WO2007114230A1 - チオレドキシン産生促進剤 - Google Patents

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WO2007114230A1
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thioredoxin
vaccinia virus
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inoculated
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Hajime Nakamura
Junji Yodoi
Yuma Hoshino
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Kyoto University
Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Definitions

  • the present invention relates to a novel pharmaceutical use of an extract of inflamed tissue inoculated with vaccinia virus, and specifically relates to an agent for promoting thioredoxin production containing an extract of inflamed tissue inoculated with vaccinia virus as an active ingredient.
  • Thioredoxin was discovered as a coenzyme that donates hydrogen ions to ribonucleotide reductase, an enzyme essential for DNA synthesis in E. coli.
  • Thioredoxin has an active site with -Cys-Gly-Pro-Cys-, creating an oxidized form and dithiol (-SH-SH) that form a disulfide (SS) bond between two cysteine residues It is an intracellular redox regulator that exists in a reduced form.
  • thioredoxin is induced by ultraviolet rays, radiation, oxidants, viral infections, ischemia-reperfusion injury, and administration of anticancer agents.
  • Thioredoxin induced by various stresses can scavenge singlet oxygen and hydroxyl radicals alone, and can act in vivo as an antioxidant that eliminates reactive oxygen species by cooperating with peroxyredoxin. It has been reported to regulate the activity of transcription factors that regulate the expression of various genes and signaling molecules in the cell. Therefore, if thioredoxin is induced, it is expected that cells, tissues, organs, etc. can be protected from pathological conditions based on various redox phenomena caused in the cells or from the previous stage.
  • the inflammatory tissue extract inoculated with vaccinia virus which is an active ingredient of the pharmaceutical of the present invention, has an analgesic action, a sedative action, an anti-stress action, an anti-allergic action (see Patent Document 3), an immune promoting action, an anti-cancer action, Cirrhosis inhibitory action (see patent document 4), therapeutic effect on idiopathic thrombocytopenic purpura (see patent document 5), postherpetic neuralgia, brain edema, dementia, spinal cord cerebellar degeneration, etc.
  • Patent Document 6 discloses a patent document 6) ), Reino-I syndrome, diabetic neuropathy, SMON sequelae (see Patent Document 7), Kallikrein production inhibitory action, terminal circulatory disturbance improvement action (see Patent Document 8), bone atrophy improvement action ( (See Patent Document 9), effective inhibitory effect of nitric acid and nitrogen production (see Patent Document 10), effective for treatment of septicemia and endotoxin shock, therapeutic effect on osteoporosis (see Patent Document 11), Nef action inhibitory action Effect of AIDS treatment based on inhibitory action on motor-in production (Patent Documents 12 and 13), therapeutic effect on ischemic diseases such as cerebral infarction (Patent Document 14), therapeutic effect on fibromyalgia (Patent Document 15), infection Therapeutic effect on infectious diseases (Patent Document 16) is disclosed.
  • the extract promotes the production of thioredoxin, protects lung cells, and is effective in the prevention or treatment of chronic obstructive pulmonary disease.
  • Patent Document 1 JP 2001-322929 A Patent Document 2: Japanese Patent Laid-Open No. 2005-60408
  • Patent Document 3 JP-A-53-101515
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 55-87724 (Pages 3, 5, 6)
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 1 265028 (Pages 1 and 2)
  • Patent Document 6 JP-A-1 319422 (pages 3 and 4)
  • Patent Document 7 JP-A-2-28119 (page 3)
  • Patent Document 8 JP-A-7-97336 (Page 4)
  • Patent Document 9 Japanese Patent Laid-Open No. 8-291077
  • Patent Document 10 Japanese Patent Laid-Open No. 10-194978
  • Patent Document 11 JP-A-11-80005 (Pages 2 and 3)
  • Patent Document 12 Japanese Patent Laid-Open No. 11-139977
  • Patent Document 13 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-336034 (Pages 2 and 3)
  • Patent Document 14 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-16942
  • Patent Document 15 International Publication WO2004Z039383
  • Patent Document 16 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-300146
  • An object of the present invention is to provide a substance that has an antioxidant, anti-inflammatory and cytoprotective action, and promotes the production of thioredoxin, which plays an important role as an intracellular redox regulator. Furthermore, another object of the present invention is to provide a pharmaceutical that contains the substance as an active ingredient and is effective and safe in preventing or treating chronic obstructive pulmonary disease.
  • Inflammatory tissue extract inoculated with vaccinia virus is resistant to oxidative stress caused by chronic smoking, etc. Therefore, the drug of the present invention containing this as an active ingredient has no problems such as side effects, and is useful as a safe pharmaceutical. High thing.
  • Fig. 1 shows the results of examining the cytoprotective effect of the vaccinia virus-infected inflammatory tissue extract of the present invention against hydrogen peroxide stimulation and serum-free stimulation.
  • FIG. 2 shows the results of examining the cytoprotective action of the extract of inflamed tissue inoculated with the vaccinia virus of the present invention against stimulation of smoking extract.
  • FIG. 3 is a photomicrograph of the anti-apoptotic effect of the vaccinia virus-infected inflammatory tissue extract of the present invention against hydrogen peroxide stimulation and serum-free stimulation.
  • FIG. 4 shows the results of examining the thioredoxin production promoting action (gene level) of the inflamed tissue extract inoculated with the vaccinia virus of the present invention.
  • FIG. 5 shows the results of examining the thioredoxin production promoting action (protein level) of the inflamed tissue extract inoculated with the vaccinia virus of the present invention.
  • Fig. 6 is a photomicrograph showing the tissue protective effect of the inflammatory tissue extract inoculated with the vaccinia virus of the present invention in the lung tissue of mice exposed to smoking.
  • Fig. 7 shows the results of measuring the number of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid of mice exposed to smoking, and examining the inflammatory cell infiltration inhibitory effect of the inflammatory tissue inoculated with the vaccinia virus of the present invention.
  • a rabbit skin inoculated liquid preparation inoculated with vaccinia virus is extracted from the inflamed skin tissue of rabbits inoculated with vaccinia virus, as described on pages 2585-2587 of the Japan Medicine Collection (2006 edition, published by the Japan Pharmaceutical Information Center).
  • Drugs containing isolated non-protein active substances Cold, low back pain, neck and shoulder syndrome, symptomatic neuralgia, shoulder periarthritis, osteoarthritis, epilepsy associated with skin diseases (eczema, dermatitis, urticaria), allergic rhinitis, SMON sequelae cold Feeling Approved for “abnormal sensation” pain, postherpetic neuralgia, etc.
  • Subcutaneous, intramuscular, intravenous injections and tablets have been approved for manufacture as ethical drugs and are commercially available.
  • the extract of inflamed tissue inoculated with vaccinia virus for use in the medicament of the present invention is a non-proteinaceous biological function regulator extracted from inflamed tissue inoculated with vaccinia virus as described above.
  • Vaccinia virus-inoculated rabbit inflammatory skin extract preparations are commercially available with the approval of pharmaceutical manufacturing.
  • various vaccinia virus-inoculated inflammatory tissue extracts described in the above-mentioned patent documents can be used as the substance of the present invention, and their production methods and preferred dosages are also described in the literature.
  • the inflammatory tissue extract inoculated with vaccinia virus for use in the medicament of the present invention is obtained by crushing inflammatory tissue generated by inoculation with vaccinia virus, adding an extraction solvent to remove tissue fragments, and then performing protein removal treatment. This can be obtained by adsorbing to an adsorbent and then eluting the active ingredients.
  • the inflammatory tissue extract inoculated with vaccinia virus is produced, for example, by the following steps.
  • an extract of inflamed tissue inoculated with vaccinia virus can be obtained. Thereafter, if desired, the eluate can be made into a dried product by evaporating to dryness or freeze-drying under reduced pressure as appropriate.
  • animals for inoculating vaccinia virus and obtaining inflamed tissues various animals infected with vaccinia virus such as rabbits, rabbits, horses, hidges, goats, monkeys, rats and mice are used. It is possible to use ugly cutaneous skin tissue as the inflamed tissue.
  • a protein removal treatment is performed.
  • the deproteinization operation can be carried out by known methods that are usually performed.
  • Heat treatment treatment with a protein denaturant, for example, an organic solvent such as acid, base, urea, guanidine, and acetone
  • isoelectric point precipitation A method such as salting out can be applied.
  • insoluble matter that has been precipitated by a normal method for removing insoluble matters for example, filtration using filter paper (cellulose, nitrocellulose, etc.), glass filter, celite, zeit filtration plate, etc., ultrafiltration, centrifugation, etc. Remove protein.
  • the active ingredient-containing extract thus obtained is adjusted to an acid, preferably pH 3.5 to 5.5, using an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, etc., and the adsorption operation to the adsorbent is performed.
  • an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, etc.
  • usable adsorbents include activated carbon, kaolin, and the like.
  • the adsorbent can be obtained by adsorbing the active ingredient by removing the solution by filtration or centrifugation.
  • an elution solvent is added to the adsorbent, and the eluent is eluted at room temperature or appropriately heated or stirred, followed by ordinary methods such as filtration and centrifugation. This can be achieved by removing the adsorbent.
  • a basic solvent for example, water adjusted to a basic pH, methanol, ethanol, isopropanol or the like, or an appropriate mixed solution thereof can be used, preferably water adjusted to PH 9 to 12.
  • the extract (eluate) thus obtained can be appropriately prepared in a form preferable as a drug substance or pharmaceutical preparation.
  • the pH of the solution can be adjusted to near neutrality to obtain a drug substance, or it can be adjusted to a desired concentration by concentration and dilution.
  • these solutions may be concentrated to dryness or freeze-dried to prepare solid forms that can be used as raw materials for tablets and the like.
  • Examples of administration methods to patients include subcutaneous, intramuscular, intravenous administration and the like in addition to oral administration, and the dosage can be appropriately set depending on the type of inflammatory tissue inoculated with vaccinia virus.
  • the doses approved for commercial preparations are basically 16NU per day for internal use and 3.6 to 7.2N U per day for injections. Although it is indicated as an ethical drug to be administered, the dose can be increased or decreased as appropriate depending on the type of disease, severity of injury, patient differences, administration method, administration period, etc. (NU: neurotropin unit.
  • the skin of healthy mature rabbits was inoculated with vaccinia virus, and the sprouted skin was exfoliated, crushed and added with phenol water. Then, this was filtered under pressure, and the obtained filtrate was adjusted to pH 5 with hydrochloric acid, and then heat-treated at 90 to: L00 ° C. for 30 minutes. After deproteinization by filtration, the solution was adjusted to PH9 with sodium hydroxide and further subjected to heat treatment at 90-: L00 ° C for 15 minutes, followed by filtration. The filtrate was adjusted to about PH4.5 with hydrochloric acid, 2% activated carbon was added, and the mixture was stirred for 2 hours, and then centrifuged.
  • the activated skin is aseptically peeled off, minced with water, ground with a homogenizer and made into a milky product .
  • the solution was adjusted to pH 9.1 with sodium hydroxide and further heated at 100 ° C. and then filtered.
  • the filtrate was adjusted to pH 4.1 with hydrochloric acid, 2% activated charcoal was added, and the mixture was stirred for 2 hours and filtered.
  • the filtrate was further filtered with 5.5% activated carbon and stirred for 2 hours.
  • A549 cells were precultured for 16 hours with a test substance (0.01 U / mL) in a thiol-removed DMEM medium. Furthermore, after adding a smoking extract and culturing for 6 hours, LDH assay was used to measure LDH in the culture supernatant, which was used as an indicator of cell viability.
  • the smoke extract (CSE) was prepared using the tobacco smoke generator SG-200 (Shibata Kagaku). That is, 10 cigarettes (Kentucky's Research Cigarette 2R4F) passed through 10 mL of chilled DMEM (with 10% HEPES added) are taken as 100% CSE and diluted appropriately to a concentration suitable for the experiment. Used.
  • An example of the results of examining the cytoprotective effect of the extract of the present invention against smoking extract stimulation is shown in FIG.
  • A549 cells cultured on Chamber slide were added with a test substance under thiol-removed DMEM medium, pre-cultured for 10 hours, and then further added with H202 and cultured for 24 hours.
  • A549 cells were also cultured in a medium supplemented with ushi fetal serum (FCS). The cells were stained with Hoechst 33342 and propidium iodide, and cell death was evaluated with a fluorescence microscope.
  • FCS ushi fetal serum
  • the extract of the present invention suppressed apoptosis caused by serum-free stimulation and H202 stimulation.
  • Fig. 3 In the fluorescence micrograph, cells having small nuclei with high brightness are apoptotic.
  • A549 cells were added with a test substance (0.01 U / mL) in a thiol-removed DMEM medium, pre-cultured for 16 hours, and further added with 0.3 mM H202 (final concentration) and cultured for 3 hours.
  • oxidant-reactive fluorescent substrate CM-H2DCFDA (Molecular Probe) was added and incubated for 20 minutes. Green fluorescence was measured by flow cytometry (FACSCalibur, BD bioscience). The cells whose fluorescence intensity increased due to oxidative stress were regarded as positive cells, and the results were determined by the positive cell rate.
  • Table 1 shows an example of the results of examining the antioxidant action of the extract of the present invention.
  • A549 cells were added with a test substance under thiol-removed DMEM medium and cultured for 9 hours. RNA was extracted and thioredoxin mRNA expression was measured by RT-PCR (ABI 7300 real-time PCR system). An example of the results of examining the thioredoxin production promoting action at the gene level of the extract of the present invention is shown in FIG.
  • the thioredoxin production promoting effect of the extract of the present invention was recognized in a concentration-dependent manner at the gene level.
  • FIG. 5 shows an example of the results showing the thioredoxin production promoting action at the protein level of the extract of the present invention.
  • the thioredoxin production promoting effect of the extract of the present invention was recognized in a concentration-dependent manner at the protein level.
  • mice C57BL / 6J male mice (8 weeks old) were exposed to smoking for 3 days (dayl-3), and the effects of test substance administration (dayO-3, 100NU / kg / day, i.p.) were examined.
  • Cigarette smoke generator SG-200 (Shibata Kagaku) was used for smoking exposure, and systemic exposure was performed for 1 hour per day. Twenty-four hours after the last smoking, mice were lethal to death and stretched fixed lung specimens were prepared using 10% neutral buffered formalin. Lung specimens were HE stained and ssDNA immunostained to assess inflammation and injury.
  • Smoking exposure causes (1) bronchiolar cell death, perivascular stromal edema 'infiltration of inflammatory cells (HE staining), (2) apoptosis of bronchiole, alveoli, and small blood vessels (ssDNA immunostaining)
  • HE staining perivascular stromal edema 'infiltration of inflammatory cells
  • ssDNA immunostaining The pulmonary inflammation and injury tended to be suppressed by the administration of the extract of the present invention (in the micrograph of ssDNA immunostaining in Fig. 6, the cells with nuclei that are darkly black are apoptotic. ).
  • cigarette smoke was exposed to C57BL6 mice aged 8 weeks using a cigarette smoke generator SG-200 (Shibata Kagaku) for 1 hour per day for a total of 3 days.
  • BAL bronchoalveolar lavage
  • FIG. 7 shows an example of the results of examining the inflammatory cell infiltration inhibitory effect (in vivo) of the extract of the present invention.
  • the extract of the present invention By applying the extract of the present invention, infiltration of inflammatory cells (neutrophils) by smoking exposure was significantly suppressed (p 0.05).
  • Industrial applicability As is clear from the above pharmacological test results, the extract of inflamed tissue inoculated with the vaccinia virus of the present invention has an excellent thioredoxin production promoting action against oxidative stress caused by stimuli such as smoking extract, hydrogen peroxide, and serum-free. In addition to its anti-oxidant effect, it showed remarkable lung cell protective effects such as for producing apoptosis.
  • the vaccinia virus-extracted inflammatory tissue extract of the present invention is effective for the disease state that causes the imbalance of the redox state, for example, chronic obstructive disease mainly caused by sustained oxidative stress such as chronic smoking. It is also useful as a preventive or therapeutic agent for lung disease (CO PD).
  • CO PD lung disease
  • Commercially available vaccinia virus inoculated rabbit inflammation Skin extract formulation has been used for many years and is recognized as a very safe drug.
  • the extract of the present invention is a novel drug as a cheredoxin production promoter, lung cell protective agent, or preventive or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary diseases such as emphysema and chronic bronchitis, and has almost no side effects. However, it is highly safe and highly useful as a medicine.

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Abstract

【課題】本発明の目的は、抗酸化、抗炎症及び細胞保護作用を有し、細胞内の酸化還元制御因子として重要な役割を果たすチオレドキシンの産生を促進する物質を提供することにある。さらには、該物質を有効成分として含有し、慢性閉塞肺疾患の予防又は治療において有効で且つ安全性が高い医薬を提供することにある。 【解決手段】本発明は、ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の新規な医薬用途に関するものであり、該抽出物を有効成分として含有するチオレドキシン産生促進剤に関する。該抽出物は、喫煙抽出物質、過酸化水素等の刺激による酸化ストレスに対して、優れたチオレドキシン産生促進作用を有し、顕著な肺細胞保護効果を示した。従って、該抽出物を有効成分とする本発明医薬は、慢性喫煙等の持続的な酸化ストレスが主原因とされる慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤として、副作用の少ない安全性の高い医薬として有用性の高いものである。

Description

明 細 書
チォレドキシン産生促進剤
技術分野
[0001] 本発明は、ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物の新規な医薬用途に関するもの であり、具体的にはワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有す るチォレドキシン産生促進剤に関する。
背景技術
[0002] 生体は紫外線や微粒子などの環境有害物質への曝露、ウィルスや細菌感染により 引き起こされる炎症など様々なストレスに曝されることにより、細胞内では活性酸素種 が産生され、蛋白質や遺伝子が酸化され障害を受ける。そこで、生体は活性酸素種 に対する防御機構として、酸化還元 (レドックス)応答を基本とするシステムを備えて おり、その代表的なものの一つとしてチォレドキシンシステムが挙げられる。
[0003] チォレドキシンは、大腸菌の DNA合成に必須な酵素であるリボヌクレオチド還元酵素 に水素イオンを供与する補酵素として発見された。チォレドキシンは- Cys- Gly-Pro- Cys-と ヽぅ活性部位を有しており、 2つのシスティン残基の間でジスルフイド (S-S)結 合を作る酸化型とジチオール (-SH-SH)を作る還元型が存在する細胞内の酸化還元 制御因子である。
[0004] チォレドキシンは紫外線、放射線、酸化剤、ウィルス感染、虚血再灌流傷害、及び抗 ガン剤投与などにより誘導されることが明らかになつている。様々なストレスにより誘導 されたチォレドキシンは、単独で一重項酸素ゃヒドロキシルラジカルを消去する他、 ペルォキシレドキシンとの協調作用により、活性酸素種を消去する抗酸化物質として 生体内で働くことが報告されており、種々の遺伝子発現を調節する転写因子や細胞 内のシグナル伝達分子の活性を制御している。従って、チォレドキシンを誘導すれば 細胞内で引き起こされる各種の酸化還元現象に基づく病的状態又はその前段階の 状態から、細胞、組織、器官等を保護し得ることが期待されることから、チォレドキシ ン誘導物質の研究が進められ、例えば、そのような誘導物質としてイソプレノイド系化 合物が開示されている。（特許文献 1参照） [0005] 上述したような酸ィ匕 Z抗酸ィ匕すなわちレドックス状態の不均衡力 sもたらす疾患 '病態 の一つとして、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)等を含む肺疾患が挙げられる。 COPDは 、有害微粒子の吸入により気道や末梢肺組織に慢性的な炎症が起き、痰のからみや 気管支のむくみ (慢性気管支炎)、肺胞の破壊 (肺気腫)によって起こる持続的な気 道の閉塞状態を病態とする疾患で、その最大の原因は喫煙である。たばこ煙中には オキシダント (oxidant)が多量に含まれており、肺は酸化ストレスに晒された状態に陥 つている。従って、抗酸化、抗炎症及び細胞保護作用を有することが知られているチ ォレドキシンは、喫煙による糸且織障害及び炎症を抑制することが示唆される。実際、 健常喫煙者では非喫煙者に比し血中チォレドキシン濃度が有意に高値であることが 報告されており、チォレドキシンの産生増力！]が、慢性喫煙という持続的な酸化ストレス 対する防御機構として働いていることが考えられる。このような観点から、これを治療 戦略として用いることは妥当であり、慢性閉塞性肺疾患の予防又は治療剤としてチォ レドキシンが有効であることが開示されている。（特許文献 2参照）
[0006] 本発明医薬の有効成分であるワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物については、 鎮痛作用、鎮静作用、抗ストレス作用、抗アレルギー作用（特許文献 3参照)、免疫促 進作用、抗癌作用、肝硬変抑制作用（特許文献 4参照）、特発性血小板減少性紫斑 病に対する治療効果 (特許文献 5参照)、帯状疱疹後神経痛、脳浮腫、痴呆、脊髄 小脳変性症等への治療効果 (特許文献 6参照)、レイノ一症候群、糖尿病性神経障 害、スモン後遺症等への治療効果 (特許文献 7参照）、カリクレイン産生阻害作用、末 梢循環障害改善作用（特許文献 8参照)、骨萎縮改善作用（特許文献 9参照)、敗血 症やエンドトキシンショックの治療に有効な一酸ィ匕窒素産生抑制作用（特許文献 10 参照)、骨粗鬆症に対する治療効果 (特許文献 11参照)、 Nef作用抑制作用ゃケモ 力イン産生抑制作用に基づくエイズ治療効果 (特許文献 12、 13)、脳梗塞等の虚血 性疾患に対する治療効果 (特許文献 14)、線維筋痛症に対する治療効果 (特許文献 15)、感染症に対する治療効果 (特許文献 16)などが開示されている。しかしながら、 該抽出物がチォレドキシンの産生を促進させることや、肺細胞を保護し、慢性閉塞肺 疾患の予防又は治療に有効であるとの医薬用途に関する発表や報告はまだ無い。
[0007] 特許文献 1 :特開 2001— 322929号公報 特許文献 2：特開 2005 - 60408号公報
特許文献 3 :特開昭 53— 101515号公報
特許文献 4:特開昭 55— 87724号公報 (第 3、 5、 6頁）
特許文献 5 :特開平 1 265028号公報 (第 1、 2頁）
特許文献 6:特開平 1 319422号公報 (第 3、 4頁）
特許文献 7：特開平 2— 28119号公報 (第 3頁）
特許文献 8：特開平 7— 97336号公報 (第 4頁）
特許文献 9：特開平 8 - 291077号公報
特許文献 10：特開平 10— 194978号公報
特許文献 11 :特開平 11— 80005号公報 (第 2、 3頁）
特許文献 12：特開平 11— 139977号公報
特許文献 13：特開 2000— 336034号公報 (第 2、 3頁）
特許文献 14:特開 2000— 16942号公報
特許文献 15：国際公開 WO2004Z039383号公報
特許文献 16：特開 2004— 300146号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の目的は、抗酸化、抗炎症及び細胞保護作用を有し、細胞内の酸化還元制 御因子として重要な役割を果たすチォレドキシンの産生を促進する物質を提供する ことにある。さらには、該物質を有効成分として含有し、慢性閉塞肺疾患の予防又は 治療において有効で且つ安全性が高い医薬を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物が、 チォレドキシン産生において優れた促進作用を有し、肺細胞の保護作用を示し、慢 性閉塞肺疾患の予防又は治療剤として有用であることを見出し発明を完成した。 発明の効果
[0010] ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物は、慢性喫煙等による酸化ストレス等に対し てチォレドキシン産生を促進させ、肺細胞保護効果を示すという優れた薬理作用を 有するため、これを有効成分として含有する本発明薬剤は、副作用等の問題点のな V、安全な医薬として有用性の高 、ものである。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1は、過酸化水素刺激及び無血清刺激に対する本発明ワクシニアウィルス接 種炎症組織抽出物の細胞保護作用を調べた結果である。
[図 2]図 2は、喫煙抽出物質刺激に対する本発明ワクシニアウィルス接種炎症組織抽 出物の細胞保護作用を調べた結果である。
[図 3]図 3は、過酸化水素刺激及び無血清刺激に対する本発明ワクシニアウィルス接 種炎症組織抽出物の抗アポトーシス作用を調べた顕微鏡写真である。
[図 4]図 4は、本発明ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物のチォレドキシン産生 促進作用（遺伝子レベル)を調べた結果である。
[図 5]図 5は、本発明ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物のチォレドキシン産生 促進作用（蛋白レベル)を調べた結果である。
[図 6]図 6は、喫煙曝露したマウスの肺組織において、本発明ワクシニアウィルス接種 炎症組織抽出物による組織保護作用を調べた顕微鏡写真である。
[図 7]図 7は、喫煙曝露したマウスの気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数を計測し、本 発明ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物による炎症細胞浸潤抑制作用を調べた 結果である。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明医薬に用いるワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物に関して、ワクシニアゥ ィルスを接種した炎症組織にお!ヽて産生される生理活性物質、該物質を病態組織か ら抽出する方法並びにそれらの薬理活性などについては上述のように種々報告され ている（上記特許文献 3乃至 16等)。
[0013] また市販されている医薬品としてはワクシニアウィルス接種家兎炎症皮膚抽出液製 剤がある。この製剤は、医療薬日本医薬品集〔2006年版、財団法人日本医薬情報セ ンター編集'発行〕の 2585-2587頁に記載されているように、ワクシニアウィルスを接種 した家兎の炎症皮膚組織から抽出分離した非タンパク性の活性物質を含有する薬 剤であり、腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、肩関節周囲炎、変形性関節症、 皮膚疾患 (湿疹、皮膚炎、じんま疹）に伴う搔痒、アレルギー性鼻炎、スモン後遺症 状の冷感 '異常知覚'痛み、帯状疱疹後神経痛等に対する適応が認められており、 皮下、筋注、静注用の注射剤並びに錠剤が医療用医薬品として製造承認を受けて 市販されている。
[0014] 本発明医薬に用いるワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物は上述したようなヮクシ ニァウィルス接種炎症組織力 抽出した非蛋白性の生体機能調整物質であり、前記 の医療薬日本医薬品集にも掲載されているワクシニアウィルス接種家兎炎症皮膚抽 出液製剤は医薬品の製造承認を受け市販されており入手可能である。また上述した 特許文献に記載されて ヽる種々のワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物を本発明 物質として利用でき、それらの製造方法や好ましい投与量なども文献中に説明され ている。
[0015] 本発明医薬に用いるワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物は、ワクシニアウィルス を接種して発痘した炎症組織を破砕し、抽出溶媒を加えて組織片を除去した後、除 蛋白処理を行い、これを吸着剤に吸着させ、次いで有効成分を溶出することによって 得ることができる。
[0016] ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物は、例えば、以下の工程で製造される。
(a)ワクシニアウィルスを接種し発痘させたゥサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、 発痘組織を破砕し、水、フエノール水、生理食塩液またはフエノール加グリセリン水等 の抽出溶媒を加えた後、濾過または遠心分離することによって抽出液 (濾液または上 清)を得る。
(b)前記抽出液を酸性の pHに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した 溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過または遠心分離する。
(c)得られた濾液または上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
(d)前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性の pHに調整し、吸着成分を溶 出することによってワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。その 後、所望に応じて、適宜溶出液を減圧下に蒸発乾固または凍結乾燥することによつ て乾固物とすることもできる。 [0017] ワクシニアウィルスを接種し炎症組織を得るための動物としては、ゥサギ、ゥシ、ゥマ、 ヒッジ、ャギ、サル、ラット、マウスなどワクシニアウィルスが感染する種々の動物を用 V、ることができ、炎症組織としてはゥサギの発痘皮膚組織が好ま U、。
[0018] これら炎症組織を採取して破砕し、その 1乃至 5倍量の抽出溶媒を加えて乳化懸濁 液とする。抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液 などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フエノール等の殺菌'防腐剤、塩 化ナトリウム、塩ィ匕カリウム、塩ィ匕マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。こ の時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組 織を破壊して抽出を容易〖こすることもできる。
[0019] 得られた乳状抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白 処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処 理、蛋白質変性剤、例えば、酸、塩基、尿素、グァ-ジン、アセトン等の有機溶媒など による処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を 除去する通常の方法、例えば、濾紙 (セルロース、ニトロセルロース等）、グラスフィル ター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などにより析出し てきた不溶蛋白質を除去する。
[0020] こうして得られた有効成分含有抽出液を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて 酸性、好ましくは pH3. 5乃至 5. 5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能 な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添 加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を 吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離 等によって溶液を除去して、有効成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
[0021] 吸着剤より有効成分を溶出 (脱離)させるには、前記吸着剤に溶出溶媒を加え、室温 又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着 剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基 性の pHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当 な混合溶液を用いることができ、好ましくは PH9乃至 12に調整した水を使用すること ができる。 [0022] このようにして得られた抽出物 (溶出液)は、製剤用原体や医薬品製剤として好ましい 形態に適宜調製することができる。例えば、溶液の pHを中性付近に調整して製剤用 原体とすることもでき、また濃縮 '希釈によって所望の濃度に合せることもできる。さら に注射用製剤として塩ィ匕ナトリウムを加えて生理食塩液と等張の溶液に調製すること もできる。また、これら溶液を濃縮乾固又は凍結乾燥することによって、錠剤等の原 料として利用できる固形物の形態に調製してもよい。
[0023] 患者への投与方法としては、経口投与の他に皮下、筋肉内、静脈内投与等が挙げら れ、投与量はワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物の種類によって適宜設定する ことができる。市販製剤で認められている投与量は、前記の医療薬日本医薬品集 (2 585頁）によれば、基本的には内服では 1日 16NU、注射剤では 1日 3. 6乃至 7. 2N Uを投与するよう医療用医薬品としては示されているが、疾患の種類、重傷度、患者 の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減可能である (NU:ノイロトロピン 単位。ノイロトロピン単位とは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物で ある S ARTストレスマウスを用い、 RandaU-Selitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力 の ED 値をもって規定する。 1NUは ED 値が 100 mgZkgであるときのノイロトロピン
50 50
製剤の鎮痛活性含有成分 lmgを示す活性である。 )
[0024] 以下に、ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物の製造方法の例、並びに本発明抽 出物の新規な薬理作用、すなわちチォレドキシン産生促進作用及び COPD予防 ·治 療作用に関する薬理試験結果を示すが、本発明はこれらの実施例の記載によって 何ら制限されるものではな 、。
実施例
[0025] 実施例 1
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウィルスを接種し、発痘した皮膚を剥出し、これ を破砕してフエノール水を加えた。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸で pH5に調整した後、 90〜： L00°Cで 30分間加熱処理した。濾過して除蛋白した後、 水酸ィ匕ナトリウムで PH9とし、さらに 90〜： L00°Cで 15分間加熱処理した後濾過した。 濾液を塩酸で約 PH4. 5に調整し、 2%の活性炭を加えて 2時間撹拌した後、遠心分 離した。採取した活性炭に水をカ卩え、水酸ィ匕ナトリウムで pHIOとし、 60°Cで 1. 5時 間撹拌した後、遠心分離濾過して上清を得た。採取した活性炭に再び水を加え、水 酸ィ匕ナトリウムで PH11とし、 60°Cで 1. 5時間撹拌した後、遠心分離して上清を得た 。両上清を合せて、塩酸で中和し、ワクシニアウィルス接種家兔炎症皮膚抽出物を得 た。以下の薬理試験では実験に適した濃度に適宜調整して使用した。
[0026] 実施例 2
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウィルスを接種し感染させた後、発痘した皮膚を 無菌的に剥出しこれを細切した後フエノール加グリセリン水をカ卩え、ホモゲナイザー で磨砕し乳状とした。次いでこれを濾過し、得た濾液を塩酸で弱酸性 (pH4. 5乃至 5 . 5)に調整した後、 100°Cで加熱処理し濾過した。濾液を水酸ィ匕ナトリウムで弱アル カリ性 (PH8. 5乃至 10. 0)とし、さらに 100°Cで加熱処理した後濾過した。濾液を塩 酸で約 pH4. 5とし、約 1. 5%の活性炭を加えて 1乃至 5時間撹拌した後濾過した。 濾取した活性炭に水を力卩ぇ水酸ィ匕ナトリウムで PH9. 4乃至 10に調整し、 3乃至 5時 間撹拌した後、濾過し濾液を塩酸で中和した。
[0027] 施例 3
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウィルスを接種し、活性化させた後、活性化した 皮膚を無菌的に剥出し、これを細切して水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状物と した。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸で pH5. 0に調整した後、流通 蒸気下 100°Cで加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸ィ匕ナトリウムで pH9. 1 とし、さらに 100°Cで加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で pH4. 1に調整し、活 性炭 2%を加えて 2時間撹拌した後濾過した。濾液は更に活性炭 5. 5%を加えて 2 時間攪拌した後濾過した。最初に濾取した活性炭に水を加え、水酸ィ匕ナトリウムで p H9. 9とし、 60°Cで 1. 5時間撹拌した後濾過した。最初の活性炭及び次の活性炭に 水を加え、水酸ィ匕ナトリウムで ρΗΙΟ. 9とし、 60°Cで 1. 5時間撹拌した後濾過した。 濾液を合わせ塩酸で中和した後、分子量 100の膜を用いた電気透析法で脱塩処理 を行い、減圧下に乾固した。
[0028] 次に、上記実施例 1で得られた本発明ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物を被 験物質として用いたチォレドキシン産生促進作用に関する薬理試験の結果の一例を 示す。 [0029] 薬理試験 1 :渦酸化水素 (H202)障害に対する細胞保護作用
ヒト肺胞上皮由来の細胞株 A549細胞をチオール除去 DMEM培地（以下、特に明記し ない場合は、該培地は無血清培地である）下で、被験物質を添加し 16時間、前培養 した。さらに 0.3 mM H202 (最終濃度）を添カ卩し 6時間培養した後、 LDH assay (Roche Diagnostics社）にて培養上清中の LDH (乳酸脱水素酵素）を測定し、細胞の viability の指標とした。過酸化水素障害に対する本発明抽出物の細胞保護効果を調べた結 果の一例を図 1に示す。
A549細胞に無血清培地下で H202刺激を加えると、細胞傷害を引き起こす力 本発 明抽出物を添加し、前培養することにより、細胞傷害が濃度依存性に有意に抑制さ れた。また、同時に無血清刺激による細胞傷害に対しても抑制効果が認められた。
[0030] 薬 喫煙抽出物質刺激に対する細胞保護作用
A549細胞をチオール除去 DMEM培地下で、被験物質（0.01 U/mL)を添カ卩し 16時間 、前培養した。さらに喫煙抽出物質を添加し 6時間培養した後、 LDH assayにて培養 上清中の LDHを測定し、細胞の viabilityの指標とした。なお、喫煙抽出物質 (dgarett e smoke extract, CSE)は、たばこ煙発生装置 SG-200 (柴田科学）を用いて作製した 。すなわち、タバコ（ケンタツキ一'リサーチシガレット 2R4F) 10本分の煙を 10mLのチォ ール除去 DMEM (10% HEPES添加）に通過させたものを 100% CSEとし、実験に適し た濃度に適宜希釈して使用した。喫煙抽出物質刺激に対する本発明抽出物の細胞 保護効果を調べた結果の一例を図 2に示す。
本発明抽出物を添加し、前培養することにより、 CSEによる細胞傷害が有意に抑制さ れ、その効果は NAC (N—ァセチルシスティン、 0.1 mM)と同等であった。
[0031] 薬理試験 3：抗アポトーシス作用
Chamber slide上に培養した A549細胞に対し、チオール除去 DMEM培地下で被験物 質を添加し 10時間、前培養した後、さらに H202添加し 24時間培養した。また、比較 のため、ゥシ胎児血清（FCS)添加培地下でも同様に A549細胞を培養した。 Hoechst 33342及びヨウ化プロビジゥムにて染色し、蛍光顕微鏡で細胞死を評価した。本発明 抽出物の抗アポトーシス作用を調べた結果の一例を図 3に示す。
本発明抽出物は無血清刺激及び H202刺激によるアポトーシスを抑制した。（図 3の 蛍光顕微鏡写真中、高輝度の小型の核を有する細胞がアポトーシスである。 )
[0032] 薬理試験 4 :杭酸化作用
A549細胞をチオール除去 DMEM培地下で、被験物質（0.01 U/mL)を添カ卩し 16時間 、前培養し、さらに 0.3 mM H202 (最終濃度）を添加し 3時間培養した。次に、トリプシ ン処理後、 oxidant反応性蛍光基質 CM- H2DCFDA (Molecular Probe社）を添加し 20 分間培養した。フローサイトメトリー（FACSCalibur、 BD bioscience社）にて緑色蛍光を 測定した。酸化ストレスにより蛍光輝度が上昇した細胞を陽性細胞として、結果を陽 性細胞率で判定した。本発明抽出物の抗酸化作用を調べた結果の一例を表 1に示 す。
無血清及び H202刺激等の酸化ストレスによる細胞の陽性細胞率上昇力 本発明抽 出物により有意に抑制された。
[0033] [表 1]
Figure imgf000012_0001
[0034] 薬理試験 5：チォレドキシン産生促進作用（遺伝子レベル）
A549細胞をチオール除去 DMEM培地下で、被験物質を添加し 9時間培養した。 RNA を抽出し、 RT- PCR法により、チォレドキシンの mRNA発現を測定した（ABI社 7300リ アルタイム PCRシステム）。本発明抽出物の遺伝子レベルでのチォレドキシン産生促 進作用を調べた結果の一例を図 4に示す。
本発明抽出物のチォレドキシン産生促進効果は、遺伝子レベルにおいて濃度依存 的に認められた。
[0035] ：チォレドキシン産生促進作用（蛋白レベル）
A549細胞をチオール除去 DMEM培地下で、被験物質を添加し培養した。細胞溶解 物中のチォレドキシン発現量を、ウェスタンプロット法により測定した。本発明抽出物 の蛋白レベルでのチォレドキシン産生促進作用を示す結果の一例を図 5に示す。 本発明抽出物のチォレドキシン産生促進効果は、蛋白レベルにおいて濃度依存性 に認められた。
なお、ヒト肺線維芽細胞株の WI38を用いた場合にも、 A549細胞と同様の細胞保護作 用、チォレドキシン産生促進作用等が本発明抽出物に認められた。
[0036] 薬理試験 7：組織保譁作用（in vivo)
C57BL/6J雄性マウス (8週齢)を 3日間喫煙曝露し (dayl-3)、被験物質投与 (dayO-3 、 100NU/kg/day, i.p.)の効果を検討した。喫煙曝露は、たばこ煙発生装置 SG-200 ( 柴田科学)を用いて行い、 1日 1時間全身曝露した。最終喫煙 24時間後に、マウスを 瀉血致死させ、 10%中性緩衝ホルマリンにて伸展固定肺標本を作製した。肺標本は、 HE染色及び ssDNA免疫染色し、炎症，傷害を評価した。本発明抽出物の組織保護 作用（in vivo)を調べた結果の一例を図 6に示す。
喫煙曝露により、 (1)細気管支の細胞死、血管周囲間質の浮腫'炎症細胞浸潤 (HE 染色）、（2)細気管支、肺胞、小血管のアポトーシス (ssDNA免疫染色）が引き起こさ れるが、本発明抽出物の投与により、これらの肺炎症 ·傷害が抑制される傾向が認め られた（図 6の ssDNA免疫染色の顕微鏡写真中、黒色に濃染する核を持つ細胞がァ ポトーシスである）。
[0037] 蓮 炎症細胞浸潤抑制作用（in vivo)
上記薬理試験 7と同様に、 8週齢の C57BL6マウスに対し、たばこ煙を 1日 1時間計 3日 間、たばこ煙発生装置 SG-200 (柴田科学)を用いて曝露させた。マウスは被験物質 投与群 (n=3、喫煙 30分前に INU/kg腹腔内投与)と生理食塩水投与群 (n=3)に分け 、最終喫煙曝露 24時間後に気管支肺胞洗浄 (BAL)を施行し、 BAL液の中の好中球 数を比較検討した。 BALは生理食塩水 lmLで計 5回行い、得られた細胞力もサイトス ピン標本を作製し、 DiffQuik染色の後、細胞数をカウントした。本発明抽出物の炎症 細胞浸潤抑制作用（in vivo)を調べた結果の一例を図 7に示す。本発明抽出物の投 与により、喫煙曝露による炎症細胞 (好中球)の浸潤が有意に (pく 0.05)抑制された。 産業上の利用可能性 上記の薬理試験結果より明らかなように、本発明ワクシニアウィルス接種炎症組織抽 出物は、喫煙抽出物質、過酸化水素、無血清等の刺激による酸化ストレスに対して、 優れたチォレドキシン産生促進作用を有するとともに、抗酸化作用、アポトーシス抑 制作用等の顕著な肺細胞保護効果を示した。従って、本発明ワクシニアウィルス接 種炎症組織抽出物はレドックス状態の不均衡力 Sもたらす疾患 '病態に有効であり、例 えば、慢性喫煙等の持続的な酸化ストレスが主原因とされる慢性閉塞性肺疾患 (CO PD)の予防又は治療剤としても有用である。市販のワクシニアウィルス接種家兎炎症 皮膚抽出液製剤は長年に亘つて使用され、非常に安全性の高い薬剤として認めら れている。このように、本発明抽出物はチォレドキシン産生促進剤、肺細胞保護剤或 いは肺気腫や慢性気管支炎等の慢性閉塞性肺疾患の予防'治療剤として新規な薬 剤であり、副作用もほとんど発現しな 、安全性の高 、医薬として有用性の高 、もので ある。

Claims

請求の範囲
[1] ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有するチォレドキシン 産生促進剤。
[2] ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する肺細胞保護剤。
[3] ワクシニアウィルス接種炎症組織抽出物を有効成分として含有する慢性閉塞性肺 疾患の予防又は治療剤。
[4] 炎症組織がゥサギの皮膚組織である請求項 1乃至 3の 、ずれか一項記載の剤。
[5] 注射剤である請求項 1乃至 4の 、ずれか一項記載の剤。
[6] 経口剤である請求項 1乃至 4の 、ずれか一項記載の剤。
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