CN100504395C - Sars病毒诊断试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多指标并行检测SARS病毒抗体的体外诊断试剂。该试剂盒包括蛋白芯片、反应液、检测液和洗涤液，其中在蛋白芯片固相基质上固定有SARS相关的多种蛋白。所述的SARS相关的多种蛋白选自下述四种或四种以上蛋白：S蛋白、N蛋白、M蛋白、E蛋白、蛋白酶3CL或RNA聚合酶，点样密度在10-200点/cm²，点样量0.1-10ng/点。本发明试剂盒对以上几种蛋白抗体的同时检测对于SARS病人的诊断准确率有重大意义。

Description

SARS病毒诊断试剂

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体涉及一种多指标并行检测SARS病毒抗体的体外诊断试剂。

背景技术

SARS(严重呼吸窘迫综合症)又称“非典型性肺炎”，其相关的病原微生物是一种变异的冠状病毒(coronavirus)，为单链正链RNA病毒(ssRNA)，这种冠状病毒被命名为SARS病毒，SARS病毒的核酸序列与已知不引起非典型性肺炎的冠状病毒基因同源性仅有50—60％，但与禽流感有相似之处。

SARS病毒主要通过短距离飞沫传播、接触病人呼吸道分泌物及密切接触传播，也不排除粪便传播和血液传播的可能性。

据中国疾病控制中心官方网站显示：SARS自2002年11月在广东首发以来，至2003年5月27日全球已有31个国家/地区发现SARS患者8221人，造成735人死亡。我国大陆及香港至27日已有7050例，造成590人死亡。为切断传染源，发现病人或疑似病人后，相关社区不得不被封闭，给社会安定、人民生命安全和国家经济发展带来了巨大的危害。虽然随着气温的升高，SARS的新增病例数有所下降，但广大人民群众仍面临着巨大的危险。有专家指出：不清楚此一传染病究竟会否持续扩大，引发更大的全球疫情，或是成为长期的偶发性传染病，每次爆发规模大小不同的疫情。因此能早期诊断SARS病毒的诊断试剂、特异性的治疗药物和预防性的疫苗成为目前研究的热点。

目前，正在研制中的SARS检测方法有：PCR检测、免疫检测和细胞培养检测。

1、PCR检测

用PCR技术扩增病毒特异性基因的方法可以检测出在各种样本(血液，粪便，呼吸道分泌物，组织切片)中的SARS病毒。据报道，德国、泰国、新加坡、我国的北京、广州、河南、上海等地都在研制基于此法的试剂盒，国外已经有基于此法的产品问世，如德国ARTUS公司的试剂盒。

PCR法检测SARS病毒具有以下特点：

1)快速、早期诊断。此法可用于对潜伏期或发病早期，临床症状不典型，抗体尚未形成或抗体滴度低的病人检测

2)高灵敏度和特异性。由于此法用的是核酸大量扩增的原理，因此只要标本中含有较低的病毒基因拷贝，即可检出。

2、免疫检测

用ELISA或荧光免疫检验法可以特异性地检测出患者血清中的病毒抗体。由于采用的是抗原和抗体特异性结合的原理，免疫检测法特异性高达95％以上。

非典型肺炎冠状病毒感染人体后的致病机理目前尚未完全清楚，但从现有的临床检测数据分析，可在发病后7天左右检测出IgG抗体。有试验表明，发病天数8—10天的阳性率为42％；而10天左右SARS病人的抗体阳性检出率可达到90％以上；随时间延长，阳性检出率不断提高。因此，SARS病毒抗体检测方法无论是作为一种辅助鉴定非典的临床检测手段，或是确诊的手段都是非常有用的。

我国的军事医学科学院研制的免疫检测试剂是国内首个SARS诊断试剂，已获SDA批准进行试生产。据报道，中国疾控中心病毒所也在研制类似检测试剂。

3、细胞培养检测

从SARS患者所采集的样本(如呼吸道分泌物，血液或者粪便)中的病毒可以通过感染性细胞培养并产生出病毒而检测出来。一旦病毒被分离，它会被进一步的检测实验来确定是否为SARS病毒。细胞培养是一项对应用条件要求很高的实验，需要时间长，在很多家临床机构还不具有操作可行性。因此，目前几乎未被用于临床诊断，只能在研究机构中使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是基于蛋白芯片技术，提供一种能实现多指标并行检测，灵敏度高，检测准确的SARS病毒抗体的检测试剂盒。

本发明公开的能实现多指标并行检测SARS病毒抗体的检测试剂盒包括蛋白芯片、反应液、检测液和洗涤液，其中在蛋白芯片固相基质上固定有SARS相关的的多种蛋白。

所述的SARS相关的多种蛋白选自下述四种或四种以上蛋白：S蛋白、N蛋白、M蛋白，蛋白酶3CL，E蛋白或SARS RNA聚合酶，点样密度在10—200点/cm²，点样量0.1—10ng/点。

所述的反应液为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，浓度为1—100mg/10ml。

所述的洗涤液至少包括下述一种成份：0—5％NaCl、0—2％KCl、0—5％Tris或0—1％Tween，PH为7.0—7.8。

目前，科研工作者通过对SARS病毒基因的全序列分析和对SARS病毒外壳蛋白结构分析，认为SARS外壳的S蛋白和M蛋白是诊断试剂和疫苗开发最重要的候选抗原。

本发明通过对SARS蛋白结构的分析，认为以下几种蛋白对于诊断试剂的开发具有重大意义。S蛋白是病毒外部的糖蛋白，形成了冠状病毒的冠状物，S蛋白具多种功能，包括受体结合活性和膜融合作用等，与病毒的致病性及组织亲嗜性密切相关；M蛋白为跨膜蛋白；N蛋白是病毒衣壳的成分；E蛋白是小的包膜相关蛋白，在冠状病毒的自我组装过程中起至关重要的作用；蛋白酶3CL与SARS病毒的复制密切相关；RNA聚合酶，是SARS侵入宿主细胞之后，启动其他一切生命活动的关键蛋白质。通过对上述几种蛋白中的至少四种的同时检测，可大大提高对SARS病毒的检出率，从而提高了SARS病人的临床诊断准确率。

本发明所要解决的另一技术问题是提供上述SARS病毒抗体的检测试剂盒的制备方法。

本发明公开的多指标并行检测SARS病毒抗体的试剂盒的制备包括下列步骤：

一、蛋白芯片的制备

1、SARS相关蛋白的制备

由于S基因序列过长，本发明将其分为4个片断S1，S2，S3，S4按常规方法将S1基因、S2基因、S3基因、S4基因、N基因、M基因、E基因、3CL基因、RNA聚合酶基因克隆质粒转化表达宿主菌，进行蛋白诱导表达后，经分离纯化得到蛋白产物，-20℃保存。其中所用到的缓冲液配方为：0—10mM NaAc溶液或0—40mMTris.HCL+0—80mM NaCl+1mM EDTA溶液

2、蛋白芯片的制备

1)确定本次制备的蛋白芯片上固定的蛋白种类，用稀释液将其稀释到各自的工作浓度。SARS的S1蛋白工作浓度为0——0.5mg/ml、S2蛋白用工作浓度0——0.5mg/ml、S3蛋白用工作浓度为0——0.5mg/ml、S4蛋白工作浓度为0——0.1mg/ml、M蛋白工作浓度为0——0.5mg/ml、N蛋白工作浓度为0—0.5mg/ml、E蛋白工作浓度为0—0.5mg/ml、3CL蛋白工作浓度为0—0.5mg/ml，RNA聚合酶蛋白工作浓度为0—0.5mg/ml、标准IgG蛋白工作浓度为0—0.5mg/ml，Gst蛋白工作浓度为0—0.5mg/ml；

用芯片自动点样系统将这些蛋白质固定在固相基质上，点样密度在10—200点/cm²，点样量0.1—10ng/点。

2)用封闭液将蛋白芯片封闭处理，以避免固相载体上未固定蛋白的区域随机吸附其它蛋白质，影响反应结果。干燥30—240分钟。

3)将蛋白芯片冻干处理，2—8℃贮存，为了长期保持蛋白活性，本发明采用冻干的方法来增加产品稳定性。

以下浓度单位除非特指均为W/V。

其中所述的稀释液配方为：0—0.04mol/l PBS+0—0.2％BSA，0—0.04mol/l TE+0—0.2％BSA或0—80mM的CBS溶液或0—40mMTris.HCL+0—80mM NaCl+0—5mM EDTA或0—50mM NaAc。

其中所述的封闭液配方为：70—95％CBS+5—15％小牛血清+1—9％蔗糖。

二、反应液的制备

采用常规的过碘酸钠法对羊抗人IgG进行辣根过氧化物酶标记，标记率不小于30％，浓度为1—100mg/10ml。

三、浓缩洗涤液的制备

0—5％NaCl、0—2％KCl、0—5％Tris和0—1％Tween，PH为7.0—7.8。

当带测血清中含有抗S蛋白、抗M蛋白、抗N蛋白、抗E蛋白、抗3CL、抗聚合酶蛋白蛋白中的一种或几种，当血清与蛋白芯片接触，该抗体可以与芯片上对应的蛋白结合，形成抗原一抗体结合物。用洗涤液洗去未结合的蛋白，将该蛋白芯片与反应液进一步反应，反应液中含有辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，可进一步形成抗原—抗体—二抗—酶标记物的结合物。该结合物与底物反应后能发出光信号，将该光信号强弱与标准IgG光信号比较，超过参考值则认为该指标对应的抗体为阳性。

为进一步控制该检测试剂的灵敏度和特异性，本发明设计了GST指标作为阴性对照，如果GST指标检测结果为阳性，则说明实验过程可能遭到污染，结果可信度下降。

本发明SARS病毒抗体的试剂盒的具体检测方法如下：

1.浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍；

2.血清用洗涤液按1：50稀释，吸取200μl加入反应孔内；

3.37℃温育振荡30分钟，弃去孔内的液体；

4.孔内加满稀释后的洗涤液，温育振荡5分钟，弃去洗涤液。共洗涤3次。

5.每反应孔内中加入200μl反应液。

6.同步骤3。

7.同步骤4。

8.在每个反应孔内加入150μl已混合15分钟的检测液A和B混合液，静置60秒。

9.用HD—2001系列生物芯片检测仪读取数据并进行数据分析。

用本发明的试剂盒对60份确诊的SARS病人血清进行了检测，结果如下：

 

被测指标	S蛋白	N蛋白	M蛋白	E蛋白	蛋白酶3CL	RNA聚合酶
							阳性率	93.3％	95％	100％	87.2％	61.6％	75.7％

试验数据表明：当病人感染SARS病毒，其产生S蛋白、N蛋白、E蛋白、M蛋白抗体的可能性在85％以上，产生RNA聚合酶和蛋白酶3CL抗体的可能性也大于60％。因此，对以上几种蛋白抗体的同时检测对于SARS病人的诊断准确率有重大意义。

附图说明

图1SARS病毒诊断试剂盒生物芯片检测结果

其中：

A1、A2点对应M蛋白

B1、B2点对应3CL蛋白

C1、C2点对应GST蛋白

D1、D2点对应标准IgG蛋白

A3、A4点对应S1蛋白

B3、B4点对应S2蛋白

C3、C4点对应S3蛋白

D3、D4点对应S4蛋白

E3、E4点对应N蛋白

具体实施方式

实施例1  SARS相关蛋白的纯化制备：以M蛋白为例

1.质粒转化表达宿主菌：取测序结果正确的M基因克隆质粒1μl，转化BL21DE3受体菌，取200μl转化产物铺于100μg/ml抗性筛选的平板，培养过夜；

2.蛋白的诱导：用无菌枪头挑取单菌落，接种于含有100μg/mlAmp抗性的3ml液体培养基中，37℃ 300rpm摇床培养至OD600＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度1mM，以不加IPTG的菌液为对照，诱导3小时，收集诱导菌液200μl，6000rpm离心5分钟，弃上清，加入电泳loading Buffer 10μl，沸水浴处理5分钟，6000rpm离心1分钟，加样于12％SDS—PAGE(配制方法见分子克隆实验指南)胶上，室温下电泳，待电泳前沿至凝胶底部，停止电泳，剥下PAGE胶置于染色液中染色3小时，然后在脱色液中脱色过夜；

3.诱导电泳结果分析：与对照相比较，如在目标分子量大小的位置出现目的电泳条带，则说明，目的蛋白已得到表达，进行下一步的蛋白纯化工作；

4.蛋白表达：取上述得到表达的菌种，活化过夜，接入含100μg/mlA抗性、300ml LB培养基的1L三角瓶中，37℃ 300rpm摇床培养至OD600＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度迪1mM，诱导3小时，然后收集菌液，8000rpm离心10分钟，弃上清；

5.菌体处理：取菌体沉淀，用30ml PBS重悬，冰浴超声(超声3S，间隔3S，共60次)破碎细胞，4℃ 11000rp离心20分钟，沉淀中加入1％ Triton X—100 30ml重悬，4℃ 11000rpm离心20分钟，沉淀中加入2Murea 30ml重悬，4℃ 11000rpm离心20分钟，4℃11000rpm离心20分钟，沉淀中加入8M变性液(含8M尿素，10mMTrisHCl pH8.0)处理过夜，4℃ 11000rpm离心20分钟，上清放入加入6M透析液(含6M尿素，10mM醋酸pH5.5)处理过夜；

6.取上述步骤5的上清以1ml/min的流速上Source 40S柱，然后以1ml/min的流速梯度洗脱，收集洗脱液，进行15％SDS—PAGE凝胶电泳，分析蛋白的洗脱情况；

7.对上述产物含有目标蛋白的收集液进行5M→4M→3M→2M→1M→0M Urea梯度透析，每个梯度时间不小于四小时；

8.透析液进行15％SDS—PAGE凝胶电泳，分析蛋白的纯化情况，产物—20℃分装保存

实施例2  SARS病毒抗体检测试剂盒的制备

1.蛋白芯片的制备

(1)将SARS的S1蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、S2蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、S3蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml、S4蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml、M蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、N蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、3CL蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml，标准IgG蛋白用稀释液稀释到15.6ug/ml，Gst蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml；

(2)用封闭液将蛋白芯片封闭处理，以避免固相载体上未固定蛋白的区域随机吸附其它蛋白质，影响反应结果。干燥30—60分钟。

(3)将蛋白芯片冻干处理，2—8℃贮存。为了长期保持蛋白活性，我们采用冻干的方法来增加产品稳定性。

以下浓度单位除非特指均为W/V。

其中S2蛋白、S3蛋白、S4蛋白、N蛋白、3CL蛋白、IgG蛋白的稀释液为50mM的CBS溶液或S1蛋白的稀释液为20mMTris.HCL+50mM NaCl+1mM EDTA或M蛋白的稀释液为10mMNaAc

其中所述的封闭液配方为：70—95％CBS+5—15％小牛血清+1—9％蔗糖。

2.反应液的制备

采用常规的过碘酸钠法对羊抗人IgG进行辣根过氧化物酶标记，标记率不小于30％，浓度为1—100mg/10ml。

3.浓缩缩洗涤液的制备

0—5％NaCl、0—2％KCl、0—5％Tris和0—1％Tween，PH为7.0—7.8。

实施例3  用于检测SARS抗体的蛋白芯片的制备

将SARS的S1蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、S2蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、S3蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml、S4蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml、M蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、N蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml、3CL蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml，标准IgG蛋白用稀释液稀释到15.6ug/ml，E蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml，SARS的RNA聚合酶蛋白用稀释液稀释到0.1mg/ml，Gst蛋白用稀释液稀释到0.05mg/ml；

其它步骤同实施例2

实施例4  用试剂盒对SARS病人血清进行检测

1.缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍。

2.血清用洗涤液按1：50稀释，吸取200μl加入反应孔内。

3.37℃温育振荡30分钟。弃去孔内的液体。

4.孔内加满稀释后的洗涤液，温育振荡5分钟，弃去洗涤液。共洗涤3次。

5.每反应孔内中加入200μl反应液。

6.同步骤3。

7.同步骤4。

8.在每个反应孔内加入150μl已混合15分钟的检测液A和B混合液，静置60秒。

用HD—2001系列生物芯片检测仪读取数据并进行数据分析。结果如图1所示。

将相同指标两点光强值取平均值，与标准IgG蛋白光强值进行比较，如超过参考值则判定该指标为阳性。

Claims (3)

1、多指标并行检测SARS病毒抗体的试剂盒包括蛋白芯片、反应液、检测液和洗涤液，其特征在于在蛋白芯片固相基质上固定有SARS相关的四种或四种以上蛋白，所述蛋白为：S蛋白、N蛋白、M蛋白、E蛋白、蛋白酶3CL或RNA聚合酶；点样密度在10200点/cm²，点样量为0.1—10ng/点。

2、根据权利要求1所述的多指标并行检测SARS病毒抗体的试剂盒，其特征在于其中所述的反应液为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，浓度为1—100mg/10ml。

3、根据权利要求1所述的多指标并行检测SARS病毒抗体的试剂盒，其特征在于其中所述的洗涤液至少包括下述一种成份：：0—5％NaCl、0—2％KCl、0—5％Tris或0—1％Tween，PH为7.0—7.8。

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