WO2000051629A1

WO2000051629A1 - Preparations stabilisees a longue conservation

Info

Publication number: WO2000051629A1
Application number: PCT/JP2000/001160
Authority: WO
Inventors: Yasushi Sato
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-02-29
Publication date: 2000-09-08
Also published as: ATE326233T1; DE60028037T2; TWI232749B; EP1197221B1; CA2381229C; AU2695400A; HK1098963A1; KR20050099637A; PT1197221E; EP1700605A3; KR20010102469A; CN101537173A; KR100731559B1; CN1879875A; CA2381229A1; AU772604B2; HK1046239B; US6908610B1; HK1045652A1; EP1700605A2

Description

長期安定化製剤技術分野

本発明は G— CSF (顆粒球コロニー刺激因子）製剤に関し、特に長期保存した後も活性成分の損失が少なく、かつ G— CS Fのメチォニン残基の酸化体生成率の低い、安定化させた G— CS F製剤に関する。

背景技術

G— CSFは、好中球の前駆細胞に作用し、その増殖ならびに分化成熟を促進する分子量約 2万の糖夕ンパク質である。

本出願人によって、口腔底癌患者の腫瘍細胞から採取した細胞株を培養することにより高純度のヒト G— CS Fが精製されて以来、これを契機に、ヒト G— C S F遺伝子のクローニングに成功し、現在では遺伝子工学的方法によって微生物や動物細胞で糸且換えヒト G— C S Fを大量に生産することが可能になった。また、本願出願人はこの精製した G— CSFの製剤化に成功し、これを感染防御剤として市場に製品を供給している（特許第 21 16515号）。

G—C S Fは極めて微量で使用され、通常成人一人当たり、 0. 1〜1000 U g (好ましくは 5〜500 g) の G— CS Fを含有する製剤を 1〜7回/週の割合で投与する。しかしながら、この G— C S Fは例えば注射用アンプル、注射器等の器壁に対し吸着性を示す。また、 G— CSFは不安定で、外的因子の影響を受けやすく、温度、湿度、酸素、紫外線等に起因して会合、重合あるいは酸化等の物理的、化学的変化を生じ、結果として大きな活性の低下を招く。

そこで安定な G— C S F製剤を市場に供給するために種々の処方設計がなされている。例えば、（a) トレオニン、トリブトファン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニン、システィン、シスチン、メチォニンから選ばれる少なくとも 1種のアミノ酸；（b) 少なくとも 1種の含硫還元剤；又は（c) 少なくとも 1種の酸化防止剤；からなる群から選ばれる少なくとも 1種を含む製剤 (特許第 2577744号）等が提案されている。また、安定化剤としてポリソルベートなどの界面活性剤を含む G— CS F製剤がある（特開昭 63 - 1468 また、容器への付着を少なくし、化学的変化を押さえるという観点からは、凍結乾燥製剤とすることが有利であり、マルトース、ラフイノ一ス、スクロース、トレハロース又はアミノ糖を含有した G—C S F凍結乾燥製剤も報告されている (特表平 8— 5 0 4 7 8 4号）。

現在市場に供給されている製品には、これら化学的、物理的変化を抑制するために、安定化剤として一般的に使用されているヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質が添加されているものがある。しかしながら、タンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウィルスのコンタミを除去する等のために非常に煩雑な工程を必要とする等の問題があった。

しかしなが'ら、このようなタンパク質を添加しない場合には、 G— C S Fのメチォニン残基の酸化体の生成が多くなり、品質劣化をもたらすというという問題があった。

発明の開示

本発明の目的は、長期の保存にもより安定で、かつ G— C S Fのメチォニン残基の酸化体生成率の低い G— C S F製剤を提供することである。

上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは安定化剤として特定ァミノ酸を組み合わせて添加することによって、長期保存後でも G— C S F残存率が高く、かつ G— C S Fのメチォニン残基の酸化体生成率の低い G— C S F 製剤となしうることを見いだし本発明を完成した。

すなわち、本発明は、 2 5で— 3ヶ月長期保存試験後における G— C S F残存率が 9 0 %以上であるか、 4 0で— 2ヶ月長期保存試験後における G— C S F残存率が 9 0 %以上であるか、 5 0 °C— 1ヶ月間の加速試験後における G— C S F 残存率が 9 0 %以上であるか、 6 0で— 2週間の加速試験後における G— C S F 残存率が 9 0 %以上であり、かつ 5 0 °C— 1ヶ月間の加速試験後又は 6 0 °C— 2 週間の加速試験後における G— C S Fのメチォニン残基酸化体生成率が 1 %以下である、安定な G— C S F製剤を提供する。

本発明はさらに、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、トレォニン、ァスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸

2 と、疎水性アミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチォニンを含む前記の G— CS F製剤を提供する。

本発明はさらに、疎水性アミノ酸がフエ二ルァラニン、トリブトファン及び口イシンから選択される前記の G— CS F製剤を提供する。

本発明はさらに、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、フエ二ルァラニン、トリプトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチォニンを含む前記の G— C S F製剤を提供する。

本発明はさらに、フエ二ルァラニン、アルギニン及びメチォニンを含む前記の G— CS F製剤を提供する。

本発明はさらに、安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない前記の G— CSF製剤を提供する。

本発明はさらに、凍結乾燥製剤である前記の G— C S F製剤を提供する。

本発明はさらに、マンニトールをさらに含む前記の G— C S F製剤を提供する。本発明はさらに、界面活性剤をさらに含む前記の G— CSF製剤を提供する。本発明はさらに、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビ夕ンアルキルエステルである前記の G— CS F製剤を提供する。

本発明はさらに、界面活性剤がポリソルベート 20及び/又は 80である前記の G— CSF製剤を提供する。

本発明はさらに、 pHが 5〜7である前記の G— CSF製剤を提供する。

本発明はさらに、 pHが 5. 5〜6. 8である前記の G— CS F製剤を提供する。

本発明はさらに、 pHが 6. 5である前記の G— CS F製剤を提供する。

本発明はさらに、 G— CS Fが CHO細胞から産生された G— CSFである前記の G— C S F製剤を提供する。

本発明はさらに、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グル夕ミン酸、トレォニン、ァスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性アミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸を含み、 pHが 5〜7であることを特徴とする、 25 :— 3ヶ月長期保存試験後における G— CSF残存率が 90%以上であるか、 40°C— 2ヶ月長期保存試験後における G— CS F残存率が 90 %以上であるか、 50°C- 1ヶ月間の加速試験後における G— C S F残存率が 90 %以上であるか、 60°C— 2週間の加速試験後における G— C S F残存率が 90%以上である、安定な G— CS F製剤を提供する。

本発明はさらに、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、ダル夕ミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、フエ二ルァラニン、トリプトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸を含み、 p Hが 5〜 7であることを特徴とする、 25 °C— 3ヶ月長期保存試験後における G 一 CSF残存率が 90%以上であるか、 40°C— 2ヶ月長期保存試験後における G— CS F残存率が 90 %以上であるか、 50°C— 1ヶ月間の加速試験後における G— CS F残存率が 90%以上である力 60°C— 2週間の加速試験後における G— CS F残存率が 90%以上である、安定な G— CS F製剤を提供する。本発明はさらに、 pHが 6. 5である前記いずれかの G— CS F製剤を提供する。

本発明はさらに、メチォニンを、メチォニン残基を有する生理活性タンパク質含有組成物に添加することを特徴とする、該タンパク質のメチォニン残基酸化体生成の抑制方法を提供する。

本発明はさらに、生理活性タンパク質が、サイト力インまたは生理活性べプチドである前記の方法を提供する。

本発明はさらに、生理活性タンパク質が、コロニー刺激因子または PTHである前記の方法を提供する。

本発明はさらに、生理活性タンパク質が、 G— CS F、エリスロポエチンまたは P THである前記の方法を提供する。

本発明はさらに、安定化剤として他の夕ンパク質を含まないことを特徴とする前記の方法を提供する。

本発明はさらに、メチォニン残基を有する生理活性タンパク質含有組成物が、凍結乾燥されているかまたは溶液状態であることを特徴とする前記の方法を提供する。

本発明はさらに、メチォニンと他の一種以上のアミノ酸を含む、メチォニン残基を有する生理活性タンパク質含有安定化組成物を提供する。

本発明はさらに、アミノ酸が、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、フエ二ルァラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、ノリン、ァラニン、プロリン、グリシン、セリン、卜レオニン、ァスパラギン、グルタミン及びチロシンから成る群より選ばれる 1種または 2種以上である、前記メチォニン残基を有する生理活性タンパク質含有安定化組成物を提供する。

本発明はさらに、安定化剤として他のタンパク質を含まないことを特徴とする前記メチォニン残基を有する生理活性タンパク質含有安定化組成物を提供する。図面の簡単な説明

図 1は、試料 34及び 36を、 60°C— 2週間加速試験を行った後に、後述する方法 2に記載する方法で実施したクロマトグラムを示す。

図 2は、試料 34〜 36を、調製直後及び 50 °C— 1ヶ月加速試験を行つた後に後述する方法 2で実施したクロマトグラムを示す。

図 3は、パラサイドホルモン溶液製剤を、実施例 6で示す方法（50°C— 3日間保存）で実施した、メチォニンの添加によるメチォニン残基酸化抑制作用を示した HPLCクロマトグラムである。なお、図 3中、中央の最も大きいピークが PTH未変化体であり、 Me t— 8ピーク、 Me t— 18ピークがそれぞれ、 8 番目のメチォニン残基が酸化された PTH， 18番目のメチォニン残基が酸化された PTHである。

発明を実施するための最良の形態

本発明の製剤に使用する G— C S Fは高純度に精製されたヒト G— CSFであれば全て使用できる。具体的には、哺乳動物、特にヒトの G— CSFと実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法によって得られたものを含む。遺伝子組換え法によって得られる G— CSFには天然の G— CS Fとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の 1または複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。本発明における G— CSFは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；ィースト菌；チヤィニーズハムスター卵巣（CHO) 細胞、 C 1 27細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、ィ一スト菌又は CHO細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくは CHO細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。

本発明の G— C S F製剤には好ましくは安定化剤としてヒト血清アルブミンや精製ゼラチンなどのタンパク質を実質的に含まない。

本発明の G— C S F製剤は、 25 °C— 3ヶ月長期保存試験後における G— C S F残存率が 90 %以上、好ましくは 95 %以上であるか、 40°C— 2ヶ月長期保存試験後における G— CS F残存率が 90 %以上、好ましくは 95%以上である、 50°C— 1ヶ月間の加速試験後における G— CS F残存率が 90%以上、好ましくは 95 %以上であるか、 60°C— 2週間の加速試験後における G— CS F 残存率が 90%以上、好ましくは 95 %以上であり、かつ 50°C— 1ヶ月間の加速試験後又は 60 — 2週間の加速試験後における G— CSFのメチォニン残基酸化体生成率が 1 %以下、好ましくは検出限界以下であり、従来知られている G -CS F製剤に比べて極めて安定な製剤である。

本発明の G— C S F製剤の一例は、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、ァスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、好ましくはリジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性ァミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸、好ましくはフエ二ルァラニン、トリプトフアン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチォニンを含む G— C S F製剤である。

さらに、本発明の G— C S F製剤の一例としては、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、ァスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、好ましくはリジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性アミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸、好ましくはフエ二ルァラニン、トリブトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチォニンを含み、 pHが 5〜7であることを特徴とする、 25°C— 3ヶ月長期保存試験後における G— CSF残存率が 90%以上であるか、 40°C— 2ヶ月長期保存試験後における G— CS F残存率が 90 %以上であるか、 50°C- 1ヶ月間の加速試験後における G— C S F残存率が 90 %以上であるか、 60°C— 2週間の加速試験後における G— C S F残存率が 90%以上であり、かつ 50°C— 1 ヶ月間の加速試験後又は 60°C— 2週間の加速試験後における G— CS Fのメチォニン残基酸化体生成率が 1 %以下である、安定な G— C S F製剤である。

本発明で用いるアミノ酸は、遊離のアミノ酸ならびにそのナトリウム塩、カリゥム塩、塩酸塩などの塩を含む。本発明の製剤には、これらのアミノ酸の D—、 L—および D L一体を含み、より好ましいのは L一体ならびにその塩である。本発明の製剤に添加するアミノ酸の添加量は使用するアミノ酸の種類により、後述する試験方法を用いて好ましい範囲を定めることができる。一般には最終投与量として、 0. 001〜5 Omg/m 1である。例えば、フエ二ルァラニンでは好ましくは 0. 1〜25mg/m 1、さらに好ましくは 1〜2 OmgZm 1であり、アルギニンでは好ましくは 0. l〜25mgZml、さらに好ましくは 1 〜20mg/mlであり、メチォニンでは好ましくは 0. 001〜5mgZm l、さらに好ましくは 0. 0 l〜4mgZm Iである。

本発明の製剤には等張化剤として、ポリエチレングリコール；デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラク 1 ^一ス、ラクト一ス、キシロース、マンノース、マルトース、シュ一クロース、ラフイノースなどの糖類を用いることができる。マンニトールが特に好ましい。マンニトールの添加量は製剤中に 1〜 10 OmgZm 1、さらに好ましくは 5〜6 Omg m 1である。

本発明の製剤には界面活性剤をさらに含むことができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビ夕ンモノカプリレート、ソルビ夕ンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテ一ト等のソルビ夕ン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセりン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビ夕ンモノラウレート、ポリオキシエチレン

ントリオレエ一ト、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビッ卜テトラオレエー卜等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリォキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレー卜等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシェチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシェチレンポリォキシプロピレングリコールエーテル、ポリォキシェチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリォキシェチレンポリォキシプロピレンアルキルェ一テル；ポリオキシェチェレンノニルフエニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリォキシェチレン水素ヒマシ油）等のポリォキシェチレン硬化ヒマシ油；ポリォキシェチレンソルビットミッロゥ等のポリォキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリォキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等の H L B 6〜 1 8を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ォレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数 1 0〜 1 8のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンォキシドの平均付加モル数が 2〜 4でアルキル基の炭素原子数が 1 0〜 1 8であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリゥム等の、アルキル基の炭素原子数が 8〜 1 8のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセ口リン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数 1 2〜 1 8 の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わせて添加することができる。

好ましい界面活性剤はポリォキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステルであり、特に好ましいのはポリソルべ一ト 20、 21、 40、 60、 65、 80、 81、 85であり、最も好ましいのはポリソルべ一卜 20及び 80である。

本発明の G— C S F含有製剤に添加する界面活性剤の添加量は、一般には G— C S F 1重量部に対して 0. 0001〜10重量部であり、好ましくは G— CS F 1重量部に対して 0. 01〜5重量部であり、最も好ましくは G— CS F 1重量部に対して 0. 2〜 2重量部である。

本発明の G— CS F製剤の pHは好ましくは 5〜7であり、さらに好ましくは pHが 5. 5〜6. 8であり、さらに好ましくは pHが 6〜6. 7であり、最も好ましくは pHが 6. 5である。

本発明の G— CSF製剤には、所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、賦形剤、 pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。例えば、含硫還元剤としては、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセチルホモシスティン、チォクト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリセ口ール、チォソルビトール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、グル夕チオン、並びに炭素原子数 1〜 7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。また、酸化防止剤としては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシァニソール、ひ—トコフエロール、酢酸トコフエロール、 L—ァスコルビン酸及びその塩、 L—ァスコルビン酸パルミテート、 L—ァスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（EDTA) 、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩ィ匕カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クェン酸ナトリウム、クェン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてよい。

本発明の G— CSF製剤は溶液製剤、凍結乾燥製剤、噴霧乾燥製剤などを含む。最も好ましくは凍結乾燥製剤である。

本発明の製剤は、これらの成分をリン酸緩衝液（好ましくはリン酸一水素ナトリウム―リン酸ニ水素ナトリゥム系）及び又はクェン酸緩衝液（好ましくはクェン酸ナトリゥムの緩衝液）などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製し、あるいはこのようにして調製された溶液製剤を定法により凍結乾燥、又は噴霧乾燥することによつて製造できる。

本発明の安定化された G— C S F含有製剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与される力経口投与も可能である。

本発明の G— CSF製剤は、通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器中に収納されており、使用時に純水（注射用滅菌水）に溶解して使用する。本発明の製剤中に含まれる G— CS Fの量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般には最終投与濃度で 1〜 1 000 g /m 1、好ましくは 10〜800 g /m 1、さらに好ましくは 50 ~500 gZm 1である。

本発明の製剤は、感染症や癌の化学治療において、抗生物質、抗菌剤、抗癌剤などの薬剤を投与する際に同時投与すると、患者の抵抗力、活性などといった免疫応答力に基づいた防御機能を改善することが判明しており、臨床上極めて有用である。従って、本発明の製剤はこれらの薬剤と併用投与することができる。本発明の G— CSF製剤は後述の実施例に示すように、 25°C— 3ヶ月長期保存試験又は 40で— 2ヶ月長期保存試験を行った後にも、あるいは 50°C— 1ケ月間の加速試験又は 60°C— 2週間の加速試験を行った後にも、極めて良好な G 一 CSF残存率を示す。また、 50°C— 1ヶ月間の加速試験後又は 60で一 2週間の加速試験を行った後にも、 G— CS Fのメチォニン残基酸化体生成率がほとんど観察されなかった。本発明の G— CSF製剤は 2 5°C— 3ヶ月長期保存試験後における G— CSF残存率が 90%以上、好ましくは 95%以上であるか、 4 0で— 2ヶ月長期保存試験後における G— C S F残存率が 90 %以上、好ましぐは 95%以上であるか、 50°C— 1ヶ月間の加速試験後における G— CSF残存率が 90 %以上、好ましくは 95 %以上である力、 60°C— 2週間の加速試験後における G— C S F残存率が 9 0 %以上、好ましくは 9 5 %以上であり、かつ 5 0 °C— 1ヶ月間の加速試験後又は 6 0 °C— 2週間の加速試験後における G— C S Fのメチォ二ン残基酸化体生成率が 1 %以下、好ましくは検出限界以下である。本発明の製剤では、後述する実施例の結果から、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、トレォニン、ァスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性アミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸を添加することにより特に常温における長期保存後の G _ C S F残存率を増加することができ、またメチォニンを添加することにより、 G— C S Fのメチォニン残基酸化体生成率を検出限界以下にすることが観察された。本発明者らは、特定の理論に拘束されるつもりはないが、 G _ C S Fのメチォニン残基に代えて、添加されたメチォニンが酸化されることにより、 G— C S Fのメチォニン残基酸化体生成率を低くすると推測した。

さらに本発明によれば、特に、メチォニン残基の酸化体生成に、より影響を受けやすく、微量で生理活性を有する、メチォニン残基を有する生理活性タンパク質の組成物にメチォニンを添加することにより、該生理活性タンパク質のメチォニン残基の酸化体生成を防止することができる。特に、該生理活性タンパク質組成物中に、安定化剤として他のタンパク質を含まない場合、タンパク質組成物が凍結乾燥されている場合、あるいはタンパク質組成物が溶液状態の場合には、夕ンパク質のメチォニン残基酸化体が生成しやすいことから、メチォニンの添加は有効であると考える。

さらに本発明の組成物に、その他の一種以上のアミノ酸を添加することにより、メチォニン残基の酸化体生成を抑制し、且つ、生理活性タンパク質の分解、凝集等を抑えた、安定化された、メチォニン残基を有する生理活性タンパク質含有組成物を製造することができる。

このとき添加するアミノ酸としては、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、フエ二ルァラニン、トリブトファン、ロイシン、ィソロイシン、ノリン、ァラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、ァスパラギン、グルタミン、チロシン等が挙げられ、好ましくは、ヒスチジン、ァルギニン、フエ二ルァラニンである。本発明の生理活性タンパク質としては、例えば、

サイト力イン；インターロイキン（ I L一 1〜 I L— 13など）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子（G— CSF) 、マクロファージコロニー刺激因子（M— C S F)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM— C S F)、エリスロポエチン（EPO) 等）、インタ一フエロン（I FN—ひ、 β、了等) 、腫瘍壊死因子（TNF— α、 TNF— |3等）、 Transforming growth factor (T )、 platelet-derived growth iactor ( P D G Fノ、 L· I l· (leukemia inhibitory factor) 、 oncostation M (〇SM) 、 migration inhibitory factor (M I F) 、ケモカイン、 I L— 8、 LD78、 MCP— 1など、

生理活性ペプチド；インシュリン、グルカゴン、パラサイロイドホルモン（PT H) 、ガストリン、セレクチン、コレシストキニン、ガシ卜リック ·インヒビトリー、ポリペプチド、サブスタンス P、モチリン、脾ポリペプチド、ニューロテンシン、ェンテログルカゴン、ガストリン放出ペプチド、ソマトス夕チン一 28、ダイノルフィン、ガラニン、バロニン、パンクレオスタチン、ゼォプシンなど生体酵素；メチォニン残基が活性中心に存在する酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等）など、

または、それらの変異体が挙げられる。

本発明の生理活性タンパク質としては、好ましくは、サイト力インまたは生理活性ペプチドであり、より好ましくは、 G— CSF、エリスロポエチン等のコロ二一刺激因子または PTHを示し、さらに好ましくは、 G— CSF、エリスロボェチンまたは P THを示す。

本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。

実施例

試験方法

バイアルあたりの各原料の添加量が下記の表 1及び表 2となるように各調剤液を調製し、無菌濾過を行った後、無菌的に各バイアルに ImLずつ正確に充填し、凍結乾燥に供した。凍結乾燥終了後、完全打栓し、 G— CSF凍結乾燥製剤を製造した'

【表 1】表 1

【表 2】

G-CSF Phe Axg Met Mannitol Polysorbate20 pH緩衝剤試料.34 lOmg lOmg Omg 25mg O.lmg リン酸緩衝剤にて pH6.5 試料.35 10011 g lOmg O.lmg 25mK O. lmg リン酸緩衝剤にて pH6.5 試料.36 IOO u g lOmg lOmg 1ms 25ms O.lmg リン酸緩衝剤にて pH6.5 このように無菌的に調製した G—CSF含有凍結乾燥製剤を、 60°Cの恒温槽内で 2週間及び 1ヶ月； 50 の恒温槽内で 1ヶ月、 2ヶ月、 3ヶ月； 40 の恒温槽内で 2ヶ月、 4ヶ月、 6ヶ月；並びに 25 °Cの恒温槽内で 3ヶ月、 6ヶ月静置した。

加速品製剤、及び未加速品製剤は、 lmLの純水で正確に溶解し、下記の方法の試験試料とした。

バイアル中の G— CSF含有量（残存率）を下記の方法 1に基づき測定した。また、バイアル中の G— CS Fメチォニン残基酸化体生成率を下記の方法 2に基づき測定した。

方法 1

試料は、 C 4逆相カラム（4. 6mmx 250 mm, 300オングストロ一ム）を用い、純水、ァセトニトリル、トリフルォロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法により G— CSF含量を測定した。 G— CSFとして 5 fi g相当量を注入し、ァセトニトリルのグラジェントにより G— C S Fを溶出させ、 215 nmの波長で分光学的に検出した。

本方法で測定した G— CSF含量を用い、下記の式に基づき、 60°C— 2週間、及び 5 O - 1ヶ月間加速後及び 60°Cで 2週間及び 1ヶ月； 50°Cで 1ヶ月、 2ヶ月、 3ヶ月； 40 °Cで 2ヶ月、 4ヶ月、 6ヶ月；並びに 25°Cで 3ヶ月、 6 ヶ月保存したときの G— CSF残存率を残存率（％) を算出した。

【式 1】

(所定期間の加速後の G— C S F含量）

残存率（％) = X 100

(未加速品の G— C S F含量）方法 2

試料は、 C 4逆相カラム（4. 6mmx 250 mm, 300オングストローム）を用い、純水、ァセトニトリル、トリフルォロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法により G—C S F未変化体及び、 G— CSF Me t 残基酸化体を測定した。ァセトニトリルのグラジェントにより G— CS Fを溶出させ、 215 nmの波長で分光学的に検出した。

本方法で測定した G— C S F未変化体及び G -CS F Me t残基酸化体にピ —ク面積を用い、下記の式に基づき、 60°C— 2週間、及び 50°C— 1ヶ月間加速後の G— CSF Me t残基酸化体生成率（％) を算出した。

【式 2】

G-CSF Met残基酸化体生成率（％) =

(G-CSF Met残基酸化体）

X 100

(G-CSF未変化体） + (未加速品の G-CSF含量）実施例 1 ：各種 PHの G— CS F残存率に及ぼす効果

表 1に記載の各種 pHで調製した試料 1及び試料 2を、 60°C— 2週、及び 5 0 C— 1ヶ月間加速試験を行つた後の G— C S F残存率を方法 1に記載の式により算出した。得られた結果を表 3に示す。

【表 3】

pH 7. 4処方に比べて、 pH6. 5において、同等あるいはそれ以上の安定性を示した。実施例 2 ：各種アミノ酸の G— CSF残存率に及ぼす効果（1)

表 1に記載の各種ァミノ酸を添加して調製した試料 3〜6 (G— CSF含量 1 00 g) 、並びに試料 7〜10 (G— CS F含量 250 g) を、 60°C— 2 週間、及び 50°C— 1ヶ月間加速試験を行った後の G— CS F残存率を方法 1に記載の式により算出した。得られた結果を表 4及び表 5に示す。【表 4】

100

【表 5】

いずれの G— CSF含量においても、アミノ酸無添加処方に比べて、フエニルァラニンを単独添加、あるいはアルギニンを単独添加した製剤では安定性が向上しているが、十分ではない。フエ二ルァラニンとアルギニンを併用することで安定性の顕著な向上が認められた。実施例 3 ：各種アミノ酸の G— CSF残存率に及ぼす効果（2)

表 1に記載の各種アミノ酸を添加して調製した試料 1 1〜20 (アミノ酸 1としてフエ二ルァラニンを、アミノ酸 2としてリジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレォニン、チロシン、ァスパラギン及びグルタミンのいずれかを添加）、並びに試料 21〜33 (アミノ酸 1としてアルギニンを、アミノ酸 2としてァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチォニン、トリプトファン、フエ二ルァラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレォニン、ァスパラギン及びグルタミンのいずれかを添加）を、 60°C— 2週間、及び 50 — 1ヶ月間加速試験を行った後の G— CS F残存率を方法 1に記載の式により算出した。得られた結果を表 6及び表 7に示す。【表 6】

【表 7】

フエ二ルァラニンとリジン、フエ二ルァラニンとヒスチジン、フエ二ルァラ二ンとアルギニン、フエ二ルァラニンとァスパラギン酸、フエ二ルァラニンとダル夕ミン酸、フエ二ルァラニンとトレオニン、フエ二ルァラニンとァスパラギンの組み合わせ、並びにアルギニンとロイシン、アルギニンとトリプトファン、アルギニンとフエ二ルァラニンの組み合わせにおいてそれぞれ顕著な長期保存安定性が観察された。実施例 4 ：長期保存試験

フエ二ルァラニン 10mg、アルギニン 10mg、メチォニン Imgを含み、 G— C S F含量が 100 ^ g及び 250 gの試料について、 60°Cで 2週間及び 1ヶ月； 50でで 1ヶ月、 2ヶ月、 3ヶ月； 40 °Cで 2ヶ月、 4ヶ月、 6ヶ月；並びに 25 で 3ヶ月、 6ヶ月保存したときの G— CSF残存率を方法 1に記載の式により算出した。得られた結果を表 8に示す。【表 8】

1: week

2: month

いずれも優れた G— C S F残存率を示した。実施例 5 ：ァミノ酸添加の G— C S F Me t残基酸化体生成率に及ぼす効果表 2に記載の各量のメチォニンを添加して調製した試料 34〜 36 (フエニルァラニンとアルギニンの量は一定でメチォニン添加量がそれぞれ Omg, 0. 1 mg、 lmg) を、 60で— 2週間加速試験を行った後に上記方法 2で実施したクロマトグラムの 1例を図 1に、調製直後及び 50°C— 1ヶ月加速試験を行った後に上記方法 2で実施したクロマトグラムの 1例を図 2に示す。

メチォニン無添加試料（試料 34 ) では調製直後並びに 50 °C— 1ヶ月保存後のいずれにおいても G - C S F Me t残基酸化体の生成が観察されたが、 0. lmg以上のメチォニンの添加により、長期保存後にも G-CSF Met残基酸化体の生成を完全に抑制することができた。

また、 G— CSF Me t残基酸化体生成率を方法 2に記載の式により算出した結果を表 9に示す。

【表 9】

N.D.：検出限界以下

このように、 0. lmg以上のメチォニンの添加により、 G-CSFMet残基酸化体の生成を完全に抑制することができた。実施例 6 ：パラサイロイドホルモン溶液製剤へのメチォニン添加による、メチォニン残基酸化抑制作用

1〜84残基を有するパラサイロイドホルモン（以下 PTHと略記）（W〇9 0 1 44 1 5に記載の方法で製造）を 2 0 0 gZmLを含み、バイアル当たりの各原料の添加量が下記の表 1 0になるよう、試料 3 7〜試料 3 9の各調剤液を調整し、無菌濾過を行った後、無菌的に各バイアルに lmLずつ正確に充填し、完全打栓し、 PTH溶液製剤を製造した。

【表 1 0 】

このように無菌的に調整した PTH含有溶液製剤を、 50°Cの恒温槽内に 3日間、静置した。

試料は、 C 1 8逆相カラム（4. 6mmx 2 5 0 mm, 3 0 0オングスト口一ム）を用い、純水、ァセトニトリル、トリフルォロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法により PTH含量を測定した。 PTHとして、 1 0 UL g相当量を注入し、ァセトニトリルのグラジェントにより PTHを溶出させ、 2 1 5 nmの波長で分光学的に検出した。

本試験系では、 PTH未変化体の直前に、図 3に示したとおり、 8番目のメチォニン残基が酸化された PTH， 1 8番目のメチォニン残基が酸化された PTH が検出される。このクロマトグラムに示すとおり、 PTH中の 8番目のメチォ二ン残基における酸化、および、 PTH中の 1 8番目のメチォニン残基における酸化が、製剤中へのメチォニンの添加に伴い抑制可能であることが示されている。さらに、製剤中へのメチォニンの添加は、メチォニン残基以外の化学分解反応には影響を及ぼしてはいないこともわかる。すなわち、製剤中へのメチォニン添加により、他の化学分解反応には影響を与えず、タンパク質中のメチォニン残基酸化体生成抑制のみを特異的に改善することが可能であることを示している。産業上の利用分野

本発明の G -CSF製剤は、長期保存後においても G— C S Fの残存率が極めて高く、また G— CSFのメチォニン残基酸化体生成率をほぼ完全に抑制することのできる安定な製剤である。

Claims

請求の範囲

I. 25 °C— 3ヶ月長期保存試験後における G— CSF残存率が 90 %以上であるか、 40°C— 2ヶ月長期保存試験後における G— C S F残存率が 90 %以上である力、 50°C— 1ヶ月間の加速試験後における G— CSF残存率が 90%以上であるか、 60°C— 2週間の加速試験後における G— C S F残存率が 90 %以上であり、かつ 50 — 1ヶ月間の加速試験後又は 60 °C— 2週間の加速試験後における G— CS Fのメチォニン残基酸化体生成率が 1 %以下である、安定な G— CS F製剤。

2. リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、ァスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性アミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチォニンを含む請求項 1記載の G — CSF製剤。

3. 疎水性アミノ酸がフエ二ルァラニン、トリブトファン及びロイシンから選択される請求項 2記載の G— C S F製剤。

4. リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、フエ二ルァラニン、トリブトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチォニンを含む請求項 1記載の G— CS F製剤。

5. フエ二ルァラニン、アルギニン及びメチォニンを含む請求項 1記載の G— C S F製剤。

6. 安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない請求項 1〜 5のいずれかに記載の G— CSF製剤。

7. 凍結乾燥製剤である請求項 1〜 6のいずれかに記載の G— C S F製剤。

8. マンニトールをさらに含む請求項 1〜7のいずれかに記載の G—CS F製剤。 9. 界面活性剤をさらに含む請求項 1〜 8のいずれかに記載の G— C S F製剤。 10. 界面活性剤がポリオキシエチレンソルビ夕ンアルキルエステルである請求項 9記載の G— CSF製剤。

I I . 界面活性剤がポリソルベート 20及び/又は 80である請求項 10記載の G— CSF製剤。

12. pHが 5〜7である請求項 1〜 1 1のいずれかに記載の G— C S F製剤。

13. pHが 5. 5〜6. 8である請求項 12記載の G— C S F製剤。

14. pHが 6. 5である請求項 13記載の G_C S F製剤。

δ 15. G— CSFが CH〇細胞から産生された G—CSFである請求項 1〜14 のいずれかに記載の G— C S F製剤。

16. リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、トレォニン、ァスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性ァミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸を含み、 P Hが 5〜 7であることを特徴0 とする、 25°C— 3ヶ月長期保存試験後における G— CSF残存率が 90%以上であるか、 4 Ot:— 2ヶ月長期保存試験後における G - CSF残存率が 90%以上であるか、 50で— 1ヶ月間の加速試験後における G— CS F残存率が 90 % 以上であるか、 60 — 2週間の加速試験後における G— C S F残存率が 90 % 以上である、安定な G— CSF製剤。

5 17. リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、フエ二ルァラニン、トリブトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸を含み、 p Hが 5〜 7であることを特徴とする、 25 °C— 3ヶ月長期保存試験後における G— C S F残存率が 90%以上であるか、 40°C— 2ヶ月長期保存試験後における G—CSF残0 存率が 90 %以上であるか、 50°C— 1ヶ月間の加速試験後における G— CS F 残存率が 90%以上であるか、 60°C— 2週間の加速試験後における G— CSF 残存率が 90%以上である、安定な G— CSF製剤。

18. pHが 6. 5である請求項 15又は 16記載の G— CS F製剤。

19. 実質的にメテオニン酸化体を生成しない、 G— CSF安定化製剤。

5 20. メチォニンと他の一種以上のアミノ酸を含み、実質的にメチォニン酸化体を生成しない、 G— CSF安定化製剤。

21. 安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない請求項 19又は 20記載の G— CSF安定化製剤。

22. メチォニンを、メチォニン残基を有する生理活性タンパク質含有組成物に添加することを特徴とする、該タンパク質のメチォニン残基酸化体生成の抑制方法。

23. 生理活性タンパク質が、サイト力インまたは生理活性ペプチドである請求項 22記載の方法。

24. 生理活性タンパク質が、コロニー刺激因子または PTHである請求項 22 記載の方法。

25. 生理活性タンパク質が、 G_CS F、エリスロポエチンまたは PTHである請求項 22記載の方法。

26. 安定化剤として他のタンパク質を含まないことを特徴とする請求項 22〜 25のいずれかに記載の方法。

27. メチォニン残基を有する生理活性タンパク質含有組成物が、凍結乾燥されているかまたは溶液状態であることを特徵とする請求項 22〜26のいずれかに記載の方法。

28. メチォニンと他の一種以上のアミノ酸を含む、メチォニン残基を有する生理活性タンパク質含有安定化組成物。

29. アミノ酸が、リジン、ヒスチジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グル夕ミン酸、フエ二ルァラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、ノリン、ァラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレォニン、ァスパラギン、ダルタミン及びチロシンから成る群より選ばれる 1種または 2種以上である請求項 28記載の組成物。

30. 安定化剤として他のタンパク質を含まないことを特徴とする請求項 28または 29記載の組成物。