CN104524553B - 一种长效促排卵注射液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种长效促排卵注射液，该长效促排卵注射液包含卵泡刺激素融合蛋白及医学上可接受的载体；其中卵泡刺激素融合蛋白的含量为10-600μg/mL。本发明的长效促排卵注射液具有明显的超排作用。
Description
技术领域
本发明涉及动物生殖领域，尤其涉及一种长效促排卵注射液。
背景技术
目前，畜牧业已逐步成为我国相对独立的产业和农村经济的支柱产业。在畜牧业发展中乳业和肉业发展较为迅速，肉和奶也正在成为我国城市居民每天消费的生活必需品。但是，目前乳业和肉业的发展规模和水平远不能满足人民生活水平以及现代农业发展的需要。借助胚胎生物技术能充分挖掘优良母畜的繁殖潜力，快速实现短期快速扩繁良种群。其中，超数排卵是发挥这种扩繁作用的重要技术环节。
超排激素是影响超排效果的主要因素之一。通常使用的超数排卵药物有促卵泡素(FSH)、孕马血清促性腺激素(PMSG)。应用FSH多次超排(FSH作用效果稳定)处理后卵巢机能恢复较快，排卵数较高。但FSH半衰期短，需分四天注射8次，比较麻烦而且费用高，在注射剂量和时间上易引起误差。用PMSG进行超数排卵，只需肌肉注射一次，对供体刺激小，费用低廉，使用方便。在发情期第13d注射PMSG，能得到一定数量的卵母细胞，但PMSG半衰期较长，常使未排卵的大卵泡残留于卵巢而分泌雌激素，从而影响回收胚胎的质量，延长卵巢恢复和重复超排间隔。用FSH在供体获得可用卵数和超排效果稳定性上，显著高于PMSG超排药品。并且FSH超排供体不会有卵巢囊肿和持续发情，所以使用FSH优于PMSG，但由于FSH的半衰期短，所以要多次注射，处理程序繁琐。同时激素质量与可用胚胎数有密切关系，不同来源的FSH制剂超数排卵的效果也大不相同。
FSH制剂也被广泛用于母畜繁殖障碍的治疗，是治疗卵巢静止、卵巢囊肿的繁殖疾病首选的药品，对提高养殖企业母畜的繁殖力有重要作用。
但是国内兽用的FSH制剂存在纯度不高，生物活性低，半衰期较短的问题。由于在体内代谢和消除迅速，在实际中需要多次连续注射，才能维持FSH血药浓度在卵巢刺激的阈值水平以上。在生产实践中大大增加了工作时间和成本，反复连续注射也会使动物产生应激反应。国际上也有人尝试使用重组FSH制剂，实验结果表明使用重组FSH制剂并没有解决天然FSH制剂在动物体内半衰期短和不稳定性的问题。继重组FSH制剂后，2010年美国推出的第一个长效FSH(即FSH-CTP)，该产品在保持天然FSH制剂活性的情况下，半衰期得到一定程度的延长，并且更加稳定。对于长效FSH，国内外也做了大量的实验研究，均证明长效FSH半衰期和生物活性明显增强，在实际生产实践中有良好的应用效果，但由于其成本较高未能在动物的超数排卵上得到应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长效促排卵注射液，该长效促排卵注射液包含卵泡刺激素融合蛋白及医学上可接受的载体；其中卵泡刺激素融合蛋白的含量为10-600μg/mL。
该长效促排卵注射液的主要活性成分为卵泡刺激素融合蛋白，其含量为10-600μg/mL，优选为50-400μg/mL，更优选为200μg/mL。
卵泡刺激素融合蛋白(FSH融合蛋白)应用的是专利申请(CN 103509121 A)中公开的FSH融合蛋白，包括同二聚体融合蛋白和异二聚体融合蛋白。
本发明的一种长效促排卵注射液，其包含卵泡刺激素融合蛋白、甘露醇、L-甲硫氨酸、吐温80和L-组氨酸；
其中甘露醇含量为10-70mg/mL，优选为25-60mg/mL；L-甲硫氨酸含量为0.02-2mg/mL，优选为0.1-1mg/mL；吐温80含量为0.01-1mg/mL，优选为0.05-0.5mg/mL；L-组氨酸含量为2-4mg/mL，优选为2.5-3.5mg/mL；
所述的长效促排卵注射液，其中卵泡刺激素融合蛋白的含量为200μg/mL，甘露醇含量为10-70mg/mL；L-甲硫氨酸含量为0.02-2mg/mL；吐温80含量为0.01-1mg/mL；L-组氨酸含量为2-4mg/mL；余量为水。
本发明所述的长效促排卵注射液，其PH值为5.5-8.0，优选为6.5-7.0。
本发明的长效促排卵注射液的制备方法为：将卵泡刺激素融合蛋白从-80℃冰箱取出，在2～8℃冷房水浴化冻24小时，加入甘露醇、L-甲硫氨酸、吐温80、L-组氨酸，然后用注射用水稀释，再用柠檬酸调节溶液的PH值为5.5-8.0(优选为6.5-7.0)，磁力搅拌10-15分钟，充分混匀，用PES材质0.22μm过滤器过滤，得到长效促排卵注射液。
本发明的长效促排卵注射液可以用于动物的生殖领域，包括促排卵，卵巢静止、持久黄体、卵泡发育停滞等的预防和治疗。
本发明所述的长效促排卵注射液进行5次反复冻融的稳定性研究，经SE-HPLC(分子排阻色谱法)纯度和生物活性的检测，表明SE-HPLC纯度和生物活性均符合标准。本发明所述的长效促排卵注射液对奶牛有明显的超排作用，获得的可用胚胎数均超过了6.5枚。
本发明所述的长效促排卵注射液是通过FSH融合蛋白特殊的分子设计，在基本保留FSH的生物学活性的基础上，显著延长其在动物体内的半衰期，避免了由于药物反复注射引起的副作用，实现真正的“长效”，能减少畜牧业生产中的工作量，降低生产成本，同时也能减轻动物的应激反应，为日后在动物繁殖领域的发展奠定良好的基础。
本发明研发的长效促排卵注射液不仅可以填补国内外兽用长效FSH市场的空白，对我国动物繁殖技术的发展，尤其是对推动家畜胚胎移植技术的发展及产业化进程有重要意义。
具体实施方式
通过如下实施例来对本发明做进一步说明，其中实施例1-5为长效促排卵注射液的实施方案。
实施例1-9
具体制备方法为：将卵泡刺激素融合蛋白异二聚体从-80℃冰箱取出，在2～8℃冷房水浴化冻24小时，加入甘露醇、L-甲硫氨酸、吐温80、L-组氨酸，然后用注射用水稀释至1L，再用柠檬酸调节溶液的PH值为5.5-8.0，磁力搅拌10-15分钟，充分混匀，用PES材质0.22μm过滤器过滤，最后分装成2000瓶。
具体的各组分的含量见表1。
表1 实施例1-5的注射液组分及含量
实施例10
对实施例3-7中的注射液进行5次反复冻融的稳定性研究，检测SE-HPLC(分子排阻色谱法)纯度和生物活性，考察项目见表2。
表2 冻融稳定性考察项目
纯度测定方法：长效促排卵注射液样品的SE-HPLC检测方法参考《中国药典》2010版三部附录ⅢD分子排阻色谱法。色谱柱为TOSOH公司的SWXL3000型300*7.8,5μm SEC柱；等度洗脱，流动相为20mM磷酸氢二钠，300mM氯化钠，pH7.4±0.1；流速0.5mL/min；检测波长280nm。纯度≥95.0为合格。
生物活性检测方法：稳定转染FSHR(卵泡刺激素受体)的HEK293细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)表面表达FSHR，加入FSH后，与FSHR结合，细胞分泌cAMP(环化腺核苷一磷酸)。通过检测cAMP表达量即可反映不同浓度FSH与FSHR的结合能力。实验先将FSHR/HEK293细胞接种于96孔板中，37℃培养16-18小时贴壁后，加入不同浓度梯度的实施例制剂，37℃培养1小时后，弃旧培养基，加入细胞裂解液，离心取上清进行cAMP表达量的检测，最后在450nm/550nm读取吸光度值。cAMP标准曲线以摩尔浓度－吸光度值差做四参数拟合，用InterpX公式通过标准曲线反推出实施例制剂各浓度下cAMP表达量，然后以实施例制剂浓度－cAMP表达量做四参数拟合，C值即为该样品的EC50(半数有效量)。浓度为5.20mg/ml的原液作为内控参考品与样品的EC50值比较，即得比活性，也即生物学活性，其可接受标准为70-130％。
具体的SE-HPLC纯度和生物活性考察结果见表3。
表3 实施例3-7注射液的SE-HPLC纯度和生物活性考察结果
结论：实施例3-7所制备的长效促排卵注射液，经过5次反复冻融，SE-HPLC纯度和生物活性均符合标准。
实施例11：实施例3-7所制备的长效促排卵注射液在牛超排中的应用
超排过程：采埋置孕酮阴道栓(CIDR)(浙江台州东牧动物药业有限公司)同期发情的方法，即奶牛(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，每组一头奶牛，每头奶牛的黄体数见表4)按照常规超排方法埋置CIDR(当天为0天)，第9天上午8:00一次性注射一支实施例3-7所制备的长效促排卵注射液，连续给药4天，第12天上午和下午各注射前列腺素(四川金科药业有限责任公司)3支和2支，下午撤除CIDR，第14天观察发情，第14天晚上8:00(间隔第一次注射前列腺素60h)AI(人工受精)配种1次，第15天8:00早上(间隔第一次注射前列腺素72h)配种1次，第21天(发情后第7日)非手术采集胚胎。结果见表4。
表4 超排结果
| 项目 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 |
| 黄体数 | 16(左8右8) | 12(左5右7) | 14(左7右7) | 13(左6右7) | 9(左2右7) |
| 获得胚胎总数 | 13 | 12 | 14 | 12 | 9 |
| 可用胚胎数 | 7 | 9 | 11 | 7 | 7 |
| 不可用胚胎数 | 6 | 3 | 3 | 6 | 2 |
结果显示5组的可用胚胎数均超过了6.5枚，表明药物的比活性很高，100μg/0.5ml的注射液对奶牛有明显的超排作用。
Claims (9)
1.一种长效促排卵注射液，其特征在于该长效促排卵注射液包含卵泡刺激素融合蛋白及医学上可接受的载体组成；其中卵泡刺激素融合蛋白的含量为10-600μg/mL；该长效促排卵注射液包含卵泡刺激素融合蛋白、甘露醇、L-甲硫氨酸、吐温80和L-组氨酸，其中，甘露醇含量为10-70mg/mL，L-甲硫氨酸含量为0.02-2mg/mL，吐温80含量为0.01-1mg/mL，L-组氨酸含量为2-4mg/mL。
2.根据权利要求1所述的长效促排卵注射液，其特征在于其中卵泡刺激素融合蛋白的含量为50-400μg/mL。
3.根据权利要求1所述的长效促排卵注射液，其特征在于其中卵泡刺激素融合蛋白的含量为200μg/mL。
4.根据权利要求1所述的长效促排卵注射液，其特征在于其中甘露醇含量为25-60mg/mL；L-甲硫氨酸含量为0.1-1mg/mL；吐温80含量为0.05-0.5mg/mL；L-组氨酸含量为2.5-3.5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的长效促排卵注射液，其特征在于其中卵泡刺激素融合蛋白的含量为200μg/mL，甘露醇含量为10-70mg/mL；L-甲硫氨酸含量为0.02-2mg/mL；吐温80含量为0.01-1mg/mL；L-组氨酸含量为2-4mg/mL；余量为水。
6.根据权利要求5所述的长效促排卵注射液，其特征在于其PH值为5.5-8.0。
7.根据权利要求6所述的长效促排卵注射液，其特征在于其PH值为6.5-7.0。
8.权利要求1-7任一项所述长效促排卵注射液在动物生殖领域的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于该长效促排卵注射液用于促排卵，卵巢静止、持久黄体、卵泡发育停滞的预防和治疗。
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