から２．４ｐｐｍのピークの積分値に３を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。
　（比較例１－１－７）グリシンアミド（Ｇｌｙ－ＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｇｌｙ－ＮＨ２およびＨＡ－Ｇｌｙ－ＮＨ２／Ｒｈ）の合成
　Ｌ－アラニンアミド塩酸塩の代わりにグリシンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１５と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｇｌｙ－ＮＨ２を白色固体、ＨＡ－Ｇｌｙ－ＮＨ２／Ｒｈを赤色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－７に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グリシンアミドのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２－；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるグリシンアミドによる修飾率を算出した（表４）。なお、グリシンアミドのメチレン由来のピークには、グルクロン酸の２～５位のピーク（４Ｈ）、グルコサミンの２～６位のピーク（６Ｈ）およびＥＤＯＢＥＡ由来のピーク（１２Ｈ）が重なっているため、３．２～４．２ｐｐｍのピークの積分値から、２．０ｐｐｍのピークの積分値に１０／３を乗じた値および２．０ｐｐｍのピークの積分値に（ＥＤＯＢＥＡの導入率）×１２／３を乗じた値を差し引いた値をグリシンアミドのメチレン由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。ＥＤＯＢＥＡの導入率は比較例１－１－２と同様の方法で算出した。
　（比較例１－１－８）Ｌ－セリンアミド（Ｓｅｒ－ＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｓｅｒ－ＮＨ２およびＨＡ－Ｓｅｒ－ＮＨ２／Ｒｈ）の合成
　Ｌ－アラニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－セリンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１５と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｓｅｒ－ＮＨ２を白色固体、ＨＡ－Ｓｅｒ－ＮＨ２／Ｒｈを赤色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－８に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、セリンアミドのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２－；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるセリンアミドによる修飾率を算出した（表４）。なお、セリンアミドのメチレン由来のピークには、グルクロン酸の２～５位のピーク（４Ｈ）、グルコサミンの２～６位のピーク（６Ｈ）およびＥＤＯＢＥＡ由来のピーク（１２Ｈ）が重なっているため、比較例１－１－７と同様の方法でセリンアミドのメチレン由来のピークの積分値を算出した。
　（比較例１－１－９）Ｌ－ロイシンアミド（Ｌｅｕ－ＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｌｅｕ－ＮＨ２およびＨＡ－Ｌｅｕ－ＮＨ２／Ｒｈ）の合成
　Ｌ－アラニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－ロイシンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１５と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｌｅｕ－ＮＨ２を白色固体、ＨＡ－Ｌｅｕ－ＮＨ２／Ｒｈを赤色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－９に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ロイシンアミドの２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるロイシンアミドによる修飾率を算出した（表４）。
　（比較例１－１－１０）Ｌ－イソロイシンアミド（Ｉｌｅ－ＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｉｌｅ－ＮＨ２およびＨＡ－Ｉｌｅ－ＮＨ２／Ｒｈ）の合成
　Ｌ－アラニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－イソロイシンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１５と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｉｌｅ－ＮＨ２を白色固体、ＨＡ－Ｉｌｅ－ＮＨ２／Ｒｈを赤色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－１０に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、イソロイシンアミドの２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるイソロイシンアミドによる修飾率を算出した（表４）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、イソロイシンアミドの３位の水素のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、１．９ｐｐｍ；１Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から０．９ｐｐｍのピークの積分値に１／６を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。
　（比較例１－１－１１）Ｌ－スレオニンアミド（Ｔｈｒ－ＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｔｈｒ－ＮＨ２およびＨＡ－Ｔｈｒ－ＮＨ２／Ｒｈ）の合成
　Ｌ－アラニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－スレオニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１５と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｔｈｒ－ＮＨ２を白色固体、ＨＡ－Ｔｈｒ－ＮＨ２／Ｒｈを赤色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－１１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、スレオニンアミドのメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．２ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるスレオニンアミドによる修飾率を算出した（表４）。
　（比較例１－１－１２）Ｌ－グルタミンアミド（Ｇｌｎ－ＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｇｌｎ－ＮＨ２およびＨＡ－Ｇｌｎ－ＮＨ２／Ｒｈ）の合成
　Ｌ－アラニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－グルタミンアミド塩酸塩（国産化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４－１５と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｇｌｎ－ＮＨ２を白色固体、ＨＡ－Ｇｌｎ－ＮＨ２／Ｒｈを赤色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－１２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グルタミンアミドのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．４ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるグルタミンアミドによる修飾率を算出した（表４）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、グルタミンアミドのメチレンのピーク（－ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．１ｐｐｍ；２Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から２．４ｐｐｍのピークの積分値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
（比較例１－２）ＨＡ－ＴＢＡからのＨＡ誘導体の合成
（比較例１－２－１）Ｌ－ノルロイシン（Ｎｌｅ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｎｌｅ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりにＬ－ノルロイシンメチルエステル塩酸塩（Ｎｌｅ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、Ｂａｃｈｅｍ社製）を用いたこと以外は実施例１－５－１と同様の方法で調製を行い、目的物（ＨＡ－Ｎｌｅ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表５に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／Ｃｈａ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図６－１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、Ｎｌｅ中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、０．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＮｌｅによる修飾率を算出した（表５）。
　（比較例１－２－２）Ｌ－ターシャリーロイシン（ｔＬｅｕ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ｔＬｅｕ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりにＬ－ターシャリーロイシンメチルエステル塩酸塩（ｔＬｅｕ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、Ｆｌｕｋａ社製）を用いたこと以外は、実施例１－５－１と同様の方法で行い、目的物（ＨＡ－ｔＬｅｕ）を白色固体として得た。試薬の添加量は表５に示す。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／Ｃｈａ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図６－２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ｔＬｅｕ中の３つのメチル由来のピーク（－Ｃ（ＣＨ３）３、１．０ｐｐｍ；９Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるｔＬｅｕによる修飾率を算出した（表５）。
　（比較例１－２－３）パラフルオロフェニルアラニン（ｐＦ－Ｐｈｅ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ｐＦＰｈｅ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりにパラフルオロフェニルアラニンエチルエステル塩酸塩（ｐＦＰｈｅ－ＯＥｔ・ＨＣｌ、Ｂａｃｈｅｍ社製）を用い、カルボキシの脱保護を５Ｎ　ＮａＯＨを用いてｐＨ１３．２で行ったこと以外は、実施例１－５－１と同様の方法で行い、目的物（ＨＡ－ｐＦＰｈｅ）を白色固体として得た。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／Ｐｈｅ－ＯＥｔ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図６－３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ｐＦＰｈｅ中の芳香環由来のピーク（－Ｃ６Ｈ４Ｆ、７．１、７．３ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるｐＦＰｈｅによる修飾率を算出した（表５）。
　（比較例１－２－４）（ｓ）－（＋）－２－フェニルグリシン（Ｐｈｇ）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｐｈｇ）の合成
　ＡＭＣＨＣＡ－ＯＭｅ・ＨＣｌの代わりに（ｓ）－（＋）－２－フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩（Ｐｈｇ－ＯＭｅ・ＨＣｌ、シグマ－アルドリッチ社製）を用いたこと以外は、実施例１－５－１と同様の方法で行い、目的物（ＨＡ－Ｐｈｇ）を白色固体として得た。
　代表例としてＨＡ分子量が９９ｋＤａ、試薬の添加比率をＨＡ－ＴＢＡユニット／ＤＭＴ－ＭＭ／Ｐｈｇ－ＯＭｅ・ＨＣｌ＝１／３／５としたときのＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図６－４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、Ｐｈｇ中の芳香環由来のピーク（－Ｃ６Ｈ５、７．３～７．５ｐｐｍ；５Ｈ）の積分値より、実施例１－４－１と同様にしてＨＡユニットにおけるＰｈｇによる修飾率を算出した（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　（比較例１－３）ＦＬラベル化ＰＥＧ誘導体（ＰＥＧ－ＦＬ）の合成
　ＰＥＧ（ＭＥＰＡ－３０Ｔ、日油株式会社製）を超純水で１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させた後、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で２倍希釈して５ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。この溶液にＰＥＧ末端に対して１５倍モル等量のＮＨＳ－フルオレセイン（ＮＨＳ－ＦＬ、ＰＩＥＲＣＥ社製）をＤＭＳＯ溶液として加えて室温で終夜攪拌した。反応溶液は、ジエチルエーテルにより再沈殿を行って、沈殿をろ過により回収し、再度超純水に溶解させた後に大過剰の超純水で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）し、凍結乾燥して目的物質（ＰＥＧ－ＦＬ）を黄色固体として得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図７に示す。ＰＥＧの片末端由来のピーク（－ＯＣＨ３、３．４ｐｐｍ、３Ｈ）および、フルオレセインに由来するピーク（７～８ｐｐｍ）が認められたことから、ＰＥＧ末端がＦＬにより修飾されていることを確認した。
　〔実施例２〕ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの生分解性の確認
　一定条件でのインキュベート後のＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ　ＳＤ（Ｈｙａｓｅ、生化学工業株式会社製）に対する耐性を確認した。
　実施例１－４および比較例１－１で得られた生成物の一部を測定した。生成物の５ｍｇ／ｍＬもしくは２０ｍｇ／ｍＬの水溶液を測定対象試料とし、ＨＡ－Ｎａの５ｍｇ／ｍＬ水溶液を標準試料とした。試料をＰＢＳ、もしくはラット血漿で１０倍希釈し、ＰＢＳ希釈試料は０時間、２４時間、１週間、血漿希釈試料は２４時間、３７℃においてインキュベートした。各試料を２分し、一方は、試料：超純水：０．２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）：Ｈｙａｓｅ／０．２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）（０．５Ｕ／ｍＬ）を２：１：２：１の混合比で混合し、Ｈｙａｓｅ処理試料とした。他方は、試料：超純水：０．２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）を２：１：３の混合比で混合し、Ｈｙａｓｅ未処理試料とした。一晩３７℃でインキュベートした後、以下に示すＲｅｉｓｓｉｇ法にて各試料中の還元末端Ｎ－アセチルグルコサミンの定量を行った。標準試料由来の試料については、溶媒の組成が変わらないよう１、３、１０、３０、１００、３００倍に希釈して検量線試料とした後、同様に呈色を行った。
　上記の方法で得られたＨｙａｓｅ処理試料、Ｈｙａｓｅ未処理試料、検量線試料について、試料：０．８Ｍ　ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）：１Ｎ　ＫＯＨを２５：５：２の混合比で混合し、沸騰水浴中で３分間加熱し、直ちに氷上に置いた。次にｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒドを１０Ｎ　ＨＣｌ／酢酸混液（１：７０）に溶解した試薬（１０ｍｇ／ｍＬ）を、上記試料：試薬の混合比が３２：１５０となるよう混合し、３７℃で２０分間インキュベートし、直ちに氷上に置いた。その後室温に戻し、直ちに５４４ｎｍの吸光度を測定した。Ｈｙａｓｅ処理試料の吸光度からＨｙａｓｅ未処理試料の吸光度を差し引いた値を用いて、検量線作成と各試料中の還元末端Ｎ－アセチルグルコサミンの濃度算出を行い、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 から分解率を求めた（表６）。なお、この条件において標準試料であるＨＡ－Ｎａは１００％分解する。分解率が１％の場合、分子量１００ｋＤａのＨＡは１分子あたり２．５箇所で切断を受け、分子量が４０ｋＤａまで低下する計算となる。
　ＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬ（比較例１－１－２）は、実施例３－３－２のサイズ排除クロマトグラフィー分析において、低分子化した投与化合物が尿中に観察されず生分解性が確認されなかったが、本試験の結果においても、Ｈｙａｓｅによる分解性が確認されなかった。それに対し、その他のＨＡ誘導体は、いずれも分解性を示した。
　特に、実施例１－４－１～１－４－６、実施例１－４－８～１－４－１１、実施例１－４－１４～１－４－１６、実施例１－４－１８、実施例１－４－１９では、ラット血漿で１日処理したサンプルは、ＰＢＳで１日処理したサンプルと比較して分解性が向上したことから、生体環境下でこれらの誘導体から修飾化合物が遊離することにより、Ｈｙａｓｅ分解をより受けやすい形へと変化したと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　〔実施例３〕ｉｎ　ｖｉｖｏでの血中滞留性および生分解性の確認
　（実施例３－１）ＨＡ誘導体投与ラット生体サンプル
　実施例１－４および比較例１－１で得られた化合物を２０ｍｇ／ｋｇの用量で、比較例１－３で得られた化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後５分、２、７、２４、４８、７２、１６８、２４０および３３６時間でヘパリンナトリウム処理したシリンジを用いて頸静脈採血し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで－２０℃以下で凍結保存した。また、投与後０～２４時間、２４～４８時間、４８～７２時間、７２～９６時間、１６８～１９２時間、２４０～２６４時間、および３３６～３６０時間で代謝ケージを用いて採尿し、尿量を量り、その一部を測定まで－２０℃以下で凍結保存した。
　（実施例３－２）ＨＡ誘導体投与ラット血漿の分析
　（実施例３－２－１）測定試料調製
　血漿サンプルを融解後、攪拌、遠心分離し、上清を採取した。バッファー（ＦＬラベル体：リン酸バッファー（ｐＨ８．０，Ｉ＝０．１５）、Ｒｈラベル体：ＰＢＳ）を用いて希釈を行った。投与液をバッファーとラットブランク血漿の混合液（３：１）で希釈し、検量線試料を調製した。
　（実施例３－２－２）濃度測定
　実施例３－２－１で調製したサンプルについて、プレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ　ＧＥＭＩＮＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて蛍光強度を測定した（ＦＬラベル体：励起波長：４９５ｎｍ／蛍光波長：５２０ｎｍ、Ｒｈラベル体：励起波長：５５２ｎｍ／蛍光波長：５９５ｎｍ）。検量線試料の測定値から、化合物ごとに検量線を作成し、各個体の各時点の血漿中濃度を算出し、平均値を図８に、血漿中濃度推移のグラフを図９に示す。
　（実施例３－２－３）薬物動態パラメーター算出
　薬物動態学的パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ　Ｖｅｒ　４．０．１／Ｖｅｒ　６．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）を用いて算出した。実施例３－２－２で求めた各群の平均データについてモデル非依存的解析を行い、クリアランス（ＣＬ）を算出した（表７）。この結果、実用的な血中滞留性を有するＰＥＧと比較して、実施例１－４－１～１－４－１９のＨＡ誘導体はいずれもＣＬの値が小さくなり、実用的な血中滞留性を有することが示された。また、比較例の一部のＨＡ誘導体のＣＬはＰＥＧよりも大きな値を示しており、修飾する化合物の種類によって様々な血中滞留性を示すＨＡ誘導体が合成可能であることを明らかにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　（実施例３－３）ＨＡ誘導体投与ラット尿の分析
　（実施例３－３－１）測定試料調製
　尿サンプルを融解後、攪拌し、０．２２μｍのフィルターでろ過し、ろ液を採取した。バッファー（ＦＬラベル体：リン酸バッファー（ｐＨ６．５，Ｉ＝０．１５）、Ｒｈラベル体：ＰＢＳ）を用いて希釈を行った。投与液をバッファーとラットブランク尿の混合液（１：１）で希釈し、標準試料を調製した。
（実施例３－３－２）サイズ排除クロマトグラフィー分析
　実施例３－３－１で調製したサンプルをサイズ排除クロマトグラフィーに供し、分子量分布の変化を観察した。サイズ排除クロマトグラフィー分析は、Ａｌｌｉａｎｃｅ　ＨＰＬＣシステム（日本ウォーターズ株式会社製）を用いて行った。分析条件を以下に示す。
　サイズ排除クロマトグラフィー分析条件
　分析カラム：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社）
　カラム温度：２５℃
　移動相：リン酸バッファー（ｐＨ６．５，Ｉ＝０．１５）（ＦＬラベル体）
　　　　　ＰＢＳ（Ｒｈラベル体）
　流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
　検出：Ｅｘ　４９５ｎｍ／Ｅｍ　５２０ｎｍ（ＦＬラベル体）
　　　　　Ｅｘ　５５２ｎｍ／Ｅｍ　５９５ｎｍ（Ｒｈラベル体）
　結果を図１０に示す。左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す。
　比較例１－１－２のＨＡ誘導体では、低分子化した投与化合物が尿中に観察されなかったのに対し、実施例のＨＡ誘導体は、いずれも低分子化した投与化合物が尿中に検出された。これは、本発明のＨＡ誘導体が生分解性を有し、投与後体外へ排泄されることを示している。
　〔実施例４〕リポソームを用いた、膜障害性の検証
　（実施例４－１）蛍光物質および消光物質内包リポソームの調製
　８－ヒドロキシピレン－１，３，６－トリスルホン酸トリナトリウム塩（Ｐｙｒａｍｉｎｅ）（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）を蒸留水に６０μｍｏｌ／ｍＬで溶解させ、またｐ－キシレン－ビス（Ｎ－ピリジニウムブロミド）（ＤＰＸ）（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）を蒸留水に８５．７μｍｏｌ／ｍＬで溶解させた後、溶液を等量で混合させ、Ｐｙｒａｍｉｎｅ／ＤＰＸ水溶液を調製した。　
　ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＥＬ－１１Ａ　ｖｉａｌ（日油株式会社）へ上記Ｐｙｒａｍｉｎｅ／ＤＰＸ溶液（２ｍＬ）を添加し、混合することにより、リポソーム溶液の調製を行った。
　その後、未封入ＰｙｒａｍｉｎｅおよびＤＰＸを除去するため、ＰＤ－１０カラム精製および生理食塩水５００ｍＬに対して透析精製（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）を３回行い、リポソーム溶液を得た。
　リポソーム溶液はイオン強度０．１５、ｐＨ６もしくは７．４のリン酸緩衝溶液で５倍希釈し各ｐＨのリポソーム溶液の調製を行った。
　（実施例４－２）リポソーム膜障害性評価
　実施例１－５および比較例１－２で得られたＨＡ誘導体を、ＨＡ－Ｎａとして１０ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩水に溶解させ、生理食塩水で順次希釈し、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。また、陽性対象としてＴｒｉｔｏｎＸの１０ｍｇ／ｍＬ生理食塩水溶液の調製を行った。陰性対象としては生理食塩水を用いた。さらに、膜障害性を有する陽性対照物質としてポリ－Ｌ－リジン臭化水素塩（ＰＬＬ、ＭＷ１５ｋＤａ～３０ｋＤａ、和光純薬株式会社製）を選択し、１０ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩水に溶解させた。　
　ｐＨ７．４またはｐＨ６．０のリン酸緩衝液２００μＬにリポソーム溶液２５μＬを添加後、サンプル２５μＬを添加した。３７℃で３時間インキュベート後、０．２２μｍのフィルターでろ過し、ろ液１００μＬをプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ　ＧＥＭＩＮＩ）を用いて蛍光強度を測定した（励起波長：４５０ｎｍ、蛍光波長：５１０ｎｍ）。ＰＬＬについてはｐＨ７．４のみ測定を行った。
　膜障害性を示す指標は下記の式に従いリポソーム分解率として算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　結果を図１１に示す。比較例として用いたＨＡ－Ｎｌｅ、ＨＡ－ｔＬｅｕ、ＨＡ－ｐＦＰｈｅはｐＨがいずれの時も膜障害性が見られなかったが、実施例で用いたサンプルはｐＨ７．４での膜障害性よりもｐＨ６．０での膜障害性が高いことが示された。特に、ＨＡ－ｐｃＡＣＨＣＡ、ＨＡ－Ｎａｌ、ＨＡ－ＡＰＢＡ、ＨＡ－Ｃｈａ、ＨＡ－ＡＭＢＡ、ＨＡ－３ＡＭＢＡ、ＨＡ－ＡＰｈＰＡ、ＨＡ－ＡＥＢ、ＨＡ－ＡＭＣｌＢＡ、ＨＡ－ＡＭＳＡ、ＨＡ－４ＡＭＣＨＣＡ、ＨＡ－ＣｈｇおよびＨＡ－ｐＨＰｈｇは、ｐＨ７．４では膜障害性が観察されず、ｐＨ６．０において、初めて膜障害性が観察された。また、ＰＬＬのｐＨ７．４でのリポソーム分解率は６．６％であったことから、数％のリポソーム分解率を示せば膜障害性を有する物質として充分機能すると判断でき、本発明のＨＡ誘導体はｐＨ６．０において膜障害性を有することが示された。
　〔実施例５〕ＨＡ－Ａｌａ誘導体－ＰＴＨアナログ結合体の合成
　（実施例５－１）ＨＡ－ＡｌａのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡ）の合成
　実施例１－２で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩をＨＡユニットに対して３倍モル等量添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡユニットに対して３倍モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、蒸留水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）した。得られた透析液に５Ｎ　ＮａＯＨ溶液を添加しｐＨ１２．５以上として、１時間攪拌してエチルエステルを加水分解し、カルボキシの脱保護を行った。その後、５Ｎ　ＨＣｌ溶液を用いて中和を行い、蒸留水、超純水でさらに透析を行った。得られた透析液に、実施例１－１でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニットに対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡを白色固体として得た。生成物の一部をとり、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、蒸留水の順で透析を行い、凍結乾燥して、アラニン修飾率算出用サンプルとした。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した、アラニン修飾率算出用サンプルおよび生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１２－１に示す。ＨＡユニットにおけるアラニンによる修飾率は、実施例１－４－１と同様にして算出を行ったところ、９８％であった。ＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡの重量あたりのＨＡユニット含量は実施例１－３と同様にして定量した。
　（実施例５－２）ＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡの合成
　実施例ｘ－１で合成したＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）に、ＥＤＯＢＥＡ、ＢＯＰの順で、ＨＡユニットに対してそれぞれ５０倍モル等量、０．１５倍モル等量添加し、室温で６時間攪拌した。反応溶液は０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、蒸留水の順で透析精製を行い（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ～１４ｋＤａ）、凍結乾燥して、ＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡを白色固体として得た。
　比較例１－１－２の記載と同様にして、生成物の１Ｈ－ＮＭＲ測定を行ったところ、ＥＤＯＢＥＡによる修飾率は９．４％であった。ＨＡユニット含量は実施例１－３と同様にして定量した。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１２－２に示す。
　（実施例５－３）ＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡ－Ｒｈの合成
実施例５－２で合成したＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡの水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２倍希釈し、ＮＨＳ－ローダミンをＨＡユニットに対して０．０７倍モル等量を５ｍｇ／ｍＬ　ＤＭＳＯ溶液で添加し、室温で２時間攪拌した。反応溶液を超純水で平衡化した脱塩カラム（ＰＤ－１０、ＧＥヘルスケア社製）に供して精製を行い、ＨＡ画分を凍結乾燥してＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡ－Ｒｈを赤色固体として得た。
　測定溶媒としてＤ２Ｏを用いた生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１２－３に示す。重量あたりのＨＡユニット含量は実施例１－３と同様にして定量した。また、生成物を０．０４２ｍｇ／ｍＬで１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その５５２ｎｍにおける吸光度から重量あたりのＲｈ含量を定量し、ＨＡユニットにおけるＲｈによる修飾率を算出したところ３．１％であった。さらに得られた生成物のモル吸光係数を算出したところ、２６９０Ｍ－１ｃｍ－１であった。
　（実施例５－４）ＨＡのブロモアセチル誘導体（ＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡ－ＢＡ／Ｒｈ／Ａｃ）の合成
　実施例５－３で合成したＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡ－Ｒｈの水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を出発原料とした。水溶液を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２倍希釈し、ＮＨＳ－ブロモ酢酸（ＮＨＳ－ＢＡ、シグマ－アルドリッチ社製）をＨＡユニットに対して０．５倍モル等量を５０ｍｇ／ｍＬアセトニトリル溶液で添加し、室温で２時間攪拌した後、ＨＡユニットに対して２０倍モル等量の無水酢酸を添加してさらに１時間攪拌することにより、余分なＥＤＯＢＥＡの末端アミノをアセチル化した。反応溶液を超純水で平衡化した脱塩カラム（ＰＤ－１０）に供して精製を行い、分取したＨＡ画分を遠心限外濾過（マクロセップ、ＭＷＣＯ３０００、ポールライフサイエンス社製）で約２倍に濃縮してＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡ－ＢＡ／Ｒｈ／Ａｃを水溶液として得た。水溶液は次の使用まで－２０℃で凍結して保存し、一部の一定容量を凍結乾燥後に重量測定して、溶液中の固形分濃度を算出した。
　（実施例５－５）ＨＡ－Ａｌａ－ＰＴＨアナログコンジュゲート（ＨＡ－Ａｌａ－ＰＴＨ／Ｒｈ）の合成
　実施例５－４で合成したＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡ－ＢＡ／Ｒｈ／Ａｃの水溶液を出発原料とした。ＰＴＨアナログはヒトＰＴＨ（１－３４）のＣ末端にシステインを導入して得たＰＴＨ－Ｃｙｓ（ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を用いた。ＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡ－ＢＡ／Ｒｈ／Ａｃ溶液に３／１０容量のアセトニトリルおよび１／１０容量の１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加えた。ＰＴＨ－Ｃｙｓを、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解後、ＨＡユニットに対して０．０３倍モル等量をＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡ－ＢＡ／Ｒｈ／Ａｃ溶液に添加し３７℃で終夜インキュベートした。ＨＡユニットに対して１倍モル等量のシステイン塩酸塩一水和物（和光純薬（株）製）を２０ｍｇ／ｍＬ水溶液で加え、更に３７℃で３時間インキュベートした後に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ４．５とした。なお、重量あたりのＨＡユニット含量を１．５μｍｏｌ／ｍｇとしてＨＡユニットの計算に使用した。
　次に、反応溶液を遠心限外濾過（マクロセップ、ＭＷＣＯ１００００）により、２ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）での希釈と濃縮を４回繰り返すことで精製を行い、ＨＡ－Ａｌａ－ＰＴＨ／Ｒｈ濃縮液を調製した。濃縮液を１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１００倍に希釈し、５５２ｎｍにおける吸光度を測定し、実施例５－３で算出したＨＡ－Ａｌａ－ＥＤＯＢＥＡ－Ｒｈの吸光係数を用いてＨＡ濃度を計算したところ、２４．３μｍｏｌ／ｍＬであった。また、ＡｃｃＱ・Ｔａｇ法（ウォーターズ社製）によりアミノ酸分析を行い、ＰＴＨ濃度を算出したところ、１４１．７５ｎｍｏｌ／ｍＬ、ＰＴＨ修飾率は０．５８％であった。アミノ酸分析における加水分解および誘導体化の操作はＰｉｃｏ・ＴａｇワークステーションおよびＡｃｃＱ・Ｔａｇケミストリーパッケージを用い、パッケージに付随するマニュアルに準じて行った。ＨＰＬＣ分析はＷａｔｅｒｓ２６９０セパレーションモジュールおよびＷａｔｅｒｓ４７４蛍光検出器を用い、アミノ酸濃度算出のための解析はリジン残基の濃度を基準とした。
　〔実施例６〕ＨＡ－Ａｌａ誘導体－ＰＴＨアナログ結合体のｉｎ　ｖｉｖｏにおける血中滞留性および生分解性の確認
　（実施例６－１）ＨＡ誘導体投与ラット生体サンプル
　実施例５－５で得られた化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後５分、２、７、２４、４８、７２、１６８、２４０および３１２時間でヘパリンナトリウム処理したシリンジを用いて頸静脈採血し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで－２０℃以下で凍結保存した。また、投与後０～２４時間、２４～４８時間、４８～７２時間、７２～９６時間、１４４～１６８時間、２１６～２４０時間、および２８８～３１２時間で代謝ケージを用いて採尿し、尿量を量り、その一部を測定まで－２０℃以下で凍結保存した。
　（実施例６－２）ＨＡ誘導体投与ラット血漿の分析
　（実施例６－２－１）測定試料調製
　実施例３－２－１に記載の方法で、測定用の試料を調製した。
　（実施例６－２－２）濃度測定
　実施例６－２－１で調製したサンプルを用いて、実施例３－２－２に記載の方法で各個体の各時点の血漿中濃度を算出した。平均値を図１３に、血漿中濃度推移のグラフを図１４に示す。
　（実施例６－２－３）薬物動態パラメーター算出
　実施例６－２－２で求めた平均データについて、実施例３－２－３に記載の方法でクリアランス（ＣＬ）を算出したところ、１．０であった。生分解性を有するヒアルロン酸誘導体の薬物結合体においても実用的な血中滞留性が示された。
　（実施例６－３）ＨＡ誘導体投与ラット尿の分析
　（実施例６－３－１）測定試料調製
　実施例３－３－１に記載の方法で、測定用の試料を調製した。
　（実施例６－３－２）サイズ排除クロマトグラフィー分析
　実施例６－３－１で調製したサンプルを実施例３－３－２に記載の方法で分析した結果を図１５に示す。左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す。
　実施例５－５を投与した個体の尿中には、低分子化した投与化合物が検出された。これは、生分解性を有するヒアルロン酸誘導体の薬物結合体が生分解性を維持し、投与後体外へ排泄されることを示している。

Claims (11)

  1. 　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｒ８は、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
    　Ｘは、－ＮＨＣＨ３、－ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、－ＮＲｘ－Ａ－Ｂ－ＣＯＯＲｙまたは－ＮＲｘ－ＣＨＲｃ－ＣＯＮＲｙａＲｙｂで表される基であり；
    　ＲｘおよびＲｙは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され；
    　Ａは、－ＣＲａＲｂ－、Ｃ３－８シクロアルキレン、２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイル、３－フェニルプロパン－１，１－ジイル、シクロヘキシルメタン－１，１－ジイルおよび４－ヒドロキシフェニルメタン－１，１－ジイルから選択され、Ｂは直接結合であり；または
    　Ａは－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－であり、Ｂはフェニレン（ここでフェニレンは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の基で置換されていてもよい）、Ｃ３－８シクロアルキレンおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択され；
    　Ｒａは、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され；
    　Ｒｂは、水素原子およびＣ１－６アルキル（ここでＣ１－６アルキルは、ヒドロキシ、カルボキシおよびカルバモイルから選択される１以上の基で置換されていてもよい）から選択され；
    　Ｒｃは、カルバモイルで置換されていてもよいＣ１－６アルキルを表し；
    　ＲｙａおよびＲｙｂは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択される］
    で表される二糖単位を含み、前記式（Ｉ）のＡが－ＣＲａＲｂ－またはＣ３－８シクロアルキレンの場合、存在する二糖単位に対する式（Ｉ）の二糖単位の割合は７０％以上であるヒアルロン酸誘導体。
  2. 　Ｘが－ＮＨＣＨ３、－ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３または－ＮＲｘ－ＣＨＲｃ－ＣＯＮＲｙａＲｙｂであるか、あるいは、Ａが－ＣＲａＲｂ－またはＣ３－８シクロアルキレンである、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  3. 　ＡがＣ３－８シクロアルキレンであり、Ｂが直接結合である；
    　Ａが－ＣＨ２－または－ＣＨ２－ＣＨ２－であり、Ｂがフェニレン（ここでフェニレンは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の基で置換されていてもよい）、Ｃ３－８シクロアルキレンおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択される；または
    　Ａが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイル、３－フェニルプロパン－１，１－ジイル、シクロヘキシルメタン－１，１－ジイルおよび４－ヒドロキシフェニルメタン－１，１－ジイルから選択され、Ｂが直接結合である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  4. 　Ａが－ＣＨ２－であり、Ｂがシクロヘキサン－１，１－ジイル、ベンゼン－１，４－ジイル、ベンゼン－１，３－ジイル、２－クロロベンゼン－１，４－ジイルおよびフェニルメタン－１，１－ジイルから選択され；
    　Ａが－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｂがベンゼン－１，４－ジイルであり；
    　または、
    　Ａが２－シクロヘキシルエタン－１，１－ジイル、２－（２－ナフチル）エタン－１，１－ジイルおよび３－フェニルプロパン－１，１－ジイルから選択され；Ｂが直接結合である、請求項１または３に記載のヒアルロン酸誘導体。
  5. 　式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｒ８ａは、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
    　Ｘａは、ヒドロキシおよび－Ｏ－Ｑ＋、から選択され；ここで、Ｑ＋は、カウンターカチオンを表す］
    で表される二糖単位をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  6. 式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｒ８ｂは、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
    　Ｘｂは、－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄで表される基であり；ここで、
    　Ｒｅは、水素原子またはＣ１－６アルキルであり；
    　Ｒｄは、水素原子、Ｃ１－６アルキル、－ＣＯ－Ｃ（Ｒ７）＝ＣＨ２、または－ＣＯ－Ｇ４－Ｘｃであり； 
    　Ｒ７は、水素原子またはメチルであり；
    　Ｇ４は、フェニレン、Ｃ３－８シクロアルキレン、または－Ｇ５－（Ｃ１－１０アルキレン）－Ｇ６－から選択され、ここでＣ１－１０アルキレン部分は、１～３のフェニレンまたはＣ３－８シクロアルキレンが挿入されていてもよく；
    　Ｇ５およびＧ６は、それぞれ独立に、直接結合、フェニレン、またはＣ３－８シクロアルキレンから選択され；
    　Ｘｃは、メルカプト、ハロゲン原子または式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     で表される基であり；
    　Ｙｂは、－ＣＨ２－（ＣＨＲ５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ－、－ＣＨ２－（ＣＨＲ６）ｐ－２－ＣＨ２－Ｏ－、－（ＣＨ２）ｊ－Ｓ－または－（ＣＨ２）ａ－（Ｙ１－（ＣＨ２）ｂ）ｃ－Ｇ－であり；
    　ｌ、ｐ、およびｊは、それぞれ独立に２～１０から選択される整数であり、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子またはヒドロキシであり；
    　ａは、２～１０から選択される整数であり；
    　ｂは、それぞれ独立に２～１０から選択される整数であり；
    　ｃは、１～２００から選択される整数であり；
    　Ｙ１は、酸素原子または－ＮＲｎ－であり；
    　Ｇは、酸素原子、硫黄原子または－ＮＨ－であり；
    　Ｒｎは、水素原子、Ｃ１－６アルキル、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｄ－Ｒｏ、－（ＣＨ２）ｅ－Ｒｐまたは－（ＣＨ２）ｆ－（Ｙ２－（ＣＨ２）ｇ）ｈ－Ｒｑであり；
    　ｇは、それぞれ独立に、２～１０から選択される整数であり；
    　ｄ、ｅ、ｆおよびｈは、それぞれ独立に、２～１０から選択される整数であり；
    　Ｒｏ，ＲｐおよびＲｑは、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ、カルボキシまたは－ＮＨＲｒであり；
    　Ｙ２は、酸素原子または－ＮＨ－であり；
    　Ｒｒは、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルである］
    で表される二糖単位を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  7. 　Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａの全てを水素原子とし、Ｒ８ａをアセチルとし、かつ、Ｘａを－Ｏ－Ｎａ＋とした場合の重量平均分子量が２０～１２０キロダルトンとなる、請求項５に定義した式（ＩＩ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を用いて製造される、請求項１～６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  8. 　前記ヒアルロン酸誘導体に主鎖構造が対応する誘導体化されていないヒアルロン酸の重量平均分子量が２０～１２０キロダルトンであり、ここで誘導体化されていないヒアルロン酸は、請求項５に定義した式（ＩＩ）においてＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａが水素原子であり、Ｒ８ａがアセチルであり、Ｘａが－Ｏ－Ｎａ＋である繰り返し単位のみからなるヒアルロン酸である、請求項１～６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体を担体として含む、医薬組成物。
  10. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体に、１以上の薬物が結合した、ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体。
  11. 　請求項１、２および５～８のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体を含む、生分解性の薬物担体。
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