WO2010035825A1 - 改質乳の製造方法 - Google Patents

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WO2010035825A1
WO2010035825A1 PCT/JP2009/066754 JP2009066754W WO2010035825A1 WO 2010035825 A1 WO2010035825 A1 WO 2010035825A1 JP 2009066754 W JP2009066754 W JP 2009066754W WO 2010035825 A1 WO2010035825 A1 WO 2010035825A1
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典子 三輪
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味の素株式会社
天野エンザイム株式会社
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01044—Protein-glutamine glutaminase (3.5.1.44)

Definitions

  • the present invention is based on the priority claim of Japanese patent application: Japanese Patent Application No. 2008-250111 (filed on September 29, 2008), the entire contents of which are incorporated herein by reference. Shall.
  • the present invention relates to a method for producing modified milk by treating raw milk so as to improve the reactivity of protein deamidase, and a method for producing a dairy product using the modified milk.
  • Raw milk (milk that has been squeezed from cows) is not only consumed as milk, but it can also be used to produce ice cream, yogurt, cheese, milk powder, lactic acid bacteria beverages, etc.
  • the butter is made and processed into various dairy products to enrich our daily table.
  • enzymes are currently used in many fields. Advantages of using an enzyme include that it acts only on a specific substance under mild conditions and has little influence on taste. Utilizing the excellent properties of these enzymes, food development, modification and improvement of manufacturing processes are performed for various purposes.
  • protein deamidase has attracted attention as a new enzyme that imparts a rich and creamy texture to dairy products, such as when adding milk fat.
  • This enzyme is an enzyme that acts on a glutamine residue in a protein to catalyze a deamidation reaction, and is also referred to as protein glutaminase (hereinafter referred to as PG).
  • PG converts glutamine residues in proteins to glutamic acid residues, resulting in carboxyl groups, increasing protein negative charge, increasing electrostatic repulsion, decreasing isoelectric point, increasing hydration power, etc. happenss.
  • Non-patent Documents 1 and 2 and Patent Documents 1 to 4 various functional characteristics such as protein solubility, increased water dispersibility, emulsification power, and emulsification stability are improved.
  • PG having such characteristics for dairy products such as yogurt and cheese improves smooth texture (Patent Document 4), and even when PG reduces fat in dairy products. It is expected to give the milk a rich and creamy texture.
  • casein milk proteins contained in 3.0-3.5% of milk are roughly divided into casein and whey protein.
  • Casein accounts for about 80% and whey protein for about 20% of the total protein.
  • Casein is composed of four components, ⁇ s1-casein, ⁇ s2-casein, ⁇ -casein, and ⁇ -casein, and whey protein is composed of ⁇ -lactalbumin and ⁇ -lactoglobulin.
  • Non-Patent Document 1 describes that PG has high reactivity with ⁇ -, ⁇ -casein and is poor with ⁇ -lactalbumin and ⁇ -lactoglobulin.
  • Non-Patent Document 3 and Patent Document 3 describe that the reactivity of PG to ⁇ -lactalbumin is higher in the molten globule state, that is, in the intermediate state in the protein denaturation process than in the undenatured state. .
  • casein which accounts for the majority, rather than whey protein.
  • casein micelles having a diameter of 0.05 to 0.3 microns and an average of about 0.1 microns.
  • heat-sensitive whey protein is known to interact with casein micelles (particularly, ⁇ -casein covering the casein micelle surface) by heating (Non-patent Document 4).
  • Non-Patent Documents 1 and 3 and Patent Document 3 are all research results at the reagent level, and no mention is made of the reactivity of the whole milk as a raw material for dairy products.
  • the reactivity of PG in a complex milk system as in Non-Patent Document 4 is expected to be different from the reactivity of a single component of milk protein, but so far the PG reactivity in milk has been reported. It has not been.
  • Yamaguchi et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, p.3337-3343 (2000) Yamaguchi et al., Eur. J. Biochem 268 p.1410-1421 (2001) Matsumura et al., J. Agric. Food Chem. (2001), 49, p.5999-6005 Milk General Dictionary, edited by Kunio Yamauchi, Asakura Shoten, p. 60 G.A.H De Jong et al., Journal of Food Science Vol.68, Nr.3, (2003) p.820-825
  • Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Documents 1 to 5 described above are incorporated herein by reference.
  • the following analysis is given from the perspective of the present invention.
  • the present inventors have been developing the use of PG for dairy products.
  • the present inventors have found for the first time the problem of “low PG reactivity with raw milk having a low heating history”.
  • LTLT method low temperature sterilization method
  • UHT method ultra high temperature heat treatment method
  • the present inventors investigated the cause of why the PG reactivity of raw milk having a low heat history is low. As a result of the study, it has been clarified that there are PG inhibitors in raw milk with a low heat history, which is responsible for the low reactivity of PG. For this reason, it has become a problem to find a method for reducing and eliminating PG inhibitors present in raw milk.
  • Non-Patent Document 5 Non-Patent Document 5
  • PG is a novel enzyme that has recently been found and has little past knowledge, and since TG differs from TG in various characteristics such as origin, primary sequence of protein, molecular weight, structure, catalytic function, etc. It is thought that different inhibition mechanisms may contribute, and it is necessary to tackle this issue newly.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to reduce or remove a protein deamidase (PG) reaction inhibitor present in raw milk having a low heat history, thereby reducing the heat history.
  • An object of the present invention is to provide a method for obtaining dairy products having good physical properties and texture (particularly imparting a fat-like texture) by allowing PG to efficiently and effectively act on low raw material milk.
  • the present inventors have reacted PG with a low molecular fraction (molecular weight of 10,000 or less) of milk having a low heating history such as raw milk, LTLT pasteurized milk, and HTST pasteurized milk.
  • a low molecular fraction molecular weight of 10,000 or less
  • milk having a low heating history such as raw milk, LTLT pasteurized milk, and HTST pasteurized milk.
  • an inhibitor was present.
  • the PG reaction inhibitor is treated with heat (heats the raw milk so that the raw milk has a whey protein denaturation degree of 40 to 80%), calcium chelating agent addition treatment, alkali raw material addition treatment (raw milk with pH 7 To 8), reducing agent is removed or treated by removing low molecular fraction, and PG is efficiently and effectively applied even to raw milk with low heating history. I found that I can do it.
  • the present invention is as follows. (1) A process comprising a step of subjecting raw milk or raw milk made of LTLT pasteurized milk or HTST pasteurized milk to a treatment for reducing a protein deamidase inhibitor, and a step of allowing protein deamidase to act. A method for producing milk.
  • the treatment for reducing a protein deamidase inhibitor is a treatment in which 0.2 to 1.0 g of a calcium chelating agent per 100 g of raw material milk is added to the raw material milk.
  • the calcium chelating agent is sodium citrate, ⁇ -polyglutamic acid sodium salt or ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt.
  • the treatment for reducing a protein deamidase inhibitor is a treatment in which 0.01 to 0.5 g of an alkaline material per 100 g of raw material milk is added to the raw material milk.
  • the method according to (1), wherein the treatment for reducing an inhibitor of protein deamidase is a treatment for fractionating and removing a low molecular fraction having a molecular weight of 10,000 or less from raw material milk.
  • the treatment for fractionating and removing the low molecular fraction is performed by an ultrafiltration membrane.
  • a method for producing modified milk characterized by adding protein deamidase to raw milk consisting of raw milk, LTLT pasteurized milk or HTST pasteurized milk and allowing it to act at 60 to 65 ° C.
  • a method for producing a dairy product comprising using the modified milk obtained by the method according to any one of (1) to (10).
  • modified milk using protein deamidase can be obtained efficiently even with raw material milk having low heat history such as raw milk with low protein deamidase reactivity. Further, by using the modified milk as a raw material, a dairy product having a rich and creamy texture can be produced.
  • the method for producing modified milk according to the present invention is applied to raw milk, LTLT pasteurized milk, HTST pasteurized milk, and other raw milk with a low heat history, by subjecting the protein deamidase to action. It is something to be made.
  • the PG may be allowed to act, or while the PG inhibitory substance is being reduced, PG may be allowed to act, or PG inhibitory substances may be reduced while PG is acting.
  • the calcium chelating agent, alkali material, reducing agent and PG may be added to the raw milk at the same time. However, after one is added first, the other may be added.
  • Raw milk or LTLT pasteurized milk or HTST pasteurized milk used in the present invention is raw milk extracted from animals such as cattle and goats, milk obtained by LTLT pasteurization or HTST pasteurization, raw milk , Mixed skim milk, partially skim milk, or processed milk.
  • Raw milk is milk as it is extracted, so-called raw milk.
  • LTLT pasteurized milk is milk that has been sterilized by the low temperature retention sterilization method (LTLT method). Specifically, it is heat sterilized between 62 and 66 ° C for 30 minutes, or 75 ° C or more for 15 minutes or more. Heat-sterilized.
  • HTST sterilized milk has a sterilization effect substantially equivalent to that of the LTLT method, and is a sterilization method of maintaining at 72 to 75 ° C. for 15 seconds.
  • Nonfat milk refers to a product obtained by removing almost all of the fat from raw milk
  • partially skim milk refers to a product obtained by partially removing fat.
  • the treatment for reducing the inhibitor of protein deamidase of the present invention includes addition of a calcium chelating agent, addition of an alkaline material, addition of a reducing agent, fractionation / removal of a low molecular fraction, and enzyme reaction at 60 to 65 ° C. It is effective to do.
  • PG reactivity comparable to UHT milk can also be obtained by controlling the heating conditions so that the raw milk has a whey protein denaturation range of 40 to 75%.
  • the amount added is preferably 0.05 to 0.5 g per 100 g of raw material milk. It is preferable to add PG to the raw milk before or at the same time as adding PG to the raw milk. However, as long as PG is not deactivated, a calcium chelating agent may be added after the addition of PG.
  • the calcium chelating agent sodium citrate, ⁇ -polyglutamic acid sodium salt, and ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt are preferable. If these substances are not salts, the pH is lowered, the milk becomes unstable, and the reactivity tends to decrease.
  • the alkaline material of the present invention includes food additives such as potassium carbonate, sodium carbonate, trisodium phosphate, sodium bicarbonate, calcined calcium, and arginine.
  • the pH of the raw milk is adjusted to 7-8. Therefore, the addition amount may be appropriately adjusted depending on the alkali material to be used, but may be 0.01 to 0.5 g per 100 g of raw material milk. It is preferable to add PG to the raw milk before or at the same time as adding PG to the raw milk. However, as long as PG is not deactivated, an alkaline raw material may be added after the addition of PG.
  • the pH of the raw milk can be adjusted to 7 to 8 using a direct sodium hydroxide solution. After the enzymatic reaction, the pH may be maintained as it is, but may be restored with an acid.
  • examples of the reducing agent of the present invention include thiol compounds, that is, glutathione, cysteine, ⁇ -glutamylcysteine, and yeast extract containing these in a high concentration, and contain these. This includes formulations.
  • the addition amount of the reducing agent is applied in the range of 0.0001 to 0.1 g per 100 g of raw material milk.
  • a yeast extract containing a reducing agent at a high concentration is used, a yeast extract containing 0.0001 to 0.1 g of a reducing substance per 100 g of raw material milk may be added to the raw material milk.
  • the addition amount is less than the range shown here, it is difficult to obtain the effect, and conversely, if the addition amount of the reducing agent is increased, the taste is adversely affected.
  • the reactivity improvement effect is constant.
  • the reducing agent When the reducing agent is added to the raw material milk, it may be added to the raw material milk in advance, or as long as PG is not deactivated, the reducing agent may be added after adding PG. It is desirable to add the reducing agent simultaneously with PG. Considering the effectiveness of the reducing agent, if the reducing agent is incubated in the raw material milk for a long time, the original reducing power is reduced.
  • ion exchange, electrodialysis, ultrafiltration (UF), reverse osmosis which are industrially used in the milk industry
  • UF ultrafiltration
  • reverse osmosis which are industrially used in the milk industry
  • the method is preferred.
  • a low molecular fraction removal method using a UF membrane that can permeate water and low molecular solutes as a solvent and retain high molecular solutes such as proteins is desirable.
  • a dialysis membrane can also be used at the laboratory level.
  • the type of protein deamidase in the present invention is not particularly limited as long as it directly acts on the amide group of the protein and has a deamidating action without peptide bond cleavage and protein cross-linking.
  • Examples of such enzymes include chryseobacteria disclosed in JP2000-50887A (Patent Document 1), JP2001-21850A (Patent Document 2), and WO2006 / 075752 (Patent Document 4).
  • Patent Document 1 JP2000-50887A
  • Patent Document 2 JP2001-21850A
  • Patent Document 4 WO2006 / 075752
  • protein deamidase derived from the genus Aum Flavobacterium or Empedobacter
  • commercially available protein glutaminase derived from the genus Chryseobacterium it is not particularly limited thereto.
  • an enzyme derived from the genus Chryseobacterium is selected.
  • transglutaminase When transglutaminase is allowed to act on food ingredients, protein cross-linking reaction takes place preferentially and deamidation reaction hardly occurs. Therefore, the protein deamidase of the present invention does not contain transglutaminase.
  • the protein deamidase one prepared from a culture solution of a microorganism producing protein deamidase can be used.
  • known protein separation and purification methods centrifugation, UF concentration, salting out
  • Various chromatographies using an ion exchange resin or the like are available.
  • the target enzyme can be obtained by centrifuging the culture solution to remove the cells, and then combining salting out, chromatography and the like.
  • the microbial cell is crushed by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc., and then separated and purified in the same manner as described above to obtain the target enzyme.
  • the enzyme may be pulverized by a drying method such as lyophilization or reduced pressure drying, and an appropriate excipient or drying aid may be used at that time.
  • the activity of the protein deamidase of the present invention is measured by the following method. (1) After adding 100 ⁇ l of an aqueous solution containing protein deamidase to 1 ml of 0.2 M phosphate buffer (pH 6.5) containing 30 mM Z-Gln-Gly (Peptide Institute), and incubating at 37 ° C. for 10 minutes Stop the reaction by adding 1 ml of 0.4 M TCA solution. (2) For the reaction solution of (1), ammonia is quantified using an ammonia test-Wako- (manufactured and sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). (3) As a blank, after incubation at 37 ° C.
  • the enzyme preparation concentration is diluted with a phosphate buffer (pH 6.5) so that the absorbance value at 630 nm falls within the range of ⁇ 0.2 to 0.8.
  • the activity is defined as 1 unit (U) for the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of ammonia per minute. The enzyme activity is calculated from the following formula.
  • the amount of PG added is preferably 0.01 to 100 U, more preferably 0.1 to 20 U, per gram of milk protein in the raw milk. If it is 0.1 U or less, it is difficult to obtain the expected effect, and if it is 20 U or more, it is difficult to obtain an economic merit.
  • the reaction temperature is generally about 0 ° C. to 65 ° C., and the reaction time can be about 1 minute to about 40 hours. However, the reaction is preferably carried out at about 5 ° C. to 65 ° C. for about 5 minutes to about 20 hours.
  • the degree of deamidation of milk protein by PG can be adjusted according to the reaction conditions such as the amount of PG added, the reaction time, the reaction temperature, etc., depending on the required physical properties of the dairy product.
  • a means for examining the degree of deamidation of milk protein is measurement of the amount of ammonia generated by the deamidation reaction.
  • the reaction is stopped by heat sterilization conditions usually used in the production of dairy products, and is not particularly limited. Of course, the effect of the present invention can be obtained without adopting such a heat sterilization step.
  • the modified raw milk thus obtained is also included in the dairy product obtained by the production method of the present invention.
  • dairy products produced according to the present invention that is, having a rich and creamy texture, prepared after subjecting raw milk with improved low reactivity of PG of milk with low heat history to PG treatment
  • dairy products include yogurt, cheese, ice cream, concentrated milk, defatted concentrated milk, whole milk powder, defatted milk powder, total milk protein, whey powder, lactic acid bacteria beverage, and milk beverage.
  • processed foods to which auxiliary materials such as salt, sugar, sweeteners, flavors, seasonings and the like are added, such as white sauce, are also included in the present invention.
  • LTLT pasteurized milk (66 ° C., 30 minutes: Takanashi pasteurized milk) and UHT pasteurized milk (130 ° C., 2 seconds: coconut milk dairy 3.6 milk)
  • Non-patent literature [Appl Microbiol Biotechnol (2008) 78: 67-74] ⁇ refined product prepared by the method described in Reference 1>: specific activity 120 U / mg-protein) added at 0 to 0.4 U / ml And reacted at 50 ° C. for 60 minutes.
  • LTLT milk was less reactive than UHT milk, and only the reaction amount of about 1/5 to 1/4 was obtained with the same enzyme amount.
  • PG purified product 50 U / ml described in Experimental Example 1 was diluted 100 times using the following solvents a to c. a: 20 mM phosphate buffer (pH 6.3), b: LTLT pasteurized milk (66 ° C., 30 minutes: Takanashi pasteurized milk), c: ultrafiltration permeate of ultracentrifugation supernatant (Amicon, Sentry) Prep YM-10; molecular weight 10,000 cut). Each was measured according to the PG activity measurement method using Z-Gln-Gly as a substrate described in paragraph [0030] of the present specification, and the results are shown in Table 1.
  • PG activity recovers when a low molecular fraction obtained by ultrafiltration of LTLT pasteurized milk is subjected to heat treatment or reducing agent addition treatment.
  • the purified product (0.5 U / ml) was diluted 100 times.
  • Table 2 The results of measuring PG activity as in Experimental Example 2 are shown in Table 2. It can be seen that the ultrafiltrate almost lost the PG activity, whereas the activity was significantly recovered by heat treatment and addition of a reducing agent.
  • LtLT pasteurized milk (66 ° C., 30 minutes: Takanashi pasteurized milk) was partially degreased by centrifugation (8,000 rpm, 1 hr, 10 ° C.). It was concentrated about 3 times using an ultrafiltration membrane (Sartorius, Hydrosart membrane, MW 10,000 cut).
  • the enzyme addition amount per milk protein was the same, and the PG reactivity was examined (reaction conditions were 50 ° C. and 1 hour).
  • the reactivity of the concentrated milk increased nearly three times.
  • the milk was dialyzed overnight at 4 ° C. with a cellulose dialysis membrane (molecular weight MW 8,000 cut)
  • the reactivity of PG further increased.
  • the present invention can produce a cheaper and higher quality dairy product by providing means for improving the PG reactivity of raw milk having a low heat history.
  • the fact that various means exemplified so far can be applied in an actual food system will be described by taking yogurt as an example.
  • LTLT pasteurized milk (66 ° C., 30 minutes: Takanashi pasteurized milk; milk protein 3.2%, milk fat content 3.7%)
  • PG purified product described in Experimental Example 1 at 1 U per gram of milk protein in raw milk
  • 0.4% of raw material milk 3Na citrate (food additive) was added, and the product temperature was kept at 50 ° C. for 1 hour. The temperature was raised to 95 ° C. and held for 1 minute for the purpose of stopping the reaction and sterilization, and then immediately cooled to 47 ° C.
  • lactic acid bacteria starter “Yo-Flex YC-370” (manufactured by Christian Hansen) is added to the raw material milk in an amount of 0.0063%, and after filling the container, the pH becomes 4.5 to 4.6 at 44 ° C. To make yogurt (product of the present invention). Similarly, a sample incubated for 1 hour at 50 ° C. (control product 1), a product obtained by adding 0.4% milk 3Na citrate and maintaining the product temperature at 50 ° C. for 1 hour (control product) 2) A sample prepared by adding PG at a rate of 3.5 U / g milk protein at 50 ° C. and incubating at 50 ° C. for 1 hour (control product 3) was also prepared for comparison.
  • the samples were stored under refrigeration (5 ° C.), and the physical properties (breaking area and adhesion) after one day were measured.
  • a texture analyzer (Stable
  • sensory evaluation was conducted by five trained panels. The results are shown in Table 5.
  • control group 2 As shown in the results of physical property measurement (FIG. 6), the PG single additive product (control group 2) is almost the same as the non-added product (control group 1), whereas the product 1 and the present invention.
  • product 2 a decrease in the fracture area and an increase in adhesion were clearly confirmed. This indicates that the physical properties of yogurt are soft and creamy, and the results agree with the sensory evaluation in Table 6.
  • glutathione yeast extract a higher PG effect than before can be obtained, and the effect can be adjusted by the addition amount.
  • LTLT pasteurized milk (66 ° C., 30 minutes: Takanashi pasteurized milk; milk protein 3.2%, milk fat content 3.7%) is limited to those that have been partially defatted by centrifugation (8,000 rpm, 1 hr, 10 ° C.)
  • an outer filtration membrane (Sartorius, Hydrosart membrane, MW 10,000 cut)
  • the solution was concentrated 4 times to obtain concentrated milk with viscosity.
  • the PG refined product described in Experimental Example 1 was added at a rate of 8 U per gram of milk protein and reacted at 50 ° C. for 60 minutes, the milk solidified and a very thick and smooth cheese-like food product was obtained.
  • PG can be made to act effectively on the concentrated milk obtained by desalting and concentration, and a cheese-like dairy product having a smooth texture can be produced.
  • the texture was also very smooth, and it was preferable that the milk flavor could be felt more.
  • the quality of pudding varies depending on the type of milk used, and pudding made with pasteurized milk is particularly popular because it allows you to enjoy the natural taste without sacrificing the flavor of raw milk. According to the present invention, it was confirmed that by setting the PG reaction temperature of LTLT milk to 65 ° C., high reactivity of PG can be ensured and a savory and smooth texture pudding can be produced.
  • the milk after milking was subjected to a degreasing treatment by applying it to a separator under 40 ° C. heating conditions. Subsequently, high temperature short time (HTST) sterilization (75 ° C., 15 seconds) was performed using a plate sterilizer to obtain sterilized skim milk.
  • HTST high temperature short time
  • the skim milk is pre-incubated at 55 ° C., and glutathione-containing yeast extract (Kohjin, Alo-Mild UG8) is added to 0.02% (w / v) of milk and PG (Amano Enzyme Protein Glutaminase) is added to 1 g of milk protein.
  • u / gp Per unit, 1.5, 4.5, and 15 units (hereinafter, units are expressed as u / gp) were added and allowed to react for 1 hour. In order to deactivate the enzyme, it was heated to 80 ° C. in a hot water bath (product of the present invention). As a control, a glutathione-containing yeast extract was added in the same manner without adding 0.02% (w / v) of milk to PG but also with PG added at 1.5, 4.5, and 15 ⁇ u / gp (control product).
  • skim milk after HTST sterilization 75 ° C, 15 seconds was further heated (95 ° C reached), then PG was added at 1.5, 4.5, 15 u / gp, 55 ° C, What was made to react for 1 hour was prepared separately (comparative product).
  • the amount of ammonia produced by the reaction was measured for the control product, the product of the present invention, and the comparative product.
  • the amount of ammonia in the milk was 0.38, 0.38, and 0.34 mM for the control product, the product of the present invention, and the comparative product, respectively.
  • the skim milk of the present invention prepared in Example 10 was spray-dried and powdered.
  • a weakly acidic milk beverage was prepared according to the formulation shown in Table 9.
  • Water was weighed in a jug to dissolve skim milk powder and granulated sugar, and then a 10% solution of citric acid (anhydrous) was added dropwise with stirring at 3,000 rpm with TK Robotics (Special Machine Industries Co., Ltd.). Immediately after increasing the rotation speed, the mixture was stirred and dissolved at 8,000 rpm for 3 minutes. Dispense into heat-resistant PET bottles (500 ml) and heat-treat at 96 ° C.
  • the influence of the pH of the milk beverage on the precipitation preventing effect was examined. Based on Table 10, the amount of citric acid was adjusted so that the final pH was 5.0 to 5.6, and the final weight was adjusted with water so that the total pH was 100%. After the preparation, it was dispensed into heat-resistant PET bottles and heat-treated at 96 ° C. As a result, as shown in Table 11, the control beverage before heating was white dispersed at pH 5.55 and 5.63, but precipitation aggregation occurred upon heating.
  • the formation of precipitates was remarkably suppressed at pH 5.2 or higher regardless of the presence or absence of heat treatment.
  • the stability of the milk protein in the weakly acidic region is usually low.
  • the stability was remarkably improved in skim milk powder that had been subjected to PG treatment in advance as in the present invention. This result suggests that this technique is useful in producing coffee milk drinks and weakly acidic milk drinks containing fruits.
  • modified milk using protein deamidase can be efficiently obtained even with raw material milk having a low heat history such as raw milk with low protein deamidase reactivity. Further, by using the modified milk as a raw material, a dairy product having a rich and creamy texture can be produced. Therefore, the present invention is extremely useful in the food field.
  • the examples and the examples can be changed and adjusted based on the basic technical concept. Various combinations and selections of various disclosed elements are possible within the scope of the claims of the present invention. That is, the present invention of course includes various variations and modifications that could be made by those skilled in the art according to the entire disclosure including the claims and the technical idea.

Abstract

　熱履歴の低い原料乳に存在するタンパク質脱アミド酵素の反応阻害物質を低減、除去することにより、熱履歴の低い原料乳に対してより効率よく効果的にタンパク質脱アミド酵素を作用させ、濃厚でクリーミーな食感を有する乳製品を得る方法を提供する。熱履歴の低い原料乳に、カルシウムキレート剤添加処理等タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理を施した後、あるいは施しながら、タンパク質脱アミド酵素を作用させる。

Description

改質乳の製造方法
［関連出願の記載］
　本発明は、日本国特許出願：特願２００８－２５０１１１号（２００８年　９月２９日出願）の優先権主張に基づくものであり、同出願の全記載内容は引用をもって本書に組み込み記載されているものとする。
　本発明は、原料乳をタンパク質脱アミド酵素の反応性が向上するよう処理し、該酵素を作用させることによる改質乳の製造方法並びに該改質乳を用いる乳製品の製造方法に関する。
　生乳（牛から搾ったままの乳）は、牛乳として飲用されるだけでなく、牛乳を使ってアイスクリームやヨーグルト、チーズ、粉乳、乳酸菌飲料等が作られたり、生乳から分離されたクリームを使ってバターが作られたり、さまざま乳製品に加工され、我々の毎日の食卓を豊かに彩っている。
　これら乳製品の“おいしさ”を決定する大きな指標の一つに、乳脂肪由来の濃厚でクリーミーな食感の大きさが挙げられ、その食感は乳製品の脂肪含有量と密接な関係があると言われている。近年は、商品価値を決める要因として、その他にも“安価”、“低カロリー”といった、消費者の買い求め安さや健康への関心も高まりつつある。これら需要の拡大により、無脂肪、低脂肪といった乳脂肪含有量の少ない乳製品が多く開発されているが、その味は依然淡白で、水っぽく、乳風味に欠けるものであり、消費者にとって決して満足できるものではなかった。このため、乳脂肪含有量が低くても、或いは乳脂肪含有量を増加させることなく消費者の満足が得られるおいしい乳製品の開発が求められている。
　ところで、食品産業では、現在多くの分野で酵素が利用されている。酵素を利用する利点としては、温和な条件で特定の物質にのみ作用すること、また味への影響が少ないことが挙げられる。こうした酵素の優れた性質を利用して、食品の開発、改質や製造工程の改良がさまざまな目的で行われている。
　とりわけ、乳脂肪を加えたときのような、濃厚でクリーミーな食感を乳製品に付与する新しい酵素として、タンパク質脱アミド酵素が注目されている。本酵素は、タンパク質中のグルタミン残基に作用し脱アミド化反応を触媒する酵素であり、プロテイングルタミナーゼ（以下、ＰＧ）とも称される。ＰＧにより、タンパク質中のグルタミン残基はグルタミン酸残基に変換され、カルボキシル基が生じることから、タンパク質の負電荷の増加、静電反発力の上昇、等電点の低下、水和力の増加等が起こる。その結果、タンパク質の溶解性、水分散性の増加、乳化力、乳化安定性の向上など様々な機能特性の向上をもたらすことが知られている（非特許文献１、２、特許文献１～４）。このような特徴を有するＰＧをヨーグルトやチーズ等の乳製品に用いると、滑らかな食感を向上させることが既にわかっており（特許文献４）、ＰＧが乳製品の脂肪を低減した場合においても乳本来の濃厚でクリーミーな食感を付与することが期待されている。
　ところで、牛乳に３．０～３．５％含まれている乳タンパク質は、カゼインとホエー（乳清）タンパク質の２つに大別される。全タンパク質に対して、カゼインは約８０％、ホエータンパク質は約２０％を占めている。カゼインは、αｓ１－カゼイン、αｓ２－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼインの４つの成分から構成され、ホエータンパク質は、α－ラクトアルブミンとβ－ラクトグロブリンから構成される。
　これまでに、これら乳タンパク質へのＰＧの作用に関しては、いくつか報告されている。非特許文献１では、α－、β－カゼインに対するＰＧの反応性は高く、α－ラクトアルブミンやα－ラクトグロブリンに対しては乏しいことが記されている。また、非特許文献３および特許文献３では、α－ラクトアルブミンに対するＰＧの反応性が、モルテングロビュール状態、すなわちタンパク質の変性過程での中間状態で、未変性状態に比べ高まることが記されている。
　牛乳に対するＰＧの反応性は、ホエータンパク質よりむしろ、大部分を占めるカゼインの反応性に依存すると言っても過言ではない。牛乳中では、大部分のカゼインは直径０．０５～０．３ミクロン、平均が約０．１ミクロンのカゼインミセルと呼ばれるコロイド粒子を形づくって分散している。それだけでなく、熱感受性の高いホエータンパク質はカゼインミセル（特にカゼインミセル表面を覆うκ－カゼイン）と加熱により相互作用することも知られている（非特許文献４）。
　しかしながら、非特許文献１、３および特許文献３の開示は、いずれも試薬レベルでの研究結果であり、乳製品の原料となる牛乳全体の反応性については言及されていない。また、非特許文献４のように複雑な牛乳の系におけるＰＧの反応性は、乳タンパク質の単一成分の反応性とは異なることが予想されるが、これまで牛乳におけるＰＧの反応性について報告されていない。
特開２０００－５０８８７号公報 特開２００１－２１８５９０号公報 ＷＯ２００２／０６８６７１ ＷＯ２００６／０７５７７２
Yamaguchi et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, p.3337-3343 (2000) Yamaguchi et al., Eur. J. Biochem 268  p.1410-1421 (2001) Matsumura et al., J. Agric. Food Chem. (2001), 49, p.5999-6005 ミルク総合事典　山内邦男編集　朝倉書店，ｐ．６０ G.A.H De Jong et al., Journal of Food Science Vol.68, Nr.3, (2003) p.820-825
　以上の特許文献１～４及び非特許文献１～５の全開示内容は、本書に引用をもって繰り込み記載されているものとする。
　以下の分析は、本発明の観点から与えられる。
　以上のような背景のもと、本発明者らはＰＧの乳製品への利用開発を進めていた。その中で、本発明者らは、「加熱履歴の低い原料乳に対するＰＧの反応性が低い」という課題を初めて見出した。例えば、低温保持式殺菌法（ＬＴＬＴ法）で殺菌された牛乳（以下、ＬＴＬＴ牛乳）と超高温加熱処理法（ＵＨＴ法）で殺菌された牛乳（以下、ＵＨＴ牛乳）と比べると、同じ酵素添加量で前者は後者の約２～３割程度の反応量しか認められないことを見出した。つまり、ＬＴＬＴ牛乳では、ＵＨＴ牛乳と同等の酵素処理の効果を得るためにより多くの酵素を必要とし、コストが高くなることが懸念される。
　このように、原料乳の加熱履歴によりＰＧの反応性が異なることは、乳製品への本酵素の利用機会を制限するものであり、乳製品加工業者にとって使いやすい技術とは言い難い。なぜなら、風味や物性の観点から、乳製品全ての原料乳をＵＨＴ方式で殺菌できるとは限らないからである。
　そこで本発明者らは、熱履歴の低い原料乳のＰＧ反応性が何故低いのか、原因の究明を行った。その研究の結果、熱履歴の低い原料乳中にはＰＧの阻害物質が存在し、それがＰＧの低反応性の原因であることが明らかとなった。このことから、原料乳中に存在するＰＧの阻害物質を減少、消失させる方法を見出すことが課題となった。
　これまでに、タンパク質架橋酵素であるトランスグルタミナーゼの阻害物質が牛乳中に存在することは知られていた（非特許文献５）が、ＰＧの阻害物質が存在することは知られていなかった。しかも、ＰＧは最近見出された新規な酵素であり、過去の知見が少ないこと、またＴＧとは起源、タンパク質の一次配列、分子量、構造、触媒機能等の種々特性が異なることから、ＴＧとは異なる阻害機構が寄与することが考えられ、新たに本課題に取り組む必要が生じた。
　本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであり、その目的は、熱履歴の低い原料乳に存在するタンパク質脱アミド酵素（ＰＧ）の反応阻害物質を低減または除去することにより、熱履歴の低い原料乳に対してより効率よく効果的にＰＧを作用させ、物性、食感（特に脂肪様の食感付与）の良好な乳製品を得る方法を提供することである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、生乳、ＬＴＬＴ殺菌乳、ＨＴＳＴ殺菌乳といった加熱履歴の低い乳の低分子画分（分子量１万以下）にＰＧの反応阻害物質が存在することを見出した。さらに、ＰＧの反応阻害物質が、加熱処理（原料乳のホエータンパク質変性度が４０～８０％となるように原料乳を加熱する）、カルシウムキレート剤添加処理、アルカリ素材添加処理（原料乳をｐＨ７～８に調整する）、還元剤添加処理、あるいは低分子画分を除去する処理を施すことにより、低減または除去され、加熱履歴の低い原料乳であっても効率よく効果的にＰＧを作用させることができることを見出した。さらに、加熱履歴の低い乳にＰＧを添加し６０～６５℃で作用させれば、効率よく効果的にＰＧを作用させることができることを見出した。そして、上記の方法により得られたＰＧ改質乳を原料として用いることにより、物性、食感（特に脂肪様の食感付与）の良好な乳製品を得ることができることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）生乳又はＬＴＬＴ殺菌乳又はＨＴＳＴ殺菌乳より成る原料乳に、タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理を施す工程と、タンパク質脱アミド酵素を作用させる工程と含むことを特徴とする改質乳の製造方法。
（２）タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理が、原料乳１００ｇ当たり０．２～１．０ｇのカルシウムキレート剤を原料乳に添加する処理である（１）記載の方法。
（３）カルシウムキレート剤が、クエン酸ナトリウム塩、γ－ポリグルタミン酸ナトリウム塩又はエチレンジアミン四酢酸４ナトリウム塩である（２）記載の方法。
（４）タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理が、原料乳１００ｇ当たり０．０１～０．５ｇのアルカリ素材を原料乳に添加する処理である（１）記載の方法。
（５）アルカリ素材が、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸３ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、焼成カルシウム又はアルギニンである（４）記載の方法。
（６）タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理が、原料乳１００ｇ当たり０．０００１～０．１ｇの還元物質若しくは原料乳１００ｇ当たり０．０００１～０．１ｇの還元物質を含有する酵母エキスを原料乳に添加する処理である（１）記載の方法。
（７）還元物質が、グルタチオン、システイン又はγ－グルタミルシステインである（６）記載の方法。
（８）タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理が、原料乳より分子量１万以下の低分子画分を分画除去する処理である（１）記載の方法。
（９）低分子画分を分画除去する処理が限外ろ過膜によるものである（８）記載の方法。
（１０）生乳又はＬＴＬＴ殺菌乳又はＨＴＳＴ殺菌乳より成る原料乳に、タンパク質脱アミド酵素を添加し、６０～６５℃で作用させることを特徴とする改質乳の製造方法。
（１１）（１）乃至（１０）の何れかに記載の方法で得られた改質乳を用いることを特徴とする乳製品の製造方法。
（１２）乳製品がヨーグルト又はチーズ様食品又はプリン又は乳飲料である（１１）記載の方法。
　本発明によれば、タンパク質脱アミド酵素の反応性が低い、生乳等の熱履歴の低い原料乳であっても、効率よく、タンパク質脱アミド酵素による改質乳を得ることができる。また、該改質乳を原料として用いることで、濃厚でクリーミーな食感を有する乳製品を製造することができる。
ＬＴＬＴ牛乳とＵＨＴ牛乳へのＰＧの反応性を示す図である。（実験例１） 還元剤添加牛乳へのＰＧの反応性を示す図である。（実施例３） グルタチオン酵母エキス添加牛乳へのＰＧの反応性を示す図である。（実施例３） 低分子画分除去牛乳へのＰＧの反応性を示す図である。（実施例４） ＰＧ反応温度とＰＧの反応性を示す図である。（実施例５） ヨーグルトの物性測定結果である。（実施例６）
　以下に、本発明を詳細に説明する。本発明の改質乳の製造方法は、生乳、ＬＴＬＴ殺菌乳、ＨＴＳＴ殺菌乳等の熱履歴の低い原料乳に、タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理を施し、タンパク質脱アミド酵素を作用させるものである。PG阻害物質の低減処理を施す工程とPGを作用させる工程の順序については、PG阻害物質の低減処理を施した後、PGを作用させてもよいし、PG阻害物質の低減処理を施しながら、PGを作用させてもよいし、PGを作用させながら、PG阻害物質の低減処理を施してもよい。例えば、カルシウムキレート剤の添加、アルカリ素材の添加、還元剤の添加によって、PG阻害物質の低減処理を施す場合、カルシウムキレート剤、アルカリ素材、還元剤とPGを同時に原料乳に添加してもよいし、一方を先に添加した後、他方を添加してもよい。
　本発明に使用される生乳又はＬＴＬＴ殺菌乳又はＨＴＳＴ殺菌乳より成る原料乳は、牛、山羊等の動物から搾乳された未加工の生乳、生乳をＬＴＬＴ殺菌又はＨＴＳＴ殺菌して得られる乳、それらを混合した乳、それらの脱脂乳、部分脱脂乳、或いはそれらを加工処理した乳のことをいう。生乳とは、搾取したままの乳、いわゆる未加工乳である。ＬＴＬＴ殺菌乳とは低温時保持式殺菌法（ＬＴＬＴ法）により殺菌された牛乳であり、具体的には６２～６６℃までの間で３０分間加熱殺菌するか、あるいは７５℃以上で１５分間以上加熱殺菌されたものである。ＨＴＳＴ殺菌乳とは、ＬＴＬＴ法とほぼ同等の殺菌効果を有するものであり、７２～７５℃で１５秒保持する殺菌方法である。脱脂乳は、生乳から脂肪分をほとんどすべて除去したもの、部分脱脂乳は部分的に除去したものをいう。
　本発明のタンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理として、カルシウムキレート剤の添加、アルカリ素材の添加、還元剤の添加、低分子画分の分画・除去、酵素反応を６０～６５℃にすることが有効である。尚、原料乳をホエータンパク質変性度が、４０～７５％の範囲になるように加熱条件を制御することによってもＵＨＴ牛乳並みのＰＧ反応性を獲得することができる。
　カルシウムキレート剤を添加する場合、その添加量は原料乳１００ｇ当たり０．０５～０．５ｇが好ましい。添加の時期はＰＧを原料乳に添加する前、あるいはＰＧと同時に原料乳に添加するのが好ましいが、PGが失活しない限り、PGを添加後、カルシウムキレート剤を添加してもよい。カルシウムキレート剤をとしては、クエン酸ナトリウム塩、γ－ポリグルタミン酸ナトリウム塩、エチレンジアミン四酢酸４ナトリウム塩が好ましい。これら物質は、塩でないと、ｐＨが低下し、乳が不安定になり、反応性は逆に低下してしまう傾向にあるため、塩であることが望ましい。
　アルカリ素材を添加する場合、本発明のアルカリ素材には、食品添加物である炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸３ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、焼成カルシウム、アルギニンが含まれる。これらアルカリ素材を添加することにより、原料乳のｐＨ７～８になるよう調整する。したがって、用いるアルカリ素材により添加量は適宜調節すればよいが、原料乳１００ｇ当たり０．０１～０．５ｇとすればよい。添加の時期はＰＧを原料乳に添加する前、あるいはＰＧと同時に原料乳に添加するのが好ましいが、PGが失活しない限り、PGを添加後、アルカリ素材を添加してもよい。或いは、直接水酸化ナトリウム溶液を用いて、原料乳のｐＨを７～８に調節することも可能である。酵素反応の後は、ｐＨはそのままでもよいが、酸により元に戻してもよい。
　還元剤を添加する場合、本発明の還元剤としては、チオール系化合物、すなわち、グルタチオン、システイン、γ－グルタミルシステイン、さらに、これらを高濃度で含む酵母エキスが挙げられ、これらを含有してなる製剤もこれに含まれる。還元剤の添加量は原料乳１００ｇ当たり０．０００１～０．１ｇの範囲で適用される。還元剤を高濃度で含む酵母エキスを用いる場合は原料乳１００ｇ当たり０．０００１～０．１ｇの還元物質を含有する酵母エキスを原料乳に添加すればよい。添加量は、ここで示す範囲より少ないと効果が得られにくく、逆に、還元剤の添加量を多くすると食味へ悪影響を及ぼしたり、種類にもよるが、ある一定以上添加量を増やしても反応性向上効果は一定となる。原料乳に還元剤を添加する時期は、あらかじめ原料乳に添加しておくのもよいし、PGが失活しない限り、PGを添加後、還元剤を添加してもよいが、実用面では、還元剤をＰＧと同時に添加するのが望ましい。また還元剤の効力を考えても、原料乳中で還元剤を長時間インキュベートすると本来の還元力が低下するため、なるべく酵素と同時がよい。
　原料乳の低分子画分を分画除去する場合、乳業界で工業的に使用されている低分子画分除去法であるイオン交換、電気透析、限外ろ過（Ｕｌｔｒａ  Ｆｉｌｔｒａｔｅ：ＵＦ）、逆浸透法等が好ましい。特に、溶媒である水および低分子溶質を透過させ、タンパク質などの高分子溶質を保持することができる、ＵＦ膜による低分子画分除去法が望ましい。例えば、分子量１～２万のＵＦ膜で低分子画分を除去するのが、効率がよい。なお、実験室レベルでは透析膜を用いることもできる。
　原料乳の反応性を向上させる方法として、添加物、分画によらない方法も見出している。反応温度の工夫である。ＰＧの至適温度は、非特許文献２に記されているように、５０～６０℃付近にあるが、安定性は５０℃を過ぎたあたりから急激に低下する。本発明では、その安定性の低下が急激に起こり始める６０～６５℃で反応させることで、低熱履歴の原料乳とＵＨＴ牛乳の反応性の差が小さくなることを明らかとした。そのため、反応は長時間行う必要がなく、５分～６０分程度の短い時間で酵素反応を終えることができる。
　本発明におけるタンパク質脱アミド酵素は、タンパク質のアミド基に直接作用してペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する限りにおいてその種類は特に限定されるものではない。この様な酵素の例として、特開２０００-５０８８７号公報（特許文献１）、特開２００１－２１８５０号公報（特許文献２）、ＷＯ２００６／０７５７７２（特許文献４）に開示された、クリセオバクテリウム属、フラボバクテリウム属又はエンペドバクター属由来のタンパク質脱アミド酵素、市販されているクリセオバクテリウム属由来のプロテイングルタミナーゼ等があるが、これらに特に限定されるものではない。好ましくはクリセオバクテリウム属由来の酵素が選択される。尚、トランスグルタミナーゼは食品原料に作用させる場合、タンパク質の架橋反応が優先的に起こり、脱アミド反応はほとんど起こらないため、本発明のタンパク質脱アミド酵素にはトランスグルタミナーゼは含まれない。
　タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質脱アミド酵素を産生する微生物の培養液より調製したものを用いることができるが、その調製方法については、公知のタンパク質分離、精製方法（遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー等）を用いることができる。例えば、培養液を遠心分離して菌体を除去し、その後塩析、クロマトグラフィー等を組み合わせて目的の酵素を得ることができる。菌体内から酵素を回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。酵素は凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化してもよいし、その際に適当な賦形剤、乾燥助剤を用いてもよい。
　本発明のタンパク質脱アミド酵素の活性は、下記の方法で測定する。
（１）３０ｍＭ  Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ（ペプチド研究所）を含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１ｍｌにタンパク質脱アミド酵素を含む水溶液１００μｌを添加して、３７℃、１０分間インキュベートした後、０．４Ｍ  ＴＣＡ溶液１ｍｌを加えて反応を停止させる。
（２）（１）の反応液についてアンモニアテスト－ワコー－（和光純薬工業株式会社製造販売）を用いてアンモニアの定量を行う。
（３）ブランクとして、酵素を添加せずに、３７℃、１０分間インキュベートした後、０．４Ｍ  ＴＣＡ溶液１ｍｌを加え、それからタンパク質脱アミド酵素を含む水溶液１００μｌを添加したものも同時に行う。
（４）酵素の調製濃度は、６３０ｎｍの吸光度値がΔ０．２～０．８の範囲に入るようにリン酸バッファー（ｐＨ６．５）を用いて希釈する。
（５）活性は、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。酵素活性は以下の式から算出される。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ｅｓ－Ｅｂ）＊Ｆ＊０．１２３×Ｄｆ
Ｅｓ：酵素反応液の吸光度値
Ｅｂ：ブランクの吸光度値
Ｆ：ファクター（アンモニア標準液の検量線を作成したときの直線の傾きの逆数）
Ｄｆ：酵素溶液の希釈率
　本発明においてＰＧの添加量は、原料乳中の乳タンパク質１ｇ当たり０．０１～１００Ｕが好ましく、０．１～２０Ｕがより好ましい。０．１Ｕ以下では期待する効果が得にくく、２０Ｕ以上では経済的メリットが得難くなる。反応温度は一般に、０℃～６５℃程度であり、反応時間は約１分～約４０時間程度とすることができる。しかし、好ましくは５℃～６５℃程度で約５分～約２０時間程度で反応させるのがよい。
　ＰＧによる乳タンパク質の脱アミド化度、すなわち乳の改質度合いは、求められる乳製品の物性に応じて適宜、ＰＧの添加量や反応時間、反応温度などの反応条件により調節することができる。乳タンパク質の脱アミド化度を調べる手段は、脱アミド反応により生じるアンモニアの発生量の測定がある。反応の停止は、通常、乳製品の製造において用いられる加熱殺菌条件が適用され、特に限定すべきものではない。勿論、このような加熱殺菌工程を採用しなくても、本発明の効果を得ることができる。このようにして得られる改質された原料乳も、本発明の製造方法により得られる乳製品に含まれる。他にも本発明により製造される乳製品、すなわち、熱履歴の低い牛乳のＰＧの低反応性が改善された原料乳にＰＧ処理を施してから調製される、濃厚でクリーミーな食感を有する乳製品としては、ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、濃縮乳、脱脂濃縮乳、全粉乳、脱脂粉乳、トータルミルクプロテイン、ホエイパウダー、乳酸菌飲料、及び乳飲料等が挙げられる。さらに、食塩、砂糖、甘味料、香料、調味料等の副原料が添加された加工食品、たとえばホワイトソースのようなものも本発明に含まれる。
　以下に実験例、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。
実験例１
　ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳）およびＵＨＴ殺菌牛乳（１３０℃、２秒：まごころ酪農３．６牛乳）それぞれのＰＧに対する反応性の違いを確認するため、各牛乳にＰＧ（非特許文献〔Appl Microbiol Biotechnol (2008) 78: 67-74〕〈参考文献１〉記載の方法により調製された精製品：比活性１２０Ｕ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ）を  ０～０．４Ｕ／ｍｌを添加し、５０℃で、６０分反応させた。その結果、図１に示すようにＬＴＬＴ牛乳はＵＨＴ牛乳に比べると反応性が低く、同じ酵素量で１／５～１／４程度の反応量しか得られなかった。これは、次の実験例２～４に示すとおり、牛乳中の低分子画分に存在する阻害物質が原因であることが考えられ、本発明では、その阻害要因を取り除き、原料乳の反応性を向上させることを目的とする。なお、参考文献１の記載内容は、引用をもって本書に組み込まれる。
実験例２
　実験例１記載のＰＧ精製品（５０Ｕ／ｍｌ）を、次のａ～ｃの溶媒を用いて１００倍希釈した。ａ：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）、ｂ：ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳）、ｃ：ｂの超遠心分離上清の限外ろ過透過液（アミコン、セントリプレップＹＭ－１０；分子量１０，０００カット）。それぞれ、本明細書の段落［００３０］記載のＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを基質としたＰＧ活性測定法に従って測定し、その結果を表１に示した。ＰＧをリン酸緩衝液で希釈した場合、活性は０．５ｕ／ｍｌであったのに対し、ＬＴＬＴ殺菌牛乳で希釈した場合、活性は約１２％に低下した。ＬＴＬＴ殺菌牛乳の限外ろ過により得られた低分子画分で希釈したものでは、活性が完全に消失した。これは、ＬＴＬＴ殺菌牛乳の中、特にその低分子画分にＰＧの阻害物質が存在することを示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実験例３
　次に、ＬＴＬＴ殺菌牛乳の限外ろ過により得られた低分子画分を加熱処理或いは還元剤添加処理をするとＰＧ活性が回復する例を示す。限外ろ過液をヒートブロックで９０℃、５分間処理したもの、或いは還元剤として還元型グルタチオン１．０ｍＭ（原料乳１００ｇ当たり０．０３ｇに相当）を添加したもので、実験例２記載のＰＧ精製品（０．５Ｕ／ｍｌ）を１００倍希釈した。実験例２と同様に、ＰＧ活性を測定した結果を表２に示す。限外ろ過液がＰＧ活性をほぼ消失させたのに対し、加熱処理、還元剤添加により活性が大幅に回復したことがわかる。この結果は、基質がＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙでなく、牛乳中のカゼインミセル（超遠心分離（日立工機Ｈｉｍａｃ  ＣＰ８０ＷＸ、２８，６００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ、２５℃）により得られる沈殿ペレット）のときも、同様であった（データには示さず）。つまり、原料乳中の主要タンパク質であるカゼインミセルのＰＧ反応性は問題なく良好であり、溶媒にＰＧの低反応性の原因があることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　以降の実施例で、低温殺菌牛乳中の低分子画分に存在する阻害物質を消失、低減させることで低熱履歴牛乳のＰＧ反応性を向上させる手法を紹介するが、本発明は、これら実施例により何ら限定されるものではない。
　ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳）にカルシウムキレート素材を適宜添加した。各々の牛乳のＰＧ反応性を次のようにして調べた。各々の牛乳に対しＰＧ（実験例１記載の精製品）を０．４Ｕ／ｍｌ（乳タンパク質１ｇ当たり約１２ｕに相当）添加し、５０℃、６０分インキュベートした。反応液と等量の１２％ＴＣＡを添加することで酵素反応を停止し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５℃、５分間）により得られた上清中のアンモニアをアンモニア定量キット、Ｆ－ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）により測定した。その結果、表３に示すように無添加（対照）と比べて各種カルシウムキレート素材を添加したものはＰＧの反応性が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳）にアルカリ素材をｐＨが７～８．４になるように適宜添加した。各々の牛乳のＰＧ反応性を実施例１と同様にして調べた。その結果、表４に示すように無添加（対照）と比べて各種アルカリ素材を添加したものはｐＨ依存的にＰＧの反応性が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳）にチオール系還元剤として、グルタチオン又はシステイン（いずれも試薬、ナカライテスク）を適宜添加した。各々の牛乳のＰＧ反応性を実施例１と同様にして調べた。その結果、図２に示すようにどちらの物質も添加量依存的にＰＧの反応性が向上し、０．００１％の添加で８０～９０％程度の反応性が回復した。同様にして、グルタチオン酵母エキス（アロマイルドＵＧ８、興人社）についても濃度を変えて牛乳に添加し、ＰＧ反応性を調べた。その結果、図３に示すように０．０２％以上で７０％程度、０．０５％以上でほぼ１００％反応性が回復した。
　ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳）を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１ｈｒ、１０℃）により部分脱脂したものを調製した。それを限外ろ過膜（ザルトリウス、ハイドロザルト膜、ＭＷ１０，０００カット）を用いて約３倍に濃縮した。実験例１記載のＰＧ精製品を乳タンパク質当たりの酵素添加量を同じにし、ＰＧ反応性を調べた（反応条件は５０℃、１時間）。反応により生じたアンモニア量をタンパク質当たりに換算して反応性を比較したところ、濃縮後の牛乳は、図４のとおり、３倍近く反応性が増加した。また、セルロース透析膜（分子量ＭＷ８，０００カット）により、４℃で一晩牛乳を透析したところ、ＰＧの反応性は更に増加した。このように、牛乳中の低分子画分を除くことで反応性が向上することが示された。
　ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳）にＰＧを反応させるときの温度とＰＧ反応量の関係を調べたところ、図５に示すようにＵＨＴとは異なる挙動を示した。ＵＨＴ牛乳では５０～６０℃が最大の反応性を示す温度帯であり、６０℃を超えると直線的に反応性は低下した。一方、ＬＴＬＴ牛乳では、いずれの温度帯でもＵＨＴ牛乳と比べると反応性は低いものの、６０℃から６５℃にかけて反応性が急激に高まり、その温度帯においてはＵＨＴに対して８０～９０％程度反応性が回復することがわかった。
　本発明は、熱履歴の低い原料乳のＰＧ反応性を向上させる手段を提供することで、より安価で高品質の乳製品を製造することができる。これまで例示した各種手段が実際の食品の系で応用できることを、ヨーグルトを例に挙げて説明する。
　ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳；乳蛋白質３．２％、乳脂肪分３．７％）に実験例１記載のＰＧ精製品を原料乳中の乳タンパク質１ｇ当たり１Ｕの割合で加えると同時に、対原料乳０．４％のクエン酸３Ｎａ（食品添加物）を添加し、品温を５０℃に保って１時間反応させた。反応停止および殺菌の目的で９５℃に達温させて１分保持した後、直ちに４７℃まで冷却した。市販の乳酸菌スターター「Ｙｏ－Ｆｌｅｘ  ＹＣ－３７０」（クリスチャンハンセン社製）を対原料乳で０．００６３％添加し、容器に充填した後、４４℃でｐＨが４．５～４．６になるまで発酵させてヨーグルトを作成した（本発明品）。同様にして、５０℃で１時間インキュベートしただけのもの（対照品１）、対乳０．４％のクエン酸３Ｎａを添加し、品温を５０℃に保って１時間インキュベートしたもの（対照品２）、５０℃でＰＧを乳タンパク質１ｇ当たり  ３．５Ｕの割合で加えて５０℃で１時間インキュベートしたもの（対照品３）も比較のために作成した。いずれも発酵終了後は冷蔵下（５℃）で静置保存し、１日後の物性（破断面積および付着性）を測定した。用いたのは、テクスチャーアナライザー（Ｓｔａｂｌｅ  Ｍａｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＬＴＤ）で、測定の条件は、テスト速度１ｍｍ／ｓ、直径１０ｍｍの平板プランジャー、１０％圧縮で行った。また、訓練されたパネル５名による官能評価を行った。その結果を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳；乳蛋白質３．２％、乳脂肪分３．７％）に実験例１記載のＰＧ精製品を乳タンパク質１ｇ当たり１Ｕの割合で加えると同時に、アロマイルドＵＧ８（興人社、グルタチオン酵母エキス、以下ＹＥと略す）を対乳０．０１％、０．０２％添加（原料乳１００ｇに対するＧＳＨ含量はそれぞれ、約０．０００７ｇ、０．００１４ｇ）し、品温を５０℃に保って１時間攪拌し反応させた。反応停止および殺菌の目的で９５℃に達温させて１分保持した後、直ちに４７℃まで冷却した。市販の乳酸菌スターター「Ｙｏ－Ｆｌｅｘ  ＹＣ－３７０」（クリスチャンハンセン社製）を対乳原料で０．００６３％添加し、容器に充填した後、４４℃でｐＨが４．５～４．６になるまで発酵させてヨーグルトを作成した（本発明品１、２）。比較のために、ＰＧもＹＥも無添加（対照区１）、ＰＧのみ添加したもの（対照区２）について同様にヨーグルトを作成した。なお、ＹＥのみ０．０１％、０．０２％添加したものは、対照区１とほとんど変わらないことをこれまでに確認済みである。いずれも発酵終了後は冷蔵下（５℃）で静置保存し、１日後の物性（破断面積および付着性）を測定した。物性測定および官能評価の方法は実施例６記載の通りである。
　物性測定の結果（図６）に示すように、ＰＧ単独添加品（対照区２）は無添加品（対照区１）と比してほとんど差がないのに対し、本発明品１および本発明品２では、破断面積の減少および付着性の増加が明らかに確認できた。これは、ヨーグルトの物性がやわらかく、クリーミーになっていることを示しており、表６の官能評価と一致する結果となった。このように、グルタチオン酵母エキスを添加することで、今まで以上に高いＰＧの効果を得ることができ、その添加量により効果を調節できることも示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳；乳蛋白質３．２％、乳脂肪分３．７％）を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１ｈｒ、１０℃）により部分脱脂したものを限外ろ過膜（ザルトリウス、ハイドロザルト膜、ＭＷ１０，０００カット）を用いて４倍に濃縮し、粘度のついた濃縮乳を得た。そこに、実験例１記載のＰＧ精製品を乳タンパク質１ｇ当たり８Ｕの割合で加えて５０℃で６０分反応させたところ、凝乳し、とても濃厚でなめらかなチーズ様食品が得られた。比較としてＰＧを添加しないものも同様に実施したが、凝乳せず液状のままであった。このように脱塩濃縮により得られた濃縮乳に、効果的にＰＧを作用させることができ、滑らかな食感のチーズ様乳製品を製造することができる。
　ＬＴＬＴ殺菌牛乳（６６℃、３０分：タカナシ低温殺菌牛乳；乳蛋白質３．２％、乳脂肪分３．７％）に実験例１記載のＰＧ精製品を乳タンパク質１ｇあたり１０Ｕ加え、６５℃で６０分間反応させた。沸騰浴中で８５℃に達するまで加熱し、酵素を失活させた後、速やかに冷却して脱アミド処理牛乳を調製した（試験品ａ）。比較として、酵素を添加しない以外は同様に調製したもの（試験品ｂ）、そして同牛乳にＰＧ精製品を乳タンパク質１ｇあたり１０Ｕ添加して５０℃で６０分間反応させたもの（試験品ｃ）も同様に調製した。反応後の牛乳中のアンモニア濃度は、試験品ａが、１１．１ｍｍｏｌ／ｌ、試験品ｂは０．１２ｍｍｏｌ／ｌ、試験品ｃは、２．０５ｍｍｏｌ／ｌであった。
　卵１００ｇ（約２個分）と砂糖３０ｇを混ぜ攪拌したものに、４０℃程度に温めた試験品ａ～ｃ加えた。シノアで濾しながらアルミカップに分注し、蒸し器で１５分間中火加熱した。冷却し、１日冷蔵したものについて官能評価（ｎ＝３）を行った。表７に示すように、試験品ｂ、ｃの牛乳でつくったプリン（比較品１、２）に比べると、試験品ａの牛乳でつくったプリン（本発明品）は、卵の黄色が最も濃く出ており、スの入りが少ないなめらかな断面であった。食感も、とてもなめらかであり、乳風味をより感じることができる、好ましいものであった。プリンの品質は、使用する牛乳の種類によって異なり、特に低温殺菌牛乳を使って作るプリンは、生乳のもつ風味を損なうことなく自然なおいしさを堪能できることで人気が高い。本発明によれば、ＬＴＬＴ牛乳のＰＧ反応温度を６５℃に設定することによりＰＧの高い反応性を確保し、風味のよい、なめらかな食感のプリンを製造できることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　搾乳後の生乳を40℃加温条件下でセパレーターにかけ、脱脂処理を行った。続いて、プレート殺菌機による高温短時間（HTST）殺菌（75℃、15秒）処理を行い、殺菌された脱脂乳を得た。該脱脂乳を55℃でプレインキュベートし、グルタチオン含有酵母エキス（興人製、アロマイルドUG8）を対乳0.02％(w/v)添加するとともに、PG（天野エンザイム製プロテイングルタミナーゼ）を1g乳タンパク質あたり、1.5、4.5、15ユニット（以下、単位をu/gpと表記する）添加し、1時間反応させた。酵素失活のため、湯浴で80℃達温加熱を行った（本発明品）。対照として、グルタチオン含有酵母エキスを対乳0.02％(w/v)添加せずに、PGを1.5、4.5、15 u/gp添加したものも同様に調製した（対照品）。また比較として、HTST殺菌（75℃、15秒）した後の脱脂乳に更なる加熱処理（95℃達温）を施し、次いで、PGを1.5、4.5、15 u/gp添加し、55℃、1時間反応させたものを別途調製した（比較品）。対照品、本発明品、比較品について、反応により生じたアンモニア量を測定した。PG無添加の場合、牛乳中のアンモニア量は、対照品、本発明品、比較品それぞれ0.38、0.38、0.34mMであった。一方、PG添加の場合、表８に示すとおり、同じPG添加量では、対照品に比べて本発明品のアンモニア発生量は明らかに多く、その反応量は比較品とほぼ同等であった。本結果は、グルタチオン含有酵母エキスを対乳0.02％(w/v)を添加することで、付加的に加熱処理を施すことなく、PG反応性を高めることが可能なことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例１０で調製した本発明品の脱脂乳をスプレードライに供し、粉乳化した。この脱脂粉乳を用いて、表９記載の配合に従い、弱酸性乳飲料を調製した。水をジョッキに計量し、脱脂粉乳とグラニュー糖を溶解させた後、ＴＫロボミックス(特殊機化工業(株))で３,０００ｒｐｍの攪拌下、クエン酸（無水）10%溶液を滴下した。すぐに回転速度を上げ、８,０００ｒｐｍで3分攪拌溶解させた。耐熱性ペットボトル（500ml容）に分注し、96℃達温の加熱処理を行った。その後の沈殿の有無の様子を調べたところ、表１０ 記載の通り、PG未処理の脱脂粉乳を用いた飲料と、PG1.5 u/gp処理品については沈殿が生じたが、4.5u/gpおよび15u/gp処理品については、沈殿が顕著に抑制されており、分散状態を維持していた。また、最終pHが対照品で5.09であったのに対し、本発明品ではpHが5.2～5.3であり、クエン酸添加量は同じにもかかわらず溶解時のpHが未処理品に比べて0.2～0.3程度高く、本発明品は緩衝能の高い脱脂粉乳であることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　次に、対照品および本発明品２（PG15u/gp処理品）の脱脂粉乳を用い、乳飲料のpHが沈殿防止効果に及ぼす影響を調べた。表１０をもとに、最終pHが5.0～5.6になるようにクエン酸量を調節し、合計100%になるように水で最終重量を合わせた。調製後、耐熱性ペットボトルに分注し、96℃達温の加熱処理を行った。その結果、表１１に示すように、対照品の加熱前の飲料はpH5.55、5.63で白く分散していたが、加熱により沈殿凝集が生じた。一方、本発明品を使用した飲料では、加熱処理の有り無しに関わらず、pH5.2以上で沈殿の形成が顕著に抑制されていた。対照品の結果からわかるように、通常、弱酸性域における乳タンパク質の安定性は低い。しかし本発明品のように、PG処理を予めほどこした脱脂粉乳では安定性が著しく向上することが明らかになった。この結果は、コーヒー乳飲料や果実入りの弱酸性乳飲料など製造する際において役立つ技術であるであることを示唆している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　本発明によれば、タンパク質脱アミド酵素の反応性が低い、生乳等の熱履歴の低い原料乳であっても、効率よく、タンパク質脱アミド酵素による改質乳を得ることができる。また該改質乳を原料として用いることで、濃厚でクリーミーな食感を有する乳製品を製造することができる。よって、本発明は食品分野において極めて有用である。
　本発明の全開示（請求の範囲を含む）の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施例ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の請求の範囲の枠内において種々の開示要素の多様な組み合わせないし選択が可能である。すなわち、本発明は、請求の範囲を含む全開示、技術的思想にしたがって当業者であればなし得るであろう各種変形、修正を含むことは勿論である。

Claims (12)

  1. 　生乳又はＬＴＬＴ殺菌乳又はＨＴＳＴ殺菌乳より成る原料乳に、タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理を施す工程と、タンパク質脱アミド酵素を作用させる工程とを含むことを特徴とする改質乳の製造方法。
  2. 　タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理が、原料乳１００ｇ当たり０．２～１．０ｇのカルシウムキレート剤を原料乳に添加する処理である請求項１記載の方法。
  3. 　カルシウムキレート剤が、クエン酸ナトリウム塩、γ－ポリグルタミン酸ナトリウム塩又はエチレンジアミン四酢酸４ナトリウム塩である請求項２記載の方法。
  4. 　タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理が、原料乳１００ｇ当たり０．０１～０．５ｇのアルカリ素材を原料乳に添加する処理である請求項１記載の方法。
  5. 　アルカリ素材が、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸３ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、焼成カルシウム又はアルギニンである請求項４記載の方法。
  6. 　タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理が、原料乳１００ｇ当たり０．０００１～０．１ｇの還元物質若しくは原料乳１００ｇ当たり０．０００１～０．１ｇの還元物質を含有する酵母エキスを原料乳に添加する処理である請求項１記載の方法。
  7. 　還元物質が、グルタチオン、システイン又はγ－グルタミルシステインである請求項６記載の方法。
  8. 　タンパク質脱アミド酵素の阻害物質を低減させる処理が、原料乳より分子量１万以下の低分子画分を分画除去する処理である請求項１記載の方法。
  9. 　低分子画分を除去する処理が限外ろ過膜によるものである請求項８記載の方法。
  10. 　生乳又はＬＴＬＴ殺菌乳又はＨＴＳＴ殺菌乳より成る原料乳に、タンパク質脱アミド酵素を添加し、６０～６５℃で作用させることを特徴とする改質乳の製造方法。
  11. 　請求項１乃至１０の何れかに記載の方法で得られた改質乳を用いることを特徴とする乳製品の製造方法。
  12. 　乳製品がヨーグルト又はチーズ様食品又はプリン又は乳飲料である請求項１１記載の方法。
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