CN1865994B - 含有机分子交联标记的分析方法及与之相关的分析组成 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含有机分子交联反应在内的标记的分析方法。其中所述标记的标记系统具有下述特征的标记物：所述标记物包括探针和引发剂的复合物，其中所述引发剂为引起所述有机分子交联反应的物质。本发明还涉及所述标记系统。本发明的标记方法，灵敏度高、特异性高、容易实现、所需装置简单。

Description

含有机分子交联标记的分析方法及与之相关的分析组成

技术领域

本发明涉及一种含标记反应的定量或/和分析方法、更具体涉及标记反应含有机分子交联反应的分析方法。本发明还涉及一种与本发明的分析方法相关的分析组成。

背景技术

含标记反应的定量或/和定性分析方法很多，例如含下述标记方法的方法：1).物理标记(Physical labelling)：是指用物理的方法(如无线电、音频、辐射或光谱发射/发生器，编号的金属/塑料标签以及其它固体埋藏物等)对所研究的生物个体或群体进行跟踪、警示或鉴别。例如：放射性标记(Radiolabelling)、发光标记(luminescentlabelling，包括化学发光(Chemiluminescence)标记、生物发光(Bioluminescence)标记、电致化学发光(Electrochemiluminescence)标记、磁性标记(Magnetic labelling)、胶体金标记(Colloidal gold labelling)、纳米标记(Nanoparticle labelling)、自旋标记(Spin labelling)、金属羰基标记(Metal carbonyl labelling)；2).化学标记(Chemistry labelling)：是基于天然或合成的化学物质对所研究的生物个体的生物大分子(蛋白质或核酸)进行标记，例如：血型标记(Blood-type labelling)、特异酶标记(Special enzyme labelling)、蛋白质标记(Protein labelling)、免疫标记(Immunizing labelling)、电化学标记(Electrochemical labelling)、亲和标记(Affinity labelling)、化学基团标记(Chemical group labelling)；3).生物标记(Biological labelling)：是指利用生物体或细胞自身在遗传或生理上的生物性状/表型或生物分子的特性作为标记来分离、分类或区分生物的群体、个体或细胞，例如：限制性长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)标记、增片段长度多态(Amplified Fragments Length Polymorphism，AFLP)标记、随机扩增多态DNA(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)标记、简单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)标记、单链构象多态(SingleStrand Conformational Polymorphism，SSCP)标记、单核苷酸多态(SingleNucleotide Polymorphism，SNP)标记、特定序列位点(Sequence Tag Site，STS)标记、原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)、mRNA差异显示(mRNADifferential Display，MRDD)标记、基因标记(Gene labelling)、基因连锁标记(Gene linkage labelling)。然而这些方法，或者要求较为复杂的装置(例如放射性物质标记、化学发光物质标记、荧光物质标记、酶催化底物标记、等等)，或者灵敏度低(例如染色剂标记)，或者可操作性差(例如银加强金标记)。

发明内容

本发明的主要目的，是提供一种含具有下述特征的标记方法在内的分析方法和相应分析组成：高灵敏度、高特异性、容易实现、所需装置简单。

根据本发明的第一个方面，其提供一种分析方法，其包含提供标记系统并进行标记，特征在于：所述标记包含有机分子交联反应。

根据本发明的第二个方面，其提供一种用于分析的标记系统，其为本发明的第一个方面所提供的分析方法中的所述标记系统。

根据本发明的第三个方面，其提供一种用于分析的装置或试剂盒，其含本发明的第一个方面所提供的分析方法中的所述标记系统。

发明内容的详细描述

术语定义

本发明术语“标记”，是指在定性或/和定量分析中，使目标物质被赋予某种特性而区别于其它物质、以便于鉴别该目标物质的过程；术语“标记系统”是指标记中必不可少的添加物的总和，其中的核心之一是标记物；术语“探针”是指标记物中用以发生特异性反应(例如与固定或未固定目标物质的亲和反应)的物质。

本发明术语“纳米结构”，是指三维结构中至少一维(例如粒径、管径、线径、等等)为纳米尺寸(优选3nm-300nm)的结构；术语“纳米粒子”是指粒径为纳米尺寸(优选3nm-300nm)的粒子；术语“纳米串珠”是指一个以上纳米粒子以有机基团共价连接的纳米结构复合物。

本发明术语“活化结构”是指这样一种组成，其至少含活化基团；术语“活化基团”是指用以提供与功能试剂结合的基团(例如氨基、羧基、等等)的基团(例如氨基酸)或复合基团(例如氨基酸衍生物、合成肽基、合成肽衍生物基)；术语“活化纳米结构”，是指这样一种组成，其含纳米结构和其上固定的活化结构；术语“活化纳米粒子”是指这样一种组成，其含纳米粒子和其上固定的活化结构；术语“活化纳米凸体”是指这样一种组成，其含纳米凸体和其上固定的活化结构；术语“活化纳米串珠”是指这样一种组成，其含纳米串珠和其上固定的活化结构。

本发明术语“多肽”相当于英语中的“polypeptide”，包括天然或合成蛋白质、蛋白质片断、合成肽、等等，免疫检测中通常的目标物和检测中通用的配基、例如抗原、抗体、等等都属于多肽。

本发明术语“分析组成”，是指用于分析过程的组成，例如装置或试剂盒、或它们的中的一种成份；术语“分析”，是指在体外或体内进行的定性或/和定量分析；术语“装置”是指具有特定功能的用品，例如含有功能试剂的仪器(例如，分析芯片、酶标板、亲和电泳条、亲和层析柱、平面层析试剂条、等等)；术语“分析芯片”简称为“芯片”，包括但不限于英语中的Biochip、Microarray、Bioarray，是指定性和/或定量分析中的一种检测装置，其反应器中微量功能试剂同样品中的目标分子发生反应的结果可以以可寻址的方式进行识别；术语“纳米结构芯片”为至少含有一个本发明所述纳米结构活性区(例如功能试剂微阵列中的一个样点)。

此外，本发明中所用凝血因子符号如下：FII(因子II，凝血酶原，prothrombin)、FVII(因子VII，稳定因子，stable Factor)、FIX(因子IX，血浆凝血活酶成分，plasma thromboplastin com-ponent，PTC)、FX(因子X，stuart-prower因子)、FXII(因子XII，接触因子，hageman factor)、FXI(因子XI，血浆凝血活酶前质，plasma thromboplastin antecede nt，PTA)、PK(激肽释放酶原，prekallikrein，PK)、HMWK(高分子量激肽原，high molecularweight kininogen)、FI(因子I，纤维蛋白原，fibrinogen)、FV(因子V，易变因子，labile factor，)、FVIII(因子VIII，抗血友病球蛋白，antiemophilia globulin，AHG)、FXIII(因子XIII，纤维蛋白稳定因子，fribrin stabilizing factor)、FIII(因子III，组织凝血活酶，tissue thromboplastin)、FIV(因子IV，钙离子，calciumion)；所用活化凝血因子的符号，在上述凝血因子符号后加“a”形成，例如活化因子II为FIIa。

本发明第一方面提供的一种分析方法，其包含提供标记系统并进行标记，特征在于：所述标记包含有机分子交联反应。在本发明分析方法的一种方案中，所述标记系统含标记物，所述标记物包括探针和引发剂的复合物，其中所述引发剂为引起所述有机分子交联反应的物质。

在本发明分析方法的一种方案中，所述有机分子交联反应包括纤维蛋白凝胶的生成反应。纤维蛋白凝胶的生成，是纤维蛋白原(fibrinogen)在凝血酶(Thrombin)作用下降解为纤维蛋白并聚合成不溶性的网状结构的过程。正常血液中的凝血酶原(FII)，在一定条件下被激活而成为凝血酶。凝血酶原激活物是由活化的凝血因子与磷脂胶粒和钙形成的复合物。因此，凝血因子的活化是导致纤维蛋白凝胶生成(血液凝固)的触发机制。据触发凝血过程的方式不同，又有内源性(intrinsic)与外源性(extrinsic)凝血之分。内源性凝血指因心血管内膜受损或血液抽出体外接触异物表面而触发的，仅有血管内凝血因子参与的凝血过程；而外源性凝血则指有受损组织释放的组织凝血活素所参与的凝血过程。更详细的描述，可参考有关凝血的文献。

在本发明分析方法的一种方案中，所述标记系统中的所述引发剂包括下述组之一种或多种：活化凝血因子(Activated Cogulation Factor)、前激肽释放酶(Prekallikrein，PK)、高分子激肽原(High-Molecular-Weight Kininogen，HWWK)、卵磷脂、钙。在本发明分析方法的一种方案中，所述标记系统中的所述探针包括下述组之一种或多种：抗原、抗体、核酸、亲和素、生物素、蛋白质A、蛋白质G。

在本发明分析方法的一种方案中，所述标记系统中的所述标记物还包含所述引发剂与探针的联接剂。在本发明分析方法的一种方案中，所述联接剂包括纳米结构。

在本发明分析方法的一种方案中，所述标记系统还含交联反应物，所述交联反应物包括：纤维蛋白原或/和纤维蛋白原衍生物、或/和含所述纤维蛋白原或/和纤维蛋白原衍生物的组成。

在本发明分析方法的一种方案中，所述标记系统还含控制剂，其中所述控制剂为可控制所述有机分子交联反应的速度或/和程度的物质。在本发明分析方法的一种方案中，所述控制剂包括下述组之一种或多种：抗凝血酶III、肝素、活化蛋白质C。

在本发明分析方法的一种方案中，所述标记包括下述步骤：a).提供样品、分析反应器和所述标记系统；b).通过分析反应器将样品中可能存在的目标物分离出来，然后使标记系统中的所述标记物与分离出来的目标物接触并结合；或b’).使样品中可能存在的目标物与标记系统中的所述标记物接触并结合，然后通过分析反应器将目标物和标记物的结合物分离出来；和c).使标记系统中的所述交联反应物与上述目标物和标记物的结合物中的所述引发剂接触、并进行所述有机分子的交联反应，然后检出并分析所述交联反应的产物。

在本发明分析方法的一种方案中，所述标记系统的提供包括下述步骤：

a).提供所述引发剂、所述探针和所述联接剂；b).将所述引发剂和探针在有效条件下结合在所述联接剂上形成所述探针/引发剂复合物。优选的分析方法包括：所述有效条件包括达到下述组成要求的条件：a).未固定在所述联接剂上的所述引发剂的含量与引发剂总量之比小于5％；b).未固定在所述联接剂上的所述探针的含量与探针总量之比小于25％；或/和c).未固定有探针的所述联接剂的含量与联接剂总量之比小于25％。

在本发明分析方法的一种方案中，所述分析包括下述组之一的分折：分析芯片分析、生物传感器分析、层析试剂条分析、微孔板分析。

本发明第二方面提供的一种用于分析的标记系统，其为本发明的第一个方面所提供的分析方法中的所述标记系统。

本发明的第三个方面提供的一种用于分析的装置或试剂盒，其含本发明的第一个方面所提供的分析方法中的所述标记系统。本发明的第三个方面提供的装置或试剂盒，其包括下述组之一的装置或试剂盒：分析芯片、生物传感器、层析试剂条、快检板、孔、球。

具体实施例

实施例1本发明的标记物的制备方法

本实施例中，所提供用于所述制备方法的试剂和材料，除个别情况外，均可在市场上购得：

1).引发剂：所用引发剂可以是任何可直接或间接引发所述有机分子交联反应的物质，例如下述组之一种或多种物质：活化凝血因子、前激肽释放酶、高分子激肽原、卵磷脂、钙。其中，所用活化凝血因子包括纯化凝血酶(华兰生物工程股分有限公司)、活化PPSB(IIa、VIIa、IXa和Xa的混合物)。活化PPSB系按公知的凝血因子活化方法自制，简言之：将PPSB(华兰生物工程股分有限公司)溶液与优选浓度(0.1-03mmol)的氯化钙溶液等量混合，室温下反应1小时，然后通过透析膜除去钙剂中止活化反应。在所用引发剂中，凝血酶和活化PPSB(含凝血酶)可直接作用于纤维蛋白原，引发纤维蛋白凝胶的生成。而其它引发剂则是通过血液中的凝血相关反应，将凝血酶原水解为凝血酶，然后作用于纤维蛋白原，引发纤维蛋白凝胶的生成。

2).探针：所用探针包括：抗原、抗体、及其它探针。所用抗原包括：标记用丙肝病毒抗原(HCV Ag，北京大学人民医院肝病研究所)和标记用艾滋病毒抗原(HIV Ag，北京大学人民医院肝病研究所)；所用抗体包括标记用抗乙肝病毒表面抗体(HBs Ab，北京大学人民医院肝病研究所)和羊抗人二抗(北京生物制品研究所)；所用其它探针包括蛋白质A(上海生物制品研究所)。本实施例的方法也适于其它探针，例如：药物、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、单链或多链DNA、RNA、以及病毒、细胞或它们的组成。

3).联接剂：所用联接剂包括下述组之一种或多种：纳米结构、微米粒子、高分子。所用纳米结构可以是任何可结合引发剂或/和探针的任何形态的纳米结构，例如：活化或未活化的纳米粒子、纳米串珠、纳米管、纳米棒、等等。优选的纳米结构之一，为含无机基质的纳米结构(例如，无机基质纳米结构、包容无机物的纳米结构、和无机物包被纳米结构)，包括氧化物纳米粒子、氧化物纳米串珠、磁纳米粒子和金属纳米粒子。本实施例中：a).所用氧化物纳米粒子包括以氨基酸基为活化基团的活化氧化物纳米粒子：氨基酸基/硅烷偶联剂/氧化硅纳米粒子、氨基酸基/硅烷偶联剂/氧化钛纳米粒子、氨基酸基/硅烷偶联剂/氧化铝纳米粒子；b).所用纳米串珠包括以氨基酸基为活化基团的活化纳米串珠：氨基酸基/硅烷偶联剂/氧化硅纳米串珠、氨基酸基/硅烷偶联剂/氧化钛纳米串珠、氨基酸基/硅烷偶联剂/氧化铝纳米串珠；c).所用金纳米粒子为平均粒径20nm的胶体金；d).所用磁纳米粒子为有机物(例如葡聚糖)包被磁纳米粒子；e).其它材料(例如有机物、其它金属、等等)的纳米结构，也可用于以下实施例的方法制备本发明的纳米标记物。其中，活化氧化物纳米粒子和活化纳米串珠的制备，按照我们的另一发明专利申请(CN200610020637.2)中的相应制备方法进行。其中，所用氧化硅纳米粒子为LUDOX AS-40(粒子平均尺寸25nm，比表面积约135m2/g，Sigma-Aldrich公司)、所用氧化铝纳米粒子为MC2R γ-相纳米氧化铝(粒子平均尺寸60nm，比表面积140m²/g，浙江弘晟材料科技股份有限公司)、所用氧化钛纳米粒子的粒子平均尺寸＜80nm(比表面积120m²/g，浙江舟山明日纳米材料有限公司)。其中，有机物包被磁纳米粒子按公知的用有机物(例如葡聚糖)包被磁纳米粒子的方法。

本实施例中，本发明的标记物的制备方法至少包括2种方法：1).对引发剂或/和探针进行化学改性(例如过碘酸钠法)，反应生成引发剂和探针直接结合的引发剂/探针复合物；2).将引发剂和探针固定在联接剂上，生成引发剂和探针间接结合的引发剂/探针复合物。对第一种方法而言，有已知的化学改性方法可用。第二种方法，例如：将上述探针与引发剂制成探针-引发剂混合液，再与上述纳米结构的悬浮液混合，并在有效条件下进行探针和引发剂结合至纳米结构上的反应。反应条件如下：探针-引发剂总蛋白浓度(w/v)0.1-3.0mg/ml；活化纳米粒子浓度(w/v)0.01-3％；反应介质缓冲液pH5.0-9.5；反应温度20-37℃；反应时间0.5-72小时。本专业的技术人员通过调节这些参数、尤其是调节探针与引发剂的相对比例，可获得所需的优化条件。反应完成后，进行纳米标记物的纯化(例如通过公知的层析-离心法进行)，必要时还包括纳米标记物的纯化(常用纯化剂包括蛋白质和氨基酸)。

本发明中，以探针/纳米结构/引发剂作记号，来表示纳米标记物。本实施例制备的纳米标记物包括：标记抗原/纳米结构/凝血酶、标记抗体/纳米结构/凝血酶、Protein A/纳米结构/凝血酶、标记抗抗体/纳米结构/凝血酶、标记抗抗体/纳米结构/活化PPSB、标记抗抗体/纳米结构/Fxa、等等。其中：标记抗原、标记抗体、标记抗抗体、各种纳米结构、各种引发剂均包括上述本发明实施例中所用标记抗原、标记抗体、标记抗抗体、各种纳米结构、各种引发剂。

实施例2本发明的标记系统的制备方法

本实施例制备的标记系统，包括：

1).标记系统A：其含本发明的标记物和交联反应物。其中：所用本发明的标记物为上述实施例1制备的本发明的标记物；所用交联反应物，包括纯化纤维蛋白原(华兰生物工程股分有限公司)，或含纤维蛋白原的血液组分(例如血浆)。

2).标记系统B：其含本发明的标记物、交联反应物、和有机分子交联反应的控制剂。其中：所用本发明的标记物为上述实施例1制备的本发明的标记物；所用交联反应物组成，包括纯化纤维蛋白原(华兰生物工程股分有限公司)，或含纤维蛋白原的血液组分(例如血浆)；所用控制剂包括：肝素、抗凝血酶III(法国LFB)、尿激酶。其中，优选的方案之一是将所用控制剂按优选浓度加入交联反应物组成中。

实施例3本发明的试剂盒的制备方法

本发明实施例制备的本发明的试剂盒，其含反应器和本发明的标记系统。其中：所用本发明的标记系统，为上述实施例2制备的本发明的标记系统；所用反应器含固相载体和固定在固相载体上的功能试剂；所用功能试剂包括：抗原或/和抗体(供间接法用)、包被抗原或/和抗体(供双抗原或/和双抗体夹心法用)、其它(例如蛋白质A)；所用抗原或包被抗原包括HIVAg和HCV Ag；所用抗体或包被抗体包括Hbs Ab和羊抗人二抗。根据所用反应器的不同，本发明试剂盒的更具体的制备方法由以下实施例3.1-3.3补充。

实施例3.1本发明的分析芯片试剂盒的制备方法

本实施例制备的本发明的分析芯片试剂盒，其含分析芯片和本发明的标记系统。本实施例中，分析芯片的制备采用公知的制备方法。其中：常规分析芯片的制备方法、应用方法参考Schena，M.，Microarray Analysis，2003，John Wiley & Sons，Inc.，New York；纳米分析芯片的制备方法、应用方法参考我们的另外两项发明专利申请(PCT/CN2004/000437和CN200610020637.2)。其中，活化载玻片包括按照已公开的方法制备的氨基玻片(参考Schena，M.，Microarray analysis，John Wiley & Sons，INC.，New York)、醛基玻片(参考Schena，M.，Microarray analysis，John Wiley &Sons，INC.，New York)、氨基肼玻片(参考Xavier Duburcq et al.，BiocongateChemistry 2002，13：713-720)。

例如，将含上述功能试剂的功能试剂溶液或功能化纳米结构悬浮液(功能试剂浓度在0.1-2mg/ml之间)点在芯片片基(例加活化载玻片)上，37℃反应3小时以上，然后用钝化剂(例如牛血清白蛋白)钝化。其中，点样可为手工点样或机械点样(DY-2003生物芯片点样仪，中国科学院电工研究所)。每种溶液或悬浮液点2-4个点。所有功能试剂点在芯片片基上形成M×N功能试剂阵列。其中M大于1，N大于1。

本实施例的方法当然适于各种芯片，例如单反应池芯片、多反应池芯片、流动芯片、非流动芯片、等等。多反应池非流动芯片片基的制备方法，可参考我们的另一专利申请《反应器高度最小化的高集成度分析芯片及其应用》(PCT申请号CN20040169)中的实施例1。然后，再对片基池进行上述“点样”操作和其它操作。流动生物芯片的制备方法，可参考我们的另一专利申请《反应器高度最小化的高集成度分析芯片及其应用》(PCT申请号CN20040169)中的实施例9或10。本实施例流动生物芯片的制备方法，参考其制备方法。

本实施例的方法制备的分析芯片试剂盒，包括：抗原芯片试剂盒、抗体芯片试剂盒、抗原和抗体芯片试剂盒、其它亲和芯片试剂盒。本实施例的方法制备的部分分析芯片试剂盒，列于表1中。

表1

其中：Ag1-HCV抗原、Ag2-HIV抗原、Ag3-梅毒抗原、Pa-蛋白质A、Ab1’-包被用HBs抗体、Ag1’-包被用HCV抗原、Ag2’-包被用HIV抗原、Ab1”-标记用HBs抗体、Ag1”-标记用HCV抗原、Ag2”-标记用HIV抗原、FI-纤维蛋白原、组成2-交联反应物组成。

ELISA多孔板包括聚苯乙烯多孔板。硅胶包括粒径40-60μm的氧化硅粒子(中国科学院化学研究所)。层析胶包括Sephadex A50和CM-Shepharose CL(Pharmacia公司)。

实施例3.2本发明的包被微孔板试剂盒的制备方法

本实施例制备的本发明的微孔板试剂盒，其含包被微孔板和本发明的标记系统。本实施例中，包被微孔板的制备方法与公知的用于ELISA试剂盒的包被微孔板的制备方法相同。例如，将功能试剂溶液(功能试剂浓度在0.0.5-2μg/ml之间)加在聚苯乙烯或聚氯乙烯96孔板(深圳金灿烨有限责任公司)孔底上，室温下摇动，包被3-24小时，然后用钝化剂(例如牛血清白蛋白)钝化。本实施例的方法制备的包被微孔板试剂盒，包括：抗原包被微孔板试剂盒、抗体包被微孔板试剂盒、抗原和抗体包被微孔板试剂盒、其它功能试剂包被微孔板试剂盒。本实施例的方法制备的部分试剂盒列于表2中。

表2

其中所用符号与表1中所用符号相同。

实施例3.3本发明的包被膜试剂盒的制备方法

本实施例制备的本发明的膜试剂盒(快检试剂条试剂盒)，其含反应膜和本发明的标记系统。本实施例中，反应膜的制备方法与公知的快检试剂条的制备方法相同。例如，将上述功能试剂溶液(功能试剂浓度在0.1-2mg/ml之间)点在纤硝基纤维膜条或尼龙纤维膜条(福建泉州长立生化有限公司)上，37℃反应3小时以上。本实施例的方法制备的快检试剂条试剂盒，包括：抗原快检试剂条试剂盒、抗体快检试剂条试剂盒。

实施例4本发明的分析方法

本发明的分析方法，包括用本发明标记系统进行标记。所述标记包括下述步骤：a).提供样品、分析反应器和所述标记系统；b).使样品与分析反应器接触、并将样品中可能存在的目标物固定在分析反应器上，然后使所述标记物中的探针与所述被固定的目标物接触、并将标记物通过所述被固定的目标物固定在分析反应器上；或b’).使样品与所述标记物中的探针接触、并将样品中可能存在的目标物固定在标记物上，然后使所述标记物/目标物复合物与分析反应器接触、并将所述标记物/目标物复合物固定在分析反应器上；和c).使所述有机分子与所述被固定的标记物中的引发剂接触、并进行所述有机分子的交联反应，然后检出并分析所述交联反应的交联物。根据所用试剂盒的不同，本发明的更具体的分析方法由以下实施例4.1-4.3补充。

以下实施例中，分析样品分别为：HCV抗体阳性血清，HIV₁₊₂抗体阳性人血清，HBs Ag阳性血清，EBV抗体阳性血清，梅毒抗体阳性血清，和阴性血清(HCV抗体、HIV₁₊₂抗体、HBs Ag和梅毒抗体都为阴性的血清)。所有的样品均经使用经典的ELISA方法在血清10倍稀释反应条件下预先检测。

实施例4.1本发明的分析芯片分析方法

含本发明的标记方法的分析芯片测试方法，一个例子如下：

a).提供样品和试剂盒：根据样品(例如血清)中待测目标物的种类(例如HCV抗体、HIV抗体和HBs抗原)，选择试剂盒(例如表1中的A6)。

b).目标物的分离：将5μl测试样品(使用间接法测定时用PBS缓冲液稀释20-50倍)加入所述芯片的反应器中，使可能存在的目标物与反应器中固定的功能物质接触、并在37℃反应30分钟，然后用洗涤液冲洗干净反应器中未固定的物质。

c).引发剂标记目标物：将5μl优化浓度的本发明的标记物加入所述芯片的反应器中，使标记物中的探针与可能固定在反应器中的目标物接触、并在37℃反应30分钟，然后用洗涤液冲洗干净反应器中未固定的标记物。

d).引发剂引发交联反应：将5μl优化浓度的交联反应物组成(加或未加有控制剂)加入所述芯片的反应器中，使交联反应物与可能固定在反应器中的标记物中的引发剂接触、并在37℃反应30分钟，然后用洗涤液冲洗干净反应器中未固定的物质。

e).检出并分析：如果样品含目标物，目标物将固定在反应器中的相应功能物质上，固定化目标物又将含相应探针的标记物固定下来，固定化标记物中的引发剂将引发交联反应物开始进行交联反应，并在反应器中的相应探针点上形成可控大小的交联物。交联物颜色及其大小，可通过光学仪器(例如照相机、显微镜)、甚至肉眼检出。相反，如果样品不含目标物，理论上不会出现交联物。然而，如同所有其它标记方法一样，本发明的方法也可能由于非特异反应而出现不应出现的交联物，影响检测特异性。利用已知的提高检测特异性的方法，本行业的专业人士应当获得优选的条件，来获得足够高的特异性和灵敏度。实际上，本实施例中，使用本发明的试剂盒分别对上述样品进行的分析，所得阴、阳性结果与上述样品用Elisa方法所得阴、阳性一致。

本实施例中，还对本发明的标记物的稳定性进行了研究。本发明的标记物在37℃放置54小时后，使用与上述方法相同的方法，在相同阳性样品时获得的结果仍是阳性。

实施例4.2本发明的包被微孔板分析方法

含本发明的标记方法的包被微孔板分析方法，一个例子与上述实施例4.1的方法的例子相同。在包被微孔板分析中，包被微孔板的反应器为孔，因而加入反应物(例如样品、标记物、交联反应物)的量可适当提高(例如20-100μl)。本实施例中，使用本发明的试剂盒分别对上述样品进行的分析，所得阴、阳性结果也与上述样品用Elisa方法所得阴、阳性一致，标记物稳定性也得以证实。

实施例4.3本发明的试剂条分析方法

含本发明的标记方法的快检试剂条分析方法，一个例子与上述实施例4.1的方法的例子相同。在快检试剂条中，反应器为膜，因而加入反应物(例如样品、标记物、交联反应物)的量可适当提高(例如50-100μl)。本实施例中，使用本发明的试剂盒分别对上述样品进行的分析，所得阴、阳性结果也与上述样品用Elisa方法所得阴、阳性一致，标记物稳定性也得以证实。

Claims (12)

1.一种分析方法，其包含提供标记系统并进行标记，其中所述标记包含有机分子交联反应，特征在于：所述有机分子交联反应包括纤维蛋白凝胶的生成反应。

2.按照权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述标记系统含标记物，其中所述标记物包括探针和引发剂的复合物，其中所述引发剂为引起所述有机分子交联反应的物质。

3.按照权利要求2所述的分析方法，其特征在于：所述标记系统中的所述引发剂包括下述组之一种或多种：活化凝血因子、前激肽释放酶、高分子激肽原、卵磷脂、钙。

4.按照权利要求2所述的分析方法，其特征在于：所述标记系统中的所述探针包括下述组之一种或多种：抗原、抗体、核酸、亲和素、生物素。

5.按照权利要求2所述的分析方法，其特征在于：所述标记系统中的所述标记物还包含所述引发剂与探针的联接剂，所述联接剂包括纳米结构。

6.按照权利要求2所述的分析方法，其特征在于：所述标记系统还含交朕反应物，所述交联反应物包括：纤维蛋白原或/和纤维蛋白原衍生物。

7.按照权利要求1或3所述的分析方法，其特征在于：所述标记系统还含控制剂，其中所述控制剂为可控制所述有机分子交朕反应的速度或/和程度的物质，所述控制剂包括下述组之一种或多种：抗凝血酶III、肝素。

8.按照权利要求6所述的分析方法，其特征在于：所述标记包括下述步骤：a).提供样品、分析反应器和所述标记系统；b).通过分析反应器将样品中可能存在的目标物分离出来，然后使所述标记系统中的标记物与分离出来的目标物接触并结合；或b’).使样品中可能存在的目标物与所述标记系统中的标记物接触并结合，然后通过分析反应器将目标物和标记物的结合物分离出来；和c).使标记系统中的所述交联反应物与上述目标物和标记物的结合物中的所述引发剂接触、并进行所述有机分子的交联反应，然后检出并分析所述交联反应的产物。

9.按照权利要求5所述的分析方法，其特征在于：所述标记系统的提供包括下述步骤：a).提供所述引发剂、所述探针和所述联接剂；b).将所述引发剂和探针在有效条件下结合在所述联接剂上形成所述标记物。

10.按照权利要求8所述的分析方法，其特征在于：所述交联反应的产物包括纤维蛋白凝胶。

11.按照权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于：所述分析包括下述组之一的分折：分析芯片分析、生物传感器分析、层析试剂条分析、微孔板分析。

12.一种用于分析的标记系统，其特征在于：其为权利要求1-11之一所述的分析方法中的所述标记系统。