BRPI0918736B1

BRPI0918736B1 - Método para produzir leite modificado.

Info

Publication number: BRPI0918736B1
Application number: BRPI0918736-7A
Authority: BR
Inventors: Miwa Noriko
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.; Amano Enzyme Inc.
Priority date: 2008-09-29
Filing date: 2009-09-28
Publication date: 2018-07-31
Also published as: EP2332421B1; WO2010035825A1; EP2332421A4; BRPI0918736A8; BRPI0918736A2; JPWO2010035825A1; CN102164496A; US8318223B2; CN102164496B; EP2332421A1; JP5643099B2; US20110236529A1; MX2011003296A

Description

(54) Título: MÉTODO PARA PRODUZIR LEITE MODIFICADO.

(51) Int.CI.: A23C 9/152; A23C 9/13; A23C 19/032 (30) Prioridade Unionista: 29/09/2008 JP 2008-250111 (73) Titular(es): AJINOMOTO CO., INC.. AMANO ΕΝΖΥΜΕ INC.

(72) Inventor(es): NORIKO MIWA (85) Data do Início da Fase Nacional: 18/03/2011 “MÉTODO PARA PRODUZIR LEITE MODIFICADO”

CAMPO TÉCNICO [REFERÊNCIA A PEDIDO RELACIONADO]

Este pedido baseia-se e reivindica os benefícios da prioridade do pedido de patente japonesa n° 2008-250111 (depositado em 29 de setembro de 2008), cuja descrição é aqui incorporada em sua totalidade como referência à referida.

A presente invenção diz respeito a um método para produzir leite modificado mediante o tratamento do leite matéria-prima de modo a aumentar a reatividade do leite matéria-prima com uma enzima de desamidação protéica e mediante ainda o tratamento do leite matéria-prima com a enzima de desamidação protéica, e diz respeito a um método para produzir um produto lácteo com o uso do leite modificado.

FUNDAMENTOS

O leite bruto (leite fresco de uma vaca) proporciona a nossa riqueza alimentar de cada dia, por ser processado em várias espécies de produtos lácteos, bem como para ser bebido como um leite, bem como um sorvete, iogurte, queijo, leite em pó, bebida bacteriana de ácido láctico, e outros produzidos do leite ou de manteiga produzida de creme separado do leite bruto.

Um dos indicadores mais eficientes para se determinar o “sabor” de tais produtos lácteos é a textura densa e cremosa da gordura do leite e é dito que a textura tem uma relação íntima com o conteúdo graxo dos produtos de leite. Por outro lado, recentemente, a atenção à facilidade de se comprar produtos tais como um produto de “baixo preço” etc., ou para a saúde dos consumidores tais como, tais como um produto de “baixa caloria” etc., está crescendo como um fator para determinar um valor comercial. Não obstante várias espécies de produtos lácteos que contenham menos conteúdo de gordura do leite, tais como produtos sem nenhuma gordura ou produtos de baixa gordura, estejam sendo desenvolvidos de acordo com as demandas crescentes, o sabor destes produtos é ainda evidente, insípido e com menos sabor de leite, e portanto os consumidores não ficam satisfeitos. Assim sendo necessário é desenvolver produtos lácteos saborosos que possam satisfazer às exigências dos consumidores mesmo quando o conteúdo de gordura do leite seja baixo ou sem conteúdo crescente da gordura do leite.

A propósito, hoje em dia, as enzimas são utilizadas em vários campos em uma indústria de alimentos. Os méritos de se usar enzimas são dados de modo que uma enzima atue apenas sobre material especificado sob condições brandas e que uma influência sobre o sabor seja pequena. Os desenvolvimentos e melhoramentos dos alimentos ou os melhoramentos dos processos de fabricação são realizados com várias finalidades mediante a utilização de tais características superiores das enzimas.

Entre elas, uma enzima de desamidação protéica está atraindo nossa atenção como uma nova enzima para dar textura densa e cremosa, a qual pode ser obtida quando a gordura do leite é adicionada aos produtos lácteos. A enzima é uma enzima catalítica que facilita uma reação de desamidação pela atuação sobre um resíduo de glutamina em uma proteína, e é também denominada como uma proteína de glutaminase (daqui por diante designada “PG”). O resíduo de glutamina em uma proteína é convertido em resíduo de ácido glutâmico e produz grupo carboxílico e, portanto, aumento da carga negativa, aumento da repulsão eletrostática, redução do ponto isoelétrico, aumento da potência de hidratação, e outras ocorrências na proteína. E conhecido o fato de que, como um resultado, o melhoramento de várias espécies de características funcionais pode ser obtido como o aumento da solubilidade e a dispersão da capacidade na água, aumentando a capacidade de emulsificação e a estabilidade, etc. da proteína (Documentos de Patente 1 e 2 e Documentos não Patentes 1 a 4). Sabe-se também que a PG que tenha tais características melhora a textura macia dos produtos lácteos tais como o iogurte ou o queijo, mediante o uso da PG para tais produtos (Documento de Patente 4). Assim sendo, espera-se que a PG possa proporcionar a textura densa e cremosa que o leite inerentemente possui mesmo quando o conteúdo de gordura no produto lácteo tenha sido reduzido.

As proteínas do leite contidas no leite, cujo conteúdo é de 3,0 a

3,5 %, são classificadas em dois grandes grupos, um sendo a caseína e o outro sendo a proteína do soro do leite. As quantidades de caseína até cerca de 80 % da proteína total, e as quantidades de proteínas do soro do leite até cerca de 20 % da proteína total. A caseína é composta de quatro componentes de caseína asl, caseína as2, caseína β e caseína k, e a proteína do soro do leite é composta de lactalbumina α e lactglobulina β.

No momento, alguns relatos podem ser observados, que dizem respeito à ação da PG sobre tais proteínas do leite. O Documento Não Patente 1 descreve que a reatividade da PG à caseína α e à caseína β é elevada e a reatividade da PG à lactalbumina α e à lactglobulina β é baixa. O Documento Não Patente 3 e o Documento Patente 3 descrevem que a reatividade da PG à lactalbumina α no estado de glóbulo fundido, que é, durante o estado intermediário no processo de desnaturação de uma proteína, aumenta em comparação com o estado de não desnaturação.

Não é demais dizer que a reatividade da PG ao leite depende da reatividade da caseína, que importa na maior parte do leite, ao invés da reatividade da proteína do soro do leite. A maior parte da caseína é dispersa no leite na forma de partículas coloidais, que são denominadas como micelas da caseína, cujo diâmetro é de 0,05 a 0,3 mícron, e cujo diâmetro médio é de cerca de 0,1 mícron. Além disso, é conhecido o fato de que a proteína do leite termicamente sensível interage com a micela da caseína (especialmente a caseína κ que cobre uma superfície da micela da caseína) por aquecimento (Documento Não Patente 4).

Entretanto, as descrições dos Documentos Não Patentes 1 e 3, e do Documento Patente 3, são os resultados da pesquisa em um nível de reagente experimental e nada é referido quanto à reatividade do leite integral como uma matéria-prima dos produtos lácteos. Considera-se que a reatividade da PG em um sistema de leite complicado como apresentado no Documento Não Patente 4, difira daquela em um componente único da proteína do leite; entretanto, a reatividade da PG no leite não foi relatada.

[Documento de Patente 1] Publicação Kokai da Patente Japonesa n° JP-P2000-50887A [Documento de Patente 2] Publicação Kokai da Patente Japonesa n^s JP-P2001-218590A [Documento de Patente 3] WO 2002/068671 [Documento de Patente 4] WO 2006/075772 [Documento Não Patente 1] Yamaguchi et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, pp. 3337-3343 (2000) [Documento Não Patente 2] Yamaguchi et al., Eur. J. Biochem 268 pp. 1410-1421 (2001) [Documento Não Patente 3] Matsumura et al., J. Agric. Food Chem. (2001), 49, pp. 5999-6005 [Documento Não Patente 4] Comprehensive Encyclopedia of Milk, editado por Kunio Yamauchi, Asakura Shoten, p. 60 [Documento Não Patente 5] G.A.H De Jong et al., Journal of Food Science Vol. 68, n° 3, (2003) pp. 820-825 SUMÁRIO DA INVENÇÃO

PROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA INVENÇÃO

As descrições dos Documentos de Patentes 1 a 4 e dos Documentos Não Patentes 1 a 5 são aqui incorporadas como referência em sua totalidade.

As análises a seguir são fornecidas pela presente invenção.

Sob os fundamentos descritos acima, os inventores da presente invenção desenvolveram a utilização da PG para os produtos lácteos. Durante o desenvolvimento, os inventores encontraram um problema de que “a reatividade da PG da matéria-prima do leite tendo baixa história de calor é pequena” pela primeira vez. Por exemplo, os inventores observaram que, comparando-se duas espécies de leite, uma delas sendo leite esterilizado em baixa temperatura e longo tempo de esterilização (método LTLT) (daqui por diante denominado “leite LTLT”) e a outra sendo leite esterilizado por esterilização em calor de temperatura ultra-alta (método UHT) (daqui por diante denominado como “leite UHT”), o primeiro reagindo apenas em cerca de dois a três décimos em comparação com o último pela mesma quantidade de enzima. Isto significa que o leite em LTLT necessita de mais quantidade de enzima para obter o mesmo efeito pelo tratamento enzimático como o leite em UHT, e isso pode causar problema de elevado custo.

A diferença da atividade da PG causada pela história de calor da matéria-prima do leite pode limitar a aplicabilidade das enzimas aos produtos lácteos e, assim, a técnica com o uso de enzimas não pode ser um método fácil para uso quanto aos processadores de produtos lácteos. Isso é porque toda a matéria-prima do leite para produtos lácteos não pode ser necessariamente esterilizada pelo método UHT, do ponto de vista de sabor ou propriedades físicas.

Os inventores da presente invenção, então, conduziram uma pesquisa sobre as causas da baixa reatividade da PG a um leite matéria-prima de baixa história de calor. Com base na pesquisa, os inventores observaram que existe um inibidor da PG em um leite matéria-prima de baixa história de calor e o inibidor ocasiona a baixa reatividade da PG. Assim, tomou-se um problema determinar um método para reduzir ou remover o inibidor da PG existente no leite matéria-prima.

Até agora, é conhecido o fato de que (Documento Não Patente 5) existe no leite um inibidor da transglutaminase, que é uma enzima reticulante de proteína, mas um inibidor da PG não foi conhecido. Tendo em vista que a PG é uma nova enzima que foi encontrada recentemente, a informação da pesquisa anterior é insignificante. Além disso, tendo em vista ser a PG diferente da TG do ponto de vista de origem, a sequência primária da proteína, o peso molecular, a estrutura e várias características tais como uma função catalítica, e assim por diante, foi suposto que um mecanismo de inibição diferente daquele da TG deve contribuir. Assim, trabalho adicional foi necessário para o problema.

A presente invenção tem por finalidade solucionar o problema acima mencionado, e é um seu objeto prover um método para produzir um produto lácteo com boas propriedades físicas e textura (especialmente textura como gordura) mediante a redução ou remoção de um inibidor da reação da enzima de desamidação protéica (PG) existente em um leite matéria-prima tendo história de baixo calor, e tratamento da matéria-prima do leite tendo história de baixo calor com PG mais eficientemente e mais eficazmente. MEIOS DE SOLUCIONAR OS PROBLEMAS

Como um resultado de esforços vigorosos para se alcançar um objetivo acima mencionado, os inventores observaram que existe um inibidor da reação da PG em uma fração de baixo peso molecular (peso molecular de 10.000 ou menos) no leite com história de baixo calor, tal como o leite bruto, o leite esterilizado de LTLT, o leite esterilizado de HTST, e outros. Além disso, os presentes inventores observaram que mesmo a matéria-prima do leite tendo história de baixo calor pode ser tratado com PG com eficiência e eficácia por redução ou remoção do inibidor da reação da PG com o uso de um processo de processamento de calor (aquecer um leite matéria-prima de modo a controlar o grau de desnaturação das proteínas do soro do leite no leite matéria-prima na faixa de 40 a 80 %), uma adição de um agente de quelação de cálcio, uma adição de um material alcalino (de modo a ajustar o pH da matéria-prima do leite na faixa de 7 a 8), uma adição de um agente redutor, ou remoção de uma baixa fração de molécula. Além disso, os inventores observaram que o leite de baixa história de calor pode ser tratado com PG eficientemente e eficazmente pela adição da PG ao leite de baixa história de calor, e tratamento em 60 a 65 graus centígrados. Mediante o uso do leite modificado por PG obtido pelo método acima mencionado como uma matéria-prima, os produtos lácteos tendo boas propriedades físicas e textura (especialmente a textura como gordura) podem ser produzidos. Como um resultado, a presente invenção pode ser resumida como segue.

(1) Um método para produzir leite modificado, compreendendo: uma etapa de tratar um leite matéria-prima do leite bruto, leite esterilizado por LTLT ou leite esterilizado por HTST para reduzir um inibidor de uma enzima de desamidação protéica; e uma etapa de ainda tratar o leite matéria-prima com uma enzima de desamidação protéica.

(2) O método de (1) acima descrito, no qual o tratamento para reduzir um inibidor de uma enzima de desamidação protéica é uma adição de um agente de quelação de cálcio ao leite matéria-prima em 0,2 a 1,0 g por 100 g do leite matéria-prima.

(3) O método de (2) acima descrito, no qual o agente de quelação de cálcio seja citrato de sódio, γ-poliglutamato de sódio ou tetraacetato de etilenodiamina tetra-sódica.

(4) O método de (1) acima descrito, no qual o tratamento para reduzir um inibidor de uma enzima de desamidação protéica é uma adição de um material alcalino ao leite matéria-prima de 0,01 a 0,5 g por 100 g do leite matéria-prima.

(5) O método de (4) acima descrito, no qual o material alcalino é hidróxido de sódio, carbonato de potássio, carbonato de sódio, fosfato trissódico, hidrogencarbonato de sódio, cálcio calcinado ou arginina.

(6) O método de (1) acima descrito, no qual o tratamento para reduzir um inibidor da uma enzima de desamidação protéica é uma adição de um material redutor ao leite matéria-prima de 0,0001 a 0,1 g por 100 g do leite matéria-prima ou uma adição de extrato de levedura contendo um agente redutor em 0,0001 a 0,1 g por 100 g do leite matéria prima.

(7) O método de (6) acima descrito, no qual o material redutor é glutationa, cisteína ou γ-glutamilcisteína.

(8) O método de (1) acima descrito, no qual o tratamento para reduzir um inibidor de uma enzima de desamidação protéica é a remoção de uma baixa fração molecular, cujo peso molecular é de 10.000 ou menos, do leite matéria-prima.

(9) O método de (8) acima mencionado, no qual a remoção de uma fração molecular baixa é realizada com o uso de uma membrana de ultrafiltração.

(10) Um método para produzir leite modificado, que compreende: adicionar uma enzima de desamidação protéica a um leite matéria-prima do leite bruto, do leite esterilizado com LTLT ou do leite esterilizado com HTST; e tratar a matéria-prima do leite com uma enzima de desamidação protéica em 60 a 65 graus centígrados.

(11) Um método para produzir um produto lácteo, mediante o uso do leite modificado obtido por um dos métodos de (1) a (10) descritos acima.

(12) O método de (11) acima descrito, no qual o produto lácteo é iogurte, alimentos semelhantes a queijo, pudim ou bebida à base de leite. EFEITO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, é possível obter leite modificado por uma enzima de desamidação protéica eficientemente mesmo de um leite matéria-prima tendo história de baixo calor, o qual tenha uma baixa reatividade com uma enzima de desamidação protéica. Além disso, é possível produzir produtos lácteos tendo textura densa e cremosa mediante o uso do leite modificado como uma matéria-prima.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico mostrando a reatividade da PG ao leite de LTLT e ao leite de UHT (Exemplo Experimental 1),

A Figura 2 é um gráfico mostrando a reatividade da PG ao leite que é adicionado com um agente redutor (Exemplo 3),

A Figura 3 é um gráfico mostrando a reatividade da PG ao leite que é adicionado com o extrato de levedura contendo glutationa (Exemplo 3),

A Figura 4 é um gráfico mostrando a reatividade da PG ao leite do qual uma fração molecular baixa tenha sido removida (Exemplo 4).

A Figura 5 é um gráfico mostrando uma relação entre a reatividade da PG e a temperatura de reação da PG (Exemplo 5), e

A Figura 6 mostra os resultados das medições das propriedades físicas do iogurte (Exemplo 6).

MODALIDADES PARA REALIZAR A INVENÇÃO

A presente invenção será descrita em detalhes. Um método de produção do leite modificado de acordo com a presente invenção é tratar um leite matéria-prima tendo baixa história de calor tal como o leite bruto, o leite de LTLT, o leite de HTST etc., de modo a reduzir um inibidor de uma enzima de desamidação protéica, e tratar o leite matéria-prima com uma enzima de desamidação protéica. De acordo com a sequência da etapa de tratamento para reduzir um inibidor da PG e da etapa de tratamento para tratar do leite matéria-prima com PG, é possível tratar de um leite matéria-prima a princípio para reduzir um inibidor da PG e, depois, para tratar do leite matéria-prima com PG, para tratar um leite matéria-prima com PG durante o tratamento do leite matéria-prima para reduzir um inibidor da PG, ou para tratar do leite matéria-prima para reduzir um inibidor da PG durante o tratamento do leite matéria-prima com PG. Por exemplo, quando da adição de um agente de quelação de cálcio, um material alcalino ou um agente de redução para reduzir um inibidor da PG, é possível adicionar o agente de quelação de cálcio, o material alcalino, o agente redutor e a PG a um leite matéria-prima ao mesmo tempo ou adicionar um em primeiro lugar e depois adicionar o outro.

O leite matéria-prima do leite bruto, do leite esterilizado em LTLT ou do leite esterilizado em HTST usados na presente invenção significa o leite bruto não processado obtido pela ordenha de um animal tal como uma vaca ou uma cabra, o leite obtido pela esterilização de LTLT ou HTST do leite bruto, do leite deste misturado, do leite deste desnatado ou parcialmente desnatado, o deste leite processado. Leite bruto significa o leite quando ordenhado, isto é, o leite não processado. O leite esterilizado de LTLT significa leite esterilizado por um método de esterilização de longo tempo em baixa temperatura (método LTLT), e. em termos concretos, leite esterilizado em 62 a 66 graus centígrados por 30 minutos ou esterilizado em 75 graus centígrados ou mais por 15 minutos ou mais. O leite esterilizado por HTST, que é esterilizado em 72 a 75 graus centígrados por 15 segundos, tem um efeito de esterilização quase igual ao método de LTLT. O leite desnatado significa leite do qual a maior parte do componente gorduroso é removida, e leite parcialmente desnatado é aquele em que o componente gorduroso é parcialmente removido.

Um tratamento eficaz para reduzir um inibidor de uma enzima de desamidação protéica de acordo com a presente invenção é uma adição de agente de quelação de cálcio, uma adição de material alcalino, uma adição de agente redutor, fracionamento e remoção da fração baixa em moléculas, ou manutenção da temperatura em 60 a 65 graus centígrados para a reação enzimática. E possível obter a reatividade da PG no mesmo nível do leite de UHT mediante o controle de uma condição de aquecimento de tal modo que a faixa do grau de desnaturação das proteínas do soro lácteo em um leite matéria-prima se tome de 40 a 75 %.

Quando da adição de um agente de quelação de cálcio, a quantidade da adição é preferivelmente de 0,05 a 0,5 g por 100 g de um leite matéria-prima. A regulação do tempo de adição é preferivelmente anterior à adição da PG a um leite matéria-prima ou no mesmo momento da adição da PG a um leite matéria-prima. Entretanto, é possível adicionar um agente de quelação de cálcio após a adição da PG a um leite matéria-prima, a menos que a PG seja desativada. No que diz respeito a um agente de quelação de cálcio, o citrato de sódio, o γ-poliglutamato de sódio ou o etilenodiaminatetraacetato tetrassódico são preferíveis. A forma de sal é preferível porque estes materiais, quando usados em outra forma que não em uma forma de sal, tendem a abaixar o pH e o leite matéria-prima tende a tomar-se instável, e a reatividade se toma mais baixa.

Quando da adição de um material alcalino, o carbonato de potássio, carbonato de sódio, fosfato trissódico, hidrogencarbonato de sódio, cálcio calcinado e arginina, como um aditivo alimentar, são incluídos como o material alcalino para a presente invenção. O leite matéria-prima pode ser ajustada até o pH 7 a 8 pela adição do material alcalino. Portanto, a quantidade da adição do material alcalino pode ser apropriadamente ajustada de acordo com o material alcalino selecionado; entretanto, pode ser preferível acrescentar 0,01 a 0,5 g por 100 g de um leite matéria-prima. A regulação do tempo de adição é preferivelmente anterior à adição da PG a um leite matériaprima, ou no mesmo momento da adição da PG a um leite matéria-prima. Entretanto, é possível adicionar o material alcalino após a adição da PG a um leite matéria-prima, a menos que a PG seja desativada. Ou pode ser possível ajustar o pH de um leite matéria-prima em 7 a 8 mediante a adição direta da solução de hidróxido de sódio. Após uma reação da enzima, o pH do leite matéria-prima pode ser deixado como estiver, ou pode ser retomado ao valor original mediante o uso de um ácido.

Quando da adição de um agente redutor, os compostos de tiol, tais como uma glutationa, cisteína, γ-glutamilcisteína ou extrato de levedura contendo o material em alta concentração, podem ser incluídos como o agente redutor, e as preparações contendo-os são também incluídas. A quantidade de adição do agente redutor é aplicada entre 0,0001 a 0,1 g por 100 g de leite matéria-prima. Quando do uso do extrato de levedura contendo o material em alta concentração, uma quantidade de extrato de levedura contendo 0,0001 a 0,1 g de agente redutor por 100 g de um leite matéria-prima pode ser adicionada a um leite matéria-prima. Quando da adição de quantidade de agente redutor menor do que a faixa indicada acima, é difícil obter-se o efeito. Por outro lado, quando da adição de quantidade de agente redutor mais elevada do que a faixa, isso pode causar à influência adversa ao sabor e, em alguns casos, o efeito para melhorar a reatividade é não mais intensificado mesmo quando a quantidade da adição seja aumentada excedendo de certo valor limite. No que diz respeito ao controle do tempo de adição de um agente redutor a um leite matéria-prima, pode ser possível adicionar um agente redutor a um leite matéria-prima antes ou após a adição da PG, a menos que a PG esteja desativada. Do ponto de vista do uso prático, um agente redutor é adicionado de preferência ao mesmo tempo da adição da PG. Igualmente do ponto de vista do efeito do agente redutor, preferivelmente o agente redutor é adicionado ao mesmo tempo da adição da PG, porque, quando o agente redutor é incubado em um leite matéria-prima por um longo tempo, a potência intrínseca de redução de um agente redutor pode ser reduzida.

Quando do fracionamento e remoção de uma baixa fração molecular de um leite matéria-prima, métodos tais como uma troca de íons, eletrodiálise, ultrafiltração (UF), método de osmose inversa, etc., podem ser preferíveis, os quais são industrialmente usados nas indústria de leite para fracionamento e remoção de uma baixa fração de moléculas. Particülarmente, um método com o uso de uma membrana de UF para remover uma baixa fração de molécula é preferível, pelo qual a água como um solvente e os solutos baixo em moléculas são permeados e os solutos altos em moléculas, tais como as proteínas, são mantidos. Por exemplo, é eficiente remover uma fração baixa em moléculas com o uso de uma membrana de UF tendo um peso molecular de 10.000 a 20.000. Uma membrana de diálise pode ser usada para um uso experimental.

Os inventores encontraram outro método sem o uso de aditivos ou de fracionamento para melhorar a reatividade de um leite matéria-prima. O método é um controle da temperatura de reação. A faixa de temperatura ótima para a PG é, como descrito no Documento Não Patente 2, ao redor de 50 a 60 graus centígrados; entretanto, a estabilidade da PG decresce abruptamente a partir da temperatura ao redor de mais do que 50 graus centígrados. De acordo com a presente invenção, foi descoberto que uma diferença da reatividade entre um leite matéria-prima tendo história de baixo calor e o leite de UHT se toma pequena pela reação do leite com a PG na (faixa de) temperatura de 60 a 65 graus centígrados, em que começa a redução abrupta da estabilidade da PG. Assim sendo, a reação não necessita de um longo tempo, mas leva um tempo curto tal como de 5 a 60 minutos para terminar a reação enzimática.

Uma espécie da enzima de desamidação protéica usada para a presente invenção não é limitada, contanto que ela possua uma função para atuar o grupo de amida em uma proteína diretamente, e cortar uma ligação peptídica e desamidar a proteína sem ligação. Como um exemplo de uma tal enzima, uma enzima desamidando uma proteína derivada de Criseobactéria, Flavobactéria ou Empedobactéria conforme apresentado nas JP 2000-50887A (Documento de Patente 1), JP 2001-21850A (Documento de Patente 2) e WO 2006/075772 (Documento de Patente 4), uma glutaminase protéica, comercialmente disponível no mercado, derivada da Criseobactéria, etc., são exemplificadas, mas não limitadas a estas. Preferivelmente, uma enzima derivada da Criseobactéria é usada. No que diz respeito à transglutaminase, não se acha incluída em uma enzima de desamidação protéica de acordo com a presente invenção, porque, quando a transglutaminase atue sobre materiais alimentares, ela acarreta principalmente uma reação de reticulação nas proteínas e quase nenhuma reação de desamidação.

Uma enzima de desamidação protéica pode ser preparada a partir de um líquido de cultura por microorganismo que produza a enzima de desamidação protéica. Métodos de separação e purificação de proteína publicamente conhecidos (tais como a centrifugação, a concentração de UF, salting out (precipitação da proteína por saturação de sal), várias espécies de cromatografia com resina trocadora de íons, etc.) podem ser usados como o método de preparação de uma enzima de desamidação protéica. Por exemplo, o líquido de cultura é centrifugado para separar células bacterianas, e depois salting-out e cromatografia, etc. podem ser combinadas para se obter enzimas alvo. Quando da coleta de enzimas do interior das células bacterianas, as células bacterianas podem ser esmagadas por um processamento de pressão ou processamento ultrassônico, por exemplo, e depois separadas e purificadas como descrito acima para se obter as enzimas alvo. As células bacterianas podem ser recuperadas de um líquido de cultura por filtração ou centrifugação, etc., antes das etapas de processamento acima explanadas (tal como esmagamento das células bacterianas, separação e purificação). As enzimas podem ser pulverizadas por um método de secagem como uma secagem por congelamento ou secagem a vácuo, etc., e um diluente ou agente auxiliar de secagem apropriados podem ser usados na etapa de secagem.

A atividade da enzima de desamidação protéica é medida pelas seguintes etapas de acordo com a presente invenção:

(1) 100 μΐ de solução aquosa contendo a enzima de desamidação protéica são adicionados a 1 ml de solução tampão de ácido fosfórico 0,2 M (pH 6,5) contendo 30 mM de Z-Gln-Gly (Peptide Institute, Inc.), e incubados por 10 minutos em 37 graus centígrados, e depois a reação é cessada pela adição de 1 ml de solução de TCA 0,4 M.

(2) Uma quantidade de amônia produzida pela reação em uma solução reagida de (1) é medida pelo uso do Ammonia-test-Wako (fabricado e vendido a varejo pelas Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

(3) Uma solução branca é preparada de tal modo que uma solução sem a enzima seja incubada por 10 minutos em 37 graus centígrados e depois 1 ml da solução de TCA 0,4 M e 100 μΐ de uma solução aquosa contendo a enzima de desamidação protéica são adicionados neste ordem.

(4) A concentração da enzima é ajustada pela diluição com uma solução tampão de ácido fosfórico (pH 6,5) de tal modo que uma absorbância em 630 nm ocorra na faixa de Δ0,2 a 0,8.

(5) A atividade é medida por uma unidade (U) que indica a quantidade da enzima que pode produzir um pmol de amônio em um minuto. A atividade enzimática é calculada pela seguinte expressão:

Atividade enzimática (U/ml) = (Es-Eb) * F * 0,123 x DF em que:

Es: absorbância de uma enzima de solução reagida,

Eb: absorbância de um branco,

F: fator (a recíproca da inclinação de uma linha reta de uma curva de calibração quanto à solução padrão de amônio), e

DF: relação de diluição de uma solução enzimática.

De acordo com a presente invenção, uma quantidade de PG adicionada é preferivelmente de 0,01 a 100 U por 1 g de proteína do leite em um leite matéria-prima e, mais preferível, de 0,1 a 20 U. Quando da adição de 0,1 U ou menos, é difícil obter um resultado desejado e, quando da adição de 20 U ou mais, uma vantagem econômica se toma pequena. A temperatura de reação pode geralmente ser estabelecida em cerca de 0 a cerca de 65 graus centígrados, e o tempo de reação pode ser estabelecido em cerca de 1 minuto a cerca de 40 horas. Entretanto, é preferível reagir por cerca de 5 minutos a cerca de 20 horas em cerca de 5 a 65 graus centígrados.

É possível ajustar o grau de desamidação da proteína do leite mediante a PG, isto é, o grau de modificação do leite de acordo com as características materiais dos produtos lácteos requeridos mediante o controle da quantidade de PG, do tempo de reação, da temperatura de reação, e outros. Uma quantidade de amônio produzida pela reação de desamidação é medida para determinar o grau de desamidação da proteína do leite. Para cessar a reação, nenhuma limitação é requerida, e as condições de esterilização usadas para fabricar produtos lácteos são geralmente empregadas. Naturalmente, é possível obter o efeito da presente invenção sem tal processo de esterilização. O leite matéria-prima modificada obtida desta maneira é incluída como um produto lácteo produzido pelo método da presente invenção. Os produtos lácteos que tenham textura densa e cremosa produzidos pela presente invenção, os quais sejam produzidos de um leite matéria-prima tendo história de baixo calor, cuja baixa reatividade com PG seja melhorada, mediante tratamento com PG, pode ser exemplificada como a seguir. Eles são iogurte, queijo, sorvete, leite condensado, leite condensado desnatado, leite em pó integral, leite desnatado em pó, proteína de leite integral, soro do leite em pó, bebida bacteriana de ácido láctico, bebida à base de leite, e outras. Além disso, os alimentos processados, um tanto como fonte branca, adicionados com um ingrediente secundário tal como sal, açúcar, adoçante, condimentos etc. são incluídos na presente invenção.

A presente invenção será explanada em detalhes com exemplos experimentais e exemplos ilustrativos.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 1

Para confirmar a diferença da reatividade com a PG entre o leite esterilizado com LTLT (66 graus centígrados, 30 minutos: leite esterilizado em baixa temperatura de Takanashi) e leite esterilizado com UHT (130 graus centígrados, 2 segundos: leite de Magokoro Rakuno 3,6), a cada leite foram adicionadas 0 a 0,4 U/,1 de PG (produto purificado preparado por um método apresentado no Documento Não Patente [Appl Microbiol Biotechnol (2008) 78: 67-74] (Referência 1), atividade relativa de 120 U/mg de proteína) e reagido em 50 graus centígrados por 60 minutos. Como mostrado na Figura 1, o leite LTLT tinha baixa reatividade em comparação com o leite UHT e obteve-se apenas um quinto a um quarto da quantidade de reação pela mesma quantidade de enzima. E estimado o fato de que um inibidor contido em uma baixa fração de moléculas no leite é a causa, conforme indicado pelos seguintes exemplos experimentais 2 a 4, e é um objeto da presente invenção remover o fator de inibição e melhorar a reatividade de um leite matéria-prima. A descrição da Referência 1 é aqui incorporada em sua totalidade como referência.

EXEMPLO EXPERIMENTAL 2

O produto da PG purificado descrito no Exemplo Experimental 1 (50 U/ml) foi diluído por 100 vezes com o uso dos seguintes solventes (a) a (c).

(a) : 20 mM de solução tampão de ácido fosfórico (pH 6,3), (b) : leite esterilizado LTLT (66 graus centígrados, 30 minutos: leite esterilizado de baixa temperatura de Takanashi), (c) ultrafiltração (Amicon, Centriprep YM-10; corte por peso molecular 10.000) do sobrenadante da supercentrífuga de (b). A atividade da PG foi medida por um método descrito mais acima no presente relatório descritivo, com o uso de Z-Gln-Gly como um substrato, e os resultados são apresentados na Tabela 1. Quando a PG foi diluída por uma solução tampão de ácido fosfórico, a atividade foi de 0,5 u/ml, e quando diluída por leite esterilizado em LTLT, a atividade desceu a cerca de 12 %. Quando a PG foi diluída por uma baixa fração de moléculas obtida pela ultrafiltração do leite esterilizado em LTLT, a atividade desapareceu completamente. Os resultados indicam que um inibidor da PG existe no leite esterilizado em LTLT, especialmente na baixa fração de moléculas.

TABELA 1

Solvente para diluir	Atividade	Atividade
enzima	(U/ml)	relativa (%)
(a) 20 mM de solução
tampão de ácido fosfórico	0,501	100
(b) leite esterilizado em
baixa temperatura	0,062	12,3
(c) ultrafiltrado de (b)	0	0

EXEMPLO EXPERIMENTAL 3

A seguir, um exemplo será explanado, no qual a atividade da

PG se recupera pelo tratamento da fração baixa em moléculas obtida por ultrafiltração do leite esterilizado LTLT com calor ou um agente redutor. O produto de PG purificada descrito no Exemplo Experimental 2 (0,5 U/ml) foi diluído por 100 vezes com ultrafiltrado tratado com bloco do calor em 90 graus centígrados por 5 minutos ou 1,0 mM de glutationa reduzida como um agente redutor (correspondente a 0,03 g por 100 g de um leite matéria prima).

A atividade da PG foi medida como o Exemplo Experimental 2 e os resultados são mostrados na Tabela 2. O ultrafiltrado eliminou quase toda a atividade da PG; no entanto, a atividade da PG foi recuperada drasticamente pelo tratamento de calor ou pela adição de um agente redutor. O mesmo resultado foi obtido quando do uso da micela de caseína (pelota precipitada obtida por ultracentrifugação (Hitachi-Koki, Ltd., Himac CP80WX, 28.600 rpm, 60 minutos, 25 graus centígrados) no leite ao invés de Z-Gln-Gly como um substrato (dados não são mostrados). A reatividade da micela de caseína, como uma proteína principal no leite matéria-prima, com PG, foi boa e foi confirmado que a baixa reatividade da PG foi causada pelo solvente.

TABELA 2

Solvente para diluição da enzima	Atividade (U/ml)	Atividade relativa (%)
(1)20 mM de solução tampão de ácido fosfórico	0,540	100
(2) ultrafiltrado do leite esterilizado em baixa temperatura	0,016	2,96
(3) (2)+calor (90 graus C, 5 minutos)	0,432	80,0
(4) (2)+l mM glutationa reduzida	0,552	102

Alguns métodos serão esclarecidos como exemplos, o que melhora a reatividade da PG ao leite tendo história de baixo calor pela eliminação ou redução de um inibidor existente em uma baixa fração de moléculas de leite esterilizado em baixa temperatura; entretanto, a presente invenção não fica limitada por estes exemplos.

EXEMPLO 1

Materiais de quelação de cálcio foram adicionados ao leite 10 esterilizados em LTLT (66 graus centígrados, 30 minutos: Takanashi leite esterilizado em baixa temperatura) apropriadamente. A reatividade da PG a cada amostra de leite foi medida como segue. A cada amostra de leite foi acrescentado 0,4 U/ml (correspondente a cerca de 12 u por 1 g de proteína do leite) da PG (um produto purificado descrito no Exemplo Experimental 1) e incubou-se em 50 graus centígrados por 60 minutos. A reação enzimática foi cessada pela adição de 12 % de TCA, cuja quantidade é a mesma da solução de reação, e centrifugada (12.000 rpm, 5 graus centígrados, 5 minutos) para medir a quantidade de amônio no sobrenadante com o uso de um kit de medição quantitativa do amônio, F-kit (Roche). O leite adicionado com vários materiais de quelação de cálcio aumentou a reatividade da PG, em comparação com o leite não adicionado com o material de quelação de cálcio (controle) conforme mostrado na Tabela 3.

TABELA 3

Aditivo	Reatividade da PG (%)
Nenhum aditivo adicionado	22,1
(controle)
20 mM de EDTA	55,9
Citrato trissódico 0,2 %	40,5
Citrato trissódico 0,4 %	47,3
Citrato trissódico 0,5 %	42,8
0,4 % γ-PGA	49,8
0,5 % γ-PGA	58,1
0,75 % γ-PGA	79,2
1 % γ-PGA	96,1

EXEMPLO 2

Materiais alcalinos foram adicionados ao leite esterilizado em LTLT (66 graus centígrados, 30 minutos: Takanashi leite esterilizado em baixa temperatura) apropriadamente de modo a ajustar o pH em 7 a 8,4. A reatividade da PG para cada amostra de leite foi medida como no Exemplo 1. Como mostrado na Tabela 4, a reatividade da PG para o leite adicionado com vários materiais alcalinos aumentou, dependendo do valor do pH, em comparação com o leite sem material alcalino (controle).

TABELA 4

Aditivo	Concentração	pH	Reatividade da PG (%)
Sem aditivo (controle)	-	6,67	13,6
Carbonato de Potássio	0,13 %	7,51	62,5
Carbonato de Sódio	0,10%	7,38	61,7
	0,15%	7,87	72,7
	0,20 %	8,38	65
Fosfato Trissódico	0,15%	7,41	54,9
	0,20 %	7,63	65,8
	0,25 %	7,94	72
Carbonato hidrogenado de sódio	0,30 %	7,22	58,1
	1,00%	7,57	57,8
cálcio calcinado	0,04 %	7,32	54,9
	0,05 %	7,61	72,4

	0,06 %	7,92	83,1
Arg (amino-	0,20 %	7,24	54,1
ácido
	0,25 %	7,45	67
	0,30 %	7,69	76,2
	0,40 %	8,18	75

EXEMPLO 3

Glutationa ou cisteína (Nacalai Tesque, Inc.), como um agente redutor do tipo tiol, foram adicionadas ao leite esterilizado em LTLT (66 graus centígrados, 30 minutos: Takanashi leite esterilizado em baixa temperatura) apropriadamente. A reatividade da PG a cada leite foi medida como no Exemplo 1. Como mostrado na Figura 2, a reatividade da PG aumentou por ambos os agentes, dependendo da quantidade de adição e da reatividade recuperada em cerca de 80 a 90 % pela adição do agente em 0,001 %. Da mesma maneira, a reatividade da PG para ó leite foi medida pela adição do extrato de levedura da glutationa (AROMILD UG8, Kohjin Co., Ltd.) ao leite em diferentes concentrações. Como mostrado na Figura 3, a reatividade recuperou cerca de 70 % por 0,02 % ou mais do extrato, e quase 100 % por 0,05 % ou mais.

EXEMPLO 4

O leite esterilizado em LTLT (66 graus centígrados, 30 minutos: Takanashi leite esterilizado em baixa temperatura) foi centrifugado (8.000 rpm, 1 hora, 10 graus centígrados) para remover parcialmente a gordura. O leite obtido foi concentrado por cerca de três vezes com o uso de uma membrana de ultrafiltração (Sartorius, Hydrosart membrane, corte por MW 10.000). O produto PG purificado descrito no Exemplo Experimental 1 foi adicionado de tal modo que as quantidades de adição da enzima por proteína do leite se tomaram iguais e a reatividade da PG foi medida (condição de reação: 50 graus centígrados, 1 hora). Uma quantidade de amônio produzida pela reação foi convertida naquilo por proteína e a reatividade foi comparada uma com a outra. Foi observado que o leite concentrado aumentou a reatividade em cerca de três vezes, conforme mostrado na Figura 4. Além disso, pela dialisação do leite com o uso de uma membrana de dialisação de celulose (corte por peso molecular 8.000) durante uma noite em 4 graus centígrados, a reatividade da PG aumentou mais. Os resultados mostraram que a reatividade aumenta pela remoção de uma baixa fração molecular no leite.

EXEMPLO 5

Uma relação entre a temperatura e a quantidade de PG reagida em uma reação entre o leite esterilizado em PG e LTLT (66 graus centígrados, 30 minutos: Takanashi leite esterilizado em baixa temperatura) foi determinada e observou-se que a relação foi diferente daquela do leite em UHT como mostrado na Figura 5. Em um caso com o uso do leite em UHT, a reatividade alcançou seu maior nível na faixa de temperatura de 50 a 60 graus centígrados e a reatividade declinou linearmente acima dos 60 graus centígrados. Por outro lado, quando do uso do leite em LTLT, foi observado que a reatividade ficou mais baixa do que aquela do leite em UHT em toda a faixa de temperatura; no entanto, a reatividade aumentou bruscamente ao redor da temperatura de 60 a 65 graus centígrados e a reatividade foi recuperada em 80 a 90 % daquela do leite em UHT.

EXEMPLO 6

De acordo com a presente invenção, é possível fornecer produtos lácteos de preço inferior e qualidade superior mediante o uso de meios para melhorar a reatividade de um leite matéria-prima tendo baixa história de calor com a PG. Será explanado que todos os meios acima mencionados podem ser aplicados à alimentação prática, tomando o iogurte como um exemplo.

Ao leite esterilizado em LTLT (66 graus centígrados, 30 minutos: Takanashi leite esterilizado em baixa temperatura; proteína do leite

3,2 %, gordura do leite 3,7 %) foram acrescentados ao mesmo tempo o produto PG purificado descrito no Exemplo Experimental 1 em 1 U por 1 g de proteína do leite no leite matéria-prima e citrato trissódico (um aditivo alimentar) em 0,4 % em relação ao leite matéria-prima e mantidos por 1 hora para a reação em 50 graus centígrados. Depois disso ele foi aquecido a 95 graus centígrados e mantido por 1 minuto para cessar a reação e esterilizar, e depois esfriou-se até 47 graus centígrados imediatamente. O iniciador bacteriano de ácido láctico comercialmente disponível “Yo-Flex YC-370” (Chr. Hansen) foi adicionado em 0,0063 % ao leite matéria-prima, colocado em caixas e fermentado em 44 graus centígrados até que o pH se tomasse na faixa de 4,5 a 4,6 para produzir iogurte (amostra da presente invenção).

Algumas amostras de controle foram preparadas do mesmo modo para comparação. Elas são uma amostra que foi simplesmente incubada por 1 hora em 50 graus centígrados (amostra de controle 1), uma amostra que foi misturada com citrato trissódico em 0,4 % com um leite matéria-prima e incubada por 1 horas em 50 graus centígrados (amostra de controle 2), e uma amostra que foi adicionada com PG em 3,5 U a 1 g de proteína do leite e incubada por 1 hora em 50 graus centígrados (amostra de controle 3). Elas foram mantidas sob refrigeração (em 5 graus centígrados) e as propriedades físicas (área de interrupção e adesividade), após 1 dia, foram medidas. Um analisador de textura (Stable Macro Systems, LTD) foi usado e as condições de teste foram: velocidade do teste de 1 mm/s, êmbolo tipo placa tendo um diâmetro de 10 mm, e 10 % de compressão. Além disso, um teste sensorial foi realizado por cinco painelistas treinados. Os resultados são apresentados na Tabela 5.

TABELA 5

	Condições	Tratamento	Area de interrupção	Adesivi- dade	Teste sensorial (comentário)
Amostra de controle 1	50 °C, 1 hora	Sem aditivo	20,6 ± 0,63	4,85 ± 0,33
Amostra de controle 2	50 °C 1 hora	Citrato trissódico 0,4 %	15,8 ±0,31	5,62 ± 0,40	Mais macio do que a amostra de controle 1
Amostra de controle 3	50 °C 1 hora	PG (3,5 u/GP)	20,0 ± 0,39	5,06 ± 0,37	Não tão diferente do que a amostra de controle 1
Presente Invenção	50 °C 1 hora	Citrato trissódico 0,4 % +PG (3,5 u/GP)	7,84 ±0,21	7,05 ± 1,5	Muito mais macio do que amostras de controle 1 ou 2 e suave (cremoso)

EXEMPLO 7

3,2 %, gordura do leite 3,7 %) foram adicionados o produto de PG purificado descrito no Exemplo experimental 1 em 1 U por 1 g de proteína do leite e o AROMILD UG8 (Kohjin Co., Ltd., extrato de levedura de glutationa, daqui por diante designado “YE”) em 0,01 % e 0,02 % em relação ao leite matériaprima (os conteúdos de GSH relativos a 100 g do leite matéria-prima são de cerca de 0,0007 g e 0,0014 g, respectivamente) ao mesmo tempo, e agitados por 1 hora para a reação em 50 graus centígrados. Depois disso eles foram aquecidos a 95 graus centígrados e mantidos por 1 minuto para cessar a reação e esterilizar o leite matéria-prima e depois esfriados até 47 graus centígrados imediatamente. O iniciador bacteriano de ácido láctico comercialmente disponível “Yo-Flex YC-370” (Chr. Hansen) foi adicionado em 0,0063 % ao leite matéria-prima, colocado em caixas e fermentado em 44 graus centígrados até que seu pH se tomasse de 4,5 a 4,6 para produzir iogurte (amostras 1 e 2 da presente invenção). Iogurtes comparativos foram preparados da mesma maneira para comparação sem a adição de nenhum PG nem YE (amostra de controle 1) e pela adição de PG apenas (amostra de controle 2). Foi confirmado que as amostras obtidas pela adição de YE apenas de 0,01 % e 0,02 % tomaram os resultados quase iguais aos da amostra de controle 1. Após a fermentação, eles foram mantidos sob refrigeração (em 5 graus centígrados) e as propriedades físicas (área de interrupção e adesividade), após 1 dia, foram medidas. Os métodos para a medição das propriedades físicas e o teste sensorial são os mesmos explanados no Exemplo 6.

Como indicado pelos resultados (Figura 6) das medições das propriedades físicas, a amostra adicionada com PG apenas (amostra de controle 2) apresentaram pouca diferença da amostra isenta de aditivo (amostra de controle 1). Por outro lado, uma redução na área de interrupção e um aumento na área de adesividade foram claramente observados das amostras 1 e 2 da presente invenção. Isto significa que as propriedades físicas do iogurte se tomaram suaves e cremosas e que os resultados correspondem aos resultados do teste sensorial apresentado na Tabela 6. Como um resultado, foi provado que um efeito da PG mais elevado do que anteriormente pode ser obtido pela adição do extrato de levedura da glutationa e que o efeito pode ser controlado por uma quantidade do extrato a ser adicionado.

TABELA 6

	Observações
Amostra de Controle 1
Amostra de Controle 2	Pouca diferença da amostra de controle 1
Presente Invenção 1	Mais suave do que a amostra de controle 1 e textura cremosa
Presente Invenção 2	Ainda mais suave do que a presente invenção 2 (sic 1) e textura cremosa

EXEMPLO 8

O leite esterilizado em LTLT (66 graus centígrados, 30 minutos: Takanashi leite esterilizado em baixa temperatura; proteína do leite

3,2 %, gordura do leite 3,7 %) foi parcialmente desnatado por centrifugação (8.000 rpm, 1 hora, 10 graus centígrados) e depois concentrado por 4 vezes com o uso da membrana de ultrafiltração (Sartorius, membrana Hydrosart, corte por MW 10.000) para obter leite condensado viscoso. O produto de PG purificada descrito no Exemplo Experimental 1 foi a ele adicionado em 8 U por 1 g de proteína do leite e reagido em 50 graus centígrados por 60 minutos. O leite condensado coagulado, e alimento semelhante a queijo muito denso e suave, foram obtidos. Um leite condensado ao qual nenhuma PG fora adicionada foi também reagido para comparação; entretanto, o leite condensado não coagulou e permaneceu em um estado líquido. Como explicado acima, um leite condensado obtido por condensação de dessalinização pode ser tratado com PG eficazmente para produzir produtos lácteos como queijo tendo textura suave.

EXEMPLO 9

3,2 %, gordura do leite 3,7 %) foi adicionado o produto de PG purificado descrito no Exemplo Experimental 1, em 10 U por 1 g de proteína do leite e reagido em 65 graus centígrados por 60 minutos. O leite reagido foi aquecido a 85 graus centígrados em um banho de água em ebulição para desativar a enzima, e depois foi esfriado rapidamente para tomar o leite desamidado [amostra experimental (a)]. Uma amostra obtida da mesma maneira, exceto que nenhuma enzima tenha sido adicionada [amostra experimental (b)], e uma amostra obtida pela adição do produto de PG purificado ao leite esterilizado em LTLT por 10 U por 1 g de proteína do leite e reagindo em 50 graus centígrados por 60 minutos [amostra experimental (c)], foram também preparadas para comparação. As concentrações do amônio no leite após a reação foram de 11,1 mmol/litro na amostra experimental (a), 0,12 mmol/litro na amostra experimental (b), e 2,05 mmol/litro na amostra experimental (c).

100 g de ovos (correspondente a cerca de 2 ovos) e 30 g de açúcar foram misturados e agitados e adicionados com as amostras experimentais (a) a (c) que foram aquecidas a cerca de 40 graus centígrados. Foram escoados em taças de alumínio através de um chinois e aquecidos em um vapor através de uma chama média por 15 minutos. Após isso, foram esfriados, refrigerados por um dia e usados para um teste sensorial (n = 3). Como mostrado na Tabela 7, em comparação com os pudins (exemplos comparativos 1 e 2) feitos do leite das amostras experimentais (b) e (c), um pudim (da presente invenção) feito do leite da amostra experimental (a) apresentou a cor amarela mais escura de um ovo e seção transversal lisa tendo poucos poros. A textura foi favorável, porque ela ficou muito lisa e se pôde sentir mais sabor de leite. A qualidade do pudim depende da espécie do leite usado, e o pudim com o uso de leite esterilizado em baixa temperatura é popular, porque nós podemos apreciar o sabor natural do leite bruto não estragado. De acordo com a presente invenção, foi confirmado que um pudim tendo sabor delicioso e textura suave pode ser produzido pelo ajuste da temperatura de reação do leite em LTLT com a PG em 65 graus centígrados para manter a alta reatividade da PG.

TABELA 7

		Observações livres (n = 3)
Experiência 1 amostra (a)	Amostra da Presente Invenção	Mais amarelecimento do que as amostras comparativas 1 e2 Textura suave, toque suave ao introduzir uma colher, e seção transversal suave com poucos poros Cheiro fraco da clara de ovo, sensação de sabor de leite (sensação muito amarela de um ovo)
Experiência 1 amostra (b)	Amostra Comparativa 1	Levemente esbranquiçado Um tanto duro (tão duro quanto a clara do ovo cozido) Forte cheiro da clara de ovo, fraco sabor de leite
Experiência 1 amostra (c)	Amostra Comparativa 2	Quase nenhuma diferença da amostra comparativa 1

EXEMPLO 10

O leite bruto ordenhado foi desnatado por um separador em 40 graus centígrados. O leite desnatado foi esterilizado em alta temperatura e curto tempo (HTST) (75 graus centígrados, 15 segundos) com o uso de um esterilizador de placa. O leite desnatado resultante foi pré-incubado em 55 graus centígrados, e um extrato de levedura contendo glutationa (Kohjin Co., Ltd., AROMILD UG8) foi adicionado em 0,02 % (p/v) ao leite e ao mesmo tempo foi adicionada PG (proteína glutaminase, Amano Enzyme Inc.) à razão de 1,5, 4,5 e 15 unidades (doravante a unidade é designada como “u/gp”) por 1 g de proteína do leite e reagida por uma hora. O leite foi aquecido até 80 graus centígrados em um banho de água quente para desativar a enzima (amostra da presente invenção). Uma amostra adicionada com PG à razão de 1,5, 4,5 e 15 u/gp sem adição do extrato de levedura contendo glutationa à razão de 0,02 % (p/v) ao leite foi preparada para referência (amostra de controle). Outra amostra foi preparada para comparação para o que o leite desnatado esterilizado em HTST (75 graus centígrados, 15 segundos) foi adicionalmente aquecido (até 95 graus centígrados) e adicionado com PG em 1,5, 4,5 e 15 u/gp e reagido em 55 graus centígrados por uma hora (amostra comparativa). A quantidade do amônio produzida pela reação foi medida para cada amostra de controle, a amostra da presente invenção e a amostra comparativa. Quando nenhuma PG era adicionada, uma quantidade de amônio no leite foi de 0,38, 0,38 e 0,34 mM para a amostra de controle, a amostra da presente invenção e a amostra comparativa, respectivamente. Por outro lado, quando a mesma quantidade de PG era adicionada, uma quantidade de amônio produzida na amostra da presente invenção foi aparentemente mais elevada em comparação com a amostra de controle, e a quantidade de reação foi quase a mesma daquela da amostra comparativa, conforme mostrado na Tabela 8. Os resultados indicam que é possível aumentar a reatividade da PG sem tratamento de calor adicional pela adição de um extrato de levedura contendo glutationa em 0,02 % (p/v) ao leite.

TABELA 8

PG (u/gp)	Quantidade de amônio produzido (mM)
amostra de controle	amostra da presente invenção	Amostra Comparativa
1,5	1,96	3,71	3,60
4,5	5,74	10,15	9,96
15	13,88	15,85	16,13

Amostra de controle: leite desnatado (tratamento em HTST), sem adição

Amostra da presente invenção: leite desnatado (tratamento em HTST), extrato de levedura com elevado conteúdo de glutationa, AROMILD 0,02 % adicionado

Amostra comparativa: leite desnatado (tratamento em HTST, tratamento de calor até 95 graus centígrados), sem adição EXEMPLO 11

O leite desnatado da presente invenção preparado pelo método do Exemplo 10 foi pulverizado por um método de secagem por pulverização. Uma bebida à base de leite fracamente acídica foi preparada com o uso do leite em pó desnatado de acordo com a composição da Tabela 9. A água foi medida por um jarro e o leite em pó desnatado e açúcar granulado foram adicionados à água medida e dissolvida, e 10 % da solução de ácido cítrico (anidro) foram gotejados com agitação em 3.000 rpm com o uso de TK Robomix (Tokushu Kika Kogyo, K. K.). Imediatamente a velocidade de rotação foi aumentada e a solução foi agitada por 3 minutos em 8.000 rpm até dissolução completa. A solução resultante foi escoada em uma garrafa de PET resistente ao calor (volume de 500 ml) por fração e tratada pelo calor até 96 graus centígrados. Depois disso, foi verificado se ou não ocorrera à precipitação. Como mostrado na Tabela 10, a precipitação ocorreu na bebida produzida pelo leite em pó desnatado sem tratamento com PG e na bebida tratada com PG em 1,5 u/gp. Entretanto, a precipitação foi notavelmente suprimida nas bebidas tratadas com PG em 4,5 u/gp e 15 u/gp, e a solução foi mantida dispersa. Os valores finais do pH das amostras da presente invenção foram de 5,2 a 5,3 enquanto na amostra de controle de controle o pH foi de 5,09. Não obstante a quantidade de ácido cítrico adicionada tenha sido a mesma, o valor do pH após a dissolução da amostra da presente invenção foi mais elevado em 0,2 a 0,3 do que aquele da amostra sem tratamento. O fato revelou que o leite em pó desnatado preparado pela presente invenção tem elevada capacidade de tampão. TABELA 9

Material	Composição (%)
Leite em pó desnatado	3,2 %
Açúcar granulado	5,0 %
10 % em peso de ácido cítrico	1,15 %
(anidro)
Agua	90,65 %
100%
TABELA 10

	PG (u/gp)	pH final	Precipitação após aquecimento
Amostra de controle	0	5,09	muita x
Amostra Comparativa	1,5	5,18	muita x
Presente Invenção 1	4,5	5,28	pouca o
Presente Invenção 2	15	5,32	quase zero O

A seguir, um efeito do pH das bebidas à base de leite para prevenir a precipitação foi testado com o uso de leite em pó desnatado da amostra de controle e da amostra 2 (tratada com PG em 15 u/gp) da presente invenção. A quantidade de ácido cítrico foi ajustada de modo a tomar o pH entre 5,0 e 5,6 com base na Tabela 10, e água foi adicionada de modo a levar o peso total a 100 %. Após a preparação, as soluções foram escoadas em garrafas de PET resistentes ao calor e tratadas pelo calor até 96 graus centígrados. Como mostrado na Tabela 11, as bebidas da amostra de controle antes do aquecimento foram dispersas em clara no pH de 5,55 e 5,63; entretanto, elas se precipitaram e se agregaram após o aquecimento. Por outro lado, no que diz respeito às bebidas de amostra da presente invenção, a precipitação foi notavelmente suprimida no pH de 5,2 ou mais indiferente do tratamento de calor. Como pode ser observado pelos resultados das bebidas de amostras de controle, geralmente a estabilidade da proteína do leite na faixa de fraca acidez é baixa. Entretanto, foi provado que a estabilidade do leite em pó desnatado pode ser notavelmente melhorada por tratamento prévio com PG como mostrado pela amostra da presente invenção. Os resultados sugerem que a presente invenção seja útil para produzir bebidas à base de leite contendo café, bebidas à base de leite fracamente acídicas contendo fruta, etc.

TABELA 11

PH	bebida da amostra de controle	Amostra 2 da presente invenção
Antes do aquecimento	Após o aquecimento	Antes do aquecimento	Após o aquecimento
5,06	X	X	X	X
5,11	—	—	X	X
5,20	X	X	o	o
5,24	—	—	©	o
5,33	X	X	©	©
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APLICABILIDADE INDUSTRIAL

De acordo com a presente invenção, é possível obter leite modificado mediante o uso de uma enzima de desamidação protéica eficazmente até de um leite matéria-prima tendo baixa história de calor, tal como o leite bruto que tenha baixa reatividade com uma enzima de desamidação protéica. Além disso, pelo uso do leite modificado como um leite matéria-prima, é possível produzir produtos lácteos que tenha textura densa e cremosa. Assim sendo, a presente invenção é muito útil no campo de alimentação.

Deve-se observar que outros objetos, características e aspectos da presente invenção se tomarão evidentes na descrição inteira e que modificações poderão ser feitas sem que se afaste do ponto essencial e do escopo da presente invenção conforme apresentados neste relatório descritivo e nas reivindicações a ele anexas.

Igualmente deve ser observado que qualquer combinação dos elementos, matérias e/ou itens apresentados e/ou reivindicados pode situar-se sob as modificações acima mencionadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir leite modificado, caracterizado pelo fato de que inclui: uma etapa de tratar de um leite como matéria prima de leite bruto, leite esterilizado em LTLT ou leite esterilizado em HTST, para reduzir

5 um inibidor de uma enzima de desamidação protéica; e uma etapa de ainda tratar o leite matéria-prima com uma enzima de desamidação protéica.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento para reduzir um inibidor da uma enzima de desamidação protéica é uma adição de um agente de quelação de cálcio ao

10 leite matéria-prima em 0,2 a 1,0 g por 100 g de leite matéria-prima.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o agente de quelação de cálcio é citrato de sódio, γ-poliglutamato de sódio ou tetra-acetato de etilenodiamina tetra-sódica.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 15 fato de que o tratamento para reduzir um inibidor de uma enzima de desamidação protéica é uma adição de um material alcalino ao leite matériaprima em 0,01 a 0,5 g por 100 g do leite matéria-prima.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o material alcalino é hidróxido de sódio, carbonato de potássio,

20 carbonato de sódio, fosfato trissódico, hidrogencarbonato de sódio, cálcio calcinado ou arginina.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento para reduzir um inibidor de uma enzima de desamidação protéica é uma adição de um material redutor ao leite matéria25 prima em 0,0001 a 0,1 g por 100 g do leite matéria-prima ou uma adição do extrato de levedura contendo um agente redutor em 0,0001 a 0,1 g por 100 g do leite matéria-prima.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o material redutor é glutationa, cisteína ou γ-glutamilcisteína.

Petição 870180011173, de 09/02/2018, pág. 11/13
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento para reduzir um inibidor de uma enzima de desamidação protéica é uma remoção de uma baixa fração molecular, um peso molecular da qual seja de 10.000 ou menos, do leite matéria-prima.

5 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a remoção de uma baixa fração molecular é realizada com o uso de uma membrana de ultrafiltração.

Petição 870180011173, de 09/02/2018, pág. 12/13

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