WO2002054070A1

WO2002054070A1 - Puces proteiques, leur procede de production, leur systeme de detection et le procede de mise en route du systeme de detection

Info

Publication number: WO2002054070A1
Application number: PCT/CN2001/001294
Authority: WO
Inventors: Gengxi Hu
Original assignee: Shanghai Health Digit Limited
Priority date: 2001-01-04
Filing date: 2001-08-30
Publication date: 2002-07-11
Also published as: CA2428428A1; CN1217194C; CN1363840A; EP1348961A1; EP1348961A4; US20030228631A1; JP2004516489A

Description

蛋白芯片和其制备方法以及使用该蛋白芯片的

检测系统和使用该检测系统的方法技术领域

本发明涉及一种用于多指标并行检测的蛋白芯片及其制备方法和使用方法。背景技术

生物芯片技术是九十年代中期兴起的一项新兴生物技术，因其可在一次反应中进行多种信息的平行分析，而受到众多研究者的瞩目，迅速在诸多生物学领域得到应用。

生物芯片技术按检測对象分类，主要分为基因芯片和蛋白芯片两类。由于基因芯片在人类基因組计划的研究工作中起重要作用，因而此技术在短短几年内得到了长足的发展。目前，人类基因組计划即将完成，生物科学的研究重心即将从基因组研究转向蛋白质組研究。因此，许多技术领先的实验室已将研究重点转移至对人类基因组中已知基因的功能研究上。

目前可用于同时研究多种蛋白质的方法多用 cDNA芯片，由于蛋白质与蛋白质之间的特异作用主要是抗原 -抗体反应或受体的反应，即构象的特异性，无序列特异性，因此用 DNA芯片模式检测蛋白质有其局限性，更好的研究蛋白质与蛋白质功能的手段是蛋白芯片技术。它通过固定于支持介质上的多种蛋白质抅成的微阵列，直接检测有特定功能的标志性蛋白。由于蛋白芯片的研制难度较大，目前对蛋白芯片的研究和应用尚很少。

现有的检测尿液、血清及其它体液的方法，如 ELISA、放射性同位素标记、金栎、荧光、化学发光、时间分辨荧光等，大多是单指标检测，信息量少，而且均具有局限性，如标记步骤复杂、仅器和试剂昂贵、操作烦琐、灵敏度低、易污染等。发明的公开

本发明需要解决的技术问题之一是提供一种用于多指标并行检测的蛋白芯片；

本发明需要解决的技术问题之二是提供上述蛋白芯片的制备方法；

本发明需要解决的技术问题之三是提供上述蛋白芯片的检测系统；

本发明需要解决的技术问题之四是提供上述蛋白芯片的检测系统的使用方法。

本发明所述用于多指标并行检测的蛋白芯片的制备原理如下：

1 )由于蛋白质可以通过物理吸附或共价结合的方式结合到固相载体上，因此利用芯片自动点样系统，可将多种蛋白质以一定的排列次序高密度地固定在固相载体上；

2)固相载体上未固定蛋白的区域可以随机地吸附蛋白质及其它小分子，从而影响蛋白芯片的检测准确度，因此需要用特定的封闭液将固相载体的非点样部位封闭；

3) 为了长期保持蛋白活性，封闭后的固相载体需要低温保存。本发明所述用于多指柘并行检测的蛋白芯片的制作方法如下：

1 )将蛋白芯片上所要点制的蛋白质以一定浓度溶于包被液中；

2)用芯片自动点样系统将这些蛋白质点制在固相载体上，点样密度在 25-200点 /cm² , 点样量 0 . 1-10 ng/点；

3 )放置过夜；

4)用封闭液将蛋白芯片封闭冻干处理，储存于 4 (：。

本发明所述用于多指标并行检测的蛋白芯片有如下几点特征： 1 ) 固相载体是无机片基或有机化合物片基，无机片基包括半导体硅片、玻璃片、微孔硅片、微孔玻璃等，首选玻璃片；有机片基包括醋酸纤維素膜、硝酸纤维素膜，尼龙膜，聚丙烯膜等，首选硝酸纤维素膜。

2) 蛋白质可以是抗原、抗体、受体、配体等，进一步指能与体内疾病性标志蛋白特异结合的蛋白质，尤其是肿瘤标志性蛋白质。其中的受体是细胞膜上或细胞内能识别生物活性分子（药物、毒素、神经递质和激素、抗原和细胞粘附分子等）并与之相结合的生物大分子。它们能将生物活性分子产生的信息传递到效应器，从而引起相应的生物效应。这些生物大分子多数是蛋白质，个别的是糖脂。配体是能与受体特异结合的生物活性分子（即药物、毒素、神经递质和激素、抗原和细胞粘附分子等）。本发明中指的受体和配体是蛋白质。

3 )为了使我们的芯片上所点的多种蛋白质在发生一系列反应后产生的化学发光信号能在相邻两个数量級上（最强点 /最弱点 <100) ,以便于同一检測仅器的检测，我们事先调节了芯片上蛋白质的浓度。

4) 包被液： pH为 9.0- 10.0(最佳 9.6)的 CBS (NaHC0₃-Na₂C0₃) 。包被液的作用是提供一定的 PH范围，使得蛋白质和固相载体之间的化学反应或物理吸附反应在液相能更好地结合。

5) 封闭液含 0. 1-0.5%Tween 20、 0.02- 0.3%酪氨酸、 1 - 9¾蔗糖、 1-9%BSA、 0.卜 l%proclin的 TBS (0.7-0.9%NaCl . 1 .0-1 .5%Tis) , 最佳为含 0.2 Tween 20、 0. 1%酪氨酸、 4%蔗糖、 5%BSA、 0.5%proclin 的 TBS。优点是：酪氨酸和 BSA有封闭作用 , proclin可以防腐，蔗糖是惰性物质，能隔绝空气， BSA 和蔗糖可作为支持框架结构的物质。封闭液的作用使固相载体的其它部位不能结合蛋白质，从而保证实验数据的准确性。

本发明还尝试了其它几种封闭液：一种为 TTBS― 0. 1%(V/V)Tween20的 TBS , 含 10% 月§奶 4分的 TBS , 含 0 · 2% 蛋白的 TTBS。参照的文献有： Bejurrum and Schater-Nielsen , 1986； Gillespie and Hudspeth > 1991； Harlow and Lane > 1988; Schneppenheim et al.,1991 。另一种为 5%(W/V)脱脂奶粉的 PBS。参照的文献为： Molecular Cloning： A Laboratory Manual (2nd ed)： J . sambrook, E.F.Fritsch T . Maniatis。

通过对结果的信噪比的分析，证明本发明提供的封闭液明显优于上述二种。

6) 本发明所用于检测的对象是各种体液，因此材料获取方便，对病人刺激小。

以上浓度单位除非特指均为 W/V。

本发明所提供的蛋白芯片的检测原理是：蛋白芯片上所点制的不同蛋白质（简称为 B) 可特异性地与体液、组织、细胞等所含的相应蛋白质（简称为 A) 相结合，结合后的蛋白复合体（B-A) 又可结合相应蛋白质（A) 的另一特异性可结合蛋白（简称为 C) ， C 已被标记过氧化物酶（简称 C-labeled) ,所以形成四联复合物（B-A-C- labeled)。此过氧化物酶可催化一个化学发光反应，产生的光信号强度可被特定的生物芯片检测仅定量检测。所以，可通过被检测的光信号强度来检测机体内所含蛋白质（A) 的含量。

本发明所述用于多指标并行检测的蛋白芯片检测系统包括：

(1)一种用于多指标并行检测的蛋白芯片；

(2)—种标记过氧化物酶的多蛋白质混合液；

(3)—种用于稀释被测体液的稀释液；

(4)一种由产生并增强化学发光反应的化合物組成的化学组合物；

(5)—种蛋白芯片的洗涤液；

(6)—系列被检蛋白质的标准品。

本发明所述用于多指标并行检测的蛋白芯片检测系统的使用方法如下：

1) 用稀释液将待测的体液上清液稀释，一般稀释 5-20倍； 2) 吸取体液上清液，按照每平方厘米蛋白芯片约 500ul的体积滴加到蛋白芯片表面，在 200-300转 /分和 20-37 C下振摇 20-30分钟，使体液中的特定蛋白质（A)与固定于蛋白质芯片上的其特异性结合蛋白（B)起反应，形成稳定复合物 B -A ;

3) 吸干反应液，将蛋白质芯片放在洗涤液中在 20-37 C下振摇洗涤 3-6分钟，重复多次；

4)吸取已标记过氧化物酶的多蛋白质混合液，按照每平方厘米蛋白质芯片约 500 μΐ的体积滴加到蛋白质芯片表面，在 200-300 转 /分和 20-37 C下振摇 20-30分钟，使稳定复合物 Β-Α中的 Β部分与多蛋白质混合液中对应椋记过氧化物酶的特异性结合蛋白（ C-labelled )起反应，形成稳定的三聚物 B-A-C- labelled；

5) 吸干反应液，将蛋白芯片放在洗涤液中在 20 - 37 C下振摇洗涤 3-6分钟，重复多次；

6) 在晾千后的芯片表面滴加产生化学发光反应的化学组合物 ( 100 ul/cm²)，在 20-37 C下催化反应 3-5分钟；

7) 取出芯片，用特定的生物芯片检测仅检测光信号。

本发明所述用于多指标并行检测的蛋白芯片检测系统有如下几点特征：以下浓度单位除非特指均为 W/V。

1 )多蛋白混合液是可与在体液中被检测到的蛋白质特异性结合的多种标记过氧化物酶的蛋白质在稳定溶液中的混合液。

2)标记物可以是过氧化物酶，进一步过氧化物酶是辣根过氧化物醉。

3) 洗涤液内含 0.7-0.輩 aCl， 1 .0-1 .5% Tris , 0.05-0.2%Tween 20， pH值在 6.0至 9.0之间。其中优选配方为 0.9%NaCl , 1 .21% Tris , 0. 1%Tween 20， pH值为 7.50。

4) 稀释液内含（ 7-0.9¾NaCl， 1 .0-1 .5% Tris , 0.05-0.2%Tween 20， 0.05—0.2%路氛酸。其中优选 S己方为 0.9¾NaCl . 1 .21% Tris , 0.1%Tween 20， 0.1%酪氨酸。

5) 稳定溶液配方为 70-80% A溶液（V/V) +5- 20%乙二醇 (V/V) + 1-9%蔗糖 (W/V)+0. l-l proclin(V/V)+0.05-0.5%EDTA.2Na( A 溶液包含 40-60% 0.05 M的 PBS(pH7.2)和 40- 60%胎牛血清）。最佳配方： 80% A 溶液 ( V/V ) +19% 乙二醇 ( V/V ) +3% 蔗糖 (W/V)+0.5% proclin(V/V)+0. %EDTA-2Na , (Α溶液包含 60% 0.05 M的 PBS(pH7.2) 和 40%胎牛血清）。

6) 一系列标准品指多种不同浓度的被检蛋白质的混合物，由蛋白芯片上的每种蛋白质对应结合的被检测蛋白质（应在体液中被检测到）混合配制成，此标准品可与蛋白芯片上的多种蛋白结合，经过以上使用方法所述的反应步骤，使蛋白芯片上的每个蛋白位置均会被检测到一定的光信号强度。如用检测系统中标准品作对照，被检样品相对于标准品有显著性信号差异，表明该指柘呈阳性。标准品用前用去离子水复溶。

7) 产生化学发光反应的組合物：化学发光反应有 2种类型：普通化学发光反应（Chemiluminescence)和增强的化学发光反应（Enhanced Chenmiluminescence)。本发明用的是增强的化学发光反应。反应涉及的试剂是 Luminol ( 5-amino-2 , 3-dihydro - 1 , 4-phthalazinedione Sodium Salt), H₂0₂(过氧化氢），增强子 Enhancer (Eosin-曙红或 PIP- 对碘苯酚），过氧化物晦（如辣根过氧化物酶 HRP) ，均购自 Sigma公司。

本发明所述用于多指标并行检测的蛋白芯片的一个显著优点是同时引入多种疾病指标，使得检测的准确性大大增加。现有的疾病指标绝大多数是非特异性指椋，不仅多个标志物含量在同一疾病同时显著升高，而且同一标志物含量在多种疾病皆会升高，这种情况造成疾病诊断上的困难，导致误诊。对肿瘤的检测来说，现有的疾病标志性蛋白均是非特异性指标，就连公认的原发性肝癌指标 AFP (甲胎蛋白）对肝癌的检出率只有 70%左右，并且 AFP在某些睾丸癌、畸胎瘤、胃癌、胰腺癌等患者血清中也有明显增高。因此提出了多种柘志物联合检测的必要性。如胰腺癌： CA19-9 检出率约 60% , 加上 CA125、 CA50 及 DU-PAN-则可把检出率提到 90%以上。再如肺癌：单用 CEA对肺癌诊断已有较高的特异性，但如加上 NSE、唾液酸、 CEA、 SCC则特异性更高。

本发明所述用于多指标并行检测的蛋白芯片的另一个优点是灵敏度高，利用化学发光反应和增强发光反应使得本蛋白芯片可检测每毫升体液中含量仅有 lpg的目标蛋白质，这使得一些特异性高但在体液中含量很低的蛋白质指柄可以被用于临床检测，从而扩大了临床检测指标的选择范围。

蛋白芯片以其特有的优势可为现代医学诊断学提供高效、便捷、准确的临床检测手段，对疑难病症的确诊及恶性疾病（如肿瘤）的早期诊断和及时治疗有重大的意义。由于蛋白质比基因更进一步的接近生命活动的物质层面，因此蛋白芯片在疾病诊断和治疗，新型药物开发，探索疾病的分子机理等生命科学相关领域有着比基因芯片更加直接的应用前景。

以下医用体外诊断试剂的技术指标中，本发明蛋白芯片检测系统的达标情况为：

灵敏度：真阳性 /(真阳性 +假阴性） > 80% ;

检测下限对血清样品为 10— ¹²克 /亳升。

特异性：真阴性 /(真阴性 +假阳性） > 95%。

稳定性： 4 °C可稳定放置 2年； 37 °C可稳定放置 1周。

简便性： 1 .5小时内完成实验。

安全性：无放射性，无污染. 附图的简要说明

图 1是用本发明蛋白芯片检测的标准血样结果的示意图；图 2是用本发明蛋白芯片检测的肝癌患者血样结果的示意图。实现本发明的最佳方式

下面以具体实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的范围。实施例 1 蛋白芯片的制备

固相载体：硝酸纤维素膜。

固相载体上所用蛋白质：检测肿瘤标志性蛋白的单克隆抗体，所用量为 5 ng，点样密度为 25点 /0.36cm²。

点样物为 Al, A2— CA153抗体， A3, A4— CA19- 9抗体， A5—负对照， Bl, B2— CA125抗体， B3, C4— AFF抗体， CI, C2— CA125抗体， C3, B4— beta-HCG抗体， B5, C5— CA19-5抗体， Dl , D2— PSA抗体， D3, E4— CEA抗体， El, E2— PSA抗体， E3, D4— CA15-3抗体， D5, E5— CA549抗体。

抗体购自 Fitzgerald, CanAg。

AFP—甲胎蛋白， CEA—癌胚抗原， PSA—前列腺特畀性抗原， betaHCG—人绒毛膜促性腺激素 beta亚基， CA—统称糖类抗原，负对照一不加任何点样物。

包被液： pH 9.6的 CBS (NaHC0₃-Na₂C0₃)。

封闭液： 0.9 NaCl . 1.21%Tris、 0.2%Tween 20. 0.1%酪氨酸、 4% 蔗糖、 5%BSA、 0.5%proclin。

制备步骤：

1) 将蛋白芯片上所要点制的蛋白质溶于包被液中浓度为 25%, 然后用芯片自动点样系统 (BioGrid Total Array Systen, BioRobotics 公司）将这些蛋白质点制在固相载体上。

2) 放置过夜。

3) 用封闭液将蛋白芯片封闭冻干处理，储存于 4 (：。

实施例 2 蛋白的检测正常人血样（附图 1 ) 和肝癌患者血样（附图 2) 用本发明蛋白芯片检测的结果比较。

正常人血样和肝癌病人血样均来自上海市第八人民医院肿瘤科。所用的蛋白芯片的点样位置如上芯片的制备：

操作步骤：

1 ) 用稀释液将待测的血清上清液稀释 5倍。

2)吸取稀释液，按照每平方厘米蛋白芯片 500 μ ΐ 的体积滴加到蛋白芯片表面，在 300转 /分钟的频率和 37 C下振摇 25分钟，使体液中的肿瘤标志性蛋白与固定于蛋白芯片上的单抗起反应，形成抗原- 抗体复合物。

3 )吸干反应液，将蛋白芯片放在洗涤液中振摇洗涤 4分钟，重复三次。

4) 吸取已标记辣根过氧化物酶的多种单抗混合液（购自 Fitzgerald , CanAg 公司），这些单抗是和上述指标对应的另一种抗体的混合物。按照每平方厘米蛋白芯片约 500 μ 1 的体积滴加到蛋白芯片表面，在 300转 /分钟的频率和 37 C下振摇 25分钟，抗原抗体复合物与多种单抗混合液中的另一单抗结合，形成稳定的三聚物：抗体-抗原-另一单抗（标 HRF) 复合物。

5 )吸干反应液，将蛋白芯片放在洗涤液中振摇洗涤 4分钟，重复三次。

6)在晾千后的芯片表面滴加产生化学发光反应的化学組合物（100 μ 1/cm²) , 37 C催化反应 3分钟。化学組合物： Luminol ( 5- amino-2 , 3-dihydro-l , 4-phthalazinedione Sodium Salt ) > H₂0₂(过氧化氪)，增强子 Enhancer , 辣根过氧化物酶（HRP)，均购自 Sigma公司。

7 ) 取出芯片， 10 分钟时检测光信号。使光信号通过透镜成像，再将光信号转变为数字信号，用软件进行定量分析，可检测到的最小信号换算成蛋白量是 10— ¹²克量級。结果如图所示，在（A3 , A4)和（B3 , C4)位置处肝癌病人的血样检测结果与正常人血样的检测结果有强烈的信号差异，在此位置对应检測的月中瘤标志物为 CA19-9和 AFP。工业应用性

本发明的优点和应用前景是十分明显的。使用本发明所述的蛋白芯片使得检测的准确性极大提高，并具有可靠性高、检测灵敏度高等优点，可广泛应用于分子生物学、生物医学、人类蛋白质組研究，尤其应用于临床诊断。

Claims

杈利要求

1 . 一种蛋白芯片，

其特征在于，它由固相载体和固定于载体上用于多指标并行检测的蛋白。

2 . 根据杈利要求 1的蛋白芯片，

其特征在于，所述的蛋白指抗原、抗体、受体、配体。

3 . 根据杈利要求 2的蛋白芯片，

其特征在于，所述的蛋白指与疾病标志性蛋白特异性结合的蛋白。

4 . 根据杈利要求 3的蛋白芯片，

其特征在于，所述的蛋白指能与体内肿瘤标志物特异性结合的蛋白。

5 . 根据杈利要求 1的蛋白芯片，

其特征在于，所述的固相载体指无机片基或有机化合物片基。

6 . 根据杈利要求 5的蛋白芯片，

其特征在于，所述的固相载体指是醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚丙烯膜。

7 - 根据杈利要求 5的蛋白芯片，

其特征在于，所述的固相载体指半导体硅片、玻璃片、微孔硅片或徵孔玻璃。

8 . 根据杈利要求 1的蛋白芯片，

其特征在于，所述的蛋白质的分布密度不低于 25 dot/cm2。

9 . 根据杈利要求 1的蛋白芯片，

其特征在于，所述的蛋白质的量是 0 . 1 ng/dot至 10 ng/dot范围内。

10 . —种蛋白芯片的制备方法，

其特征在于，

(a)在固相载体上以一定的排列次序固定多种蛋白质；

( b)然后用封闭液将固相载体的非点样部位封闭，冻干保存。

11. 根据杈利要求 10的制备方法，

其特征在于，所述的蛋白质是以共价结合或物理吸附的原理固定到固相载体表面的。

12- 根据杈利要求 10的制备方法，

其特征在于，所述的封闭液含有蔗糖、 BSA、 Tween 20、 PBS，酪氨酸。

13. 根据杈利要求 12的制备方法，

其特征在于，所述的封闭液含有 0.1- 0.5%Tween 20、 0.02- 0.3%酪氨酸、 1-9¾蔗糖、 1-9%BSA、 0.1-l%proclin

14. 根据杈利要求 12的制备方法，

其特征在于，所述的封闭液含有 0.2%Tween20、 0.1%酪氨酸、 4%蔗糖、 5¾BSA 0.5%proclin。

15. 根据杈利要求 11的制备方法，

其特征在于，蛋白质先溶于包被液，包被液为： pH 为 9.0-10.0 的 NaHC03-Na2C03緩沖液。

16- 一种用于多指标并行检测的蛋白芯片检测系统，

其特征在于，它利用化学发光反应同时检测多种生物大分子在体液内的含量，该检测系统包括：

(1)一种用于多指标并行检测的蛋白芯片；

(2)—种标记过氧化物酶的多蛋白质混合液；

(3)—种用于稀释被测体液的稀释液；

(4)一种由产生并增强化学发光反应的化合物组成的化学组合物；

(5)—种蛋白芯片的洗涤液；

(6)—系列被检蛋白质的标准品。

17- 杈利要求 16所述的检测系统，

其特征在于，所述的过氧化物酶是辣根过氧化物酶。

18. 杈利要求 16所述的检测系统 ,

其特征在于，所述的多蛋白质混合液是可与在体液中被检测到的蛋白质特异性结合的多种标记过氧化物酶的蛋白质，以一定浓度配比后的混合液。

19. 根据杈利要求 16所述的检测系统，

其特征在于，所述的洗涤液内含 0.7- 0.9%NaCl， 1.0-1.5% Tris , 0.05-0.2%Tween 20, pH值在 6.0至 9.0之间。

20. 根据杈利要求 19所述的检测系统，

其特征在于，所述的洗涤液优选配方为 0.9%NaCl, 1.21% Tris, 0.1 Tween 20, pH值为 7.50。

21. 根据杈利要求 16所述的检测系统，

其特征在于，所述的稀释液内含 0.7-0.9%NaCl， 1.0-1.5% Tris , 0.05-0.2%Tween 20, 0.05-0.2%酪氨酸。

22. 根据杈利要求 21所述的检测系统，

其特征在于，所述的稀释液优选配方为 0.9%NaCl， 1.21% Tris, 0.1%Tween 20， 0.1%酪氨酸。

23. 一种利用杈利要求 16所述的检测系统进行检测的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1) 将结合了多个可与体内指标特异性结合的蛋白（B) 的固相载体与含目椋蛋白（A) 的待测液接触，并使其充分反应形成稳定复合物

(B - A) ；

(2) 复合物（B- A) 进一步与多蛋白混合液中对应标记（A) 的特异结合蛋白（C-labelled)反应，形成稳定复合物（B -A-C-labelled)，标记是化学发光法的柘记物；

(3) 加上产生化学发光反应的化学組合物，使反应发光；

(4) 信号检测。

24. 根据杈利要求 23的方法，

其特征在于，所述的标记物是过氧化物酶。

25. 根据杈利要求 23的方法，其特征在于，所述的多蛋白混合液是可与在体液中被检测到的蛋白质特异性结合的多种标记过氧化物酶的蛋白质，以一定浓度配比后的混合液。

26 . 根据杈利要求 24或 25的方法，

其特征在于，所述的过氧化物酶是辣根过氧化物酶。