CN102164496B - 改性乳的制造方法 - Google Patents

Abstract

提供通过减少、除去热经历低的原料乳中存在的蛋白质脱酰胺酶的反应抑制物质，进一步效率良好且有效果地使蛋白质脱酰胺酶作用于热经历低的原料乳，得到具有浓厚且奶油般口感的乳制品的方法。实施钙螯合剂添加处理等减少蛋白质脱酰胺酶的抑制物质的处理后或者在实施的同时，使蛋白质脱酰胺酶作用于热经历低的原料乳。

Description

改性乳的制造方法

技术领域

[关联申请的记载]

本发明主张日本专利申请：日本特愿2008-250111号(2008年9月29日申请)的优先权，引用该申请的全部记载内容记载到本说明书中。

本发明涉及处理原料乳使蛋白质脱酰胺酶的反应性提高，并使该酶作用于原料乳而制造改性乳的方法以及使用该改性乳制造乳制品的方法。

背景技术

生奶(刚由牛挤出的奶)不仅被作为牛奶饮用，也使用牛奶制作冰淇淋、酸奶、奶酪、奶粉、乳酸菌饮料等，使用由生奶分离出的奶油制造黄油，或加工成各种乳制品，使我们每日的饮食丰富多彩。

决定这些乳制品的“可口程度”的重要指标之一可以举出源自乳脂的浓厚且奶油般口感的程度，该口感可以说与乳制品的脂肪含量密切相关。近年来，作为决定商品价值的要因，以及“低价格”、“低卡路里”之类消费者对购买便宜或健康的关心也不断提高。随着上述需求扩大，无脂肪、低脂肪的乳脂含量少的乳制品受到大量开发，但其味依然清淡似水，欠缺奶味，绝对无法满足消费者。因此，要求开发出即使乳脂含量低、或者不增加乳脂含量也能够满足消费者的可口的乳制品。

但是，食品产业目前在众多领域中利用酶。作为利用酶的优点，可以举出在温和的条件下仅作用于特定物质、另外对味道的影响小。为了各种目的，利用上述酶的优异性质，进行食品的开发、改进或制造工序的改良。

特别是作为对乳制品赋予加入乳脂时那样的浓厚且奶油般口感的新型的酶，蛋白质脱酰胺酶受到关注。该酶是作用于蛋白质中的谷氨酰胺残基、催化脱酰胺化反应的酶，也被称为蛋白质谷氨酰胺酶(以下，PG)。蛋白质中的谷氨酰胺残基被PG转化为谷氨酸残基，因为产生羧基，所以引起蛋白质的负电荷增加、静电斥力上升、等电点下降、水合力增加等。已知结果使得蛋白质的溶解性、水分散性增加、乳化力、乳化稳定性提高等各种功能特性提高(非专利文献1、2、专利文献1~4)。已知如果将具有上述特征的PG用于酸奶或奶酪等乳制品，则使润滑的口感提高 (专利文献4)，期待即使在PG将乳制品的脂肪减少时也赋予奶本来的浓厚且奶油般的口感。

但是，牛奶中包含的3.0~3.5%的乳蛋白质大致分为酪蛋白和乳清(whey)蛋白质2种。相对于总蛋白质，酪蛋白占约80%，乳清蛋白质占约20%。酪蛋白由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白4种成分构成，乳清蛋白质由α-乳白蛋白和β-乳球蛋白构成。

迄今为止，有若干关于PG对上述乳蛋白质的作用的报告。非专利文献1中，记载了PG对α-、β-酪蛋白的反应性高、对α-乳白蛋白或α-乳球蛋白欠缺反应性的内容。另外，非专利文献3及专利文献3中，记载了与未变性状态相比，PG对α-乳白蛋白的反应性在熔球状态、即蛋白质的变性过程中的中间状态下更高。

PG对牛奶的反应性与其说依赖于乳清蛋白质，倒不如说依赖于占大部分的酪蛋白的反应性。牛奶中，大部分的酪蛋白形成直径0.05~0.3微米、平均约0.1微米的称为酪蛋白胶束的胶体粒子而分散。不仅如此，还已知热敏性高的乳清蛋白质与酪蛋白胶束(特别是覆盖酪蛋白胶束表面的κ-酪蛋白)通过加热而相互作用(非专利文献4)。

但是，非专利文献1、3及专利文献3的公开均是试剂水平的研究结果，并未提及作为乳制品原料的牛奶整体的反应性。另外，如非专利文献4所述，推测复杂的牛奶体系中的PG的反应性与乳蛋白质的单一成分的反应性不同，但迄今并没有针对牛奶中的PG的反应性的报道。

现有技术文献 

专利文献 

专利文献1：日本特开2000-50887号公报

专利文献2：日本特开2001-218590号公报

专利文献3：WO2002/068671

专利文献4：WO2006/075772

非专利文献 

非专利文献1：Yamaguchi et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, p.3337-3343 (2000)

非专利文献2：Yamaguchi et al., Eur. J. Biochem 268 p.1410-1421 (2001)

非专利文献3：Matsumura et al., J. Agric. Food Chem. (2001), 49, p.5999-6005

非专利文献4：ミルク総合事典　山内邦男編集　朝倉書店, p.60

非专利文献5：G.A.H De Jong et al., Journal of Food Science Vol.68, Nr.3, (2003) p.820-825。

发明内容

发明所要解决的课题 

以上的专利文献1~4及非专利文献1~5的全部公开内容通过引用并入记载于本说明书中。

基于本发明的观点提供以下分析。

基于以上所述背景，本发明人等进行PG对乳制品的利用开发。开发过程中，本发明人等首次发现“PG对加热经历低的原料乳的反应性低”的课题。例如如果将通过低温保持式杀菌法(LTLT法)杀菌的牛奶(以下称为LTLT牛奶)和通过超高温加热处理法(UHT法)杀菌的牛奶(以下称为UHT牛奶)进行比较，则发现在相同的酶添加量下前者仅为后者的约2~3成左右的反应量。即，LTLT牛奶为了得到与UHT牛奶同等的酶处理效果，则需要更多的酶，成本可能变高。

这样，PG的反应性根据原料乳的加热经历而不同限制了对乳制品利用该酶的机会，对于乳制品加工业者难以说是容易使用的技术。原因在于，从风味或物性的观点考虑，只能将乳制品的全部原料乳以UHT方式杀菌。

于是，本发明人等探究了热经历低的原料乳的PG反应性为何低的原因。该研究的结果明确了热经历低的原料乳中存在PG的抑制物质，这就是PG的低反应性的原因。因此找出使原料乳中存在的PG的抑制物质减少、消失的方法成为了课题。

迄今已知牛奶中存在作为蛋白质交联酶的转谷氨酰胺酶的抑制物质(非专利文献5)，但并不知道存在PG的抑制物质。而且，PG是最近才发现的新型的酶，过去的认识少，另外，起源、蛋白质的一级序列、分子量、结构、催化功能等各种特性与TG不同，所以考虑与TG不同的抑制机制是有帮助的，需要另外致力于本课题。

本发明鉴于上述课题而完成，其目的在于提供通过减少或除去热经历低的原料乳中存在的蛋白质脱酰胺酶(PG)的反应抑制物质，而使PG更效率良好且有效果地作用于热经历低的原料乳，得到物性、口感(特别是赋予脂肪样的口感)良好的乳制品的方法。

用于解决课题的手段 

本发明人等为了实现上述目的进行了深入研究，结果发现在生奶、LTLT杀菌乳、HTST杀菌乳之类加热经历低的奶的低分子馏分(分子量1万以下)内存在PG的反应抑制物质。进而，发现PG的反应抑制物质通过加热处理(将原料乳加热至原料乳的乳清蛋白质变性度为40~80%)、钙螯合剂添加处理、碱原料添加处理(将原料乳调整至pH7~8)、还原剂添加处理、或者除去低分子馏分的处理而被减少或除去，即使是加热经历低的原料乳，也可以使PG效率良好且有效果地作用。进而，发现如果在加热经历低的乳中添加PG，在60~65℃下使其作用，则能够使PG效率良好且有效果地作用。并且，发现通过将由上述方法得到的PG改性乳用作原料，能够得到物性、口感(特别是赋予脂肪样的口感)良好的乳制品，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。

(1)改性乳的制造方法，其特征在于，包含对由生奶、LTLT杀菌乳或HTST杀菌乳而成的原料乳实施使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理的工序、和使蛋白质脱酰胺酶作用于该原料乳的工序。

(2) (1)所述的方法，其中，使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理是在原料乳中每100g原料乳添加0.2~1.0g钙螯合剂的处理。

(3) (2)所述的方法，其中，钙螯合剂是柠檬酸钠盐、γ-聚谷氨酸钠盐或乙二胺四乙酸4钠盐。

(4) (1)所述的方法，其中，使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理是在原料乳中每100g原料乳添加0.01~0.5g碱原料的处理。

(5) (4)所述的方法，其中，碱原料为氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、磷酸3钠、碳酸氢钠、煅烧钙或精氨酸。

(6) (1)所述的方法，其中，使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理是在原料乳中每100g原料乳添加0.0001~0.1g还原物质或每100g原料乳添加含有0.0001~0.1g还原物质的酵母提取物的处理。

(7) (6)所述的方法，其中，还原物质为谷胱甘肽、半胱氨酸或γ-谷氨酰半胱氨酸。

(8) (1)所述的方法，其中，使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理是从原料乳中分馏除去分子量1万以下的低分子馏分的处理。

(9) (8)所述的方法，其中，将低分子馏分分馏除去的处理利用超滤膜。

(10) 改性乳的制造方法，其特征在于，对由生奶、LTLT杀菌乳或HTST杀菌乳而成的原料乳添加蛋白质脱酰胺酶，并在60~65℃使其作用于该原料乳。

(11) 乳制品的制造方法，其特征在于，使用通过(1)～(10)中任一项所述方法得到的改性乳。

(12) (11)所述的方法，其中，乳制品为酸奶、奶酪样食品、布丁或乳饮料。

发明效果 

根据本发明，即使是蛋白质脱酰胺酶的反应性低的、生奶等热经历低的原料乳，也能够效率良好地利用蛋白质脱酰胺酶得到改性乳。另外，通过将该改性乳用作原料，可制造具有浓厚且奶油般口感的乳制品。

附图说明

[图1] 表示PG对LTLT牛奶和UHT牛奶的反应性的图。(实验例1)

[图2] 表示PG对添加了还原剂的牛奶的反应性的图。(实施例3)

[图3] 表示PG对添加了谷胱甘肽酵母提取物的牛奶的反应性的图。(实施例3)

[图4] 表示PG对除去了低分子馏分的牛奶的反应性的图。(实施例4)

[图5] 表示PG反应温度和PG的反应性的图。(实施例5)

[图6] 酸奶的物性测定结果。(实施例6)。

具体实施方式

以下详细说明本发明。本发明的改性乳制造方法是对生奶、LTLT杀菌乳、HTST杀菌乳等热经历低的原料乳实施使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理，以使蛋白质脱酰胺酶作用于该原料乳。对于实施PG抑制物质的减少处理的工序和使PG作用的工序的顺序，可以在实施PG抑制物质的减少处理后，使PG作用，也可以边实施PG抑制物质的减少处理，边使PG作用，还可以边使PG作用，边实施PG抑制物质的减少处理。例如通过添加钙螯合剂、添加碱原料、添加还原剂实施PG抑制物质的减少处理时，可以将钙螯合剂、碱原料、还原剂和PG同时添加到原料乳中，也可以先添加一方后，添加另一方。

本发明中使用的由生奶、LTLT杀菌乳或HTST杀菌乳而成的原料乳是指从牛、山羊等动物挤出的未加工的生奶、对生奶进行LTLT杀菌或HTST杀菌得到的乳、将它们混合得到的乳、它们的脱脂乳、部分脱脂乳、或者对它们进行了加工处理的乳。生奶是指刚挤出的奶，所谓未加工乳。LTLT杀菌乳是指通过低温保持式杀菌法(LTLT法)杀菌的牛奶，具体是在62~66℃之间进行30分钟加热杀菌或者在75℃以上加热杀菌15分钟以上得到的牛奶。HTST杀菌乳具有与LTLT法大致同等的杀菌效果，是在72~75℃保持15秒的杀菌方法。脱脂乳是从生奶中几乎全部除去了脂肪成分的乳，部分脱脂乳是指部分除去了脂肪成分的乳。

作为本发明的使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理，添加钙螯合剂、添加碱原料、添加还原剂、将低分子馏分分馏·除去、使酶反应在60~65℃下进行是有效的。另外，通过对原料乳控制加热条件以使乳清蛋白质变性度为40~75%的范围，也能够获得与UHT牛奶相当的PG反应性。

添加钙螯合剂时，其添加量优选每100g原料乳为0.05~0.5g。添加的时期优选在将PG添加到原料乳中之前或者与PG同时添加到原料乳中，但只要PG不失活，也可以在添加PG后，添加钙螯合剂。作为钙螯合剂，优选为柠檬酸钠盐、γ-聚谷氨酸钠盐、乙二胺四乙酸4钠盐。如果上述物质不是盐，则有pH下降、乳变得不稳定、反而导致反应性下降的倾向，所以优选为盐。

添加碱原料时，本发明的碱原料中包含作为食品添加物的碳酸钾、碳酸钠、磷酸3钠、碳酸氢钠、煅烧钙、精氨酸。通过添加上述碱原料，将原料乳调整至pH7~8。因此，只要根据使用的碱原料适当调节添加量即可，每100g原料乳为0.01~0.5g即可。添加时期优选在将PG添加到原料乳中之前、或者与PG同时添加到原料乳中，但只要PG不失活，也可以在添加PG后，添加碱原料。或者也可以直接使用氢氧化钠溶液，将原料乳的pH调节到7~8。酶反应后，pH可以保持原样，也可以用酸恢复到原来水平。

添加还原剂时，作为本发明的还原剂，可以举出硫醇系化合物、即谷胱甘肽、半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸、以及高浓度包含上述化合物的酵母提取物，含有上述化合物的制剂也包括在其中。还原剂的添加量在每100g原料乳为0.0001~0.1g的范围内适用。使用以高浓度包含还原剂的酵母提取物时，只要在原料乳中每100g原料乳添加含有0.0001~0.1g还原物质的酵母提取物即可。如果添加量低于此处所示的范围，则难以得到效果，相反如果增加还原剂的添加量，则对口味产生不良影响，虽然也取决于种类，但即使增加添加量到某一定值以上，反应性提高效果也保持一定。对于在原料乳中添加还原剂的时期，可以预先添加在原料乳中，只要PG不失活，也可以在添加PG后添加还原剂，但从实用方面考虑，优选将还原剂与PG同时添加。另外，即使考虑还原剂的效力，也因为在原料乳中长时间培养还原剂时本来的还原力会下降，所以尽可能与酶同时添加。

将原料乳的低分子馏分分馏除去时，优选作为乳业界中被工业地使用的低分子馏分除去法的离子交换、电渗析、超滤(Ultra Filtrate:UF)、反渗透法等。特别优选可以使作为溶剂的水及低分子溶质透过、保持蛋白质等高分子溶质的、利用UF膜的低分子馏分除去法。例如用分子量1~2万的UF膜除去低分子馏分的效率良好。需要说明的是，实验室水平上也可以使用透析膜。

作为提高原料乳的反应性的方法，还发现了不依赖于添加物、分馏的方法。该方法是控制反应温度的方法。PG的最适温度如非专利文献2所述在50~60℃附近，稳定性在超过50℃后急剧下降。本发明发现通过在其稳定性开始急剧下降的60~65℃下使其反应，低热经历的原料乳和UHT牛奶的反应性之差会变小。所以，反应无需长时间进行，在5分钟~60分钟左右的短时间内即可完成酶反应。

本发明中的蛋白质脱酰胺酶只要具有直接作用于蛋白质的酰胺基，不伴随肽键切断及蛋白质交联而进行脱酰胺的作用即可，其种类没有特别限定。作为此类酶的例子，有日本特开2000-50887号公报(专利文献1)、日本特开2001-21850号公报(专利文献2)、WO2006/075772(专利文献4)中公开的来源于金黄杆菌属、黄杆菌属或短稳杆菌属的蛋白质脱酰胺酶、市售的来源于金黄杆菌属的蛋白质谷氨酰胺酶等，但并不特别限定于此。优选选择来源于金黄杆菌属的酶。另外，使转谷氨酰胺酶作用于食品原料时，蛋白质的交联反应优先发生，脱酰胺反应几乎不发生，所以本发明的蛋白质脱酰胺酶中不含转谷氨酰胺酶。

蛋白质脱酰胺酶可以使用由产生蛋白质脱酰胺酶的微生物培养液制备的酶，对于其制备方法，可以使用公知的蛋白质分离、精制方法(离心分离、UF浓缩、盐析、使用离子交换树脂等的各种色谱等)。例如可以将培养液离心分离除去菌体，然后组合盐析、色谱等得到目标酶。从菌体内回收酶时，例如通过加压处理、超声波处理等将菌体破碎后，与上述同样地进行分离、精制，由此可以得到目标酶。另外，也可以通过过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、精制)。酶可以通过冷冻干燥、减压干燥等干燥法进行粉末化，此时可以使用适当的赋型剂、干燥助剂。

本发明的蛋白质脱酰胺酶的活性通过下述方法测定。

(1)在1ml含30mM Z-Gln-Gly(肽研究所)的0.2M磷酸缓冲液(pH6.5)中添加100μl含蛋白质脱酰胺酶的水溶液，在37℃下培养10分钟后，加入1ml 0.4M TCA溶液，使反应停止。

(2)对于(1)的反应液，使用Ammonia-test-Wako(和光纯药工业株式会社制造销售)进行氨的定量。

(3)作为空白，不添加酶，在37℃下培养10分钟后，加入1ml 0.4M TCA溶液，然后添加100μl包含蛋白质脱酰胺酶的水溶液而得的空白溶液也同时进行。

(4)酶的制备浓度使用磷酸缓冲液(pH6.5)稀释成630nm的吸光度值在Δ0.2~0.8的范围内。

(5)活性以1分钟内生成1μmol氨的酶量为1单位(U)。酶活性由下式算出。

酶活性(U/ml)=(Es-Eb)*F*0.123×Df

Es：酶反应液的吸光度值

Eb：空白的吸光度值

F：因子(制作氨标准液的标准曲线时的直线的斜率的倒数)

Df：酶溶液的稀释率 

本发明中PG的添加量在原料乳中每1g乳蛋白质优选为0.01~100U，更优选为0.1~20U。在0.1U以下时难以获得期待的效果，在20U以上时难以得到经济性优点。反应温度通常为0℃~65℃左右，反应时间可以为约1分钟~约40小时左右。但是，优选可在5℃~65℃左右反应约5分钟~约20小时左右。

利用PG的乳蛋白质的脱酰胺化度、即乳的改性程度可以对应于所要求的乳制品的物性适当通过PG的添加量或反应时间、反应温度等反应条件进行调节。调节乳蛋白质的脱酰胺化度的手段有测定通过脱酰胺反应所产生的氨的发生量。反应的停止通常适用乳制品的制造中可使用的加热杀菌条件，没有特别限定。当然，即使不采用上述加热杀菌工序，也能够获得本发明的效果。由此得到的经改性的原料乳也包括在通过本发明的制造方法得到的乳制品中。除此之外，作为通过本发明制造的乳制品、即、对热经历低的牛奶的PG的低反应性经改善的原料乳实施PG处理后制备的、具有浓厚且奶油般口感的乳制品，可以举出酸奶、奶酪、冰淇淋、浓缩乳、脱脂浓缩乳、全奶粉、脱脂奶粉、总牛奶蛋白、乳清粉、乳酸菌饮料及乳饮料等。进而，添加了食盐、砂糖、甜味料、香料、调味料等副原料的加工食品、例如白沙司（white source）之类也包括在本发明中。

以下列举实验例、实施例，更详细地说明本发明。

实验例1

为了确认LTLT杀菌牛奶(66℃、30分钟：Takanashi低温杀菌牛奶)及UHT杀菌牛奶(130℃、2秒：Magokoro Rakuno 3.6牛奶)各自对PG的反应性差异，在各牛奶中添加0~0.4U/ml PG(通过非专利文献〔Appl Microbiol Biotechnol (2008) 78: 67-74〕〈参考文献1〉中记载的方法制备的精制品：比活性120U/mg-蛋白质)，于50℃反应60分钟。结果如图1所示，LTLT牛奶与UHT牛奶相比反应性低，相同的酶量下只能得到1/5~1/4左右的反应量。认为这是因为如下述实验例2~4所示，牛奶中的低分子馏分中存在的抑制物质的缘故，本发明中以除去该抑制要因、提高原料乳的反应性为目的。需要说明的是，参考文献1的记载内容通过引用并入本说明书中。

实验例2

将实验例1记载的PG精制品(50U/ml)使用下述a~c的溶剂稀释100倍。a：20mM磷酸缓冲液(pH6.3)、b：LTLT杀菌牛奶(66℃、30分：Takanashi低温杀菌牛奶)、c：b的超离心分离上清的超滤透过液(Amicon、Centriprep YM-10；截留分子量10,000)。分别按照本说明书第10页第2行～第19行记载的以Z-Gln-Gly为底物的PG活性测定法进行测定，其结果示于表1。相对于将PG用磷酸缓冲液稀释时活性为0.5u/ml，用LTLT杀菌牛奶稀释时活性下降至约12%。用LTLT杀菌牛奶通过超滤得到的低分子馏分进行稀释时活性完全消失。这表示在LTLT杀菌牛奶中、特别是在其低分子馏分中存在PG的抑制物质。

[表1]

。

实验例3

接着，给出将LTLT杀菌牛奶通过超滤得到的低分子馏分进行加热处理或者添加还原剂的处理时PG活性恢复的例子。用将超滤液以加热块于90℃处理5分钟的超滤液或者作为还原剂添加了还原型谷胱甘肽1.0mM(每100g原料乳相当于0.03g)的超滤液将实验例2记载的PG精制品(0.5U/ml)稀释100倍。与实验例2同样地测定PG活性，结果示于表2。可知相对于超滤液使PG活性基本消失，通过加热处理、添加还原剂使得活性大幅恢复。该结果在底物不是Z-Gln-Gly、而是牛奶中的酪蛋白胶束(通过超离心分离(日立工机Himac CP80WX、28,600rpm、60min、25℃)得到的沉淀粒)时也是同样的(数据未给出)。总之，可以确认作为原料乳中主要蛋白质的酪蛋白胶束的PG反应性没有问题，是良好的，溶剂中存在PG的低反应性的原因。

[表2]

以下实施例中，介绍通过使低温杀菌牛奶中的低分子馏分中存在的抑制物质消失、减少而提高低热经历牛奶的PG反应性的手法，但本发明并不受下述实施例的任何限制。

实施例 1 

在LTLT杀菌牛奶(66℃、30分：Takanashi低温杀菌牛奶)中适当添加钙螯合原料。如下所述地研究各牛奶的PG反应性。相对于各牛奶，添加0.4U/ml(相当于每1g乳蛋白质约12u)PG(实验例1记载的精制品)，在50℃下培养60分钟。通过添加与反应液等量的12%TCA将酶反应停止，由氨定量试剂盒F-kit(Roche社)测定通过离心分离(12,000rpm、5℃、5分钟)得到的上清中的氨。结果如表3所示，与无添加(对照)相比添加了各种钙螯合原料的牛奶的PG的反应性提高。

[表3]

。

实施例 2 

在LTLT杀菌牛奶(66℃、30分钟：Takanashi低温杀菌牛奶)中适当添加碱原料使pH为7~8.4。与实施例1同样地研究各牛奶的PG反应性。结果如表4所示，与无添加(对照)相比添加了各种碱原料的牛奶的PG的反应性pH依赖性地提高。

[表4]

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实施例 3 

在LTLT杀菌牛奶(66℃、30分钟：Takanashi低温杀菌牛奶)中，作为硫醇系还原剂，适当添加谷胱甘肽或半胱氨酸(均为试剂、Nacalai Tesque)。与实施例1同样地研究各牛奶的PG反应性。结果如图2所示任一物质的PG的反应性均添加量依赖性地提高，添加0.001%时恢复80~90%左右的反应性。同样地对于谷胱甘肽酵母提取物(AROMILD UG8、兴人社)也改变浓度添加到牛奶中，研究PG反应性。结果如图3所示，在0.02%以上时反应性恢复70%左右，0.05%以上时反应性基本恢复100%。

实施例 4 

将LTLT杀菌牛奶(66℃、30分钟：Takanashi低温杀菌牛奶)离心分离(8,000rpm、1hr、10℃)制备部分脱脂牛奶。将其使用超滤膜(Sartorius、Hydrosart膜、截留MW10,000)浓缩至约3倍。使实验例1记载的PG精制品与每克乳蛋白质的酶添加量相同，研究PG反应性(反应条件为50℃、1小时)。将通过反应生成的氨量换算成每克蛋白质，比较反应性时，浓缩后的牛奶如图4所示反应性增长接近3倍。另外，通过纤维素透析膜(截留分子量MW8,000)于4℃将牛奶透析一晚时，PG的反应性进一步增加。由此通过除去牛奶中的低分子馏分，反应性提高。

实施例 5 

研究使LTLT杀菌牛奶(66℃、30分钟：Takanashi低温杀菌牛奶)与PG反应时的温度和PG反应量的关系时，如图5所示，显示不同于UHT的行为。对于UHT牛奶，50~60℃是显示最大反应性的温度带，如果超过60℃，则反应性直线下降。另一方面，可知对于LTLT牛奶，在任一温度带与UHT牛奶相比，反应性均低，但是在60℃～65℃反应性急剧提高，在该温度带中，相对于UHT反应性恢复80~90%左右。

实施例 6 

本发明通过提供使热经历低的原料乳的PG反应性提高的手段能够制造价格更低且高品质的乳制品。以酸奶为例说明以上列举的各种手段能够应用于实际的食品体系。

将实验例1记载的PG精制品按原料乳中的每1g乳蛋白质为1U的比例添加到LTLT杀菌牛奶(66℃、30分钟：Takanashi低温杀菌牛奶;乳蛋白质3.2%、乳脂成分3.7%)中，同时添加相对于原料乳的0.4%的柠檬酸3Na(食品添加物)，将料温保持在50℃反应1小时。为了停止反应及杀菌的目的使温度达到95℃保持1分钟后，立刻冷却至47℃。相对于原料乳添加0.0063%市售的乳酸菌发酵剂“Yo-Flex YC-370”(Chr. Hansen社制)，填充到容器中后，于44℃发酵至pH为4.5~4.6以制作酸奶(本发明品)。同样地，为了比较仅在50℃下培养1小时制作样品(对照品1)，相对于乳添加0.4%的柠檬酸3Na，将料温保持在50℃培养1小时制作样品(对照品2)，在50℃下以每1g乳蛋白质为3.5U的比例添加PG、于50℃培养1小时制作样品(对照品3)。均在发酵结束后于冷藏下(5℃)静置保存，测定1日后的物性(断裂面积及附着性)。使用质构仪(Stable Macro Systems, LTD)，在测定条件为测试速度1mm/s、直径10mm的平板活塞、10%压缩下进行。另外，由经过训练的5名评判进行官能评价。其结果示于表5。

[表5]

实施例 7 

将实验例1中记载的PG精制品以每1g乳蛋白质为1U的比例添加在LTLT杀菌牛奶(66℃、30分钟：Takanashi低温杀菌牛奶;乳蛋白质3.2%、乳脂成分3.7%)中，同时将AROMILD UG8(兴人社、谷胱甘肽酵母提取物、以下简称为YE)相对于乳添加0.01%、0.02%(相对于100g原料乳的GSH含量分别约0.0007g、0.0014g)，将料温保持在50℃，搅拌1小时反应。为了停止反应及杀菌的目的使温度达到95℃保持1分钟后，立刻冷却至47℃。相对于乳原料添加0.0063%市售的乳酸菌发酵剂“Yo-Flex YC-370」(Chr. Hansen社制)，填充到容器中后，于44℃发酵至pH为4.5~4.6以制作酸奶(本发明品1、2)。为了比较，PG、YE均无添加(对照组1)、仅添加了PG(对照组2)同样地制作酸奶。需要说明的是，已经确认仅添加了0.01%、0.02%YE的酸奶与对照组1相比几乎无变化。均在发酵结束后于冷藏下(5℃)静置保存，测定1日后的物性(断裂面积及附着性)。物性测定及官能评价的方法如实施例6所述。

如物性测定的结果(图6)所示，能够明确地确认PG单独添加品(对照组2)与无添加品(对照组1)相比几乎无差别，而本发明品1及本发明品2的断裂面积减少及附着性增加。这表示酸奶的物性为柔软、变得奶油般，是与表6的官能评价一致的结果。由此，显示通过添加谷胱甘肽酵母提取物，能够得到迄今水平以上的高PG效果，也显示可以通过其添加量调节效果。

[表6]

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实施例 8 

将LTLT杀菌牛奶(66℃、30分钟：Takanashi低温杀菌牛奶;乳蛋白质3.2%、乳脂成分3.7%)通过离心分离(8,000rpm、1hr、10℃)部分脱脂得到的牛奶使用超滤膜(Sartorius、Hydrosart膜、截留MW10,000)浓缩至4倍，得到带粘度的浓缩乳。在其中以每1g乳蛋白质为8U的比例加入实验例1记载的PG精制品，于50℃反应60分钟时，发生凝乳，得到特别浓厚且光滑的奶酪样食品。作为比较，没有添加PG的牛奶也同样地实施，但没有凝乳，保持液状。由此使PG有效果地作用于通过脱盐浓缩得到的浓缩乳，可以制造润滑口感的奶酪样乳制品。

实施例 9 

在LTLT杀菌牛奶(66℃、30分钟：Takanashi低温杀菌牛奶;乳蛋白质3.2%、乳脂成分3.7%)中每1g乳蛋白质加入10U实验例1记载的PG精制品，在65℃下反应60分钟。在沸腾浴中加热至达到85℃，使酶失活后，迅速冷却，制备脱酰胺处理牛奶(试验品a)。作为比较，除了不添加酶以外同样地制备(试验品b)，并且在相同牛奶内每1g乳蛋白质添加10U PG精制品，在50℃下反应60分钟同样地制备(试验品c)。反应后的牛奶中的氨浓度：试验品a为11.1mmol/l、试验品b为0.12mmol/l、试验品c为2.05mmol/l。

在100g(约2个)蛋和30g砂糖的混合搅拌物中加入升温至40℃左右的试验品a~c。边用漏勺过滤，边分注于铝杯内，用蒸锅中火加热15分钟。进行冷却，对于冷藏1日的样品进行官能评价(n=3)。如表7所示，如果与用试验品b、c的牛奶制作的布丁(比较品1、2)相比，则用试验品a的牛奶制作的布丁(本发明品)是蛋的黄色最浓、孔穴出现少的光滑断面。口感也非常爽滑，更能够感到奶味，故优选。布丁的品质根据使用的牛奶的种类而不同，特别是使用低温杀菌牛奶制作的布丁能够不破坏生奶所具有的风味而拥有自然的美味，故而人气高。根据本发明，确认了可通过将LTLT牛奶的PG反应温度设定为65℃，确保PG的高反应性，制造风味好、爽滑口感的布丁。

[表7]

实施例 10 

将挤奶后的生奶在40℃加温条件下用分离器进行脱脂处理。然后，用平板杀菌机进行高温短时(HTST)杀菌(75℃、15秒)处理，得到经杀菌的脱脂乳。将该脱脂乳在55℃下进行预培养，相对于乳添加0.02%(w/v)含有谷胱甘肽的酵母提取物(兴人制、AROMILD UG8)，同时将PG(天野酶制蛋白质谷氨酰胺酶)按每1g乳蛋白质为1.5、4.5、15单位(以下单位用u/gp表示)进行添加，反应1小时。为了使酶失活，用热水浴加热至温度达到80℃(本发明品)。作为对照，同样地制备没有添加相对于乳为0.02%(w/v)的含有谷胱甘肽的酵母提取物、添加了1.5、4.5、15u/gp PG的产品(对照品)。另外，作为比较，对进行了HTST杀菌(75℃、15秒)后的脱脂乳进一步施行加热处理(温度达到95℃)，然后，另行制备添加1.5、4.5、15u/gp PG，于55℃反应1小时的产品(比较品)。对于对照品、本发明品、比较品，测定通过反应生成的氨量。PG无添加时，牛奶中的氨量在对照品、本发明品、比较品中分别是0.38、0.38、0.34mM。另外，添加PG时，如表8所示，相同的PG添加量下，与对照品相比，本发明品的氨发生量明显多，其反应量与比较品大致相同。该结果显示通过将含有谷胱甘肽的酵母提取物按相对于乳为0.02%(w/v)进行添加，无需额外施行加热处理即可提高PG反应性。

[表8]

对照品：实施了脱脂的牛奶（HTST处理）无添加

本发明品：实施了脱脂的牛奶（HTST处理）含有高谷胱甘肽的酵母提取物，添加了0.02%的AROMILD

比较品：实施了脱脂的牛奶（HTST处理+温度达到95℃的加热处理）无添加。

实施例 11 

将实施例10中制备的本发明品的脱脂乳供于喷雾干燥，制成奶粉。使用该脱脂奶粉，按表9记载的配比，制备弱酸性乳饮料。用壶称量水，使脱脂奶粉和砂糖溶解后，用TK Robomix(特殊机化工业(株))在3,000rpm搅拌下滴入柠檬酸(无水)10%溶液。立刻提高旋转速度，以8,000rpm搅拌溶解3分钟。分注于耐热性PET瓶(500ml容积)，进行温度达到96℃的加热处理。随后调查是否有沉淀的情况，如表10所述，使用了PG未处理的脱脂奶粉的饮料、与PG1.5u/gp处理品产生了沉淀，但4.5u/gp及15u/gp处理品的沉淀受到显著抑制而维持分散状态。另外，相对于对照品中最终pH为5.09，本发明品中pH为5.2~5.3，即使柠檬酸添加量相同，溶解时的pH也比未处理品高0.2~0.3左右，显然本发明品是缓冲能力高的脱脂奶粉。

[表9]

[表10] 

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然后使用对照品及本发明品2(PG15u/gp处理品)的脱脂奶粉研究乳饮料的pH对沉淀防止效果的影响。基于表10，调节柠檬酸量使最终pH为5.0~5.6，用水调整最终重量至合计100%。制备后，分注于耐热性PET瓶，进行温度达到96℃的加热处理。结果如表11所示，对照品加热前的饮料在pH5.55、5.63时发白且分散，但通过加热发生沉淀凝集。另一方面，使用了本发明品的饮料无论是否有加热处理，在pH5.2以上，沉淀的形成均被显著抑制。由对照品的结果可知，通常在弱酸性区域中的乳蛋白质的稳定性低。但是，如本发明品所示，预先实施了PG处理的脱脂奶粉稳定性显著提高。该结果暗示本发明是制造咖啡乳饮料、含有果实的弱酸性乳饮料等时有用的技术。

[表11]

产业上的可利用性 

根据本发明，即使是蛋白质脱酰胺酶的反应性低的、生奶等热经历低的原料乳也能够效率良好地利用蛋白质脱酰胺酶得到改性乳。另外，通过将该改性乳用作原料，能够制造具有浓厚且奶油般口感的乳制品。所以，本发明在食品领域极其有用。

在本发明的全部公开(包括权利要求书)范围内，基于其基本技术构思能够进一步变更·调整实施例乃至实施例。另外，在本发明的权利要求书范围内，与各种公开要素的多种组合甚至选择也是可以的。即，本发明当然包括包含权利要求书的全部公开内容、本领域技术人员根据技术构思能够想到的各种变形、修改。 

Claims (8)

1.改性乳的制造方法，其特征在于，包含对由生奶、LTLT杀菌乳或HTST杀菌乳而成的原料乳实施使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理的工序、和使蛋白质脱酰胺酶作用于该原料乳的工序，

其中，使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理是在原料乳中每100g原料乳添加0.2~1.0g钙螯合剂的处理，

钙螯合剂是柠檬酸钠盐、γ-聚谷氨酸钠盐或乙二胺四乙酸4钠盐。

2.改性乳的制造方法，其特征在于，包含对由生奶、LTLT杀菌乳或HTST杀菌乳而成的原料乳实施使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理的工序、和使蛋白质脱酰胺酶作用于该原料乳的工序，

其中，使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理是在原料乳中每100g原料乳添加0.01~0.5g碱原料，

碱原料是氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、磷酸3钠、碳酸氢钠、煅烧钙或精氨酸。

3.改性乳的制造方法，其特征在于，包含对由生奶、LTLT杀菌乳或HTST杀菌乳而成的原料乳实施使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理的工序、和使蛋白质脱酰胺酶作用于该原料乳的工序，

其中，使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理是在原料乳中每100g原料乳添加0.0001~0.1g还原物质或每100g原料乳添加含有0.0001~0.1g还原物质的酵母提取物的处理，

还原物质为谷胱甘肽、半胱氨酸或γ-谷氨酰半胱氨酸。

4.改性乳的制造方法，其特征在于，包含对由生奶、LTLT杀菌乳或HTST杀菌乳而成的原料乳实施使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理的工序、和使蛋白质脱酰胺酶作用于该原料乳的工序，

其中，使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理是从原料乳中分馏除去分子量1万以下的低分子馏分的处理。

5.如权利要求4所述的方法，其中，将低分子馏分除去的处理利用超滤膜。

6.改性乳的制造方法，其特征在于，包含对由生奶、LTLT杀菌乳或HTST杀菌乳而成的原料乳实施使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理的工序、和使蛋白质脱酰胺酶作用于该原料乳的工序，其中，使蛋白质脱酰胺酶的抑制物质减少的处理是在60~65℃下用蛋白质脱酰胺酶处理原料乳。

7.乳制品的制造方法，其特征在于，使用通过权利要求1～6中的任一项所述的方法得到的改性乳。

8.如权利要求7所述的方法，其中，乳制品为酸奶、奶酪样食品、布丁或乳饮料。

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