WO2006054681A1

WO2006054681A1 - リパーゼの活性測定用組成物および活性測定法

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Publication number: WO2006054681A1
Application number: PCT/JP2005/021213
Authority: WO
Inventors: Shigeyuki Imamura
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corporation
Priority date: 2004-11-19
Filing date: 2005-11-18
Publication date: 2006-05-26
Also published as: JP4836196B2; US7883862B2; ATE532873T1; HK1108586A1; US20080038765A1; EP1813680B8; EP1813680A1; JPWO2006054681A1; ES2372859T3; EP1813680B1; CN101061234A; EP1813680A4; CN101061234B

Abstract

【課題】日常行われる臨床検査の現場において簡便で操作性に優れ正確性と再現性に優れた酵素法によるリパーゼ活性測定試薬の提供。【解決手段】低濃度の緩衝液に溶解したジグリセリドをリパーゼの基質とすることで液状で長期保存安定性を確保し、リパーゼ反応で生成されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼでグリセロールに変換し更にグリセロールキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、還元型NAD、ATP、ホスフォエノールピルビン酸を含有してなる試薬、またはリパーゼ反応で生成されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼでグリセロールに変換し更にグリセロールキナーゼ、グルコース、ADP依存性へキソキナーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、酸化型NADまたは酸化型NADP、ATP、を含有してなる試薬またはリパーゼ反応で生成されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼでグリセロールに変換し更にグリセロールキナーゼ、グリセロ－３－リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、過酸化水素発色色素から構成される試薬を用いてリパーゼ活性を測定する。

Description

明細書

リパーゼの活性測定用組成物および活性測定法

技術分野

[0001] 本発明は臨床検査薬分野における脾臓由来リパーゼ、又は非脾臓由来リパーゼ（肝性リパーゼ、又はリポプロテインリパーゼ等）の活性測定用組成物および活性測定方法に関する。

背景技術

[0002] 血中の脾臓由来リパーゼは急性膝炎等の脾臓疾患の診断マーカーとして重要であり日常の臨床検査に採り入れられている。

また肝性リパーゼゃリポプ口ティンリパーゼ（以下合わせて非脾臓由来リパーゼという）は、肝疾患の診断ゃリポプロテインの脂質代謝において重要な酵素である。非脾臓由来リパーゼは肝臓や各種臓器 ·血管壁の酸性糖タンパクに結合して存在して生体中で機能している。非脾臓由来リパーゼはへノ^ンを静脈注射又は透析中のへパリンの使用等により血中に出現するがその活性はかなり低い。

[0003] 従来より血中の脾臓由来リパーゼ活性測定及び Z又は非脾臓由来リパーゼ活性測定において、その基質としてトリグリセリドが用いられてきた。該トリグリセリドはァラビアゴムやポリビュルアルコール等と強制撹拌させることにより緩衝液中に乳化分散したヽゎゆるェマルジヨンの形態で使用されてきた。この基質を用いてリパーゼ活性を測定する際はリパーゼ反応により生成した脂肪酸をアルカリ滴定により定量することにより行われてきた。このリパーゼ基質からリパーゼ反応で遊離される脂肪酸を酵素法により測定する試みもなされてきたが、トリグリセリド基質はェマルジヨンに起因する強い濁度のために酵素共役系を用いて分光学的に該リパーゼ活性を測定することは不可能であった。またェマルジヨン基質は保存により相分離を起こしやす、欠点があり、再現性良く該リパーゼ活性を測定することは困難であった。さらに非脾臓由来リパーゼ活性測定に関しては、血中では脾臓由来リパーゼ活性に比較して非脾臓由来リパーゼは活性が低、ために実務上は放射性ィ匕合物で標識したトリグリセリドが基質に用いられ、リパーゼ反応で生成される遊離脂肪酸と基質であるトリグリセリドとを分離した後、遊離脂肪酸の放射活性を測定することでリパーゼ活性が測定されてきた (非特許文献 1)が、放射性ィ匕合物の取り扱い操作には制約が多く日常の臨床検查には不向きであった。

[0004] こうしたトリグリセリド基質を用いる方法の課題解決を目的としてジグリセリドを基質に用いる方法が開発されてきている (特許文献 1、特許文献 2)。これらの特許文献にはリパーゼの基質としては主に 1, 2—ジグリセリドが使用されている。 1, 2—ジグリセリドは分子内でエステル結合の転移反応により 1, 3—ジグリセリドへ変化することが知られており、この変化が極力起きないようにして使用されてきた。

[0005] これまでに知られている非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド溶液は、安定性が悪ぐ長期保存することは不可能であった。このためジグリセリドを基質として用いる試薬やキットにおいては、実質上、該基質を凍結乾燥することが必須であり、使用前に溶解操作が必要となり使用上煩雑であった。

[0006] また、前述のように血液検体中の非脾臓由来リパーゼの酵素活性を測定するのは困難であるため、近年モノクロナル抗体を用いて免疫学的手法によりリパーゼの蛋白量を測定する方法が臨床検査の分野で行われるようになってきているが (非特許文献 2)、免疫学的手法はリパーゼの蛋白量を定量するものであり、リパーゼの機能としての酵素活性を表すものではないという欠点がある。こうした状況下、脾臓由来リバーゼ又は非脾臓由来リパーゼ活性を正確、且つ高感度、さらに簡便に測定する技術開発が望まれていた。

特許文献 1：特開昭 59— 91898号公報

特許文献 2：特開昭 63— 245672号公報

非特許文献 l :J.Clin.Invest, 1986,78卷、 6号、 1523〜1528ページ

非特許文献 2 :臨床病理第 52卷補冊 Z臨床化学第 33卷補冊 3号、 2004年、 220ぺージ

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本発明は、液状で長期安定性に優れたリパーゼ活性測定用組成物を提供することを目的とする。さらには、簡便なリパーゼ活性測定用試薬、リパーゼ活性測定用キット、及びリパーゼ活性測定方法を提供することを目的とする。具体的には臨床検査薬分野における脾臓由来リパーゼの活性測定用組成物として、従来の組成物よりも優れた組成物を提供すること、及び該組成物を用いた脾臓由来リパーゼ活性測定方法を目的とする。さらには検体中、特に血液検体中の非脾臓由来リパーゼに高感度且つ特異性の高い非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を提供すること及び該組成物を用いた簡便且つ精度の高い非脾臓由来リパーゼ活性の測定方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは、まず安定した脾臓由来リパーゼ活性を測定するために現在、原料として使用されている 1, 2—ジグリセリドの安定性に着目した結果、長期間にわたって保存すると 1, 2—ジグリセリドは試薬中で徐々に加水分解されリパーゼ活性に変動をきたすことを見出し、該変化によって安定して正確な脾臓由来リパーゼ活性を測定することが困難であることを見出した。この課題を解決するために、優れた安定性を示すジグリセリドを見出す事に留意して鋭意検討した結果、低濃度のアルカリ性の pH 緩衝液中で 1, 2—ジグリセリドを処理することにより予め大量の 1, 3—ジグリセリドに変換したジグリセリドを用いることで安定したリパーゼ活性を測定できる試薬を調製することができることを見出した。

[0009] また、該ジグリセリドが非脾臓由来リパーゼの基質として有用であることをも見出し、非脾臓由来リパーゼ反応測定時に使用するリパーゼ基質を澄明な溶液に調製することでリパーゼ反応の生成物を酵素法により測定する新規な非脾臓由来リパーゼ活性測定法を確立し、これにより高感度且つ簡便な測定方法を見出した。さらに、非脾臓由来リパーゼ活性の測定に影響を及ぼす成分を含有する検体、例えば、高い脾臓由来リパーゼ活性を示す検体であっても全く脾臓由来リパーゼ活性の影響を受けない特異性に優れた非脾臓由来リパーゼ反応用組成物、および非脾臓由来リパーゼの新規な活性測定法を見出した。

[0010] そして本発明者は、上記目的を達成するためにジグリセリドの水溶液中における長期保存安定性の向上に着目して鋭意検討した結果、低濃度の pH緩衝剤を共存させると長期保存安定性が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成力も成る。

[A- 1〕低濃度の pH緩衝液、及び非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液；

〔A— 2〕ジグリセリドが 1, 3 ジグリセリド及び 1, 2 ジグリセリド混合物である前記〔 A- 1〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液；

[A- 3]前記〔A— 1〕又は〔A— 2〕に記載のジグリセリドからリパーゼ反応により生成されるモノグリセリドを、遊離のグリセロールを経由してグリセロール 3—リン酸に変換する酵素類を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用組成物；

[A-4] 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセロキナーゼ、グリセ口 3 リン酸ォキシダーゼ、及びペルォキシダーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも前記〔A— 1〕又は〔A— 2〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2 ;から構成される非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；〔A— 5] 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、酸化型 NAD又は酸化型 NADP、グルコース、 ADP—へキソキナーゼ、及びグルコース 6 リン酸デヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも前記〔A— 1〕又は〔A - 2]に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2 ;から構成される非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[A-6] 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセロキナーゼ、還元型 NAD、ホスフォェノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、及びラクテ一トデヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも前記〔A— 1〕又は〔A— 2〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2 ;から構成される非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔A— 7〕非イオン性界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現せず非脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である、前記〔A— 4〕〜〔A 6〕のいずれかに記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[A-8]試薬 1及び Z又は試薬 2が液状である、前記〔A—4〕〜〔A— 7〕の、ずれかに記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[A- 9] 1)少なくとも前記〔A— 1〕又は〔A— 2〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、グリセロー 3—リン酸ォキシダーゼ、及びペルォキシダーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の緩衝液及び胆汁酸又はその塩を含有する試薬 2 ;から構成される脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[A- 10〕 1)少なくとも請求項 1項又は 2項記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、酸化型 NAD又は酸化型 NADP、グルコース、 ADP—へキソキナーゼ、及びグルコースー6—リン酸デヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の緩衝液及び胆汁酸又はその塩を含有する試薬 2 ;から構成される脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔A— 11〕 1)少なくとも前記〔A— 1〕又は〔A— 2〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、還元型 NAD、ホスフォェノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、及びラタテートデヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の緩衝液及び胆汁酸又はその塩を含有する試薬 2；から構成される脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[A- 12]非イオン性界面活性剤の濃度が、非脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現せず脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である、前記〔A— 9〕〜〔A— 11〕の、ずれかに記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[A- 13]試薬 1及び Z又は試薬 2が液状である、前記〔A— 9〕〜〔A— 12〕の、ずれかに記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔A— 14〕前記〔A— 4〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリド力遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセ口ール— 3—リン酸に変換し、次ヽでグリセロール— 3—リン酸ォキシダーゼを作用させ過酸化水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルォキシダーゼを作用させ発色反応を行い、 540〜700nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定する非脾臓由来リパーゼ活性測定方法；

〔A— 15〕前記〔A— 5〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリド力遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次、でダルコース存在下に ADP -へキソキナーゼでダルコース— 6—リン酸に変換し、更に酸化型 NAD又は NADP存在下にダルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、還元型 NAD又は還元型 NADPの 340nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定する非脾臓由来リパーゼ活性測定方法；

〔A— 16〕前記〔A— 6〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリド力遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次、でホスフォェノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型 NAD存在下にラタテートデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型 NADの 340nm付近の波長における吸光度の減少速度を測定する非脾臓由来リバーゼ活性測定方法；

[A- 17]リパーゼ活性測定用組成物における非イオン界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現せず非脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である、前記〔A— 14〕〜〔A— 16〕の、ずれかに記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定方法；

〔A— 18〕前記〔A— 9〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リバーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセ口ール— 3—リン酸に変換し、次ヽでグリセロール— 3—リン酸ォキシダーゼを作用させ過酸化水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルォキシダーゼを作用させ発色反応を行い、 540〜700nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定する脾臓由来リパーゼ活性測定方法；

〔A— 19〕前記〔A— 10〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリド力遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次、でダルコース存在下に ADP -へキソキナーゼでダルコース— 6—リン酸に変換し、更に酸化型 NAD又は NADP存在下にダルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、還元型 NAD又は還元型 NADPの 340nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定する脾臓由来リパーゼ活性測定方法；

〔A— 20〕前記〔A— 11〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリド力遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次、でホスフォェノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型 NAD存在下にラタテートデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型 NADの 340nm付近の波長における吸光度の減少速度を測定する脾臓由来リパーゼ活性測定方法；

〔A— 21〕リパーゼ活性測定用組成物における非イオン界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現せず非脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である、前記〔A— 18〕〜〔A— 20〕の、ずれかに記載の脾臓由来リパーゼ活性測定方法；

〔A— 22〕リパーゼ活性測定用組成物における試薬 1及び Z又は試薬 2が液状である、前記〔A— 14〕〜〔A— 21〕のいずれかに記載のリパーゼ活性測定方法；〔A— 23〕少なくとも非イオン性界面活性剤、及び 1, 3—ジグリセリド並びに 1, 2—ジグリセリド混合物を含有することを特徴とする脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；〔A— 24〕少なくともジグリセリドを含有することを特徴とする非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔A— 25〕低濃度の pH緩衝液、及び非イオン性界面活性剤存在下で実質的に 1, 2 ージグリセリドと 1, 3—ジグリセリドの平衡状態の濃度分布となっているジグリセリドから構成されるリパーゼ活性測定用基質；

[A- 26] l, 2—ジグリセリド及び 1, 3—ジグリセリドの平衡ィ匕方法；

〔B— 1〕低濃度の pH緩衝液、及び非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液；

[B- 2]非イオン性界面活性剤存在下でアルカリ処理を施したジグリセリドを用いることを特徴とする前記〔B— 1〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド液；

[B- 3] 1)少なくとも高濃度の pH緩衝剤、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセロキナーゼ、グリセロー 3 リン酸ォキシダーゼ、ペルォキシダーゼを含有する試薬 1と； 2) 少なくとも前記〔B— 1〕又は〔B— 2〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2；から構成されるリパーゼ活性測定用組成物；

[B-4] 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセロキナーゼ、酸化型 NADまたは酸化型 NADP、グルコース、 ADP—へキソキナーゼ、ダルコースー 6 リン酸デヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも前記〔B— 1〕又は [B- 2]に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2 ;から構成されるリパーゼ活性測定用組成物；

[B- 5] 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセロキナーゼ、還元型 NAD、ホスフォェノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ラタテートデヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも前記〔B— 1〕又は〔B— 2〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2 ;から構成されるリパーゼ活性測定用組成物；

[B-6] 1)少なくとも低濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセロキナーゼ、グリセロー 3 リン酸ォキシダーゼ、ペルォキシダーゼ、前記〔B— 1〕又は〔B— 2〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の pH緩衝液を含有する試薬 2；から構成されるリパーゼ活性測定用組成物； [B- 7] 1)少なくとも低濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセロキナーゼ、酸化型 NADまたは酸化型 NADP、グルコース、 ADP—へキソキナーゼ、ダルコースー 6 リン酸デヒドロゲナーゼ、前記〔B— 1〕又は〔B— 2〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の pH緩衝液を含有する試薬 2；カゝら構成されるリパーゼ活性測定用組成物；

[B-8] 1)少なくとも低濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセロキナーゼ、還元型 NAD、ホスフォェノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ラタテートデヒドロゲナーゼ、前記〔_B 又は〔_{B 2}〕に記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の pH緩衝液を含有する試薬 2；力ゝら構成されるリパーゼ活性測定用組成物；

〔B— 9〕非イオン性界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現しな、濃度である前記〔B— 3〕〜〔B— 8〕の、ずれかに記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[B- 10]非イオン性界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である前記〔B— 3〕〜〔B— 8〕の、ずれかに記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔B— 11〕前記〔B— 3〕又は〔B— 6〕に記載のリパーゼ活性測定用組成物と検体とを接触させた後、可視部の波長における吸光度の増加速度を測定するリパーゼ活性測定方法；

〔B— 12〕前記〔B— 9〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物と検体とを接触させた後、可視部の波長における吸光度の増加速度又は 340nm付近の波長における吸光度の増加速度あるいは減少速度を測定する非脾臓由来リパーゼ活性測定方法；

〔B— 13〕前記〔B— 10〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物と検体とを接触させた後、可視部の波長における吸光度の増加速度又は 340nm付近の波長における吸光度の増加速度あるいは減少速度を測定する脾臓由来リパーゼ活性測定方法；

[B- 14]さらにジグリセリド力リパーゼ反応により生成されるモノグリセリドを、遊離のグリセロールを経由してグリセロール 3—リン酸に変換する酵素類を含有することを特徴とする前記〔B— 3〕又は〔B— 6〕に記載のリパーゼ活性測定用組成物；〔B— 15〕さらに、トリンダー試薬及びカップラーを含有することを特徴とする前記〔B 14〕に記載のリパーゼ活性測定用組成物；

〔B— 16〕非イオン性界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現しな、濃度である前記〔B— 14〕又は〔B— 15〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔B— 17〕非イオン性界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である前記〔B— 14〕又は〔B— 15〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔B— 18〕さらに、コリパーゼ、及び胆汁酸又はその塩を含有することを特徴とする前記〔B— 17〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔B— 19〕前記〔B— 3〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、リパーゼ反応で該ジグリセリド力遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール一 3—リン酸に変換し、次、でグリセ口 3—リン酸ォキシダ一ゼを作用させ過酸ィ匕水素に変換し、過酸ィ匕水素の増加速度を測定するリパーゼ活性の測定方法；

〔B— 20〕前記〔B— 5〕に記載のリパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、脾臓由来リパーゼ反応で該ジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次!、でホスフォェノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型 NAD存在下にラタテートデヒドロゲナーゼを作用させ還元型 NADの 300〜400應付近の波長における吸光度の減少速度を測定するリパーゼ活性の測定方法；

〔B— 21〕前記〔B— 15〕に記載のリパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、脾臓由来リパーゼ反応で該ジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール— 3—リン酸に変換し、次いでグリセ口— 3—リン酸ォキシダーゼを作用させ過酸化水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルォキシダーゼを作用させ発色反応を行い 540〜700應付近の波長における吸光度の増加速度を測定するリパーゼ活性の測定方法；

〔B— 22〕非イオン性界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現しない濃度である前記〔B— 19〕〜〔B— 21〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；

〔B— 23〕非イオン性界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である前記〔B— 19〕〜〔B— 21〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；

〔C 1〕少なくとも非イオン性界面活性剤存在下でアルカリ処理を施したジグリセリドを含有することを特徴とする脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔C— 2〕さらにジグリセリドから脾臓由来リパーゼ反応により生成されるモノグリセリドを、遊離のグリセロールを経由してグリセロール 3—リン酸に変換する酵素類を含有することを特徴とする前記〔C 1〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；〔C— 3〕酵素類としてモノグリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ラタテートデヒドロゲナーゼを含有し、さらに ATP、ホスフエノールピルビン酸、還元型 NADを含有することを特徴とする前記〔C 2〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔C— 4〕酵素類としてモノグリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセ口— 3—リン酸ォキシターゼを含有し、さらに ATPを含有することを特徴とする前記〔C 2〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[C- 5]さらにペルォキシターゼ、トリンダー試薬及びカップラーを含有することを特徴とする前記〔C 4〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[C-6]さらに緩衝液を含有することを特徴とする前記〔C— 1〕〜〔C— 5〕のいずれかに記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔C 7〕さらにコリパーゼ、及び胆汁酸又はその塩を含有することを特徴とする前記〔 C— 1〕〜〔C— 6〕のいずれかに記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[C - 8〕 2つ以上の試薬に分けたことを特徴とする前記〔C— 1〕〜〔C— 7〕の、ずれかに記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[C- 9] 1の試薬にグリセロールォキシターゼを添カ卩し、他のいずれかの試薬にグリセロールキナーゼ、アデノシン 3—リン酸のどちらか又は両方を添カ卩したことを特徴とする前記〔C 8〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔C 10〕前記〔C 3〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、脾臓由来リパーゼ反応で該ジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次!、でホスフォェノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型 NAD存在下にラタテートデヒドロゲナーゼを作用させ還元型 NADの 300〜400nm付近の波長における吸光度の減少速度を測定する脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；

〔C 11〕前記〔C 4〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、脾臓由来リパーゼ反応で該ジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール 3—リン酸に変換し、次、でグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼを作用させ過酸ィ匕水素に変換し、過酸化水素の増加速度を測定する脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；

ー12〕前記ー5〕に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、脾臓由来リパーゼ反応で該ジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール 3—リン酸に変換し、次、でグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼを作用させ過酸化水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルォキシダーゼを作用させ発色反応を行い 540〜700nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定する脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；

〔D—1〕少なくともジグリセリドを含有することを特徴とする非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔D— 2〕さらにジグリセリドから非脾臓由来リパーゼ反応により生成されるモノグリセリドを、遊離のグリセロールを経由してグリセロール 3—リン酸に変換する酵素類を含有することを特徴とする前記〔D— 1〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔D— 3〕酵素類としてモノグリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ラタテートデヒドロゲナーゼを含有し、さらに非イオン性界面活性剤、 ATP、ホスフォェノールピルビン酸、還元型 NADを含有することを特徴とする前記〔D— 2〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔D— 4〕酵素類としてモノグリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロー 3—リン酸ォキシダーゼを含有し、さらに非イオン性界面活性剤、 ATPを含有することを特徴とする前記〔D— 2〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[D- 5]さらにペルォキシダーゼ、トリンダー試薬及びカップラーを含有することを特徴とする前記〔D— 4〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；〔D— 6〕非イオン性界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現しな、濃度である前記〔D— 3〕〜〔D— 5〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[D- 7]さらに緩衝液を含有することを特徴とする前記〔D— 1〕〜〔D— 6〕のいずれかに記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[D-8] 2つ以上の試薬に分割したことを特徴とする前記〔D— 1〕〜〔D— 7〕の、ずれかに記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

[D- 9] 1の試薬にグリセロールォキシダーゼを添カ卩し、他のいずれかの試薬にグリセロールキナーゼ、アデノシン 3—リン酸のどちらか又は両方を添加することを特徴とする前記〔D— 8〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物；

〔D— 10〕前記〔D— 1〕〜〔D— 2〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、非脾臓由来リパーゼ反応で該ジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、該グリセ口ールを定量することを特徴とする非脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；

〔D— 11〕前記〔D— 3〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、非脾臓由来リパーゼ反応で該ジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次!、でホスフォェノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型 NAD存在下にラクテ一トデヒドロゲナーゼを作用させ還元型 NADの 300〜400nm付近の波長における吸光度の減少速度を測定する非脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；

〔D— 12〕前記〔D— 4〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、非脾臓由来リパーゼ反応で該ジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール— 3—リン酸に変換し、次いでグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼを作用させ過酸ィ匕水素に変換し、過酸化水素の増加速度を測定する非脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；〔D— 13〕前記〔D— 5]に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、非脾臓由来リパーゼ反応で該ジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール— 3—リン酸に変換し、次いでグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼを作用させ過酸ィ匕水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルォキシダーゼを作用させ発色反応を行い 540〜700nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定する非脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；〔D— 14〕非脾臓由来リパーゼと脾臓由来リパーゼを含有する検体中の非脾臓由来リパーゼ活性を測定する方法であって、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性の発現を抑制するように非イオン性界面活性剤の濃度を調整することを特徴とする非脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；

〔D— 15〕前記〔D— 1〕〜〔D— 9〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた非脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；

〔D— 16〕前記〔D— 3〕に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、非脾臓由来リパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次!、でホスフォェノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型 NAD存在下にラタテートデヒドロゲナーゼを作用させ還元型 NADの減少速度を測定する、非脾臓由来リパーゼ活性の測定方法；

〔D— 17〕前記〔D— 5]に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物中のジグリセリドを基質とし、非脾臓由来リパーゼ反応で該ジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール— 3—リン酸に変換し、次いでグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼを作用させ過酸ィ匕水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルォキシダーゼを作用させ発色反応を行ヽ、該発色の増加速度を測定する、非脾臓由来リパーゼ活性の測定方法。

発明の効果 [0014] 取り扱、が簡便であり再現性及び正確性に優れたリパーゼ活性測定試薬、リパーゼ活性測定用組成物を提供すること、及び長期保存安定性に優れたジグリセリドの水溶液を提供することが可能になる。また、再現性よぐ正確性に優れた脾臓由来リパーゼ活性を測定することが可能になる。さらに検体中、特に、血液検体中の非脾臓由来リパーゼ活性を、感度よく簡便に、且つ精度よく特異性高く測定することが可會になる。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]本発明の実施例 1—5に基づく脾臓由来リパーゼの希釈直線性の結果である。

[図 2]本発明の実施例 1 6に基づく非脾臓由来リパーゼの希釈直線性の結果である。

[図 3]本発明の実施例 2— 5に基づく非脾臓由来リパーゼの稀釈直線性の結果である。

[図 4]本発明の実施例 2— 6に基づく非イオン性界面活性剤の脾臓由来リパーゼ、非脾臓由来リパーゼ活性への影響を示す結果である。図中參印は非脾臓由来リパーゼを示し、國印は脾臓由来リパーゼを示す。

[図 5]反応式 1に基づく脾臓由来リパーゼ反応のタイムコースである。

[図 6]反応式 1に基づく脾臓由来リパーゼの稀釈直線性の結果である。

[図 7]反応式 3に基づく脾臓由来リパーゼの稀釈直線性の結果である。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 以下、本発明について具体的に説明する。

本発明の長期保存安定性に優れたジグリセリド水溶液、ジグリセリド水溶液の長期保存安定化方法、ジグリセリド水溶液の安定な流通保存方法は、該溶液を用いる各種製品、例えば、長期保存安定性に優れたリパーゼ活性測定用組成物やリパーゼ活性測定用試薬に有用である。また、リパーゼ活性測定用組成物やリパーゼ活性測定用試薬の長期保存安定化方法、リパーゼ活性測定用組成物やリパーゼ活性測定用試薬の流通時及び Z又は保存時の長期保存安定化方法に有用である。

[0017] 本発明のリパーゼ活性測定用組成物、リパーゼ活性測定用試薬、及びリパーゼ活性測定方法は、検体のリパーゼ活性の測定を正確且つ簡便に行うのに有用であり、特に、臨床検査分野における血中の脾臓由来リパーゼ又は非脾臓由来リパーゼ活性測定を正確且つ簡便に行うのに有用である。

[0018] 本発明のリパーゼ活性測定用組成物は、非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリド基質の長期安定性を向上させるために低濃度の pH緩衝液を共存させて、流通時及び Z又は保存時等の長期保存安定性を著しく向上させたジグリセリド溶液を用いることを特徴とする簡便性の高いリパーゼ活性測定用組成物である。さらには、非イオン性界面活性剤存在下でアルカリ処理を施したジグリセリド基質を低濃度の pH 緩衝液と共存させることも特徴とする。さら〖こは、測定対象のリパーゼの種類 (脾臓由来リパーゼ又は非脾臓由来リパーゼ）に応じて、非イオン性界面活性剤の濃度を適正化してあることも特徴とする。

[0019] 本発明のリパーゼ活性測定方法は、この基質に脾臓由来リパーゼあるいは非脾臓由来リパーゼが作用して遊離するモノグリセリドを酵素的に検出することを特徴とする

[0020] 本発明に用いることができるリパーゼの基質は、例えば、 1, 2—ジォレオルグリセリルコリン、 1—パルミトイル— 2—ォレイルグリセリルコリン、卵黄由来精製レシチン、又は大豆由来精製レシチン等のリン脂質を予め調製し、これらのリン脂質にホスフオリパーゼ Cを作用して得ることができる力レシチン等のリン脂質にホスフォリパーゼ C を反応させることによって得られる 1, 2—ジグリセリドが好ましい例として挙げられる。また、該 1, 2—ジグリセリドを、非イオン界面活性剤存在下でアルカリ処理を施して一部 1, 3—ジグリセリドに変換させたジグリセリド（1、 2—ジグリセリドと 1, 3—ジグリセリドの混合物)も本発明のリパーゼ反応の基質として用いることができる。より安定したリパーゼ活性を得ることができる点で、該 1, 2—ジグリセリドと 1, 3—ジグリセリド混合物の方がリパーゼ基質として好ましぐ 1, 2—ジグリセリドと 1, 3—ジグリセリド平衡状態付近の混合物であることが好ましヽ態様もある。このジグリセリド混合物は非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液を用い温度と加温時間を変えてアルカリ処理を施すことで得ることができる。アルカリ処理温度とアルカリ処理時間は、 1, 2—ジグリセリドと 1 , 3—ジグリセリドの比率を測定して適宜設定できる。具体的には 1, 2—ジグリセリドと 1, 3—ジグリセリドの比率が 2 : 1〜2： 3の範囲になるようにするのが好ましぐ 1 : 1から 2 : 3の範囲になるようにするのも好ましい。また、 2 : 1〜1 : 1の範囲になるようにするのが好ましい別の態様もある。さらに、 1, 2 ジグリセリドと 1, 3 ジグリセリドの比率力 70： 30〜30： 70の範囲になるようにするの力 S好ましく、 50： 50〜30： 70の範囲になるようにするのも好ましい。また、 1, 2 ジグリセリドと 1, 3 ジグリセリドの比率が 7 0 : 30〜50： 50の範囲になるようにするのが好ましい別の態様もある。さらに 1, 2 ジグリセリドと 1, 3 ジグリセリドの比率が 50 : 50〜35 : 65の範囲になるようにするのが好ましい別の態様もある。 1, 2 ジグリセリドと 1, 3 ジグリセリドの平衡状態を達成する条件としては、例えば pH8〜pH9の場合には 37°Cで 5〜8時間、 30°Cで 10〜20時間程度加温する方法、又、 ρΗ9〜ρΗ11の場合には 37°Cで 1時間程度加温する等の方法が挙げられる。 _PH9〜pHllの場合に 37°Cで 1時間程度加温する方法がより好ましい。また、 pH8〜pH9の場合に 37°Cで 5〜8時間、 30°Cで 10〜20時間程度加温する方法がより好ましい別の態様もある。 pH8〜pH9の場合においては、 pHの上限としては PH9.0未満であることが好ましぐ pH8.7以下であることがより好ましぐ pH8.5以下であることがさらに好ましぐまた pHの下限としては pH8.0以上であることが好ましぐ pH8 .1以上であることがより好ましぐ pH8.3以上であることがさらに好ましぐ pH8.4以上であることが特に好ましい。又、 ρΗ9〜ρΗ11の場合においては pHの上限としては pHll. 0以下であることが好ましぐ ρΗΙΟ.7以下であることがより好ましぐ ρΗΙΟ.5以下であることがさらに好ましぐ ρΗΙΟ.3以下であることが特に好ましぐ ρΗΙΟ.25以下であることが最も好ましぐまた pHの下限としては pH9.0以上であることが好ましぐ pH9.4以上であることがより好ましぐ pH9.5以上であることがさらに好ましぐ pH9.7以上であることが特に好ましぐ pH9.8以上であることが最も好ましい。このようにして調製した基質溶液は長期保存するために冷蔵保存することが好まヽ。この基質を後述するリパーゼ反応液に供する。

また、本発明により、低濃度の pH緩衝液、及び非イオン性界面活性剤存在下で実質的に 1, 2 ジグリセリドと 1, 3 ジグリセリドの平衡状態の濃度分布となっているジグリセリドを含有した液状であるリパーゼ活性測定用基質が提供される。平衡状態の濃度分布とは、 1, 2 ジグリセリドと 1, 3 ジグリセリドの比率が一定温度条件下変化しな、時点での 1 , 2 ジグリセリドと 1 , 3 ジグリセリドの割合であれば特に限定されないが、具体的にはジグリセリド混合物に対して上記アルカリ処理を行い、その後 4 °C〜8°Cで保存した状態が挙げられる。 4〜8°Cで保存した場合、 1, 2—ジグリセリドと 1, 3—ジグリセリドの比率は変化しない。冷蔵保存する時の pHは 5から 9.5範囲で使用することができるが、上限としては pH9.5以下であることが好ましぐ pH9.0以下であることがより好ましぐ pH8.5以下であることがさらに好ましぐ pH8.3以下であることが特に好ましぐ pH8.1以下であることが最も好ましぐ下限としては pH5.0以上であること力子ましく、 pH6.0以上であることがより好ましぐ pH7.0以上であることがさらに好ましぐ pH7.5以上であることが特に好ましぐ pH7.8以上であることが最も好ましい。また冷蔵保存時の pHとして、 pH8付近が好ま、別の態様もある。

なお、 1, 2—ジグリセリドと 1, 3—ジグリセリドの割合を測定する方法としては、薄層クロマトにより展開（展開溶媒；クロ口ホルム 95：アセトン 5)した後ャトロスキャン法 (検出は FID ;フレームィォナイス、スキャン法による）を用いて分析を行った。

リパーゼ反応に最適な基質濃度は 0.25mM〜2mMの範囲であるが 0.5mM程度が安定性およびリパーゼに対する特異性を考慮した場合特に好ま、。本発明で用いる原料ジグリセリドの濃度としては、下限値は 0.25mM以上が好ましぐ 0.30mM以上がさらに好ましぐ 0.32mM以上が特に好ましぐ 0.34mM以上が最も好ましい。また、上限値は 0.5mM以下が好ましぐ 0.4mM以下がさらに好ましぐ 0.38mM以下が特に好ましぐ 0.36mM以下が最も好ましい。特に、 0.35mM程度が安定性および脾臓由来リパーゼに対する特異性を考慮した場合に好ましい。本発明で用いるジグリセリドの濃度としては、非脾臓由来リパーゼ反応に最適な濃度を選択すればよぐ下限値は 0.25mM 以上が好ましぐ 0.30mM以上がさらに好ましぐ 0.32mM以上が特に好ましぐ 0.5mM 以上が最も好ましい。また、上限値は 2mM以下が好ましぐ ImM以下がさらに好ましく、 0.8mM以下が特に好ましぐ 0.6mM以下が最も好ましい。特に、 0.5mM程度が安定性および脾臓由来リパーゼに対する特異性を考慮した場合に好ましい。一般的に酵素活性を測定するための基質としては酵素に対する親和性が高い方が、基質が保存中に減少した場合でも一定の酵素活性が得られる点で好ましヽ。この親和性を表す指標は Km値である。脾臓由来リパーゼの 1, 2—ジグリセリドに対する Km値は 1. 1 X 10^_3Mであるのに対し、 1, 2—ジグリセリドと 1, 3—ジグリセリドの比率が 1 : 1の基質に対する Km値は 2. 3 X 10^_3Mであり 1, 3 ジグリセリドを含有する基質の方が好ましい。さらには 1, 3 ジグリセリドを多く含有する基質の方が好ましい。

[0023] ジグリセリドにおける高級脂肪酸残基としての脂肪酸としては炭素数 12以上の高級脂肪酸であればよぐ例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ァラキン酸等の飽和高級脂肪酸やパルミトォレイン酸、ォレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ァラキドン酸等の不飽和高級脂肪酸が挙げられる。これらの高級脂肪酸は 1種類だけでもよく 2種類の異なる高級脂肪酸の組み合わせであってもよ、が、不飽和高級脂肪酸を含有するジグリセリドが基質として調製した際の溶液の澄明度が高くより好ましい。特に好ましいジグリセリドとしては 1, 2—ジォレイルグリセロール、 1 ノレミトィル一 2—ォレイルグリセロールを挙げることができる。これらのジグリセリドを得るには 1, 2—ジォレオルグリセリルコリン、 1 パルミトイルー 2—ォレイルグリセリルコリン、卵黄由来精製レシチン、大豆由来精製レシチン等のリン脂質を予め調製し、これらのリン脂質にホスフォリパーゼ Cを作用させればよい。

[0024] 本発明におヽて、液状で長期安定性に優れたリパーゼ活性測定用組成物を得るために用いる非イオン性界面活性剤としてはポリオキシエチレン (POE)高級アルコールエーテル、 POE第 2級アルコールエトキシレート、 POEアルキルフエ-ルエーテル、 POE脂肪酸エステル、 POEソルビタン脂肪酸エステル等カゝら選択することができるが、溶解性、安定性の面で POEアルキルフエ-ルエーテル系非イオン性界面活性剤が好ましい。 POEアルキルフエ-ルエーテル系非イオン性界面活性剤としては、例えば、 POEノ-ルフエ-ルエーテル等が挙げられる。

[0025] 非イオン性界面活性剤の使用濃度は、脾臓由来リパーゼの場合には脾臓由来リバーゼ活性を最大に発現させ且つ阻害しない濃度範囲、すなわち原料ジグリセリドに対して 1.5〜2.5倍モル比の範囲で使用できるが特に 2倍モル比が好ま U、。非脾臓由来リパーゼの場合には、検体中に非脾臓由来リパーゼの活性を測定する上で影響を及ぼす成分が存在しない場合には通常の濃度設定でよぐ具体的には、ジグリセリドに対して 1.5倍モル比以上であればよい。検体中に非脾臓由来リパーゼの活性を測定する上で影響を及ぼす成分として脾臓由来リパーゼ等が存在する場合には、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現しない濃度、且つ、非脾臓由来リパーゼのリパーゼ反応を阻害しない濃度に調整することが好ましい。該調整のためには、ジグリセリドに対する非イオン性界面活性剤のモル比として 1.5〜2倍モル付近を回避すればよぐ 2.5倍モル以上が好ましぐ 3倍モル以上がより好ましぐ 4倍モル以上がさらに好ましぐ 5倍モル以上が特に好ましい。実作業の観点からの具体的な下限値としては、 0.08% (重量％)以上が好ましぐ 0.10%以上がより好ましぐ 0.15%以上がさらに好ましぐ 0.20%以上が特に好ましい。また、実作業の観点力もの具体的な上限値としては、 2% (重量％)以下が好ましぐ 1%以下がより好ましぐ 0.5%以下がさらに好ましぐ 0.3%以下が特に好ましい。好適な範囲の一例としては、 0.15%〜2%、特に 0.2 〜0.3%が挙げられる。

[0026] 本質的には、ジグリセリドと非イオン性界面活性剤のモル比によって形成される水に可溶性のミセル構造に着目し、ジグリセリド：非イオン性界面活性剤 = 1： 2付近で形成されるミセル構造と異なるミセル構造を形成するのに必要な量以上の非イオン性界面活性剤を用いればよい。また、脾臓由来リパーゼ活性が発現せず非脾臓由来リパーゼ活性を発現する 10〜30倍モル比の範囲で使用することができる力特に 15〜 20倍モル比で使用することが好まし、。

[0027] 本発明において、界面活性剤に溶解したジグリセリドの長期保存安定性を得るために用いる pH緩衝液としては、例えばトリス一塩酸、 TES、 HEPES、 TAPSO、 POPSO、 T ricine、 Bicine等のグッドの緩衝液やグリシン一水酸ィ匕ナトリウム緩衝液等を使用することができるが、中でも、試薬ブランクが低い Tricine、 Bicineがより好ましぐ Bicineが特に好ま、。使用する濃度はジグリセリド濃度と同倍モル〜 2倍モル程度でょ、。界面活性剤に溶解したジグリセリドの長期保存安定性は、共存する pH緩衝液の濃度に依存するため _PH緩衝液濃度の選択は極めて重要である。非イオン性界面活性剤に溶解したジグリセリドに添加する pH緩衝液の濃度が、例えば 10mM以上の高濃度条件では、ジグリセリドは室温にぉ、て不安定であり冷蔵保存を行ったときですら長期保存により加水分解を受ける。ジグリセリドの長期保存安定性を維持するためには 0.5〜9mMの範囲で使用することが好ましい。より好ましくは 2〜7mM、特に好ましくは 3〜5mMである。従って、リパーゼ測定用組成物においては、ジグリセリド、界面活性剤を含有する溶液の長期安定性や、測定対象リパーゼの種類等を考慮して、必要に応じて試薬を分割する等の工夫を施すことが大変に好ましい。

[0028] 本発明のリパーゼ活性測定用組成物は下記の 6つの形態がある。

[0029] A) 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、グリセロー 3 リン酸ォキシダーゼ、ペルォキシダーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも前記〔A— 1〕又は〔A— 2〕記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2 ;から構成される。

前述したようにリパーゼ基質のジグリセリドは低濃度の緩衝液で使用することが好ましいが、基質を含有しない方の試薬の緩衝液の濃度は自由に選択することができる。高濃度の pH緩衝液はリパーゼ反応の再現性を確保するためには必須である。使用する濃度の下限値としては、 50mM以上が好ましぐ lOOmM以上がより好ましぐ 15 OmM以上が更に好ましぐ 180mM以上が特に好ましい。また上限値としては、 500m M以下が好ましぐ 300mM以下がより好ましぐ 250mM以下が更に好ましぐ 220mM 以下が特に好ま U、。 200mM付近が最も好まし、。

緩衝液の pHは脾臓由来リパーゼの場合には最適 pHは 7.8〜8.1であり、非脾臓由来リパーゼの最適 _PHは 7.7〜8.3であり、この pH範囲に pH緩衝能のある緩衝液、例えばトリス一塩酸、 TES、 HEPES、 TAPSO、 POPSO、 Tricine、 Bicine等のグッドの緩衝液を使用することができる力中でも、試薬ブランクが低い Tridne、 Bicineがより好ましく、 Bicineが特に好ましい。

[0030] B)少なくとも低濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、グリセロー 3—リン酸ォキシダーゼ、ペルォキシダーゼ、前記記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の緩衝液を含有する試薬 2 ;から構成される。尚、組成物の中のモノグリセリドリパーゼ、グリセ口キナーゼ、ダリセロー 3—リン酸ォキシダーゼ、ペルォキシダーゼその他の構成成分の最良の形態は後記の反応式 3で詳細に説明する。

[0031] C) 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、酸化型 NADまたは酸化型 NADP、グルコース、 ADP—へキソキナーゼ、グルコース 6 リン酸デヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも前記のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2 ;から構成される。 [0032] D) 1)少なくとも低濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、酸化型 NADまたは酸化型 NADP、グルコース、 ADP キソキナーゼ、グルコース 6 リン酸デヒドロゲナーゼ、前記記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 1と； 2)少なくともを高濃度の緩衝液を含有する試薬 2；から構成される。尚、本発明で使用する酵素のモノグリセリドリパーゼ、グリセ口キナーゼ、 ADP キソキナーゼ、グルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼの最良の形態については後記の反応式 2で詳細に説明する。

[0033] E) 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、還元型 NAD、ホスフォェノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ラタテートデヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも前記記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2；から構成される。

[0034] F) 1)少なくとも低濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、還元型 NAD、ホスフォェノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、ラタテートデヒドロゲナーゼ、前記記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の緩衝液を含有する試薬 2 ;から構成される。尚、 E)、 F)で使用する酵素のモノグリセリドリパーゼ、グリセ口キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ラタテートデヒドロゲナーゼの最良の形態については後記の反応式 1で詳細に説明する。

[0035] ジグリセリドを基質にした際のリパーゼ反応の生成物は遊離脂肪酸とモノグリセリドである。遊離脂肪酸もしくはモノグリセリドを酵素反応を共役させて分光学的手法でこれらの生成速度を測定することによりリパーゼ活性を測定することができるが遊離脂肪酸は血中に存在しており特にへパリン静注後又は透析後の血清中では高濃度になる。このためモノグリセリドを酵素法により測定する方が好ましい。該モノグリセリドを定量する際は、関与する共役酵素を用いた酵素法を用いて測定するのが好ましい。

[0036] モノグリセリドを酵素法により定量する方法として下記反応式に示す 3つの方法がある。

下記反応式中 MGLPはモノグリセリドリパーゼ、 GKはグリセロールキナーゼ、 ATPはァデノシン一 3 リン酸、 ADPはアデノシン一 2 リン酸、 PEPはホスフォエノールビルビン酸、 NADHは還元型 βジホスフオビリジンヌクレオチド、 NADは酸化型 βジホスフォピリジンヌクレオチド、 ADP— HKは ADP依存性のへキソキナーゼ、 G6PDHはダルコス 6—リン酸デヒドロゲナーゼである。 GPOはグリセロー 3—リン酸ォキシダーゼ、 P ODはペルォキシダーゼ、 4— AAは 4—ァミノアンチピリン、 TOOSはェチル N— (2 —ヒドロォキシ 3—スルフォプロピル)一 m—トルイジンナトリウムである。

[化 1]

反応式 1

MGLP

Monoglyceride + H₂0 ► Glycerol + Fatty acid

GK

Glycerol + ATP Giycerol-3phosphate + ADP

PK ADP + PEP ► Pyruvate + ATP

し DH

NADH + Pyruvate ► NAD + Lactate

[0038] [化 2] 反応式 2

MGLP

Monoglyceride + H₂0 Glycerol + Fatty acid

GK

Glycerol + ATP - Glycerol-3phosphate

ADP-HK

ADP + Giucose Glucose— 6— phosphate

G6PDH

Glucose-6-phosphate + NAD(P) ► NAD(P)H + Glucono- δ -6-phosphate

[0039] [化 3] 反応式 3

MGLP

Monoglyceride + H₂0 ^ Glycerol + Fatty aci。

GK

Glycerol + ATP ► Giyceroト 3phosphate + ADP

GPO

Glycer。ト 3- phosphate + O_z ► Dihydroxyacetonephosphate + H₂0₂

POD

2H₂0₂ + 4-AA + TOOS ► Quinoneimine dye + 4H₂0

[0040] まず反応式 1の場合にっ、て述べる。

本発明で用いるモノグリセリドリパーゼとしては、ジグリセリドに作用せずモノグリセリドに特異的に作用する酵素であれば特に起源は問わないが安定供給の点で微生物由来酵素が好ましい。中でもバチルス属由来酵素が好ましい。リパーゼ反応における共役酵素として使用する濃度の下限値としては、 0.5U/ml以上が好ましぐ 0.6U/ml 以上がより好ましぐ 0.7U/ml以上がさらに好ましぐ 0.72U/ml以上が特に好ましぐ 0. 74U/ml以上が大変に好ましい。上限値としては、 5U/ml程度あれば充分であり、 3U/ ml以下が好ましぐ 1.13U/ml以下がより好ましぐ lU/ml以下がさらに好ましぐ 0.8U/ ml以下が特に好ましぐ 0.78U/ml以下が大変に好ましぐ 0.76U/ml以下が特に大変に好まし、。最も好ましヽのは 0.75U/ml付近である。

[0041] 本発明で用いるグリセ口キナーゼは特にその起源は問わないが安定性に優れた酵素の使用が好ましい。中でもフラボパクテリゥム属由来酵素が好ましい。脾臓由来リパーゼ反応における共役酵素として使用する濃度は、下限値としては 0.1U/ml以上が好ましぐ 0.15U/ml以上がより好ましぐ 0.18U/ml以上がさらに好ましぐ 0.2U/ml以上が特に好ましい。また、上限値としては 2U/ml程度あれば充分であり、 lU/ml以下が好ましぐ 0.5U/ml以下がより好ましぐ 0.3U/ml以下がさらに好ましぐ 0.22U/ml以下が特に好ま U、。最も好まし、のは 0.2U/ml付近である。

[0042] 本発明で用いるピルビン酸キナーゼは、臨床検査試薬の原料として汎用される動物筋肉由来酵素を使用することができる。脾臓由来リパーゼ反応における共役酵素としてのピルビン酸キナーゼは 0.5〜10U/ml程度あればよぐ l〜2U/mlの範囲が好ましぐ 0.8〜1.2U/mlの範囲が特に好ましい。最も好ましいのは lU/ml付近である。ピルビン酸キナーゼの基質である、本発明で用いるホスフォェノールピルビン酸は 0.3〜2 mMの範囲、好ましくは 0.3〜0.4mM、或いは 0.48〜0.52mMで使用することができるが好ましくは 0.5mM付近である。

[0043] 本発明で用いるラタテートデヒドロゲナーゼは、その起源は特に問わないが安定性に優れたトリ心臓由来酵素の使用がより好ましい。脾臓由来リパーゼ反応における共役酵素としての本酵素は 0.15〜1.5U/ml程度あればよぐ好ましくは 0.3〜0.4U/ml、或いは 0.28〜0.32U/mlの範囲が挙げられる。好ましくは 0.3U/ml付近である。

ラタテートデヒドロゲナーゼの基質である、本発明で用いる還元型 NADは 0.2〜0.4 mMの範囲が好ましぐ 0.2〜0.35mMの範囲がさらに好ましぐ 0.28〜0.32mMの範囲が特に好ましい。好ましくは 0.3mM付近である。 0.3-0.4 mMの範囲が好ましい態様もめる。

[0044] グリセ口キナーゼおよびピルビン酸キナーゼの活性化剤であるマグネシウムイオンを、本発明の組成物にさらに添加した組成物も大変に好ましい。該マグネシウムィォンは 1.5〜4mMの範囲、好ましくは 1.8〜2.2mMの範囲で使用することができる力特に好ましくは 2mM付近である。マグネシウムイオンは塩化マグネシウム、硫酸マグネシゥム、酢酸マグネシウム等の塩を使用することができるが中でも硫酸マグネシウムが特に好ましい。

[0045] リパーゼ反応の pHを一定に保っために緩衝液を使用することは大変に好ましい。

脾臓由来リパーゼの場合は pH7.7〜8.1、非脾臓由来リパーゼの最適 pHは 7.7〜8.3 であり、この pH範囲に緩衝能のある緩衝液、例えばトリス—塩酸、 TES、 HEPES、 TAP SO、 POPSO、 Tricine、 Bicine等のグッドの緩衝液を使用することができる力中でも、試薬ブランクが低い Tricine、 Bicineがより好ましぐ Bicineが特に好ましい。使用する濃度の下限値としては、 50mM以上が好ましぐ lOOmM以上がより好ましぐ 150mM 以上が更に好ましぐ 180mM以上が特に好ましい。また上限値としては、 500mM以下が好ましぐ 300mM以下がより好ましぐ 250mM以下が更に好ましぐ 220mM以下が特に好まし、。 200mM付近が最も好まし、。

[0046] 次に反応式 2について述べる。

反応式 2を用いるリパーゼの測定試薬組成の中で緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼおよび ATPは、前記反応式 1の内容と同一である。グリセロールキナーゼの生成物のひとつである ADPは、グルコース存在下 ADP依存性へキソキナーゼ（ADP-HK)によりグルコース— 6—リン酸に変換できる。 ADP-HKは特にその起源は問わないが、安定供給の点で微生物由来が好ましい。中でも保存安定性に優れたパイロコッカス属ゃサ一モコッカス属等の高度好温菌由来酵素が特に好ましい。 ADP-HKの基質であるグルコースは 2〜50mMの範囲で使用することができるが中でも 10〜30mM特に 15〜25mMが特に好ましい。リパーゼ反応の共役酵素としての本酵素の濃度は 0.2〜3U/mlの範囲で使用できるが 0.4〜lU/mlが特に好ましい。本酵素の生成物であるグルコース 6—リン酸は酸化型 NADまたは NADP存在下でグルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼによって還元型 NADまたは NADPに変換できる。グルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼは特にその起源は問わないが安定供給の点で微生物由来酵素が好ましい。なかでもロイコノストツク属由来酵素が特に好まし、。リパーゼ反応の共役酵素としての本酵素の濃度は 0.2〜3U/mlの範囲で使用できるが 0.4〜： LU/mlが特に好ましい。

次に反応式 3について述べる。

反応式 1を用いるリパーゼの測定試薬組成の中で緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼおよび ATPは前記反応式 1の内容と同一である。グリセロールキナーゼの生成物のひとつであるグリセロール 3—リン酸はこれを特異的に酸ィ匕するグリセ口 3—リン酸ォキシダーゼにより過酸ィ匕水素に変換することができる。グリセロー 3—リン酸ォキシダーゼは特にその起源は問わな、が、安定供給の点で微生物由来が好ましい。中でも乳酸菌由来酵素が特に好ましい。脾臓由来リパーゼ反応の共役酵素としての本酵素の濃度は 2〜50U/mlの範囲で使用できるが 5〜20U/mlが特に好ましヽ。グリセ口 3—リン酸ォキシダーゼ反応で生成される過酸ィ匕水素はペルォキシダーゼとトリンダー試薬の色原体とカップラーとの酸ィ匕縮合により色素を生成する。トリンダー型試薬の色原体としては、フエノール誘導体、ァ-リン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例として Ν,Ν ジメチルァ-リン、 Ν,Ν ジェチルァ-リン、 2, 4 ジクロロフエノール、 Ν—ェチル Ν— (2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル)— 3, 5—ジメトキシァ-リン (DAOS)、 N—ェチル—N—スルホプロピル— 3, 5—ジメチルァ-リン (MAPS)、 N—ェチル N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメチルァ-リン（MAOS)、 N—ェチルー N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプ口ピル） m—トルイジン（TOOS)、 N—ェチルー N—スルホプロピル— m—ァ-シジン (ADPS)、 N—ェチルー N—スルホプロピルァ-リン（ALPS)、 N—ェチルー N—スルホプロピル— 3, 5—ジメトキシァ-リン（DAPS)、 N—スルホプロピル— 3, 5—ジメトキシァ-リン（HDAPS )、 N—ェチルー N—スルホプロピル— m トルイジン（TOPS)、 N— ェチル N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル）—m—ァ-シジン（ADOS)、 N— ェチル N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）ァ-リン（ALOS)、 N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメトキシァ-リン（HDAOS)、 N—スルホプロピル—ァ-リン (HALPS) (以上同人化学研究所社製)等が挙げられる。脾臓由来リバーゼ活性測定試薬中での濃度は 0.02〜0.5%の範囲で使用することができるが 0.05 〜0.1%の範囲が特に好ましい。カップラーとしては 4 ァミノアンチピリン若しくは 3— メチル 2—ベンゾチアゾリノンヒドラゾン (MBTH)等のカップラーを使用することができる。脾臓由来リパーゼ活性測定試薬中での濃度は 0.02〜0.5%の範囲で使用することができるが 0.05〜0.1%の範囲が特に好ましい。

[0048] また過酸ィ匕水素はパーォキシダーゼ存在下ロイコ型試薬を用いて発色することができる。この試薬の具体例としては、 0—ジァ-シジン、 0—トリジン、 3, 3—ジァミノべンジジン、 3, 3, 5, 5—テトラメチルベンジジン；以上同人化学研究所社製、 N- (カルボキシメチルァミノカルボ-ル）—4, 4 ビス（ジメチルァミノ）ビフエ-ルァミン（DA64 )、 10— (カルボキシメチルァミノカルボ-ル）— 3, 7 ビス（ジメチルァミノ）フエノチアジン (DA67)；以上和光純薬社製等が挙げられる。

[0049] 本発明で使用するペルォキシダーゼはその起源は特に問わないが、既に安定供給されている西洋わさび大根由来の酵素が特に好ましい。リパーゼ反応の共役酵素としては 2〜50U/mlの範囲で使用できるが 5〜20U/mlが特に好ましい。

[0050] また過酸ィ匕水素は蛍光法、化学発光を利用した分析法、アルコールカゝら生じたァルデヒドを定量する方法、又は電極法でも定量することができる。蛍光法には、酸ィ匕によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、 4ーヒドロキシフヱ-ル酢酸、チラミン、ノラクレゾール、ジァセチルフルォレスシン誘導体等を、化学発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノール、ピロガロール等を用いることが出来る。カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドを定量する方法としては、ハンチ反応を用いる方法や、 MBTHとの縮合反応により発色させる方法、若しくはアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いる方法等が挙げられる。

[0051] また過酸ィ匕水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられ、電極測定方法としてはアンべロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の、公知の方法を用いることが出来、さらにォキシダーゼまたは基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフエ口セン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またォキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を測定しても良、。

[0052] 本発明のリパーゼ活性測定用組成物は、全てを含有する 1つの試薬として用いてもよいが、試薬 1 (R1)と試薬 2 (R2)の 2つに分けて使用することが好ましい。反応式 1の場合、 R1としては、例えば、 ATP、ホスフォェノールピルビン酸、モノグリセリドリパーゼ、グリセ口キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ラタテートデヒドロゲナーゼを含有する試薬が好ましぐさらにカルシウムイオン、マグネシウムイオン、アンモ-ゥムイオン、グッドの緩衝液等を含有してもよい。反応式 1〜3の R1あるいは R2には共通してリパーゼの基質であるジグリセリドを非イオン性界面活性剤に溶解させて使用する。ジグリセリドを変性させな、で水溶液状で長期保存安定性を確保するためには R2中の緩衝液濃度が極めて重要である。緩衝液の種類としては酢酸バッファー、クェン酸バッファ一、トリス塩酸バッファー、 MESゝ Bis- Trisゝ ADAゝ PIPESゝ ACES, MOPSO、 BESゝ MOP S、 TES、 HEPPES、 DIPSO、 TAPSO、 POPSO、 HEPPSO、 EPPS、 Tricine, Bicine、 TAP S、 CHES、 CAPSO、 CAPS等のグッドのバッファーの中力も選択することができる。その濃度は 0.5〜10mMの範囲で使用することができるが好ましくは l〜5mM、特に好ましくは 1.5〜2mMである。また R2には脾臓由来リパーゼを測定する際には胆汁酸又はその塩、還元型 NADを含有する試薬が好ましぐさらにグッドの緩衝液等を含有してもよい。胆汁酸としては、デォキコール酸、タウロデオキシコール酸、又はグリコデォキシコール酸が好ましぐデォキシコール酸がより好ましい。これらのタウロデオキシコール酸、グリコデォキシコール酸、及びデォキシコール酸についてはナトリウム塩の方が水への溶解度が高いため特に好ましい。胆汁酸の塩としてはナトリウム塩に限定されることはなぐカリウム塩等も好ましい例として挙げられる。

[0053] 血清等の生体成分中には遊離のグリセロールが存在することがあり正誤差を生じる危険性が考えられるため検体中の遊離のグリセロールを消去することが好ましい。消去する方法は反応式 1、 2と反応式 3とでは異なる。反応式 1、 2を利用する場合 R1に遊離のグリセロールを消去する目的でグリセロールに作用する酸ィ匕酵素（グリセロールォキシダーゼ）を添カ卩し遊離のグリセロールをアルデヒドに変換することで遊離のグリセロールの影響を回避することができる。この際にはグリセロールキナーゼ、 ATPのどちら力または両方を R2に添加すればょ、。該グリセロールォキシダーゼとしては、ァスペルギルス属、ノイロスポラ属、ぺニシリウム属由来のグリセロールォキシダーゼ等の公知のグリセロールォキシダーゼを使用することができる（ァダリカルチャル'バィォロジカル 'ケミストリー 44卷、 2号、 399〜406頁、 1980年を参照）。

[0054] 反応式 3を利用する場合のグリセロールは、グリセ口キナーゼ、グリセロー 3 リン酸ォキシダーゼ、カタラーゼあるいはパーォキシダーゼとフエノール誘導体、ァ-リン誘導体、トルィジン誘導体等のトリンダー試薬の色原体とを含有する試薬 1 (R1)に被験液を添加し予め加温することでこの成分を消去することができる。トリンダー型試薬の色原体としては、反応式 1で説明した色原体が挙げられる。

[0055] 試薬 2 (R2)は 4ァミノアンチピリン若しくは 3—メチル 2 ベンゾチアゾリノンヒドラゾン (MBTH)等のカップラー力もなる成分で構成される。 R1と R2が混合されると同時にグリセ口― 3—リン酸ォキシダーゼ反応で生成される過酸ィ匕水素はトリンダー試薬の色原体とカップラーとの酸化縮合により色素を生成する。この色素の吸光度を分光学的に測定することができる。

[0056] 反応式 1、 2および反応式 3を使用してリパーゼ活性測定試薬を調製する際には必要に応じて酵素の安定化剤、例えばシュクロース、マン-トール、ソルビトール、マルトース、ラタトース、サイクロデキストリン、トレハロース等の糖類、 EDTA等のキレート剤を適宜添加してもよい。添加する糖類の濃度は 1〜20%の範囲で使用できるが好ましくは 3〜15%特に好ましくは 4〜8%である。キレート剤を使用する場合にはその濃度範囲は 0.02mM〜lmMであり、好ましくは 0.05mM〜0.5mM、特に好ましくは 0.1〜0. 3mMである。更に各種の防腐剤、例えばアジ化ナトリウムの 0.01〜10%、好適には 0.0 5〜1%を適宜添加してもよい。さらに必要に応じて、 3つ以上の試薬に分割して使用することも可會である。

[0057] また、本発明のリパーゼの測定用試薬は溶液状で安定であるため凍結乾燥法での製剤化が必要でなく試薬を取り扱う上では極めて簡便で操作性に優れて、る。またこれらのリパーゼ活性測定方法は、正確さや再現性に優れている。具体的には、反応式 1の場合にはリパーゼ反応でジグリセリド力遊離されるモノグリセリドをモノダリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次!、でホスフォェノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型 NAD存在下にラタテートデヒドロゲナーゼを作用させ還元型 NADの吸光度の減少速度を測定する、リパーゼ活性の測定方法である。還元型 NADの吸光度を測定する際の波長としては、試料中の脾臓由来リパーゼ活性を正確に測定できる波長であれば何を用いてもよい（ある 1波長でもよいし、ある範囲の波長の積算でもよい）が、例えば、 300〜400nm力選択することが好ましぐ 320〜360nmから選択することがより好ましぐ 330〜350nmから選択すること力 Sさらに好ましぐ 340nm付近を選択することが大変に好ましい。 340nm付近とは例えば、 340nmに設定し、その誤差範囲が 10nm以下であることが好適な例として挙げられ、その誤差範囲力 S5nm以下であることがより好適な例として挙げられ、その誤差範囲力^ nm以下であることがさらに好適な例として挙げられ、その誤差範囲が lnm以下であることが大変に好適な例として挙げられる。

[0058] 反応式 2の場合にはリパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次!、でダルコース存在下に ADP依存性へキソキナーゼでグルコース 6—リン酸に変換し、更に酸化型 NADまたは酸化型 NADP存在下にダルコースー 6—リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ還元型 NADまたは還元型 N ADPの吸光度の増加速度を測定する、リパーゼ活性の測定方法である。還元型 NAD の吸光度を測定する際の波長としては、試料中の脾臓由来リパーゼ活性を正確に測定できる波長であれば何を用いてもょヽ（ある 1波長でもよ、し、ある範囲の波長の積算でもよい） 1S 例えば、 300〜400nmから選択することが好ましぐ 320〜360nmから選択することがより好ましぐ 330〜350nm力選択することがさらに好ましぐ 340nm付近を選択することが大変に好ましい。 340nm付近とは例えば、 340nmに設定し、その誤差範囲が 10應以下であることが好適な例として挙げられ、その誤差範囲力應以下であることがより好適な例として挙げられ、その誤差範囲が 3應以下であることがさらに好適な例として挙げられ、その誤差範囲力 ^應以下であることが大変に好適な例として挙げられる。

[0059] 反応式 3の場合にはリパーゼ反応でジグリセリドから遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、次いでこれを ATP存在下にダリセロールキナーゼによりグリセロール 3—リン酸に変換し、次いで生成される過酸化水素をペルォキシダーゼとトリンダー試薬、カップラー試薬とにより可視部の波長をもつキノン色素に変換できる。波長は使用するトリンダー試薬によって異なるが 540 700nm付近の波長を選択すればょ生成される色素の増加速度をレート法によつて測定してもよぐまたは一定時間反応を行った後ラウリル硫酸ナトリウムのような酵素変性剤で反応を停止した後 540 700 付近の波長でその吸光度を測定してもよい。

[0060] へパリン静注後又は透析中のへパリン使用中において、血中に出現するリパーゼは肝臓由来のリパーゼとリポプ口ティンリパーゼであり上記のリパーゼ測定用組成物ではこれらの両者の酵素を同時に測定されることになる力どちらか一方のリパーゼを特異的に測定する必要がある場合には他方のリパーゼを特異的に阻害する阻害剤や抗体を用いてリパーゼ特異性を出すこともできる。

実施例

[0061] 以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。

[0062] [実施例 1 1]リパーゼ基質ジグリセリドの調製

卵黄レシチン由来ホスファチジルコリン（旭化成ファーマ社製） 1.5gを 10mlのクロ口ホルムに溶解する。 400Unitのホスフオリパーゼ C (旭化成ファーマ社製）を溶解した 5 mlの 0.5MPIPES— NaOH緩衝液 (pH7.5)をカ卩ぇ 37°Cで攪拌しながら加水分解反応を行った。 2時間後溶媒層と水槽とを分離しクロ口ホルム層を集め、予めクロ口ホルムに懸濁したシリカゲルカラム（3ml)に通しクロ口ホルムで展開しジグリセリド画分を得た。ロータリーエバポレーターでクロ口ホルムを完全に留去しオイル状のジグリセリド l.lg を得た。

[0063] [実施例 1 2]前記反応式 2における脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物の調製

1)試薬 1 (R1)の調製

200mMBicine-NaOH (pH8.0) , 2mM塩化カルシウム、 2mM硫酸マグネシウム、 20m M塩化アンモ-ゥム、 3mMアデノシン 3リン酸、 30mMグルコース、 3mMNADP、モノグリセリドリパーゼ（旭化成ファーマ社製） 1125U/L、グリセ口キナーゼ（旭化成ファーマ社製） 600U/L、グルコース 6 リン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡社製） 600U/L、 ADP— HK (旭化成ファーマ社製） 900U/L、コリパーゼ（旭化成ファーマ社製） 15000U/Lから成る試薬を調製した。

2)試薬 2 (R2)の調製

実施例 1— 1で得たジグリセリドを一定量秤量し、 0.4mMになるように 0.04%POEノ- ルフエ-ルエーテル（1.5mM MES— NaOH緩衝液、 pH5.5)を一定量カ卩え、 37°Cで 30 分間攪拌して完全に澄明な基質溶液を得た。この基質溶液にデォキシコール酸を 8 mMになるように添加し溶解して調製した。

[0064] [実施例 1 3]前記反応 3における非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物の調製

1)試薬 1 (R1)の調製

300mMトリス塩酸バッファー（pH8.5) , 2mM塩化カルシウム、 3mM硫酸マグネシウム、アデノシンー3 リン酸3mM、モノグリセリドリパーゼ（旭化成ファーマ社製） 1125U/ L、グリセ口キナーゼ（旭化成ファーマ社製） 600U/L、グリセロー 3 リン酸ォキシダーゼ（旭化成ファーマ社製） 30000U/L、ペルォキシダーゼ（シグマ社） 5000U/L、 0.2%T OOSから構成される試薬を調製した。

2)試薬 2 (R2)の調製

実施例 1— 2記載の方法で調製したジグリセリド基質液 (ジグリセリド濃度が 1.5mM、 POE—ノ-ルフエ-ルエーテル濃度が 0.3%) ImM Bicine- NaOH (pH8.0)、 0.2%4 ァミノアンチピリンで構成される試薬を調製した。

[0065] [実施例 1 4]リパーゼ基質ジグリセリドの保存安定性

実施例 1 1で得たジグリセリドを一定量秤量し、ジグリセリド濃度が 0.6mMになるように 0.06%POEノ-ルフエ-ルエーテルを含有する 0.5〜200mMの Bicine- NaOH緩衝液 (pH8)を添加し 37°Cで 3日間加温し、残存するジグリセリド濃度を酵素法により測定した (防腐剤として 0.1%アジィ匕ナトリウムを使用）。

結果を表 1に示した。表 1に示した結果から、緩衝液濃度が高くなるとジグリセリド基質残存率が低下することが明らかである。

[0066] [表 1] 緩衝液濃度（m M) 基質残存率（％)

0 . 5 9 9 . 6

1 9 8 . 1

2 . 5 9 9 . 4

5 9 8 . 8

1 0 9 6 - 9

2 0 8 8 . 4

5 0 8 4 . 9

1 0 0 8 3 . 5

2 0 0 6 3 - 9

[0067] [実施例 1 5]脾臓由来リパーゼ活性測定

実施例 1—2に示した組成の試薬 1 (R1) 1000マイクロリットルに検体 0〜50マイクロリットルの酵素液を加え、 37°Cで 3分間反応を行った後、実施例 1—2に示した組成の試薬 2 (R2) 500マイクロリットルを添カ卩し 37°Cで反応をスタートさせた。 340nmにおける吸光度を連続的に測定した。酵素量に対する吸光度変化の直線性を図 1に示した。

[0068] [実施例 1 6]非脾臓由来リパーゼ活性測定

実施例 1—3に示した組成の試薬 1 (R1) 1000マイクロリットルにへノリンを静注後 15 分後の血漿検体を添加し 37°Cで 5分間保温した。その後 R2を 500マイクロリットル添カロし発色反応をスタートさせ 550應における吸光度を連続的に測定した。酵素量に対する吸光度変化の直線性を図 2に示した。

[0069] [実施例 2— 1]非脾臓由来リパーゼ反応液用基質ジグリセリドの調製

卵黄レシチン由来ホスファチジルコリン（旭化成ファーマ社製） 1.5gを 10mlのクロ口ホルムに溶解した。 400Unitのホスフオリパーゼ C (旭化成ファーマ社製）を溶解した 5 mlの 0.5M PIPES— NaOH緩衝液 (pH7.5)をカ卩ぇ 37°Cで攪拌しながら加水分解反応を行った。 2時間後、溶媒層と水層とを分離し溶媒層を集め、予めクロ口ホルムに懸濁して調製した湿式のシリカゲルカラム（3ml)にチャージし、クロ口ホルムで展開して、標題のジグリセリド画分を得た。

[0070] [実施例 2— 2— 1 ]非脾臓由来リパーゼ反応用基質溶液の調製

実施例 2— 1で得たジグリセリドのクロ口ホルム溶液を一定量とり、減圧下で溶媒を完全に溜去した。 10mMになるように 2%POE ノ-ルフエ-ルエーテル（10mM MES — NaOH緩衝液、 pH5.5)を一定量カ卩え、 37°Cで 30分間攪拌して、標題の基質溶液を完全に澄明な基質溶液として得た。本基質溶液は冷蔵 (約 4°C)で保存した。

[0071] [実施例 2— 2— 2]アルカリ処理を施した非脾臓由来リパーゼ反応用基質溶液の調製

実施例 2— 2— 1にお、て、 pHが 5.5の緩衝液を用いる代わりに pHが 7.97である緩衝液 (トリス—塩酸)を用いる以外は実施例 2— 2—1と同様に行なって、標題の基質溶液を完全に澄明な基質溶液として得た。本基質溶液は冷蔵 (約 4°C)で保存した。

[0072] [実施例 2— 3]反応式 1を共役酵素系とした例

非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物の調製

標題の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物として、試薬 1 (R1)と試薬 2 (R2)からなる試薬を調製した。

1)試薬 1 (R1)の調製

300mM Bicine-NaOH (pH8.0)、実施例 2記載の方法で調製したジグリセリド基質液（ジグリセリド濃度力 Sl.5mM、 POE—ノユルフェ-ルエーテル濃度が 0.3%)、 3mM硫酸マグネシウム、 3mMアデノシン一 3—リン酸、 1.5mMホスフォェノールピルビン酸、モノグリセリドリパーゼ (旭化成ファーマ社製） 1125U/L、グリセロールキナーゼ (旭化成ファーマ社製 300U/L、ピルビン酸キナーゼ（オリエンタル酵母社製） 3000U/L、ラタテートデヒドロゲナーゼ (オリエンタル酵母社製) 600U/Lカゝら構成される試薬を調製した。

2)試薬 2 (R2)の調製

10mM Bicine-NaOH (pH8.5)、 ImM還元型 NADで構成される試薬を調製した。

[0073] [実施例 2— 4]反応式 3を共役酵素系とした例

非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物の調製

1)試薬 1 (R1)の調製

300mM Bicine-NaOH (pH8.0)、実施例 2— 2—1及び 2— 2— 2に記載の方法で調製したジグリセリド基質液 (ジグリセリド濃度力 l.5mM、 POE—ノユルフェ-ルエーテル濃度が 0.3%)、 3mM硫酸マグネシウム、 30mM塩化アンモ-ゥム、アデノシンー3—リン酸 3mM、モノグリセリドリパーゼ（旭化成ファーマ社製） 1125U/L、グリセロールキナーゼ (旭化成ファーマ社製) 300U/L、グリセ口リン酸ォキシダーゼ (旭化成ファーマ社製 ) 15U/ml、ペルォキシダーゼ（シグマ社） 1500U/L、 0.2%TOOSから構成される試薬を調製した。

2)試薬 2 (R2)の調製

10mM Bicine-NaOH (pH8.0)、 0.2%4—ァミノアンチピリンで構成される試薬を調製した。

[0074] [実施例 2— 5]非脾臓由来リパーゼ活性測定

実施例 2— 4に示した組成の試薬 1 (R1) 800マイクロリットルに検体 0〜50マイクロリツトルの酵素液を加え、 37°Cで 3分間反応を行った後、実施例 2— 4に示した組成の試薬 2 (R2) 400マイクロリットルを添カ卩し 37°Cで正確に 5分間発色反応を行!、0.5%SDS ( ラウリル硫酸ナトリウム） 500マイクロリットルを添カ卩し反応を止めた後、 550nmにおける吸光度を測定した。

酵素量 (非脾臓由来リパーゼ量）に対する吸光度変化の希釈直線性を図 3に示した。

[0075] [実施例 2— 6]非イオン性界面活性剤の脾臓由来リパーゼ、非脾臓由来リパーゼ活性への影響

脾臓由来リパーゼとしては日本臨床検査標準協議会で認証された ERMロット 1を用い、非脾臓由来リパーゼとしてはへノリンを静注後の血漿力らへノリンセファロースカラムで精製したリパーゼ画分 (0.8MNaCl溶出）を用いて非イオン性界面活性剤の影響について調べた。結果を図 4に示した。非脾臓由来リパーゼ活性が最大に活性ィ匕を受ける 0.2%の非イオン性界面活性剤領域では、脾臓由来リパーゼ活性は全くリバーゼ活性は発現しな、ことがわ力つた。

[0076] [実施例 3— 1]脾臓由来リパーゼ反応液用基質ジグリセリドの調製

卵黄由来の精製ホスファチジルコリン（旭化成ファーマ社製） 1.5gを 10mlのクロロホルムに溶解した。 400Unitのホスフオリパーゼ C (旭化成ファーマ社製）を溶解した 5ml の 0.5M PIPES— NaOH緩衝液 (pH7.5)をカ卩ぇ 37°Cで攪拌しながら加水分解反応を行った。 2時間後、溶媒層と水層とを分離し溶媒層を集め、予めクロ口ホルムに懸濁して調製した湿式のシリカゲルカラム（3ml)にチャージし、クロ口ホルムで展開して、標題のジグリセリド画分を得た。

[0077] [実施例 3— 2]脾臓由来リパーゼ反応用基質溶液の調製

実施例 3— 1で得たジグリセリドのクロ口ホルム溶液を一定量とり、減圧下で溶媒を完全に溜去した。 7mMになるように 0.7%POE—ノ-ルフエ-ルエーテル（15mMの各種緩衝液)を一定量加え、各種 pH条件下、 37°Cで 10時間加温して標題の基質溶液を得た。本基質溶液は冷蔵 (約 4°C)で保存した。

[0078] [実施例 3— 3]本基質を用いた脾臓由来リパーゼ活性の測定実験

得られた基質中の 1 ,3— DG生成量と、該基質を用 Vヽて実施例 3— 5に記載の組成 ( 反応式 1)の試薬を用い、実施例 3— 5に記載の方法により脾臓由来リパーゼ活性を測定した結果を表 2に示す。

表 2に示されるとおり、 pHが 7以下では 1, 3—ジグリセリドは生成せず、脾臓由来リパーゼの活性値も低かった。

[0079] [表 2]

[0080] [実施例 3— 4]本基質の調製方法

実施例 3— 1で得たジグリセリドのクロ口ホルム溶液を一定量とり、減圧下で溶媒を完全に溜去した。 7mMになるように 0.7%POE—ノ-ルフエ-ルエーテル（表 3に記載した 2.5mMの pH緩衝液）を一定量カ卩え、 37°Cで 1時間および 4時間静置加温した。ャトロスキャン法により 1,3-ジグリセリドの含量を分析した。表 3に示される通り pHが 10以上では 1時間で平衡に達した。 pH7.88から pH9.33の範囲では加温時間と共に 1,3- ジグリセリドの含量が増加した。 [0081] [表 3]

[0082] [実施例 3— 5]本基質の安定性実験

従来の調製法、即ち、 15mMの MES— NaOH(pH5.5)、 0.053%POE—ノニルフエニルエーテルを含有する溶液で可溶ィ匕した 1.05mM卵黄ホスファチジルコリン由来ジグリセリドで 1時間加温処理した脾臓由来リパーゼ基質液 (PH5.5)と実施例 3— 2の pH7.9 7の条件で調製した基質溶液を原料にして実施例 3— 7に記載の方法で調製した (反応式 3)の試薬を 15°Cで試薬を保存した。実施例 3— 7に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定法に従!、測定した結果を表 4に示す。

表 4に示されるとおり、本基質の活性は従来のものと比べ非常に安定していた。

[0083] [表 4]

は [U/L]

[実施例 3— 6]反応式 1を共役酵素系とした例

(1)脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物の調製

標題の膝臓由来リパーゼ活性測定用組成物として、試薬 1 (R1)と試薬 2 (R2)力ゝらなる試薬を調製した。

1)試薬 1 (R1)の調製 300mM Bicine— NaOH (pH8.0)、 15mMの Bicine— NaOH (pH8.0)、 0.053%POE—ノ -ルフヱ-ルエーテルを含有する溶液で可溶化した 1.05mM卵黄ホスファチジルコリン由来ジグリセリドを 37°Cで 10時間加温処理した脾臓由来リパーゼ基質、 3mM硫酸マグネシウム、塩化アンモ-ゥム 30mM、コリパーゼ（旭化成ファーマ社製） 4500U/L、アデノシン一 3—リン酸 3mM、ホスフォェノールピルビン酸 1.5mM、モノグリセリドリパーゼ（旭化成ファーマ社製） 1125U/L、グリセロールキナーゼ（旭化成ファーマ社製） 300 U/L、ピルビン酸キナーゼ（オリエンタル酵母社製） 3000U/L、ラタテートデヒドロゲナーゼ (オリエンタル酵母社製) 600U/L力も構成される試薬を調製した。

2)試薬 2 (R2)の調製

10mM Bicine- NaOH (pH8.5)、 21mMデォキシコール酸ナトリウム、 ImM還元型 NA Dで構成される試薬を調製した。

(2)自動分析機器での脾臓由来リパーゼ活性測定

(1)に示した組成の試薬 1 (R1) 200マイクロリットルに検体 15マイクロリットル（日本臨床検査標準協議会で認証された ERMロット 1)を加え 37°Cで 5分経過した後、試薬 2 ( R2) 100マイクロリットルを添カ卩し 37°Cで反応を行、340nmにおける吸光度 (Abs)を連続的に測定した。

R2添加後 3分から 5分の吸光度変化量力次式により脾臓由来リパーゼ活性を求めた。反応のタイムコースを図 5、希釈直線性を図 6に示す。

リパーゼ活性（U/L)=340nmにおける 1分間あたりの吸光度変化 xl/6.3x315/15xl0

00

[実施例 3— 7]反応式 3を共役酵素系とした例

(1)脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物の調製

標題の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物として、試薬 1 (R1)と試薬 2 (R2)力ゝらなる試薬を調製した。

1)試薬 1 (R1)の調製

300mM Bicine— NaOH (pH8.0) , 15mMの Bicine— NaOH (pH8.0)、 0.053%POE—ノ -ルフヱ-ルエーテルを含有する溶液で可溶化した 1.05mM卵黄ホスファチジルコリン由来ジグリセリドを 37°Cで 10時間加温処理した脾臓由来リパーゼ基質、 3mM硫酸マグネシウム、 30mM塩化アンモ-ゥム、コリパーゼ（旭化成ファーマ社製） 4500U/L、アデノシン— 3—リン酸 3mM、モノグリセリドリパーゼ（旭化成ファーマ社製） 1125U/L、グリセロールキナーゼ（旭化成ファーマ社製） 300U/L、グリセ口リン酸ォキシダーゼ（旭化成ファーマ社製） 15U/ml、ペルォキシダーゼ（シグマ社） 1500U/L、 0.2%TOOSから構成される試薬を調製した。

2)試薬 2 (R2)の調製

10mM Bicine- NaOH (pH8.0)、 21mMデォキシコール酸ナトリウム、 0.2%4—アミノアンチピリンで構成される試薬を調製した。

(2)マニュアルでの脾臓由来リパーゼ活性測定

(1)に示した組成の試薬 1 (R1) 800マイクロリットルに検体 50マイクロリットル（日本臨床検査標準協議会で認証された ERMロット 1)を加え、 37°Cで 3分間反応を行った後、実施例 3— 6に示した組成の試薬 2 (R2) 400マイクロリットルを添カ卩し 37°Cで正確に 5 分間発色反応を行ヽ 0.5%SDS (ラウリル硫酸ナトリウム) 500マイクロリットルを添加し反応を止めた後、 550nmにおける吸光度を測定し、希釈直線性を図 7に示す。

産業上の利用可能性

本発明のリパーゼ活性測定用組成物は、正確なリパーゼ活性を測定することができ、血中のリパーゼ活性の診断薬用として好適である。

Claims

請求の範囲

[1] 低濃度の pH緩衝液、及び非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とするリバーゼ活性測定用ジグリセリド溶液。

[2] ジグリセリドが 1, 3 ジグリセリド及び 1, 2 ジグリセリド混合物である請求項 1項記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液。

[3] 請求項 1項又は 2項に記載のジグリセリドからリパーゼ反応により生成されるモノダリセリドを、遊離のグリセロールを経由してグリセロール 3—リン酸に変換する酵素類を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用組成物。

[4] 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、グリセ口 3—リン酸ォキシダーゼ、及びペルォキシダーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも請求項 1項又は 2項記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2 ;から構成される非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[5] 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、酸化型 NAD又は酸化型 NADP、グルコース、 ADP—へキソキナーゼ、及びグルコース 6 リン酸デヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも請求項 1項又は 2項記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2 ;から構成される非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[6] 1)少なくとも高濃度の pH緩衝液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、還元型 NAD、ホスフォェノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、及びラタテートデヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも請求項 1項又は 2項記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液を含有する試薬 2 ;から構成される非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[7] 非イオン性界面活性剤の濃度が、脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現せず非脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である、請求項 4項〜 6項のいずれカゝ 1項記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[8] 試薬 1及び Z又は試薬 2が液状である、請求項 4項〜 7項のいずれか 1項記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[9] 1)少なくとも請求項 1項又は 2項記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、グリセロー 3—リン酸ォキシダーゼ、及びペルォキシダーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の緩衝液及び胆汁酸又はその塩を含有する試薬 2 ;から構成される脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[10] 1)少なくとも請求項 1項又は 2項記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、酸化型 NAD又は酸化型 NADP、ダルコース、 ADP—へキソキナーゼ、及びグルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の緩衝液及び胆汁酸又はその塩を含有する試薬 2；カゝら構成される脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[11] 1)少なくとも請求項 1項又は 2項記載のリパーゼ活性測定用ジグリセリド溶液、モノグリセリドリパーゼ、 ATP、グリセ口キナーゼ、還元型 NAD、ホスフォェノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、及びラタテートデヒドロゲナーゼを含有する試薬 1と； 2)少なくとも高濃度の緩衝液及び胆汁酸又はその塩を含有する試薬 2 ;から構成される脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[12] 非イオン性界面活性剤の濃度が、非脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現せず脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である、請求項 9項〜 11項のいずれカゝ 1項記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[13] 試薬 1及び Z又は試薬 2が液状である、請求項 9項〜 12項のいずれか 1項記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[14] 請求項 4項に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドカも遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりダリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール 3—リン酸に変換し、次、でグリセロール— 3—リン酸ォキシダーゼを作用させ過酸化水素に変換し、更に過酸ィ匕水素発色色素存在下にペルォキシダーゼを作用させ発色反応を行い、 540〜700nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定する非脾臓由来リパーゼ活性測定方法。

[15] 請求項 5項に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドカも遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりダリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次いでグルコース存在下に ADP—へキソキナーゼでグルコースー6—リン酸に変換し、更に酸化型 NAD又は NADP存在下にダルコースー 6—リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、還元型 NAD又は還元型 NADPの 340nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定する非脾臓由来リパーゼ活性測定方法。

[16] 請求項 6項に記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドカも遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりダリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次いでホスフォェノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型 NAD存在下にラタテートデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型 NAD の 340nm付近の波長における吸光度の減少速度を測定する非脾臓由来リパーゼ活性測定方法。

[17] リパーゼ活性測定用組成物における非イオン界面活性剤の濃度が、脾臓由来リバーゼのリパーゼ活性が発現せず非脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である、請求項 14項〜 16項のいずれか 1項記載の非脾臓由来リパーゼ活性測定方法。

[18] 請求項 9項に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリド力遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりグリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼによりグリセロール— 3— リン酸に変換し、次いでグリセロール— 3—リン酸ォキシダーゼを作用させ過酸ィ匕水素に変換し、更に過酸化水素発色色素存在下にペルォキシダーゼを作用させ発色反応を行い、 540〜700nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定する脾臓由来リパーゼ活性測定方法。

[19] 請求項 10項に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドカも遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりダリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次いでグルコース存在下に ADP—へキソキナーゼでグルコースー6—リン酸に変換し、更に酸化型 NAD又は NADP存在下にダルコースー 6—リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、還元型 NAD又は還元型 NADPの 340nm付近の波長における吸光度の増加速度を測定する脾臓由来リパーゼ活性測定方法。

[20] 請求項 11項に記載の脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物を用いた、リパーゼ反応でジグリセリドカも遊離されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼの作用によりダリセロールに変換し、これを ATP存在下にグリセロールキナーゼにより ADPに変換し、次いでホスフォェノールピルビン酸存在下にピルビン酸キナーゼでピルビン酸に変換し、更に還元型 NAD存在下にラタテートデヒドロゲナーゼを作用させ、還元型 NAD の 340nm付近の波長における吸光度の減少速度を測定する脾臓由来リパーゼ活性測定方法。

[21] リパーゼ活性測定用組成物における非イオン界面活性剤の濃度が、脾臓由来リバーゼのリパーゼ活性が発現せず非脾臓由来リパーゼのリパーゼ活性が発現する濃度である、請求項 18項〜 20項のいずれか 1項記載の脾臓由来リパーゼ活性測定方法。

[22] リパーゼ活性測定用組成物における試薬 1及び Z又は試薬 2が液状である、請求項 14項〜 21項の、ずれか 1項記載のリパーゼ活性測定方法。

[23] 少なくとも非イオン性界面活性剤、及び 1, 3—ジグリセリド並びに 1, 2—ジグリセリド混合物を含有することを特徴とする脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[24] 少なくともジグリセリドを含有することを特徴とする非脾臓由来リパーゼ活性測定用組成物。

[25] 1, 2—ジグリセリド及び 1, 3—ジグリセリドの平衡ィ匕方法。