WO2010100781A1 - 核酸デリバリー用組成物 - Google Patents

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WO2010100781A1
WO2010100781A1 PCT/JP2009/067201 JP2009067201W WO2010100781A1 WO 2010100781 A1 WO2010100781 A1 WO 2010100781A1 JP 2009067201 W JP2009067201 W JP 2009067201W WO 2010100781 A1 WO2010100781 A1 WO 2010100781A1
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WO
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group
polymer
composition
integer
nucleic acid
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Application number
PCT/JP2009/067201
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English (en)
French (fr)
Inventor
片岡一則
位高啓史
呉寿栄
内田智士
Original Assignee
国立大学法人東京大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/04—Uses of viruses as vector in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/06—Uses of viruses as vector in vitro

Definitions

  • the present invention relates to a novel composition capable of delivering a nucleic acid to a target cell.
  • virus-type gene carriers As a non-viral nucleic acid carrier, it has so far been formed by electrostatic interaction between a block copolymer composed of polyethylene glycol (PEG) and polycation (cationic polypeptide) and a nucleic acid which is a polyanion.
  • a micellar polyion complex has been reported (see Patent Document 1, Non-Patent Document 1, and Non-Patent Document 2).
  • This PIC can stably encapsulate a nucleic acid in blood, for example.
  • the particle size is about the same as that of viruses (about 100 nm)
  • a foreign body recognition mechanism in the living body can be avoided.
  • the ethylenediamine unit (— (CH 2 ) 2 —NH— (CH 2 ) 2 —NH 2 ) contained in the side chain of the polycation in the block copolymer has two steps of pKa, In the cell, endosome escape is promoted by the proton sponge effect.
  • the above PIC has improved nucleic acid introduction efficiency due to such characteristics.
  • nucleic acid introduction efficiency improvement of nucleic acid introduction efficiency and improvement of cytotoxicity derived from lipids and cationic polymers constituting carriers are required.
  • an object of the present invention is to provide a novel nucleic acid carrier with improved nucleic acid introduction efficiency and safety.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems.
  • non-viral compositions prepared by mixing polycationically charged polymers and glycosaminoglycans with nucleic acids have high stability and biocompatibility along with high nucleic acid introduction efficiency into target cells.
  • the present invention has been completed. Accordingly, the present invention relates to the following.
  • a composition for nucleic acid delivery to a target cell comprising a polycation chargeable polymer and a glycosaminoglycan.
  • a method for delivering the nucleic acid to the cell comprising contacting a composition containing the nucleic acid, a polycationic chargeable polymer and a glycosaminoglycan with a target cell.
  • the polycationic chargeable polymer has a main chain based on poly (amino acid), polysaccharide, polyester, polyether, polyurethane, or vinyl polymer, and as a side chain, A group represented by the formula —NH— (CH 2 ) a — (NH (CH 2 ) 2 ) e —NH 2 bonded to the main chain directly or via a linking group (where a and e are each independently And a segment chain derived from a chargeable polymer including 1 to 5).
  • examples of the polycationic chargeable polymer include a block copolymer having a segment chain derived from the chargeable polymer and a segment chain derived from a nonionic hydrophilic polymer.
  • the nonionic hydrophilic polymer includes, for example, poly (ethylene glycol), poly (vinyl alcohol), poly (vinyl pyrrolidone), poly (methacrylamide), poly (acrylamide), poly (hydroxyethyl methacrylate) and Selected from the group consisting of poly (hydroxyethyl acrylate).
  • the polycation chargeable polymer is, for example, a chargeable polymer represented by the following general formula (III), a block copolymer represented by the following general formula (I) or (II), or those Mention may be made of salts.
  • R 10 represents a hydroxyl group, an oxybenzyl group or an NH—R 11 group, wherein R 11 represents a linear or branched C 1-20 alkyl group which may be substituted
  • R 1a and R 1b each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted linear or branched C 1-12 alkyl group
  • R 2a , R 2b , R 2c and R 2d each independently represent a methylene group or an ethylene group
  • R 3 represents a hydrogen atom
  • R 4 represents a hydroxyl group or a group represented by —O—X 3 , —S—X 3 or —NH—X 3 , wherein X 3 is a primary, secondary or tertiary amine compound or quaternary ammonium.
  • R 5a , R 5b , R 5c , and R 5d each independently represent a hydroxyl group, an oxybenzyl group, or an NH— (CH 2 ) a —X group, where a is an integer of 1 to 5.
  • X each independently represents an amine compound residue containing one or more groups derived from a primary, secondary or tertiary amine compound or a quaternary ammonium salt, or a non-amine compound residue, and the total number of R 5a R 5b Or, among the total number of R 5c and R 5d , —NH— (CH 2 ) a —X group (where X is (NH (CH 2 ) 2 ) e —NH 2 , e is an integer of 1 to 5)
  • R 6a and R 6b are each independently a hydrogen atom or a protecting group, wherein the protecting group is selected from the group consisting of a Z group, a Boc group, an acetyl group, and a trifluoroacetyl group, L 1 and L 2 represent a linking group, m is an integer of 5 to 20,000, n is an integer of 2 to 5,000, y is an integer from 0 to 5,000, z is an integer from
  • a preferred glycosaminoglycan is chondroitin sulfate or hyaluronic acid.
  • nucleic acid can be efficiently introduced into target cells.
  • a nucleic acid carrier excellent in stability and biocompatibility is provided.
  • FIG. 1 is a graph showing the efficiency of gene introduction into cells by chondroitin sulfate-added DNA complex.
  • FIG. 2 is a diagram showing an improvement in stability of chondroitin sulfate-added DNA complex.
  • FIG. 3 is a diagram evaluating the influence of a difference in the preparation method of chondroitin sulfate-added DNA complex.
  • FIG. 4 is a diagram showing the evaluation of complex properties due to differences in the preparation method of chondroitin sulfate-added DNA complex.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of a transvenous gene transfer experiment into mouse skeletal muscle as an application to in vivo delivery.
  • FIG. 6 is a diagram showing measurement results of gene expression levels when chondroitin sulfate-added DNA complex was intratracheally administered to mouse lung tissue.
  • FIG. 7 is a diagram showing the expression level of TNF- ⁇ after intratracheal administration to mouse lung tissue.
  • FIG. 8 is a diagram showing the expression level of IL-6 after intratracheal administration to mouse lung tissue.
  • FIG. 9 is a graph showing the tumor growth inhibitory effect of administration of sFlt-1 pDNA / PEG-PAspDET / CS complex.
  • FIG. 10 is a diagram showing PECAM-1-stained images (A) of mouse tumor tissues administered with sFlt-1 pDNA / PEG-PAspDET / CS complex and quantitative results (B) of PECAM-1-positive regions.
  • FIG. 11 is a view showing the state of the mouse lower limb on the 21st day after the ischemia treatment based on Example 1.
  • FIG. 12 is a diagram showing the blood flow state of the mouse lower limbs to which various test samples were administered after ischemia treatment.
  • FIG. 13 is a diagram showing blood flow quantification values of the mouse lower limbs before and after ischemia treatment.
  • FIG. 14 is a diagram showing blood flow quantification values of the mouse lower limbs before and after ischemia treatment.
  • FIG. 15 is a diagram showing the effect of reducing membrane damage by the composition of the present invention.
  • the present inventor used a polycation chargeable polymer as a glycosaminoglycan and a triple mixed complex added with a nucleic acid. It was found that the gene expression in the target cells was remarkably increased as compared with the case where no saminoglycan was added. Therefore, the present invention provides a composition capable of delivering a nucleic acid to a target cell, comprising a polycation chargeable polymer and a glycosaminoglycan. Moreover, the method of introduce
  • the present inventor has found that the mixed complex of polycation chargeable polymer, glycosaminoglycan and nucleic acid is stable and gene expression ability is maintained over a long period of time. That is, the present inventor has revealed that glycosaminoglycan can stabilize a complex (PIC) of a polycation chargeable polymer and a nucleic acid. Therefore, the present invention provides a composition for nucleic acid delivery excellent in stability. The present invention also provides a method for stabilizing the complex, comprising bringing glycosaminoglycan into contact with a complex of a polycation chargeable polymer and a nucleic acid. Moreover, the composition of the present invention can be applied to animals by various routes such as vein, skeletal muscle, subcutaneous and lung.
  • the composition of the present invention when applied to animals, has a characteristic that tissue injury and inflammation are remarkably reduced as compared with the case of using a conventional nucleic acid carrier. Therefore, the present invention provides a composition for nucleic acid delivery that is highly convenient and has few side effects and improved biocompatibility.
  • the feature of the present invention is that the biocompatible polymer glycosaminoglycan represented by chondroitin sulfate is applied to the nucleic acid carrier to significantly improve the nucleic acid introduction efficiency and safety of the non-viral carrier, This is to enhance the function of a non-viral nucleic acid delivery system.
  • the composition of this invention can be utilized as a drug discovery, it can be said that this invention has the very high industrial utility value.
  • the polycation chargeable polymer used in the present invention is a polymer having a segment chain derived from a chargeable polymer or a salt thereof.
  • the polycationic chargeable polymer may be a chargeable homopolymer.
  • the polycation chargeable polymer used in the present invention may be a block copolymer having a segment chain derived from a chargeable polymer and a segment chain derived from a nonionic hydrophilic polymer, or a salt thereof.
  • the chargeable polymer has a main chain based on poly (amino acid), polysaccharide, polyester, polyether, polyurethane, or vinyl polymer, and a side chain has a direct or connecting group on the main chain.
  • -NH- (CH 2 ) a -(NH- (CH 2 ) 2 ) e -NH 2 (Wherein, a and e are each independently an integer of 1 to 5).
  • “having a main chain based on poly (amino acid)” preferably means that the main chain of the polymer includes a polyamino acid formed through a peptide bond between natural or synthetic amino acids. To do.
  • the amino acid constituting the polyamino acid is preferably an amino acid having a cationic group in the side chain.
  • the cationic group referred to here is not limited to a group that has already become a cation by coordination of a hydrogen ion, but also includes a group that becomes a cation when a hydrogen ion is coordinated.
  • Such cationic groups include all known groups.
  • a polypeptide having a cationic group in the side chain is a peptide in which a known amino acid having a basic side chain (lysine, arginine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, etc.) is peptide-bonded, and various amino acids are peptide-bonded, Also included are those in which the side chain is substituted so as to have a cationic group.
  • “having a polysaccharide-based main chain” means including, for example, a sugar chain such as DEAE-dextran, chitosan, or polygalactosamine as the main chain of the polymer.
  • “Having a main chain based on a vinyl polymer” means containing a polymer chain formed by polymerization of an unsaturated ethylenically polymerizable monomer as the polymer main chain.
  • the side chain contained in the charged polymer has the formula -NH- (CH 2 ) a -(NH (CH 2 ) 2 ) e -NH 2 (Wherein a and e are each independently an integer of 1 to 5) and are bonded to the main chain directly or via a linking group.
  • the side chain is bonded to the main chain via a carboxyl group present at the beta or gamma position of the amino acid, an amino group at the ⁇ -position, or the like.
  • the main chain is based on a polysaccharide, for example, it is bonded to the main chain via the hydroxy group, amino group or carboxyl group of the sugar moiety
  • a vinyl polymer for example, It is bonded to the main chain via a hydroxy group such as (vinyl alcohol), poly (methacrylamide), poly (acrylamide) or poly (methacrylic acid), or an amide group carboxyl group.
  • the bonding reaction between the main chain and the side chain a substitution reaction for halogen, a condensation reaction using a carboxyl group or an amino group, a transesterification reaction for an ester, an aminolysis, or the like can be used.
  • the side chain and the main chain are bonded, for example, by C 1-22 It may be via a linking group containing an alkylene chain.
  • C 1-22 The “alkylene chain” means a linear or branched alkylene group having 1 to 22 carbon atoms. In the present invention, C 1-22 The alkylene chain may be substituted.
  • the linking group may be interrupted with, for example, 1 to 10 oxygen or sulfur.
  • the side chain is usually introduced into the polymer by a polymer reaction, but is not limited thereto.
  • the molecular weight of the polymer thus produced is not limited as long as the object of the present invention can be achieved, but the lower limit is usually 1000 or more, preferably 15,000 or more, more preferably 18,000 or more. For example, it may be 23,000 or more or 28,000 or more.
  • the upper limit is usually 200,000 or less, preferably 45,000 or less, and may be 34,000 or less, 30,000 or less, or 22,000 or less, for example.
  • the chargeable polymer is a polymer represented by the following general formula (III) or a salt thereof.
  • R 10 Is a hydroxyl group, an oxybenzyl group or NH-R 11 Represents a group.
  • R 11 Is an optionally substituted linear or branched C 1-20 Represents an alkyl group.
  • R 11 Is unsubstituted linear or branched C 1-20 Alkyl groups are preferred.
  • R 11 C 1-20 The alkyl group may be substituted with one or more substituents.
  • C 1-20 The alkyl group is an acetalized formyl group, cyano group, formyl group, carboxyl group, amino group, C 1-6 Alkoxycarbonyl group, C 2-7 Acylamide group, siloxy group, silylamino group and tri-C 1-6 It may be substituted with a substituent selected from the group consisting of alkylsiloxy groups (each alkyl group may be the same or different).
  • “C 1-20 “Alkyl group” means a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.
  • alkyl group examples include methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, n-hexyl, decyl and undecyl.
  • C 1-6 "Alkoxy group” means straight or branched C 1-6 This means a group in which an oxygen atom is bonded to the terminal of the alkyl group.
  • methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group iso-propoxy group, n-butoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group, n- Examples thereof include a pentyloxy group and an n-hexyloxy group.
  • C 1-6 The term “alkoxycarbonyl group” means the above “C 1-6 It means a carbonyl group to which “alkoxy group” is bonded, and examples thereof include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a 1-propoxycarbonyl group, a 2-propoxycarbonyl group, and a 2-methyl-2-propoxycarbonyl group.
  • C 2-7 “Acyl group” means straight or branched C 1-6 This means that it is a carbonyl group to which an alkyl group is bonded, and specific examples include acetyl group, propionyl group, isopropionyl group, butyryl group, isobutyryl group and the like.
  • C 2-7 “Acylamide group” means the above “C” 2-7 Acyl group " A bonded amino group is meant.
  • R included in the general formula (III) 10 Other groups will be described later.
  • each repeating unit in General formula (III) is shown in the order specified for convenience of description, each repeating unit can exist at random.
  • the charged polymer may be a main chain based on poly (amino acid) in which each repeating unit in the general formula (III) starts from the N-terminal side.
  • the polymer represented by the general formula (III) may be a salt of the polymer represented by the general formula (III) as one embodiment of the present invention.
  • the salt is not particularly limited, but Cl as a counter ion ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ , (1 / 2SO 4 ) ⁇ , NO 3 ⁇ , (1 / 2CO 3 ) ⁇ , (1 / 3PO 4 ) ⁇ , CH 3 COO ⁇ , CF 3 COO ⁇ , CH 3 SO 3 ⁇ Or CF 3 SO 3 ⁇ And the like.
  • the nonionic hydrophilic polymer is not particularly limited as long as it is a nonionic and hydrophilic polymer.
  • the nonionic hydrophilic polymer includes, for example, poly (ethylene glycol), poly (vinyl alcohol), poly (vinyl pyrrolidone), poly (methacrylamide), poly (acrylamide), poly (hydroxyethyl methacrylate) and Selected from the group consisting of poly (hydroxyethyl acrylate).
  • a preferred nonionic hydrophilic polymer in the present invention is polyethylene glycol.
  • the nonionic hydrophilic polymer can be prepared, for example, using the production method described in WO96 / 32434, WO96 / 33233, or WO97 / 06202.
  • the polycation chargeable polymer used in the present invention is a chargeable homopolymer represented by the above general formula (III) or a salt thereof.
  • the polycationic chargeable polymer used in the present invention is a block copolymer having a segment chain derived from the above charged polymer and a segment chain derived from a nonionic hydrophilic polymer, or a salt thereof.
  • Specific examples of such block copolymers include block copolymers represented by the general formula (I) or (II), or salts thereof.
  • R 1a And R 1b Each independently represents a hydrogen atom or an optionally substituted linear or branched C 1-12 Represents an alkyl group.
  • C 1-12 “Alkyl group” means a linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms.
  • the alkyl group include methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, n-hexyl and decyl.
  • the alkyl group may be substituted with one or more substituents.
  • substituents include acetalized formyl group, cyano group, formyl group, carboxyl group, amino group, C 1-6 Alkoxycarbonyl group, C 2-7 Acylamide group, siloxy group, silylamino group and tri-C 1-6 And alkylsiloxy groups (each alkyl group may be the same or different).
  • acetalization is one of the methods for protecting the carbonyl of the formyl group.
  • the carbonyl of the formyl group and two branched alkanol molecules having 1 to 6 carbon atoms or 2 to 6 carbon atoms are branched.
  • an acetal part is formed by reaction with an alkylene diol which may be present.
  • the substituent can be converted to another group under appropriate conditions.
  • the substituent when the substituent is an acetalized formyl group, it can be converted to another substituent, a formyl group (aldehyde group; —CHO), by hydrolysis under acidic mild conditions.
  • a formyl group aldehyde group; —CHO
  • the substituent is a formyl group, a carboxyl group or an amino group, for example, an antibody or a fragment having a specific binding property thereof (F (ab ′)) via these groups 2 , F (ab), etc.
  • F (ab ′) an antibody or a fragment having a specific binding property thereof
  • R 1a And R 1b Is a methyl group.
  • R 2a , R 2b , R 2c And R 2d R 2a , R 2b , R 2c And R 2d
  • R 2a , R 2b , R 2c And R 2d Each independently represents a methylene group or an ethylene group, preferably a methylene group.
  • R 2a And R 2b In the case where both are methylene groups, the main chain of the repeating unit corresponds to poly (aspartic acid derivative), and in the case of ethylene groups, it corresponds to poly (glutamic acid derivative).
  • R 2c And R 2d In any case, the main chain of the repeating unit corresponds to poly (aspartic acid derivative), and in the case of ethylene group, it corresponds to poly (glutamic acid derivative).
  • R 2a And R 2b Or R 2b And R 2a Each represents a methylene group and an ethylene group
  • R 2c And R 2d Or R 2d And R 2c Each represent a methylene group and an ethylene group
  • the repeating units of the aspartic acid derivative and glutamic acid derivative may be present in the form of blocks, respectively, or may be present randomly.
  • R 3 R 3 Represents a hydrogen atom, a protecting group, a hydrophobic group or a polymerizable group.
  • the “protecting group” is not particularly limited as long as it is a group usually used as a protecting group for an amino group.
  • examples of the protecting group include a Z group (benzyloxycarbonyl group), a Boc group (tert-butoxycarbonyl group), an acetyl group, and a trifluoroacetyl group.
  • the hydrophobic group is not limited, and examples thereof include an alkyl group, a cycloalkyl group, and an aryl group.
  • the polymerizable group may be a functional group that causes a polymerization reaction, and examples thereof include, but are not limited to, an unsaturated hydrocarbon group.
  • the polymerizable group is vinyl group, allyl group, acrylic group, acryloyl group, methacryloyl group, propenyl group, vinylidene group, vinylene group, isocyanate group, isothiocyanate group, carboxyl group, hydroxyl group, amino group. And an alkoxy group.
  • R 4 R 4 Is a hydroxyl group, a protecting group, -O-X 3 , -S-X 3 Or -NH-X 3 Or a polymerization initiator residue of poly (amino acid).
  • the protective group may be a group used as a protective group for the terminal carboxyl group, and for example, a group that forms an alkyl ester (for example, methyl ester, ethyl ester, tert-butyl ester) or benzyl ester together with the carboxyl group.
  • the present invention is not limited to this.
  • X 3 Although there is no particular limitation, it is desirable that it be a compound residue that does not interfere with a series of reactions of the intended polymer synthesis.
  • X 3 examples thereof include an amine compound residue containing one or more groups derived from a primary, secondary or tertiary amine compound or a quaternary ammonium salt, or a non-amine compound residue.
  • initiator means a substance used for initiating a polymerization reaction of poly (amino acid), and examples thereof include butylamine.
  • Initiator residue means a residue derived from an initiator contained in a polymer as a result of a polymerization reaction.
  • preferable R 4 Is —NH—R 9 It is. Where R 9 Is an optionally substituted linear or branched C 1-20 It is an alkyl group.
  • R 5a , R 5b , R 5c And R 5d Each independently represents a hydroxyl group, an oxybenzyl group, or NH- (CH 2 ) a -X group is represented.
  • a is an integer of 1 to 5
  • X is independently an amine compound residue containing one or more groups derived from a primary, secondary or tertiary amine compound or a quaternary ammonium salt, or a non-amine. Represents a compound residue.
  • R 5a And R 5b Total number or R 5c And R 5d At least two of the total number of —NH— (CH 2 ) a -X group (where X is (NH (CH 2 ) 2 ) e -NH 2 And e is an integer from 1 to 5.
  • the total number means all “R” contained in the block copolymer represented by the general formula (I) or (II) or the charged polymer represented by the general formula (III). 5a And R 5b "Or” R 5c And R 5d "Means the number.
  • R 5a And R 5b Total number or R 5c And R 5d Of these groups are —NH— (CH 2 ) a -X group (where X is (NH (CH 2 ) 2 ) e -NH 2 It is preferable to use a block copolymer in which 50% or more, more preferably 85% or more, of which e is an integer of 1 to 5.
  • R contained in the polycation chargeable polymer represented by the general formulas (I) to (III) 5a And R 5b All or R 5c And R 5d Are all —NH— (CH 2 ) a -X group (where X is (NH (CH 2 ) 2 ) e -NH 2 It is preferable that a is 2 or 3, and e is an integer of 1 to 3, particularly preferably e is 1.
  • X is -NH 2 , -NH-CH 3 , -N (CH 3 ) 2 And groups represented by the following formulas are preferred.
  • X 2 Is a hydrogen atom, C 1-6 Alkyl group or amino C 1-6 Represents an alkyl group
  • R 7a , R 7b And R 7c Each independently represents a hydrogen atom or a methyl group
  • D1, d2 and d3 each independently represents an integer of 1 to 5
  • E1, e2, and e3 each independently represents an integer of 1 to 5
  • F represents an integer from 0 to 15
  • G represents an integer of 0 to 15.
  • R 8a And R 8b Each independently represents a hydrogen atom or a protecting group, wherein the protecting group is usually selected from the group consisting of a Z group, a Boc group, an acetyl group and a trifluoroacetyl group, which are commonly used as protecting groups for amino groups. To be elected.
  • R 5a , R 5b , R 5c And R 5d Is —NH—NH 2 Or -NH- (CH 2 ) 2 -NH- (CH 2 ) 2 -NH 2 Is particularly preferred, and in particular, —NH— (CH containing diethylenetriamine unit 2 ) 2 -NH- (CH 2 ) 2 -NH 2 Is more preferable.
  • R 6a And R 6b R 6a And R 6b are each independently a hydrogen atom or a protecting group.
  • the protecting group is selected from the group consisting of a Z group, a Boc group, an acetyl group, and a trifluoroacetyl group, which are usually used as a protecting group for an amino group.
  • L 1 And L 2 L 1 And L 2 Represents a linking group.
  • L is the linker part 1 Is —S—S—, —NH— or the formula: — (CH 2 ) b
  • a group represented by —NH— (where b is an integer of 1 to 5) is preferred.
  • L is the linker part 2 Is —S—S—, —CO— or the formula: — (CH 2 ) c
  • a group represented by -CO- (where c is an integer of 1 to 5) is preferred.
  • L 1 And L 2 May further include OCO, OCONH, NHCO, NHCOO, NHCONH, CONH or COO.
  • m, n, y and z M and n represent the number of repeating units (polymerization degree) of each block part.
  • M is an integer of 5 to 20,000.
  • N is an integer from 2 to 5,000.
  • Y is an integer from 0 to 5,000.
  • Z is an integer of 0 to 5,000, but y + z is not larger than n. Preferred z is 0.
  • R 3 A polycation chargeable polymer in which is an acetyl group, an acryloyl group, or a methacryloyl group.
  • each repeating unit is shown in the specified order for convenience of description, but each repeating unit can exist at random.
  • the polycation chargeable polymer may form a salt.
  • the salt is not particularly limited, but the counter ion is Cl.
  • the production method of the block copolymer is not limited.
  • a segment chain derived from a nonionic hydrophilic polymer is synthesized in advance, and one end of the segment chain derived from this nonionic hydrophilic polymer (R 1a Or R 1b Or a segment derived from a nonionic hydrophilic polymer, by polymerizing predetermined monomers in sequence at the opposite end) and then substituting or converting the side chain so that the side chain contains a cationic group as necessary.
  • Examples include a method of previously synthesizing a chain and a segment chain derived from a chargeable polymer and linking them together.
  • the methods and conditions for various reactions in the production method can be appropriately selected or set in consideration of conventional methods. For example, an example of a manufacturing method is described in Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • the average molecular weight (Mw) of the block copolymer thus produced is not limited, but is preferably 23,000 to 45,000, more preferably 28,000 to 34,000.
  • the average molecular weight (Mw) of the segment chain derived from the nonionic hydrophilic polymer is preferably 8,000 to 15,000, more preferably 10,000 to 12,000.
  • the molecular weight (Mw) of the segment chain derived from the chargeable polymer is preferably 15,000 to 30,000, more preferably 18,000 to 22,000. 2.
  • Glycosaminoglycan is a biocompatible polymer that exists universally in the living body, and representative examples thereof include chondroitin sulfate, hyaluronic acid, ketalan sulfate, and heparan sulfate.
  • chondroitin sulfate is abundant in the extracellular matrix and is known as one of the main components of the body.
  • Glycosaminoglycans are biocompatible polymers that are almost non-toxic and harmless to living organisms.
  • glycosaminoglycan when glycosaminoglycan is used for nucleic acid delivery together with a polycation chargeable polymer, the nucleic acid carrier is stabilized and the tissue is not easily damaged.
  • the glycosaminoglycan used in the present invention is, for example, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, ketalan sulfate, heparan sulfate, chondroitin or heparin, preferably chondroitin sulfate (CS) or hyaluronic acid (HA).
  • the glycosaminoglycan used is one extracted from a natural product such as an animal, one extracted from a culture of a microorganism, or one chemically or enzymatically synthesized. Can do. In the present invention, commercially available glycosaminoglycans may be used. 3. Nucleic acid In the present invention, the nucleic acid is not particularly limited. For example, DNA, RNA, and nucleic acid analog (for example, a peptide nucleic acid or a nucleic acid whose phosphate moiety is modified to phosphorothioate, methylphosphonate, phosphate triester, phosphoramidate, etc.) Is included.
  • nucleic acids may be genes responsible for genetic information, or may be responsible for functions such as gene expression regulation, and are not limited to their properties and functions.
  • the nucleic acid is preferably, for example, plasmid DNA, antisense oligo DNA, siRNA, shRNA or the like.
  • the nucleic acid can be used together with various substances such as a high-molecular substance such as a physiologically active protein or peptide or a low-molecular substance such as a water-soluble compound, if necessary.
  • these materials are preferably “anionic materials”.
  • the anionic substance includes a substance having a charged functional group in the molecule and a molecule having a plurality of different charged functional groups (anionic group and cationic group) by changing the pH. Also included are those capable of changing the charged state of the entire molecule to anionic. These anionic substances may be used alone or in combination of two or more, and are not limited. 4).
  • Composition The composition of the present invention contains a polycation chargeable polymer and a glycosaminoglycan. Since the composition of the present invention can be used for delivery of nucleic acid to target cells, the composition of the present invention may further contain a nucleic acid. The composition of the present invention can also be used as a pharmaceutical composition or an experimental composition.
  • compositions of the present invention can be readily prepared by mixing the polycationically charged polymer and chondroitin sulfate in any buffer (eg, an aqueous medium, preferably a medium based on deionized water). it can.
  • a buffer eg, an aqueous medium, preferably a medium based on deionized water.
  • the composition of the present invention contains a nucleic acid, it can be prepared by mixing the nucleic acid, the polycation chargeable polymer and the chondroitin sulfate in an arbitrary buffer.
  • the method for mixing the nucleic acid, the polycation chargeable polymer, and the chondroitin sulfate is not particularly limited.
  • one type may be mixed, or three types may be mixed at a time.
  • Mixing may be carried out in small amounts, for example, by dropping, and the components may be brought into contact with each other, the amount of contact may be increased over time, or the total amount of the components may be brought into contact at a time.
  • each component is not particularly limited, and chondroitin sulfate may be premixed in the polycation chargeable polymer, and the nucleic acid may be mixed in the resulting mixture, or the nucleic acid may be mixed in the polycation chargeable polymer in advance.
  • the mixture may be mixed, and chondroitin sulfate may be further mixed into the mixture, or after mixing chondroitin sulfate and nucleic acid, the polycation chargeable polymer may be mixed.
  • the mixing ratio between the nucleic acid and the polycation chargeable polymer can be represented by the ratio (N / P ratio) between the cation in the polymer and the phosphate group in the nucleic acid molecule.
  • the N / P ratio is a value defined by the following equation, and the N / P ratio refers to this value unless otherwise stated.
  • N / P ratio [total number of cations in polymer in solution] / [total number of phosphate groups in nucleic acid in solution]
  • the N / P ratio is not limited as long as the composition can form a polyion complex, and varies depending on the properties of the uncharged segment or the charged segment contained in the polymer.
  • An appropriate N / P ratio in the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the mixing ratio of the polycation chargeable polymer and the nucleic acid is not limited.
  • the N / P ratio is 0.5 to 160, preferably 1 to 120, more preferably 2 to 80, and still more preferably. 10 to 80.
  • the N / P ratio is not limited, but is preferably 1 to 120, more preferably 2 to 80, More preferably, it is 10-80.
  • chondroitin sulfate is preferably used at a concentration of 0.001 to 100 mg / ml, preferably 0.01 to 50 mg / ml, more preferably 0.05 to 5 mg / ml after mixing.
  • the chondroitin sulfate is 1/50 to 1/2 volume, preferably 1 to the volume of the polycation chargeable polymer or the complex capacity of the polycation charge polymer and the nucleic acid or the amount of the solution containing them. It is preferable to add / 20 to 1/5 volume, more preferably 1/10 volume.
  • a composition containing, as a final concentration, 160 ⁇ g / ml of nucleic acid, 2200 ⁇ g / ml of polymer (PEG-PAspDET), and 5 mg / ml of chondroitin sulfate may be mentioned. It is not a thing.
  • the present invention can provide a method for stabilizing a complex of a polycationic charged polymer and a nucleic acid, characterized by using glycosaminoglycan.
  • the method for stabilizing the complex can be achieved by a method similar to the method for preparing the composition of the present invention. That is, the complex may be stabilized by mixing glycosaminoglycan, nucleic acid, and polycationic chargeable polymer. Complex stabilization can be evaluated by the amount of nucleic acid introduced, the amount of nucleic acid expressed, and the like. 5.
  • the composition of the present invention can be used for nucleic acid delivery to target cells. Accordingly, the present invention provides a nucleic acid delivery composition and a method for delivering a nucleic acid to a target cell, characterized by using the composition of the present invention.
  • the cell is an animal, insect, or plant-derived cell or cell line, or a microorganism.
  • the composition of the present invention and the target cell may be contacted. The contact introduces a nucleic acid into the target cell.
  • contact means, for example, that the composition of the present invention and target cells are present in the same reaction system or culture system, or that the composition of the present invention is contained in a living body containing target cells. It means to exist.
  • the contact between the composition of the present invention and the target cell can be achieved by culturing the cells in the presence of the composition of the present invention, Adding the composition, mixing the cells with the composition of the present invention, and the like.
  • the amount of the composition of the present invention used can be appropriately set in consideration of the nature of the nucleic acid and the cell type.
  • the contact between the composition of the present invention and the target cell can be achieved by administration methods commonly used in the art such as gene therapy.
  • living bodies include individuals (or individuals to be treated) that require introduction of the nucleic acid, and specifically humans, mice, rats, rabbits, dogs, monkeys, cows, horses, pigs. , Birds and the like.
  • an administration method to a living body an oral method or a parenteral method is used, and a parenteral method is usually employed.
  • parenteral methods include infusion such as intravenous infusion, intravenous introduction, intratracheal administration, and the like.
  • Each condition such as the dose, the number of administrations, and the administration period of the composition of the present invention can be appropriately set according to the type and condition of the test animal.
  • the composition of the present invention can be used for treatment (gene therapy) for introducing a desired nucleic acid into cells that cause various diseases. Therefore, according to the present invention, it is also possible to provide a pharmaceutical composition for various diseases and a treatment method (particularly a gene therapy method) using the pharmaceutical composition.
  • the administration method and conditions are the same as described above.
  • excipients for the above pharmaceutical compositions, excipients, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, buffering agents, preservatives, solubilizers commonly used in drug production.
  • An agent, an antiseptic, a flavoring agent, a soothing agent, a stabilizer, an isotonic agent and the like can be appropriately selected and used, and can be prepared by a conventional method.
  • the pharmaceutical composition is usually in the form of an injection (intravenous (including infusion), intramuscular, intraperitoneal), and is provided in the form of, for example, a unit dose ampoule or a multi-dose container. .
  • the composition of the present invention has low cytotoxicity, it can be used as a pharmaceutical composition that causes little or no side effects. That is, the cationic polymer used for gene transfer may damage cells (cell membranes), but the addition of glycosaminoglycan, an anionic polymer, to this polymer can be expected to reduce the damage. .
  • the present invention can simultaneously realize reduction of toxicity while maintaining high gene expression efficiency. It has become possible.
  • the present invention provides a nucleic acid delivery kit comprising the above composition.
  • the kit can be preferably used for gene therapy for various target cells such as cancer cells.
  • the storage state of the composition is not limited, and a solution state or a powder state can be selected in consideration of its stability (storage property) and ease of use.
  • the kit of the present invention may contain components other than the above composition. Examples of other components include various buffers, various nucleic acids to be introduced into cells (plasmid DNA, antisense oligo DNA, siRNA, etc.), lysis buffers, various proteins, and instructions for use (use manual). Can do.
  • the kit of the present invention is used for preparing a composition containing a desired nucleic acid to be introduced into target cells, and the prepared composition can be effectively used as a device for nucleic acid delivery to target cells.
  • the N terminal was acetylated with acetic anhydride, reprecipitated with diethyl ether, and dried to obtain a poly ( ⁇ -benzyl-L-aspartate) (PBLA) polymer.
  • PBLA poly ( ⁇ -benzyl-L-aspartate)
  • PBLA was dissolved in DMF, and diethylenetriamine corresponding to 50 times equivalent to the benzyl ester was added and reacted at 40 ° C. for 1 day.
  • the reaction solution was dropped into an acetic acid aqueous solution, placed in a dialysis tube, and dialyzed using 0.01N hydrochloric acid as an external solution.
  • PEG-PBLA polyethylene glycol-block-poly ( ⁇ -benzyl-L-aspartate)
  • ⁇ -benzyl-L-aspartate polyethylene glycol-block-poly ( ⁇ -benzyl-L-aspartate)
  • NMR N-terminal acetylation is performed with acetic anhydride to obtain polyethylene glycol-block-poly ( ⁇ -benzyl-L-aspartate) (PEG-PBLA). It was. From the analysis by NMR, the polymerization degree of the PBLA part was 68.
  • a block copolymer having a molecular weight of PEG of 12,000 and a polymerization degree of 68 in the PBLA part may be expressed as PEG-PBLA (12-68) (the number 12 in parentheses indicates the molecular weight of 12,000).
  • 68 represents the degree of polymerization).
  • PEG-PBLA (12-68) thus obtained was dissolved in benzene, freeze-dried, and then dissolved in DMF under an argon atmosphere.
  • 50-fold equivalent of diethylenetriamine dried and purified by distillation with respect to the benzyl ester was added and stirred at 40 ° C. for 24 hours under an argon atmosphere.
  • the reaction solution is added dropwise to 10% acetic acid, dialyzed against 0.1N HCl using a dialysis membrane with a molecular weight cut off of 3500, and the dialysis membrane solution is collected and freeze-dried to the following formula (V).
  • PEG-PAspDET A PEG-PAspDET block copolymer (hereinafter also referred to as “PEG-PAspDET” or “PEG-PAsp (DET)”) that can be represented by the structural formula shown was obtained as a white solid in the form of hydrochloride.
  • PEG-PAspDET A PEG-PAspDET block copolymer that can be represented by the structural formula shown was obtained as a white solid in the form of hydrochloride.
  • PEG-PAspDET polyethylene glycol-poly (N- (3-aminopropyl) -aminopropylaspartamide) block copolymer
  • a polyion complex (PIC) of plasmid DNA (pDNA) encoding the luciferase gene and each of the following polymers was prepared by mixing each polymer solution and the pDNA solution 30 minutes to 1 hour before transfection.
  • Each polymer solution contains a polymer prepared in a solid state in a concentration of 5500 ⁇ g / ml (PEG-PAspDET), 420 ⁇ g / ml (PAspDET), and 230 ⁇ g / ml (PEG-PLL) in 10 mM Tris-HCl buffer ( It was prepared by dissolving in pH 7.5).
  • Each polymer solution and the pDNA solution are mixed at a volume mixing ratio of 2: 1, and the polymer concentration in the obtained PIC is 1/3 of the above concentration.
  • the polymers used in this example are PEG-PAspDET (80), PAspDET (10), PEG-PLL (2) and Exgen 500 (linear polyethyleneimine (LPEI); MBI Fermentas) (10).
  • LPEI linear polyethyleneimine
  • MBI Fermentas MBI Fermentas
  • chondroitin sulfate was dissolved in pure water to prepare dissolution solutions with respective concentrations of 50 mg / ml, 5 mg / ml, and 0.5 mg / ml.
  • 1/10 volume of each solution was added to the solution containing PIC prepared as described above, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes.
  • the cells are HuH-7 cells (Riken cell bank) in a 96-well dish, 0.7 ⁇ 10. 3
  • the cells were plated with cells / well, incubated in DMEM containing 10% serum for 24 hours, and then used for transfection.
  • the medium was again replaced with 10% serum-containing DMEM (100 ⁇ l / well), and the prepared chondroitin sulfate-added complex or chondroitin sulfate-free complex was adjusted to 0.19 ⁇ g / well as the amount of pDNA. It was dripped in. After 48 hours incubation, luciferase gene expression was quantified. The results are shown in FIG. The data was expressed as a relative expression level when the expression of the complex with no chondroitin sulfate added was taken as 1. As shown in FIG. 1, when chondroitin sulfate was added to PEG-PAspDET / pDNA complex, it was revealed that the efficiency of gene transfer was greatly improved.
  • Example 2 Evaluation of stability of chondroitin sulfate-added DNA complex (Fig. 2) The stability of the complex after preparation was evaluated using the PAspDET / pDNA complex in which a significant increase in gene expression was observed in Example 1. In the same manner as in Example 1, each sample with and without chondroitin sulfate (concentration of chondroitin sulfate solution used was 50 mg / ml) and without addition were allowed to stand overnight at 37 ° C.
  • transvenous gene transfer into mouse skeletal muscle (Fig. 5)
  • transvenous gene introduction into mouse limb skeletal muscle was performed as an application to in vivo delivery.
  • hydrodynamics is performed by injecting a sample from the lower limb vein in a state where the proximal femur is preliminarily blocked and the venous perfusion is temporarily interrupted, and the gene is incorporated into the skeletal muscle by temporarily increasing the internal pressure. It is a gene transfer method based on the principle of the law.
  • the experiment was performed using 6-8 week-old mice and injecting complex (PAspDET / pDNA, PEG-PAspDET / pDNA, PEG-PLL / pDNA) prepared as described in Example 1 from the saphenous vein of the lower limb. went.
  • the dose of pDNA was 50 ⁇ g / animal.
  • Luciferase gene expression was observed with IVIS (Xenoxen: in vivo imaging system) (FIG. 5A).
  • the muscle sample was extracted and the expression of the luciferase protein from the extracted protein was quantified (FIG. 5B).
  • Example 6 In vivo delivery: intratracheal administration to mouse lung tissue (FIGS. 6-8) Samples obtained by adding chondroitin sulfate to PEG-PAspDET / pDNA and PEG-PAspDET / pDNA (chondroitin sulfate-added DNA complex) were used for intratracheal administration to mouse lung tissue. In both cases, the amount of DNA was 10 ⁇ g / animal. Three days after administration, lung tissue was removed and luciferase gene expression was evaluated (FIG. 6).
  • the expression level of the luciferase gene increased in the chondroitin sulfate-added DNA complex (the concentrations of the chondroitin sulfate (CS) solution used were 0.5 mg / mL and 5 mg / mL) as compared with the control. (FIG. 6). From this, it was shown that chondroitin sulfate addition also works effectively to improve gene transfer efficiency in intratracheal administration to lung tissue. Since it is considered that stabilization of complex by addition of chondroitin sulfate contributes to such improvement in gene transfer efficiency, the present invention was strongly shown to be effective in many in vivo administration systems.
  • the expression level of inflammatory cytokines in the lung tissue one day after administration was evaluated by quantitative PCR.
  • the expression levels of TNF ⁇ and IL-6 were lower than in the chondroitin sulfate-free DNA complex.
  • the chondroitin sulfate 50 mg / ml added sample significantly suppressed the production of TNF- ⁇ compared to the chondroitin sulfate non-added sample.
  • a mouse subcutaneous tumor transplantation model was prepared using pancreatic cancer-derived cell BxPC3 (American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)), and in the same manner as in Example 5, a intravenous gene to the model mouse skeletal muscle
  • the introduction method was used to suppress tumor growth by administration of sFlt-1 expression plasmid DNA (pDNA).
  • sFlt-1 is a soluble part of the receptor for VEGF (Flt-1), which is an angiogenic factor.
  • Flt-1 a soluble part of the receptor for VEGF
  • This example shows that sFlt-1 is remotely overexpressed using the composition of the present invention, thereby capturing VEGF actively produced from tumor cells and suppressing angiogenesis that feeds the tumor.
  • BxPC3 cells were transplanted subcutaneously on the back of the mouse, and after 3 weeks, the engraftment of the tumor tissue was confirmed, and then the following experiment was performed.
  • a gene carrier using PEG-PAspDET and chondroitin sulfate was prepared in the same manner as in Example 5 (FIG. 5). The prepared complex was administered twice to each of five mice, that is, 50 ⁇ g each as pDNA amount to the right lower limb on the first day (Day 0) and to the left lower limb one week later (Day 7).
  • the tumor diameter of the mice was measured every 3 or 4 days, including 5 mice that were not administered.
  • the tumor diameter at Day 0 of each mouse was taken as 1, and the subsequent tumor size was displayed relatively (FIG. 9).
  • the growth rate of the tumor size was significantly reduced in the mice into which sFlt-1-expressing pDNA was introduced (FIG. 9).
  • the tumor tissue was collected one week after administration of sFlt-1-expressing pDNA or Luciferase-expressing pDNA in the same manner as described above, and the vascular endothelium was collected.
  • PECAM-1 platelet endothelial cell adhesion molecule-1
  • composition of the present invention effectively functions as a carrier for nucleic acids to target cells and can be used for treatment of various diseases.
  • HIF hypoxia-inducible factor
  • HIF-1, HIF-2, HIF-3, etc. are known in the HIF family.
  • HIF-1 is a heterodimer composed of an ⁇ subunit and a ⁇ subunit, and functions as a central regulator of oxygen homeostasis. It is known that the production of angiogenic factors such as VEGF, FGF2, and Ang-1 is directly or indirectly induced by the ⁇ subunit of HIF-1 (HIF-1 ⁇ ).
  • HIF-1 ⁇ is hydroxylated by prolyl hydroxylase domain-2 (PHD2), and the hydroxylated HIF-1 ⁇ is subsequently degraded by the E3 ubiquitin ligase complex.
  • PHD2 heterodeficient mice have shown that tumor metastasis is suppressed through normalization of vascular endothelium, suggesting that inhibiting PHD2 leads to cancer treatment (Mazzone M et al., Cell 136: 839-851, 2009).
  • the inventors of the present invention introduced a PHD2-siRNA expression plasmid into mouse fibroblasts and attempted to silence the PHD2 gene.
  • RNA expression plasmid As a polyanionic substance that suppresses the expression of PHD2, an siRNA expression plasmid for mouse PHD2 was constructed. An oligonucleotide having the following base sequence was used as the sense strand of DNA corresponding to the siRNA for mouse PHD2.
  • an oligonucleotide consisting of a base sequence of 21 bases having no homology with the mouse gene was used as a sense strand of DNA corresponding to the control siRNA. These oligonucleotides were all purchased from Hokkaido System. Then, according to the attached protocol, the expression vector pSilencer2.1-U6 (No. 5762, manufactured by Ambion) incorporating the human U6 promoter or the expression vector pSilencer 4.1-CMV (No. 5775) incorporating the cytomegalovirus promoter is incorporated.
  • each of the oligonucleotides was linked to construct a siRNA (shRNA) expression plasmid for mouse PHD2 and a control siRNA (shRNA) expression plasmid.
  • siRNA siRNA
  • shRNA siRNA expression plasmid for mouse PHD2
  • siRNA siRNA expression plasmid for control siRNA (shRNA) expression plasmid.
  • the following experiment was performed using the expression vector of siPHD2-A.
  • Synthesis of polycationic chargeable polymers The same poly (N- (2-aminoethyl) -aminoethylaspartamide) as produced in Production Example 1 was used. 2-2.
  • Polyethylene glycol-poly (N- (2-aminoethyl) -aminoethylaspartamide) block copolymer The same PEG-PAsp (DET) block copolymer as that produced in Production Example 2 was used. 2-3. Synthesis of polyethylene glycol-polylysine block copolymer N ⁇ -ZL-lysine N carboxylic acid anhydride was polymerized using polyethylene glycol having a primary amino group at one terminal as an initiator. A polyethylene glycol-poly (N ⁇ -ZL-lysine) block copolymer (PEG-PLL (Z)) produced by dropping the reaction solution into cold ether was collected by filtration.
  • PEG-PLL (Z) polyethylene glycol-poly (N ⁇ -ZL-lysine) block copolymer
  • PEG-PLL (Z) is dissolved in trifluoroacetic acid, deprotection reaction is performed using HBr acetic acid, polyethylene glycol-polylysine block copolymer (hereinafter referred to as “PEG-PLL”) by ether reprecipitation, dialysis and lyophilization. Also called).
  • PEG-PLL polyethylene glycol-polylysine block copolymer
  • Each polymer solution contains a polymer prepared in a solid state with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7) so that the concentration is 5500 ⁇ g / ml (PEG-PAsp (DET)) and 230 ⁇ g / ml (PEG-PLL). .5) and dissolved.
  • PEG-PAsp PEG-PAsp
  • PEG-PLL PEG-PLL
  • the numbers in parentheses for each polymer indicate the N / P ratio.
  • the final DNA concentration was 33.3 ⁇ g / ml.
  • a polyion complex to which chondroitin sulfate (chondroitin sulfate A sodium salt: Sigma) was added was prepared as follows. First, chondroitin sulfate was dissolved in pure water to prepare a chondroitin sulfate solution having a concentration of 50 mg / ml. Next, 1/10 volume of the chondroitin sulfate solution was added to the solution containing the polyion complex of each plasmid and each polymer prepared as described above, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes. 4).
  • mice Eight-week-old male Balb / c mice were purchased from Oriental Yeast Co., Ltd. All mice were bred with free intake of sterilized feed and sterilized water. All animal studies were conducted according to the principles of the University of Tokyo guidelines on animal experiments. 5). Effects of shPHD2 administration in ischemic model mice Using an 8-week-old male Balb / c mouse, a left lower limb ischemia model mouse was prepared by ligating the origin of the femoral artery of the left lower limb. These mice were divided into 4 groups of 5-6 animals per group, and on the first day after ligation of the femoral artery, the following compositions (A) to (D) were applied to the left lower limbs of each group of mice.
  • FIG. 11 shows a control shRNA expression plasmid using a polyethylene glycol-poly (N- (2-aminoethyl) -aminoethylaspartamide) block copolymer (PEG-PAsp (DET)).
  • PEG-PAsp polyethylene glycol-poly (N- (2-aminoethyl) -aminoethylaspartamide) block copolymer
  • B is a state in which a PHD2 shRNA expression plasmid is administered without using a polycation chargeable polymer
  • C is a polyethylene glycol-polylysine block copolymer (PEG-PLL).
  • FIG. 11 shows the mouse
  • shPHD2 of (B) to (D) the left lower limb was preserved without any problem in appearance in all mice.
  • shCont of (A) the left lower limb of the mouse was not preserved, necrotic and disappeared in appearance.
  • Example 9 Analysis of blood flow state in ischemic model mice Left lower limb ischemia in four groups of (A) shCont + PEG-PAsp (DET), (B) naked shPHD2, (C) shPHD2 + PEG-PLL, and (D) shPHD2 + PEG-PAsp (DET) treated as in Example 8.
  • A shCont + PEG-PAsp
  • B naked shPHD2
  • C shPHD2 + PEG-PLL
  • D shPHD2 + PEG-PAsp
  • FIG. 12 shows a state in which a control shRNA expression plasmid was administered using PEG-PAsp (DET), and (B) shows a PHD2 shRNA expression plasmid without using a polycation chargeable polymer.
  • (C) is a state in which a shRNA expression plasmid of PHD2 is administered using PEG-PLL
  • (D) is a shRNA expression of PHD2 using PEG-PAsp (DET). It is a figure which shows the state which administered the plasmid. As shown in the photograph of FIG. 12, the mice in the group (A) showed no blood flow in the left lower limb from the third day after the treatment, and the left lower limb became necrotic and disappeared after the seventh day. The state is shown. In contrast, the mice in groups (B) to (D) all had blood flow in the left lower limb on the 21st day after treatment.
  • Example 10 Quantification of blood flow in ischemia model mice The left lower limb imaginary of four groups of (A) shCont + PEG-PAsp (DET), (B) Naykit shPHD2, (C) shPHD2 + PEG-PLL, and (D) shPHD2 + PEG-PAsp (DET) treated as in Example 8. Blood model mice were subjected to blood flow measurement using a laser Doppler.
  • the blood flow quantification value indicates the ratio of the blood flow measurement value of the treated leg to the blood flow measurement value of the untreated leg, and shows the average value and the standard deviation.
  • (A) uses a polyion complex containing a control shRNA expression plasmid in PEG-PAsp (DET)
  • (B) uses only a PHD2 shRNA expression plasmid
  • (D) shows PEG -It is a figure which used the polyion complex containing the shRNA expression plasmid of PHD2 in PAsp (DET).
  • PEG-It is a figure which used the polyion complex containing the shRNA expression plasmid of PHD2 in PAsp (DET).
  • (A) uses a polyion complex containing a control shRNA expression plasmid in PEG-PAsp (DET), and (C) shows a PHD2 shRNA expression plasmid in PEG-PLL.
  • (D) shows that a polyion complex containing a PHD2 shRNA expression plasmid in PEG-PAsp (DET) was used. From the results of FIG. 13, in the mice of group (D), more blood flow was observed on the third day after treatment than immediately after the treatment, and the amount increased with time, and on day 21, the same as before the treatment. It was shown to have a moderate blood flow.
  • PAsp (DET) is adjusted to have an amine concentration of about 230 ⁇ M (about 5 times the concentration used in normal transfection), and hyaluronic acid and chondroitin sulfate A have a combined concentration of carboxyl and sulfate groups of 46 ⁇ M. Adjusted as follows. NIH3T3 was seeded at 10,000 / well in a 96-well plate, and after 24 hours, a solution of polymer and YO-PRO1 (1 ⁇ M) in PBS was administered. After 20 minutes, hoechst was administered to a final concentration of 2.5 ⁇ g / ml, and 10 minutes later, the fluorescence intensity of nuclear YO-PRO1 was observed with an intracellular analyzer (GE Healthcare).
  • NIH3T3 was seeded at 10,000 / well in a 96-well plate, and after 24 hours, a solution of polymer and YO-PRO1 (1 ⁇ M) in PBS was administered. After 20 minutes, hoechst was
  • the composition of the present invention contributes to the reduction of tissue injury and the suppression of inflammation (FIG. 15, D + HA10 or D + CS10).
  • SEQ ID NO: 1 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 2 Synthetic DNA

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Abstract

本発明は、核酸の導入効率及び安全性が改善された新規核酸キャリアを提供し、ポリカチオン荷電性ポリマー及びグリコサミノグリカンを含むことを特徴とする、標的細胞に核酸をデリバリー可能な組成物に関する。

Description

核酸デリバリー用組成物
　本発明は、核酸を標的細胞にデリバリー可能な新規組成物に関する。
　ヒトゲノムの解読が完了した現在、遺伝情報と病気との相関が解明されつつある。そのような中で、遺伝子を薬として用い、遺伝子レベルで治療を行う遺伝子治療は、これまで治療が困難であった種々の疾患に対する治療法として大きな期待が寄せられている。遺伝子治療の達成のためには、遺伝子を安定に標的部位へ輸送するキャリアの開発が不可欠であり、従来から広く検討されている。キャリアに求められている特性は、１）血中での安定性、２）細網内皮系による取り込みや腎排泄の回避、３）標的細胞への選択的取り込み、４）細胞質内へのスムーズな移行、５）低毒性などが挙げられる。つまり、標的細胞に取り込まれるまでは安定に遺伝子を内包するが、細胞（細胞質）に取り込まれた後はスムーズに遺伝子を放出するという、相反する２つの特性を兼ね備えている必要がある。感染能に優れたウィルスベクターは、そのような特性を備えた遺伝子キャリアとしての性質を満たすものであるが、免疫原性や細胞の癌化のリスクにより安全性が問題とされているため、非ウィルス型の遺伝子キャリアに注目が集まっている。
　非ウィルス型核酸キャリアとしては、これまでに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリカチオン（カチオン性のポリペプチド）から構成されるブロックコポリマーと、ポリアニオンである核酸との間の静電的相互作用により形成されたミセル状のポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）が報告されている（特許文献１、非特許文献１及び非特許文献２を参照）。
　このＰＩＣは、例えば血中でも核酸を安定に内包することができる。しかも、粒径がウィルスと同程度（約１００ｎｍ）であるため、生体内の異物認識機構を回避することができる。
さらに、ブロックコポリマー中のポリカチオンの側鎖に含まれるエチレンジアミンユニット（−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２）が、２段階のｐＫａを有しているため、核酸とのコンプレックスが形成されながら、細胞内ではプロトンスポンジ効果によりエンドソームエスケープが促進されるという効果も有する。上記ＰＩＣは、このような特性により核酸導入効率の向上が図られたものである。
　しかしながら、ウィルスベクターに代わる非ウィルス性の核酸キャリアを臨床応用することが強く求められている中で、核酸を標的部位にデリバリーするためのさらなる手段を開発する必要性は、依然として存在している。特に、核酸の導入効率の改善や、キャリアを構成する脂質、カチオン性ポリマーに由来する細胞毒性の改善などが求められている。
国際公開第２００６／０８５６６４号パンフレット
Ｓ．Ｋａｔａｙｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，８，７０２−７０７（１９９７） Ｓ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，２８１０−２８１１（２００５）
　上記のように、核酸をデリバリーするために最適なキャリアの開発が求められており、特に、核酸の導入効率及び安全性の面で、より優れたキャリアを開発する必要がある。したがって、本発明の課題は、核酸の導入効率及び安全性が改善された新規核酸キャリアを提供することにある。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、ポリカチオン荷電性ポリマー及びグリコサミノグリカンと核酸とを混合することによって調製される非ウィルス性の組成物は、標的細胞への高い核酸導入効率とともに、高い安定性及び生体適合性を示すことを見出し、本発明を完成した。
　したがって、本発明は以下に関する。
　（１）ポリカチオン荷電性ポリマー及びグリコサミノグリカンを含む、標的細胞への核酸デリバリー用組成物。
　（２）核酸、ポリカチオン荷電性ポリマー及びグリコサミノグリカンを含む組成物を、標的細胞と接触させることを含む、当該細胞への当該核酸のデリバリー方法。
　上記（１）及び（２）において、ポリカチオン荷電性ポリマーは、ポリ（アミノ酸）、多糖、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン又はビニルポリマーをベースとする主鎖を有し、かつ、側鎖として、当該主鎖に直接又は連結基を介して結合した式−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２で表される基（ここで、ａ及びｅはそれぞれ独立して、１~５の整数である）を含む荷電性ポリマー由来のセグメント鎖を有するポリマーである。
　本発明において、上記ポリカチオン荷電性ポリマーとしては、前記荷電性ポリマー由来のセグメント鎖と非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖とを有するブロックコポリマーを挙げることができる。
　ここで、前記非イオン性親水性ポリマーは、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）及びポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）からなる群より選ばれる。
　本発明において、前記ポリカチオン荷電性ポリマーが、例えば、下記の一般式（ＩＩＩ）で表される荷電性ポリマー、下記の一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表されるブロックコポリマー、又はそれらの塩を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
（式中、
　Ｒ１０は、水酸基、オキシベンジル基又はＮＨ−Ｒ１１基を表し、ここでＲ１１は置換されていてもよい直鎖又は分枝のＣ１−２０アルキル基を表し、
　Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよい直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、
　Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄは、それぞれ独立して、メチレン基又はエチレン基を表し、
　Ｒ３は水素原子を表し、
　Ｒ４は、水酸基、又は−Ｏ−Ｘ３、−Ｓ−Ｘ３もしくは−ＮＨ−Ｘ３で表される基を表し、ここでＸ３は一級、二級もしくは三級アミン化合物もしくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表し、
　Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ、及びＲ５ｄは、それぞれ独立して、水酸基、オキシベンジル基、又はＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでａは１~５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して、一級、二級もしくは三級アミン化合物もしくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表し、Ｒ５ａＲ５ｂの総数又はＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ｅは１~５の整数である）であるものが少なくとも２つ以上存在し、
　Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基であり、ここで保護基はＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
　Ｌ１及びＬ２は、連結基を表し、
　ｍは５~２０，０００の整数であり、
　ｎは２~５，０００の整数であり、
　ｙは０~５，０００の整数であり、
　ｚは０~５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとし、
　また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。
　また、本発明において、好ましいグリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸である。
　本発明の組成物を用いることにより、標的細胞へ核酸を効率的に導入することが可能となった。
　また、本発明により、安定性及び生体適合性に優れた核酸キャリアが提供される。
　図１は、コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘによる細胞への遺伝子導入効率を示す図である。
　図２は、コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘの安定性の向上を示す図である。
　図３は、コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘの調製法の違いによる影響を評価した図である。
　図４は、コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘの調製法の違いによるｃｏｍｐｌｅｘ性状を評価した図である。
　図５は、Ｉｎ　ｖｉｖｏデリバリーへの応用として、マウス骨格筋への経静脈遺伝子導入実験の結果を示す図である。
　図６は、コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘをマウス肺組織へ気管内投与したときの遺伝子発現量の測定結果を示す図である。
　図７は、マウス肺組織への気管内投与後のＴＮＦ−α発現量を示す図である。
　図８は、マウス肺組織への気管内投与後のＩＬ−６発現量を示す図である。
　図９は、ｓＦｌｔ−１　ｐＤＮＡ／ＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴ／ＣＳ　ｃｏｍｐｌｅｘの投与による腫瘍増殖抑制効果を示す図である。
　図１０は、ｓＦｌｔ−１　ｐＤＮＡ／ＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴ／ＣＳ　ｃｏｍｐｌｅｘを投与したマウス腫瘍組織のＰＥＣＡＭ−１染色像（Ａ）及びＰＥＣＡＭ−１陽性領域の定量結果（Ｂ）を示す図である。
　図１１は、実施例１に基づいて虚血処置を行った後の２１日目におけるマウス下肢の状態を示す図である。
　図１２は、虚血処置を行った後、各種被検試料を投与したマウス下肢の血流状態を示す図である。
　図１３は、虚血処置を行う前とその後の時間におけるマウス下肢の血流定量値を示す図である。
　図１４は、虚血処置を行う前とその後の時間におけるマウス下肢の血流定量値を示す図である。
　図１５は、本発明の組成物による膜障害性軽減効果を示す図である。
　以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更して実施し得る。
　なお、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献、公開公報、特許公報およびその他の特許文献は、その全体が本明細書において参考として組み込まれる。本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００９−０５２８０４号（２００９年３月６日出願）明細書の内容を包含する。
　本発明者は、核酸キャリアによる標的細胞への核酸導入効率を向上させるための研究において、ポリカチオン荷電性ポリマーは、グリコサミノグリカン及び核酸を添加した３種混合コンプレックスとして用いた場合に、グリコサミノグリカンを添加しない場合に比べて、標的細胞での遺伝子発現が顕著に増大することを見出した。
　したがって、本発明は、ポリカチオン荷電性ポリマー及びグリコサミノグリカンを含むことを特徴とする、標的細胞に核酸をデリバリー可能な組成物を提供する。また、本発明の組成物を用いて核酸を標的細胞に導入する方法を提供する。
　また、本発明者は、ポリカチオン荷電性ポリマー、グリコサミノグリカン及び核酸の３種混合コンプレックスは、安定であり、長期間にわたり遺伝子発現能が維持されることを見出した。つまり、本発明者は、グリコサミノグリカンは、ポリカチオン荷電性ポリマーと核酸とのコンプレックス（ＰＩＣ）を安定化し得ることを明らかにした。
　したがって、本発明は、安定性に優れた核酸デリバリー用の組成物を提供する。また、本発明は、グリコサミノグリカンを、ポリカチオン荷電性ポリマーと核酸とのコンプレックスに接触させることを含む、前記コンプレックスの安定化方法を提供する。
　また、本発明の組成物は、静脈、骨格筋、皮下、肺など多様な経路で動物に適用することが可能である。さらに、本発明の組成物は、動物に適用される場合、従来の核酸キャリアを使用したときに比べて、組織傷害や炎症惹起が顕著に軽減される特性を有している。
　したがって、本発明は、利便性が高く、また、副作用が少なく生体適合性の向上した核酸デリバリー用の組成物を提供する。
　このように、本発明の特徴は、コンドロイチン硫酸に代表される生体適合性高分子グリコサミノグリカンを核酸キャリアに適用することにより、非ウィルス性キャリアの核酸導入効率と安全性を著しく向上させ、非ウィルス性の核酸デリバリーシステムの機能を高める点にある。
　そして、本発明の組成物は創薬として利用され得るため、本発明は極めて高い産業上の利用価値を有するものといえる。また、本発明の組成物は新規治療分野の展開を可能にするものであるため、医療経済的にも本発明の意義は大きいものといえる。
１．ポリカチオン荷電性ポリマー
　本発明で使用するポリカチオン荷電性ポリマーは、荷電性ポリマー由来のセグメント鎖を有するポリマー又はその塩である。ポリカチオン荷電性ポリマーは、荷電性のホモポリマーであってもよい。
　また、本発明で使用するポリカチオン荷電性ポリマーは、荷電性ポリマー由来のセグメント鎖及び非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖を有するブロックコポリマー、又はその塩であってもよい。
（１）荷電性ポリマー
　本発明において、荷電性ポリマーは、ポリ（アミノ酸）、多糖、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン又はビニルポリマーをベースとする主鎖を有し、かつ、側鎖として、当該主鎖に直接又は連結基を介して結合した式−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＨ−（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２で表される基（ここで、ａ及びｅは、それぞれ独立して、１~５の整数である）を含む。
　ここで、「ポリ（アミノ酸）をベースとする主鎖を有し」とは、好ましくは、天然又は合成アミノ酸間のペプチド結合を介して形成されるポリアミノ酸をポリマーの主鎖として含むことを意味する。
　本発明において、荷電性ポリマーがカチオン性であるためには、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸は、カチオン性基を側鎖に有するアミノ酸であることが好ましい。なお、ここで言うカチオン性基は、水素イオンが配位して既にカチオンとなっている基に限らず、水素イオンが配位すればカチオンとなる基も含まれる。このようなカチオン性基としては、公知のものが全て含まれる。カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドは、塩基性側鎖を有する公知のアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸等）がペプチド結合してなるもののほか、各種アミノ酸がペプチド結合し、その側鎖がカチオン性基を有するように置換されたものも含む。
　また、「多糖をベースとする主鎖を有する」とは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、キトサン又はポリガラクトサミン等の糖連鎖をポリマーの主鎖として含むことを意味する。「ビニルポリマーをベースとする主鎖を有する」とは、不飽和エチレン性重合性モノマーの重合により形成される重合鎖をポリマーの主鎖として含むことを意味する。
　荷電性ポリマーに含まれる側鎖は、式−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２で表される基（ここで、ａ及びｅは、それぞれ独立して、１~５の整数である）を含み、前記主鎖に直接又は連結基を介して結合する。
　このような側鎖は、主鎖がポリ（アミノ酸）をベースとする場合には、例えば、アミノ酸のベーターもしくはガンマー位に存在するカルボキシル基やε−位のアミノ基等を介して主鎖に結合する。主鎖が多糖をベースとする場合には、例えば、糖部分のヒドロキシ基、アミノ基もしくはカルボキシル基を介して主鎖に結合し、主鎖がビニルポリマーをベースとする場合には、例えば、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）もしくはポリ（メタクリル酸）等のヒドロキシ基、もしくはアミド基カルボキシル基を介して主鎖に結合する。
　主鎖と側鎖の結合反応としては、ハロゲンに対する置換反応、カルボキシル基又はアミノ基を利用した縮合反応、エステルに対するエステル交換反応又はアミノリシス等も用いられる。また、側鎖と主鎖の結合は，例えば、Ｃ１−２２アルキレン鎖を含む連結基を介してもよい。
　なお、本明細書において「Ｃ１−２２アルキレン鎖」としては、炭素数が１~２２の直鎖又は分枝のアルキレン基を意味する。本発明において、Ｃ１−２２アルキレン鎖は置換されていてもよい。
　本発明において、連結基は例えば、１~１０個の酸素又は硫黄で中断されていてもよい。連結基を介して側鎖と主鎖とが結合する場合、側鎖は、通常、高分子反応によりポリマーに導入されるが、それに限定されるものでない。
　このようにして製造されるポリマーの分子量は、本発明の目的を達成できるものであれば限定されないが、下限は、通常１０００以上、好ましくは１５，０００以上、より好ましくは１８，０００以上であり、例えば２３，０００以上または２８，０００以上であってもよい。上限は、通常２００，０００以下、好ましくは４５，０００以下であり、例えば３４，０００以下、３０，０００以下または２２，０００以下であってもよい。
　本発明のより具体的な態様において、荷電性ポリマーは、下記の一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマー又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　ここで、Ｒ１０は、水酸基、オキシベンジル基又はＮＨ−Ｒ１１基を表す。Ｒ１１は置換されていてもよい直鎖もしくは分枝のＣ１−２０アルキル基を表す。
　本発明において、Ｒ１１は置換されていない直鎖又は分枝のＣ１−２０アルキル基が好ましい。
　また、本発明において、Ｒ１１のＣ１−２０アルキル基は一つ以上の置換基で置換されていてもよい。例えば、Ｃ１−２０アルキル基は、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基及びトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基（各アルキル基はそれぞれ同一又は異なっていてもよい）からなる群より選ばれる置換基で置換されていてもよい。
　本明細書において「Ｃ１−２０アルキル基」とは、炭素数が１~２０の直鎖又は分枝のアルキル基を意味する。
　本発明において、Ｃ１−２０アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル及びウンデシル等が挙げられる。
　本明細書において「Ｃ１−６アルコキシ基」とは、直鎖又は分枝のＣ１−６アルキル基の末端に酸素原子が結合した基を意味し、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉｓｏ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基及びｎ−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
　本明細書において「Ｃ１−６アルコキシカルボニル基」とは、上記の「Ｃ１−６アルコキシ基」が結合したカルボニル基を意味し、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、１−プロポキシカルボニル基、２−プロポキシカルボニル基、２−メチル−２−プロポキシカルボニル基などがあげられる。
　本明細書において「Ｃ２−７アシル基」とは、直鎖又は分枝のＣ１−６アルキル基が結合したカルボニル基であることを意味し、具体例としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基、イソプロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基などがあげられる。
　本明細書において「Ｃ２−７アシルアミド基」とは、上記の「Ｃ２−７アシル基」が
結合したアミノ基を意味する。
　なお、一般式（ＩＩＩ）に含まれるＲ１０以外の基については、後述する。
　なお、一般式（ＩＩＩ）における各繰り返し単位は、記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。例えば、荷電性ポリマーは、一般式（ＩＩＩ）における各繰り返し単位がＮ末端側から始まるポリ（アミノ酸）をベースとする主鎖であってもよい。
　さらに、上記の一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマーは、本発明の一態様として、該一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマーの塩であってもよい。
　本発明において、塩は特に限定されるものではないが、対イオンとしてＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、（１／２ＳＯ４）−、ＮＯ３ −、（１／２ＣＯ３）−、（１／３ＰＯ４）−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＨ３ＳＯ３ −、又はＣＦ３ＳＯ３ −等との塩があげられる。
（２）非イオン性親水性ポリマー
　本発明において、非イオン性親水性ポリマーは、非イオン性であり、かつ、親水性のポリマーであれば特に限定されない。
　本発明において、非イオン性親水性ポリマーは、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）及びポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）からなる群より選ばれる。本発明において好ましい非イオン性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。
　非イオン性親水性ポリマーは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４号公報、ＷＯ９６／３３２３３号公報又はＷＯ９７／０６２０２号公報に記載の製法を用いて調製することができる。
（３）ポリカチオン荷電性ポリマー
　本発明の一態様において、本発明で使用するポリカチオン荷電性ポリマーは、上記一般式（ＩＩＩ）で表される荷電性ホモポリマー又はその塩である。
　本発明の別の態様において、本発明で使用するポリカチオン荷電性ポリマーは、上記荷電性ポリマー由来のセグメント鎖及び非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖を有するブロックコポリマー、又はそれらの塩である。
　このようなブロックコポリマーの具体例として、一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表されるブロックコポリマー、又はそれらの塩をあげることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
（ｉ）Ｒ１ａ及びＲ１ｂ
　上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよい直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表す。
　本明細書において「Ｃ１−１２アルキル基」としては、炭素数が１~１２の直鎖又は分枝のアルキル基を意味する。
　本発明において、Ｃ１−１２アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル及びデシル等が挙げられる。
　また、本発明において、アルキル基は一つ以上の置換基で置換されていてもよい。置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基及びトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基（各アルキル基はそれぞれ同一又は異なっていてもよい）等が挙げられる。
　ここで、アセタール化は、ホルミル基のカルボニルの保護方法の一つであり、ホルミル基のカルボニルと、例えば、炭素数１~６個のアルカノール２分子又は炭素原子数２~６個の分枝していてもよいアルキレンジオールとの反応によりアセタール部が形成されること意味する。
　置換基は、適切な条件下で別の基に転化することができる。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基（アルデヒド基；−ＣＨＯ）に転化することができる。
　また、置換基がホルミル基、又はカルボキシル基もしくはアミノ基の場合は、例えば、これらの基を介して、抗体もしくはその特異結合性を有する断片（Ｆ（ａｂ′）２、Ｆ（ａｂ）、等）などと結合することにより、機能性もしくは標的指向性をキャリアに付与するのに利用することができる。
　本発明において、好ましいＲ１ａ及びＲ１ｂは、メチル基である。
（ｉｉ）Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄ
　Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄは、それぞれ独立して、メチレン基又はエチレン基を表し、好ましくはメチレン基である。
　Ｒ２ａ及びＲ２ｂのいずれもがメチレン基の場合は、反復単位の主鎖は、ポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、また、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。また、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄのいずれもがメチレン基の場合は、反復単位の主鎖は、ポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。
　これらの一般式中、Ｒ２ａ及びＲ２ｂ、又はＲ２ｂ及びＲ２ａがそれぞれメチレン基及びエチレン基を表す場合、あるいはＲ２ｃ及びＲ２ｄ、又はＲ２ｄ及びＲ２ｃがそれぞれメチレン基及びエチレン基を表す場合、アスパラギン酸誘導体及びグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。
（ｉｉｉ）Ｒ３
　Ｒ３は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表す。
　ここで、「保護基」は、アミノ基の保護基として通常用いられている基であればとくに限定されない。本発明において、保護基は、例えば、Ｚ基（ベンジルオキシカルボニル基）、Ｂｏｃ基（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基）、アセチル基及びトリフルオロアセチル基等である。
　また、本発明において、疎水性基は、限定されるわけではないが、例えば、アルキル基、シクロアルキル基又はアリール基を挙げることができる。
　また、本発明において、重合性基は、重合反応を起こす官能基であればよく、例えば、不飽和炭化水素基が挙げられるがこれに限定されない。より具体的には、重合性基は、ビニル基、アリル基、アクリル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、プロペニル基、ビニリデン基、ビニレン基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルコキシ基などである。
　本発明の一態様において、Ｒ３は、アセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基が好ましい。
　また、本発明の別の態様において、Ｒ３は、水素原子が好ましい。
（ｉｖ）Ｒ４
　Ｒ４は、水酸基、保護基、−Ｏ−Ｘ３，−Ｓ−Ｘ３もしくは−ＮＨ−Ｘ３で表される基、又はポリ（アミノ酸）の重合開始剤残基を示す。
　ここで、保護基は、末端カルボキシル基の保護基として用いられる基であればよく、例えばカルボキシル基と共にアルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステルなど）又はベンジルエステルを形成する基が挙げられるが、これに限定されるわけではない。
　また、Ｘ３は特に限定されるものではないが、このましくは目的のポリマー合成の一連の反応を妨害しない化合物残基であることが望ましい。例えば、Ｘ３としては、例えば一級、二級もしくは三級アミン化合物もしくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を挙げることができる。
　本明細書において「開始剤」とは、ポリ（アミノ酸）の重合反応を開始させる際に使用する物質を意味し、例えばブチルアミンを挙げることができる。また「開始剤残基」は、重合反応の結果としてポリマーに含まれる開始剤由来の残基を意味する。
　本発明において、好ましいＲ４は、−ＮＨ−Ｒ９である。ここで、Ｒ９は置換されていてもよい直鎖又は分枝のＣ１−２０アルキル基である。
（ｖ）Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ及びＲ５ｄ
　Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ及びＲ５ｄは、それぞれ独立して、水酸基、オキシベンジル基、又はＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表す。ここで、ａは１~５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して、一級、二級もしくは三級アミン化合物もしくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表す。
　さらに、一般式（Ｉ）~（ＩＩＩ）において、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数又はＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち少なくとも２つ以上は、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ｅは１~５の整数である）である。
　ここで、総数とは、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表されるブロックコポリマー又は一般式（ＩＩＩ）で表される荷電性ポリマーに含まれる全ての「Ｒ５ａ及びＲ５ｂ」の数又は「Ｒ５ｃ及びＲ５ｄ」の数を意味する。
　本発明の別の態様においては、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数又はＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち、これらの基が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘが（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ｅは１~５の整数である）であるものが５０％以上、さらには８５％以上存在するブロックコポリマーを使用するのが好ましい。
　また、本発明の別の態様においては、一般式（Ｉ）~（ＩＩＩ）で表されるポリカチオン荷電性ポリマーに含まれるＲ５ａとＲ５ｂのすべて、又はＲ５ｃとＲ５ｄのすべてが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ａが２又は３であり、ｅは１~３の整数、特に好ましくはｅが１である）であることが好ましい。
　また、本発明において、Ｘは、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、及び下記の式で表される基等が好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　上記の各式中、Ｘ２は水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はアミノＣ１−６アルキル基を表し、
　Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びＲ７ｃは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、
　ｄ１、ｄ２及びｄ３は、それぞれ独立して、１~５の整数を表し、
　ｅ１、ｅ２及びｅ３は、それぞれ独立して、１~５の整数を表し、
　ｆは０~１５の整数を表し、
　ｇは０~１５の整数を表す。
　Ｒ８ａ及びＲ８ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基を表し、ここで、保護基は、通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれる。
　本発明において、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ及びＲ５ｄは、−ＮＨ−ＮＨ２又は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２が特に好ましく、中でもジエチレントリアミンユニットを含む−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２がより好ましい。
（ｖｉ）Ｒ６ａ及びＲ６ｂ
　Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基である。ここで、保護基は通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれる。
（ｖｉｉ）Ｌ１及びＬ２
　Ｌ１及びＬ２は、連結基を表す。
　一般式中、リンカー部分となるＬ１は、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−又は式：−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−（ここでｂは１~５の整数である）で表される基が好ましい。
　一般式中、リンカー部分となるＬ２は、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−又は式：−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−（ここでｃは１~５の整数である）で表される基が好ましい。
　また、Ｌ１及びＬ２は、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯ等をさらに有していてもよい。
（ｖｉｉｉ）ｍ、ｎ、ｙ及びｚ
　ｍ及びｎは、各ブロック部分の繰り返し単位の数（重合度）を表す。
　ｍは、５~２０，０００の整数である。
　ｎは２~５，０００の整数である。
　ｙは０~５，０００の整数である。
　ｚは０~５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとする。好ましいｚは０である。
　本発明において、例えば、ｚが０（ゼロ）である場合、Ｒ３がアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基であるポリカチオン荷電性ポリマーを例示することができる。
　なお、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、各繰り返し単位は記載の便宜上、特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。
　本発明おいて、ポリカチオン荷電性ポリマーは、塩を形成していてもよい。本発明において塩は特に限定されるものでないが、対イオンとしてＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、（１／２ＳＯ４）−、ＮＯ３ −、（１／２ＣＯ３）−、（１／３ＰＯ４）−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＨ３ＳＯ３ −、又はＣＦ３ＳＯ３ −等との塩があげられる。
　本発明において、ブロックコポリマーの製造方法は限定されないが、例えば、非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖を予め合成しておき、この非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖の片末端（Ｒ１ａ又はＲ１ｂと反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖がカチオン性基を含むように側鎖を置換又は変換する方法、あるいは、非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖と、荷電性ポリマー由来のセグメント鎖とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。
　当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。例えば、特開２００４−３５２９７２号公報に製造方法の一例が記載されており、記載された方法又はそれらの改変方法にしたがって製造することができる。
　このように製造されるブロックコポリマーの平均分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、２３，０００~４５，０００であることが好ましく、より好ましくは２８，０００~３４，０００である。また、個々のブロック部分については、非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖の平均分子量（Ｍｗ）は、８，０００~１５，０００であることが好ましく、より好ましくは１０，０００~１２，０００であり、荷電性ポリマー由来のセグメント鎖の分子量（Ｍｗ）は、１５，０００~３０，０００であることが好ましく、より好ましくは１８，０００~２２，０００である。
２．グリコサミノグリカン
　グリコサミノグリカンは、生体に普遍的に存在する生体適合性高分子であり、代表例として、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ケタラン硫酸、ヘパラン硫酸が挙げられる。グリコサミノグリカンの中でもコンドロイチン硫酸は細胞外マトリックスに多く存在し、身体の主要構成成分の一つとして知られている。グリコサミノグリカンは、生体にとってはほぼ無毒、無害な生体適合性高分子である。
　本発明において、グリコサミノグリカンをポリカチオン荷電性ポリマーと共に核酸のデリバリーに用いる場合、核酸キャリアは安定化し、また、組織を損傷しにくい。
　本発明で使用されるグリコサミノグリカンは、例えば、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ケタラン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン又はヘパリンであり、好ましくはコンドロイチン硫酸（ＣＳ）又はヒアルロン酸（ＨＡ）である。
　本発明において、グリコサミノグリカンは、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物の培養物から抽出されたもの、又は化学的もしくは酵素的に合成されたものなどの何れをも使用することができる。また、本発明において、グリコサミノグリカンは市販品を使用してもよい。
３．核酸
　本発明において、核酸は特に限定されないが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸又はリン酸部がホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスフェートトリエステル、ホスホロアミデート等に改変された核酸）が含まれる。これらの核酸は、遺伝情報を担う遺伝子であってもよいし、遺伝子発現調節などの機能を担うものであってもよく、それらの性質、機能に限定されるものではない。
　本発明において、核酸は、例えばプラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が好ましい。
　また、本発明においては、上記核酸は、必要に応じて生理活性タンパク質もしくはペプチドなどの高分子物質又は水溶性化合物などの低分子物質など、様々な物質とともに用いることもできる。静電的相互作用によりポリカチオン荷電性ポリマーと結合するためには、これらの物質は「アニオン性物質」であることが好ましい。なお、当該アニオン性物質としては、分子内に荷電性官能基を有する物質の他、複数の異なる帯電状態の官能基（アニオン性基及びカチオン性基）を有する分子について、ｐＨを変化させることにより分子全体としての帯電状態をアニオン性に変化させることができるものも含む。これらアニオン性物質は、１種のみ用いてもよいし２種以上を併用してもよく、限定はされない。
４．組成物
　本発明の組成物は、ポリカチオン荷電性ポリマー及びグリコサミノグリカンを含む。本発明の組成物は、標的細胞への核酸のデリバリーに用いることが可能であるため、本発明の組成物は、さらに核酸を含んでいてもよい。
　また、本発明の組成物は、医薬組成物又は実験用組成物としても用いることができる。医薬組成物又は実験用組成物として使用する場合、デリバリーされる核酸の種類又は機能により、本発明の組成物を適用する対象を選択することができる。
　本発明の組成物は、ポリカチオン荷電性ポリマー及びコンドロイチン硫酸を任意のバッファー（例えば、水性媒体、好ましくは，脱イオン水をベースとする媒体）中で混合することにより、容易に調製することができる。本発明の組成物が核酸を含む場合も同様に、核酸、ポリカチオン荷電性ポリマー及びコンドロイチン硫酸を任意のバッファー中で混合することにより、調製することができる。また、必要により、透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、ｐＨ制御、イオン強度制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜付加することができる。
　核酸、ポリカチオン荷電性ポリマー、及びコンドロイチン硫酸の混合方法は特に限定されず、たとえば、１種ずつ混合してもよいし、３種を一度に混合してもよい。混合は、少量ずつ、例えば滴下により添加して各成分を接触させてもよいし、接触量を経時的に増量させてもよいし、さらに成分全量を一度に接触させてもよい。
　また、各成分の混合の順番は特に限定されず、ポリカチオン荷電性ポリマーにコンドロイチン硫酸を予め混合させ、得られた混合物に核酸を混合させてもよいし、ポリカチオン荷電性ポリマーに核酸を予め混合させておき、混合物にコンドロイチン硫酸をさらに混合させてもよいし、また、コンドロイチン硫酸と核酸とを混合した後に、ポリカチオン荷電性ポリマーを混合してもよい。
　本発明の組成物では、核酸とポリカチオン荷電性ポリマーとの混合比は、ポリマー中のカチオンと核酸分子内のリン酸基との比率（Ｎ／Ｐ比）で表すことができる。Ｎ／Ｐ比とは、次式によって定義される値であり、以後別の言及をしない限り、Ｎ／Ｐ比はこの値を指す。
　Ｎ／Ｐ比＝〔溶液中のポリマー中のカチオンの総数〕／〔溶液中の核酸中のリン酸基の総数〕
　本発明において、Ｎ／Ｐ比は、組成物がポリイオンコンプレックスを形成できる限り限定されず、ポリマーに含まれる非荷電性セグメント又は荷電性セグメントの性質によって異なる。本発明における適当なＮ／Ｐ比は、当業者であれば、適宜選択することができる。
　ポリカチオン荷電性ポリマーと核酸との混合比は、限定はされないが、例えば、Ｎ／Ｐ比が、０．５~１６０であり、好ましくは１~１２０、より好ましくは２~８０、さらに好ましくは１０~８０である。特に、ポリカチオン荷電性ポリマーが前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）のブロックコポリマーである場合は、Ｎ／Ｐ比は、限定はされないが、好ましくは１~１２０、より好ましくは２~８０、さらに好ましくは１０~８０である。
　本発明において、コンドロイチン硫酸は、混合後の濃度として、０．００１~１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１~５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５~５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いることが好ましい。
　本発明において、コンドロイチン硫酸は、ポリカチオン荷電性ポリマーの容量もしくはポリカチオン荷電性ポリマーと核酸とのコンプレックスの容量またはそれらを含む溶液量に対して、１／５０~１／２容量、好ましくは１／２０~１／５容量、より好ましくは１／１０容量を添加することが好ましい。
　本発明の組成物の一例としては、最終濃度として核酸１６０μｇ／ｍｌ、ポリマー（ＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴ）２２００μｇ／ｍｌ、及びコンドロイチン硫酸５ｍｇ／ｍｌを含む組成物を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
　このように調製される本発明の組成物は、グリコサミノグリカンを含むため、核酸とポリカチオン性荷電性ポリマーとのコンプレックス（ＰＩＣ）が安定化している。したがって、本発明は、グリコサミノグリカンを用いることを特徴とする、ポリカチオン性荷電性ポリマーと核酸とのコンプレックスの安定化方法を提供することができる。前記コンプレックスの安定化方法は、本発明の組成物の調製方法と同様の方法で達成することができる。すなわち、グリコサミノグリカン、核酸、及びポリカチオン性荷電性ポリマーを混合することにより、コンプレックスを安定化すればよい。
　コンプレックスの安定化は、核酸の導入量、核酸の発現量などによって評価することができる。
５．標的細胞への核酸のデリバリー
　本発明の組成物は、標的細胞への核酸デリバリーに用いることができる。したがって、本発明により、核酸デリバリー用の組成物及び本発明の組成物を用いることを特徴とする、核酸を標的細胞にデリバリーする方法が提供される。
　本発明において、細胞は、動物、昆虫、又は植物由来の細胞もしくは細胞株、又は微生物である。
　標的細胞に核酸をデリバリーするには、本発明の組成物と標的細胞とを接触させればよい。当該接触により、標的細胞中に核酸が導入される。
　本発明において、「接触」とは、例えば、本発明の組成物と標的細胞とを同一の反応系又は培養系に存在させること、あるいは、本発明の組成物を、標的細胞を含む生体中に存在させることを意味する。
　例えば、本発明の組成物を培養細胞に適用する場合、本発明の組成物と標的細胞との接触は、本発明の組成物の存在下で細胞を培養すること、細胞培養容器に本発明の組成物を添加すること、細胞と本発明の組成物とを混合することなどを含む。本発明の組成物の使用量は、核酸の性質及び細胞の種類を考慮して、適宜設定することができる。
　他方、本発明の組成物を生体内の細胞に適用する場合、本発明の組成物と標的細胞との接触は、遺伝子療法等の当該技術分野で常用されている投与方法により、本発明の組成物を生体に投与すること、標的細胞周辺の組織に本発明の組成物を直接移植することなどを含む。このような生体としては、当該核酸の導入を必要とする個体（又は処置すべき個体）を挙げることができ、具体的にはヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、鳥類等挙げることができる。生体への投与方法は、経口用法又は非経口用法が用いられるが、通常、非経口用法が採用される。非経口用法としては、例えば、点滴静注などの注入、経静脈導入法、気管内投与などを挙げることができる。本発明の組成物の投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態に合わせて適宜設定することができる。
　本発明の組成物は、各種疾患の原因となる細胞に所望の核酸を導入する治療（遺伝子治療）に用いることができる。よって本発明により、各種疾患に対する医薬組成物及び当該医薬組成物を用いる治療方法（特に遺伝子治療方法）を提供することもできる。なお、投与の方法及び条件は前記と同様である。
　上記医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、注射剤（静脈内（点滴を含む）、筋肉内、腹腔内）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
　上記医薬組成物及び治療方法は、各種疾患、例えば癌に対して有効に適用される。
　さらに、本発明の組成物は細胞毒性が少ないため、副作用を生じない又は生じにくい医薬組成物として使用することができる。すなわち、遺伝子導入に用いるカチオン性ポリマーは細胞（細胞膜）を傷害することがあるが、このポリマーにアニオン性高分子であるグリコサミノグリカンを加えることで上記傷害性の軽減を期待することができる。人工遺伝子ベクターを用いた遺伝子導入に際して、毒性の軽減を目指すと発現効率が低下することが知られているが、本発明により、高い遺伝子発現効率を維持しつつ毒性の軽減を同時に実現することが可能となった。
　さらに、本発明は、上記組成物を含むことを特徴とする、核酸デリバリー用キットを提供する。当該キットは、癌細胞等の各種標的細胞に対する遺伝子治療などに好ましく用いることができる。
　本発明のキットにおいて、上記組成物の保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
　本発明のキットは、前記上記組成物以外の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、各種バッファー、細胞内に導入する各種核酸（プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、溶解用バッファー、各種タンパク質及び使用説明書（使用マニュアル）等を挙げることができる。
　本発明のキットは、標的細胞内に導入する所望の核酸を含む組成物を調製するために使用され、調製した組成物は、標的細胞への核酸デリバリー用デバイスとして有効に用いることができる。
　以下、具体例を参照しながら本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これらに限定して解釈されるものでない。
〔製造例１：ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）の合成〕
　β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とジクロロメタンの混合溶媒に溶解し、ブチルアミンを開始剤として４０℃で２日間重合反応を行った。Ｎ末端を無水酢酸によりアセチル化した後、ジエチルエーテルで再沈を行い、乾燥してポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＢＬＡ）ポリマーを得た。ＰＢＬＡをＤＭＦに溶解し、ベンジルエステルに対し５０倍当量に相当するジエチレントリアミンを加え、４０℃で１日間反応させた。反応液を酢酸水溶液中に滴下し透析チューブに入れ、０．０１Ｎ塩酸を外液として透析を行った。エバポレートした後凍結乾燥を行い、ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）の白色粉末を得た。得られたポリマー（以下、「ＰＡｓｐＤＥＴ」ともいう）は下記の構造式で表すことのできるポリマーの塩酸塩であり、ｎ＝９８であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
〔製造例２：ポリエチレングリコール−ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）ブロックコポリマーの合成〕
　片末端がメトキシで、もう一方の片末端がアミノプロピルであり、平均分子量が１２，０００のポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」ともいう）をジクロロメタンに溶解し、ＢＬＡ−ＮＣＡをＤＭＦとジクロロメタンとの混合溶媒に溶解して加え、４０℃で２日間反応させ、さらに無水酢酸によりＮ末端のアセチル化を行い、ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得た。ＮＭＲによる解析からＰＢＬＡ部分の重合度は６８であった。以下、ＰＥＧの分子量が１２，０００、ＰＢＬＡ部分の重合度６８のブロック共重合体をＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）のように表記することがある（かっこ内の数字１２が分子量１２，０００を表し、６８が重合度を表している）。
　こうして得られた、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）をベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下でＤＭＦに溶解させた。この溶液に、蒸留により乾燥し精製したジエチレントリアミンをベンジルエステルに対して５０倍当量添加し、アルゴン雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した。反応溶液を１０％酢酸に滴下し、分画分子量３５００の透析膜を用いて０．１Ｎ−ＨＣｌに対して透析を行い、透析膜内液を回収、凍結乾燥することで下記式（Ｖ）に示す構造式で表すことのできるＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴブロックコポリマー（以下、「ＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴ」又は「ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」ともいう）を塩酸塩の形で白色固体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
〔製造例３：ポリエチレングリコール−ポリ（Ｎ−（３−アミノプロピル）−アミノプロピルアスパルタミド）ブロックコポリマーの合成〕
　製造例２で用いたのと同じＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）をベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下でＤＭＦに溶解させた。この溶液に、蒸留により乾燥し精製したジプロピレントリアミンをベンジルエステルに対して５０倍当量添加し、アルゴン雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した。反応溶液を１０％酢酸に滴下し、分画分子量３５００の透析膜を用いて０．１Ｎ−ＨＣｌに対して透析を行い、透析膜内液を回収、凍結乾燥することで下記式（ＶＩ）に示す構造式で表すことのできるＰＥＧ−ＤＰＴブロックコポリマーを塩酸塩の形で白色固体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
［実施例１］　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（図１）
　ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）と以下の各ポリマーとのポリイオンコンプレイックス（ＰＩＣ）は、トランスフェクションの３０分から１時間前に各ポリマー溶液とｐＤＮＡ溶液とを混合することによって調製した。各ポリマー溶液は、固体の状態で製造されたポリマーを、濃度５５００μｇ／ｍｌ（ＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴ），４２０μｇ／ｍｌ（ＰＡｓｐＤＥＴ），２３０μｇ／ｍｌ（ＰＥＧ−ＰＬＬ）となるように１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）に溶解して調製したものである。各ポリマー溶液とｐＤＮＡ溶液とは、２：１の体積混合比で混合し、得られたＰＩＣ中のポリマー濃度は上記濃度の１／３となっている。本実施例で用いたポリマーは、ＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴ（８０）、ＰＡｓｐＤＥＴ（１０）、ＰＥＧ−ＰＬＬ（２）及びＥｘｇｅｎ５００（直鎖状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）；ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１０）である。ポリマーの括弧内の数値は、Ｎ／Ｐ比を示す。
　ＤＮＡ最終濃度は３３．３μｇ／ｍｌとした。
　コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａ：Ｓｉｇｍａ　Ｃ９８１９−５）添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘは、以下のように調製した。まず、コンドロイチン硫酸を純水に溶解させ、それぞれ５０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌの各濃度の溶解液を準備した。次に、上記のように調製したＰＩＣを含む溶液に溶解液をそれぞれ１／１０体積加え、３０分静置して調製した。
　細胞は、ＨｕＨ−７細胞（Ｒｉｋｅｎ　ｃｅｌｌ　ｂａｎｋ）を９６ｗｅｌｌディッシュに０．７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで捲き、１０％血清入りＤＭＥＭ中で２４時間インキュベーションした後、トランスフェクションに用いた。トランスフェクションは、培地を再度１０％血清入りＤＭＥＭに交換し（１００μｌ／ｗｅｌｌ）、調製した各コンドロイチン硫酸添加ｃｏｍｐｌｅｘ又はコンドロイチン硫酸非添加ｃｏｍｐｌｅｘを、ｐＤＮＡ量として０．１９μｇ／ｗｅｌｌとなるように、培地中に滴下した。４８時間インキュベーション後、ルシフェラーゼ遺伝子発現を定量した。
　結果を図１に示す。データはコンドロイチン硫酸非添加ｃｏｍｐｌｅｘの発現を１としたときの相対的な発現量として表示した。
　図１に示すように、ＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴ／ｐＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘにコンドロイチン硫酸を添加すると、遺伝子導入の効率が極めて向上することが明らかとなった。また、ＰＡｓｐＤＥＴ／ｐＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘにコンドロイチン硫酸を添加すると、添加するコンドロイチン硫酸の濃度依存的に細胞への遺伝子導入効率が顕著に向上することが明らかとなった。
［実施例２］　コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘの安定性の評価（図２）
　実施例１において顕著な遺伝子発現の増加が観察されたＰＡｓｐＤＥＴ／ｐＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘを用いて、調製後のｃｏｍｐｌｅｘの安定性を評価した。
　実施例１と同様に、コンドロイチン硫酸添加（用いたコンドロイチン硫酸溶解液濃度は５０ｍｇ／ｍｌ）及び非添加の各サンプルを、３７℃で一晩静置した後、トランスフェクションに用いた。
　その結果、３７℃で一晩静置したＰＡｓｐＤＥＴ／ｐＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘを遺伝子のキャリアとして遺伝子導入に使用すると、遺伝子発現のレベルが減少した。しかし、コンドロイチン硫酸添加ＰＡｓｐＤＥＴ／ｐＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘでは、遺伝子発現のレベルは減少しなかった（図２）。
　このことは、コンドロイチン硫酸をＰＩＣに添加すると、ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘの安定性が向上することを示している。
［実施例３］　調製法の違いによる発現量の評価（図３）
　実施例２と同様にＰＡｓｐＤＥＴ／ｐＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘを用いて、本発明の組成物を調製する際のコンドロイチン硫酸の添加タイミングと遺伝子発現との関係を調べた。上述のように、先にｐＤＮＡとポリマーとを混合してｃｏｍｐｌｅｘを調製し、コンドロイチン硫酸を添加したサンプル（図３（ｂ））のほか、先にポリマーとコンドロイチン硫酸を混合し、次にｐＤＮＡを添加したサンプル（図３（ｃ））、先にｐＤＮＡとコンドロイチン硫酸を混合した後にポリマーを添加したサンプル（図３（ｄ））、及びコントロールとしてコンドロイチン硫酸を添加しないｃｏｍｐｌｅｘ（図３（ａ））を用いて、トランスフェクションを行った。
　その結果、（ｂ）~（ｄ）のサンプルにおいて遺伝子発現量はほとんど同じであり、ｐＤＮＡ及びポリマーとコンドロイチン硫酸とを共存させるタイミングを変化させても、遺伝子の発現量に影響しないことが示された（図３）。すなわち、コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘの調製法の違いは、遺伝子の発現量に影響しないことが示された。
［実施例４］　調製法の違いによるｃｏｍｐｌｅｘ性状の評価（図４）
　実施例３の調製法の異なる３種のコンドロイチン硫酸添加サンプル（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のｐＤＮＡ凝縮状態を、蛍光二重標識ｐＤＮＡを用いて、蛍光スペクトル解析する手法（ＦＲＥＴ）（Ｉｔａｋａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２００２；３：８４１−５）にて解析した。本実施例では、ポリマーとしてＰＡｓｐＤＥＴ及びＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴを用いた。
　その結果、ｐＤＮＡ及びポリマーとコンドロイチン硫酸とを共存させるタイミングを変化させて調製したサンプル間において、ｃｏｍｐｌｅｘ内のＤＮＡ凝縮の程度に差異は認められなかった。したがって、コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘの調製法の違いは、ｃｏｍｐｌｅｘ性状に影響しないことが示された。
［実施例５］　Ｉｎ　ｖｉｖｏデリバリー：マウス骨格筋への経静脈遺伝子導入（図５）
　本実施例では、ｉｎ　ｖｉｖｏデリバリーへの応用として、マウス下肢骨格筋への経静脈遺伝子導入を行った。この導入法は、予め大腿近位を駆血して一時的に静脈潅流を遮断した状態で下肢静脈よりサンプルを注入し、一時的な内圧上昇で骨格筋への遺伝子の取り込みを図る、ハイドロダイナミクス法の原理による遺伝子導入法である。
　実験は６~８週齢マウスを用い、実施例１に記載のように調製したｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＡｓｐＤＥＴ／ｐＤＮＡ、ＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴ／ｐＤＮＡ、ＰＥＧ−ＰＬＬ／ｐＤＮＡ）を下肢大伏在静脈より注入することで行った。ｐＤＮＡの投与量は、５０μｇ／匹とした。ルシフェラーゼ遺伝子発現は、ＩＶＩＳ（Ｘｅｎｏｘｅｎ社：ｉｎ　ｖｉｖｏルシフェラーゼイメージング装置（ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ））により観察した（図５Ａ）。また、筋肉サンプルを摘出して、抽出したタンパク質からのルシフェラーゼタンパク質の発現を定量した（図５Ｂ）。同時にＤＮＡを抽出し、含まれるルシフェラーゼｐＤＮＡを定量ＰＣＲにて計測し、筋肉の単位重量あたりに含まれるゲノム内アクチンＤＮＡ量により標準化した（図５Ｂ）。
　その結果、コンドロイチン硫酸を添加して調製したｃｏｍｐｌｅｘでは、添加せずに調製したｃｏｍｐｌｅｘに比べて、筋肉でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量が著しく増加することが示された。
　また、コンドロイチン硫酸添加サンプルにおいて、ＤＮＡ取り込み量の増加及び発現の長期持続化が観察された。これは、コンドロイチン硫酸添加により、ＰＩＣが安定化したためと考えられる。
［実施例６］　Ｉｎ　ｖｉｖｏデリバリー：マウス肺組織への気管内投与（図６~８）
　ＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴ／ｐＤＮＡおよびＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴ／ｐＤＮＡにコンドロイチン硫酸を添加したサンプル（コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘ）を、マウス肺組織への気管内投与に用いた。いずれもＤＮＡ量は１０μｇ／匹とした。投与から３日後に肺組織を摘出して、ルシフェラーゼ遺伝子発現を評価した（図６）。
　その結果、コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘ（用いたコンドロイチン硫酸（ＣＳ）溶解液濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬ）において、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量がコントロールと比較して増加した。（図６）。
　このことから、コンドロイチン硫酸添加が、肺組織への気管内投与における遺伝子導入効率向上へも有効に働くことが示された。このような遺伝子導入効率の向上には、コンドロイチン硫酸添加によるｃｏｍｐｌｅｘの安定化が寄与していると考えられるため、本発明は多くのｉｎ　ｖｉｖｏ投与系において有効であることが強く示された。
　また、投与１日後の肺組織中の炎症性サイトカイン発現量（ＴＮＦ−α：図７、ＩＬ−６：図８）を、定量ＰＣＲにて評価した。
　その結果、コンドロイチン硫酸添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘでは、ＴＮＦα及びＩＬ−６の発現量がコンドロイチン硫酸非添加ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘに比べて低かった。特に、コンドロイチン硫酸５０ｍｇ／ｍｌ添加サンプルは、コンドロイチン硫酸非添加サンプルに対して有意にＴＮＦ−αの産生を抑制した。
　主た、コンドロイチン硫酸０．５，５及び５０ｍｇ／ｍｌ添加サンプルは、コンドロイチン硫酸非添加サンプルに対して有意にＩＬ−６の産生を抑制した。
　これらのことは、コンドロイチン硫酸を添加することにより、遺伝子サンプルによる炎症性サイトカインの発現を抑制できることを示している。
［実施例７］　腫瘍増殖の抑制実験（図９~１０）
　膵臓がん由来細胞ＢｘＰＣ３（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ））を用いてマウスの皮下腫瘍移植モデルを作製し、実施例５と同様に、当該モデルマウス骨格筋への経静脈的遺伝子導入法を用いて、ｓＦｌｔ−１発現プラスミド　ＤＮＡ（ｐＤＮＡ）投与による腫瘍増殖の抑制を行った。ｓＦｌｔ−１は血管新生因子であるＶＥＧＦのレセプター（Ｆｌｔ−１）の可溶性部分である。本実施例は、本発明の組成物を用いてｓＦｌｔ−１を遠隔的に過剰発現させることにより、腫瘍細胞から活発に産生されるＶＥＧＦを捕捉し、腫瘍を栄養する血管新生を抑制することを図るものである（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　６０：２１６９，２０００，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　１２０：２７８，２００６）。
　ＢｘＰＣ３細胞をマウス背部皮下に移植し、３週後に腫瘍組織の生着を確認後、以下の実験を行った。ｓＦｌｔ−１発現ｐＤＮＡ及びネガティブコントロールとしてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ｐＤＮＡを用いて、実施例５（図５）と同様に、ＰＥＧ−ＰＡｓｐＤＥＴおよびコンドロイチン硫酸を用いた遺伝子キャリアを作製した。
　作製したｃｏｍｐｌｅｘの投与は、それぞれ５匹ずつのマウスに、２度、すなわち初日（Ｄａｙ０）に右下肢へ、１週後（Ｄａｙ７）に左下肢へ、ｐＤＮＡ量として５０μｇずつ行った。投与を行っていないマウス５匹も含めて、３，４日おきにマウスの腫瘍の直径を計測した。それぞれのマウスのＤａｙ０での腫瘍直径を１として、以後の腫瘍サイズを相対的に表示した（図９）。
　その結果、ｓＦｌｔ−１発現ｐＤＮＡを導入したマウスでは、腫瘍サイズの増殖速度が有意に減少した（図９）。
　また，実際に腫瘍組織での血管新生が抑制されていることを確認する目的で、上記と同様にｓＦｌｔ−１発現ｐＤＮＡまたはＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ｐＤＮＡを投与した１週後に腫瘍組織を採取し、血管内皮に特異的に発現する血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）抗体による免疫組織学的染色による観察を行った。
　観察は共焦点レーザー顕微鏡を用いて行った（図１０Ａ）。また、血管領域を定量評価するために、ＰＥＣＡＭ−１陽性の領域を取得画像から計測した（ｎ＝１２~１６）（図１０Ｂ）。
　その結果、ｓＦｌｔ−１　ｐＤＮＡを投与したマウス腫瘍組織では、ＰＥＣＡＭ−１陽性領域が減少しており、血管新生が抑制されていることが示された（図１０）。
　本実施例において、本発明の組成物を用いてｓＦｌｔ−１　ｐＤＮＡを動物に投与すると、腫瘍サイズが減少し、また、血管新生が抑制された。これらの結果は、本発明の組成物が、標的細胞への核酸のキャリアとして有効に機能し、種々の疾患の治療に使用できることを示している。
［実施例８］
　全ての血管形成過程に作用する根本的な因子の発見並びにその対処が求められるが、この鍵となり得るものに低酸素誘導因子（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｆａｃｔｏｒ：ＨＩＦ）がある。ＨＩＦファミリーには、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−２およびＨＩＦ−３等が知られている。ＨＩＦ−１は、αサブユニット及びβサブユニットからなるヘテロ二量体であり、酸素恒常性の中心的な調節因子として機能する。ＨＩＦ−１のαサブユニット（ＨＩＦ−１α）により直接又は間接的にＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、及びＡｎｇ−１等の血管新生因子の産生が誘導されることが知られている。しかしながら、酸素の存在下では、ＨＩＦ−１αはプロリルヒドロキシラーゼドメイン−２（ＰＨＤ２）によってヒドロキシル化され、ヒドロキシル化されたＨＩＦ−１αは、その後、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体によって分解される。ＰＨＤ２ヘテロ欠損マウスを用いた研究において、血管内皮の正常化を介して腫瘍の転移が抑制されることが示され、ＰＨＤ２を阻害することが癌の治療につながることが示唆されている（Ｍａｚｚｏｎｅ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　１３６：８３９−８５１，２００９）。
　本発明者らは、ＰＨＤ２−ｓｉＲＮＡ発現プラスミドをマウス線維芽細胞に導入してＰＨＤ２遺伝子のサイレンシングを試みたところ、有意にＶＥＧＦやＦＧＦ２の発現が誘導されること、並びに導入した細胞をマウスの皮下に移植して血管新生が誘導されることを報告した（Ｗｕ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　１６：１２２７−１２３４，２００８）。
　そこで本実施例では、本発明の組成物にＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡを含め、虚血モデルマウスにおいて血管新生の誘導が生じるか否かを検討した。
　１．ＲＮＡ発現プラスミドの調製
　ＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質として、マウスＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡの発現プラスミドを構築した。下記塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、マウスＰＨＤ２用ｓｉＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　また、マウス遺伝子とは相同性を持たない２１塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、コントロール用ｓｉＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖とした。これらのオリゴヌクレオチドは、いずれも北海道システム社より購入した。そして、添付のプロトコールに従って、ヒトＵ６プロモーターが組み込まれた発現ベクターｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１−Ｕ６（Ｎｏ．５７６２、Ａｍｂｉｏｎ社製）又はサイトメガロウイルスプロモーターが組み込まれた発現ベクターｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ｎｏ．５７７５、Ａｍｂｉｏｎ社製）にそれぞれのオリゴヌクレオチドを連結させて、マウスＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現プラスミド及びコントロールのｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現プラスミドを構築した。以下の実験は、ｓｉＰＨＤ２−Ａの発現ベクターを用いて行った。
　２．ポリカチオン荷電性ポリマーの合成
　ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）は、前記製造例１で製造したものと同じものを使用した。
　２−２．ポリエチレングリコール−ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）ブロック共重合体
　ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体は、前記製造例２で製造したものと同じものを使用した。
　２−３．ポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体の合成
　Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシンＮカルボン酸無水物を、片末端一級アミノ基のポリエチレングリコールを開始剤として重合した。反応溶液を、冷エーテル中に滴下し生じたポリエチレングリコール−ポリ（Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン）ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｚ））を濾過で回収した。ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｚ）をトリフルオロ酢酸に溶解させ、ＨＢｒ酢酸を用いて脱保護反応を行い、エーテル再沈、透析、凍結乾燥によりポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体（以下、「ＰＥＧ−ＰＬＬ」ともいう）を得た。
　３．ポリイオンコンプレックスの調製
　上記の通り調製した、ＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡ発現プラスミド（以下、「ｓｈＰＨＤ２」ともいう）及びコントロールのｓｉＲＮＡ発現プラスミド（以下、「ｓｈＣｏｎｔ」ともいう）のそれぞれと、上記の各ポリカチオン荷電性ポリマーとのポリイオンコンプレックスは、投与の３０分から１時間前に、各プラスミド溶液と各ポリマー溶液とを混合することによって調製した。各ポリマー溶液は、固体の状態で製造されたポリマーを、濃度が、５５００μｇ／ｍｌ（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））、２３０μｇ／ｍｌ（ＰＥＧ−ＰＬＬ）となるように１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）に溶解して調整したものである。各ポリマー溶液と各プラスミド溶液とは、２：１の体積混合比で混合し、得られたポリイオンコンプレックス中のポリマー濃度は前記濃度の１／３となっている。本実施例で用いたポリマーは、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（２０）及びＰＥＧ−ＰＬＬ（２）である。各ポリマーのカッコ内の数値はＮ／Ｐ比を示す。なお、ＤＮＡ最終濃度は、３３．３μｇ／ｍｌとした。
　コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩：Ｓｉｇｍａ社製）を添加したポリイオンコンプレックスは、次のように調製した。まず、コンドロイチン硫酸を純水に溶解させ、５０ｍｇ／ｍｌの濃度のコンドロイチン硫酸溶解液を準備した。次に、上記の通り調製した、各プラスミドと各ポリマーとのポリイオンコンプレックスを含む溶液に、当該コンドロイチン硫酸溶解液を１／１０体積量加え、３０分放置して調製した。
　４．実験動物
　８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスは、オリエンタル酵母工業社から購入した。全てのマウスは、高圧滅菌した飼料及び滅菌水を自由摂取させて飼育した。全ての動物研究は、東京大学の動物実験に関するガイドラインの原則に従って行った。
　５．虚血モデルマウスにおけるｓｈＰＨＤ２投与の影響
　８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、左下肢の大腿動脈起始部を結紮することにより左下肢虚血モデルマウスを作製した。これらのマウスを１群あたり５~６匹ずつの４群に分け、大腿動脈結紮後の１日目に、下記（Ａ）~（Ｄ）の組成物をそれぞれ各群のマウスの左下肢大伏在静脈より注入した。
　（Ａ）ｓｈＣｏｎｔとＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）とのポリイオンコンプレックス（以下、「ｓｈＣｏｎｔ＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」とする）
　（Ｂ）ｓｈＰＨＤ２のみ（以下、「ネイキッドｓｈＰＨＤ２」とする）
　（Ｃ）ｓｈＰＨＤ２とＰＥＧ−ＰＬＬとのポリイオンコンプレックス（以下、「ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＬＬ」とする）
　（Ｄ）ｓｈＰＨＤ２、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）及びコンドロイチン硫酸のポリイオンコンプレックス（以下、「ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」とする）
　なお、ｓｈＰＨＤ２及びｓｈＣｏｎｔの注入量は、それぞれ５０μｇ（溶液としては３００μＬ）とした。そして２１日目に、各群のマウスについて下肢の状態を目視により外観調査し、代表的なものについて写真撮影を行った。
　これらの代表写真を図１１に示す。図１１において、（Ａ）は、ポリエチレングリコール−ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））を用いて、コントロールのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｂ）は、ポリカチオン荷電性ポリマーを用いずにＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｃ）は、ポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＬＬ）を用いて、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｄ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態を示す図である。
　なお、図１１中の矢印は、虚血処置を行ったマウス左下肢を示すものである。
　その結果、図１１の写真に示された通り、（Ｂ）~（Ｄ）のｓｈＰＨＤ２を投与した群では、全てのマウスにおいて外観上問題なく左下肢が温存されていた。これに対して、（Ａ）のｓｈＣｏｎｔを投与した群では、マウスの左下肢は温存されておらず、壊死して外観上消滅していた。
［実施例９］虚血モデルマウスにおける血流状態の解析
　実施例８の通り処置を行った（Ａ）ｓｈＣｏｎｔ＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、（Ｂ）ネイキッドｓｈＰＨＤ２、（Ｃ）ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＬＬ、及び（Ｄ）ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の４群の左下肢虚血モデルマウスについて、レーザードップラー血流画像化装置（ｍｏｏｒＬＤＩ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｏｐｐｌｅｒ　Ｉｍａｇｅｒ，Ｍｏｏｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）及びソフトウェア（ＭＬＤＩ　ＶＳ．１　Ｓ／Ｎ　５４０９，Ｍｏｏｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて血流状態の解析を行った。血流状態の解析については、施術前、施術後、３日目、７日目、１４日目、２１日目の状態を調べ、同時に各群の代表的なものについて同血流画像化装置を用いて写真撮影を行った。
　これらの代表写真を図１２に示す。図１２において、（Ａ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて、コントロールのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｂ）は、ポリカチオン荷電性ポリマーを用いずにＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｃ）は、ＰＥＧ−ＰＬＬを用いて、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｄ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態を示す図である。
　図１２の写真の通り、（Ａ）群のマウスは、処置後から３日目まで左下肢に血流の存在が示されておらず、７日目以降は当該左下肢が壊死して消滅している状態が示された。これに対して（Ｂ）~（Ｄ）群のマウスは、処置後２１日目においては全て左下肢に血流の存在が見られた。その中でも（Ｄ）群は、処置後３日目から左下肢に血液が流れ始めており、７日目では左下肢のほぼ全体にわたって血流が見られ、１４日目及び２１日目では未処置である右下肢と変わらない程度に血液が流れている状態が観察された。なお、（Ｂ）及び（Ｃ）群は、７日目から血液が流れ始めるものの、２１日目まで経過しても右下肢と同程度の血流までは回復していなかった。
［実施例１０］虚血モデルマウスにおける血流の定量
　実施例８の通り処置を行った、（Ａ）ｓｈＣｏｎｔ＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、（Ｂ）ネイキットｓｈＰＨＤ２、（Ｃ）ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＬＬ、及び（Ｄ）ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の４群の左下肢虚血モデルマウスについて、レーザードップラーによる血流測定を行った。具体的にはレーザードップラー血流計（ｍｏｏｒＬＤＩ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｏｐｐｌｅｒ　Ｉｍａｇｅｒ，Ｍｏｏｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）及びソフトウェア（ＭＬＤＩ　ＶＳ．１　Ｓ／Ｎ　５４０９，Ｍｏｏｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用い、施術前、施術後、３日目、７日目、１４日目、２１日目の状態について血流量を測定した。測定値については、同マウスの非手術の右下肢をコントロールとして、当該コントロールの下肢血流量に対する虚血下肢血流量の比率を求めて定量を行い、各群における血流量比の平均値及び標準偏差を算出した。（Ａ），（Ｂ），（Ｄ）の結果を図１３のグラフに示し、（Ａ），（Ｃ），（Ｄ）の結果を図１４のグラフに示す。
　図１３において、血流定量値は、未処置下肢の血流測定値に対する処置下肢の血流測定値の比を示したもので、その平均値及び標準偏差を示す図である。被検試料として、（Ａ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）にコントロールのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを含有したポリイオンコンプレックスを用い、（Ｂ）は、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドのみを用い、（Ｄ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）にＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを含有したポリイオンコンプレックスを用いたことを示す図である。
　また、図１４において、被検試料として、（Ａ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）にコントロールのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを含有したポリイオンコンプレックスを用い、（Ｃ）は、ＰＥＧ−ＰＬＬにＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを含有したポリイオンコンプレックスを用い、（Ｄ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）にＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを含有したポリイオンコンプレックスを用いたことを示す図である。
　図１３の結果により、（Ｄ）群のマウスでは、処置後３日目において処置直後よりも多くの血流量が見られ、経時的にその量は増加して、２１日目では処置前と同程度の血流量であることが示された。これに対して、（Ｂ）群のマウスは経時的に血流量は増加したが、（Ｄ）群よりも少ない血流量であり、（Ａ）群においては、時間が経過しても血流量は増えなかった。また、図１４の結果からは、（Ｃ）群のマウスは（Ｄ）群ほどの多くの血流量ではないものの、（Ａ）群よりも多量の血流量が見られた。
［実施例１１］本発明の組成物の膜傷害性軽減効果
＜方法＞
　ｐｏｌｙｍｅｒとして前記の通り合成したｐＡｓｐ（ＤＥＴ）（重合度９８）を用い、グリコサミノグリカンとしてヒアルロン酸（Ｓｉｇｍａ）及びコンドロイチン硫酸Ａ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）はアミン濃度が約２３０μＭ（通常のｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎで用いる濃度の５倍程度）となるよう調整、また、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａは、カルボキシル基と硫酸基の濃度を合わせて４６μＭとなるよう調整した。
　ＮＩＨ３Ｔ３を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１０，０００／ｗｅｌｌ蒔き、２４ｈｒ後ＰＢＳにｐｏｌｙｍｅｒとＹＯ−ＰＲＯ１（１μＭ）を溶かしたものを投与した。２０ｍｉｎ後にｈｏｅｃｈｓｔを最終濃度２．５μｇ／ｍｌになるよう投与し、その１０分後に細胞内分析装置（ｉｎ　ｃｅｌｌ　ａｎａｌｙｚｅｒ、ＧＥヘルスケア社）で核のＹＯ−ＰＲＯ１の蛍光強度を観察した。
　正常細胞にはＹＯ−ＰＲＯ１は取り込まれないが、膜傷害が起こった細胞にＹＯ−ＰＲＯ１が取り込まれ、蛍光強度が増加すると考えた。
　個々の細胞の蛍光強度をヒストグラムにして示した。１サンプルあたり５ｗｅｌｌの観察し、蛍光強度が４０，０００以上ある細胞をＹＯ−ＰＲＯ１陽性細胞として陽性細胞の割合を各群で比較した。
＜結果＞
　ｐＡｓｐ（ＤＥＴ）存在下でＹＯ−ＰＲＯ１取り込みによる蛍光強度が増加し、ポリマーによる膜透過性亢進が観察された（図１５、ＤＥＴ５０）。一方、ヒアルロン酸（ＨＡ）やコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を添加することで蛍光強度は減少し、ヒアルロン酸又はコンドロイチン硫酸によりｐＡｓｐ（ＤＥＴ）の膜への影響が軽減したものと考えられた。従って、本実施例により、本発明の組成物が組織傷害の軽減、炎症の抑制に寄与していることが示された（図１５、Ｄ＋ＨＡ１０又はＤ＋ＣＳ１０）。
　配列番号１：合成ＤＮＡ
　配列番号２：合成ＤＮＡ

Claims (20)

  1. ポリカチオン荷電性ポリマー及びグリコサミノグリカンを含む、標的細胞への核酸デリバリー用組成物であって、
    ポリカチオン荷電性ポリマーが、ポリ（アミノ酸）、多糖、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン又はビニルポリマーをベースとする主鎖を有し、かつ、側鎖として、当該主鎖に直接又は連結基を介して結合した式−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２で表される基（ここで、ａ及びｅはそれぞれ独立して、１~５の整数である）を含む荷電性ポリマー由来のセグメント鎖を有するポリマーである、前記組成物。
  2. ポリカチオン荷電性ポリマーが、前記荷電性ポリマー由来のセグメント鎖と非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖とを有するブロックコポリマーである、請求項１記載の組成物。
  3. 非イオン性親水性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）及びポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）からなる群より選ばれる、請求項２記載の組成物。
  4. ポリカチオン荷電性ポリマーが、下記の一般式（ＩＩＩ）で表される荷電性ポリマー、下記の一般式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表されるブロックコポリマー、又はそれらの塩である請求項１記載の組成物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式中、Ｒ１０は、水酸基、オキシベンジル基又はＮＨ−Ｒ１１基を表し、ここでＲ１１は置換されていてもよい直鎖又は分枝のＣ１−２０アルキル基を表し、
    Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよい直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、
    Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ及びＲ２ｄは、それぞれ独立して、メチレン基又はエチレン基を表し、
    Ｒ３は水素原子を表し、
    Ｒ４は、水酸基、又は−Ｏ−Ｘ３、−Ｓ−Ｘ３もしくは−ＮＨ−Ｘ３で表される基を表し、ここでＸ３は一級、二級もしくは三級アミン化合物もしくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表し、
    Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ及びＲ５ｄは、それぞれ独立して、水酸基、オキシベンジル基、又はＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでａは１~５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して、一級、二級もしくは三級アミン化合物もしくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表し、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数又はＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ｅは１~５の整数である）であるものが少なくとも２つ以上存在し、
    Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基であり、ここで保護基はＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
    Ｌ１及びＬ２は、連結基を表し、
    ｍは５~２０，０００の整数であり、
    ｎは２~５，０００の整数であり、
    ｙは０~５，０００の整数であり、
    ｚは０~５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとし、
    また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。
  5. Ｒ１１が未置換の直鎖もしくは分枝のＣ１−２０アルキル基であるか、又はアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基及びトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基（各アルキル基はそれぞれ同一又は異なっていてもよい）からなる群より選ばれる置換基で置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−２０アルキル基である、請求項４記載の組成物。
  6. Ｒ１ａ又はＲ１ｂが、置換された直鎖又は分枝Ｃ１−１２アルキル基を表し、ここで置換基がアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基及びトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基（各アルキル基はそれぞれ同一又は異なっていてもよい）からなる群より選ばれる、請求項４記載の組成物。
  7. Ｒ１ａ又はＲ１ｂがメチル基である、請求項４記載の組成物。
  8. Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ又はＲ２ｄが、メチレン基である請求項４記載の組成物。
  9. Ｒ３がアセチル基、アクリロイル基及びメタクリロイル基からなる群より選ばれる、請求項４記載の組成物。
  10. Ｒ４が−ＮＨ−Ｒ９であり、ここでＲ９は置換されていてもよい直鎖又は分枝のＣ１−２０アルキル基を表す、請求項４記載の組成物。
  11. Ｒ５ａとＲ５ｂの総数又はＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ｅは１~５の整数である）であるものが５０％以上存在する、請求項４記載の組成物。
  12. Ｒ５ａとＲ５ｂの総数又はＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ｅは１~５の整数である）であるものが８５％以上存在する、請求項４記載の組成物。
  13. Ｒ５ａ及びＲ５ｂのすべて、又はＲ５ｃ及びＲ５ｄのすべてが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ａは２又は３であり、ｅは１~３の整数である）である、請求項４記載の組成物。
  14. ｅが１である、請求項１３記載の組成物。
  15. Ｘが、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、及び下記の式で表される基からなる群から選ばれるいずれかの基である請求項４記載の組成物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    上記の各式中、Ｘ２は水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はアミノＣ１−６アルキル基を表し、
    Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びＲ７ｃは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、
    ｄ１、ｄ２及びｄ３は、それぞれ独立して、１~５の整数を表し、
    ｅ１、ｅ２及びｅ３は、それぞれ独立して、１~５の整数を表し、
    ｆは０~１５の整数を表し、
    Ｒ８ａ及びＲ８ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基を表し、ここで、保護基は、Ｚ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、及び
    ｇは０~１５の整数を表す。
  16. ｚが０である請求項４記載の組成物。
  17. Ｌ１が、−Ｓ−Ｓ−又は−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−であり、ここでｂは１~５の整数である、請求項４記載の組成物。
  18. Ｌ２が、−Ｓ−Ｓ−又は−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−であり、ここでｃは１~５の整数である、請求項４記載の組成物。
  19. グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸である、請求項１記載の組成物。
  20. 核酸、ポリカチオン荷電性ポリマー及びグリコサミノグリカンを含む組成物を、標的細胞と接触させることを含む、当該細胞への当該核酸のデリバリー方法であって、
    ポリカチオン荷電性ポリマーが、ポリ（アミノ酸）、多糖、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン又はビニルポリマーをベースとする主鎖を有し、かつ、側鎖として、当該主鎖に直接又は連結基を介して結合した式−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２で表される基（ここで、ａ及びｅはそれぞれ独立して、１~５の整数である）を含む荷電性ポリマー由来のセグメント鎖を有するポリマーである、前記方法。
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