ES2635087T3 - Derivado de ácido hialurónico modificado con ácido amino-carboxilico - Google Patents
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Abstract
Un derivado de ácido hialurónico que comprende unidades de disacárido representadas por la Fórmula (I): **(Ver fórmula)** donde R1, R2, R3, y R4 se seleccionan cada uno independientemente de entre un átomo de hidrógeno, alquilo C1-6, formilo y alquilcarbonilo C1-6; R8 es un átomo de hidrógeno, formilo o alquilcarbonilo C1-6; X está representado por las siguientes fórmulas: **(Ver fórmula)** "*" representa una posición de unión al carboxi en el derivado de ácido hialurónico, donde la proporción de las unidades de disacárido de Fórmula (I) con respecto a las unidades de repetición de disacárido presentes en el derivado de ácido hialurónico es, al menos, de 70 %.
Description
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DESCRIPCION
Derivado de acido hialuronico modificado con acido amino-carboxflico Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un derivado de acido hialuronico modificado con alquilamina, o con un compuesto que tiene amino y carboxi (acido amino-carboxflico), tal como aminoacido, o con un compuesto de amida del mismo (amida de acido amino-carboxflico), un conjugado entre dicho derivado de acido hialuronico y un farmaco, asf como una composicion farmaceutica que comprende dicho derivado de acido hialuronico, en particular, un complejo entre dicho derivado de acido hialuronico y un farmaco.
Tecnica anterior
Los polietilenglicoles (en lo sucesivo tambien conocidos como "PEG") son compuestos que son inactivos en el cuerpo vivo. Se sabe que la estabilidad y las propiedades farmacocineticas de las protefnas y los liposomas en el cuerpo vivo se pueden mejorar modificandolos con PEG. Las protefnas modificadas con PEG y los liposomas cuya permanencia en sangre se potencia recubriendolos con PEG ya han entrado en la fase de comercializacion como productos farmaceuticos. Sin embargo, se ha informado de que despues de una inyeccion en bolo a largo plazo de protefnas PEGiladas en ensayos con animales se produjo acumulacion de PEG en el rinon y cavitacion renal. En terminos concretos, el PEG no es un polfmero biodegradable y todavfa tiene varios problemas que se deben aclarar, incluyendo su acumulacion y seguridad en el cuerpo despues de la inyeccion a largo plazo a los seres humanos. Ademas, en los ultimos anos, han aparecido algunos informes sobre el fenomeno que provoca que los conjugados de PEG y los liposomas PEGilados se eliminen de manera inusualmente rapida despues de su segunda dosis (fenomeno de aclaramiento sangufneo acelerado) en lo sucesivo tambien conocido como "fenomeno ABC" (documentos no patente 1 y 2); por lo tanto, no se puede decir que se haya establecido completamente la seguridad y la eficacia de los productos farmaceuticos PEGilados.
Entre tanto, existe un polfmero que ya se ha usado en situaciones clfnicas, acido hialuronico. El acido hialuronico (en lo sucesivo tambien conocido como "HA" es un polisacarido aislado por primera vez del humor vftreo del ojo bovino por K. Meyer en 1934 y desde entonces se sabe que es un componente principal de la matriz extracelular. El HA es un tipo de glucosaminoglucano compuesto por unidades repetidas de disacaridos de acido D-glucuronico y N- acetilglucosamina unida por enlaces (3-(1 —»3) glucosfdicos. El HA no tiene ninguna diferencia de especies en su estructura qufmica o ffsica y el sistema metabolico de HA existe incluso en los seres humanos. El acido hialuronico es tambien conocido como un biomaterial muy seguro desde el punto de vista de la inmunidad o la toxicidad.
En los ultimos anos, el acido hialuronico ha atrafdo la atencion desde el punto de vista no solo de su seguridad, como se ha mencionado anteriormente, sino tambien los papeles que desempena como sustancia fisiologicamente activa en la adhesion celular, el crecimiento celular y la induccion de la migracion celular. En cuanto a su produccion, se ha conseguido la produccion en masa de acido hialuronico de alto peso molecular usando microorganismos y se ha realizado una investigacion intensiva sobre sistemas de administracion de farmacos (en lo sucesivo tambien denominados "DDS") usando acido hialuronico. Existen otros informes que indican que la conjugacion de acido hialuronico a un farmaco hace posible conseguir el direccionamiento del farmaco a los tejidos cancerosos (documento de patente 1), el direccionamiento del farmaco al hfgado (documento de patente 2) y la reduccion de la antigenicidad (documento de patente 3).
El inconveniente del acido hialuronico cuando se utiliza como un sustrato de DDS para el direccionamiento o extension del tiempo de retencion es su poca permanencia en sangre. Se cree que seis sacaridos consecutivos son el sitio del acido hialuronico que es reconocido por el receptor y se han realizado varios intentos para prolongar el tiempo de retencion del HA en la sangre modificando sus grupos carboxi (documentos de patente 4, 5 y 6).
Se ha desarrollado un derivado de acido hialuronico cuya permanencia en sangre se aumento modificando considerablemente el carboxi en el resto de acido glucuronico del acido hialuronico, estando demostrada su utilidad (documento de patente 7). En general, la permanencia de un derivado de acido hialuronico en sangre se prolonga aumentando el grado de modificacion de carboxi en su resto de acido glucuronico. Sin embargo, se ha descubierto que ambos factores no se correlacionan linealmente entre sf, pero la correlacion cambia dramaticamente una vez que se supera el umbral particular.
Los oligonucleotidos tales como ADN/ARN antisentido y ARNip, que se han estado desarrollando como farmacos de acido nucleico en los ultimos anos, estan sujetos a degradacion por nucleasas dentro y fuera del cuerpo vivo, se degradan rapidamente cuando se inyectan por via intravenosa (en lo sucesivo denominado tambien "i.v.") individualmente. Para que los farmacos de acido nucleico muestren su eficacia es esencial liberar los acidos nucleicos en el citoplasma o el nucleo. Una mayorfa de productos farmaceuticos convencionales que comprenden protefnas o peptidos como ingrediente activo actuan sobre dianas extracelulares. Para desarrollar productos farmaceuticos mas innovadores, se necesita un medio para permitir que las protefnas o peptidos actuen sobre dianas intracelulares. Para este proposito, existe la necesidad de desarrollar un proceso para liberar protefnas o
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peptidos en el citoplasma, mas especfficamente un proceso mediante el cual, despues de que un medicamento es captado por la celula a traves de endocitosis, el ingrediente activo del medicamento se libera eficazmente desde el endosoma en el citoplasma.
Los polfmeros cationicos sinteticos hacen posible condensar electrostaticamente el gen cargado negativamente y liberar el gen al citoplasma y, por lo tanto, se han considerado tan eficaces como un portador de genes. Los polfmeros cationicos sinteticos que se han notificado incluyen poli-L-lisina (documento de patente 8, documento no de patente 3), polietilenimina (documento no de patente 4), un polfmero sintetico que tiene un grupo imidazolilo (documento no de patente 5), y un dendrfmero de poliamidoamina (documento no de patente 6). En particular, se ha demostrado que la polietilenimina que tiene amina secundaria y el polfmero sintetico que tiene un grupo imidazolilo son captados al citoplasma con alta eficiencia de transferencia debido a su efecto de esponja de protones. Sin embargo, estos polfmeros sinteticos son poliaminas que generalmente se cree que tienen una citotoxicidad alta y no se sabe completamente si son seguras. Habfa otro ejemplo de uso de quitosano, un polfmero polisacarido cationico (documento no de patente 7), pero esta tecnica aun no se ha puesto en practica debido a su baja eficacia de transferencia genica. Todavfa se hizo otro informe sobre un intento de transferencia intracitoplasmica de ARNip usando un nanogel que se obtiene modificando carboxi en el acido hialuronico con un compuesto que tiene un grupo mercapto (tiol) y reticulacion ultrasonica del HA modificado (documento no de patente 17).
Tambien hubo varios informes sobre transferencia intracitoplasmatica de protefnas/peptidos. Los ejemplos incluyen los informes sobre los intentos de transferencia intracitoplasmatica a traves de la modificacion de un peptido con un peptido penetrante de celulas (cpp) (documento no de patente 8) o a traves de la formacion de un complejo protefna/peptido que comprende un liposoma cationico como un portador (documento no de patente 9), pero las eficiencias de transferencia de estas tecnicas no fueron necesariamente altas.
Ademas, con el fin de reducir la citotoxicidad, se intentaron diversos enfoques, incluyendo la PEGilacion de una poliamina o modificacion de HA con una poliamina (documento no de patente 10) y modificacion de una poliamina con un grupo funcional que se separa de una forma sensible al pH (por ejemplo, a pH bajo). Sin embargo, las poliaminas se utilizan de forma inherente incluso en estos enfoques, por lo que se necesitan trabajos y estudios adicionales sobre la toxicidad de estos componentes (documento no de patente 11).
Tambien se han estudiado polfmeros de acido policarboxflico debilmente anionicos. Dichos polfmeros presentan solubilidad en agua en condiciones fisiologicas (pH 7,4) pero muestran hidrofobicidad en un intervalo debilmente acido (pH 5-6,8) que corresponde al pH en el endosoma, y, por tanto, rompen la membrana endosomica, permitiendo de este modo la liberacion de un gen/farmaco desde el endosoma hacia el citoplasma. Dichos polfmeros anionicos conocidos incluyen poli (acido etilacrflico) (documento no de patente 12) y poli(acido propil acrflico) (documento no de patente 13) y se demostro que un polfmero de acido policarboxflico que tiene un pKa de aproximadamente 5 es menos citotoxico y eficaz para la liberacion de un acido nucleico del endosoma. Otros informes indicaron que el poliglicidol succinilado (documento no de patente 14) y pseudo-peptidos preparados mediante la modificacion de las cadenas laterales de poli (L-lisina iso-ftalamida) con L-fenilalanina (documento no de patente 15) son eficaces como polfmeros anionicos sensibles al pH en la liberacion de genes/farmacos desde el endosoma, mas especfficamente captacion de farmacos endocitados en el citoplasma.
Ejemplos de las modificaciones de carboxi en acido hialuronico con aminoacidos incluyen modificacion con un ester etflico de glicina usando, como agente de condensacion, 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina)-4-metilmorfolinio (en lo sucesivo tambien conocido como DMT-MM) formado con 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina en presencia de N- metilmorfolina, pero el grado de esta modificacion fue del 20 % como maximo (documento no de patente 16). Ejemplos de las modificaciones usando compuestos de triazina como agente de condensacion, que se publicaron en los documentos divulgados despues de la fecha de prioridad de la presente solicitud, incluyen acido hialuronico introducido en alanina (documento no de patente 18); y tambien se han notificado las modificaciones con otros aminoacidos mediante los mismos procedimientos (documento no de patente 19, documento de patente 10). Se produjo aun otro informe que indicaba que el acido hialuronico estaba modificado con clorhidrato de ester metflico de leucina, clorhidrato de ester metflico de valina, clorhidrato de ester metflico de isoleucina, clorhidrato de ester metflico de prolina, clorhidrato de ester metflico de fenilalanina, clorhidrato de ester metflico de arginina, o clorhidrato de ester metflico de histidina usando clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (en lo sucesivo tambien conocido como EDC) como agente de condensacion, y el producto resultante se gelifico sin desproteger, de modo que se preparo una pelfcula biocompatible insoluble en agua, pero el grado de esta modificacion era desconocido (documento de patente 9).
En cuanto a la modificacion del acido hialuronico mediante la amidacion de grupos carboxilo en acido hialuronico con una amina alifatica o una amina arilalifatica, se publicaron ejemplos donde se introdujeron bencilamina, octilamina, dodecilamina, y hexadecilamida usando 1,1-carbonildiimidazol en rendimientos del 60 %, 25 %, 15 % y 5 %, respectivamente, pero los grados de estas modificaciones fueron del 60 % como maximo (documento no de patente 11).
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LISTA DE CITAS
DOCUMENTOS DE PATENTE
Documento de patente 1: publicacion de patente internacional n.° WO 92/06714
Documento de patente 2: Publicacion de la solicitud de patente japonesa sin examinar numero JP 2001-81103
Documento de patente 3: Publicacion de la solicitud de patente japonesa sin examinar numero JP H02-273176
Documento de patente 4: Publicacion de la solicitud de patente japonesa sin examinar numero JP H05-85942
Documento de patente 5: publicacion de patente internacional n.° WO 01/05434
Documento de patente 6: publicacion de patente internacional n.° WO 01/60412
Documento de patente 7: publicacion de patente internacional n.° WO 2006/028110
Documento de patente 8: publicacion de patente internacional n.° WO 1999/029839
Documento de patente 9: publicacion de patente internacional n.° WO 92/20349
Documento de patente 10: publicacion de patente internacional n.° WO 2011/148116
Documento de patente 11: publicacion de patente internacional n.° WO 2000/01733
DOCUMENTOS NO DE PATENTE
documento no de patente 1: Int. J. Pharm., Vol. 255, p. 167-174, 2003 Documento no de patente 2: J. Control. Rel., Vol. 88, p. 35-42, 2003 Documento no de patente 3: J. Biol. Chem., Vol. 262, p. 4429-4432, 1987 Documento no de patente 4: J. Control. Rel., Vol. 60, p. 149-160, 1999 Documento no de patente 5: Bioconjugate Chem., Vol. 10, p. 406-411, 1999 Documento no de patente 6: Bioconjugate Chem., Vol. 4, p. 372-379, 1993 Documento no de patente 7: J. Control. Rel., Vol. 56, p. 259-272, 1998 Documento no de patente 8: J. Biol. Chem., Vol. 272, p. 16010-16017, 1997 Documento no de patente 9: J. Biol. Chem., Vol. 276, p. 35103-35110, 2001 Documento no de patente 10: Biopolymers, Vol. 89, p. 635-642, 2008 Documento no de patente 11: Bioconjugate Chem., Vol. 14, p. 51-57, 2003 Documento no de patente 12: Acc. Chem. Res., Vol. 25, p. 336-342, 1992 Documento no de patente 13: J. Control. Rel., Vol. 61, p. 137-143, 1999 Documento no de patente 14: Bioconjugate Chem., Vol. 19, p. 1040-1048, 2008 Documento no de patente 15: Biomaterials, Vol. 30, p. 1954-1961,2009 Documento no de patente 16: Biomacromolecules, Vol. 8, p. 2190-2195, 2007 Documento no de patente 17: J. Control. Rel., Vol. 119, p. 245-252, 2007 Documento no de patente 18: CARBOHYDRATE Polymers, Vol. 86, p. 747-752, 2011 Documento no de patente 19: CARBOHYDRATE Polymers, Vol. 87, p. 2211-2216, 2012
Sumario de la invencion
PROBLEMA TECNICO
Se ha encontrado que la permanencia en sangre de un derivado de acido hialuronico se correlaciona con el grado de modificacion de carboxi en su resto de acido glucuronico y tambien que la correlacion cambia dramaticamente una vez que se excede el umbral particular; Por lo que es diffcil controlar la permanencia en sangre de un derivado de acido hialuronico dentro de un intervalo deseable simplemente controlando el grado de modificacion del carboxi. Por consiguiente, ha existido la necesidad de un proceso para controlar la permanencia en sangre de una manera mas simple y mas fiable. Tambien se supone que a medida que el acido hialuronico se vuelve menos reconocible por un receptor, es menos susceptible al metabolismo en el cuerpo vivo y su biodegradabilidad intrfnseca es mas diffcil de exhibir. Por lo tanto, se ha necesitado un nuevo sustrato que se caracteriza tanto por su biodegradabilidad (seguridad) como por su permanencia en la sangre.
Aunque se han publicado diversos materiales que pueden utilizarse para la administracion de un ingrediente activo medico endocitado en el citoplasma, tambien se ha necesitado un proceso para administrar un ingrediente activo de manera mas eficaz y/o mas segura.
Un problema que debe resolver la presente invencion es proporcionar un derivado de acido hialuronico caracterizado tanto por biodegradabilidad como por permanencia en sangre y/o un derivado de acido hialuronico que puede administrar un gen o un farmaco en el citoplasma. Otro problema que se debe resolver mediante la presente invencion es proporcionar un conjugado entre el derivado de acido hialuronico y un farmaco y una composicion farmaceutica que comprende el derivado de acido hialuronico, en particular, un complejo entre el derivado de acido hialuronico y el farmaco.
SOLUCION AL PROBLEMA
Los presentes inventores tienen estudios intensivos para resolver los problemas citados anteriormente y, como
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resultado, han descubierto que un derivado de acido hialuronico, que se obtiene amidando el carboxi en el resto acido glucuronico del acido hialuronico o una sal del mismo a traves de su reaccion con una alquilamina particular, un acido amino-carboxflico concreto o una amida de acido amino-carboxflico concreta, se caracteriza por la biodegradabilidad y la permanencia en la sangre. Por lo tanto, los inventores han completado la presente invencion. Los inventores han descubierto tambien que un derivado de acido hialuronico modificado con un acido amino- carboxflico particular es eficaz para la liberacion de un gen/farmaco desde el endosoma al citoplasma y, por lo tanto, los inventores han completado la invencion.
Mas especfficamente, la presente invencion se refiere a un derivado de acido hialuronico caracterizado tanto por biodegradabilidad como por permanencia en sangre, y a un derivado de acido hialuronico que hace posible prevenir la degradacion de un compuesto que tiene actividad farmacologica, en particular un farmaco de acido nucleico, dentro del cuerpo vivo y liberar el compuesto en el citoplasma. Ademas, la presente invencion se refiere a un proceso para preparar el derivado de acido hialuronico, asf como a una composicion farmaceutica que comprende un farmaco y el derivado de acido hialuronico, y a un proceso para preparar dicha composicion.
Se proporcionan derivados de acido hialuronicos como se citan mas adelante en (1) a (17).
(1) Un derivado de acido hialuronico que comprende unidades de disacarido representadas cada una de ellas por la Formula (I):
R1, R2, R3, y R4 se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo C1-6, formilo y alquilcarbonilo C1-6;
R8 es un atomo de hidrogeno, formilo o alquilcarbonilo C1-6;
X es un grupo representado por -NRx-A-B-Z;
A se selecciona de entre -cRaRb- y cicloalquileno C3-8, B es un enlace directo y Z es -COORy o -CONRyaRyb; o -A-B-Z representa alquilo C1-6; o
A es -CH2- o -CH2-CH2-, B se selecciona de entre fenileno (donde el fenileno puede estar sustituido por uno o mas grupos seleccionados de entre los atomos de hidroxi y de halogeno), cicloalquileno C3-8 y fenilmetano- 1,1 -diflo, y Z es -COORy;
Rx y Ry se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno y alquilo C1-6;
Ra se selecciona de entre un atomo de hidrogeno y alquilo C1-6;
Rb se selecciona de entre un atomo de hidrogeno, alquilo C1-6 (donde el alquilo C1-6 puede estar sustituido por uno o mas grupos seleccionados de entre hidroxi, carboxi, cicloalquilo C3-8, arilo y carbamoflo, donde el arilo puede estar sustituido con hidroxi), cicloalquilo C3-8, y arilo (donde el arilo puede estar sustituido por hidroxi); Rya y Ryb se selecciona cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo C1-6, formilo y alquilcarbonilo C1-6], donde, cuando A en la Formula (I) es -CRaRb- o cicloalquileno C3-8, la proporcion de las unidades de disacarido de Formula (I) con respecto a las unidades de disacarido presentes es al menos 70 %.
(2) El derivado de acido hialuronico como se cita en (1), donde X es -NHCH3, -NH(CH2)2CH3, o -NRx-A-Z; y A es - CRaRb- o cicloalquileno C3-8.
(3) El derivado de acido hialuronico como se cita en (1), donde A es cicloalquileno C3-8, y B es un enlace directo;
A es -CH2- o -CH2-CH2-, y B se selecciona de entre fenileno (donde el fenileno puede estar sustituido por uno o mas grupos seleccionados de entre los atomos de hidroxi y de halogeno), cicloalquileno C3-8 y fenilmetano- 1,1 -diflo; o A se selecciona de entre 2-ciclohexiletano-1,1 -diflo, 2-(2-naftil)etano-1,1 -diflo, 3-fenilpropano-1,1- diflo, ciclohexilmetano-1,1-diflo y 4-hidroxifenilmetano-1,1-diflo y B es un enlace directo.
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A es -CH2-, y B se selecciona de entre ciclohexano-1,1-dnlo, benceno-1,4-dnlo, benceno-1,3-dnlo, 2- clorobenceno-1,4-dnlo y fenilmetano-1,1-dnlo;
A es -CH2CH2-, y B es benceno-1,4-dnlo; o
A se selecciona de entre 2-ciclohexiletano-1,1-dnlo, 2-(2-naftil)etano-1,1-dMlo y 3-fenilpropano-1,1-dnlo; y B es un enlace directo.
(5) El derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (4), donde Z es -COORy.
(6) Un derivado de acido hialuronico que comprende unidades de disacarido representadas por la Formula (I):
[Formula 2]
R1, R2, R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo C1-6, formilo y alquilcarbonilo C1-6;
R8 es un atomo de hidrogeno, formilo o alquilcarbonilo C1-6;
X es un grupo representado por -NHCH3, -NH(CH2)2CH3, -NRx-A-B-COORy o -NRx-CHRc-CONRyaRyb;
Rx y Ry se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno y alquilo C1-6;
A se selecciona de entre -CRaRb-, cicloalquileno C3-8, 2-ciclohexiletano-1,1-dNlo, 2-(2-naftil)etano-1,1 -diflo, 3- fenilpropano-1,1-di^lo, ciclohexilmetano-1,1-dNlo y 4-hidroxifenilmetano-1,1-dMlo, y B es un enlace directo; o A es -CH2- o -CH2-CH2-, y B se selecciona de entre fenileno (donde el fenileno puede estar sustituido por uno o mas grupos seleccionados de entre los atomos de hidroxi y de halogeno), cicloalquileno C3-8 y fenilmetano- 1,1-dnlo;
Ra se selecciona de entre un atomo de hidrogeno y alquilo C1-6;
Rb se selecciona de entre un atomo de hidrogeno y alquilo C1-6 (donde el alquilo C1-6 puede estar sustituido por uno o mas grupos seleccionados de entre hidroxi, carboxi y carbamoflo);
Rc representa alquilo C1-6 que puede estar sustituido por carbamoflo;
Rya y Ryb se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo C1-6, formilo y alquilcarbonilo C1-6] donde, cuando A en la Formula (I) es -CRaRb- o cicloalquileno C3-8, la proporcion de las unidades de disacarido de Formula (I) con respecto a las unidades de disacarido presentes es al menos 70 %.
(7) El derivado de acido hialuronico como se cita en (6), donde X es -NHCH3, -NH(CH2)2CH3 o -NRx-CHRc- CONRyaRyb, o A es -CRaRb- o cicloalquileno C3-8.
(8) El derivado de acido hialuronico como se cita en (6), donde
A es cicloalquileno C3-8, y B es un enlace directo;
A es -CH2- o -CH2-CH2-, y B se selecciona de entre fenileno (donde el fenileno puede estar sustituido por uno o mas grupos seleccionados de entre los atomos de hidroxi y de halogeno), cicloalquileno C3-8 y fenilmetano- 1,1-dnlo; o A se selecciona de entre 2-ciclohexiletano-1,1-dNlo, 2-(2-naftil)etano-1,1-dnlo, 3-fenilpropano-1,1- diflo, ciclohexilmetano-1,1-diflo y 4-hidroxifenilmetano-1,1-dnlo y B es un enlace directo.
(9) El derivado de acido hialuronico como se cita en (6) o (8), donde
A es -CH2-, y B se selecciona de entre ciclohexano-1,1-dnlo, benceno-1,4-dnlo, benceno-1,3-dnlo, 2- clorobenceno- 1,4-dnlo y fenilmetano-1,1-dnlo;
A es -CH2CH2-, y B es benceno-1,4-dnlo; o
A se selecciona de entre 2-ciclohexiletano-1,1-dnlo, 2-(2-naftil)etano-1,1-dMlo y 3-fenilpropano-1,1-dnlo; y B es un enlace directo.
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R1 R2 R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo C1-6, formilo y alquilcarbonilo C1-6;
R8 es un atomo de hidrogeno, formilo o alquilcarbonilo C1-6;
X es un grupo representado por -NRx-A-B-COORy;
Rx y Ry se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno y alquilo C1-6;
A se selecciona de entre -CRaRb-, cicloalquileno C3-8, 2-ciclohexiletano-1,1-diflo, 2-(2-naftil)etano-1, 1 -diflo, y 3-fenilpropano-1,1-diflo, y B es un enlace directo; o A es -CH2-, y B se selecciona de entre fenileno y cicloalquileno C3-8;
Ra se selecciona de entre un atomo de hidrogeno y alquilo C1-6;
Rb se selecciona de entre un atomo de hidrogeno y alquilo C1-6 (donde el alquilo C1-6 puede estar sustituido por uno o mas grupos seleccionados de entre hidroxilo y carboxi,]
donde, cuando A en la Formula (I) es -CRaRb- o cicloalquileno C3-8, la proporcion de las unidades de disacarido de Formula (I) con respecto a las unidades de disacarido presentes es al menos 70 %.
(11) El derivado de acido hialuronico como se cita en (10), donde A es -CRaRb- o cicloalquileno C3-8
(12) El derivado de acido hialuronico como se cita en (10), donde
A es cicloalquileno C3-8, y B es un enlace directo;
A es -CH2-, y B se selecciona de entre fenileno y cicloalquileno C3-8; o
A se selecciona de entre 2-ciclohexiletano-1,1-diflo, 2-(2-naftil)etano-1,1 -diflo y 3-fenilpropano-1,1-diflo, y B es un enlace directo.
(13) El derivado de acido hialuronico como se cita en (10) o (12), donde
A es -CH2- y B se selecciona de entre ciclohexano-1,1-diflo y benceno-1,4-diflo; o
A se selecciona de entre 2-ciclohexiletano-1,1-diflo, 2-(2-naftil)etano-1,1 -diflo y 3-fenilpropano-1,1-diflo, y B es un enlace directo.
(14) El derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (13), que ademas comprende unidades de disacarido representadas por la formula (II):
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[donde
R , R , R , y R se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo Ci- 6, formilo y alquilcarbonilo Ci-a;
R8a es un atomo de hidrogeno, formilo o alquilcarbonilo Ci-a;
Xa se selecciona de entre hidroxi y -O-Q+, donde Q+ representa a contracation].
(15) El derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (14), que ademas comprende unidades de disacarido representadas por la formula (III):
R1b, R2b, R3b, y R4b se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo C1- a, formilo y alquilcarbonilo C1-a;
R8b es un atomo de hidrogeno, formilo o alquilcarbonilo C%a;
Xb es un grupo representado por -NRe-Yb-Rd; donde Re es un atomo de hidrogeno o alquilo C1-a;
Rd es un atomo de hidrogeno, alquilo C1-a, -CO-C(R7)=CH2, o -CO-G4-Xc;
R7 es un atomo de hidrogeno o metilo;
G4 se selecciona de entre fenileno, cicloalquileno C3-8 y -G5-(alquileno C1-10)-Ga-, donde el resto de alquileno C1.10 puede tener de uno a tres fenilenos o cicloalquilenos C3-8insertados en e mismo;
G5 y Ga se seleccionan cada uno independientemente de entre un enlace directo, fenileno y cicloalquileno C3-
8;
Xc es mercapto, un atomo de halogeno o un grupo representado por
[Formula 6]
0 •
Yb es -CH2-(CHR5)1-2-CH2-NH-, -CH2-(CHRa)p-2-CH2-O-, -(CH2)j-S-, o -(CH2)a-(Y1-(CH2)b)c-G-;
1, p y j son cada uno independientemente un numero entero seleccionado de entre 2 y 10, y R5 y Ra son cada uno independientemente un atomo de hidrogeno o hidroxi; a es un numero entero seleccionado de entre 2 y 10;
cada b es independientemente un numero entero seleccionado de entre 2 y 10; c es un numero entero seleccionado de entre 1 y 200;
Y1 es un atomo de oxfgeno o -NRn-;
G es un atomo de oxfgeno, un atomo de azufre o -NH-;
Rn es un atomo de hidrogeno, alquilo C1-a, -CO-(CH2)d-R°, -(CH2)e-Rp, o -(CH2)r(Y2-(CH2)g)h-Rq;
cada g es independientemente un numero entero seleccionado de entre 2 y 10;
d, e, f y h son cada uno independientemente un numero entero seleccionado de entre 2 y 10;
Ro, Rp y Rq se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, hidroxi, carboxi o - NHRr;
Y2 es un atomo de oxfgeno o -NH-;
Rr es un atomo de hidrogeno, formilo o alquilcarbonilo C1-a].
(1a) El derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (15), que se prepara usando acido hialuronico compuesto exclusivamente por las unidades de disacarido representadas cada una por la Formula (II)
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como se cita en (14), donde, cuando R , R , R , y R son todos atomos de hidrogeno, R es acetilo, y X es - O'Na+, el peso molecular promedio en peso esta en el intervalo de 20-120 kilodalton.
(17) El derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (15), donde un acido hialuronico no derivatizado correspondiente al derivado de acido hialuronico en terminos de la estructura principal tiene un peso molecular promedio en peso de 20-120 kilodalton, donde el acido hialuronico no derivatizado es acido hialuronico
11 1a 2a 3a 4a
compuesto exclusivamente por unidades de disacarido de formula (II) donde R , R , R y R son atomos de hidrogeno, R8a es acetilo y Xa es -O"Na+.
En otro aspecto proporcionado es una composicion farmaceutica que comprende el derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (17) como transportador.
En otro aspecto mas tambien, se proporciona un derivado/conjugado de farmaco de acido hialuronico donde uno o mas farmacos se conjugan con el derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (17).
En aun otro aspecto tambien, se proporciona un transportador de farmaco biodegradable que comprende el derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (17).
En auno otro tambien, se proporciona un transportador para la transferencia intracitoplasmatica de un farmaco, que comprende el derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (17).
Ademas, en otro aspecto, se proporciona un transportador de farmaco biodegradable que comprende el derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1), (2), (5) a (7), (10), (11), y (14) a (17).
En aun otro aspecto se proporciona un transportador para la transferencia intracitoplasmatica de un farmaco, que comprende el derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1), (3) a (6), (8) a (10), y (12) a (17).
Ademas, en otro aspecto, se proporciona un metodo para administrar un farmaco, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un farmaco junto con el derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (17).
En aun otro aspecto, se proporciona un metodo de transferencia intracitoplasmatica de un farmaco, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un farmaco junto con el derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1) a (17).
Ademas, en otro aspecto, se proporciona un metodo para administrar un farmaco, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un farmaco junto con el derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1), (2), (5) a (7), (10), (11), y (14) a (17).
En aun otro aspecto, se proporciona un proceso para la transferencia intracitoplasmatica de un farmaco, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un farmaco junto con el derivado de acido hialuronico como se cita en uno cualquiera de (1), (3) a (6), (8) a (10), y (12) a (17).
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-TBA preparado en el Ejemplo 1-2.
La figura 2 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-FL/tBa preparado en el Ejemplo 1-3.
La figura 3-1 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Ala/FL preparado en el Ejemplo 1-4-1.
La figura 3-2 muestra ejemplos de los espectros de RMN de 1H de HA-Ser/FL y HA-Ser-OEt/FL preparados en el Ejemplo 1-4-2.
La figura 3-3 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Glu/FL preparado en el Ejemplo 1-4-3.
La figura 3-4 muestra ejemplos de los espectros de RMN de 1H de HA-Gly/FL y HA-Gly-OEt/FL preparados en el Ejemplo 1-4-4.
La figura 3-5 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Val/FL preparado en el Ejemplo 1-4-5.
La figura 3-6 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Leu/FL preparado en el Ejemplo 1-4-6.
La figura 3-7 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Ile/FL preparado en el Ejemplo 1-4-7.
La figura 3-8 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Thr/FL preparado en el Ejemplo 1-4-8.
La figura 3-9 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Asp/FL preparado en el Ejemplo 1-4-9.
La figura 3-10 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-cACHCA/FL preparado en el Ejemplo 1-410.
La figura 3-11 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-tACHCA-OEt/FL preparado en el Ejemplo 1-4-11.
La figura 3-12 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Aib/FL preparado en el Ejemplo 1-4-12.
La figura 3-13 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-ACBuCA-OEt/FL preparado en el Ejemplo 1-4-13.
La figura 3-14 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Asn/FL preparado en el Ejemplo 1-4-14.
La figura 3-15 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Ala-NH2/Rh preparado en el Ejemplo 1-4-
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La figura 3-16 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Val-NH^/Rh preparado en el Ejemplo 1-416.
La figura 3-17 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Asn-NH2/Rh preparado en el Ejemplo 1-417.
La figura 3-18 muestra ejemplos de los espectros de RMN de 1H de HA-Me y HA-Me/FL preparados en el Ejemplo 1-4-18.
La figura 3-19 muestra ejemplos de los espectros de RMN de 1H de HA-Pr y HA-Pr/FL preparados en el Ejemplo 1-4-19.
La figura 4-1 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-AMCHCA preparado en el Ejemplo 1-5-1.
La figura 4-2 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-pcACHCA preparado en el Ejemplo 1-5-2.
La figura 4-3 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Nal preparado en el Ejemplo 1-5-3.
La figura 4-4 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-APBA preparado en el Ejemplo 1-5-4.
La figura 4-5 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Cha preparado en el Ejemplo 1-5-5.
La figura 4-6 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-AMBA preparado en el Ejemplo 1-5-6.
La figura 4-7 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-3AMB preparado en el Ejemplo 1-5-7.
La figura 4-8 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-APhPA preparado en el Ejemplo 1-5-8.
La figura 4-9 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-AEBA preparado en el Ejemplo 1-5-9.
La figura 4-10 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-AMClBA preparado en el Ejemplo 1-5-10.
La figura 4-11 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-AMSA preparado en el Ejemplo 1-5-11.
La figura 4-12 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-4AMChCa preparado en el Ejemplo 1-512.
La figura 4-13 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Chg preparado en el Ejemplo 1-5-13.
La figura 4-14 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-pHPhg preparado en el Ejemplo 1-5-14.
La figura 5-1 muestra ejemplos de los espectros de RMN de 1H de HA-FL y HA-EDOBEA con un grado de modificacion bajo, que se prepararon en el Ejemplo comparativo 1-1-1.
La figura 5-2 muestra ejemplos de los espectros de rMn de 1H de HA-EDOBEA-Ac/FL y HA-EDOBEA con un grado de modificacion alto, que se prepararon en el Ejemplo comparativo 1-1-2.
La figura 5-3 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Phe/FL preparado en el Ejemplo comparativo 1-1-3.
La figura 5-4 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Tyr/FL preparado en el Ejemplo comparativo 1-1-4.
La figura 5-5 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-MePhe/FL preparado en el Ejemplo comparativo 1-1-5.
La figura 5-6 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Pro-OMe/FL preparado en el Ejemplo comparativo 1-1-6.
La figura 5-7 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Gly-NH2/Rh preparado en el Ejemplo comparativo 1-1-7.
La figura 5-8 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Ser-NH2/Rh preparado en el Ejemplo comparativo 1-1-8.
La figura 5-9 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Leu-NH2/Rh preparado en el Ejemplo comparativo 1-1-9.
La figura 5-10 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Ile-NH2/Rh preparado en el Ejemplo comparativo 1-1-10.
La figura 5-11 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Thr-NH2/Rh preparado en el Ejemplo comparativo 1-1-11.
La figura 5-12 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Gln-NH2/Rh preparado en el Ejemplo comparativo 1-1-12.
La figura 6-1 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Nle preparado en el Ejemplo comparativo 12-1.
La figura 6-2 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-tLeu preparado en el Ejemplo comparativo 1-2-2.
La figura 6-3 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-pFPhe preparado en el Ejemplo comparativo 1-2-3.
La figura 6-4 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Phg preparado en el Ejemplo comparativo 12-4.
La figura 7 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de PEG-FL preparado en el Ejemplo comparativo 1-3. La figura 8 muestra los promedios del grupo para los cursos de tiempo de las concentraciones de la muestra en plasma de rata segun se calculo en el Ejemplo 3-2-2.
La figura 9-1 muestra los graficos que representan los promedios del grupo para los cursos de tiempo de las concentraciones de la muestra en plasma de rata segun se calculo en el Ejemplo 3-2-2.
La figura 9-2 muestra los graficos que representan los promedios del grupo para los cursos de tiempo de las concentraciones de la muestra en plasma de rata segun se calculo en el Ejemplo 3-2-2.
La figura 10-1 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatografia de exclusion por tamano en las muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Ala/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-1.
La figura 10-2 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatografia de exclusion por tamano en las
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muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Ser/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-2.
La figura 10-3 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Glu/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-3.
La figura 10-4 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Gly/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-4.
La figura 10-5 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Val/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-5.
La figura 10-6 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Leu/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-6.
La figura 10-7 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Ile/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-7.
La figura 10-8 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Thr/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-8.
La figura 10-9 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Asp/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-9.
La figura 10-10 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-cACHCA/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-10.
La figura 10-11 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-tACHCA-OEt/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-11.
La figura 10-12 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Aib/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-12.
La figura 10-13 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-ACBuCA-OEt/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-13.
La figura 10-14 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Asn/Rh preparadas en el Ejemplo 1-4-14.
La figura 10-15 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Ala-NH2/Rh preparadas en el Ejemplo 1-4-15.
La figura 10-16 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Val-NH2/Rh preparadas en el Ejemplo 1-4-16.
La figura 10-17 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Asn-NH2/Rh preparadas en el Ejemplo 1-4-17.
La figura 10-18 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Me/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-18.
La figura 10-19 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Pr/FL preparadas en el Ejemplo 1-4-19.
La figura 10-20 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-FL preparadas en el Ejemplo 1-1-1.
La figura 10-21 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-EDOBEA-Ac/FL preparadas en el Ejemplo 1-1-2.
La figura 10-22 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Phe/FL preparadas en el Ejemplo 1-1-3.
La figura 10-23 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Tyr/FL preparadas en el Ejemplo 1-1-4.
La figura 10-24 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-MePhe/FL preparadas en el Ejemplo 1-1-5.
La figura 10-25 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Pro-OMe/FL preparadas en el Ejemplo 1-1-6.
La figura 10-26 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Gly-NH2/Rh preparadas en el Ejemplo 1-1-7.
La figura 10-27 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Ser-NP2/Rh preparadas en el Ejemplo 1-1-8.
La figura 10-28 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Leu-NH2/Rh preparadas en el Ejemplo 1-1-9.
La figura 10-29 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Ile-NH2/Rh preparadas en el Ejemplo 1-1-10.
La figura 10-30 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Thr-NH2/Rh preparadas en el Ejemplo 1-1-11.
La figura 10-31 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Gln-NH2/Rh preparadas en el Ejemplo 1-1-12.
La figura 11 es una tabla que muestra los grados de degradacion de los liposomas de los derivados de HA de acuerdo con la presente invencion segun se evaluo en el Ejemplo 4-2.
La figura 12-1 muestra ejemplos de los espectros de rMn de 1H de la muestra para calcular los grados de modificacion con alanina y HA-Ala-TBA, que se prepararon en el Ejemplo 5-1.
La figura 12-2 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Ala-EDOBEA preparado en el Ejemplo 5-2. La figura 12-3 muestra un ejemplo del espectro de RMN de 1H de HA-Ala-EDOBEA-Rh preparado en el Ejemplo 5-3.
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La figura 13 muestra los promedios del grupo para los cursos de tiempo de las concentraciones de la muestra en plasma de rata segun se calculo en el Ejemplo 6-2-2.
La figura 14 muestra el grafico que representa los promedios del grupo para los cursos de tiempo de las concentraciones de la muestra en plasma de rata segun se calculo en el Ejemplo 6-2-2.
La figura 15 muestra los cromatogramas obtenidos realizando cromatograffa de exclusion por tamano en las muestras de orina de las ratas tratadas con HA-Ala-PTH/Rh preparadas en el Ejemplo 5-5.
Descripcion de realizaciones
El derivado de acido hialuronico de la presente invencion no esta particularmente limitado, siempre y cuando sea un derivado de acido hialuronico que comprende una o mas unidades de disacarido representadas por la Formula (I). En una realizacion de la presente invencion, la proporcion de las unidades de disacarido de Formula (I) con respecto a las unidades de repeticion de disacarido presentes en el derivado de acido hialuronico de la presente invencion es, por ejemplo, de al menos 70 %, preferentemente de al menos 75 % y, mas preferentemente, de al menos 90 %. El lfmite superior de dicha proporcion puede ser cualquier valor no superior al 100 %. En una realizacion de la presente invencion, se proporciona un derivado de acido hialuronico que comprende una o mas unidades de disacarido representadas por la Formula (I) y una o mas unidades de disacarido representadas por la Formula (II) y/o (III).
En una realizacion de la presente invencion, el derivado de acido hialuronico esta compuesto sustancialmente por unidades de disacarido de Formulas (I) y (II). En el derivado de acido hialuronico, por ejemplo al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 % y, mas preferentemente, al menos un 95 % de sus unidades de repeticion de disacarido constitutivas compuestas por acido D-glucuronico y N-acetilglucosamina estan ocupadas por las unidades de disacarido de Formula (I) o (II). En una realizacion de la presente invencion, el derivado de acido hialuronico esta compuesto exclusivamente por unidades de disacarido representadas por las Formulas (I) y (II).
En una realizacion de la presente invencion, el derivado de acido hialuronico esta compuesto sustancialmente por unidades de disacarido de Formulas (I), (II) y (III). En el derivado de acido hialuronico, por ejemplo al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 % y, mas preferentemente, al menos un 95 % de sus unidades de repeticion de disacarido constitutivas compuestas por acido D-glucuronico y N-acetilglucosamina estan ocupadas por las unidades de disacarido de Formula (I), (II) o (III). En una realizacion de la presente invencion, el derivado de acido hialuronico esta compuesto exclusivamente por unidades de disacarido representadas por las Formulas (I), (II) y (III).
La proporcion de unidades de disacarido particulares con respecto a las unidades de repeticion de disacarido presentes en el derivado de acido hialuronico de la presente invencion significa, preferentemente, la proporcion de unidades de disacarido particulares con respecto a todas las unidades de disacarido presentes en una cierta cantidad del derivado de acido hialuronico de la presente invencion que es un polisacarido compuesto por unidades de repeticion de un disacarido.
En la Formula (I) que representa una unidad de disacarido presente en el derivado de acido hialuronico de la presente invencion, R1, R2, R3 y R4 son todos, preferentemente, atomos de hidrogeno. R8 es, preferentemente, un atomo de hidrogeno o alquilcarbonilo C1-6, mas preferentemente, un atomo de hidrogeno o acetilo, e, incluso mas preferentemente, acetilo. En las formulas (II) y (III) que representan unidades de disacarido presentes en el derivado de acido hialuronico de la presente invencion, R1a, R2a, R3a y R4a, asf como R1b, R2b, R36 y R4b son todos, preferentemente, atomos de hidrogeno. R8a y R8b son cada uno, preferentemente, un atomo de hidrogeno o alquilcarbonilo C1-6, mas preferentemente, un atomo de hidrogeno o acetilo, e, incluso mas preferentemente, acetilo.
En la Formula (I), cuando -A-B-Z es alquilo C1-6, alquilo C1-3 es preferente, y metilo o n-propilo es particularmente preferente.
En la Formula (I), Rx es un atomo de hidrogeno, o alquilo C1-6, tal como metilo y etilo, y es, preferentemente, un atomo de hidrogeno. Ry es un atomo de hidrogeno, o alquilo C1-6, tal como metilo y etilo, y es, preferentemente, un atomo de hidrogeno, metilo o etilo.
En la Formula (I), cuando A o B es cicloalquileno C3-8, ejemplos del cicloalquileno C3-8 incluyen 1,1-ciclohexileno, 1,2- ciclohexileno, 1,3-ciclohexileno, 1,4-ciclohexileno, 1,1-ciclopentileno, 1,2-ciclopentileno, 1,3-ciclopentileno, 1,1- ciclobutileno, 1,2-ciclobutileno, y 1,3-ciclobutileno. Entre los ejemplos preferentes se incluyen 1,1-ciclohexileno, 1,2- ciclohexileno, 1,4-ciclohexileno, y 1,1 -ciclobutileno. Desde el punto de vista de la provision tanto de biodegradabilidad como de permanencia en la sangre, el cicloalquileno C3-8 es, preferentemente, 1,1-ciclohexileno, 1,2-ciclohexileno, o 1,1-ciclobutileno, y desde el punto de vista de la administracion de un gen o un farmaco en el citoplasma, el cicloalquileno C3-8 es, preferentemente, 1,4-ciclohexileno.
En la Formula (I), cuando B es fenileno, ejemplos del fenileno incluyen 1,2-fenileno, 1,3-fenileno y 1,4-fenileno. Entre los ejemplos preferentes se incluyen 1,4-fenileno y 1,3-fenileno. Asimismo, cuando B es fenileno, entre los ejemplos particularmente preferentes se incluye 1,4-fenileno.
El fenileno puede estar sustituido por uno o mas grupos seleccionados de entre hidroxi y atomos de halogeno. Entre
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los ejemplos especfficos del fenileno sustituido se incluyen 2-hidroxi-1,4-fenileno, 3-hidroxi-1,4-fenileno, 2,3-dihidroxi-
1.4- fenileno, 3,5-dihidroxi-1,4-fenileno, 5-hidroxi-1,3-fenileno, 3-hidroxi-1,2-fenileno, y 4-hidroxi-1,2-fenileno; 2-cloro-
1.4- fenileno, 2-yodo-1,4-fenileno, 1-bromo-1,4-fenileno, 2,6-difluoro-1,4-fenileno, 3,5-dicloro-1,4-fenileno, 5-cloro-1,3- fenileno, 3-bromo-1,2-fenileno, y 4-cloro-1,2-fenileno; 6-fluoro-2-hidroxi-1.4-fenileno, 5-cloro-3-yodo-1,4-fenileno, 2- bromo-3-hidroxi-1,4-fenileno, 5-bromo-3-cloro-1,4-fenileno, 5-hidroxi-6-yodo-1,3-fenileno, 3-cloro-4-hidroxi-1,2- fenileno, y 4-bromo-3-cloro-1,2-fenileno, y, preferentemente, incluyen 3-hidroxi-1,4-fenileno y 2-cloro-1,4-fenileno.
Rc es alquilo C1.6 que puede estar sustituido por carbamoflo (-CONH2) y es, preferentemente, metilo, isopropilo o carbamoilmetilo, y es, mas preferentemente, isopropilo o carbamoilmetilo.
Rya y Ryb se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo C1-6, formilo y alquilcarbonilo C1-6; preferentemente, ambos son atomos de hidrogeno o uno de ellos es un atomo de hidrogeno y el otro es alquilo C1-6, o uno de ellos es un atomo de hidrogeno y el otro es alquilcarbonilo C1-6, mas preferentemente, ambos son atomos de hidrogeno o uno de ellos es un atomo de hidrogeno y el otro es metilo o uno de ellos es un atomo de hidrogeno y el otro es etilo; e incluso mas preferentemente, ambos son atomos de hidrogeno. En la Formula (I), X se ilustra con los siguientes grupos:
[donde Ry es como se define en el presente documento].
Los grupos de ejemplo son preferentes desde el punto de vista de la provision tanto de biodegradabilidad como de permanencia en la sangre.
Ademas, X en la Formula (I) se ilustra mediante los siguientes grupos:
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[donde Ry, Rya y Ryb son como se definen en el presente documento].
En las formulas anteriores, representa una posicion de union a carboxi en el derivado de acido hialuronico (lo mismo se aplica mas adelante en el presente documento).
En una realizacion de la presente invencion, desde el punto de vista de la provision tanto de biodegradabilidad como de permanencia en la sangre se prefiere que, como se define en la Formula (I), A sea -CRaRb- (donde Ra es como se ha definido anteriormente, y Rb se selecciona de entre un atomo de hidrogeno y alquilo Ci-6 (donde el alquilo Ci-6 puede estar sustituido por un grupo seleccionado de entre hidroxi y carboxi)), y B sea un enlace directo; o que A sea cicloalquileno C3-8, y B sea un enlace directo.
En otra realizacion de la presente invencion, desde el punto de vista de la provision tanto de biodegradabilidad como de permanencia en la sangre se prefiere que, como se define en la Formula (I), X sea -NHCH3, -NH(CH2)2CH3 o NRx-CHRc-CONRyaRyb; o que A sea --CRaRb- (donde Ra es como se ha definido anteriormente, y Rb se selecciona de entre un atomo de hidrogeno y alquilo Ci-6 (donde el alquilo Ci-6 puede estar sustituido por un grupo seleccionado de entre hidroxi, carboxi y carbamoflo)), y B sea un enlace directo; o que A sea cicloalquileno C3-8 y B sea un enlace directo.
Ra es, mas preferentemente, un atomo de hidrogeno y metilo, e incluso mas preferentemente, un atomo de hidrogeno. Rb es, preferentemente, un atomo de hidrogeno y alquilo C1-4 (donde el alquilo C1-4 puede estar sustituido por un grupo seleccionado de entre hidroxi y carboxi), y, mas preferentemente, metilo, que puede estar sustituido por hidroxi. Entre los ejemplos preferentes de Rb se incluyen un atomo de hidrogeno y alquilo C1-4 (donde el alquilo C1-4 puede estar sustituido por un grupo seleccionado de entre hidroxi, carboxi y carbamoflo).
B es, preferentemente, ciclohexano-1,2-diflo y ciclobutano-1,1-diflo, y, mas preferentemente, ciclohexano-1,2-diflo. Se prefiere que la configuracion de -NRx- y -COORy en el anillo de ciclohexano sea cualquiera de configuracion cis y
la configuracion trans. En el derivado de acido hialuronico de la presente invencion, las configuraciones de -NRx- y - COORy en los anillos de ciclohexano pueden consistir exclusivamente en configuraciones cis o en configuraciones trans, o pueden consistir en configuraciones cis y configuraciones trans en cualquier proporcion. Como alternativa, la configuracion de cada grupo puede consistir en uno de los tipos de configuracion o puede consistir en ambos tipos 5 de configuraciones en cualquier proporcion.
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Desde el punto de vista de la provision tanto de biodegradabilidad como de permanencia en la sangre, entre los ejemplos especfficos del X preferente se incluyen, pero sin limitacion, los grupos representados por las siguientes formulas:
[Formula 9]
15 Desde el punto de vista de la provision tanto de biodegradabilidad como de permanencia en la sangre, otros ejemplos especfficos del X preferente incluyen, pero sin limitacion, los grupos representados por las siguientes formulas:
5 Entre los ejemplos especfficos del X mas preferente se incluyen siguientes grupos:
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[Formula 12]
Entre los ejemplos especfficos del X mas preferente se incluyen siguientes grupos:
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Entre otros ejemplos especfficos del X mas preferente se incluyen los siguientes grupos:
[Formula 14]
Entre los ejemplos especfficos del X particularmente preferente se incluyen siguientes grupos:
[Formula 15]
hcT^C0:
HN
\*
Desde el punto de vista de la provision tanto de biodegradabilidad como de permanencia en la sangre, la proporcion de las unidades de disacarido de Formula (I) con respecto a las unidades de repeticion de disacarido presentes en el derivado de acido hialuronico de la presente invencion es, preferentemente, de al menos 70 %, mas preferentemente de al menos 75 %, e incluso mas preferentemente de al menos 90 %.
En una realizacion de la presente invencion, desde el punto de vista de la administracion de un gen o un farmaco en el citoplasma como se define en la formula (I) es preferente que A sea cicloalquileno C3-8 y B sea un enlace directo; o que A sea -CH2- y B se seleccione de fenileno y cicloalquileno C3-8; o que A se seleccione de entre 2- ciclohexiletano-1, 1 -diflo, 2-(2-naftil)etan-1,1 -diflo y 3-fenilpropano-1,1-diflo, y B sea un enlace directo. Es mas preferente que, como se define en la Formula (I), A sea -CH2-, y B se seleccione de entre ciclohexano-1,1-diflo y
benceno-1,4-difio; o que A se seleccione de entre 2-ciclohexiletano-1,1 -diflo, 2-(2-naftil)etano-1,1 -diflo y 3- fenilpropano-1,1-difio.
En otra realizacion de la presente invencion, desde el punto de vista de la administracion de un gen o un farmaco en 5 el citoplasma como se define en la formula (I) es preferente que A sea cicloalquileno C3-8 y B sea un enlace directo; o que A sea -CH2- o -CH2-CH2-, y B se seleccione de entre fenileno (donde el fenileno puede estar sustituido por uno o mas grupos seleccionados de entre hidroxi y atomos de halogeno), cicloalquileno C3-8 y fenilmetano-1,1-diflo; o que A se seleccione de entre 2-ciclohexiletano-1, 1 -diflo, 2-(2-naftil)etano-1,1-diflo, 3-fenilpropano-1,1-diflo, ciclohexilmetano-1,1-diflo y 4-hidroxifenilmetano-1,1-diflo, y B sea un enlace directo. Es mas preferente que, como 10 se define en la Formula (I), A sea -CH2-, y B se seleccione de entre ciclohexano-1,1-diflo, benceno-1,4-diflo, benceno-1,3-diflo, 2-clorobenceno-1,4-diflo y fenilmetano-1,1-diflo; o que A sea -CH2CH2-, y B sea benceno-1,4-diflo; o que A se seleccione de entre 2-ciclohexiletano-1,1-diflo, 2-(2-naftil)etano-1,1 -diflo y 3-fenilpropano-1,1-diflo.
Desde el punto de vista de la administracion de un gen o un farmaco en el citoplasma, entre los ejemplos especfficos 15 del X preferente se incluyen, pero sin limitacion, los grupos representados por las siguientes formulas:
[Formula 16]
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Desde el punto de vista de la administracion de un gen o un farmaco en el citoplasma, entre los ejemplos especfficos del X preferente se incluyen, pero sin limitacion, los grupos representados por las siguientes formulas:
5 Entre los ejemplos especfficos del X mas preferente se incluyen siguientes grupos:
[Formula 18]
Entre otros ejemplos especfficos del X mas preferente se incluyen los siguientes grupos:
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Cuando X en la Formula (I) contiene uno o mas puntos asimetricos, la configuracion en cada punto asimetrico puede consistir exclusivamente en una configuracion R o S, o puede consistir en ambas configuraciones en cualquier proporcion.
Cabe senalar que los siguientes grupos:
[Formula 20]
o los siguientes grupos:
[Formula 21]
pueden excluirse de X en la Formula (I).
En la Formula (II), Q+ no esta particularmente limitado, siempre que sea un contracation que forme una sal con carboxi en agua y cuando es divalente o superior, forma una sal con dos o mas grupos carboxi dependiendo de la Valencia. Ejemplos del contracation incluyen, pero sin limitacion, iones metalicos, tales como ion litio, ion sodio, ion rubidio, ion cesio, ion magnesio, ion calcio; y un ion amonio representado por la formula N+RjRkRlRm (donde Rj, Rk, R1 y Rm cada uno se seleccionan independientemente de entre un atomo de hidrogeno y Ci_a alquilo), y, preferentemente, incluyen ion sodio, ion potasio e ion tetraalquilamonio (por ejemplo, ion tetra-n-butilamonio). Rj, R,
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R1 y Rm son cada uno preferentemente el mismo grupo seleccionado de alquilos Ci-6, y son, cada uno mas preferentemente, n-butilo.
En la Formula (III), ejemplos de Xb incluyen los siguientes grupos:
-HN-(CH2)j-SH;
-HN-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-SH;
-HN-(CH2)p-O-CO-C(R7)=CH2;
-HN-(CH2)l-NHCO-C(Rr)=CH2;
-HN-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-NHCO-C(R7)=CH2; o -HN-CH2-CH2-(Y1-CH2-CH2)c-O-CO-C(R7)=CH2
[donde j, Y1. c, p R7 y 1 son como se han definido anteriormente en el presente documento].
En la presente invencion, "alquilo C1-6” significa alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de 1 a 6 atomos de carbono y los ejemplos incluyen "alquilo C1-4”, tal como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, i-butilo, y t-butilo, asf como n-pentilo, 3-metilbutilo, 2-metilbutilo, 1 -metilbutilo, 1 -etilpropilo, n-hexilo, 4-metilpentilo, 3- metilpentilo, 2-metilpentilo, 1 -metilpentilo, 3-etilbutilo, y 2-etilbutilo.
En la presente invencion, "alquilcarbonilo C1.6” significa alquilcarbonilo que tiene alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada, que contiene de 1 a 6 atomos de carbono, y los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pivaloflo, valerilo, isovalerilo, y hexanoflo.
En la presente invencion, "arilo” significa un grupo carbodclico aromatico, tal como un grupo carboxidclico aromatico que contiene de 6 a 14 atomos de carbono, y los ejemplos de arilo incluyen, pero sin limitacion, fenilo y naftilo (1- naftilo, 2-naftilo y 3-naftilo).
En la presente invencion, "cicloalquilo C3-8” significa alquilo dclico que contiene de 3 a 8 atomos de carbono y los ejemplos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
En la presente invencion, "cicloalquileno C3-8" significa alquilo cfclico divalente que contiene de 3 a 8 atomos de carbono y los ejemplos incluyen ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno, cicloheptileno, y ciclooctileno. Ejemplos mas especfficos incluyen, pero sin limitacion, 1,1-ciclohexileno, 1,2-ciclohexileno, 1,3- ciclohexileno, 1,4-ciclohexileno, 1,1-ciclopentileno, 1,2-ciclopentileno, 1,3-ciclopentileno, 1,1 -ciclobutileno, 1,2- ciclobutileno, y 1,3-ciclobutileno. Entre los ejemplos preferentes se incluyen 1,1-ciclohexileno, 1,2-ciclohexileno, 1,4- ciclohexileno, y 1,1 -ciclobutileno.
En la presente invencion, "fenileno" significa un grupo divalente donde dos atomos de hidrogeno en benceno estan sustituidos y los ejemplos incluyen benceno-1,2-diflo, benceno-1,3-diflo y benceno-1,4-diflo.
En la presente invencion, "alquileno C1-10" significa un grupo alquileno de cadena lineal o de cadena ramificada que contiene de 1 a 10 atomos de carbono y los ejemplos incluyen metileno, etano-1,2-diflo, propano-1,3-diflo, butano- 1,4-diflo, pentano-1,5-diflo, hexano-1,6-diflo, heptano-1,7-diflo, octano-1,8-diflo, nonano-1,9-diflo, decano-1,10-diflo, propano-1,2-diflo, 2-metil-propano-1,3-diflo, butano-2,4-diflo, 3-metilbutano-1,4-diflo, 2-metilpentano-1,5-diflo, 4- etilhexano-1,6-diflo, 4-metil-heptano-2,7-diflo, 5-etiloctano-1,8-diflo, y 6-metilnonano-1,9-diflo.
En la presente invencion, "alquileno C1-10 e tiene de uno a tres cicloalquilenos C3-8 o fenilenos insertados en el mismo" significa un grupo alquileno C1-10 donde de uno a tres, preferentemente uno, fenileno(s) o cicloalquileno(s) C3-8 esta(estan) insertados.
Ejemplos preferentes de G4 incluyen, pero sin limitacion, fenileno o los grupos representados por las siguientes formulas:
(donde x es un numero entero seleccionado de 1 a 10, y es un numero entero seleccionado de 1 a 6, z es un numero entero seleccionado de 1 a 5, y "**" representa una posicion de enlace a Xc).
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En la presente invencion, "atomo de halogeno" significa un atomo de fluor, un atomo de cloro, un atomo de bromo, o un atomo de yodo. Cuando Xc es un atomo de halogeno, se prefieren un atomo de cloro, un atomo de bromo y un atomo de yodo, y, desde el punto de vista de la reactividad con mercapto en un farmaco, se prefieren un atomo de bromo y un atomo de yodo.
En la presente invencion, "el transportador de farmaco es biodegradable" significa que el transportador de farmaco detectado en una orina se ha reducido en cuanto al peso molecular hasta que han transcurrido dos semanas despues de la inyeccion intravenosa a una rata y/o a un ser humano.
En la presente invencion, "intracelular" significa el interior de la membrana celular, incluyendo el endosoma y el nucleo celular.
En la presente invencion, "intracitoplasmatico" o "dentro del citoplasma" significa el interior de la membrana celular que excluye el endosoma y el nucleo celular.
En la presente invencion, "endosoma significa una vesfcula compuesta por una biomembrana, que se forma en el proceso de absorcion de una sustancia por una celula y una vesfcula formada por fusion de dicha vesfcula con el lisosoma.
Se puede juzgar el "peso molecular reducido" determinando el tamano de un transportador de farmaco excretado en una orina por cromatograffa de exclusion por tamano (vease el Ejemplo 3-3 en esta memoria descriptiva). Si la parte superior del pico del transportador de farmaco derivado de la orina como se observa en cualquier momento, hasta dos semanas despues del tratamiento o durante un periodo de 24 horas se desplaza al lado de bajo peso molecular en comparacion con el del transportador de farmaco derivado de la orina recogida en un punto de tiempo previo o durante un periodo previo (en otras palabras, el tiempo de retencion en el cromatograma se hace mas largo), entonces se considera que el transportador de farmaco es biodegradable.
El derivado de acido hialuronico de la presente invencion que comprende una o mas unidades de disacarido representadas por la Formula (I) se sintetiza tfpicamente usando, como material de partida, acido hialuronico o un derivado del mismo que esta compuesto sustancialmente por unidades de disacarido representadas por la Formula (II), mas preferentemente acido hialuronico (incluyendo una sal del mismo) que esta compuesto exclusivamente por unidades de disacarido representadas cada una por la Formula (II). En un aspecto de la presente invencion, el peso molecular promedio en peso del acido hialuronico a utilizar como material de partida esta en el intervalo de 20-120 kilodalton y, preferentemente, en el intervalo de 20-30 y 50-120 kilodalton. El peso molecular promedio en peso preferente se ilustra por 25 kilodalton y 99 kilodalton. Desde el punto de vista de la permanencia mejorada en la sangre, es suficiente como mfnimo 5 kilodalton como lfmite inferior del peso molecular promedio en peso, y es, preferentemente, al menos 50 kilodalton y, mas preferentemente, al menos 99 kilodalton. El lfmite superior del peso molecular promedio en peso es, preferentemente no mayor de 250 kilodalton. El peso molecular promedio en peso preferente desde el punto de vista de la biodegradabilidad esta en el intervalo de 50-120 kilodalton, por ejemplo 99 kilodalton, y el peso molecular promedio en peso desde el punto de vista de la migracion intracitoplasmatica esta en el intervalo de 20-120 kilodalton, por ejemplo 25 kilodalton y 99 kilodalton.
Como se hace referencia en el presente documento, el peso molecular promedio en peso que varfa de 20 a 120 kilodalton del acido hialuronico (incluyendo una sal del mismo) que esta compuesto exclusivamente por unidades de disacarido representadas cada una por la Formula (II) y usado como material de partida significa un peso molecular promedio en peso calculado sobre la suposicion de que en la formula (II), R1a, R2a, R3a, y R4a son todos atomos de hidrogeno, R8a es acetilo y Xa es -O'Na+, manteniendose la estructura principal del derivado de acido hialuronico de la presente invencion. Por lo tanto, incluso en el caso en que algunas o todas las unidades de disacarido en un material de partida realmente usadas tienen -O-(ion tetra-n-butilamonio) como Xa y, por lo tanto, el material de partida tiene un peso molecular promedio en peso de 400 kilodalton, el material de partida se incluira como una realizacion preferida de la presente invencion, siempre que tenga un peso molecular promedio en peso de 20-120 kilodalton, calculado de acuerdo con la suposicion mencionada anteriormente.
Con el fin de determinar el peso molecular promedio en peso de HA, se pueden usar diversos metodos conocidos, incluidos el metodo de dispersion de la luz, osmometrfa y viscometrfa, como se divulga tfpicamente en Seiichi Nakahama, et al., Essential Polymer Science (publicado por Kodansha Ltd., ISBN10-X). Tal como se indica en el presente documento, los pesos moleculares promedio en peso determinados por el metodo de dispersion de la luz se pueden determinar mediante un procedimiento utilizado habitualmente en el campo tecnico al que pertenece la presente invencion, por ejemplo, usando un detector de dispersion de luz laser de angulo multiple acoplado con un analizador cromatografico de exclusion por tamano (SEC-MALLS).
De acuerdo con otro aspecto de la presente invencion, el derivado de acido hialuronico de la presente invencion se puede preparar usando, como material de partida, el acido hialuronico (incluyendo una sal del mismo) que esta compuesto exclusivamente por unidades de disacarido representadas por la Formula (II), que tiene un peso molecular promedio en peso no superior a 500 kilodalton, preferentemente no superior a 250 kilodalton. En una realizacion de la presente invencion, el derivado de acido hialuronico de la presente invencion es un derivado de
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acido hialuronico compuesto sustancialmente por unidades de disacarido de las Formulas (I) y (II).
El derivado de acido hialuronico de la presente invencion que comprende unidades DE disacarido representadas por la formula (I) se puede preparar amidando carboxi en su resto de acido glucuronico. Un proceso de preparacion de ejemplo es el siguiente: acido hialuronico (incluyendo una sal del mismo) como material de partida, preferentemente acido hialuronico compuesto exclusivamente por unidades de disacarido representadas cada una por la Formula (II), se convierte en una sal de tetrametilamonio (por ejemplo, sal de tetrabutilamonio (TBA)) del mismo a traves de intercambio ionico y la sal de acido hialuronico resultante se hace reaccionar con un compuesto representado por la formula HNRx-A-B-COORz (donde Rz es un grupo que forma un ester para la proteccion del carboxi, y Rx, A y B son como se han definido anteriormente en el presente documento) o la formula HNRx-A-CONRyaRyb en un disolvente en presencia de un agente de condensacion adecuado, y la desproteccion se realiza si hay algun grupo protector presente. Como se hace referencia en el presente documento, el grupo que forma el ester no esta particularmente limitado, siempre que sea un grupo de uso habitual para la proteccion del carboxi. Ejemplos del grupo que forma el ester incluyen alquilo Ci-6, bencilo, alcoxi Ci-6 alquilo Ci-6 y benciloxi alquilo Ci-6.
En la Formula (I), los grupos -NRx-A-B-COORz y -NRx-A-CONRyaRybpueden ser iguales o diferentes para dos o mas unidades de disacarido respectivas presentes. Por ejemplo, la reaccion anterior puede realizarse tambien utilizando diferentes tipos de compuestos representados por las formulas: HNRx-A-B-COORz y/o HNRx-A-CONRyaRyb.
El agente de condensacion que se puede usar en la reaccion anterior no esta particularmente limitado y los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina)-4-metilmorfolinio (DMT-MM), N,N'-carbonildiimidazol (CDI), N,N'-diciclohexil- carbodiimida (DCC), N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ), tetrafluoroborato de 2-benzotriazol-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU), 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HODhbt), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-oxi-tris- pirrolidino-fosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi- tris(dimetilamino)fosfonio (BOP), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) o N-hidroxisuccinimida (NHS).
Aunque no esta particularmente limitado, se prefiere el DMT-MM porque la reaccion prosigue con una alta eficiencia, incluso en un disolvente mixto de agua y un disolvente organico. Asimismo, usando DMT-MM como agente de condensacion, se puede realizar amidacion altamente selectiva con amino y carboxi mientras se reduce la esterificacion, en un sistema donde coexisten muchos grupos hidroxi. El uso de este agente de condensacion puede impedir, por ejemplo, la reaccion de un alcohol como disolvente con carboxi en el resto de acido hialuronico y la reticulacion indeseada causada por uniones intramoleculares o intermoleculares entre carboxi e hidroxi coexistentes en el esto de acido hialuronico.
El disolvente usado en la reaccion anterior se puede ejemplificar mediante agua, dimetilsulfoxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMAc), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMI), sulfolan (SF), N- metilpirrolidona (NMP), dioxano (por ejemplo, 1,4-dioxano), metanol, etanol, propanol, butanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano, diclorometano, cloroformo, hexano, eter dietflico, acetato de etilo, y disolventes mixtos de los mismos. Desde el punto de vista de la solubilidad de los materiales de partida, los modificadores y productos y la reactividad de los agentes de condensacion, se prefiere usar DMSO solo o usar un disolvente mixto de agua/DMSO. Dependiendo del tipo de acido amino-carboxflico como modificador, tambien puede usarse en la reaccion como una solucion de metanol o una solucion de dioxano.
El compuesto representado por la formula HNRx-A-B-COORz se ilustra mediante ester de alanina, ester de serina, diester de acido glutamico, ester de glicina, ester de valina, ester de leucina, ester de isoleucina, ester de treonina, diester de acido aspartico, ester de acido cis-2-amino-1-ciclohexilcarboxflico, ester de acido trans-2-amino-1- ciclohexilcarboxflico, ester de acido 2-aminoisobutfrico, ester de acido 1-amino-1-ciclobutfrico, ester de acido 1- aminometil-1-ciclohexanoico, ester de acido cis-4-aminociclohexanoico, ester de L-2-naftilalanina, ester de acido 2- aminofenilbutfrico, ester de ciclohexil-L-alanina, y ester de acido 4-aminometilbenzoico. Ejemplos de los esteres anteriores incluyen, pero sin limitacion, ester de alquilo C1-6, ester de arilo, ester de alcoxi C1-6 alquilo C1-6, y ester de alquilarilo C1-6, siendo preferentes ester metflico, ester etflico, ester bencflico y similares.
El compuesto representado por la formula HNRx-A-CONRyaRyb se ilustra mediante alaninamida, asparaginamida, amida de acido aspartico, glutaminamida, amida de acido glutamico, glicinamida, isoleucinamida, leucinamida, fenilalaninamida, serinamida, treoninamida, tirosinamida, y valinamida.
El proceso para preparar el derivado de acido hialuronico de la presente invencion que comprende unidades de disacarido representadas por la formula (I) donde X es -NHCH3 o -NH(CH2)2CH3 se ilustra mediante un proceso por el cual la sal de tetrabutilamonio anterior del acido hialuronico se hace reaccionar con un compuesto representado por NH2CH3 o NH2(CH2)2CH3 en un disolvente en presencia de un agente de condensacion adecuado. En esta reaccion se puede usar un agente de condensacion y un disolvente como se ha divulgado anteriormente en el presente documento. l grado de modificacion con cada amina se puede ajustar, por ejemplo, controlando el numero de equivalentes del agente de condensacion y/o la amina con respecto a la unidad de HA, la temperatura de reaccion y/o el tiempo de reaccion.
El proceso para preparar el derivado de acido hialuronico de la presente invencion que comprende unidades de
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disacarido representadas por la Formula (III) se ilustra mediante un proceso por el cual la sal de tetrabutilamonio de acido hialuronico anterior se hace reaccionar con un compuesto representado por la formula HNRe-Yb-Rw (donde Rw es un atomo de hidrogeno, alquilo Ci-6, -CO-C(R7)=CH2, -CO-G4-Xc, un grupo protector de hidroxi, un grupo protector de amino, o un grupo protector de mercapto, y Re, Yb, R7 G4, y Xc son como se han definido anteriormente en el presente documento) en un disolvente en presencia de un agente de condensacion adecuado, y la desproteccion se realiza si hay algun grupo protector presente. En esta reaccion se puede usar un agente de condensacion y un disolvente como se ha divulgado anteriormente en el presente documento.
Ejemplos especfficos de -CO-G4-Xc incluyen los grupos representados por las formulas siguientes:
Ejemplos especfficos del grupo protector usado en la reaccion anterior se divulgan, tfpicamente, en T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Tercera edicion, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999.
Ejemplos del grupo protector de hidroxi incluyen alquilcarbonilo Ci-6, arilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, alcoxicarbonilo Ci-6, alcoxi Ci-6 alquilo Ci-6 alquilaminocarbonilo Ci-6, di(alquil Ci-6)aminocarbonilo, arilalquilo Ci-6, heteroarilalquilo Ci-6, arilalquil Ci-6 aminocarbonilo, alquilo Ci-6, alquilsulfonilo Ci-6, ((aminoalquil Ci-6)carboniloxi)alquilo Ci-6, alquilo Ci-6 carboniloxi heterocfclico insaturado, di(alquil Ci-6)sililarilo, y tri(alquil Ci-6)sililo. El grupo protector de hidroxi preferente se ilustra mediante acetilo.
Ejemplos de -NH- o del grupo protector de amino incluyen, pero sin limitacion, alquilcarbonilo Ci-6, arilalquilcarbonilo Ci-6, arilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, alcoxicarbonilo Ci-6, alquilaminocarbonilo Ci-6, di(alquil Ci-6)aminocarbonilo, arilalquilo Ci-6, heteroarilalquilo Ci-6, y (arillalquil Ci-6)aminocarbonilo. El grupo protector de amino preferente se ilustra mediante acetilo, t-butoxicarbonilo, y 9-fluorenilmetoxicarbonilo. El amino puede protegerse para formar un grupo heterocfclico saturado o insaturado, tal como imida de acido ftalico, imida de acido succfnico, imida de acido glutarico y i-pirrolilo.
El grupo protector de mercapto se ilustra mediante alquiltio Ci-6, tal como etiltio y t-butiltio; feniltio sustituido, tal como 2-nitrofeniltio y 2-carboxifeniltio; y heteroariltio, tal como 2-piridiltio. Un ejemplo preferente es 2-piridiltio.
Ejemplos del grupo representado por -NRe-Yb-Rd en la formula (III) como se ha mencionado anteriormente incluyen el grupo representado por la siguiente formula:
-NH-CH2-(CHR5)i-2-CH2-NH2;
-NH-CH2-CH2-(Yi-CH2-CH2)c-NH2;
-NH-CH2-(CHR6)p-2-CH2-OH;
-NH-CH2-CH2-(Yi-CH2-CH2)c-OH;
-NH-(CH2)j-SH;
-NH-CH2-CH2-(Yi-CH2-CH2)c-SH;
-NH-(CH2)p-O-CO-C(R7)=CH2;
-NH-(CH2)l-NHCO-C(R7)=CH2;
-NH-CH2-(CHR5)i-2-CH2-NH-CO-CH2-SH;
-NH-CH2-CH2-(Yi-CH2-CH2)c-NH-CO-CH2-SH;
-NH-(CH2)p-O-CO-CH2-CH2-SH;
-Nh-(Ch2)l-NHCO-CH2-CH2-SH;
-NH-CH2-CH2-(Yi-CH2-CH2)c-O-CO-CH2-CH2-SH;
-NH-CH2-CH2-(Yi-CH2-CH2)c-NHCO-CH2-CH2-SH;
-NH-CH2-(CHR5)i-2-CH2-NH-CO-CH2-Br;
-NH-CH2-CH2-(Yi-CH2-CH2)c-NH-CO-CH2-I;
-NH-CH2-CH2-(Yi-CH2-CH2)c-NHCO-C(R7)=CH2; o -NH-CH2-CH2-(Yi-CH2-CH2)c-O-CO-C(R7)=CH2
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En estas formulas, los numeros respectivos de CHR y CHR , donde R y R son hidroxi, que estan contenidos en una molecula del derivado del acido hialuronico, estan en el intervalo de 0 a 8, respectivamente, preferentemente en el intervalo de 0 a 3, y, mas preferentemente, 0 o 1. La solubilidad en agua del derivado de acido hialuronico de la presente invencion se puede ajustar controlando los numeros de CHR5 y CHR6, donde R5 y R6 son hidroxi. Cuando todos los R5' son atomos de hidrogeno, 1 esta, preferentemente, en el intervalo de 2 a 6, y se ilustra espedficamente por 2 y 6. Cuando uno de R5' es hidroxi, 1 se ilustra espedficamente por 3. Cuando Y1 es un atomo de oxfgeno, c se ilustra especfficamente por 2. Cuando Y1 es -NH-, c se ilustra especfficamente por 1 a 3. 1 y p se ilustran especfficamente por 3.
Ejemplos especfficos de -(CH2)a-(Y1-(CH2)b)C-G- incluyen, pero sin limitacion,
-(CH2)2-(O-CH2-CH2)c-O-, -(CH2)2-(O-CH2-CH2)c-NH-,
-(CH2)3-(O-CH2-CH2-CH2)c-O-, -(C^MO-C^-C^-C^^NH-,
-(CH2)2-NRn-(CH2)2-O, -(CH2)2-NRn-(CH2)2-NH-, -(CH2)3-NRn-(CH2)4-O-,
-(CH2)3-NRn-(CH2)4-NH-, -(CH2)6-NRn-(CH2)6-O-, -(CH2)6-NRn-(CH2)6-NH-,
-(CH2)a-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)a-O-, -(CH2)a-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)a-NH-,
-(CH2)a-NRn-(CH2)4-NRn-(CH2)a-O-, -(CH2)a-NRn-(CH2)4-NRn-(CH2)a-NH-(de tipo espermina), -(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-O-,
-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NH-,
-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-O-, y
-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NRn-(CH2)2-NH-. En estas formulas, se prefiere que todos los Rn' sean atomos de hidrogeno.
Ejemplos especfficos de Rd que esta unido a cualquiera de estos ejemplos de
-(CH2)a-(Y1-(CH2)b)c-G- incluyen, pero sin limitacion, un atomo de hidrogeno, -CO-CH=CH2, -CO-C(CH3)=CH2, -CO-
CH2-Cl, -CO-CH2-Br, -CO-CH2-I, -CO-CH2-SH, y
-CO-CH2-CH2-SH.
Ejemplos especfficos del grupo representado por -NRe-Yb-Rd incluyen, pero sin limitacion, -NH-(CH2)3-N(-(CH2)4-NH-(CH2)3-NHCOCH3)-(CH2)2-SH,
-NH-(CH2)2-N(-(CH2)3-NH-(CH2)4-NHCOCH3)-(CH2)3-SH, y -NH-(CH2)5-N(-(CH2)3-NH-(CH2)2-NHCOCH3)-(CH2)2-SH.
El proceso para preparar el derivado de acido hialuronico de la presente invencion que comprende unidades de disacarido representadas por la Formula (III) se ilustra mediante un proceso mediante el cual se hace reaccionar el carboxi (-COOH) en el resto de acido glucuronico de acido hialuronico con una diamina representada por la formula H2N-CH2-(CHR5)1-2-CH2-NH2 para convertirlo en una amida representada por la formula -CONH-CH2-(CHR5)1-2-CH2- NH2, y despues se modifica el amino terminal para convertir dicha amida en una amida representada por el grupo -CONH-CH2-(CHR5)1-2-CH2-NHRd.
Ejemplos especfficos de la diamina anterior incluyen, pero sin limitacion, H2N-(CH2)2-NH2, H2N-(CH2)3-NH2, H2N- (CH2)4-NH2, H2N-(CH2)5-NH2, H2N-(CH2)6-NH2, H2N-(CH2)7-NH2, H2N-(CH2)8-NH2, H2N-(CH2)g-NH2, H2N-(CH2)10-NH2, H2N-CH2-CHOH-CH2-NH2, H2N-CH2-CHoH-(CH2)2-NH2, H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-NH2, H2N- CH2-CHOH-(CH2)3-NH2, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)2-NH2, H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)2-NH2, H2N-(CH2-CHOH)2-CH2-NH2, H2N-CH2-(CHOH)3- CH2-NH2, H2N-CH2-CHOH-(CH2)4-NH2, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)3-NH2, H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)3-NH2, H2N-CH2- CHOH-CH2-CHOH-(CH2)2-NH2, H2N-CH2-CHOH-(CH2)2-CHOH-CH2-NH2, H2N-(CH2)2-(CHoH)2-(CH2)2-NH2, H2N- CH2-(CHoH)3-(CH2)2-NH2, H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-CHOH-CH2-NH2, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)4-NH2, H2N-(CH2)3- CHOH-(CH2)4-NH2, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)6-NH2, y H2N-(CH2)5-CHOH-(CH2)4-NH2.
El proceso para preparar el derivado de acido hialuronico de la presente invencion que comprende unidades de disacarido representadas por la Formula (III) se ilustra mediante un proceso mediante el cual se hace reaccionar el carboxi (-COOH) en el resto de acido glucuronico de acido hialuronico con una hidroxiamina representada por la formula H2N-CH2-(CHR5)p-2-CH2-OH para convertirlo en una amida representada por la formula -CONH-CH2-(CHR5)p- 2-CH2-OH, y despues se modifica el amino terminal para convertir dicha amida en una amida representada por el grupo -CONH-CH2-(CHR5)p-2-CH2-ORd.
Ejemplos especfficos de la hidroxilamina anterior incluyen, pero sin limitacion, H2N-(CH2)2-OH, H2N-(CH2)3-OH, H2N- (CH2)4-OH, H2N-(CH2)5-OH, H2N-(CH2)6-OH, H2N-(CH2)7-OH, H2N-(CH2)8-OH, H2N-(CH2)9-OH, H2N-(CH2)10-OH, H2N-CH2-CHOH-CH2-OH, H2N-CH2-CHOH-(CH2)2-OH, H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-OH, H2N- CH2-CHOH-(CH2)3-OH, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)2-OH, H2N-CH2-(CHoH)2-(CH2)2-OH, H2N-(CH2-CHOH)2-CH2-OH, H2N-CH2-(CHOH)3-CH2- OH, H2N-CH2-CHOH-(CH2)4-OH, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)3-OH, H2N-CH2-(CHOH)2-(CH2)3-OH, H2N-CH2-CHOH- CH2-CHOH-(CH2)2-OH, H2N-CH2-CHOH-(CH2)2-CHOH-CH2-OH, H2N-(CH2)2-(CHoH)2-(CH2)2-OH, H2N-CH2-(CHoH)3- (CH2)2-OH, H2N-CH2-(CHOH)2-CH2-CHOH-CH2-OH, H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)4-OH, H2N-(CH2)3-CHOH-(CH2)4-OH,
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H2N-(CH2)2-CHOH-(CH2)6-OH, y H2N-(CH2)5-CHOH-(CH2)4-OH.
Estos compuestos estan tfpicamente disponibles comercialmente en Sigma-Aldrich y pueden adquirirse para su uso segun sea apropiado. Como alternativa, tambien pueden sintetizarse siguiendo un metodo publicado o utilizando dicho metodo como referencia.
En la Formula (III), el grupo -NRe-Yb-Rd puede el mismo o diferente para dos o mas unidades de disacarido respectivas presentes. Por ejemplo, la reaccion anterior tambien puede llevarse a cabo usando diferentes tipos del compuesto representado por la formula HNRe-Yb-Rd.
Cuando X en la Formula (I) es -NRx-A-B-COORy, Xb puede estar presente en la posicion indicada en la unidad de disacarido representada por la Formula (III) o, como alternativa, algunos o todos Xb' pueden estar sustituidos con - ORy, de forma que X puede ser -NRx-A-B-CO-Xb.
En un aspecto de la presente invencion, un acido hialuronico no derivatizado correspondiente al derivado de acido hialuronico de la presente invencion en terminos de la estructura principal tiene un peso molecular promedio en peso de 20-120 kilodalton. Dicho acido hialuronico no derivatizado (incluyendo una sal del mismo) es acido hialuronico
' J ia 2a 3a ' 4a
compuesto exclusivamente por unidades de disacarido de formula (II), donde R , R , R y R son atomos de hidrogeno, R8a es acetilo y Xa es -O'Na+.
Dado que dicho acido hialuronico no derivatizado corresponde al derivado de acido hialuronico de la presente invencion en terminos de estructura principal, el numero de unidades de disacarido presentes en dicho acido hialuronico no derivatizado coincide con el del derivado de acido hialuronico de la presente invencion. El derivado de acido hialuronico en este aspecto se puede preparar usando, como material de partida, acido hialuronico que tiene un peso molecular promedio en peso de 20-120 kilodalton o una sal de sodio del mismo.
En un aspecto de la presente invencion, la proporcion de las unidades de disacarido de Formula (II) con respecto a las unidades de disacarido presentes es, preferentemente, no superior al 50 %, mas preferentemente no superior al 30 %, e incluso mas preferentemente no superior al 20 %. El lfmite inferior de la proporcion puede ser cualquier valor no inferior a 0 %. En este aspecto, al menos el 50 % de los grupos carboxi (-COOH) en el derivado de acido hialuronico se convierte en los grupos de -CONHCH3, -COnH(CH2)2CH3, -CONRx-A-B-COORy, -CONRx-A- CONRyaRyb, o -CONRe-Yb-Rd.
El derivado de acido hialuronico que comprende unidades de disacarido de Formula (III) que tienen un doble enlace carbono-carbono reactivo puede someterse a una reaccion de reticulacion con un agente de reticulacion que tiene dos o mas grupos mercapto (por ejemplo ditiotreitol (DTT), butanoditiol, o polietilenglicol ditiol). Asimismo, el derivado de acido hialuronico que comprende unidades de disacarido de Formula (III) que tienen un grupo mercapto puede someterse a una reaccion de reticulacion mediante formacion de disulfuro con un agente de reticulacion que tiene dos o mas grupos mercapto (por ejemplo, ditiotreitol (DTT), butanoditiol, o polietilenglicol ditiol) o a una reaccion de reticulacion con un agente de reticulacion que tiene dos o mas enlaces dobles de carbono-carbono reactivos (por ejemplo, divinilsulfona). La realizacion de una reaccion de reticulacion permite la gelificacion del derivado de acido hialuronico de la presente invencion.
Otras reacciones de reticulacion de ejemplo incluyen: reticulacion a base de condensacion entre un derivado de acido hialuronico modificado con amino y un agente de reticulacion que comprende alquileno C2-20 que tiene un ester succinimidflico o cualquier otro imidoester en ambos extremos terminales del mismo (por ejemplo, bis[sulfosuccinimidil]suberato (BS3), etilenglicol-bis[sulfosuccinimidil]succinato (Sulfo-EGS), o clorhidrato de dimetiladipimidato (DMA)); reticulacion entre un derivado de acido hialuronico modificado con amino y un agente de reticulacion que comprende alquileno C2-20 que tiene formilo en ambos extremos terminales del mismo (por ejemplo, glutaraldehfdo); reticulacion basada en la oxidacion de un derivado de acido hialuronico modificado con mercapto en condiciones de oxidacion (por ejemplo, en presencia de tetrationato de sodio (STT)); reticulacion basada en la adicion de Michael entre un derivado de acido hialuronico modificado con mercapto y un agente de reticulacion que comprende alquileno C2-20 que tiene un enlace insaturado, tal como maleimida (MAL) o metacriloflo en ambos extremos terminales del mismo (por ejemplo, 1,4-bis- maleimidabutano (BMB), etilendimetacrilato (EDMA)); reticulacion basada en la polimerizacion de radicales entre un derivado de acido hialuronico modificado con un enlace insaturado, tal como acriloflo y metacriloflo y cualquiera de varios iniciadores de la polimerizacion (por ejemplo, peroxodisulfato de potasio (KPS)/N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED), e Irgacure2959); y reticulacion con un agente de condensacion (por ejemplo, N,N'-carbonildiimidazol (CDI), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N- etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EeDQ), cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina)-4-metil-morfolinio (DMT- MM), tetrafluoroborato de 2-benzatriazol-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU), 3,4-dihidro- 3-hidroxi-4-oxo-1,2,3- benzotriazina (HODhbt), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris(dimetilamino)fosfonio (BOP), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) o N- hidroxisuccinimida (NHS)) en presencia de un compuesto de diamina (por ejemplo, EDA o 2,2'- (etilendioxi)bis(etilendiamina)). Las reticulaciones mencionadas anteriormente pueden tener lugar en una molecula de derivado de acido hialuronico o entre diferentes moleculas de derivado de acido hialuronico.
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Supongase el caso donde el proceso para preparar el derivado de acido hialuronico de la presente invencion que comprende una etapa de condensacion de una diamina con carboxi en el resto de acido glucuronico y solo una porcion (por ejemplo, 10 %) de la diamina esta unida a un farmaco, de modo que el amino no utilizado permanece en el derivado del acido hialuronico. A continuacion, dicho amino puede tratarse con un anhfdrido dicarboxflico, tal como anhfdrido succfnico, anhfdrido maleico, anhfdrido glutarico, y anhfdrido adfpico o puede hacerse reaccionar con acido dicarboxflico, tal comos acido maleico, acido glutarico y acido adfpico en presencia de un agente de condensacion, de manera que los grupos funcionales terminales se pueden convertir de nuevo en carboxi para eliminar la cationicidad de dicho amino restante o hacer anionica la carga total. Como alternativa, dicho amino puede tratarse con un anhfdrido carboxflico, tal como anhfdrido acetico y anhfdrido benzoico o puede tratarse con un acido carboxflico, tal como acido acetico y acido benzoico en presencia de un agente de condensacion, de manera que los grupos funcionales terminales se pueden amidar para eliminar la cationicidad de dicho amino restante o hacer no ionica la carga total.
La estructura qufmicamente reticulada de un gel del derivado de acido hialuronico de la invencion puede comprender tambien una estructura biodegradable. Aunque lo siguiente no es exhaustivo, los grupos que tienen un enlace ester y metacriloflo pueden usarse como un grupo sometido a una reaccion de reticulacion. Como alternativa, se puede usar un compuesto que tenga un enlace ester, tal como Sulfo-EGS y EDMA, o un compuesto que tiene un espaciador peptfdico que se degrada por una enzima en el cuerpo vivo como agente de reticulacion. Ademas, un gel reticulado mediante enlaces disulfuro formado por oxidacion de grupos mercapto se degradara en el cuerpo vivo a traves de reaccion de intercambio de disulfuro o reaccion de reduccion. La presencia de una estructura reticulada qufmicamente degradable permite el control de la velocidad de biodegradacion del gel del derivado de acido hialuronico de la invencion, permitiendo asf tambien el control de la velocidad de liberacion del farmaco.
El derivado de acido hialuronico de la presente invencion se puede usar como vehfculo para una composicion farmaceutica. En un aspecto de la presente invencion, un derivado de acido hialuronico que comprende unidades de disacarido representadas por la Formula (I) y la Formula (III) o por la Formula (I), la Formula (II) y la Formula (III) se reticula usando un agente de reticulacion para gelificacion, de manera que el gel resultante puede usarse como vehfculo para encapsular un farmaco (compuesto de bajo peso molecular, protefna, peptido, o acido nucleico). El farmaco se puede ilustrar mediante lo siguiente.
Ejemplos del compuesto de bajo peso molecular incluyen, pero sin limitacion, agente carcinostatico (por ejemplo, agente alquilante, antimetabolito, alcaloide), agente inmunosupresor, agente antiinflamatorio (por ejemplo, esteroide, agente antiinflamatorio no esteroideo), agente antirreumatico y agente antibacteriano (por ejemplo, antibiotico p - lactamico, antibiotico aminoglucosido, antibiotico macrolido, antibiotico tetraciclina, nuevo antibiotico quinolona farmaco sulfa).
Ejemplos de la protefna y el peptido incluyen, pero sin limitacion, eritropoyetina (EPO) que sirve como farmaco para la anemia y farmaco de proteccion de organos, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) que actua como farmaco para la neutropenia, interferon-a, -p, -y, (INF-a, -p, -y), trombopoyetina (TPO), factor neurotrofico ciliar (CNTF), factor de necrosis tumoral (TNF), protefna de union al factor de necrosis tumoral (TNFbp), interleucina-10 (IL-10), tirosina quinasa de tipo FMS (Flt-3), hormona de crecimiento (GH), insulina, factor 1 de crecimiento insulinoide (IGF-1), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1 ra), factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNf), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de celulas madre (SCF), factor de crecimiento y diferenciacion de megacariocitos (MGDF), osteoprotegerina (OPG), leptina, hormona paratiroidea (PTH), factor de crecimiento fibroblastico basico (b-FGF), protefna morfogenetica osea (BMP), peptido natriuretico auricular (ANP), peptido natriuretico cerebral (BNP), peptido natriuretico tipo C (CNP), Peptido 1 similar al glucagon (GLP-1), diversos farmacos de sustitucion de la enzima, anticuerpo, diacuerpo, minicuerpo, anticuerpo fragmentado y formas qufmicamente modificadas de los mismos.
Ejemplos del acido nucleico incluyen, pero sin limitacion, ADN, ARN, antisentido, decoy, ribozima, ARN pequeno de interferencia, microARN, aptamero de ARN y formas qufmicamente modificadas de los mismos.
Los farmacos preferidos son una protefna, un peptido y un acido nucleico, y la composicion de la invencion que comprende una protefna, un peptido y un acido nucleico puede obtenerse encapsulando estos farmacos.
En otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un conjugado de derivado de acido hialuronico/farmaco donde uno o mas de los farmacos anteriores estan conjugados a un derivado de acido hialuronico que comprende unidades de disacarido representadas por la Formula (I). El derivado de acido hialuronico que puede usarse en una realizacion de este aspecto es un derivado de acido hialuronico que comprende unidades de disacarido representadas por la Formula (I) y la Formula (III) o por la Formula (I), Formula (II) y Formula (III). Por ejemplo, el conjugado de derivado de acido hialuronico/farmaco puede prepararse conjugando el farmaco a hidroxi, amino, mercapto o un doble enlace carbono-carbono reactivo (por ejemplo, metacriloflo, acriloflo), que estan presentes en el grupo de -NRe-Yb-Rd en la Formula (III). Algunos o todos los grupos de la formula --NRe-Yb-Rd que se convierten en - NRx-A- B-CO-NRe-Yb-Rd pueden estar presentes en la Formula (I).
Ademas, puede insertarse, entre el grupo de -NRe-Yb-Rd y un farmaco, un espaciador representado por la formula
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Q1 Q2 Q3 J ***
(donde
"***" representa una posicion de union al farmaco;
G1 se selecciona de entre un enlace directo, -C(=O)-, -NRs-, y -S-;
G2 se selecciona de entre -(CH2)i- y -(CH2)q-(O-CH2-CH2)k-;
G3 se selecciona de entre un enlace directo, -C(=O)-NRt-(CH2)r-, y -NRu-C(=O)-(CH2)m-; J representa un grupo representado por la formula siguiente:
[Formula 24]
Rs, Rt y Ru se seleccionan independientemente entre un atomo de hidrogeno y alquilo C1-6, i es un numero entero seleccionado de 1 a 10, q es un numero entero seleccionado de 2 a 10, k es un numero entero seleccionado de 1 a 100 y r y m son independientemente un numero entero seleccionado de 1 a 10).
Ejemplos especfficos de la formula -G1-G2-G3-J-*** incluyen, pero sin limitacion, las siguientes formulas:
[Formula 25]
Los grupos hidroxi en la posicion 4 del acido glucuronico o en la posicion 1 de la acetilglucosamina, que estan presentes en los extremos terminales de la cadena principal del derivado del acido hialuronico de la presente invencion, pueden convertirse en grupos diferentes, y pueden ser, por ejemplo, alcoxi C1-6, formiloxi, y alquilcarboniloxi C1-6.
Un gel del derivado de acido hialuronico de la presente invencion que tiene un farmaco encapsulado en el mismo o un conjugado entre el derivado de acido hialuronico de la presente invencion y un farmaco puede formularse en una composicion farmaceutica que comprende el gel o el conjugado y uno o mas aditivos farmaceuticamente aceptables, tales como diluyentes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de dispersion, adyuvantes, agentes antisepticos, agentes tamponadores, agentes aglutinantes, agentes estabilizantes, de manera que la composicion puede administrarse en cualquier forma de dosificacion apropiada dependiendo de la via de administracion deseada. La via de administracion puede ser una via parenteral u oral.
La presente invencion hace posible conseguir una liberacion sostenida prolongada de farmacos tales como protefnas, peptidos, acidos nucleicos y compuestos de bajo peso molecular, lo que no se ha logrado mediante formulaciones convencionales de liberacion sostenida, asf como proporcionar formulaciones de liberacion sostenida y composiciones farmaceuticas que tienen una biodegradabilidad y seguridad adecuadas. Esta invencion tambien hace posible proporcionar formulaciones farmaceuticas y composiciones que permitan una captacion efectiva de los farmacos en el citoplasma, porque en la ruta de captacion intracelular de farmacos endocitados, el derivado de acido hialuronico de la presente invencion tiene una accion promotora sobre la liberacion de los farmacos desde el endosoma al citoplasma.
Ejemplos
La presente invencion se describio a continuacion usando realizaciones adecuadas especfficas de la misma como ejemplos de trabajo.
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Como se usa en el presente documento a continuacion, "unidad de HA" significa una unidad repetitiva de acido N- acetilglucosamina-glucuronico en acido hialuronico. El analisis de RMN se realizo usando un espectrometro de resonancia magnetica nuclear (JNM-ECA500; JEOL, Ltd.). Las condiciones de analisis de RMN son las siguientes.
Condiciones de analisis de RMN de 1H RMN
Punto de datos: 16384 Anchura del espectro (barrido en X): 15 ppm Tiempo de adquisicion (tiempo de adq. X): 1.749 s Retraso del pulso (retraso de relajacion): 30 s Temporales (barridos): 64
[Ejemplo 1] Sfntesis de derivados de acido hialuronico
(Ejemplo 1-1) Conversion de una resina de intercambio cationico en sal de tetrabutilamonio (TBA)
Se suspendio DOWEX™ 50WX-8-400 (Sigma-Aldrich) en agua ultrapura y la resina se lavo con agua ultrapura aproximadamente tres veces por decantacion. Se anadio una solucion acuosa de 40 % en peso de hidroxido de tetrabutilamonio (TBA-OH) (Sigma-Aldrich) en una cantidad de aproximadamente 1,5 equivalentes molares calculada para la capacidad del intercambio cationico de la resina, y se realizo agitacion durante 30 minutos. Despues de la retirada de la solucion en exceso de TBA-OH mediante decantacion, se repitio mas lavado con exceso de agua ultrapura y, por ultimo, la mezcla se paso a traves de un filtro de 0,45 pm, de modo que se obtuvo una resina de intercambio cationico convertida en una sal de TBA.
(Ejemplo 1-2) Preparacion de una sal de TBA de acido hialuronico (HA-TBA)
Las sales de sodio de acido hialuronico (HA-Na, Shiseido Co., Ltd.) con pesos moleculares de 25 kDa y 99 kDa se disolvieron cada una en agua ultrapura a una concentracion de 15 mg/ ml. La resina de intercambio cationico convertida en una sal de TBA en el Ejemplo 1-1 se anadio en una cantidad de 5 equivalentes molares con respecto al numero de moles de la unidad de HA (peso molecular de la unidad, 401,3) calculado para la capacidad de intercambio ionico de la resina. Despues de agitar durante 15 minutos, la mezcla se paso a traves de un filtro de 0,45 pm y el filtrado se liofilizo, para dar muestras de HA-TBA como un solido blanco.
La figura 1 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na de 99 kDa como material de partida. La relacion cuantitativa de TBA y la unidad de HA se calculo a partir del valor integrado de la senal derivada de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de las senales derivadas de cuatro etilenos en TBA (N(CH2CH2CH2CHa)4, 1,4 1,7 ppm; 16H), y, despues, se calculo el peso molecular promedio unitario de HA-TBA a partir de la relacion resultante. Por ejemplo, el peso molecular promedio unitario de HA-TBA sintetizado utilizando HA-Na 99 kDa como material de partida fue de 752,6.
(Ejemplo 1-3) Sfntesis de una sal de TBA de HA (HA-FL/TBA) marcada con fluorescefna
Se preparo una solucion en DMSO anhidro (10 mg/ml) de HA-TBA sintetizada usando HA-Na (99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2. A continuacion,
se anadio clorhidrato de 5-(aminometil)fluorescefna (Invitrogen) en una cantidad de 0,05 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA. Despues,
se anadio cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMT-MM, Kokusan Chemical Co., Ltd.) en una cantidad de 0.2 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA, y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante al menos 6 horas. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden. La suspension de resina de intercambio cationico convertida en una sal de TBA en el Ejemplo 1-1 se anadio al dializado resultante en una cantidad de 5 equivalentes molares con respecto a la unidad de Ha segun se ha calculado para la capacidad de intercambio ionico de la resina. Despues de agitar durante 15 minutos, la mezcla se paso a traves de un filtro de 0,45 pm y el filtrado se liofilizo, para dar el producto de interes (HA-FL/TBA) en forma de un solido de color amarillo.
La figura 2 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en D2O. La relacion cuantitativa entre TBA y la unidad de HA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de cuatro metilos en TBA ((N(CH2CH2CH2CH3)4, 1,0 ppm; 12H), y, despues, se calculo el peso molecular promedio unitario de HA-FL/TBA a partir de la relacion resultante. El contenido de unidades de HA por peso se cuantifico a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina y el valor integrado del pico derivado de metilo en 3- (trimetilsilil)propionato-d4 de sodio (TSP-d4) usado como el material estandar interno (-Si(CH3)3, 0,0 ppm; 9H). El producto se disolvio en una solucion de tampon carbonato 50 mM (pH 9,0) a una concentracion de 0,05 mg/ ml y el contenido de FL por peso se cuantifico a partir de la absorbancia a 491 nm, calculando de este modo el grado de
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modificacion de la unidad de HA con FL. El grado de modificacion con FL estaba en el intervalo de 3 % a 6 % para cada lote.
(Ejemplo 1-4) Sfntesis de derivados de HA a partir de HA-TBA o HA-FL/TBA
(Ejemplo 1-4-1) Sfntesis de un derivado de HA modificado con L-alanina (Ala) (HA-Ala/FL)
Se preparo una solucion en DMSO anhidro (5 mg/ml) de HA-TBA sintetizada usando HA-Na (99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2. A continuacion, se anadieron clorhidrato de ester etflico de L-alanina (Sigma-Aldrich) y clorhidrato de 5-(aminometil)fluorescefna en cantidades de 3 y 0,15 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA. Despues, se anadio DMT- MM en una cantidad de 6 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra DMSO, una solucion acuosa de NaCl 0,3 M, y agua ultrapura, en este orden. A continuacion se anadio NaOH 2N al dializado resultante para ajustar el pH a, al menos, 12,5, se realizo agitacion durante una hora para efectuar desproteccion con carboxi mediante hidrolisis de ester etflico. A continuacion, la mezcla se neutralizo con HCl 2N y se dializo despues, y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-Ala/FL como un solido de color amarillo.
La figura 3-1 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con alanina se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo en alanina (-CH3, 1,4 ppm; 3H) usando la ecuacion siguiente (Tabla 1).
[Formula 26]
Grado de modificacion (%) =
(valor mtegrado del pico de metilo en alanLna)/3 (valor integrado del pico de acetilo en HAJ/3
*100
(Ejemplo 1-4-2) Sfntesis de un derivado de HA modificado con L-serina (Ser) (HA-Ser/FL)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1, excepto que se uso clorhidrato de ester etflico de L- serina (Sigma-Aldrich) en lugar de clorhidrato de ester etflico de L-alanina; de este modo, se proporciono HA-Ser/FL en forma de un solido de color amarillo. Ademas, se tomo una parte de la solucion de dialisis antes de la desproteccion del carboxi y se liofilizo para su uso como muestra para calcular el grado de modificacion (HA-Ser- OEt/FL).
La figura 3-2 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis de la muestra para el calculo del grado de modificacion en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con serina se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (- COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo en ester etflico de serina (-CH3, 1,3 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1). La figura 3-2 tambien muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis de la muestra desprotegida en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3.
(Ejemplo 1-4-3) Sfntesis de un derivado de HA modificado con acido L-glutamico (Glu) (HA-Glu/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1, excepto que se uso clorhidrato de ester dietflico de acido L-glutamico (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) en lugar de clorhidrato de ester etflico de L-alanina; de este modo, se proporciono HA-Glu/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 3-3 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con acido glutamico se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metileno en acido glutamico (-CH2CH2COOH, 2,3 ppm; 2H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1). Dado que el pico derivado de acetilo en HA glucosamina solapaba con el pico derivado de otro metileno en acido glutamico (-CH2CH2COOH, 2,1 ppm; 2H), el valor obtenido restando el valor integrado del pico a 2,3 ppm del de los picos a de 1,7 a 2,2 ppm se tomo como el pico derivado de acetilo en la glucosamina HA y se uso para el calculo del grado de modificacion.
(Ejemplo 1-4-4) Sfntesis de derivados de HA modificados con glicina (Gly) (HA-Gly y HA-Gly/FL)
Como material de partida se uso una solucion en DMSO anhidro (5 mg/ ml) de HA-TBA sintetizada en el Ejemplo 1-2 o una solucion con agua ultrapura/DMSO (1:3) de HA-FL/TBA (aproximadamente 4 mg/ ml) sintetizada en el Ejemplo 1-3. Se anadio clorhidrato de ester etflico de glicina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en una cantidad de 5 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA. Despues, se anadio DMT-MM en una cantidad de 3 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la
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noche. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden. A continuacion se anadio NaOH 2N al dializado resultante para ajustar el pH a, al menos, 12,5, se realizo agitacion durante una hora para efectuar desproteccion con carboxi mediante hidrolisis de ester etflico. A continuacion, la mezcla se neutralizo con HCl 2N y se dializo despues, y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-Gly como un solido de color blanco o HA-Gly/FL como un solido de color amarillo. Ademas, se tomo una parte de la solucion de dialisis antes de la desproteccion del carboxi y se liofilizo para su uso como muestra para calcular el grado de modificacion (HA-Gly-OEt/FL).
La figura 3-4 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis de la muestra para el calculo del grado de modificacion en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con glicina se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (- COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo en ester etflico de glicina (-CH3, 1,3 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1). La figura 3-4 tambien muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis de las muestras desprotegidas en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3.
(Ejemplo 1-4-5) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-valina (Val) (HA-Val y HA-Val/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de ester dietflico de L-valina (Watanabe Chemical Industries, Ltd.) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina; de este modo, se proporciono HA-Val en forma de un solido de color blanco, o HA-Val/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 3-5 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con glicina se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de dos metilo en valina (-CH(CH3)2, 0,9 ppm; 6H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1). Dado que el pico derivado de acetilo en Ha glucosamina solapaba con el pico derivado de hidrogeno en la posicion 3 de valina (-CH(CH3)2, 2,1 ppm; 1H), el valor integrado del pico a 0,9 ppm multiplicado por 1/6 se resto del valor integrado de los picos a de 1,8 a 2,2 ppm y el valor resultante se tomo como el pico derivado de acetilo en HA glucosamina y se uso para el calculo del grado de modificacion.
(Ejemplo 1-4-6) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-leucina (Leu) (HA-Leu y HA-Leu/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de ester etflico de L-leucina (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina; de este modo, se proporciono HA-Leu en forma de un solido de color blanco, o HA-Leu/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 3-6 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con leucina se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de dos metilos en leucina (-CH(CH3)2, 0,9 ppm; 6H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1).
(Ejemplo 1-4-7) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-isoleucina (Ile) (HA-Ile y HA-Ile/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso DMSO anhidro como disolvente y que se uso clorhidrato de ester metflico de L-isoleucina (Watanabe Chemical Industries, Ltd.) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina; de este modo, se proporciono HA-Ile en forma de un solido de color blanco o HA-Ile/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 3-7 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con isoleucina se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de dos metilos en isoleucina (-CH(CH3)CH2CH3, 0,9 ppm; 6H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1). Dado que el pico derivado de acetilo en HA glucosamina solapaba con el pico derivado de hidrogeno en la posicion 3 de isoleucina (-CH(CH3)CH2CH3, 1,9 ppm; 1H), el valor integrado del pico a 0,9 ppm multiplicado por 1/6 se resto del valor integrado de los picos a de 1,8 a 2,2 ppm y el valor resultante se tomo como el pico derivado de acetilo en HA glucosamina y se uso para el calculo del grado de modificacion.
(Ejemplo 1-4-8) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-treonina (Thr) (HA-Thr y HA-Thr/FL)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de L- treonina (Bachem) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina; de este modo, se proporciono HA-Thr en forma de un solido de color blanco o HA-Thr/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 3-8 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones
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que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con treonina se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo en treonina (-CH3, 1,2 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1).
(Ejemplo 1-4-9) Sfntesis de derivados de HA modificados con acido de L-aspartico (Asp) (HA-Asp y HA- Asp/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de ester dietflico de acido L-aspartico (Watanabe Chemical Industries, Ltd.) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina; de este modo, se proporciono HA-Asp en forma de un solido de color blanco o HA-Asp/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 3-9 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con acido aspartico se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de metileno en acido aspartico (-CH2COOH, 2,7 2,8 ppm; 2H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1).
(Ejemplo 1-4-10) Sfntesis de un derivado de HA modificado con acido cis-2-amino-1-ciclohexil carboxflico (cACHCA) (HAcACHCA/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de ester etflico de cACHCA (Acros) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina y que se llevo a cabo desproteccion de carboxi usando NaOH 5N a pH 13,2; de este modo, se proporciono HA-cACHCA/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 3-10 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con cACHCA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado del anillo de ciclohexano en (-CHCOO-, 2,5 ppm; 1H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1).
(Ejemplo 1-4-11) Sfntesis de un derivado de HA modificado con ester etflico de acido trans-2-amino-1- ciclohexil carboxflico ester (tACHCA-OEt) (HA-tACHCA-OEt/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de tACHCA-OEt (Acros) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina y que no se llevo a cabo desproteccion de carboxi; de este modo, se proporciono HA --cACHCA/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 3-11 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con tACHCA-OEt se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado del proton sobre el carbono adyacente al carbonilo en el anillo de ciclohexano en tACHCA-OEt (-CH(COOEt)-, 2,2 ppm; 1H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1). Dado que el pico derivado de acetilo en HA glucosamina solapaba con el pico derivado de ciclohexilo y metilo en el grupo protector (11H), el valor integrado del pico a 2,2 ppm multiplicado por 11 se resto del valor integrado de los picos a de 1,2 a 2,1 ppm y el valor resultante se tomo como el pico derivado de acetilo en HA glucosamina y se uso para el calculo del grado de modificacion.
(Ejemplo 1-4-12) Sfntesis de un derivado de HA modificado con acido 2-aminoisobutfrico (Aib) (HA-Aib/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de ester etflico de Aib (Watanabe Chemical Industries, Ltd.) se uso en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina y que se llevo a cabo desproteccion del carboxi usando NaOH 5N a pH 13,2; de este modo, se proporciono HA-Aib/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 3-12 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con Aib se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de dimetilo en Aib (-C(CH3)2-, 1,5 ppm; 6H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-41 (Tabla 1).
(Ejemplo 1-4-13) Sfntesis de un derivado de HA modificado con ester etflico de acido 1-amino-1-ciclobutfrico (ACBuCA-OEt) (HA-ACBuCA-OEt/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de ACBuCA-OEt
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(Sigma- Aldrich) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina y que no se llevo a cabo desproteccion de carboxi; de este modo, se proporciono HA-ACBuCA-OEt/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 3-13 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con ACBuCA-OEt se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo en el grupo protector de ACBuCA-OEt (-CH3, 1,3 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1). Dado que el pico derivado de acetilo en HA glucosamina solapaba con el pico derivado de ciclobutano presente en ACBuCA-OEt (6H), el valor integrado del pico a 1,3 ppm multiplicado por 2 se resto del valor integrado de los picos a de 1,8 a 2,8 ppm y el valor resultante se tomo como el pico derivado de acetilo en HA glucosamina y se uso para el calculo del grado de modificacion.
(Ejemplo 1-4-14) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-asparagina (Asn) (HA-Asn y HA-Asn/Rh)
Se sintetizo HA-Asn del siguiente modo. Se anadio clorhidrato de ester metflico de L-asparagina (Bachem) a una solucion en DMSO anhidro (5 mg/ ml) de HA-TBA sintetizado usando HA-Na (99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2 en una cantidad de 5 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA. Despues, se anadio DMT- MM en una cantidad de 3-6 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. Despues de la reaccion, la solucion se volvio a precipitar con eter dietflico y el precipitado se disolvio en agua ultrapura, se anadio una solucion de NaOH 5N para ajustar el pH a al menos 12,5 y se realizo agitacion durante una hora para efectuar desproteccion de carboxi mediante hidrolisis de ester etflico. A continuacion, la mezcla se neutralizo con una solucion de HCl 5N y se dializo adicionalmente para su purificacion contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M, agua destilada y agua ultrapura en este orden, y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-Asn como un solido de color blanco.
HA-Asn/Rh se sintetizo del siguiente modo. Se anadio clorhidrato de 1-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxa- 8-octanamina (Fmoc-EDOBEA, Iris Biotech GmbH) a una solucion en DMSO anhidro (5 mg/ ml) de HA-TBA sintetizado usando HA-Na (99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2 en una cantidad de 0,1 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA. Despues, se anadio DMT-MM en una cantidad de 0,2 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante 6 horas. A continuacion, se anadieron clorhidrato de ester metflico de L-asparagina y DMT-MM en este orden en cantidades de 5 y 3-6 equivalentes molares, respectivamente, con respecto a la unidad de HA, y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. La solucion de reaccion se dializo para su purificacion contra DMSO. Se anadio piperidina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) al dializado resultante, para dar a concentracion de 20 % y se realizo agitacion durante 2 horas para retirar el grupo Fmoc. A continuacion, la mezcla se dializo para su purificacion contra DMSO, una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua destilada en este orden. Se anadio NaOH 5N al dializado resultante para ajustar el pH a, al menos, 12,5 y se realizo agitacion durante una hora para efectuar la hidrolisis del ester y la desproteccion del carboxi. A continuacion, la mezcla se neutralizo con una solucion de HCl 5N y se dializo adicionalmente para su purificacion contra agua destilada y agua ultrapura, en este orden, y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-Asn/EDOBEA.
Se diluyo 2 veces una solucion acuosa (10 mg/ ml) de HA-Asn/EDOBEA con PB 100 mM (pH 7,4), se anadio NHS- rhodamina (ester succinimidflico de 5/6-carboxitetrametilrhodamina, Thermo Fisher Scientific Inc.) en una cantidad de 0,05 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. A continuacion, se anadio anhfdrido acetico (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en una cantidad de 40 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion durante una hora para acetilar el amino terminal en exceso de EDOBEA. Se anadio una solucion de NaOH 5N a la solucion de reaccion para ajustar el pH a, al menos, 12,5 y se realizo agitacion durante una hora. A continuacion, la mezcla se neutralizo con una solucion de HCl 5N y se dializo para su purificacion contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M, agua destilada y agua ultrapura, en este orden, y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-Asn/Rh como un solido de color rojo.
Todas las membranas de dialisis utilizadas fueron Spectra/Por 4 (corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa).
La figura 3-14 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con asparagina se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metileno en asparagina (-CH2CONH2, 2,8 ppm; 2H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1).
(Ejemplo 1-4-15) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-alaninamida (Ala-NH2) (HA-Ala-NH y HA- Ala- NH2/Rh)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-14, excepto que se uso clorhidrato de L-alaninamida (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) en lugar de clorhidrato de ester metflico de L-aspargina y de que no se realizo ningun procedimiento para reprecipitacion o desproteccion del carboxi; de este modo, se proporciono HA-Ala-NH2 en
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forma de un solido de color blanco o HA-Ala- Nh^/Rh en forma de un solido de color rojo.
La figura 3-15 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con alaninamida se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo en alaninamida (-CH3, 1,5 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1).
(Ejemplo 1-4-16) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-valinamida (Val-NH2) (HA-Val-NH2 y HA-Val- IWRh)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-15, excepto que se uso clorhidrato de L-valinamida (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) en lugar de clorhidrato de L-alaninamida; de este modo, se proporciono HA-Val- NH2 en forma de un solido de color blanco o HA-Val-NH2/Rh en forma de un solido de color rojo.
La figura 3-16 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con valinamida se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de dos metilos en valinamida (-CH(CH3)2, 1,0 ppm; 6H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1). Dado que el pico derivado de acetilo en HA glucosamina solapaba con el pico derivado de hidrogeno en la posicion de valinamida (-CH(CH3)2, 2,1 ppm; 1H), el valor integrado del pico a 1,0 ppm multiplicado por 1/6 se resto del valor integrado de los picos a de 1,8 a 2,2 ppm y el valor resultante se tomo como el pico derivado de acetilo en HA glucosamina y se uso para el calculo del grado de modificacion.
(Ejemplo 1-4-17) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-asparaginamida (Asn-NH2) (HA-Asn-NH y HA-Asn-NH2/Rh)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-15, excepto que se uso clorhidrato de L- asparaginamida (Kokusan Chemical Co., Ltd.) en lugar de clorhidrato de L-alaninamida; de este modo, se proporciono HA-Asn-NH2 en forma de un solido de color blanco o HA-Asn-NH2/Rh en forma de un solido de color rojo.
La figura 3-17 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con asparaginamida se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metileno asparaginamida (-CH2CONH2, 2,8 ppm; 2H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1).
(Ejemplo 1-4-18) Sfntesis de derivados de HA modificados con metilamina (Me) (HA-Me y HA-Me/FL)
Se sintetizo HA-Me del siguiente modo. Se preparo una solucion en DMSO anhidro (5 mg/ml) de HA-TBA sintetizada usando HA-Na (99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2. A continuacion, se anadieron metilamina (solucion de metanol al 40 %, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) y BOP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en este orden a una relacion equivalente de unidad de HA/BOP/metilamina = 1/3/50 (mol/mol/mol), y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden, y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-Me como un solido de color blanco.
HA-Me/FL se sintetizo del siguiente modo. Se preparo una solucion en DMSO anhidro (5 mg/ml) de HA-TBA sintetizada usando HA-Na (99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2. A continuacion, se anadieron metilamina, etilendiamina (Sigma- Aldrich) y BOP, en este orden, a una relacion equivalente de unidad de HA/metilamina/etilendiamina = 1/2,5/4,5/0,25 (mol/mol/mol/mol) y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden, y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar un intermedio como un solido de color blanco.
Despues, el producto intermedio resultante se disolvio en agua ultrapura para dar una concentracion de 10 mg/ml y, despues, la solucion se diluyo 2 veces con una solucion de tampon fosfato 100 mM (pH 7,4) para preparar una solucion de 5 mg/ml. A esta solucion se anadio NHS-fluorescefna como una solucion en DMSO en una cantidad de 0,1 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante una hora. A continuacion, se anadio anhfdrido acetico (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en una cantidad de 40 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion adicional durante una hora para acetilar el amino terminal en exceso de etilendiamina. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden, en condiciones de oscuridad y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-Me/FL como un solido de color amarillo.
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La figura 3-18 muestra los espectros de RMN de 1H obtenidos mediante analisis de los productos en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con metilo se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo (-CH3, 2,8 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1).
(Ejemplo 1-4-19) Sfntesis de derivados de HA modificados con propilamina (Pr) (HA-Pr y HA-Pr/FL)
Se sintetizo HA-Pr del siguiente modo. Se preparo una solucion en DMSO anhidro (5 mg/ml) de HA-TBA sintetizada usando HA-Na (99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2. A continuacion, se anadieron propilamina (Sigma- Aldrich) y BOP, en este orden, a una relacion equivalente de unidad de HA/BOP/propilamina = 1/3/50 (mol/mol/mol) y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden, y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-Pr como un solido de color blanco.
Se sintetizo HA-Pr/FL del siguiente modo. Se preparo una solucion en DMSO anhidro (5 mg/ml) de HA-TBA sintetizada usando HA-Na (99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2. A continuacion, se anadieron propilamina, etilendiamina y BOP, en este orden, a una relacion equivalente de unidad de HA/propilamina/etilendiamina = 1/2,5/45/2,5 (mol/mol/mol/mol) y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden, y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar un intermedio como un solido de color blanco.
Despues, el producto intermedio resultante se disolvio en agua ultrapura para dar una concentracion de 10 mg/ml y, despues, la solucion se diluyo 2 veces con una solucion de tampon fosfato 100 mM (pH 7,4) para preparar una solucion de 5 mg/ml. A esta solucion se anadio NHS-fluorescefna como una solucion en DMSO en una cantidad de 0,06 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante una hora. A continuacion, se anadio anhfdrido acetico (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en una cantidad de 40 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion adicional durante una hora para acetilar el amino terminal en exceso de etilendiamina. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden, en condiciones de oscuridad y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-Pr/FL como un solido de color amarillo.
La figura 3-19 muestra los espectros de RMN de 1H obtenidos mediante analisis de los productos en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con metilo se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo perteneciente a propilo (-CH3, 0,9 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 1).
[Tabla 1]
Tabla 1 Grados de modificacion de los derivados de HA sintetizados (99 kDa)
- N.° de ejemplo
- Compuesto de modificacion Grado de modificacion con derivado de acido amino-carboxflico o alquilamina (%)
- 1-4-1
- Ala/FL 86
- 1-4-2
- Ser/FL 89
- 1-4-3
- Glu/FL 73
- 1-4-4
- Gly 89
- Gly/FL
- 93
- 1-4-5
- Val 99
- Val/FL
- 101
- 1-4-6
- Leu 84
- Leu/FL
- 93
- 1-4-7
- Ile 100
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20
25
- N.° de ejemplo
- Compuesto de modificacion Grado de modificacion con derivado de acido amino-carboxflico o alquilamina (%)
- Ile/FL 98
- 1-4-8
- Thr 98
- Thr/FL
- 99
- 1-4-9
- Asp 96
- Asp/FL
- 100
- 1-4-10
- cACHCA/FL 82
- 1-4-11
- tACHCA-OEt/FL 87
- 1-4-12
- Aib/FL 80
- 1-4-13
- ACBuCA-OEt/FL 98
- 1-4-14
- Asn 84
- Asn/Rh
- 81
- 1-4-15
- Ala-NH2 93
- Ala-NH2/Rh
- 82
- 1-4-16
- Val-NH2 97
- Val-NH2/Rh
- 83
- 1-4-17
- Asn-NH2 91
- Asn-NH2/Rh
- 71
- 1-4-18
- Me 101
- Me/FL
- 91
- 1-4-19
- Pr 108
- Pr/FL
- 87
(Ejemplo 1-5) Sfntesis de derivados de HA de HA-TBA (25 kDa o 99 kDa)
(Ejemplo 1-5-1) Sfntesis de derivados de HA modificados con acido 1-aminometil-1-ciclohexanoico (AMCHCA) (HA-AMCHCA)
Se prepararon soluciones de DMSO anhidro (10 mg/ml) de HA-TBA sintetizada usando HA-Na (25 kDa y 99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2 y, despues, se anadio clorhidrato de ester metflico de 1-aminometil- ciclohexanoico (AMCHCA-OMeHCl, Bionet Research) a cada una de las soluciones a la relacion con respecto a la unidad HA-TBA como se muestra en la Tabla 2. Despues, Se anadio DMT- MM a la relacion con respecto a la unidad HA-TBA como se muestra en la Tabla 2 y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) para su purificacion contra un exceso grande de solucion acuosa de NaCl 0,3 M. Se anadio una solucion acuosa de NaOH 5N al dializado resultante para ajustar el pH a, al menos, 13,2 y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante una hora, y ademas se anadio HCl 5N para la neutralizacion. Despues, la mezcla se dializo (Spectra/Por 4, COPM: 12-14 kDa) para la purificacion contra agua destilada y agua ultrapura, en este orden, y el dializado resultante se liofilizo, para dar los productos de interes (HA-AMCHCA) en forma de un solido de color blanco.
La figura 4-1 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/AMCHCA-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con AMCHCA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (- COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de ciclohexano perteneciente a AMCHCA (C6H10,, 1,2-1,9 ppm; 10H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-2) Sfntesis de un derivado de HA modificado con acido cis-4-aminociclohexanoico (pcACHCA) (HA-pcACHCA)
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Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de acido cis-4-amino-1-ciclohexilcarboxflico (pcACHCA-OMeHCl, Iris Biotech) en lugar de AMCHCA-OMeHCl; de este modo, se proporciono el producto de interes (HA-pcACHCA) en forma de un solido de color blanco. Las cantidades de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 2.
Como ejemplo representativo, la figura 4-2 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/pcACHCA-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con pcACHCA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de dos etilenos presentes en ciclohexano perteneciente a pcACHCA (1,5-1,8 ppm; 8H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-3) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-2-naftilalanina (Nal) (HA-Nal)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1 excepto que se uso sal de para-tosilato de ester bencflico de L-2-naftilalanina (Nal-Obzlp-Ts, Bachem) en lugar de AMCHCA-OMeHCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-Nal) en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 2.
La figura 4-3 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/Nal-Obzlp-Ts=1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con Nal se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de naftilo perteneciente a Nal (-C10H7, 7,4-7,9 ppm; 7H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-4) Sfntesis de un derivado de HA modificado con acido 2-amino-4-fenilbutfrico (APBA) (HA- APBA)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester etflico de acido 2-amino-4-fenilbutfrico (APBA-OEt HCl, Sigma-Aldrich) en lugar de AMCHCA-OMe HCl; de este modo, se proporciono el producto de interes (HA-APBA) en forma de un solido de color blanco. La relacion de adicion de los reactivos se muestra en la Tabla 2.
La figura 4-4 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/APBA- OEtHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con APBA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de fenilo perteneciente a APBA (-C6H5, 7,2-7,4 ppm; 5H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-5) Sfntesis de derivados de HA modificados con ciclohexil-L-alanina (Cha) (HA-Cha)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de ciclohexil-L-alanina (Cha-OMeHCl, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) en lugar de AMCHCA-OMeHCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-Cha)en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 2.
La figura 4-5 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/Cha-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con Cha se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de ciclohexilmetilo perteneciente a Cha (-CH2C6H11, 0,9-1,8 ppm; 13H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-6) Sfntesis de derivados de HA modificados con acido 4-aminometilbenzoico (AMBA) (HA- AMBA)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de 4- aminometilbenzoico (AMBA-OMe HCl, Sigma-Aldrich) en lugar de AMCHCA-OMe HCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-AMBA) en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 2. La figura 4-6 muestra el espectro de RMN de 1H del producto. El grado de modificacion de la unidad de HA con AMBA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de fenilo perteneciente a AMBA (-CH2C6H4COOH, 7,4 7,9 ppm; 4H) usando los mismos procedimientos que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
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(Ejemplo 1-5-7) Sfntesis de derivados de HA modificados con acido 3-aminometilbenzoico (3AMBA) (HA- 3AMBA)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de 3- aminometilbenzoico (AMBA-OMe HCl, Fluorochem) en lugar de AMCHCA-OMeHCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-3AMBA) en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 2.
La figura 4-7 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo
mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los
reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/3AMBA-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la
unidad de HA con 3AMBA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-
COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de fenilo perteneciente a 3AMBA (-C6H4COOH, 7,47,9 ppm; 4H) usando los mismos procedimientos que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-8) Sfntesis de derivados de HA modificados con acido 3-amino-2-fenilpropionico (APhPA) (HA- APhPA)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester etflico de acido 3-amino-2-fenilpropionico (APhPA-OEt HCl, Fluorochem) en lugar de AMCHCA-OMe HCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-APhPA) en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 2.
La figura 4-8 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo
mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los
reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/APhPA-OEtHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la
unidad de HA con APhPA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-
COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de fenilo perteneciente a APhPA (-C6H5, 7,4 ppm; 5H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-9) Sfntesis de derivados de HA modificados con acido 4-(2-aminoetil)benzoico (AEBA) (HA- AEBA)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de acido 4-(2-aminoetil)benzoico (AEBA-OMe HCl, enamina) en lugar de AMCHCA-OMe HCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-AEBA) en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 2.
La figura 4-9 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/APhPA-OEtHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con AEBA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (- COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de fenilo perteneciente a AEBA (-C6H4COOH, 7,3 7,9 ppm; 4H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-10) Sfntesis de derivados de HA modificados con acido 4-aminometil-3-clorobenzoico (AMClBA) (HA- AMClBA)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de 4- aminometil-3-clorobenzoico (AMClBA-OMe HCl, Anichem) en lugar de AMCHCA-OMe HCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-AMClBA) en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 2.
La figura 4-10 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/AMClBA-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con AMCIBA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (- COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de fenilo perteneciente a AMCIBA (-C6H3OCOOH, 7,5 7,8 7,9 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-11) Sfntesis de derivados de HA modificados con acido 5-aminometilsalicflico (AMSA) (HA- AMSA)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de acido 5-aminometilbenzoico (AMSA-OMe HCl, Oakwood) en lugar de AMCHCA-OMe HCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-AMSA en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion
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de los reactivos se muestran en la Tabla 2.
La figura 4-11 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/AMSA-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con AMSA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (- COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de fenilo perteneciente a AMSA (-C6H3(OH)COOH, 6,9-7,9 ppm; 3h) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-12) Sfntesis de un derivado de HA modificado con acido trans-4-aminometilciclohexanoico (4AMCHCA) (HA-4AMCHCA)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de acido trans-4-aminometilciclobenzoico (4AMCHCA-OMeHCl, AK Scientific) en lugar de AMCHCA-OMeHCl; de este modo, se proporciono el producto de interes (HA-4AMCHCA en forma de un solido de color blanco. La relacion de adicion de los reactivos se muestra en la Tabla 2.
La figura 4-12 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 25 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT- MM/4AMCHCA-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con 4AMCHCA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de ciclohexano perteneciente a 4AMCHCA (-CH2CH(CH?CH2)2CH-. 1,2-1,9 ppm; 9H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-13) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-ciclohexilglicina (Chg) (HA-Chg)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de L- ciclohexilglicina (Cha-OMeHCl, INDOFINE Chemical Company) en lugar de AMCHCA-OMeHCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-Cha)en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 2.
La figura 4-13 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 25 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/Chg-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con Chg se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de ciclohexilo perteneciente a Chg (-C6H11, 1,0-1,8 ppm; 11H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
(Ejemplo 1-5-14) Sfntesis de derivados de HA modificados con acido (R)-amino-(4-hidroxifenil)acetico (pHPhg) (HA- pHPhg)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de acido (R)-amino-(4-hidroxifenil)acetico (pHPhg-OMeHCl Sigma-Aldrich) en lugar de AMCHCA-OMe HCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-pHPhg) en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 2.
La figura 4-14 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/pHPhg-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con pHPhg se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (- COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de fenilo perteneciente a pHPhg (-C6H4OH, 6,9 7,3 ppm; 4H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 2).
[Tabla 2]
Tabla 2 Cantidades de los reactivos utilizados para sintetizar derivados de HA y resultados de sfntesis
- N.° de ejemplo
- Compuesto de modificacion Peso molecular de HA Relacion de adicion molar del compuesto de modificacion y DMT-MM (unidad de HA-TBA/ DMT- MM/compuesto de modificacion) Grado de modificaci on (%)
- 1-5-1
- AMCHCA 99 kDa 1/3/5 94
- AMCHCA
- 99 kDa 1/0,33/5 27
- AMCHCA
- 25 kDa 1/3/5 93
- N.° de ejemplo
- Compuesto de modificacion Peso molecular de HA Relacion de adicion molar del compuesto de modificacion y DMT-MM (unidad de HA-TBA/ DMT- MM/compuesto de modificacion) Grado de modificaci on (%)
- AMCHCA 25 kDa 1/0,33/5 31
- 1-5-2
- pcACHCA 99 kDa 1/3/5 90
- 1-5-3
- Nal 99 kDa 1/3/5 106
- Nal
- 99 kDa 1/0,55/5 31
- Nal
- 99 kDa 1/0,33/5 16
- Nal
- 25 kDa 1/3/5 105
- Nal
- 25 kDa 1/0,55/5 36
- Nal
- 25 kDa 1/0,33/5 18
- 1-5-4
- APBA 99 kDa 1/3/5 99
- 1-5-5
- Cha 99 kDa 1/3/5 99
- Cha
- 99 kDa 1/0,33/5 26
- Cha
- 25 kDa 1/3/5 99
- Cha
- 25 kDa 1/0,33/5 29
- 1-5-6
- AMBA 99 kDa 1/3/5 102
- AMBA
- 25 kDa 1/3/5 101
- 1-5-7
- 3AMBA 99 kDa 1/3/5 100
- 3AMBA
- 25 kDa 1/3/5 101
- 1-5-8
- APhPA 99 kDa 1/3/5 101
- APhPA
- 25 kDa 1/3/5 100
- 1-5-9
- AEB 99 kDa 1/3/5 99
- AEB
- 99 kDa 1/0,33/5 26
- AEB
- 25 kDa 1/3/5 101
- AEB
- 25 kDa 1/0,33/5 33
- 1-5-10
- AMClBA 99 kDa 1/3/5 99
- AMClBA
- 99 kDa 1/0,33/5 22
- AMClBA
- 25 kDa 1/3/5 97
- AMClBA
- 25 kDa 1/0,33/5 22
- 1-5-11
- AMSA 99 kDa 1/3/5 97
- AMSA
- 25 kDa 1/3/5 95
- 1-5-12
- 4AMCHCA 25 kDa 1/3/5 105
- 1-5-13
- Chg 25 kDa 1/3/5 103
- Chg
- 25 kDa 1/0,33/5 32
- 1-5-14
- pHPhg 99 kDa 1/3/5 103
- pHPhg
- 99 kDa 1/0,33/5 28
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(Ejemplo comparativo 1-1) Sfntesis de derivados de HA marcados con FL de HA-TBA o HA-FL/TBA (Ejemplo comparativo 1-1-1) Sfntesis de un HA marcado con FL (HA-FL)
Se preparo una solucion en DMSO anhidro (5 mg/ml) de HA-TBA sintetizada usando HA-Na (99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2. A continuacion, se anadieron 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (EDOBEA, Sigma-Aldrich) y BOP (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), en este orden, a una relacion equivalente de unidad de HA/EDOBEA = 1/0,2/50 (mol/mol/mol), y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden, y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-EDOBEA con un grado de modificacion bajo.
La figura 5-1 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis de HA-EDOBEA con un grado de modificacion bajo en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con EDOBEA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (- COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metileno terminal en EDOBEA (-CH2NH2, 3,2 ppm; 2H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-3 (Tabla 3).
Despues, el HA-EDOBEA resultante con un grado de modificacion bajo se disolvio en agua ultrapura para dar una concentracion de 10 mg/ml y, despues, la solucion se diluyo 2 veces con una solucion de tampon fosfato 100 mM (pH 7,4) para preparar una solucion de 5 mg/ml. A esta solucion se anadio NHS-fluorescefna (ester succinimidflico de 5/6-carboxifluorescefna, NHS-FL, PIERCE) como una solucion en DMSO en una cantidad de 0,1 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante una hora. A continuacion, se anadio anhfdrido succfnico (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como una solucion en DMSO en una cantidad de 40 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion adicional durante una hora para tratar el amino terminal en exceso de EDOBEA con acido succfnico. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden, en condiciones de oscuridad y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA-FL (HA con un grado de modificacion bajo) en forma de un solido de color amarillo.
La figura 5-1 muestra tambien el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3.
El producto se disolvio en una solucion de tampon carbonato 50 mM (pH 9,0) a una concentracion de 0,05 mg/ ml y el contenido de FL por peso se cuantifico a partir de la absorbancia a 491 nm, calculando de este modo el grado de modificacion de la unidad de HA con FL (Tabla 3).
(Ejemplo comparativo 1-1-2) Sfntesis de un derivado de HA modificado con EDOBEA (HA-EDOBEA-Ac/FL)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo comparativo 1-1-1 excepto que se anadieron los reactivos a una realizacion de unidad de HA/BoP/EDOBEA = 1/2,5/50 (mol/mol/mol); de este modo, se obtuvo HA-EDOBEA con un grado de modificacion alto.
La figura 5-2 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis de HA-EDOBEA con un grado de modificacion alto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. Para analizar la solucion, se anadio NaOD a una concentracion de 0,0046N para hacer que la solucion sea alcalina. El grado de modificacion de la unidad de HA con EDOBEA se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metileno terminal en EDOBEA (-CH2NH2, 2,8 ppm; 2H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-3 (Tabla 3).
Despues, el HA-EDOBEA resultante con un grado de modificacion alto se disolvio en agua ultrapura, para dar una concentracion de 10 mg/ml y, despues, la solucion se diluyo 2 veces con una solucion de tampon fosfato 100 mM (pH 7,4) para preparar una solucion de 5 mg/ml. A esta solucion se anadio NHS-fluorescefna como una solucion en DMSO en una cantidad de 0,04 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante una hora. A continuacion, se anadio anhfdrido acetico (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en una cantidad de 40 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion adicional durante una hora para acetilar el amino terminal en exceso de EDOBEA. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua ultrapura, en este orden, en condiciones de oscuridad y, a continuacion, el dializado se liofilizo, para dar HA- EDOBEA- Ac/FL como un solido de color amarillo.
La figura 5-2 muestra tambien el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA de este producto con FL se determino mediante el mismo procedimiento como en el Ejemplo comparativo 1-1-1 (Tabla 3).
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[Tabla 3]
_____Tabla ^ 3 Cantidades de los reactivos utilizados para sintetizar derivados de HA y resultados de sintesis
- N.° Ej. comp.
- Producto de interes Relacion de adicion de los reactivos usados para sintetizar HA-EDOBEA (unidad de HA/EDOBEA) Grado de modificacion con EDOBEA(%) Grado de modificacion con FL (%)
- 1-1-1
- HA-FL 1/0,2/50 13 7
- 1-1-2
- HA-EDOBEA - Ac/FL 1/2,5/50 82 3
(Ejemplo comparativo 1-1-3) Sintesis de un derivado de HA modificado con L-fenilalanina (Phe) (HA-Phe/FL)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1, excepto que se uso clorhidrato de ester etflico de L- fenilalanina (Sigma-Aldrich) en lugar de clorhidrato de ester etflico de L-alanina; de este modo, se proporciono HA- Phe/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 5-3 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con fenilalanina se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de fenilo en fenilalanina (-CaH5, 7,2-7,4 ppm; 5H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 4).
(Ejemplo comparativo 1-1-4) Sintesis de un derivado de HA modificado con L-tirosina (Tyr) (HA-Tyr/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de ester etflico de L-tirosina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina; de este modo, se proporciono HA-Tyr/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 5-4 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con tirosina se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados de hidroxifenilo en tirosina (-CaH4 OH, 6,8 7,2 ppm; 4H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 4).
(Ejemplo comparativo 1-1-5) Sintesis de un derivado de HA modificado con a-metil-DL-fenilalanina (MePhe) (HA- MePhe/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de MePhe (Watanabe Chemical Industries, Ltd.) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina y que se llevo a cabo desproteccion del carboxi usando NaOH 5N a pH 13,2; de este modo, se proporciono HA-MePhe/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 5-5 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con MePhe se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo en MePhe (-CH3, 1,5 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 4).
(Ejemplo comparativo 1-1-6) Sintesis de un derivado de HA modificado con ester metflico de L-prolina (Pro- OMe) (HA-Pro-OMe/FL)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-4, excepto que se uso clorhidrato de Pro-OMe (Sigma- Aldrich) en lugar de clorhidrato de ester etflico de glicina y que no se llevo a cabo desproteccion de carboxi; de este modo, se proporciono HA- Pro-OMe/FL en forma de un solido de color amarillo.
La figura 5-6 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con Pro-OMe se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico para 1H derivado del anillo de pirrolidina en Pro-OMe (-CHCOO-, 2,4 ppm; 1H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 4). Dado que el pico derivado de acetilo en HA glucosamina solapaba con los picos derivados para los otros hidrogenos en el grupo de pirrolidona (3H), el valor integrado del pico a 2,4 ppm multiplicado por 3 se resto del valor integrado de los picos a de 1,8 a 2,2 ppm y el valor resultante se tomo como el pico derivado de acetilo en HA glucosamina y se uso para el calculo del grado de modificacion.
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(Ejemplo comparativo 1-1-7) Sfntesis de derivados de HA modificados con glisinamida (Gly-NH2) (HA-Gly-NH2 y HA-Gly-NH2/Rh)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-15, excepto que se uso clorhidrato de glicinamida (Watanabe Chemical Industries, Ltd.) en lugar de clorhidrato de L-alaninamida; de este modo, se proporciono HA- Gly-NH2 en forma de un solido de color blanco o HA-Gly-NH2/Rh en forma de un solido de color rojo.
La figura 5-7 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con glicinamida se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metileno en glicinamida (-CH2-; 2H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 4). Dado que el pico derivado de metileno en glicinamida solapaba con los picos para las posiciones 2-5 de acido glucuronico (4H), aquellos para las posiciones 2-6 de glucosamina (6H) y los derivados de EDOBEA (12H), el valor integrado del pico en 2,0 ppm multiplicado por 10/3, asf como el valor integrado del pico a 2,0 ppm multiplicado por (grado de modificacion de EDOBEA) 12/3 se restaron del valor integrado de los picos a 3,2 a 4,2 ppm y el valor resultante se tomo como el pico derivado de metileno en glicinamida y se uso para el calculo del grado de modificacion. El grado de modificacion de EDOBEA se calculo mediante el mismo procedimiento como en el Ejemplo comparativo 1-1-2.
(Ejemplo comparativo 1-1-8) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-serinamida (Ser-NH2) (HA-Ser- NH2 y HA-Ser-NH2/Rh)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-15, excepto que se uso clorhidrato de L-serinamida (Watanabe Chemical Industries, Ltd.) en lugar de clorhidrato de L-alaninamida; de este modo, se proporciono HA- Ser-NH2 en forma de un solido de color blanco o HA-Ser-NH2/Rh en forma de un solido de color rojo.
La figura 5-8 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con serinamida se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metileno serinamida (-CH2-; 2H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 4). Dado que el pico derivado de metileno en serinamida solapaba con los picos para las posiciones 2-5 de acido glucuronico (4H), aquellos para las posiciones 2-6 de glucosamina (6H) y los derivados de EDOBEA (12H), el valor integrado del pico derivado de metileno en serinamida se calculo mediante el mismo procedimiento que en el ejemplo comparativo 1-1-7.
(Ejemplo comparativo 1-1-9) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-leucinamida (Leu-NH2) (HA-Leu- NH2 y HA-Leu4WRh)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-15, excepto que se uso clorhidrato de L-leucinamida (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) en lugar de clorhidrato de L-alaninamida; de este modo, se proporciono HA-Leu- NH2 en forma de un solido de color blanco o HA-Leu-NH2/Rh en forma de un solido de color rojo.
La figura 5-9 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con leucinamida se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de dos metilos en leucinamida (-CH(CH3)2, 0,9 ppm; 6H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 4).
(Ejemplo comparativo 1-1-10) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-isoleucinamida (Ile-NH2) (HA- Ile-NH2 y HA-Ile-NH2/Rh)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-15, excepto que se uso clorhidrato de L- isoleucinamida (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) en lugar de clorhidrato de L-alaninamida; de este modo, se proporciono HA-Ile-NH2 en forma de un solido de color blanco o HA-Ile-NH2/Rh en forma de un solido de color rojo.
La figura 5-10 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con isoleucinamida se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de dos metilos en isoleucinamida (-CH(CH3)CH2CH3, 0,9 ppm; 6H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 4). Dado que el pico derivado de acetilo en HA glucosamina solapaba con el pico para el hidrogeno en la posicion 3 de isoleucinamida (-CH(CH3)CH2CH3, 1,9 ppm; 1H), el valor integrado del pico a 0,9 ppm multiplicado por 1/6 se resto del valor integrado de los picos a de 1,8 a 2,2 ppm y el valor resultante se tomo como el pico derivado de acetilo en HA glucosamina y se uso para el calculo del grado de modificacion.
(Ejemplo comparativo 1-1-11) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-treoninamida (Thr-NH2) (HA-
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Thr-NH2 y HA-Thr-lWRh)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-15, excepto que se uso clorhidrato de L-treoninamida (Watanabe Chemical Industries, Ltd.) en lugar de clorhidrato de L-alaninamida; de este modo, se proporciono HA- Thr-NH2 en forma de un solido de color blanco o HA-Thr-NH2/Rh en forma de un solido de color rojo.
La figura 5-11 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas
condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con treoninamida se
calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo en treoninamida (-CH3, 1,2 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 4).
(Ejemplo comparativo 1-1-12) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-glutaminamida (Gln-NH2) (HA- Gln-NH2 y HA-Gln4WRh)
Se llevo a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-15, excepto que se uso clorhidrato de L- glutaminamida (Kokusan Chemical Co., Ltd.) en lugar de clorhidrato de L-alaninamida; de este modo, se proporciono HA-Gln-NH2 en forma de un solido de color blanco o HA-Gly-NH2/Rh en forma de un solido de color rojo.
La figura 5-12 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas
condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con glutaminamida se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metileno en glutaminamida (-CH2CH2CONH2, 2,4 ppm; 2H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 4). Dado que el pico derivado de acetilo en HA glucosamina solapaba con el pico derivado para metileno en glutaminamida (-CH2CH2, 2,1 ppm; 2H), el valor integrado del pico a 2,4 ppm se resto del valor integrado de los picos a de 1,8 a 2,2 ppm y el valor resultante se tomo como el pico derivado de acetilo en HA glucosamina y se uso para el calculo del grado de modificacion.
[Tabla 4]
Tabla 4 Grados de modificacion de los derivados de HA sintetizados (99 kDa)
- N.° Ej. comp.
- Compuesto de modificacion Grado de modificacion con derivado de acido amino- carboxflico (%)
- 1-1-3
- Phe/FL 88
- 1-1-4
- Tyr/FL 97
- 1-1-5
- MePhe/FL 80
- 1-1-6
- Pro-OMe/FL 78
- 1-1-7
- Gly-NH2 99
- Gly-NH2/Rh
- 93
- 1-1-8
- Ser-NH2 98
- Ser-NH2/Rh
- 93
- 1-1-9
- Leu-NH2 98
- Leu-NH2/Rh
- 83
- 1-1-10
- Ile-NH2 95
- Ile-NH2/Rh
- 83
- 1-1-11
- Thr-NH2 97
- Thr-NH2/Rh
- 85
- 1-1-12
- Gln-NH2 93
- Gln-NH2/Rh
- 81
(Ejemplo comparativo 1-2) Sfntesis de derivados de HA a partir de HA-TBA
(Ejemplo comparativo 1-2-1) Sfntesis de derivados de HA modificados con L-norleucina (Nle) (HA-Nle)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de L-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
norleucina (Cha-OMeHCl, Bachem) en lugar de AMCHCA-OMeHCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-Nle) en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se muestran en la Tabla 5.
La figura 6-1 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/Cha-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con Nle se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de metilo en Nle (-CH3, 0,9 ppm; 3H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 5).
(Ejemplo comparativo 1-2-2) Sfntesis de un derivado de HA modificado con L-leucina terciaria (tLeu) (HA- tLeu)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de L- leucina terciaria (tLeu-OMeHCl, Fluka) en lugar de AMCHCA-OMe HCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-tLeu) en forma de un solido de color blanco. Las relaciones de adicion de los reactivos se mostraron en la Tabla 5.
La figura 6-2 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/Cha-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con tLeu se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado del pico derivado de tres metilos en tLeu (-C(CH3)3, 1,0 ppm; 9H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 5).
(Ejemplo comparativo 1-2-3) Sfntesis de derivados de HA modificados con para-fluorofenilalanina (pF-Phe) (HA-pFPhe)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester etflico de para- fluorofenilalanina (tLeu (pFPhe-OEt HCl, Bachem) en lugar de AMCHCA-OMe HCl y que se llevo a cabo desproteccion del carboxi usando NaOH 5N a pH 13,2; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-pFPhe) en forma de un solido de color blanco.
La figura 6-3 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/Phe-OEtHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con pFPhe se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados del anillo aromatico en pFPhe (-C6H4F, 7,1, 7,3 ppm; 4H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 5).
(Ejemplo comparativo 1-2-4) Sfntesis de derivados de HA modificados con (s)-(+)-2-fenilglicina (Phg) (HA- Phg)
Se realizo el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-5-1, excepto que se uso clorhidrato de ester metflico de (s)- (+)-2-fenilglicina (Phg-OMeHCl, Sigma-Aldrich) en lugar de AMCHCA-OMeHCl; de este modo, se proporcionaron los productos de interes (HA-Phg) en forma de un solido de color blanco.
La figura 6-4 muestra el espectro de RMN de 1H de un ejemplo representativo de los productos, que se obtuvo mediante analisis en D2O del producto sintetizado usando HA-Na con un PM de 99 kDa en presencia de los reactivos a la relacion de unidad de HA-TBA/DMT-MM/Phg-OMeHCl = 1/3/5. El grado de modificacion de la unidad de HA con Phg se calculo a partir del valor integrado del pico derivado de acetilo en HA glucosamina (-COCH3, 2,0 ppm; 3H) y el valor integrado de los picos derivados del anillo aromatico en Phg (-C6H5, 7,3-7,5 ppm; 5H) usando el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1 (Tabla 5).
[Tabla 5]
Tabla 5 Cantidades de los reactivos utilizados para sintetizar derivados de HA y resultados de sfntesis
- N.° Ej. comp.
- Compuesto de modificacion Peso molecular de HA Relacion de adicion molar del compuesto de modificacion y DMT-MM (unidad de HA-TBA/ DMT-MM/compuesto de modificacion) Grado de modificacion (%)
- 1-2-1
- Nle 99 kDa 1/3/5 103
- Nle
- 25 kDa 1/3/5 100
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
- N.° Ej. comp.
- Compuesto de modificacion Peso molecular de HA Relacion de adicion molar del compuesto de modificacion y DMT-MM (unidad de HA-TBA/ DMT-MM/compuesto de modificacion) Grado de modificacion (%)
- 1-2-2
- tLeu 99 kDa 1/3/5 105
- tLeu
- 25 kDa 1/3/5 107
- 1-2-3
- pFPhe 99 kDa 1/3/5 108
- pFPhe
- 25 kDa 1/3/5 109
- 1-2-4
- Phg 99 kDa 1/3/5 97
- Phg
- 25 kDa 1/3/5 103
(Ejemplo comparativo 1-3) Sfntesis de a derivado de PEG marcado con FL (PEG-FL)
Se disolvio PEG (MEPA-30T, NOF Corporation) en agua ultrapura para dar una concentracion de 10 mg/ ml, y, despues, la solucion se diluyo 2 veces con una solucion de tampon fosfato 100 mM (pH 7,4) para preparar una solucion de 5 mg/ml. A esta solucion se anadio NHS-fluorescefna (NHS-FL, PIERCE) como una solucion en DMSO en una cantidad de 15 equivalentes molares al extremo terminal de PEG y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. Despues de la solucion de reaccion se volvio a precipitar con eter dietflico, el precipitado se recogio mediante filtracion y se disolvio de nuevo en agua ultrapura, la solucion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra agua ultrapura en exceso grande y el dializado se liofilizo, para dar el producto de interes (PEG-FL)en forma de un solido de color amarillo.
La figura 7 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. Los hallazgos del pico derivado de un extremo terminal de PEG (-OCH3, 3,4 ppm, 3H) y los picos derivados de fluorescefna (7-8 ppm) demostraron la modificacion del extremo terminal de PEG con FL.
[Ejemplo 2] Confirmacion in vitro de biodegradabilidad
Se confirmaron las resistencias de las muestras incubadas en ciertas condiciones con hialuronidasa SD (Hyase, Seikagaku Corporation).
Se determinaron algunos de los productos obtenidos en el Ejemplo 1-4 y el Ejemplo Comparativo 1-1. Se usaron soluciones acuosas de cinco (5) o 20 mg/ ml de los productos como muestras de analisis y una solucion acuosa de 5 mg/ ml de HA- Na como muestra patron. Las muestras se diluyeron 10 veces con PBS o plasma de rata. Las muestras diluidas con PBS se incubaron cada una a 37 °C durante 0 horas, 24 horas, o 1 semana, respectivamente, y las muestras diluidas en plasma se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Cada una de las muestras se dividio en dos alfcuotas. Una alfcuota se mezclo a una relacion de agua de muestra/agua ultrapura/solucion de tampon fosfato 0,2 M (pH 6,2)/solucion de tampon fosfato 0,2 M (pH 6,2) que contenfa Hyase (0,5 U/ml) = 2/1/2/1 y la mezcla resultante se puso en uso como una muestra tratada con Hyase. La otra alfcuota se mezclo a una relacion de muestra/agua ultrapura/solucion de tampon fosfato 0,2 M (pH 6,2) = 2/1/3 y la mezcla resultante se puso en uso como una muestra no tratada con Hyase. Despues de incubar las muestras respectivas a 37 °C durante la noche, se cuantificaron los contenidos de N-acetilglucosamina terminal reductora en las muestras mediante el metodo Reissig descrito a continuacion. Las muestras derivadas de la muestra estandar se diluyeron 1,3, 10, 30, 100 y 300 veces, respectivamente, ara asegurar que las composiciones de los disolventes no se cambiaron. A continuacion, las respectivas muestras resultantes, puestas en uso como muestras de curva de calibracion, se sometieron a coloracion mediante el mismo procedimiento.
Las muestras tratadas con Hyase obtenidas de este modo, las muestras no tratadas con Hyase y las muestras de la curva de calibracion se mezclaron cada una a una relacion de la muestra /solucion tampon de borato 0,8M (pH 9,1 )/1 N KOH = 25/5/2. Las mezclas resultantes se calentaron cada una en un bano de agua en ebullicion durante 3 minutos y, despues, se introdujeron en hielo inmediatamente. Despues, se disolvio p-dimetilaminobenzaldehfdo en una solucion mixta (1:70) de HCl 10N y acido acetico para proporcionar un reactivo (10 mg/ ml). Las muestras anteriores se mezclaron cada una con el reactivo en una relacion de 32:150 y las mezclas resultantes se incubaron cada una a 37 °C durante 20 minutos y, despues, se introdujeron en hielo inmediatamente. Despues de que las temperaturas de las muestras retornaron a la temperatura ambiente se determino la absorbancia a 544 nm inmediatamente. Utilizando los valores obtenidos restando las absorbancias de las muestras no tratadas con Hyase de las de las muestras tratadas con Hyase, se construyo una curva de calibracion para calcular las concentraciones de N-acetilglucosamina terminal reductora en las respectivas muestras, con lo que los grados de degradacion se determinaron a partir de la siguiente ecuacion (Tabla 6):
[Formula 27]
UrancenrtracLoii is la N - aoetijgluco sannna terrcnnaJ reductoral
[grain ie iegradad-onJ = ----------------;------------------------------------;—1--------;-----------------------------------------------------* 100
' ' [csr.nsr.Trannr. ns lai urn nans* ns rspsnmnr. ns maananns nstsrarnana rasmar.ts RHN ns 1H_'
Ademas, la muestra estandar degrado HA-Na completamente (100 %) en estas condiciones. Al grado de 5 degradacion del 1 %, se estima que el HA con un PM de 100 kDa se escinde en 2,5 posiciones por molecula, lo que da como resultado una disminucion en el peso molecular hasta 40 kDa.
En cuanto a HA-EDOBEA-Ac/FL (Ejemplo comparativo 1-1-2), se realizo analisis mediante cromatograffa de exclusion por tamano como se ha descrito en el Ejemplo 3-3-2, pero no se observo ningun compuesto inyectado con 10 peso molecular reducido en la muestra de orina, lo que confirma la ausencia de biodegradabilidad y los resultados de este ensayo tampoco mostraron degradabilidad con Hyase. Por otro lado, todos los demas derivados de HA mostraron degradabilidad.
En particular, las muestras de los ejemplos 1-4-1 a 1-4-6, 1-4-8 a 1-4-11, 1-4-14 a 1-4-16, 1-4-18, y 1-4-19 que se 15 trataron con plasma de rata durante un dfa mostraron una degradabilidad aumentada en comparacion con las muestras que se trataron con PBS durante un dfa; esto hizo concebible que estos derivados se alteraran hasta producir formas mas sensibles a la degradacion mediada por Hyase liberando compuestos de modificacion en un entorno biologico.
20 [Tabla 6-1]
Tabla 6 Resultados de una evaluacion in vitro de las biodegradabilidades de los derivados de HA
- N.° ej./N.° ej. comp.
- Compuesto de modificacion Grado de degradacion inicial (%) Grado de degradacion despues del tratamiento con PBS durante un dfa (%) Grado de degradacion despues del tratamiento con PBS durante 7 dfas 7 dfas (%) Grado de degradacion despues del tratamiento con plasma de rata durante un dfa (%)
- Ej. 1-4-1
- Ala/FL 0,92 0,96 0,92 3,19
- Ej. 1-4-2
- Ser/FL 0,63 0,61 0,54 2,17
- Ej. 1-4-3
- Glu/FL 2,45 2,54 2,40 6,92
- Ej. 1-4-4
- Gly 1,06 1,09 1,21 2,73
- Ej. 1-4-5
- Val 0,27 0,23 0,26 0,61
- Ej. 1-4-6
- Leu 3,43 2,81 3,24 6,01
- Ej. 1-4-7
- He 0,42 0,34 0,59 n.d.
- Ej. 1-4-8
- Thr 0,11 0,12 0,23 1,02
- Ej. 1-4-9
- Asp 0,26 0,29 0,22 0,88
- Ej. 1-4-10
- cACHCA/FL 0,54 0,36 0,19 1,11
- Ej. 1-4-11
- tACHCA-O Et/FL 1,14 0,85 0,65 1,69
- Ej. 1-4-12
- Aib/FL 3,57 3,56 3,18 3,03
- Ej. 1-4-13
- ACBuCA-O Et/FL 0,30 0,19 0,44 n.d.
- Ej. 1-4-14
- Asn 0,26 0,10 n.d. 0,90
- Ej. 1-4-15
- Ala-NH2 n.d. 0,22 n.d. 2,07
- Ej. 1-4-16
- Val-NH2 n.d. 0,88 0,72 2,28
- Ej. 1-4-17
- Asn-NH2 n.d. n.d. 0,23 n.d.
- Ej. 1-4-18
- Me 0,31 0,33 0,32 0,68
- Ej. 1-4-19
- Pr 0,19 0,09 0,10 0,46
- Ej. comp. 11-2
- EDOBEA-A c/FL n.d. n.d. n.d. n.d.
5
10
15
20
25
30
35
- N.° ej./N.° ej. comp.
- Compuesto de modificacion Grado de degradacion inicial (%) Grado de degradacion despues del tratamiento con PBS durante un dfa (%) Grado de degradacion despues del tratamiento con PBS durante 7 dfas 7 dfas (%) Grado de degradacion despues del tratamiento con plasma de rata durante un dfa (%)
- Ej. comp. 11-3
- Phe/FL 1,74 1,84 1,82 4,75
[Tabla 6-21
- Ej. comp. 1-1-4
- Tyr/FL 0,23 0,13 0,19 0,98
- Ej. comp. 1-1-5
- MePhe/FL 7,49 5,57 6,06 5,25
- Ej. comp. 1-1-6
- Pro-OMe/FL 8,12 10,03 8,94 7,92
- Ej. comp. 1-1-7
- Gly-NH2 1,04 0,11 0,30 1,58
- Ej. comp. 1-1-8
- Ser-NH2 n.d. 0,91 n.d. 2,23
- Ej. comp. 1-1-9
- Leu-NH2 0,50 0,92 0,79 2,17
- Ej. comp. 1-1-10
- Ile-NH2 n.d. 0,93 0,34 3,53
- Ej. comp. 1-1-11
- Thr-NH2 1,29 n.d. 0,24 1,52
- Ej. comp. 1-1-12
- Gln-NH2 n.d. 0,17 n.d. 0,91
* "n.d. (no determinado)" representa que el grado de degradacion no se pudo calcular debido a que la concentracion de N-acetilglucosamina terminal reductora estaba por debajo del lfmite inferior de cuantificacion.
[Ejemplo 3] Confirmacion in vivo de la permanencia en sangre y la biodegradabilidad (Ejemplo 3-1) Muestras biologicas de ratas tratadas con derivado de HA
Los compuestos obtenidos en el Ejemplo 1-4 y el Ejemplo comparativo 1-1 y los compuestos obtenidos en Ejemplo comparativo 1-3 se administraron por via intravenosa a ratas a dosis unicas de 20 y 10 mg/kg, respectivamente. Cinco (5) minutos y 2, 7, 24, 48, 72, 168, 240 y 336 horas despues del tratamiento, se obtuvieron muestras de sangre de la vena yugular usando jeringas tratadas con heparina sodica y se sometieron a centrifugacion para obtener plasma. Las muestras de plasma se crioconservaron por debajo de -20 °C hasta el analisis. Las muestras de orina se recogieron utilizando jaulas metabolicas de 0 a 24 horas, 24 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 168 a 192 horas, 240 a 264 horas, y 336 a 360 horas despues del tratamiento. Se midieron las cantidades de orina y una parte de las respectivas muestras se crioconservaron por debajo de -20 °C hasta el analisis.
(Ejemplo 3-2) Analisis de las muestras de plasma de las ratas tratadas con derivados de HA (Ejemplo 3-2-1) Preparacion de muestras de analisis
(Ejemplo 3-2-1) Preparacion de muestras de analisis
Las muestras de plasma se descongelaron, se agitaron y se centrifugaron para recoger los sobrenadantes. Los sobrenadantes se diluyeron con una solucion tampon (HA marcado con FL:solucion de tampon fosfato (pH 8,0, I=0,15); HA marcado con Rh: PBS). Las soluciones de administracion se diluyeron con una solucion mixta (3:1) de una solucion tampon y plasma de rata en blanco para preparar muestras de la curva de calibracion.
(Ejemplo 3-2-2) Determinacion de la concentracion
Se determino la intensidad de fluorescencia de las muestras preparadas en el Ejemplo 3-2-1 utilizando un lector de placas (SPECTRAmax GEMINI, Molecular Devices) (HA marcados con FL: longitud de onda de excitacion 495 nm, longitud de onda de fluorescencia 520 nm; HA marcados con Rh: longitud de onda de excitacion 552 nm, longitud de onda de fluorescencia 595 nm). Se construyo una curva de calibracion para cada compuesto a partir de los valores medidos de las muestras de la curva de calibracion, por lo que se calcularon las concentraciones de los compuestos en plasma de los individuos respectivos en los respectivos puntos de tiempo. Los promedios de las concentraciones plasmaticas se muestran en la figura 8, y los graficos para los cursos temporales de dichos promedios se muestran en la figura 9.
(Ejemplo 3-2-3) Calculo de los parametros farmacocineticos
Los parametros farmacocineticos se calcularon utilizando WinNonlin Ver 4.0.1/Ver 6.1 (Pharsight). Los datos promedio para cada grupo calculado en el Ejemplo 3-2-2 se sometieron a un analisis independiente del modelo para 5 calcular un aclaramiento (CL) (Tabla 7). Como resultado, en comparacion con PEG que tiene permanencia practica en sangre, todos los derivados de HA de los Ejemplos 1-4-1 a 1-4-19 mostraron valores de CL mas bajos, demostrando de este modo que tienen permanencia practica en la sangre. Asimismo, algunos de los derivados de HA de los Ejemplos Comparativos mostraron valores de CL mas altos que PEG, lo que revela que se pueden sintetizar derivados de HA que muestran diferentes permanencias en sangre en funcion del tipo del compuesto de 10 modificacion.
[Tabla 7]
Tabte 7 Evaluacion de los aclaramientos de los derivados de HA y PEG de la sangre
- N.° ej./N.° ej. comp. Compuesto
- CL (ml/h/kg)
- Ejemplo 1-4-1
- HA-Ala/FL 1,0
- Ejemplo 1-4-2
- HA-Ser/FL 1,1
- Ejemplo 1-4-3
- HA-Glu/FL 3,0
- Ejemplo 1-4-4
- HA-Gly/FL 1,4
- Ejemplo 1-4-5
- HA-Val/FL 1,2
- Ejemplo 1-4-6
- HA-Leu/FL 1,3
- Ejemplo 1-4-7
- HA-Ile/FL 1,3
- Ejemplo 1-4-8
- HA-Thr/FL 1,0
- Ejemplo 1-4-9
- HA-Asp/FL 2,8
- Ejemplo 1-4-10
- HA-cACHCA/FL 1,1
- Ej. 1-4-11
- HA-tACHCA-OEt /FL 1,3
- Ej. 1-4-12
- HA-Aib/FL 1,1
- Ejemplo 1-4-13
- HA-AcBuCA-OEt /FL 0,8
- Ejemplo 1-4-14
- HA-Asn/Rh 1,8
- Ejemplo 1-4-15
- HA-Ala-NH2/Rh 2,0
- Ejemplo 1-4-16
- HA-Val-NH2/Rh 2,5
- Ej. 1-4-17
- HA-Asn-NH2/Rh 2,4
- Ej. 1-4-18
- HA-Me/FL 1,1
- Ej. 1-4-19
- HA-Pr/FL 0,9
- Ej. comp. 1-1-1
- HA-FL 8,4
- Ej. comp. 1-1-2
- HA-EDOBEA-Ac/FL 0,6
- Ej. comp. 1-1-3
- HA-Phe/FL 6,0
- Ej. comp. 1-1-4
- HA-Tyr/FL 14,8
- Ej. comp. 1-1-5
- HA-MePhe/FL 12,9
- Ej. comp. 1-1-6
- HA-Pro-OMe/FL 3,7
- Ej. comp. 1-1-7
- HA-Gly-NH2/Rh 6,6
- Ej. comp. 1-1-8
- HA-Ser-NH2/Rh 29,3
- Ej. comp. 1-1-9
- HA-Leu-NH2/Rh 3,6
- Ej. comp. 1-1-10
- HA-Ile-NH2/Rh 3,2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
- N.° ej./N.° ej. comp. Compuesto
- CL (ml/h/kg)
- Ej. comp. 1-1-11
- HA-Thr-NH2/Rh 47,9
- Ej. comp. 1-1-12
- HA-Gln-NH2/Rh 10,6
- Ej. comp. 1-3
- PEG-FL 3,0
(Ejemplo 3-3) analisis de las orinas de ratas tratadas con derivados de HA (Ejemplo 3-3-1) Preparacion de muestras de analisis
Las muestras de orina se descongelaron, se agitaron y se pasaron a traves de un filtro de 0,22 pm para recoger los filtrados. Los filtrados se diluyeron con una solucion tampon (HA marcados con FL:solucion de tampon fosfato (pH 6,5, I=0,15); HA marcados con HA: PBS). Las soluciones de administracion se diluyeron con una solucion mixta (1:1) de una solucion tampon y plasma de rata en blanco para preparar muestras de la curva de calibracion.
(Ejemplo 3-3-2) Analisis mediante cromatograffa de exclusion por tamano
Las muestras preparadas en el Ejemplo 3-3-1 se sometieron a cromatograffa de exclusion por tamano para observar los cambios en la distribucion del peso molecular. El analisis por cromatograffa de exclusion por tamano se realizo usando el sistema e HPLC Alliance (Nihon Waters K.K.). Las condiciones de analisis son las siguientes.
Condiciones del analisis mediante cromatograffa de exclusion por tamano
Columna de analisis: Gel TSK G5000PWXL (Tosoh Corporation)
Temperatura de la columna: 25 °C
Fase movil: Solucion tampon de fosfato (pH 6,5, I=0,15) (para HA marcados con HA) PBS (para HA marcados con Rh)
Caudal: 0,5 ml/min
Deteccion: Ex 495 nm/Em 520 nm (HA marcados con FL)
Ex 552 nm/Em 595 nm (HA marcados con Rh)
Los resultados se muestran en la figura 10. Para cada figura, el panel izquierdo muestra los cromatogramas en el mismo intervalo en los respectivos puntos de tiempo y el panel derecho muestra los cromatogramas en los respectivos puntos de tiempo, que se normalizaron con el pico mas fuerte.
En cuanto al derivado de HA del Ejemplo Comparativo 1-1-2, no se observo ningun compuesto inyectado con peso molecular reducido en las muestras de orina. Por otro lado, como para todos los derivados de HA de los Ejemplos, se detectaron los compuestos inyectados con peso molecular reducido en las muestras de orina. Esto indica que los derivados de HA de la presente invencion tienen biodegradabilidad y son excretados del cuerpo despues del tratamiento.
[Ejemplo 4] Verificacion de la propiedad de alteracion de la membrana usando liposomas (Ejemplo 4-1) Preparacion de un liposoma que encapsula un fosforo y un inactivador
En primer lugar, se disolvio la sal trisodica de acido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfonico (piramina) (Sigma-Aldrich) en agua destilada a una concentracion de 60 pmol/ ml y, continuacion, se disolvio bromuro de p-xileno-bis(N-piridinio) (DPX) (Sigma-Aldrich) en agua destilada a una concentracion de 85,7 pmol/ ml; a continuacion, se mezclaron estas soluciones en cantidades equivalentes para preparar una solucion acuosa de piramina/DPX.
Se anadio la solucion piramina/DPX resultante (2 ml) a un vial COATSOME EL-11A (NOF Corporation) y se mezclaron los componentes, de modo que se preparo una solucion de liposomas.
A continuacion, con el fin de eliminar la piramina y el DPX no encapsulados, la solucion se sometio a purificacion con columnas PD-10 y purificacion por dialisis (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra 500 ml de solucion fisiologica salina tres veces, de modo que se proporciono una solucion de liposomas.
La solucion de liposomas se diluyo 5 veces con una solucion de tampon de fosfato con una fuerza ionica de 0,15 y un pH de 6 o 7,4; con lo que se preparo una solucion de liposomas con cada pH.
(Ejemplo 4-2) Evaluacion de la propiedad de alteracion de la membrana liposomica
Los derivados de HA obtenidos en el Ejemplo 1-5 y el Ejemplo Comparativo 1-2 se disolvieron cada uno en solucion fisiologica salina, para dar una concentracion de HA-Na de 10 mg/ml y las soluciones respectivas se diluyeron
5
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secuencialmente con solucion fisiologica salina para ajustar las concentraciones a 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, y 0,01 mg/ ml. Como control positivo, se preparo una solucion de Triton X en 10 mg/ml de solucion fisiologica salina. Como control negativo, se utilizo solucion fisiologica salina. Ademas, se selecciono bromhidrato de poli- L-lisina (PLL, MW 15-30 kDa, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como sustancia de control positivo con propiedad de alteracion de la membrana y se disolvio en solucion fisiologica salina, para dar una concentracion de 10 mg/ ml.
Despues de la adicion de 25 pl de la solucion de liposomas a 200 pl de la solucion de tampon fosfato con pH 7,4 o pH 6,0, se anadieron 25 pl de las muestras a cada uno. Despues de incubar a 37 °C durante 3 horas, cada mezcla se paso a traves de un filtro de 0,22 pm y se determino la intensidad de la fluorescencia de 100 pl de los filtrados usando un lector de placas (SPECTRAmax GEMINI) (longitud de onda de excitacion 450 nm, longitud de onda de emision 510 nm). Se determino PLL unicamente a pH 7,4.
El indicador de una propiedad de alteracion de la membrana se calculo como un grado de degradacion de liposomas de acuerdo con la siguiente ecuacion.
(Grado de degradacion de
liposomas)
[Formula 28]
(Intensidad de fluorescencia de la muestra a la que se ha anadido HA)
(Intensidad de fluorescencia de la muestra a la que se ha anadido Triton X)
(Intensidad de fluorescencia de la muestra a la que se ha anadido solucion salina) (Intensidad de fluorescencia de la muestra a la que se ha anadido solucion salina)
x 100
Los resultados se muestran en la figura 11. Las muestras HA-Nle, HA-tLeu, y HA-pFPhe utilizadas en los Ejemplos no mostraron una propiedad de alteracion de la membrana a ningun pH. mientras que las muestras utilizadas en los Ejemplos mostraron una propiedad de alteracion de la membrana mas alta a pH 6,0 que a pH 7,4. En particular, HA- pcACHCA, HA-Nal, HA-APBA, HA-Cha, HA-AMBA, HA-3AMBA, HA-APhPA, HA-AEB, HA-AMCIBA, HA-AMSA, HA- 4AMCHCA, HA-Chg y HA-pHPhg no mostraron propiedad de alteracion de la membrana a pH 7,4, pero la mostraron unicamente a pH 6,0. Ademas, puesto que PLL mostro un grado de degradacion de liposomas del 6,6 % a pH 7,4, puede juzgarse que cualquier derivado funciona adecuadamente como una sustancia que tiene una propiedad de alteracion de la membrana si muestra un grado de degradacion de liposomas de al menos un pequeno porcentaje y, por tanto, se demostro que los derivados de HA de la presente invencion tienen una propiedad de alteracion de la membrana a pH 6,0.
[Ejemplo 5] Sfntesis de conjugados de derivado de HA-Ala/analogo de PTH
(Ejemplo 5-1) Sfntesis de una sal de TBA de HA-Aa (HA-Ala-TBA)
Se preparo una solucion en DMSO anhidro (5 mg/ml) de HA-TBA sintetizada usando HA-Na (99 kDa) como material de partida en el Ejemplo 1-2. A continuacion, se anadio ester etflico de L-alanina en una cantidad de 3 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA. Despues, se anadio DMT-MM en una cantidad de 3 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante toda la noche. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua destilada, en este orden. Se anadio NaOH 5N al dializado resultante para ajustar el pH a, al menos, 12,5 y se realizo agitacion durante una hora para efectuar desproteccion de carboxi mediante hidrolisis de ester etflico. A continuacion, la mezcla se neutralizo con una solucion de HCl 5N y se dializo adicionalmente contra agua destilada y agua ultrapura, en este orden, La suspension de resina de intercambio cationico convertida en una sal de TBA en el Ejemplo 1-1 se anadio al dializado resultante en una cantidad de 5 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA segun se ha calculado para la capacidad de intercambio ionico de la resina. Despues de agitar durante 15 minutos, la mezcla se paso a traves de un filtro de 0,45 pm y el filtrado se liofilizo, para dar muestras de HA-Ala-TBA en forma de un solido blanco. Se tomo una parte del producto y se dializo contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua destilada, en este orden y el dializado se liofilizo para su uso como una muestra para calcular el grado de modificacion con alanina.
La figura 12-1 muestra los espectros de RMN de 1H obtenidos mediante analisis de la muestra para calcular el grado de modificacion con alanina y el producto en las mismas condiciones que se han descrito en el Ejemplo 1-3. El grado de modificacion de la unidad de HA con alanina se calculo que era del 98 % mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-4-1. El contenido de unidades HA por peso en HA-Ala-TBA se cuantifico mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-3.
(Ejemplo 5-2) Sfntesis de HA-Ala-EDOBEA
Se anadieron EDOBEA y BOP en este orden a la solucion en DMSO anhidro (5 mg/ml) de HA-Ala-TBA sintetizada en el Ejemplo 5-1 en cantidades de 50 y 0,15 equivalentes molares, respectivamente, con respecto a la unidad de
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HA, y se realizo agitacion a temperature ambiente durante 6 horas. La solucion de reaccion se dializo (Spectra/Por 4, corte del peso molecular (COPM): 12-14 kDa) para su purificacion contra una solucion acuosa de NaCl 0,3 M y agua destilada, en este orden, y el dializado se liofilizo, para dar HA-Ala-EDOBEA en forma de un solido blanco.
El producto se sometio a analisis RMN de 1H mediante el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo Comparativo 1-1-2 y, como resultado, se encontro que el grado de modificacion con EDOBEA era del 9,4 %. El contenido de unidades de HA se cuantifico mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-3. La figura 12-2 muestra el espectro de RMN de 1H del producto.
(Ejemplo 5-3) Sfntesis de HA-Ala-EDOBEA-
La solucion acuosa (10 mg/ ml) de HA-Ala-EDOBEA sintetizada en el Ejemplo 5-2 se diluyo 2 veces con una solucion de tampon fosfato 100 mM (pH 7,4), se anadio NHS-rhodamina como una solucion en 5 mg/ml de DMSO en una cantidad de 0,07 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante 2 horas. La solucion de reaccion se purifico en una columna desaladora (PD-10, GE Healthcare) equilibrada con agua ultrapura y la fraccion de HA se liofilizo, para dar HA-Ala-EDOBEA-Rh en forma de un solido de color rojo.
La figura 12-3 muestra el espectro de RMN de 1H obtenido mediante analisis del producto en D2O. El contenido de unidades de HA por peso se cuantifico mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1-3. Asimismo, el producto se disolvio en una solucion de tampon carbonato 100 mM (pH 9,0) a una concentracion de 0,042 mg/ ml y el contenido de Rh por peso se cuantifico a partir de la absorbancia a 552 nm, por lo que el grado de modificacion de la unidad de HA con Rh se calculo en 3,1 %. Adicionalmente, se calculo que el coeficiente de absorcion molar del producto resultante era de 2.690 M- cm- .
(Ejemplo 5-4) Sfntesis de un derivado bromoacetilo de HA (HA-Ala-EDOBEA-BA/Rh/Ac)
La solucion acuosa (20 mg/ml) de HA-Ala-EDOBEA-Rh sintetizada en el Ejemplo 5-3 se uso como material de partida. La solucion se diluyo 2 veces con una solucion de tampon fosfato 100 mM (pH 7,4) se anadio NHS- bromoacetato (NHS- BA, Sigma-Aldrich) como una solucion en 50 mg/ml de acetonitrilo en una cantidad de 0,5 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuacion, se anadio anhfdrido acetico en una cantidad de 20 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y se realizo agitacion adicional durante una hora para acetilar el amino terminal en exceso de EDOBEA. La solucion de reaccion se purifico en una columna desaladora (PD-10) equilibrada con agua ultrapura y la fraccion de HA fraccionado se concentro aproximadamente 2 veces mediante ultrafiltracion centrffuga (Macrosep, COPM 3000, Paul Life Science) para dar HA-Ala-EDOBEA-BA/Rh/Ac como una solucion acuosa. La solucion acuosa se crioconservo a -20 °C hasta su uso posterior. Despues de liofilizar, se midio una alfcuota para determinar su peso para calcular la concentracion de solidos en la solucion.
(Ejemplo 5-5) Sfntesis de un conjugado de analogo de HA-Ala/PTH (HA-Ala-PTH/Rh)
La solucion acuosa de HA-Ala-EDOBEA-BA/Rh/Ac sintetizada en el Ejemplo 5-4 se uso como material de partida. Se uso PTH-Cys (SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFC, American Peptide Company) que se obtuvo introduciendo cistefna en el extremo C de la PTH humana (1-34) como analogo de PTH. A la solucion de HA-Ala- EDOBEA-BA/Rh/Ac se anadieron 3/10 del volumen de acetonitrilo en 1/10 del volumen de una solucion de tampon de fosfato 1M (pH 7,4). Despues de disolver PTH-Cys en una solucion de tampon citrato 10 mM (pH 4,5) a una concentracion de 5 mg/ ml, la solucion resultante se anadio a la solucion de HA-Ala-EDOBEA-BA/Rh/Ac en una cantidad de 0.03 equivalentes molares con respecto a la unidad de HA y la mezcla se incubo a 37 °C durante toda la noche. Se anadio clorhidrato de cistefna monohidrato (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como una solucion en 20 mg/ml de acetonitrilo en una cantidad de 1 equivalente molar con respecto a la unidad de HA y la mezcla se incubo adicionalmente a 37 °C durante 3 horas, y, a continuacion, el pH de la mezcla se ajusto a 4,5 con una solucion acuosa de hidroxido sodico 1 N. Se especifico que el contenido de unidades de HA por peso era 1,5 pmol/mg y este valor se uso para calcular la unidad de HA.
Despues, la solucion de reaccion se purifico mediante ultrafiltracion centrffuga (Macrosep, COPM 10000) repitiendo la dilucion con una solucion DE tampon citrato 2 mM (pH 4,5) y UNA concentracion DE cuatro veces para preparar un concentrado DE HA-Ala-PTH/Rh. El concentrado resultante se diluyo 100 veces con una solucion de tampon carbonato 100 mM (pH 9,0) y se determino la dilucion para su absorbancia a 552 nm, por lo que se calculo que la concentracion de HA era de 24,3 pmol/ml usando el coeficiente de absorcion de HA-Ala-EDOBEA-Rh calculado en el Ejemplo 5-3. Se realizo el analisis de aminoacidos mediante el metodo AccQTag (Waters), de modo que se calculo que la concentracion de PTH era de 141,75 nmol/ml y se determino que el grado de modificacion con PTH era de 0,58 %. En el analisis de aminoacidos, la hidrolisis y la derivatizacion se realizaron utilizando la estacion de trabajo PicoTag y el paquete de qufmica AccQTag conforme al manual adjunto al paquete. El analisis de HPLC se realizo usando el Modulo de Separacion Waters 2690 y el Detector de Fluorescencia Waters 474 y el analisis para calcular la concentracion de aminoacidos se baso en la concentracion de residuos de lisina.
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[Ejemplo 6] Confirmacion in vivo de la permanencia en sangre y biodegradabilidad del conjugado de derivado de HA-Ala/analogo de PTH
(Ejemplo 6-1) Muestras biologicas de ratas tratadas con derivados de HA
El compuesto obtenido en el Ejemplo 5-5 se administro por via intravenosa a ratas a una dosis unica de 10 mg/kg. Despues de 5 minutos, y 2, 7, 24, 48, 72, 168, 240 y 312 horas de tratamiento, se obtuvieron muestras de sangre de la vena yugular usando jeringas tratadas con heparina sodica y se sometieron a centrifugacion para obtener plasma. Las muestras de plasma se crioconservaron por debajo de -20 °C hasta el analisis. Las muestras de orina se recogieron utilizando jaulas metabolicas de 0 a 24 horas, 24 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 144-168 horas, 216-240 horas, y 288-312 horas despues del tratamiento. Se midieron las cantidades de orina y una parte de las respectivas muestras se crioconservaron por debajo de -20 °C hasta el analisis.
(Ejemplo 6-2) Analisis de las muestras de plasma de ratas tratadas con derivados de HA
(Ejemplo 6-2-1) Preparacion de muestras de analisis
Las muestras de analisis se prepararon mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 3-2-1.
(Ejemplo 6-2-2) Determinacion de la concentracion
Utilizando las muestras preparadas en el Ejemplo 6-2-1 las concentraciones del compuesto en plasma de los individuos respectivos en los respectivos puntos de tiempo se calcularon mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 3-2-2. Los promedios de las concentraciones plasmaticas se muestran en la figura 13, y los graficos para los cursos temporales de dichos promedios se muestran en la figura 14.
(Ejemplo 6-2-3) Calculo de los parametros farmacocineticos
Utilizando las datos promedio calculados en el Ejemplo 6-2-2 se calculo que el aclaramiento CL) era 1,0 mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 3-2-3. El derivado de acido hialuronico biodegradable mostro una permanencia practica en la sangre, tambien en forma del conjugado con el farmaco.
(Ejemplo 6-3) Analisis de las muestras de orina de ratas tratadas con derivados de HA
(Ejemplo 6-3-1) Preparacion de muestras de analisis
Las muestras de analisis se prepararon mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 3-3-1.
(Ejemplo 6-3-2) Analisis mediante cromatograffa de exclusion por tamano
La figura 15 muestra los resultados del analisis de las muestras preparadas en el Ejemplo 6-3-1 mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 3-3-2. En esta figura, el panel izquierdo muestra los cromatogramas en el mismo intervalo en los respectivos puntos de tiempo y el panel derecho muestra los cromatogramas en los respectivos puntos de tiempo, que se normalizaron con el pico mas fuerte.
Se detecto un compuesto con peso molecular reducido en las muestras de orina de los individuos tratados con el compuesto del Ejemplo 5-5. Esto indica que el conjugado entre el derivado de acido hialuronico biodegradable y el farmaco mantiene su biodegradabilidad y se excreta del cuerpo despues del tratamiento.
Claims (7)
1. Un derivado de acido hialuronico que comprende unidades de disacarido representadas por la Formula (I):
R1, R2, R3, y R4 se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo C1-6, 10 formilo y alquilcarbonilo C1-6;
R8 es un atomo de hidrogeno, formilo o alquilcarbonilo C1-6; X esta representado por las siguientes formulas:
5
10
15
"*" representa una posicion de union al carboxi en el derivado de acido hialuronico,
donde la proporcion de las unidades de disacarido de Formula (I) con respecto a las unidades de repeticion de disacarido presentes en el derivado de acido hialuronico es, al menos, de 70 %.
2. El derivado de acido hialuronico de acuerdo con la reivindicacion 1, que ademas comprende unidades de disacarido representadas por la formula (II):
1a 2a 3a 4a
R , R , R , y R se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo C1-6, formilo y alquilcarbonilo C1-6;
R8a es un atomo de hidrogeno, formilo o alquilcarbonilo C1-6;
Xa se selecciona de entre hidroxi y -O-Q+, donde Q+ representa a contracation. 2 3
3. El derivado de acido hialuronico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que ademas comprende unidades de disacarido representadas por la formula (ill):
5
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40
45
R1b, R2b, R3b, y R4b se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, alquilo Ci-6, formilo y alquilcarbonilo Ci-a;
R8b es un atomo de hidrogeno, formilo o alquilcarbonilo Ci-a;
Xb es un grupo representado por -NRe-Yb-Rd; donde Re es un atomo de hidrogeno o alquilo Ci-a;
Rd es un atomo de hidrogeno, alquilo Ci-a, -CO-C(R7)=CH2, o -CO-G4-Xc;
R7 es un atomo de hidrogeno o metilo;
G4 se selecciona de entre fenileno, cicloalquileno C3-8 y -G5-(alquileno Ci-i0)-Ga-, donde el resto de alquileno Ci-i0 puede tener de uno a tres fenilenos o cicloalquilenos C3-8insertados en el mismo;
G5 y Ga se seleccionan cada uno independientemente de entre un enlace directo, fenileno o cicloalquileno C3-8 Xc es mercapto, un atomo de halogeno o un grupo representado por la formula:
Yb es -CH2-(CHR5)i-2-CH2-NH-, -CH2-(CHRa)p-2-CH2-O-, -(CH2)j-S-, o -(CH2)a-(Yi-(CH2)b)c-G-; i, p y j son cada uno independientemente un numero entero seleccionado de entre 2 y i0, R5 y Ra son cada uno independientemente un atomo de hidrogeno o hidroxi; a es un numero entero seleccionado de entre 2 y i0;
cada b es independientemente un numero entero seleccionado de entre 2 y i0; c es un numero entero seleccionado de entre i y 200;
Yi es un atomo de oxfgeno o -NRn-;
G es un atomo de oxfgeno, un atomo de azufre o -NH-;
Rn es un atomo de hidrogeno, alquilo Ci-a, -CO-(CH2)d-R°, -(CH2)e-Rp o -(CH2)f(Y2-(CH2)g)h-Rq;
cada g es independientemente un numero entero seleccionado de entre 2 y i0;
d, e, f y h son cada uno independientemente un numero entero seleccionado de entre 2 y i0;
Ro, Rp y Rq se seleccionan cada uno independientemente de entre un atomo de hidrogeno, hidroxi, carboxi o - NHRr;
Y2 es un atomo de oxfgeno o -NH-; y
Rr es un atomo de hidrogeno, formilo o Ci-a alquilcarbonilo.
4. El derivado de acido hialuronico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones i a 3, que se prepara usando acido hialuronico compuesto exclusivamente por las unidades de disacarido representadas cada una por la Formula (II) como se expone en la reivindicacion 2, donde, cuando R , R , R , y R son todos atomos de hidrogeno, R8a es acetilo y Xa es -O'Na+, el peso molecular promedio en peso esta en el intervalo de 20-i20 kilodalton.
5. El derivado de acido hialuronico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones i a 4, donde un acido hialuronico no derivatizado correspondiente al derivado de acido hialuronico en terminos de la estructura principal tiene un peso molecular promedio en peso de 20-i20 kilodalton, donde el acido hialuronico no derivatizado es acido hialuronico compuesto exclusivamente por unidades de disacarido de formula (II) como se expone en la reivindicacion 2, donde Ria, R2a, R3a y R4a son atomos de hidrogeno, R8a es acetilo y Xa es -O'Na+.
a. Una composicion farmaceutica que comprende el derivado de acido hialuronico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones i a 5 como vehfculo.
7. Un conjugado de derivado de acido hialuronico/farmaco, donde uno o mas farmacos se conjugan con el derivado de acido hialuronico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Un vehfculo de farmaco biodegradable que comprende el derivado de acido hialuronico de acuerdo con una 5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
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