-
Die Erfindung betrifft den Bereich der Umweltanalytik, insbesondere die Anlagensteuerung/Optimierung von Anlagen, die die biologische Abbauaktivität ausnutzen, wie beispielsweise Kläranlagen, Biogasanlagen, Kompostierung, Biofilter, Regenwasserfilter.
-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie ein Kit zur Bestimmung der Esterase-Aktivität von Proben aus biologisch aktiven verfahrenstechnischen Anlagen, z. B. Klär-, und Biogasanlagen, bzw. von Umweltproben.
-
Unspezifische Esterasen sind Enzyme, die in den meisten heterotrophen Mikroorganismen ubiquitär sind und hydrolytische Ester-Spaltungen beim biologischen Abbau organischer Verbindungen katalysieren. Sie sind bei der Umsetzung eines breiten Spektrums von organischen Substanzen innerhalb diverser Stoffwechselwege beteiligt. Die Aktivität dieser Enzyme kann daher als allgemeines Maß der heterotrophen Abbauaktivität angesehen werden und dient zur Abschätzung des Potentials einer Mikroorganismengemeinschaft zur Hydrolyse von Biopolymeren.
-
Einsatz findet die Analyse der Esterase-Aktivität daher in biologischen Systemen, die einer Kontrolle oder Steuerung bedürfen. Dazu zählt beispielsweise das Monitoring des laufenden Prozesses in Biogasanlagen. Da die Bestimmung der Esterase-Aktivität bislang nur in dafür spezialisierten Laboren durch entsprechende Fachkräfte durchgeführt werden kann – was einen erhöhten Kosten- und Zeitaufwand zur Folge hat – beschränkt sich in der Praxis die Analyse meist auf physikochemische Parameter, wie beispielsweise die Bestimmung des pH-Wertes, der Temperatur, des Chemischen Sauerstoffbedarfes (CSB) und anderer vor Ort bestimmbarer Parameter, die jedoch nicht spezifisch die biologischen Vorgänge des Systems widerspiegeln. So arbeiten viele Biogasanlagen unter dem theoretisch möglichen Wirkungsgrad. Aber auch in der Abwasserbehandlung und bei der großtechnischen Kompostierung wird die Analyse der Esterase-Aktivität zur Prozesskontrolle eingesetzt. Zudem dient sie als wichtiger Parameter bei der Untersuchung von Umweltproben, wie Gewässer und Böden, z. B. hinsichtlich möglicher Schadstoffbelastungen.
-
Zur Bestimmung der Esterase-Aktivität liegt bisher kein standardisierter Test vor, wie z. B. eine Richtlinie oder DIN-Norm. In der Fachliteratur sind jedoch diverse Analysevorschriften beschrieben. Sie beruhen alle auf dem Prinzip, dass der zu untersuchenden Probe, welche die Esterasen oder aktive Mikroorganismen enthält, ein künstliches Substrat mit Esterbindungen zugeführt wird, welches innerhalb einer bestimmten Zeit bei einer spezifischen Temperatur und einem zuvor eingestellten pH-Wert inkubiert wird. In dieser Zeit katalysieren die in der Probe enthaltenen Esterasen die Hydrolyse der Esterbindungen, so dass ein chromogenes bzw. fluorogenes Produkt entsteht. Dieses kann mikroskopisch oder photometrisch analysiert und quantifiziert werden.
-
Als künstliche Substrate werden z. B. Fluoresceindiacetat, 2-Nitrophenylacetat, α- bzw. β-Naphthylacetat, Indoxylacetat, Resorufinacetat, 5(6)-Carboxyfluorescein-diacetat, 3-(2-Benzoxazolyl)umbelliferyl-acetat eingesetzt. In der Abwasser- und Umweltanalytik wird heute meist nach Obst und Holzapfel-Pschorn (Obst, U. und Holzapfel-Pschorn, A., Enzymatische Tests für die Wasseranalytik. 1988, München: Oldenbourg Verlag). Fluoresceindiacetat (FDA) als Substrat verwendet, welches nach Hydrolyse eine gelb-grünliche Fluoreszenz aufweist und somit eine mikroskopische, colorimetrische und fluoreszenzphotometrische Analyse ermöglicht.
-
Da es sich um eine enzymatische Reaktion handelt, ist nach Inkubation entweder eine sofortige Messung nötig oder die Reaktion muss abgestoppt werden.
-
In
US2001049091 A1 wird die Aktivität von Esterasen in Lymphozyten und Krebszellen mittels Fluoresceindiacetat nachgewiesen. Die Messung der bei der enzymatischen Reaktion entstehenden Fluoreszenz erfolgt direkt im Anschluss an die Reaktion mittels Durchflusszytometrie.
-
Oftmals wird die Hydrolyse durch starkes Abkühlen des Reaktionsansatzes verlangsamt und eine sofortige Messung erfolgt. Als mögliches Stoppreagenz wird in der Literatur zudem meist Aceton genannt. Nachteilig ist jedoch, dass Aceton die Extraktion von organischem Material fördert, Fluorescein sich an dieses anlagern kann und so das Fluoreszenzsignal verringert wird. Die Inkubation selbst sollte bei einem definierten pH-Wert und einer festgelegten Temperatur erfolgen. Da Fluorescein bei pH-Werten zwischen 7 und 8 die maximale Fluoreszenz aufweist und FDA ab pH 8,5 dazu neigt spontan zu hydrolysieren, sollte der Reaktionspuffer einen pH-Wert zwischen 7 und 8,5 haben. Bei pH 7,6 zeigt Fluoresceindiacetat nach Swisher und Carroll die maximale mikrobielle Hydrolyserate (Swisher, A. R. und Carroll, C., Fluorescein diacetate hydrolysis as an estimator of microbial biomass on coniferous needle surfaces. Microbiology and Ecology, 1980. 6: 217–226.), weshalb meist dieser pH-Wert eingestellt wird. Eine spontane Hydrolyse des FDA tritt zudem auch bei erhöhten Temperaturen von über 30 bis 40°C auf. So sollte die Inkubationstemperatur maximal 40°C betragen.
-
Die Analyse der Esterase-Aktivität, wie sie bislang in der Literatur beschrieben wird, setzt jedoch ein dafür spezialisiertes Labor mit entsprechendem Equipment und qualifizierten Fachkräften voraus. Durch den hier beschriebenen Esterase-Schnelltest ist im Gegensatz dazu durch Vereinfachung der Analysedurchführung auch eine Bestimmung außerhalb des spezialisierten Labors, im Außenbereich, und durch weniger qualifiziertes Personal (analog den handelsüblichen Schnelltests für die Wasseranalytik) möglich. Ein weiterer Vorteil besteht in der schnellen Auswertung der Ergebnisse, das ein entsprechend schnelles Handeln beim Steuern einer Anlage erlaubt.
-
Generell ist durch die Veränderlichkeit des biologisch aktiven Materials eine möglichst schnelle Messung nach der Probenahme sinnvoll. Dies ist durch die herkömmliche Bearbeitung in einem Labor eingeschränkt, da dort eine Analyse meist erst nach Stunden des Probentransports am nächsten Tag erfolgen kann. Durch den Schnelltest ist eine sofortige Bestimmung nach der Probenahme möglich, so dass Veränderungen der Proben vermieden werden können.
-
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Schnelltestes zur Bestimmung der Esterase-Aktivität, welcher außerhalb eines spezialisierten Labors, im Außenbereich, und durch weniger qualifiziertes Personal durchgeführt werden kann.
-
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Bestimmung der Esterase-Aktivität in einer Probe einer wässrigen Lösung gelöst, umfassend folgende Schritte:
a. Stabilisierung des pH-Wertes der Probe, durch Zugabe eines Puffers zur Probe,
b. Zugabe von Fluoresceindiacetat,
c. Mischen der Lösung und Inkubation des Ansatzes bei 20°C bis 40°C bevorzugt bei 30°C, für 30 bis 240, bevorzugt 50 bis 70, besonders bevorzugt für 60 Minuten,
d. Abstoppen der Reaktion,
e. Klärung des Ansatzes,
f. Photometrische Bestimmung der Absorption bei 480 bis 500 nm, bevorzugt bei 490 nm.
-
Die Bezeichnung „Probe einer wässrigen Lösung” meint dabei bevorzugt eine Probe aus einem Bioreaktor. In weiteren Ausführungsformen sind auch Proben aus einem künstlichen oder natürlichen Gewässer oder aus Trinkwasseraufbereitungs- und/oder Abwasseranlagen möglich.
-
Je nach zu erwartender mikrobieller Aktivität kann die Probe mit Wasser verdünnt oder die Inkubationsdauer variiert werden.
-
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Bestimmung der mikrobiellen Aktivität der Biomasse von Feststoffproben möglich, welche zuvor in Lösung gebracht wurde, beispielsweise durch Abschütteln der Biomasse in eine wässrige Lösung.
-
Esterasen sind Enzyme, die in der Lage sind, Ester hydrolytisch in einen Alkohol und eine Säure aufzuspalten.
-
Kerngedanke der Erfindung ist, dass die in einer Probe vorhandenen Esterasen Fluoresceindiacetat zu Fluorescein umsetzen. Das so entstehende Fluorescein kann photometrisch detektiert werden. Vor der photometrischen Messung erfolgt ein Abstoppen der Reaktion, sowie eine Klärung des Ansatzes zur Abtrennung größerer Zellfragmente oder anderer Schwebstoffe/Partikel von dem zu detektierenden Fluorescein. Mit Hilfe einer Eichkurve, welche die Absorption definierter Fluorescein-Konzentrationen bei verschiedenen Wellenlängen angibt, können Rückschlüsse auf die in der Probe enthaltene Fluorescein-Konzentration und damit auf die Aktivität der enthaltenen Esterasen gezogen werden. Bei Proben mit starker Eigenfärbung ist die Mitführung eines Probenblindwertes sinnvoll. Dieser besteht aus entsprechenden Volumina an Puffer und Probe ohne Zusatz der Fluoresceindiacetat-Lösung. Dieser Probenblindwert wird vom eigentlichen Absorptions-Messwert abgezogen.
-
Die Bestimmung der Esterase-Aktivität erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren unspezifisch, das heißt sowohl die Aktivität von Lipasen, Phosphatasen als auch Nukleasen kann nachgewiesen werden. Dies ist von Vorteil, da bisherige bekannte Verfahren sich lediglich auf den Nachweis einzelner bestimmter Esterase-Typen beziehen. Zudem resultieren aus einer Messung der Gesamtaktivität von Esterasen höhere Messwerte bei kürzeren Inkubationszeiten.
-
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der verwendete Puffer vorzugsweise Dinatriumhydrogenphosphat mit einer Endkonzentration von 0,01 bis 0,05 mol/L, bevorzugt 0,017 mol/L.
-
Endkonzentration meint hierbei die Gesamtkonzentration im Reaktionsvolumen, das heißt in der Lösung enthaltend Puffer, Probe, Fluoresceindiacetat und eventuell ein Stoppreagenz.
-
Durch Zugabe des Puffers wird der gewünschte pH-Wert der Probe stabilisiert. Dies verhindert eine Veränderung des pH-Wertes in späteren Verfahrensschritten. Alternativ zum Natriumphosphatpuffer können auch andere geeignete Puffer, wie beispielsweise Hepes-Puffer, BK Puffer S15 MOPS, TRIS-HCl-Puffer, PBS-Puffer, Mcllvaine-Puffer oder Kaliumphosphat-Puffer verwendet werden.
-
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stabilisiert der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Puffer den pH-Wert der Probe im Bereich von 6,5 bis 9, bevorzugt von 7,4 bis 7,8, besonders bevorzugt von 7,6.
-
Fluorescein weist bei pH-Werten zwischen 7 und 8 die maximale Fluoreszenz auf. Da Fluoresceindiacetat (FDA) ab einem pH-Wert von 8,5 dazu neigt, spontan zu hydrolysieren und bei einem pH-Wert von 7,6 die maximale mikrobielle Hydrolyserate aufweist, erweist sich ein pH-Wert von 7,6 als optimal für das erfindungsgemäße Verfahren.
-
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe im Anschluss an die Pufferzugabe mit Fluoresceindiacetat versetzt.
Fluoresceindiacetat-Rest
-
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Fluoresceindiacetat mit einer Endkonzentration von 0,048 mmol/L zugegeben, woraufhin eine gründliche Durchmischung, beispielsweise durch Schütteln erfolgt.
-
Das Fluoresceindiacetat liegt dabei bevorzugt gelöst in Aceton vor. Alternativ ist auch ein Vorliegen in anderen organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise DMSO, Methanol, Chloroform oder Formamid denkbar.
-
In Aceton ist das Fluoresceindiacetat bei –20°C im Dunkeln gelagert mehrere Jahre haltbar.
-
Endkonzentration meint hierbei die Gesamtkonzentration im Reaktionsvolumen, das heißt in der Lösung enthaltend Puffer, Probe, Fluoresceindiacetat und eventuell ein Stoppreagenz.
-
Nach Zugabe des Fluoresceindiacetats und gründlichem Durchmischen der Lösung erfolgt eine Inkubation des Ansatzes für 30 bis 240 Minuten, bevorzugt 50 bis 70 Minuten, besonders bevorzugt für 60 Minuten.
-
Da Fluoresceindiacetat bei Temperaturen über 30–40°C spontan hydrolisiert, sollte die Temperatur bei der Inkubation des Ansatzes 40°C nicht überschreiten. Bevorzugt wird bei 20°C bis 40°C, besonders bevorzugt bei 30°C inkubiert.
-
Erfindungsgemäß wird die Reaktion anschließend abgestoppt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Abstoppen der Reaktion durch Zugabe eines Stoppreagenzes. Als Stoppreagenz wird dabei bevorzugt SDS-Lösung (Natriumlaurylsulfat) verwendet.
-
Alternativ kann das Abstoppen durch Zugabe von 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenylpolyethylene glycol erfolgen. Weitere bekannte Reagenzien zum Abstoppen der Reaktion sind EDTA (Ethylendiamintetraacetat) oder Aceton. Ebenfalls denkbar ist ein Abstoppen durch Kühlung im Eisbad. Allen Methoden gemein ist, dass die Aktivität der Esterasen herabgesetzt oder inhibiert wird.
-
SDS ist ein anionisches Tensid, welches an der Solubilisierung von Membranproeinen beteiligt ist und Proteine denaturiert bzw. inaktiviert, indem es Komplexe mit ihnen bildet.
-
Durch Zugabe des Stoppreagenzes wird die Enzymreaktion zuverlässig inhibiert. Dadurch kann die Bestimmung der Enzymaktivität auch noch einige Stunden nach Inkubation mit Fluoresceindiacetat erfolgen, ohne dass signifikante Veränderungen der Messwerte eintreten. So zeigen Untersuchungen hierzu, dass bei Abstoppen der Reaktion durch 7,5% SDS die Enzymaktivität pro Stunde nur noch um etwa 1% zunimmt – bei Abstoppen durch 50% Aceton gibt es eine weitere Zunahme der Enzymaktivität von etwa 20% je Stunde, bei Abstoppen durch Kühlung ist noch eine Zunahme von etwa 9% je Stunde zu verzeichnen.
-
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Zugabe von SDS-Lösung mit einer Endkonzentration von 0,035 bis 0,35 mol/L, bevorzugt 0,24 bis 0,28 mol/L, besonders bevorzugt 0,26 mol/L und einem pH-Wert von 6,5 bis 9, bevorzugt von 7,4 bis 7,8, besonders bevorzugt von 7,6.
-
Da Tenside die Eigenschaft aufweisen zu schäumen, ist eine Endkonzentration von mehr als 0,35 mol/L nicht erstrebenswert. Bei einer Endkonzentration von 0,26 mol/L wird die Enzymreaktion am effektivsten inhibiert.
-
Fluorescein weist bei pH-Werten zwischen 7 und 8 die maximale Fluoreszenz auf. Da Fluoresceindiacetat (FDA) ab einem pH-Wert von 8,5 dazu neigt, spontan zu hydrolysieren und bei einem pH-Wert von 7,6 die maximale mikrobielle Hydrolyserate aufweist, erweist sich ein pH-Wert von 7,6 als optimal für das erfindungsgemäße Verfahren.
-
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt nach Abstoppen der Reaktion die Klärung des Reaktionsgemisches durch das Filtrieren durch eine Membran mit einer Porengröße von 0,15 bis 0,3 μm, bevorzugt von 0,2 μm. Bevorzugt erfolgt das Filtrieren durch eine Polyethersulfon-Membran.
-
Durch die Filtration kommt es zu einer Klärung des Ansatzes vor der photometrischen Analyse. Zellen, größere Zellfragmente und andere Partikel werden zurück gehalten, während das zu detektierende Fluorescein die Membran passiert. Nach herkömmlichen Analysemethoden ist eine Zentrifugation zur Klärung des Ansatzes nötig. Die Filtration stellt eine Alternative dar, die mit weniger Zeitaufwand verbunden und technisch schlichter durchführbar ist, insbesondere bei einer geringeren Anzahl von Reaktionsansätzen.
-
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt zur Klärung eine Zentrifugation des Ansatzes, vorzugsweise bei 0 bis 8°C, bevorzugt bei 4°C und 9.000 bis 11.000 g, bevorzugt bei 10.000 g. Die Filtration ist die bevorzugte Variante der Klärung.
-
Das durch die Umsetzung des Fluoresceindiacetat durch Esterasen entstehende Fluorescein wird in einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens photometrisch detektiert.
-
Da das entstehende Flourescein ein Absorptionsmaximum bei 490 nm aufweist, ist die photometrische Analyse bei dieser Wellenlänge optimal. In der Praxis werden jedoch oftmals einfache Photometer eingesetzt, die nur eine geringe Auswahl an Wellenlängen geben, so dass hier auch eine Messung bei 500 nm möglich ist.
-
Bei Proben mit starker Eigenfärbung ist die Mitführung eines Probenblindwertes sinnvoll. Dieser besteht aus entsprechenden Volumina an Puffer und Probe ohne Zusatz der Fluoresceindiacetat-Lösung. Dieser Probenblindwert wird vom eigentlichen Absorptions-Messwert abgezogen.
-
Die Auswertung erfolgt mithilfe einer zuvor vom Nutzer zu erstellenden Eichgerade.
-
Die Reagenzien sowie die Anleitung hierzu werden dem Schnelltest beigefügt. Die Absorptions-Messwerte können so über eine einfache Tabellenkalkulation der Kalibrierfunktion in die Enzymaktivität in Units (μmol/min–1ml–1) umgerechnet werden.
-
Ebenfalls möglich ist eine kolorimetrische Auswertung. Die klare Substratlösung verfärbt sich nach Umsetzung des Fluoresceindiacetats durch Esterasen grün-gelblich, was mit bloßem Auge zu detektieren ist.
-
Vorteilhafterweise sind die Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beliebig kombinierbar.
-
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe auch durch ein Kit zur Bestimmung der Esterase-Aktivität in einer Probe einer wässrigen Lösung gelöst, welches
- a. eine Pufferlösung enthaltend Dinatriumhydrogenphosphat,
- b. Fluoresceindiacetat,
- c. ein Stoppreagenz,
- d. eine Eichsubstanz
jeweils getrennt voneinander in geeigneten Behältern enthält.
-
Ein geeigneter Behälter für die Pufferlösung enthaltend Dinatriumhydrogenphosphat ist dabei bevorzugt ein fest verschließbarer Behälter mit einem Fassungsvermögen von 25 bis 1000 ml, bevorzugt 400 bis 600 ml.
-
Alternativ kann die Pufferlösung in ihren Einzelkomponenten zum Selbstherstellen enthalten sein.
-
Geeignete Behälter für das Fluoresceindiacetat, das Stoppreagenz und die Eichsubstanz sind dabei bevorzugt fest verschließbare Behälter mit einem Fassungsvermögen von 0,5 bis 25 ml.
-
Als Stoppreagenz wird ein Reagenz bezeichnet, welches die Umsetzung des Fluoresceindiacetats durch Esterasen abstoppt.
-
Zusätzlich kann im erfindungsgemäßen Kit eine geeignete Arbeitsanleitung enthalten sein.
-
Die Bezeichnung „Probe einer wässrigen Lösung” meint dabei bevorzugt eine Probe aus einem Bioreaktor. In weiteren Ausführungsformen sind auch Proben aus einem künstlichen oder natürlichen Gewässer oder aus Trinkwasseraufbereitungs- und/oder Abwasseranlagen möglich.
-
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Bestimmung der mikrobiellen Aktivität der Biomasse von Feststoffproben möglich, welche zuvor in Lösung gebracht wurde, beispielsweise durch Abschütteln der Biomasse in eine wässrige Lösung.
-
Esterasen sind Enzyme, die in der Lage sind, Ester hydrolytisch in einen Alkohol und eine Säure aufzuspalten.
-
Kerngedanke der Erfindung ist, dass die in einer Probe vorhandenen Esterasen Fluoresceindiacetat zu Fluorescein umsetzen. Das so entstehende Fluorescein kann photometrisch detektiert werden. Vor der photometrischen Messung erfolgt ein Abstoppen der Reaktion, sowie eine Klärung des Ansatzes zur Abtrennung größerer Zellfragmente sowie anderer Schwebstoffe/Partikel von dem zu detektierenden Fluorescein. Mit Hilfe einer Eichkurve, welche die Absorption definierter Fluorescein-Konzentrationen bei verschiedenen Wellenlängen angibt, können Rückschlüsse auf die in der Probe enthaltene Fluorescein-Konzentration und damit auf die Aktivität der enthaltenen Esterasen gezogen werden.
-
Die Bestimmung der Esterase-Aktivität erfolgt mit Hilfe des erfindungsgemäßen Kits unspezifisch, das heißt sowohl die Aktivität von Lipasen, Phosphatasen als auch Nukleasen kann nachgewiesen werden. Dies ist von Vorteil, da bisherige bekannte Kits sich lediglich auf den Nachweis einzelner bestimmter Esterase-Typen beziehen. Zudem resultieren aus einer Messung der Gesamtaktivität von Esterasen höhere Messwerte bei kürzeren Inkubationszeiten.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits weist die Pufferlösung enthaltend Dinatriumhydrogenphosphat einen pH-Wert von 6,5 bis 9, bevorzugt von 7,4 bis 7,8, besonders bevorzugt von 7,6 auf.
-
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits liegt das Fluoresceindiacetat in Aceton gelöst vor. Diese Lösung ist bei –20°C im Dunkeln gelagert mehrere Jahre haltbar. Die Konzentration des Fluoresceindiacetats ist dabei so gewählt, dass die Fluoresceindiacetat-Lösung für mehrere Proben einsetzbar ist, wobei die Endkonzentration von Fluoresceindiacetat 0,048 mmol/L beträgt. Endkonzentration meint, die Gesamtkonzentration an Fluoresceindiacetat in der Lösung enthaltend Probe, Pufferlösung, Fluoresceindiacetat und Stoppreagenz.
-
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist das Stoppreagenz eine SDS-Lösung mit einem pH-Wert von 6,5 bis 9, bevorzugt von 7,4 bis 7,8, besonders bevorzugt von 7,6.
-
Fluorescein weist bei pH-Werten zwischen 7 und 8 die maximale Fluoreszenz auf. Da Fluoresceindiacetat (FDA) ab einem pH-Wert von 8,5 dazu neigt, spontan zu hydrolysieren und bei einem pH-Wert von 7,6 die maximale mikrobielle Hydrolyserate aufweist, erweist sich ein pH-Wert von 7,6 als optimal für das erfindungsgemäße Kit.
-
Die Konzentration von SDS ist dabei so gewählt, dass die SDS-Lösung für mehrere Proben einsetzbar ist, wobei die Endkonzentration von SDS 0,035 bis 0,35 mol/L beträgt. Endkonzentration meint, die Gesamtkonzentration an SDS in der Lösung enthaltend Probe, Pufferlösung, Fluoresceindiacetat und Stoppreagenz.
-
Die im erfindungsgemäßen Kit enthaltene Eichsubstanz dient der Erstellung einer Eichgerade und ist in einer bevorzugten Ausführungsform Fluorescein-Natriumsalz (Uranin).
-
Das Fluorescein-Natriumsalz (Uranin) kann dabei als Feststoff vorliegen. Zusätzlich zum Feststoff kann dem erfindungsgemäßen Kit eine Substanz beiliegen, in die der Feststoff überführt werden kann, bevorzugt Wasser.
-
Die vorgelegten Mengen an Fluorescein-Natriumsalz (Uranin) und Wasser sind dabei vorzugsweise so gewählt, dass bei Vermischung von Fluorescein-Natriumsalz (Uranin) und Wasser eine Fluorescein-Konzentration von bevorzugt 1 bis 32 μmol/l üerreicht wird.
-
In einer weiteren Ausführungsform liegt das Fluorescein-Natriumsalz (Uranin) als Lösung mit einer Fluorescein-Konzentration von 1 bis 32 μmol/L vor.
-
Das Kit zur Bestimmung der Esterase-Aktivität in einer Probe einer wässrigen Lösung ist besonders vorteilhaft im Bereich der Umweltanalytik, insbesondere zur Anlagensteuerung/Optimierung von Anlagen, die die biologische Abbauaktivität ausnutzen, einsetzbar.
-
Vorteilhafterweise sind die Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits beliebig kombinierbar.
-
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kits zur Bestimmung der Esterase-Aktivität in einer Probe einer wässrigen Lösung im Bereich der Umweltanalytik, insbesondere zur Anlagensteuerung/Optimierung von Anlagen, die biologische Abbauaktivität ausnutzen.
-
Neben der Miniaturisierung des Tests auf handelsübliche Reagenzglasgröße (Voraussetzung für Konfektionierung als Schnelltest) nimmt einen großen Anteil an der Erfindung die Ermittlung eines neuen Stoppreagenzes ein, welches die Enzymreaktion zuverlässig inhibiert. Dadurch kann die Bestimmung auch noch einige Stunden nach Inkubation erfolgen ohne dass signifikante Veränderungen der Messwerte eintreten.
-
Neu gegenüber der herkömmlich im Labor verwendeten Verfahrensdurchführung ist die logistische Umsetzung des Tests als Schnelltest. Wesentliche Vorteile, die sich durch diesen neuen Test ergeben sind:
- – Die Bestimmung der biologischen (heterotrophen) Abbauaktivität ist sofort nach der Probenahme möglich – dadurch keine Verfälschungen der Probe durch ansonsten notwendigen Probentransport und Lagerung
- – Die Reaktion kann zuverlässig abgestoppt werden, wodurch es zusätzlich möglich ist, den Reaktionsansatz ohne Beeinträchtigung für eine spätere Messung zu einem Labor zu transportieren, falls kein Photometer vor Ort vorhanden ist.
- – Sehr einfache Handhabung des Tests, wodurch auch eine Ausführung durch Personal mit Labor-Grundausbildung möglich ist.
- – Ausführung des Tests auch bei einfacher Laborausrüstung möglich.
-
Bislang gibt es keinen Küvetten-Schnelltest zur Bestimmung der Esterase-Aktivität auf dem Markt.
-
Nachfolgend soll die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels eingehender erläutert werden, ohne dabei auf dieses beschränkt zu sein.
-
Ausführungsbeispiel – Bestimmung der Esterase-Aktivität in einer flüssigen Probe
-
Zu 2,9 ml eines vorgelegten Natriumphosphatpuffers (0,06 M, pH 7,6) werden 2 ml einer flüssigen Probe gegeben, welche zuvor aus einem aus einem Bioreaktor einer Biogasanlage entnommen wurde, in der mithilfe einer mikrobiellen Biozönose Maissilage fermentiert und zu Biogas umgesetzt wird.
-
20 mg Fluoresceindiacetat werden in 10 ml Aceton gelöst. 2 Tropfen dieser Lösung (etwa 100 μl) werden zu der Probe-Puffer-Lösung gegeben. Es folgt eine gründliche Durchmischung des Ansatzes sowie eine Inkubation des Ansatzes bei 30°C für eine Stunde im Wasserbad. Alternativ kann für eine Stunde in einem handelsüblichen Reagenzglasinkubator inkubiert werden.
-
5 ml einer 15%igen SDS-Lösung (pH 7,6) werden zum Ansatz gegeben.
-
Nach einer erneuten gründlichen Durchmischung erfolgt eine Filtration des Ansatzes durch eine Polyethersulfon-Membran mit einer Porengröße von 0,2 μm. Die Absorption der Probe wird am Photometer bei 490 nm gemessen. Der Absorptions-Messwert beträgt 0,14. Die Berechnung der Esterase-Aktivität erfolgt mithilfe einer zuvor erstellten Eichkurve, zu deren Erstellung Lösungen mit einem Fluorescein-Konzentrationsbereich von 1–32 μmol/L und dem Stoppreagenz (SDS-Lösung) genutzt wurden. Es wurde eine Esterase-Aktivität von 3 Units (μmol/min–1ml–1) bestimmt. Dies entspricht einer hohen mikrobiellen Aktivität und lässt auf eine hohe Substratumsatzrate mit hohem Biogasertrag schließen.
-
Die Bestimmung der Esterase-Aktivität erfolgte zügig und wurde mit einfachen Mitteln von Personal mit Labor-Grundausbildung durchgeführt.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
