WO1999057313A1 - Verfahren und vorrichtung zur isolierung von nucleinsäuren - Google Patents

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WO1999057313A1
WO1999057313A1 PCT/EP1999/003039 EP9903039W WO9957313A1 WO 1999057313 A1 WO1999057313 A1 WO 1999057313A1 EP 9903039 W EP9903039 W EP 9903039W WO 9957313 A1 WO9957313 A1 WO 9957313A1
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sample
dna
nucleic acids
dna mixture
random sequences
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PCT/EP1999/003039
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Jürgen Bernhagen
Herwig Brunner
Hubertus Eyb
Stefan Kiesewetter
Brigitte Koch-Pelster
Günter Tovar
Frank Vitzthum
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for isolating nucleic acids from a sample, in particular a biotic or abiotic material.
  • nucleic acids are, for example, environmental analysis, food diagnostics, veterinary diagnostics, epidemiology, soil tests, agricultural engineering, forensic technology, medical diagnostics such as tumor diagnostics, genetic analysis, early detection of epidemic multiple drug-resistant germs, development of more efficient therapies or disease monitoring, basic research the like.
  • Areas of application can be the starting materials for the preparative isolation of the nucleic acids, for example eukaryotic or prokaryotic cells or their homogenates, soil samples, blood samples, body fluids or tissue homogenates.
  • different digestion methods have to be used in order to make the nucleic acids present in cells and / or cell nuclei accessible for isolation. Digestion processes that are frequently used are, for example, ultrasound and / or enzyme treatment. After the digestion treatment has been carried out, the nucleic acids are isolated, for example by means of gel electrophoresis, ultracentrifugation or affinity chromatography.
  • Affinity chromatography is essentially based on the ability of nucleic acids to bind reversibly to positively charged and / or positively polar matrices.
  • an anionic or polar binding of the nucleic acids to the matrix is first achieved and then the nucleic acid is freed of impurities by using suitable solvents.
  • the nucleic acid bound to the matrix is detached from the matrix using a further solvent, for example with a higher ionic strength.
  • the nucleic acid isolated in this way generally has to be deionized again in order to be able to be used for further investigations.
  • Both DNA and RNA are conventionally also isolated by means of ultracentrifugation, with protease and phenol treatments frequently having to be carried out.
  • This procedure has the disadvantage that high molecular weight DNA in particular is often still contaminated with proteins even after the isolation has been carried out and the molecules are exposed to the risk of breakage due to the acting shear forces.
  • the phenol treatment is also harmful to health and the environment.
  • Gel electrophoresis which is often used for nucleic acid isolation, also has disadvantages, inter alia because of the comparatively complicated pre- and post-treatment of the samples or nucleic acids that are necessary.
  • the technical problem on which the present invention is based is therefore to provide a cost-effective and easy-to-carry out quantitative isolation method for nucleic acids, which, from any biotic and / or abiotic sample material, is highly specific to all or essentially all of the nucleic acids in a particularly simple step during sample digestion in a single step Form insulated and provided.
  • the invention solves this problem by providing a method for the quantitative isolation of nucleic acids from a sample, the - 4 -
  • sample is disrupted and a DNA mixture consisting only of random sequences is brought into contact with the disrupted sample in such a way that all or essentially all of the nucleic acids present in the sample can bind to the DNA mixture.
  • the nucleic acids bound to the DNA mixture can then be detached from the DNA mixture after an optional washing step and, for example, amplified, detected or used in some other way.
  • sample digestion is understood to mean the most complete possible release of nucleic acids, optionally the sequence and / or compartment-selective release of nucleic acids from a biological material, ie a sample, which involves destruction of the sample, for example Lysis, or reversible damage to the sample, for example pore formation, can go hand in hand.
  • the invention thus provides an affinity-chromatographic method for the quantitative, that is to say quantitative, isolation of all or essentially all of the nucleic acids present in a sample, in which the nucleic acids contained in a sample after digestion of the sample with a DNA mixture consisting only of random sequences be brought into contact and this DNA mixture specifically contains the nucleic acids contained in the sample, for example DNA and / or - 5 -
  • RNA binds and thus isolated from the other sample components such as carbohydrates, fats etc.
  • the hybridization conditions to be observed such as temperature and buffer composition, depend on the respective specific insulation task.
  • the invention therefore provides in an advantageous manner that all or essentially all nucleic acids can be removed quantitatively from a sample by means of the DNA mixture consisting only of random sequences.
  • the method according to the invention is therefore highly specific with regard to the isolated class of substances, namely nucleic acids, but is equally able to isolate all or almost all of the nucleic acids present in the sample.
  • the separation of essentially all nucleic acids means the separation of at least 85%, preferably 90%, particularly preferably 95% and in particular 99% of all nucleic acids present in the sample.
  • the invention advantageously enables the steps of sample digestion, in particular nucleic acid isolation, nucleic acid purification, and their detection to be combined in a single step, that is to say a one-step method.
  • This integration creates the basis for methods and devices that further accelerate nucleic acid diagnostics and reduce the risk of cross-contamination, so that sensitivity and specificity are increased. Automation of this technology is also made easier.
  • the invention enables - 6 -
  • the invention comprises a method that can be carried out quickly, requires only a small amount of material and reduces the use of costly and toxic substances.
  • a DNA mixture consisting only of random sequences is understood to mean a mixture of DNA random sequences, which are also referred to as random primers, which is not specifically put together for a nucleic acid to be specifically isolated, but rather has any desired nucleotide permutation , so that all nucleic acids present in the sample, in particular all nucleic acids with a chain length sufficient for hybridization, are bound indiscriminately.
  • the DNA random sequences have an essentially uniform, but any chain length, for example from 5 to 50, preferably an average chain length from 15 to 30.
  • the DNA mixture consisting only of random sequences thus has a large number of different DNA molecules in single-strand form , the sequence of which is composed at random.
  • the preparation of this DNA mixture is carried out in such a way that in the course of the DNA synthesis the four nucleosides involved in DNA construction, that is to say deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytidine and deoxythymidine and, if appropriate, because synthons, that is, their structurally analogous modifications, are used per DNA chain extension step in a mixing ratio of 1: 1: 1: 1. As a result, all four nucleosides are inserted with the same probability for each position in a DNA molecular chain.
  • a DNA mixture with random DNA sequences each of 20 nucleotides in length for example, represented by the sequence 5 '(N) 20 3', where N stands for deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxythymidine, deoxycytidine and / or synthons, thus represents a mixture of all single-stranded DNA molecules with a chain length of 20 nucleotides, that is 4 20 different DNA molecules.
  • the number of different DNA random sequences per DNA mixture according to the invention is therefore 4 X , where x is the chain length or number of nucleotides of the DNA random sequence.
  • the invention relates to a aforementioned method, the 4 X random sequences present in the DNA mixture occurring in the same, preferably in essentially molar, proportions.
  • the DNA mixture used according to the invention is therefore not developed with a view to a specific isolation task, but rather represents a DNA mixture that can be used for any DNA or RNA isolation task without any specific DNA or RNA specificity DNA mixture is only specific to the extent that it can separate nucleic acids, ie DNA or RNA, from other substances such as proteins, sugars or the like. According to the invention, however be provided to distinguish DNA from RNA by suitable selection of the binding or hybridization conditions between nucleic acid to be isolated and DNA mixture or the dissolution conditions (temperature, ionic strength, etc.). The method according to the invention can therefore advantageously be carried out specifically for DNA or RNA.
  • the DNA mixture to be used according to the invention can also contain other modified bases or nucleosides such as deoxyinosine, uridine, pseudouridine, N 2 -dimethyl-guanosine, N 6 -isopentenyl-adenosine, and / or synthons.
  • other modified bases or nucleosides such as deoxyinosine, uridine, pseudouridine, N 2 -dimethyl-guanosine, N 6 -isopentenyl-adenosine, and / or synthons.
  • pentoses that is to say RNA building blocks, instead of the deoxygen pentoses.
  • a DNA mixture may also be understood to mean an RNA mixture.
  • a sample is understood to mean any organic, inorganic or biotic / abiotic material, provided that it contains a nucleic acid, ie DNA or RNA.
  • a sample can be a prokaryotic or eukaryotic cell or a cell homogenate, viruses, for example in the form of a virus suspension, blood, sperm, lymph or other body fluid, organ or tissue preparation, water or soil samples, liposomes, yeast, cell organelles , Cell nucleus, plant homogenates, amber or other.
  • the sample preferably has water or a physiological salt or buffer solution as a solvent.
  • the invention has the advantage that highly specific nucleic acids can be isolated from a sample already during sample digestion in a single step and obtained in pure form, so that these can be used directly for other analysis or preparation steps, such as a PCR method .
  • the procedure according to the invention advantageously does not require any costly and time-consuming adaptation steps of the method to the respective insulation task. Rather, the method according to the invention can be used directly for any insulation task without further modification.
  • the method according to the invention can thus be used in the course of almost any electrical, chemical, physical or chemical-physical digestion of organic or inorganic material.
  • the invention advantageously provides a aforementioned method, the DNA mixture consisting only of random sequences being immobilized on a carrier. If, according to this preferred embodiment, the DNA mixture is bound to a sample carrier, in a further preferred embodiment the DNA mixture, which consists only of random sequences, can be brought into contact with the sample under the influence of an electric field, for example a pulsed electric field or a field constant voltage are carried out in such a way that electrohybridization takes place, as is described, for example, in DE 196 281 717 or US Pat. No. 5,632,957, which are included in this regard in the present disclosure.
  • nucleic acids initially accumulate in the anode region of a device suitable for carrying out the method according to the invention, in which the immobilized random sequences are advantageously also located, so that locally high nucleic acid concentrations arise in the region of these random sequences, which favor hybridization kinetically and thermodynamically.
  • the polarity can be washed rigorously in a further preferred embodiment of the invention due to the changed kinetic and thermodynamic conditions in the cathode region, as is described, for example, in DE 196 281 717 or US Pat. No. 5,632,957, which is so far described in the present Disclosure content are included.
  • a further specificity of the method according to the invention for example with regard to an enrichment of certain nucleic acid species, can be achieved following the separation of all nucleic acid species.
  • the invention relates to a aforementioned method, the DNA mixture consisting only of random sequences being in free, that is to say unbound, form. If, according to this particularly preferred embodiment of the invention, the DNA mixture consisting only of random sequences is freely available, in a preferred embodiment it must have a negative net charge in order to support the nucleic acid purification by means of electrophoretic and dielectrophoretic effects.
  • an electric field is preferably applied, preferably an inhomogeneous electric field. In this field - 1 1 -
  • the DNA mixture and the released nucleic acids of the sample move in the same direction towards the anode, so that their concentration increases there locally and hybridization is kinetically and thermodynamically favored.
  • the invention therefore provides in a particularly preferred embodiment that at least one electric field, for example a pulsed electric field and / or a field of constant electric voltage, is applied when the nucleic acids are brought into contact with the either immobilized or free DNA mixture consisting only of random sequences becomes.
  • the number and parameters of the electrical fields to be used depend on the specific insulation and cleaning task. Suitable parameters for pulsed electric fields are, for example, in Kinosita and Tsong, Nature 268 (1977), 438 to 441, Proc. Natl. Acad. Be. USA 74 (1977), 1923 to 1927 or Benz and Zimmermann, Bioelectrochem. Bioenergy. 7 (1980), 723 to 739 and for constant fields in Pollard-Knight et.
  • the invention provides in a preferred embodiment that an electric field is also present during the sample digestion, for example a - 12 -
  • pulsed electrical field and / or a field of constant electrical voltage is used.
  • the use of pulsed electric fields leads to the electroporation and osmotic lysis of biological materials such as cells. This releases the nucleic acids present in the biological materials and makes them accessible for purification.
  • the number of fields and their technical parameters depend on the respective task, i.e. the material to be digested and the solvent.
  • a pulsed electric field with field strengths of 2 to 100 kV / cm, in particular 5 to 50 kV / cm, and a pulse length or time constant of approximately 0.5 ⁇ s to 50 ms is particularly preferred both for sample digestion and optionally for electro-hybridization used.
  • different electrical parameters can also be used for the electro-hybridization.
  • the action of the electric field and the electrical breakthrough create pores in the lipid layers that make up the cell membrane.
  • 1 to 1,000,000, preferably 100 to 20,000, pulses can be applied to the cells.
  • the pulse shape can be, for example, rectangular, exponentially decreasing or sinusoidal, preferably in radio frequency.
  • the electrical field can be generated by both AC and DC voltage.
  • the field strength is preferably above the critical voltage V c across the membrane of the cell to be disrupted.
  • Usual conditions for cell disruption or nucleic acid release from biological materials by means of electrical fields are, for example, in Vitzthum et. al., FEBS Abstract (1998), 155, US Pat. No. 5,235,905, US Pat. No. 5,447,733 or US Pat. No. 5,393,541, which in this respect are included in the disclosure content of the invention.
  • sample digestion and / or the nucleic acid release with other parameters of the electric field and / or to provide chemical agents, for example chaotropic substances or detergents, which support cell digestion, for example SDS, lipases, proteases such as that Proteinase K or DMSO (dimethyl sulfoxide), urea, guanidinium thiocyanate or guanidinium hydrochloride.
  • chemical agents for example chaotropic substances or detergents, which support cell digestion, for example SDS, lipases, proteases such as that Proteinase K or DMSO (dimethyl sulfoxide), urea, guanidinium thiocyanate or guanidinium hydrochloride.
  • nucleic acids can be provided to detect the nucleic acids following the binding of the nucleic acids or the detachment of the nucleic acids to or from the free or immobilized DNA mixture, an amplification optionally being carried out by means of PCR before detection.
  • the nucleic acids purified from the sample can be detected directly in the sample carrier, for example optically, for example spectrophotometrically, luminometrically, radioactive or else electrically.
  • the amplification of the nucleic acids to be detected which may be carried out can, according to the invention, be an electrical isothermal amplification as described in WO 98/02573, WO 93/15224 or WO 95/25177 and which are included in the present disclosure.
  • ultrasonic influence for example at 16 to 40 kHz
  • the DNA is fragmented, which improves binding to the immobilized DNA mixture.
  • the influence of ultrasound can therefore also be used or only to support the binding of the nucleic acids to the DNA mixture.
  • bound nucleic acid can be detached from the DNA mixture by increasing the ambient temperature, for example to at least 70 ° C., for example boiling temperature, in the presence of a suitable solvent, for example a buffer solution or water. Detachment can also take place by increasing the ionic strength of the dissolving buffer or by changing the pH. According to the invention, it is also possible to carry out the washing step and / or an elution using the electrical field described, that is to say to carry out an electro-stringent washing, as described, for example, in Hintsche, Medical Genetics 11 (1999), 12-13, Cheng et al. , Anal. Chem. 70 (1998), 2321-2326, Cheng et al.
  • the nucleic acid obtained is free from impurities and can be amplified in particular by PCR methods, even in the presence of the immobilized DNA mixture.
  • the present invention also relates to a device, in particular an affinity matrix, for isolating nucleic acids from a sample, in particular for carrying out a method mentioned above, comprising a DNA mixture consisting only of random sequences and described above, which is immobilized on a matrix.
  • the random sequences of the DNA mixture are preferably coupled via their 3 'ends, so that when a subsequent amplification is preferably carried out, for example by means of PCR, no by-products - 17 -
  • the invention therefore provides a device, in particular an affinity matrix, with which the aforementioned method can be carried out, in particular with the aid of which nucleic acids can be isolated from any sample in a simple and inexpensive manner.
  • the device according to the invention comprises a matrix which can be designed, for example, as an electrode, for example made of stainless steel, platinum, silver, gold, aluminum and / or graphite, as a membrane, as beads or columnar gel and as a support or basic structure for the only DNA mixture consisting of random sequences acts. It can also be provided to use magnetic particles, for example beads, as a matrix.
  • the invention advantageously provides for the material for the matrix to be a chemically and physically largely inert material, such as glass or plastic, for example polystyrene or polypropylene, or a correspondingly inert electrode material.
  • a chemically and physically largely inert material such as glass or plastic, for example polystyrene or polypropylene, or a correspondingly inert electrode material.
  • the material must be suitable, temperature differences in an interval between 10 ° C and 95 ° C, pH differences in an interval between 0 to 14 and sodium or potassium chloride ion concentrations in an interval of 10 itiM to 2 M without significant change in Tolerate material properties.
  • the material used must be insoluble in water, detergents and surfactant mixtures as well as chemically - 18 -
  • the surface of the matrix is modified in an advantageous manner, for example by the application of biomolecules which bind with high affinity to the surface of the matrix material.
  • a biomolecule immobilized on the matrix can be, for example, streptavidin.
  • the matrix surface can also be modified in such a way that a covalent bond between the random sequences of the DNA mixture and the matrix is made possible.
  • the matrix can have amino groups which can bond via a dialdehyde spacer or a dialdehyde compound molecule, for example glutaraldehyde, to form a Schiff base with an amino function introduced, for example, at the 5 'end of the DNA random sequences.
  • the matrix is cleaned before modification of its surface, for example with nitric acid.
  • the invention provides, in an advantageous embodiment, for silanizing the surface of the matrix before the modification.
  • the random sequences of the DNA mixture accordingly also have modifications for the purpose of immobilization on the matrix, preferably at the 3 'or 5' end.
  • modifications can be, for example, biomolecules, such as biotin, which are linked to the 5 'end of the DNA random sequence and which bind with high affinity to other biomolecules immobilized on the matrix, such as, for example, streptavidin. It can also be provided that amino functions in the - 19 -
  • each random sequence can thus have, for example, an amino group or other customary functional groups such as epoxy or succinimide esters.
  • the modified DNA random sequences in single strand form that is to say the DNA mixture
  • the modified matrix are brought into contact with one another, so that the DNA mixture is immobilized on the matrix.
  • the matrix loaded with the DNA mixture to be used according to the invention is also referred to in the context of the present invention as the affinity matrix.
  • the affinity matrix according to the invention can advantageously also be applied to the surface of particles which are exposed or exposed to the digestion in the course of digestion.
  • the invention also relates to a device for isolating nucleic acids from a sample, in particular for carrying out a method according to the invention, this device comprising a sample chamber with at least two planar electrodes, preferably arranged opposite one another, and at least one non-conductive frame part, the at least two electrodes and the frame part are designed as a wall, cover and / or base part.
  • the invention thus relates to a device mentioned above, also as a sample carrier. - 20 -
  • the sample carrier preferably also adapted to the chip format, ie cm or mm format, since this minimizes the amount of consumables and maximizes the sample throughput.
  • a chip is constructed according to the principles of microfluidics.
  • the frame part can accordingly also be flat, that is to say evenly constructed, with no sample chamber being provided and the electrodes being integrated into the frame part.
  • the device according to the invention when designing the device according to the invention as a sample carrier chip, there are advantages with regard to the voltage to be applied, since high field strengths can be achieved even at lower voltages due to the small electrode spacing.
  • a preferred method according to the invention that is to say sample digestion and nucleic acid purification and, if appropriate, washing and detection can advantageously be carried out in a single sample carrier, an electrical field preferably being applied during the entire method or at certain times, which ensures the said method steps.
  • the sample carrier according to the invention is accordingly made of conductive elements, the electrodes, and not conductive. - 21 -
  • the electrodes preferably consist or contain aluminum, stainless steel, silver, gold, platinum, graphite or the like, the non-conductive frame parts being made of plastic, glass, silicon or the like or containing these individually or in combination.
  • the geometry of the sample holder is to be designed in such a way that both homogeneous and inhomogeneous electric fields can be generated.
  • the device according to the invention is thus characterized in that a sample chamber is provided for receiving a sample from a base, cover and wall parts, which has at least two flat electrodes as a wall or base part, the remaining areas of the sample chamber not conductive material, the frame part, is constructed.
  • a sample chamber is provided for receiving a sample from a base, cover and wall parts, which has at least two flat electrodes as a wall or base part, the remaining areas of the sample chamber not conductive material, the frame part, is constructed.
  • one or more openings can be integrated into the frame parts, for example as input and removal units for introducing and removing sample liquid, which are optionally provided with filters and / or valves.
  • the dimensions of the sample carrier are preferably from 1 cm 2 (chip) to 10 cm x 10 cm x 10 cm (laboratory device). - 22 -
  • At least one of the electrodes and / or a region of the frame part has the DNA mixture used according to the invention, which consists only of random sequences, and thus acts equally as a matrix or carrier for the DNA mixture immobilized on the electrode and / or the frame part .
  • the invention also relates to the use of a DNA mixture consisting only of random sequences, in particular a mixture of the same part, of 4 X different DNA random sequences, where x is the chain length of the DNA random sequence, preferably 5 to 50, in particular 15 to 30, for Isolation of nucleic acids from a sample.
  • FIG. 1 shows a matrix of a device according to the invention
  • FIG. 2 shows a device or DNA affinity matrix according to the invention
  • FIG. 3 shows an electropherogram, - 23 -
  • FIG. 4 shows two chromatograms of the binding of standard DNA to untreated and treated glass beads
  • FIG. 5 shows a further embodiment of a device according to the invention in the form of a sample carrier
  • Figure 6 shows a further embodiment of a device according to the invention designed as a chip.
  • FIG. 1 shows a matrix 10 which is designed in the form of a membrane 1.
  • the membrane 1 is coated on its surface with streptavidin molecules 3.
  • FIG. 2 shows an affinity matrix 100 which was produced by bringing the matrix 10 into contact with 5 'modified chemically or synthetically produced DNA random sequences 7, 7', 7 '' of a DNA mixture in single-strand form, the 5th Modification of the DNA random sequence enables it to bind to the streptavidin molecules 3 with high affinity.
  • FIG. 2 shows that the 5 'ends of the DNA random sequences 7, 7', 7 1 'are each bound to biotin 5.
  • the biotin modification at the 5 'end of the DNA random sequences 7, 7', 7 '' binds with high affinity to the immobilized streptavidin molecules 3, so that a DNA mixture immobilized on a matrix 10 is also included - 24 -
  • Example 2 Isolation of DNA from a cell disruption
  • the glass beads were boiled in nitric acid. 50 g of the glass beads were placed in a 1 liter three-necked flask with a reflux condenser to 500 ml of approximately 7% nitric acid. The mixture was heated to boiling over a heating element and refluxed for 1 hour. In the meantime, a magnetic stirrer was used to stir the fish. After cooling, the supernatant liquid was decanted off. The glass beads were washed three times with MilliQ quality water and filtered through a filter. They were dried in a drying cabinet at 95 ° C. overnight. Since contamination was still visible to the naked eye after drying, the entire cleaning process was repeated again.
  • thoxysilane Fluka
  • 0.5 ml of triethylamine was added as catalyst.
  • the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • the reaction solution was decanted off and the glass beads were washed with water (MilliQ) and filtered through a suction filter.
  • a potassium phosphate buffer was prepared from 160 ml 0.1 MK 2 HP0 4 and 40 ml 0.1 M KH 2 P0 4 and adjusted to pH 7.5.
  • a 2.5% glutardialdehyde solution was prepared from 10 ml of 25% glutardialdehyde solution and 90 ml of the potassium phosphate buffer.
  • 4 g of the silanized glass beads were added to 40 ml of the 2.5% glutardialdehyde solution and stirred at room temperature for about 1 hour. The glass beads were then washed with water, potassium phosphate buffer and again well with water.
  • Oligonucleotides (1 ⁇ mol per batch) (15-mer, each 15-mer in the same concentration, that is, there is a distribution of all theoretically possible oligomers with the nucleotides A, T, G and C in equal proportions, company Interactiva, Ulm, Germany) were taken up in 1 ml of potassium phosphate buffer.
  • a 15 ml tube (Greiner GmbH)
  • 1 g of the silanized glass beads activated with glutardialdehyde and 1 ml of the primer solution were added to 4 ml of potassium phosphate buffer.
  • the mixture was briefly cooled in ice.
  • the tube was placed on a roller in the cold room overnight and rolled there for 17 hours.
  • the glass beads were centrifuged in a minifuge (Heraeus) for 5 minutes at 1500 rpm.
  • Example 5 Nucleic acid isolation using electrical fields using a sample carrier in chip format
  • FIG. 5 shows a device 200, comprising a sample chamber 210 made up of four electrodes 220, 220 'combined into two opposite electrode pairs and a frame part 230 made of non-conductive materials.
  • the sample carrier is rectangular in cross section and constructed in chip format, that is to say has a size of approximately 1 to 2 cm 2 .
  • the top and bottom parts of the sample chamber 210 are not shown.
  • Frame part 230 and the four flat electrodes 220, 220 ' form the walls and enclose an internal volume which serves to hold the sample. It can be provided that a distance between the two is arranged opposite one another. - 30 -
  • the non-conductive areas 240 between the conductive elements 220, 220 'of a pair of electrodes are chosen to be as small as possible, so that approximately homogeneous electric fields can arise if, for example, the conductive elements, i.e. electrodes 220' as cathode and the conductive elements, i.e. Electrodes 220 act as an anode.
  • the sample chamber 210 has a frame part 230 which has input 260 and removal units 270 provided with filters. The input and removal units 260, 270 are fitted into connection-like non-conductive elements 280 of the frame part 230 in such a way that the sample carrier 200 can be filled and emptied.
  • the device 200 has optical units 290 between non-conductive regions 295 and 280 of the frame part 230, so that the optical units can be adapted in such a way that connections are created.
  • DNA mixture used according to the invention are immobilized. Provision can also be made to attach the random sequences 300 additionally or exclusively to the non-conductive element 240 in the region of the electrodes 220, 220 '.
  • one or more corresponding voltage-generating devices must be connected to the sample carrier 200, in order to avoid the various fields required to be able to generate.
  • the device according to the invention is characterized in particular by the fact that parts or areas of the sample chamber 210, that is to say the wall, the base and / or cover part, are constructed from electrodes which can generate at least one electric field in the chamber, in walls, floor or cover openings for sampling, inputs and / or detection may be present.
  • the procedure according to the invention initially provides that a sample, such as E. coli cells in water, is introduced into the sample carrier 200. Subsequently, a dielectrophoresis can optionally be provided using an electric field to concentrate or separate certain biological cells or as a prerequisite for an electrofusion, a corresponding voltage being applied to the connections 225 of the electrodes 220, 220 '. An electrofusion can be provided for the electrolysis - 32 -
  • An electrical voltage is then applied, for example to generate pulsed electrical fields or an electrical field of constant voltage, in such a way that the biological cells or viruses are electrolyzed, where appropriate the conditions can be set such that only certain biological cells are electrolyzed.
  • an electrical field with a field strength of 2 to 100 kV / cm is used.
  • the conditions are then selected such that the nucleic acids released from the disrupted cells use an electrical field with random sequences of the DNA mixture used according to the invention either freely present in the sample chamber or with the conductive and / or non-conductive regions of the sample chamber 210 in the anode region immobilized random sequences 300 of the DNA mixture used according to the invention can be electro-hybridized.
  • a pulse number of 10,000 to 100,000, a time constant of 2 s to 50 ⁇ s, a field strength of 1 kV / cm to 10 kV / cm and exponential decrease in pulse during cell disruption and hybridization were used.
  • electrostringent washing can be carried out with reverse polarity and enrichment or de-enrichment of certain nucleic acids and removal of undesired substances, for example amplification inhibitors. Electroelution and, if necessary, amplification of the nucleic acids still present then close in the sample chamber 210 - 33 -
  • nucleic acids can be detected, preferably electrically (described for example in Hintsche, 1999, op. Cit.)
  • FIG. 6 shows a device 400 according to the invention for carrying out a method according to the invention, the device 400 being constructed from a flat non-conductive frame part 560 and at least two electrodes 500 integrated in this flat frame part 560.
  • the device 400 according to the invention is designed as a chip, that is to say has no sample chamber formed from a wall or cover part.
  • the invention thus also relates to a flat sample carrier, that is to say a chip, made of a non-conductive chip base 560, also referred to as a frame part, and two flat electrodes 500 integrated into this chip base 560.
  • a flat sample carrier that is to say a chip, made of a non-conductive chip base 560, also referred to as a frame part, and two flat electrodes 500 integrated into this chip base 560.
  • the method according to the invention can be carried out by a targeted control of the electrodes 500 in chronological order, for example an electrode control 1 for electrical digestion of the biotic or abiotic material (nucleic acid isolation), an electrode control 2 for electrical nucleic acid cleaning, an electrode control 3 for electrical isothermal nucleic acid amplification and an electrode control 4 for electrical detection.
  • a targeted control of the electrodes 500 in chronological order, for example an electrode control 1 for electrical digestion of the biotic or abiotic material (nucleic acid isolation), an electrode control 2 for electrical nucleic acid cleaning, an electrode control 3 for electrical isothermal nucleic acid amplification and an electrode control 4 for electrical detection.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, wobei die Probe aufgeschlossen und gleichzeitig oder anschließend eine nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung mit der Probe so in Kontakt gebracht wird, daß eine Bindung von im wesentlichen allen in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren an die DNA-Mischung stattfinden kann.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäuren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäu- ren aus einer Probe, insbesondere einem biotischen oder abiotischen Material.
Die spezifische Isolierung bestimmter DNA-Sequenzen aus Gemischen verschiedener DNA-Sequenzen unter Einsatz von mehr oder weniger spezifizierten Nucleinsäuren ist bekannt. So beschreibt die US 5,650,489 die Verwendung von DNA-Zufallssequenzen zur Isolierung bestimmter, interessierender DNA- Sequenzen. Ein Probenaufschluß und die quantitative Abtrennung von in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren wird nicht beschrieben.
Die quantitative Isolierung von Nucleinsäuren aus bestimmten noch aufzuschließenden Ausgangsmaterialien spielt jedoch in einer Vielzahl von wissenschaftlichen, industriellen oder sonstigen Bereichen eine große Rolle. Derartige Bereiche sind zum Beispiel die Umweltanalytik, Lebensmitteldiagno- stik, Veterinärdiagnostik, Epidemiologie, Bodenuntersuchungen, Agrotechnik, Kriminaltechnik, medizinische Diagnostik wie Tumordiagnostik, Erbgutanalyse, Früherkennung von epidemischen Multiple-Drug- resistenten Keimen, Entwicklung von effizienteren Therapien, Monitoring von Krankheiten, Grundlagenforschung oder ähnliches. Ebenso vielfältig wie die - 2 -
Anwendungsbereiche können die Ausgangsmaterialien für die präparative Isolierung der Nucleinsäuren sein, beispielsweise eukaryotische oder prokaryoti- sche Zellen oder deren Homogenate, Bodenproben, Blutproben, Körperflüssigkeiten oder Gewebehomo- genate. In Abhängigkeit von diesem Ausgangs- oder Probenmaterial müssen unterschiedliche Aufschlußverfahren eingesetzt werden, um die beispielsweise in Zellen und/oder Zellkernen vorhandenen Nucleinsäuren einer Isolierung zugänglich zu machen. Häufig eingesetzte Aufschlußverfahren sind zum Beispiel die Ultraschall- und/oder Enzymbehandlung. Nach Durchführung der AufSchlußbehandlung werden die Nucleinsäuren beispielsweise mittels Gelelektrophorese, Ultrazentrifugation oder Affinitätschromatographie isoliert.
Die Affinitätschromatographie beruht im wesentlichen auf der Fähigkeit von Nucleinsäuren, reversibel an positiv geladene und/oder positivpolare Matrizes zu binden. In der Regel wird zunächst eine anionische oder polare Bindung der Nucleinsäuren an die Matrix erwirkt und anschließend die Nucleinsäu- re durch Einsatz geeigneter Lösemittel von Verunreinigungen befreit. In einem zweiten Schritt wird die an die Matrix gebundene Nucleinsäure unter Einsatz eines weiteren Lösemittels, beispielsweise mit höherer Ionenstärke, von der Matrix gelöst. Anschließend muß die so isolierte Nucleinsäure im allgemeinen wieder deionisiert werden, um für weitere Untersuchungen verwendet werden zu können.
Als nachteilig erweist sich dabei, daß je nach eingesetztem Probenmaterial und durchgeführtem Auf- schlußverfahren unterschiedliche Isolierungsstrategien entwickelt und eingesetzt werden müssen.
Sowohl DNA als auch RNA wird herkömmlicherweise auch mittels Ultrazentrifugation isoliert, wobei häufig Protease- und Phenolbehandlungen durchgeführt werden müssen. Diese Verfahrensweise weist den Nachteil auf, daß insbesondere hochmolekulare DNA selbst nach Durchführung der Isolierung häufig noch mit Proteinen verunreinigt sind und die Moleküle aufgrund der einwirkenden Scherkräfte der Gefahr des Zerbrechens ausgesetzt sind. Zudem ist die Phenolbehandlung gesundheits- und umweltschädlich.
Auch die zur Nucleinsäureisolierung oftmals eingesetzte Gelelektrophorese weist unter anderem aufgrund der notwendigen vergleichsweise umständlichen Vor- und Nachbehandlung der Proben beziehungsweise Nucleinsäuren Nachteile auf.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem liegt also darin, ein kostengünstiges und einfach durchzuführendes quantitatives Isolierungsverfahren für Nucleinsäuren bereitzustellen, das aus beliebigem biotischen und/oder abiotischen Probenmaterial bereits während des ProbenaufSchlusses in einem einzigen Schritt hochspezifisch alle oder im wesentlichen alle Nucleinsäuren in besonders reiner Form isoliert und bereitstellt.
Die Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur quantitativen Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, wobei die - 4 -
Probe aufgeschlossen und eine nur aus Zufallsse- quenzen bestehende DNA-Mischung mit der aufgeschlossenen Probe so in Kontakt gebracht wird, daß eine Bindung beziehungsweise Hybridisierung von allen oder im wesentlichen allen in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren an die DNA-Mischung stattfinden kann. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung können nach erfolgter Abtrennung der restlichen Probe dann die an die DNA-Mischung gebundenen Nucleinsäuren nach einem gegebenenfalls erfolgenden Waschschritt von der DNA-Mischung wieder abgelöst werden und zum Beispiel amplifizier , nachgewiesen oder sonstwie verwendet werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter ProbenaufSchluß die möglichst vollständige Freisetzung von Nucleinsäuren, gegebenenfalls die Sequenz- und/oder Kompartiment-selektive Freisetzung von Nucleinsäuren, aus einem biologischen Material, einer Probe also, verstanden, die mit einer Zerstörung der Probe, zum Beispiel Lyse, oder reversibler Schädigung der Probe, zum Beispiel Porenbildung, einhergehen kann.
Die Erfindung stellt also ein affinitätschroma- tographisches Verfahren zur quantitativen, das heißt mengenmäßigen, Isolierung von allen oder im wesentlichen allen in einer Probe vorhandenen Nucleinsäuren bereit, bei dem die in einer Probe enthaltenen Nucleinsäuren nach erfolgtem Probenaufschluß mit einer nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung in Kontakt gebracht werden und diese DNA-Mischung spezifisch die in der Probe enthaltenen Nucleinsäuren, zum Beispiel DNA und/oder - 5 -
RNA, bindet und damit von den anderen Probenbestandteilen wie Kohlenhydraten, Fetten etc. isoliert. Die dabei einzuhaltenden Hybridisierungsbe- dingungen wie Temperatur und Pufferzusammensetzung hängen von der jeweiligen konkreten Isolieraufgabe ab.
Die Erfindung sieht also in vorteilhafter Weise vor, daß mittels der nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung alle beziehungsweise im wesentlichen alle Nucleinsäuren quantitativ aus einer Probe entfernt werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren ist also hochspezifisch im Hinblick auf die isolierte Substanzklasse, nämlich Nucleinsäuren, ist gleichermaßen aber in der Lage, alle oder nahezu alle der in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren zu isolieren. Unter der Abtrennung von im wesentlichen allen Nucleinsäuren wird das Abtrennen von mindestens 85 %, vorzugsweise 90 %, besonders bevorzugt 95 % und insbesondere 99 % aller in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren verstanden.
Die Erfindung ermöglicht in vorteilhafter Weise das Zusammenfassen der Schritte des Probenaufschlusses, insbesondere der Nucleinsäureisolierung, Nuclein- säurereinigung und deren Nachweis in einem einzigen Schritt, das heißt einem einstufigen Verfahren. Durch diese Integration wird die Grundlage für Verfahren und Vorrichtungen geschaffen, welche die Nucleinsäurediagnostik weiter beschleunigen und die Gefahr von Querkontaminationen vermindern, so daß die Empfindlichkeit und Spezifität gesteigert werden. Außerdem wird eine Automatisierung dieser Technologie erleichtert. Die Erfindung ermöglicht - 6 -
in vorteilhafter Weise also eine universelle, durchgängige, standardisierbare, kostengünstige und automatisierbare Nucleinsäurediagnostik zur Gen- und Genomanalyse mit einer Vielzahl von Anwendungs- möglichkeiten. Die Erfindung umfaßt ein schnell durchführbares Verfahren, erfordert einen nur geringen Materialaufwand und reduziert den Einsatz kostenintensiver und giftiger Substanzen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung eine Mischung aus DNA-Zufallssequenzen, die auch als random primers bezeichnet werden, verstanden, die nicht spezifisch auf eine konkret zu isolierende Nucleinsäure zusammengestellt ist, sondern jede beliebige Nucleotidpermutation aufweist, so daß unterschiedslos alle in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren, insbesondere alle Nucleinsäuren mit für eine Hybridisierung ausreichender Kettenlänge, gebunden werden. Die DNA- Zufallssequenzen weisen eine im wesentlichen einheitliche, aber beliebige Kettenlänge auf, beispielsweise von 5 bis 50, vorzugsweise eine durchschnittliche Kettenlänge von 15 bis 30. Die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung weist also eine Vielzahl von unterschiedlichen DNA-Molekülen in Einzelstrangform auf, deren Sequenz jeweils zufallsgemäß zusammengesetzt ist.
Bei der Herstellung dieser DNA-Mischung wird so vorgegangen, daß im Verlauf der DNA-Synthese die vier am DNA-Aufbau beteiligten Nucleoside, das heißt Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxycytidin und Desoxythymidin sowie gegebenenfalls deren je- weilige Synthone, das heißt deren strukturanaloge Modifikationen, pro DNA-Kettenverlängerungsschritt in einem Mischungsverhältnis von 1:1:1:1 eingesetzt werden. Das hat zur Folge, daß je Position in einer DNA-Molekülkette alle vier Nucleoside mit gleicher Wahrscheinlichkeit eingebaut werden. Eine DNA- Mischung mit DNA-Zufallssequenzen von jeweils beispielsweise 20 Nucleotiden Länge, dargestellt durch die Abfolge 5' (N) 20 3', wobei N für Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin, Desoxycytidin und/oder Synthone steht, repräsentiert demnach eine Mischung aller einzelsträngiger DNA-Moleküle mit einer Kettenlänge von 20 Nucleotiden, das heißt 420 verschiedene DNA-Moleküle. Die Anzahl von unterschiedlichen DNA-Zufallsequenzen pro erfindungsgemäßer DNA-Mischung beträgt demnach 4X, wobei x die Kettenlänge oder Nucleotidanzahl der DNA-Zufallssequenz ist.
In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung betrifft die Erfindung ein vorgenanntes Verfahren, wobei die in der DNA-Mischung vorhandenen 4X Zufallssequenzen in gleichen, vorzugsweise in im wesentlichen, molaren Mengenanteilen vorkommen. Die erfindungsgemäß eingesetzte DNA-Mischung ist also nicht im Hinblick auf eine konkrete Isolieraufgabe hin entwickelt, sondern stellt vielmehr eine für jede beliebige DNA- oder RNA-Isolieraufgabe ein- setzbare DNA-Mischung ohne jegliche konkrete DNA- oder RNA-Spezifität dar. Die eingesetzte DNA- Mischung ist nur insoweit spezifisch, als daß sie Nucleinsäuren, das heißt DNA oder RNA, von anderen Stoffen wie zum Beispiel Proteinen, Zuckern oder ähnlichem trennen kann. Erfindungsgemäß kann jedoch vorgesehen sein, durch geeignete Auswahl der Bindebeziehungsweise Hybridisierungsbedingungen zwischen zu isolierender Nucleinsäure und DNA-Mischung oder der Lösebedingungen (Temperatur, Ionenstärke etc.) DNA von RNA zu unterscheiden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann also in vorteilhafter Weise DNA- oder RNA-spezifisch durchgeführt werden.
Selbstverständlich kann die erfindungsgemäß einzusetzende DNA-Mischung auch andere modifizierte Basen oder Nucleoside wie Desoxyinosin, Uridin, Pseu- douridin, N2-Dimethyl-guanosin, N6-Isopentenyl- adenosin, und/oder Synthone enthalten. Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, anstelle der De- soxypentosen, Pentosen, also RNA-Bausteine, einzusetzen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer DNA-Mischung gegebenenfalls also auch eine RNA-Mischung verstanden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Probe jedes beliebige organische, anorganische oder biotisch/abiotische Material verstanden, sofern dieses eine Nucleinsäure, also DNA oder RNA, enthält. Eine Probe kann demgemäß eine pro- karyotische oder eukaryotische Zelle oder ein Zell- homogenat , Viren, beispielsweise in Form einer Virussuspension, Blut, Sperma, Lymph- oder sonstige Körperflüssigkeit, Organ- oder Gewebepräparat, Wasser- oder Bodenproben, Liposomen, Hefe, Zellorganellen, Zellkern, Pflanzenhomogenate, Bernstein oder sonstiges sein. Die Probe weist vorzugsweise Wasser oder eine physiologische Salz- oder Pufferlösung als Lösungsmittel auf. - 9 -
Die Erfindung weist den Vorteil auf, daß aus einer Probe bereits während des ProbenaufSchlusses in einem einzigen Schritt hochspezifisch Nucleinsäuren isoliert werden können und in reiner Form erhalten werden, so daß diese direkt für andere Analyseoder Präparationsschritte, wie beispielsweise ein PCR-Verfahren, eingesetzt werden können. Die erfindungsgemäße Vorgehensweise setzt in vorteilhafter Weise keine kosten- und zeitintensiven Anpassungsschritte des Verfahrens an die jeweilige Isolieraufgabe voraus. Vielmehr kann das erfindungsgemäße Verfahren direkt ohne weitere Modifikation für jede beliebige Isolieraufgabe eingesetzt werden. So kann das erfindungsgemäße Verfahren im Verlauf nahezu jeden elektrischen, chemischen, physikalischen oder chemisch-physikalischen Aufschlusses organischen oder anorganischen Materials eingesetzt werden.
Die Erfindung sieht in vorteilhafter Weise ein vorgenanntes Verfahren vor, wobei die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung an einem Träger immobilisiert vorliegt. Liegt gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform die DNA-Mischung an einem Probenträger gebunden vor, kann in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform das Inkontaktbrin- gen der nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA- Mischung mit der Probe unter Einfluß eines elektrischen Feldes, beispielsweise eines gepulsten elektrischen Feldes oder eines Feldes konstanter Spannung so durchgeführt werden, daß eine Elektrohybri- disierung stattfindet, so wie es zum Beispiel in der DE 196 281 717 oder US 5,632,957 beschrieben ist, die insoweit in den vorliegenden Offenbarungsgehalt einbezogen sind. Die negativ geladenen - 10 -
Nucleinsäuren reichern sich demgemäß zunächst im Anodenbereich einer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Vorrichtung an, in dem sich vorteilhafterweise auch die immobilisierten Zufallssequenzen befinden, so daß im Bereich dieser Zufallssequenzen lokal hohe Nuclein- säurekonzentrationen entstehen, die eine Hybridisierung kinetisch und thermodynamisch begünstigen. Durch Umpolen des elektrischen Feldes kann in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung aufgrund der veränderten kinetischen und thermody- namischen Bedingungen im Kathodenbereich stringent gewaschen werden, so wie es zum Beispiel in der DE 196 281 717 oder US 5,632,957 beschrieben ist, die insoweit in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogen sind. Auf diese Weise läßt sich eine weitere Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens, beispielsweise im Hinblick auf eine Anreicherung bestimmter Nucleinsäurespezies, im Anschluß an die Abtrennung aller Nucleinsäurespezies erreichen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein vorgenanntes Verfahren, wobei die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA- Mischung in freier, das heißt ungebundener, Form vorliegt. Liegt gemäß dieser besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung frei vor, muß sie in bevorzugter Ausführungsform negative Nettoladung besitzen, um über elektrophoretische und dielektrophoretische Effekte die Nucleinsäurer- einigung zu unterstützen. Erfindungsgemäß bevorzugt wird ein elektrisches Feld angelegt, vorzugsweise ein inhomogenes elektrisches Feld. In diesem Feld - 1 1 -
wandert die DNA-Mischung und die freigesetzten Nucleinsäuren der Probe in dieselbe Richtung zur Anode hin, so daß sich deren Konzentration dort lokal erhöht und eine Hybridisierung kinetisch und thermodynamisch begünstigt ist. Dazu kommt der Vorteil, daß Substanzen anderer elektrischer Eigenschaften durch dieses Verfahren abgetrennt werden.
Die Erfindung sieht also in besonders bevorzugter Ausführungsform vor, daß während des Inkontaktbrin- gens der Nucleinsäuren mit der nur aus Zufallssequenzen bestehenden entweder immobilisierten oder freien DNA-Mischung mindestens ein elektrisches Feld, beispielsweise ein gepulstes elektrisches Feld und/oder ein Feld konstanter elektrischer Spannung angelegt wird. Die Anzahl und die Parameter der einzusetzenden elektrischen Felder richten sich nach der konkreten Isolier- und Reinigungsaufgabe. Geeignete Parameter für gepulste elektrische Felder sind zum Beispiel in Kinosita und Tsong, Na- ture 268 (1977), 438 bis 441, Proc . Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 1923 bis 1927 oder Benz und Zimmermann, Bioelectrochem. Bioenerg. 7 (1980), 723 bis 739 und für konstante Felder in Pollard-Knight et. al., WO 97/41219 (1997) beschrieben, die insoweit in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogenen sind. Da ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dann erreicht wird, wenn das erfindungsgemäße Verfahren einstufig durchgeführt wird, das heißt der Probenaufschluß gleichzeitig mit der Nucleinsäurereinigung stattfindet, sieht die Erfindung in bevorzugter Ausfüh- rungsform vor, daß auch während des Probenauf- Schlusses ein elektrisches Feld, beispielsweise ein - 12 -
gepulstes elektrisches Feld und/oder ein Feld konstanter elektrischer Spannung eingesetzt wird. Der Einsatz gepulster elektrischer Felder führt zur Elektroporation und osmotischen Lyse von biologischen Materialien wie Zellen. Dadurch werden die in den biologischen Materialien vorhandenen Nucleinsäuren freigesetzt und einer Reinigung zugänglich. Auch hier richtet sich die Anzahl der Felder und deren technische Parameter nach der jeweiligen Aufgabe, das heißt dem aufzuschließenden Material und dem Lösungsmittel. Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß vorgesehen, die Anzahl und die Parameter des/der elektrischen Felder, wie Impulszahl, Feldstärke oder Pulsfrequenz, im Verlauf eines erfindungsgemäßen Verfahrensdurchgangs zu variieren, beispielsweise bei höheren Feldstärken und größeren Impulszahlen aufzuschließen und die Elektrohybridi- sierung bei geringeren Feldstärken und/oder Impulszahlen durchzuführen. Bei der Verwendung von gepulsten elektrischen Feldern oder auch Feldern konstanter elektrischer Spannung zur Nucleinsäureiso- lierung ist es erfindungsgemäß möglich, über die Wahl der Behandlungsparameter nur bestimmte Zelltypen in einer Probe verschiedener Zelltypen zu ly- sieren. Dies kann ausgenutzt werden, um bestimmte Nucleinsäuren eines Zelltyps von anderen Zelltypen und damit auch deren Nucleinsäuren abzutrennen. Während des Probenaufschlusses können mit Hilfe der elektrischen Felder durch zum Beispiel Zellfusion auch Substanzen in die Zellen oder Micellen eingebracht werden, die später die Lyse und/oder Nucleinsäurefreisetzung unterstützen, spezifizieren oder der Markierung für eine spätere Detektion dienen. - 13 -
Erfindungsgemäß wird sowohl für Probenaufschluß als auch gegebenenfalls für die Elektrohybridisierung besonders bevorzugt ein gepulst betriebenes elektrisches Feld mit Feldstärken von 2 bis 100 kV/cm, insbesondere 5 bis 50 kV/cm, und einer Pulslänge beziehungsweise Zeitkonstanten von zirka 0,5 μs bis 50 ms eingesetzt. Selbstverständlich können für die Elektrohybridisierung jedoch auch abweichende elektrische Parameter eingesetzt werden. Durch die Einwirkung des elektrischen Feldes und den elektrischen Durchbruch entstehen in den Lipidschichten, aus denen die Zellmembran besteht, Poren. Erfindungsgemäß können 1 bis 1.000.000, vorzugsweise 100 bis 20.000 Impulse an die Zellen angelegt werden. Die Impulsform kann zum Beispiel rechteckig, expo- nentiell abnehmend oder sinusartig, vorzugsweise in Radiofrequenz, sein. Das elektrische Feld kann dabei sowohl durch Wechsel- als auch Gleichspannung erzeugt werden. Die Feldstärke liegt bevorzugt über der kritischen Spannung Vc über der Membran der aufzuschließenden Zelle. Übliche Bedingungen für den Zellaufschluß beziehungsweise die Nucleinsäure- freisetzung aus biologischen Materialien mittels elektrischer Felder sind zum Beispiel in Vitzthum et. al., FEBS Abstract (1998), 155, US-PS 5,235,905, US-PS 5,447,733 oder US-PS 5,393,541 beschrieben, die insoweit in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit einbezogen sind.
Es ist erfindungsgemäß auch bevorzugt, den Zellaufschluß durch den Einsatz hoher Temperaturen, zum Beispiel von 30°C bis 95°C, zu unterstützen. - 14 -
Selbstverständlich ist es auch möglich, den Probenaufschluß und/oder die Nucleinsäurefreisetzung mit anderen Parametern des elektrischen Feldes durchzuführen und/oder gegebenenfalls chemische Agenzien, zum Beispiel chaotrope Stoffe oder Detergenzien, vorzusehen, die den Zellaufschluß unterstützen, zum Beispiel SDS, Lipasen, Proteasen wie die Proteinase K oder DMSO (Dimethylsulfoxid) , Harnstoff, Guanidi- niumthiocyanat oder Guanidiniumhydrochlorid.
Bevorzugt ist es jedoch, das erfindungsgemäße Verfahren des Probeaufschlusses, der Nucleinsäurerei- nigung sowie gegebenenfalls der Nucleinsäuredetek- tion ohne Zusatz solcher Substanzen, zum Beispiel ausschließlich in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder Pufferlösung ohne Zusatz von Chemikalien durchzuführen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, im Anschluß an die Bindung der Nucleinsäuren oder das Ablösen der Nucleinsäuren an beziehungsweise von der freien oder immobilisierten DNA-Mischung die Nucleinsäuren nachzuweisen, wobei gegebenenfalls vor Nachweis eine Amplifikation mittels PCR durchgeführt wird. Der Nachweis der aus der Probe aufgereinigten Nucleinsäuren kann direkt im Probenträger, beispielsweise optisch, zum Beispiel spektrophotometrisch, luminometrisch, radioaktiv oder auch elektrisch durchgeführt werden. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist es möglich, den Probenaufschluß, die Probenaufreinigung und den Nachweis in einem einstufigen Verfahren in ein und demselben Probenträger durchzuführen, wobei vorzugsweise während des gesamten Prozesses ein - 15 -
elektrisches Feld angelegt wird, welches den Probenaufschluß, die Nucleinsäureaufreinigung und die Detektion gewährleistet. Die gegebenenfalls durchgeführte Amplifikation der nachzuweisenden Nucleinsäuren kann erfindungsgemäß eine elektrische isotherme Amplifikation sein, wie sie in WO 98/02573, WO 93/15224 oder WO 95/25177 beschrieben ist und die insoweit in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogen sind.
In besonders vorteilhafter Weise kann vorgesehen sein, die mit der, vorzugsweise immobilisierten, nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung in Kontakt gebrachte Probe Ultraschalleinfluß, beispielsweise bei 16 bis 40 kHz, auszusetzen, um einen Probenaufschluß, insbesondere Zellaufschluß, zu erreichen. Dies führt gleichzeitig zu einer Erwärmung des Reaktionsgemisches aus Probe und, vorzugsweise immobilisierter, DNA-Mischung, so daß die in der Probe enthaltende DNA denaturiert wird und beim Abkühlen an die, vorzugsweise immobilisierte, DNA- Mischung binden kann. Des weiteren wird die DNA fragmentiert, wodurch eine Bindung an die immobilisierte DNA-Mischung verbessert wird. Der Ultraschalleinfluß kann also auch beziehungsweise nur zur Unterstützung der Bindung der Nucleinsäuren an die DNA-Mischung verwendet werden.
In besonders bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, daß nach der Affinitätsbindung der in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren an die DNA-Mischung Verunreinigungen mittels geeigneter Pufferlösungen oder Wasser entfernt werden. Nach dem erfolgten Waschschritt kann die affinitätsge- - 16 -
bundene Nucleinsäure durch Erhöhung der Umgebungstemperatur, beispielsweise auf mindestens 70°C, zum Beispiel Siedetemperatur, in Gegenwart eines geeigneten Lösemittels, zum Beispiel einer Pufferlösung oder Wasser, von der DNA-Mischung abgelöst werden. Die Ablösung kann auch durch Erhöhung der Ionenstärke des Lösepuffers oder eine Veränderung des pH-Wertes erfolgen. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, den Waschschritt und/oder eine Elution unter Einsatz des beschriebenen elektrischen Feldes durchzuführen, das heißt ein elek- trostringentes Waschen durchzuführen, wie es zum Beispiel in Hintsche, Medizinische Genetik 11 (1999), 12-13, Cheng et al . , Anal. Chem. 70 (1998), 2321-2326, Cheng et al . , Nat Biotechnol 16 (1998), 541-546, DE 196 28 171.7 oder US-PS 5,632,957 beschrieben ist, die insofern in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Erfindung mit einbezogen sind. Die erhaltene Nucleinsäure ist frei von Verunreinigungen und kann insbesondere durch PCR- Verfahren, auch in Gegenwart der immobilisierten DNA-Mischung, amplifiziert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung, insbesondere eine Affinitätsmatrix, zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, insbesondere zur Durchführung eines vorgenannten Verfahrens, umfassend eine nur aus Zufallssequenzen bestehende, vorstehend beschriebene, DNA-Mischung, die an einer Matrix immobilisiert ist. Die Kopplung der Zufallssequenzen der DNA-Mischung erfolgt vorzugsweise über deren 3' -Ende, so daß bei einer vorzugsweise durchgeführten anschließenden Amplifikation, zum Beispiel mittels PCR, keine Nebenprodukte - 17 -
entstehen. Die Erfindung sieht also eine Vorrichtung, insbesondere eine Affinitätsmatrix, vor, mit Hilfe derer das vorgenannte Verfahren durchgeführt werden kann, insbesondere mit Hilfe derer Nucleinsäuren aus einer beliebigen Probe in einfacher und kostengünstiger Weise isoliert werden können.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt eine Matrix, die beispielsweise als Elektrode, zum Beispiel aus Edelstahl, Platin, Silber, Gold, Aluminium und/oder Graphit, als Membran, als Kügelchen (beads) oder Säulengel ausgeführt sein kann und als Träger oder Grundgerüst für die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung fungiert . Es kann auch vorgesehen sein, magnetische Partikel, zum Beispiel Kügelchen, als Matrix einzusetzen.
Die Erfindung sieht in vorteilhafter Weise vor, als Material für die Matrix ein chemisch und physikalisch weitgehend inertes Material einzusetzen, wie Glas oder Kunststoff, zum Beispiel Polystyrol oder Polypropylen oder ein entsprechend inertes Elektrodenmaterial.
Insbesondere muß das Material geeignet sein, Temperaturunterschiede in einem Intervall zwischen 10°C und 95°C, pH-Unterschiede in einem Intervall zwischen 0 bis 14 und Natrium- beziehungsweise Calium- chloridionenkonzentrationen in einem Intervall von 10 itiM bis 2 M ohne signifikante Veränderung der Materialeigenschaften zu tolerieren. Darüber hinaus muß das eingesetzte Material unlöslich in Wasser, Detergentien und Tensidmischungen sowie chemisch - 18 -
inert gegenüber chaotropen Reagenzien, wie zum Beispiel Isoguanidinthiocyanat , sein.
Die Matrix ist in vorteilhafter Weise auf ihrer Oberfläche modifiziert, beispielsweise durch das Aufbringen von Biomolekülen, die hochaffin an der Oberfläche des Matrixmaterials binden. Ein derartiges auf der Matrix immobilisiertes Biomolekül kann zum Beispiel Streptavidin sein. Die Matrixoberfläche kann jedoch auch derart modifiziert sein, daß eine kovalente Bindung zwischen den Zufallssequenzen der DNA-Mischung und der Matrix ermöglicht wird. Demgemäß kann die Matrix Aminogruppen aufweisen, die über einen Dialdehydspacer beziehungsweise ein Dialdehydverbindungsmolekül, zum Beispiel Glu- tardialdedyd, unter Bildung einer Schiff sehen Base mit einer zum Beispiel am 5 ' -Ende der DNA-Zufallssequenzen eingeführten Aminofunktion eine Bindung eingehen kann. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, die Matrix vor Modifizierung ihrer Oberfläche zu reinigen, zum Beispiel mit Salpetersäure. Zudem sieht die Erfindung in vorteilhafter Ausführungs- form vor, die Oberfläche der Matrix vor der Modifizierung zu silanisieren.
Die Zufallssequenzen der DNA-Mischung weisen demgemäß zum Zweck der Immobilisierung an der Matrix ebenfalls Modifikationen, vorzugsweise am 3'- oder 5 '-Ende, auf. Derartige Modifikationen können beispielsweise mit dem 5 ' -Ende der DNA-Zufallssequenz verbundene Biomoleküle wie Biotin sein, die hochaffin an auf der Matrix immobilisierte andere Biomoleküle binden, wie beispielsweise Streptavidin. Es kann auch vorgesehen sein, Aminofunktionen in die - 19 -
DNA-Zufallssequenzen einzuführen, so daß diese unter Bildung einer Schiff 'sehen Base mit an der Matrix immobilisierten Aldehydgruppen kovalent binden können. Das 5'- oder 3 '-Ende jeder Zufallssequenz kann also zum Beispiel eine Aminogruppe oder andere übliche funktioneile Gruppen wie Epoxid oder Succinimidester aufweisen.
In jedem Fall werden die modifizierten DNA- Zufallssequenzen in Einzelstrangform, also die DNA- Mischung, und die modifizierten Matrix miteinander in Kontakt gebracht, so daß die DNA-Mischung an der Matrix immobilisiert wird. Die mit der erfindungs- gemäß einzusetzenden DNA-Mischung beladene Matrix wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch als Affinitätsmatrix bezeichnet.
Die erfindungsgemäße Affinitätsmatrix kann in vorteilhafter Weise auch auf der Oberfläche von Partikeln aufgebracht werden, die im Rahmen eines Aufschlusses dem Aufschluß zu- beziehungsweise ausgesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, insbesondere zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei diese Vorrichtung eine Probenkammer mit mindestens zwei flächig ausgebildeten, vorzugsweise gegenüberliegend angeordneten, Elektroden und mindestens einem nicht leitenden Rahmenteil umfaßt, wobei die mindestens zwei Elektroden und das Rahmenteil als Wand-, Deckel- und/oder Bodenteil ausgeführt sind. Die Erfindung betrifft also eine vorgenannte Vorrichtung, auch als Probenträger be- - 20 -
zeichnet, deren Abmessungen den Gegebenheiten des zu untersuchenden biologischen Materials angepaßt sein kann. Dies schließt sowohl Größenordnungen vom Bereich der Mikrosystemtechnik und Chiptechnologie als auch die derzeit üblichen Probenträgergrößen, die in Labors angewendet werden, ein. Vorzugsweise sind die Abmessungen und Geometrien des Probenträgers auch deshalb dem Chipformat, also cm- beziehungsweise mm-Format, angepaßt, da hierdurch die Menge an Verbrauchsmaterial minimiert und der Probendurchsatz maximiert werden kann. In bevorzugter Ausführungsform wird ein solcher Chip nach den Prinzipien der Mikrofluidik aufgebaut. Das Rahmenteil kann demgemäß in solcher Ausführungsform auch flächig, das heißt eben ausgeführt sein, wobei keine Probenkammer vorgesehen ist und die Elektroden in das Rahmenteil integriert vorliegen. Des weiteren bieten sich beispielsweise bei Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Probenträgerchip Vorteile bezüglich der anzulegenden Spannung an, da hohe Feldstärken durch den geringen Elektrodenabstand bereits bei geringeren Spannungen erreicht werden können. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren, das heißt Probenaufschluß und Nuclein- säurereinigung sowie gegebenenfalls Waschen und De- tektion kann vorteilhafterweise in einem einzigen Probenträger durchgeführt werden, wobei vorzugsweise während des gesamten Verfahrens oder zu bestimmten Zeiten ein elektrisches Feld angelegt wird, welches die genannten Verfahrensschritte gewährleistet .
Der erfindungsgemäße Probenträger ist demgemäß aus leitenden Elementen, den Elektroden, und nicht lei- - 21 -
tenden Elementen, dem Rahmenteil, aufgebaut. Vorzugsweise bestehen oder enthalten die Elektroden aus Aluminium, Edelstahl, Silber, Gold, Platin, Graphit oder ähnlichem, wobei die nicht leitenden Rahmenteile aus Kunststoff, Glas, Silizium oder ähnlichem bestehen oder dieses einzeln oder in Kombination enthalten. Die Geometrie des Probenträgers ist so auszuführen, daß gegebenenfalls sowohl homogene als auch inhomogene elektrische Felder erzeugt werden können.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich also dadurch aus, daß eine Probekammer für die Aufnahme einer Probe aus einem Boden-, Deckel- und Wandteilen vorgesehen ist, die mindestens zwei flächig ausgebildete Elektroden als Wand- oder Bodenteil aufweist, wobei die restlichen Bereiche der Probekammer aus nicht leitendem Material, dem Rahmenteil, aufgebaut ist. Vorzugsweise können in die Rahmenteile eine oder mehrere Öffnungen, zum Beispiel als Eingabe- und Entnahmeeinheiten zur Einleitung und Entnahme von Probeflüssigkeit integriert werden, die gegebenenfalls mit Filtern oder/und Ventilen versehen sind. Zudem ist es er- findungsgemäß bevorzugt, zwischen den Rahmenteilen optische oder sonstige Meßeinheiten zu integrieren, die den Nachweis der isolierten Nucleinsäuren erlauben.
Die Abmessungen des Probenträgers betragen bevorzugt von 1 cm2 (Chip) bis 10 cm x 10 cm x 10 cm (Laborgerät) . - 22 -
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist zumindest eine der Elektroden und/oder ein Bereich des Rahmenteils die erfindungsgemäß verwendete nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA- Mischung auf, wirkt gleichermaßen also als Matrix beziehungsweise Träger für die auf der Elektrode und/oder dem Rahmenteil immobilisierte DNA- Mischung.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung, insbesondere einer gleichteiligen Mischung, aus 4X verschiedenen DNA-Zufallssequenzen, wobei x gleich der Kettenlänge der DNA-Zufallssequenz ist, vorzugsweise 5 bis 50, insbesondere 15 bis 30, zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen und dazugehöriger Figuren näher erläutert .
Die Figuren zeigen:
Figur 1 eine Matrix einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Figur 2 eine erfindungsgemäße Vorrichtung beziehungsweise DNA-Affinitätsmatrix,
Figur 3 ein Elektropherogramm, - 23 -
Figur 4 zwei Chromatogramme der Bindung von Standard-DNA an unbehandelte und behandelte Glasperlen,
Figur 5 eine weitere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in Form eines Probenträgers und
Figur 6 eine weitere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ausgeführt als Chip.
Beispiel 1 : Vorrichtung zur DNA-Isolierung
Die Figur 1 zeigt eine Matrix 10, die in Form einer Membran 1 ausgeführt ist. Die Membran 1 ist auf ihrer Oberfläche mit Streptavidinmolekülen 3 beschichtet .
Die Figur 2 stellt eine Affinitätsmatrix 100 dar, die hergestellt wurde, indem die Matrix 10 mit 5' modifizierten chemisch oder synthetisch hergestellten DNA-Zufallssequenzen 7, 7', 7'' einer DNA-Mischung in Einzelstrangform in Kontakt gebracht wurde, wobei die 5 ' -Modifikation der DNA-Zufallssequenz diese in die Lage versetzt, hochaffin an die Streptavidinmoleküle 3 zu binden. Die Figur 2 stellt dar, daß die 5 ' -Enden der DNA-Zufallssequenzen 7, 7', 71' jeweils an Biotin 5 gebunden sind. Die Biotinmodifikation am 5 ' -Ende der DNA- Zufallssequenzen 7, 7', 7'' bindet hochaffin an die immobilisierten Streptavidinmoleküle 3, so daß eine auf einer Matrix 10 immobilisierte DNA-Mischung mit - 24 -
den einzelnen DNA-Zufallssequenzen 7, 7', 7'' gebildet wird.
Beispiel 2: Isolierung von DNA aus einem Zellaufschluß
A) Herstellung der Affinitätsmatrix
Für die Versuche wurden Bailotini Micro-Glaskugeln Typ 3000 der Firma Potters-Ballotini GmbH, Kirch- heimbolanden verwendet . Ihre Größe war mit bis zu 50 μm angegeben. Um das Ausgangsmaterial zu reinigen und die Oberfläche für die Silanisierung vorzubereiten, wurden die Glaskügelchen in Salpetersäure gekocht. 50 g der Glaskügelchen wurden in einen 1 1-Dreihalskolben mit Rücklaufkühler zu 500 ml circa 7%iger Salpetersäure gegeben. Über einen Heizpilz wurde bis zum Sieden erhitzt und 1 Stunde unter Rückfluß gekocht. Währenddessen wurde über einen Magnetruhrer mit Rührfisch gerührt. Nach dem Erkalten wurde die überstehende Flüssigkeit abdekantiert. Die Glaskügelchen wurden dreimal mit Wasser in MilliQ-Qualität gewaschen und über eine Nut- sche abfiltriert. Bei 95°C wurden sie über Nacht im Trockenschrank getrocknet . Da nach dem Trocknen mit bloßem Auge noch Verunreinigungen zu erkennen waren, wurde der gesamte Reinigungsvorgang nochmals wiederholt .
10 g der trockenen und gereinigten Glaskügelchen wurden zu 200 ml trockenem Methanol in einen 250 ml Einhals-Rundkolben gegeben. Der Kolben wurde mit Argon gespült. Es wurden 20 ml 3- Aminopropyltrime- - 25 -
thoxysilan (Fluka) zugegeben. Als Katalysator wurden 0 , 5 ml Triethylamin zugesetzt. Der Ansatz wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde abdekantiert und die Glaskügelchen mit Wasser (MilliQ) gewaschen und über eine Nutsche abfiltriert .
Zunächst wurde aus 160 ml 0,1 M K2HP04 und 40 ml 0,1 M KH2P04 ein Kaliumphosphatpuffer hergestellt und auf pH 7,5 eingestellt. Aus 10 ml 25%iger Glutardialdehyd-Lösung und 90 ml des Kaliumphosphatpuffers wurde eine 2,5%ige Glutardialdehyd-Lösung hergestellt. Zu 40 ml der 2,5%igen Glutardialdehyd- Lösung wurden 4 g der silanisierten Glaskügelchen zugegeben und circa 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Glaskügelchen wurden anschließend mit Wasser, Kaliumphosphatpuffer und wieder gut mit Wasser gewaschen.
Oligonucleotide (1 μmol pro Ansatz) (15-mere, jedes 15-mer in gleicher Konzentration, das heißt, es liegt eine Verteilung sämtlicher theoretisch möglicher Oligomere mit den Nucleotiden A,T,G und C in jeweils gleichen Anteilen vor, Firma Interactiva, Ulm, Deutschland) wurden in 1 ml Kaliumphosphatpuffer aufgenommen. In einem 15 ml Röhrchen (Greiner GmbH) wurde zu 4 ml Kaliumphosphatpuffer 1 g der silanisierten und mit Glutardialdehyd aktivierten Glaskügelchen sowie 1 ml der Primer-Lösung zugegeben. Der Ansatz wurde kurz in Eis gekühlt. Über Nacht wurde das Röhrchen im Kühlraum auf einen Roller gelegt und dort 17 Stunden gerollt. Die Glaskügelchen wurden in einer Minifuge (Heraeus) 5 Minuten bei 1500 U/min abzentrifugiert . Der Überstand - 26 -
wurde abdekantiert und zunächst im Kühlschrank aufbewahrt. Das Pellet wurde dreimal in circa 6 ml Kaliumphosphatpuffer aufgenommen und abzentrifugiert , um ungebundene Primer auszuwaschen. Die Kügelchen wurden mit Wasser (MilliQ) aufgeschlemmt und je zur Hälfte in zwei Eppendorfhütchen gegeben. Die eine Hälfte wurde so eingefroren, die andere Hälfte wurde in 3 Durchgängen zu je 10 Minuten in der Speed- vac getrocknet und ebenfalls im Gefrierschrank gelagert.
B) Zellaufschluß und DNA-Isolierung
In einem Reaktionsgefäß wurden 102 bis 109 der aufzuschließenden Zellen in 0,05 bis 1 ml eines Puffers der Zusammensetzung 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2P04 und 8,1 mM Na2HP04, pH = 7,0, vorgelegt. Anschließend wurden 50 bis 500 mg der Oligo- nucleotid-beschichteten Affinitätsperlen zugegeben. Zum Aufschluß der Zellen wurde in die entstehende Mischung Ultraschall der Frequenz 16 bis 40 kHz über einen Becherresonator eingekoppelt. Das Reaktionsgemisch erwärmte sich dabei auf durchschnittlich 80 °C, was ausreichte, die freigesetzte doppel- strängige DNA zu denaturieren, so daß sie beim Abkühlen der Reaktionsmischung durch Hybridisierung an die Affinitätsmatrix zu binden vermochte. Durch Unterschichten des Reaktionsgemisches mit Chloroform wurde eine Phasentrennung herbeigeführt, wobei sich die Glasperlen, aufgrund ihres hohen spezifischen Gewichtes in der Chloroformphase anreicherten. Der wäßrige Überstand, der neben Zelltrümmern alle wasserlöslichen Bestandteile des Zellaufschlusses enthält, wurde abgenommen und die Glas- - 27 -
perlen, denen die zu isolierende DNA anhaftete, im Vakuum getrocknet. Die gesamte DNA der Probe konnte so in einem einzigen Schritt aus der biologischen Probe freigesetzt und von den übrigen Bestandteilen präparativ getrennt werden.
Wurde die Isolierung der DNA an Dynabeads durchgeführt, wurden 50 μl Zellysat mit 50 μl konjugierten Dynabeads der Konzentration 5 mg/ml in einem Puffer der Zusammensetzung 20 mM Tris/HCl pH = 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, versetzt. Das resultierende Gemisch inkubierte hier für 10 Minuten auf einem Roller und für weitere 10 Minuten im Stehen. Die mit DNA beladenen Partikel wurden magnetisch separiert und zweimal mit je 100 μl Waschpuffer nach Herstellerangaben gewaschen.
C) Elution von DNA von der Affinitätsmatrix
Die DNA enthaltenden Affinitätsmatrices wurden wahlweise in Wasser oder einem Puffer der Zusammensetzung 10 mM Tris, 1 mM EDTA, ph = 8,0 aufgewärmt. Die resultierende Suspension wurde 10 Minuten zum Sieden erhitzt, wobei sich die an die Affinitätsmatrix gebundene DNA löste und mit dem Überstand, in der Hitze, abgenommen werden konnte.
Beispiel 3: DNA-Isolierung und PCR
In einem ersten Experiment wurde die prinzipielle Durchführbarkeit der Isolierung von DNA an immobilisierten DNA-Zufallssequenzen (15-mere, wie in Beispiel 2) gezeigt. Dazu wurden am 5'-Ende bio- - 28 -
tinylierte DNA-Zufallssequenzen an kommerziell erhältliche Streptavidin-beschichtete magnetische Partikel immobilisiert und ihre DNA-Bindungseigenschaften mit den Bindungseigenschaften eines kommerziell erhältlichen DNA-Isolierungssystems (DYNAL Direct) verglichen. Als Referenz-DNA diente ein das MIF-Gen enthaltendes Plasmid, das aus intakten Escherichia coli Zellen durch chemischen Zellaufschluß freigesetzt wird. Nach der Plasmid- Isolierung wurde das MIF-Gen mit einem geeigneten Sondenpaar amplifiziert und die PCR-Produkte elek- trophoretisch getrennt. Die Ergebnisse dieser Vergleichsuntersuchungen sind in Figur 3 dargestellt. Die Bahnen 3 und 4 des Elektropherogramms repräsentieren das MIF-PCR-Produkt von Plasmid-DNA, die an DNA-Zufallssequenzen isoliert werden konnte. Dem sind in den Bahnen 5 und 6 die MIF-PCR-Produkte der mit Hilfe des kommerziellen Systems isolierten Plasmid-DNA gegenübergestellt. Es zeigt sich weder ein qualitativer, noch ein quantitativer Unterschied zwischen beiden Isolierungsstrategien.
Beispiel 4: Affinitätschromatographie
Die als Affinitätsmatrix zur DNA-Isolierung hergestellten Glasperlen nach Beispiel 2 wurden in eine HPLC-Leersäule übergeführt und dort auf ihre DNA- Bindungskapazität untersucht. Ein wesentlicher Vorteil säulenchromatographischer Verfahren gegenüber sogenannten Batch-Verfahren ist ihre hohe Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit, die Versuchsbedin- gungen (Flußrate, Laufmittel, Temperatur) auf einfache Weise variieren zu können. Die Figur 4 stellt - 29 -
Chromatogramme der Bindung von Standard-DNA (jeweils 25 μg) bei 50 °C und einem Puffer der Zusammensetzung 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH = 8,0 an unbehandelte Glasperlen und an Glasperlen mit immobilisierten DNA-Zufallssequenzen dar. Die Differenz der Flächen unter den Kurven (Kurve 1: Glasperlen ohne DNA-Zufallssequenz ; Kurve 2: Glasperlen mit DNA-Zufallssequenz) entspricht der DNA-Bindungskapazität der Affinitätsmatrix. Die Flußrate betrug jeweils 0,1 ml/min. Unter den gewählten Bedingungen zeigte sich (vgl. Figur 4) , daß die DNA-Bindungskapazität der mit Zufallssequenzen beschichteten Glasperlen die Bindungskapazität unbeschichteter Glasperlen um das 7,16 fache übertraf.
Beispiel 5: Nucleinsäureisolierung unter Einsatz elektrischer Felder mittels eines Probenträgers in Chipformat
Die Figur 5 zeigt eine Vorrichtung 200, umfassend eine Probenkammer 210 aus vier zu zwei gegenüberliegenden Elektrodenpaaren zusammengefaßte Elektroden 220, 220' und einem Rahmenteil 230 aus nicht leitenden Materialien. Der Probenträger ist im Querschnitt rechteckig und im Chipformat aufgebaut, das heißt weist eine Größe von ca. 1 bis 2 cm2 auf. Nicht dargestellt ist der Deckel- und Bodenteil der Probenkammer 210. Rahmenteil 230 und die vier flächig ausgebildeten Elektroden 220, 220' bilden die Wände und umschließen ein Innenvolumen, das der Aufnahme der Probe dient. Es kann vorgesehen sein, einen Abstand der beiden gegenüberliegend angeord- - 30 -
neten und jeweils eine Wand bildenden Elektrodenpaare 220, 220' von 100 nm bis 5 mm und einen Elektrodendurchmesser bis ca. 1 cm auszuführen. Dargestellt ist, daß nicht leitende Bereiche 240 die einzelnen Elektroden 220, 220' der jeweiligen Elektrodenpaare mit ihren Anschlüssen 225 voneinander trennen, so daß inhomogene und annähernd homogene elektrische Felder erzeugt werden können. So kann die Bildung von inhomogenen Feldern durch Anlegen einer Spannung an nur zwei oder drei von vier leitenden Elementen 220, 220' erreicht werden. Vorzugsweise werden die nicht leitenden Bereiche 240 zwischen den leitenden Elementen 220, 220' eines Elektrodenpaares möglichst klein gewählt, so daß annähernd homogene elektrische Felder entstehen können, wenn zum Beispiel die leitenden Elemente, also Elektroden, 220' als Kathode und die leitenden Elemente, also Elektroden, 220 als Anode fungieren. Die Probenkammer 210 weist ein Rahmenteil 230 auf, welches mit Filtern versehene Eingabe- 260 und Entnahmeeinheiten 270 aufweist. Die Eingabe- und Entnahmeeinheiten 260, 270 sind in anschlußartige nicht leitende Elemente 280 des Rahmenteils 230 so eingepaßt, daß der Probenträger 200 befüllt und entleert werden kann. Um gegebenenfalls spektropho- tometrische oder luminometrische Messungen durchführen zu können, weist die Vorrichtung 200 optische Einheiten 290 zwischen nicht leitenden Bereichen 295 und 280 des Rahmenteils 230 auf, so daß die optischen Einheiten so angepaßt werden können, daß Anschlüsse entstehen. Zur elektrischen Detekti- on können die Anschlüsse 225 der Elektroden 220, 220' verwendet werden. Dargestellt ist auch, daß an den Elektroden 220 Zufallssequenzen 300 der erfin- - 31 -
dungsgemäß eingesetzten DNA-Mischung immobilisiert sind. Es kann auch vorgesehen sein, die Zufallssequenzen 300 zusätzlich oder ausschließlich am nicht leitenden Element 240 im Bereich der Elektroden 220, 220' anzubringen. Um sämtliche Verfahrensschritte unter Einsatz elektrischer Felder, das heißt Probenaufschluß, Nucleinsäureaufreinigung und gegebenenfalls Nucleinsäure-Waschen sowie detektion mit dem Probenträger 200 durchführen zu können, müssen ein oder mehrere entsprechende span- nungsgebende Apparaturen an den Probenträger 200 angeschlossen werden, um so die verschiedenen notwendigen Felder erzeugen zu können. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich also insbesondere dadurch aus, daß Teile oder Bereiche der Probenkammer 210, also der Wand, des Boden- und/oder Deckelteils aus Elektroden aufgebaut sind, die mindestens ein elektrisches Feld in der Kammer erzeugen können, wobei in Wänden, Boden oder Deckel Öffnungen zur Probeentnahme, -eingäbe und/oder Detektion vorhanden sein können.
Die erfindungsgemäße Verfahrensweise sieht unter Einsatz der vorgenannten Vorrichtung zunächst vor, daß eine Probe, wie in Wasser befindliche E. coli- Zellen, in den Probenträger 200 eingebracht wird. Anschließend kann gegebenenfalls eine Dielektropho- rese unter Einsatz eines elektrischen Feldes zur Konzentrierung beziehungsweise Abtrennung bestimmter biologischer Zellen oder als Voraussetzung für eine Elektrofusion vorgesehen sein, wobei an die Anschlüsse 225 der Elektroden 220, 220' eine entsprechende Spannung angelegt wird. Dabei kann eine Elektrofusion vorgesehen sein, um die Elektrolyse - 32 -
zu unterstützen oder eine Markierung durchzuführen. Anschließend wird eine elektrische Spannung beispielsweise zur Erzeugung gepulster elektrischer Felder oder eines elektrischen Feldes konstanter Spannung so angelegt, daß eine Elektrolyse der biologischen Zellen oder der Viren erfolgt, wobei gegebenenfalls die Bedingungen so eingestellt werden können, daß nur bestimmte biologische Zellen elek- trolysiert werden. Vorliegend wird ein elektrisches Feld mit einer Feldstärke von 2 bis 100 kV/cm eingesetzt. Anschließend werden die Bedingungen so gewählt, daß die aus den aufgeschlossenen Zellen freigesetzten Nucleinsäuren unter Einsatz eines elektrischen Feldes mit entweder frei in der Probenkammer vorliegenden Zufallssequenzen der erfindungsgemäß eingesetzten DNA-Mischung oder mit den im Anodenbereich an leitenden und/oder nicht leitenden Bereichen der Probenkammer 210 immobilisierten Zufallssequenzen 300 der erfindungsgemäß eingesetzten DNA-Mischung elektrohybridisieren können. Es wurde eine Impulszahl von 10000 bis 100000, eine Zeitkonstante von 2 s bis 50 μs , eine Feldstärke von 1 kV/cm bis 10 kV/cm und exponentielle Impulsabnahme bei Zellaufschluß und Hybridisierung eingesetzt .
Anschließend kann gegebenenfalls elektrostringentes Waschen unter Umpolung und An- beziehungsweise Entreicherung bestimmter Nucleinsäuren und Abtrennung unerwünschter Stoffe, zum Beispiel von Ampli- fikationsinhibitoren, durchgeführt werden. In der Probenkammer 210 schließt sich anschließend gegebenenfalls eine Elektroelution und gegebenenfalls eine Amplifikation der noch vorhandenen Nucleinsäuren - 33 -
an, vorzugsweise über eine elektrische, isotherme PCR, wie beschrieben in WO 97/47767. Schließlich kann, vorzugsweise elektrisch, eine Detektion der gebundenen oder frei vorliegenden aufgereinigten Nucleinsäuren erfolgen (beschrieben zum Beispiel in Hintsche, 1999, a.a.O.)
Dem Fachmann ist klar, daß zwischen oder nach einzelnen beschriebenen Schritten je nach Isolierstrategie ein Waschen oder Eluieren erwünschter oder gegebenenfalls nicht erwünschter Substanzen oder Nucleinsäuren ebenso wie eine Änderung des elektrischen Feldes hinsichtlich Polung, Feldstärke, Im- pulszahl, Impulsdauer oder Impulsfrequenz erfolgen kann.
Beispiel 6:
Die Figur 6 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung 400 zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die Vorrichtung 400 aus einem flächig ausgebildeten nichtleitenden Rahmenteil 560 und mindestens zwei in dieses flächig ausgebildete Rahmenteil 560 integrierten Elektroden 500 aufgebaut ist. Die erfindungsgemäße Vorrichtung 400 ist als Chip ausgeführt, das heißt weist keine aus Wand- oder Deckelteil gebildete Probenkammer auf. Die Erfindung betrifft also auch einen flächig ausgebildeten Probenträger, das heißt einen Chip, aus einer nichtleitenden Chipbasis 560, auch als Rahmenteil bezeichnet, und zwei in diese Chipbasis 560 integrierten flächigen Elektroden 500. In bevorzugter Weise kann an den Elektroden eine nur aus Zu- - 34 -
fallssequenzen bestehende DNA-Mischung 550 immobilisiert sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich durch eine gezielte Ansteuerung der Elektroden 500 in chronologischer Abfolge durchführen, beispielsweise eine Elektrodenansteuerung 1 zum elektrischen Aufschluß des biotischen beziehungsweise abiotischen Materials (Nucleinsäureisolierung) , eine Elektrodenansteuerung 2 zur elektrischen Nucleinsäurereinigung, eine Elektrodenansteuerung 3 zur elektrischen isothermen Nucleinsäureamplifikation und eine Elektrodenansteuerung 4 zur elektrischen Detektion.

Claims

- 35 -Ansprüche
1. Verfahren zur quantitativen Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, wobei die Probe aufgeschlossen und gleichzeitig oder anschließend eine nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung mit der Probe so in Kontakt gebracht wird, daß eine Bindung von im wesentlichen allen in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren an die DNA-Mischung stattfinden kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die an die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung gebundenen Nucleinsäuren nach Abtrennung der restlichen Probe und einem gegebenenfalls erfolgenden Waschschritt von der DNA-Mischung abgelöst werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , wobei die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung an einem Träger immobilisiert vorliegt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung frei in Lösung vorliegt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei während des Probenaufschlusses und/oder des Inkontaktbringens der Nucleinsäuren mit der nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung mindestens ein elektrisches Feld angelegt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das elektrische Feld ein gepulstes elektrisches Feld oder ein elektrisches Feld konstanter Spannung ist. - 36 -
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe unter Ultraschalleinfluß aufgeschlossen wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die immobilisierte, nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung unter Einfluß einer Ultraschall-Behandlung mit der Probe in Kontakt gebracht wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im Anschluß an die Bindung der Nucleinsäuren an die DNA-Mischung gewaschen wird, vorzugsweise unter Einsatz eines elektrischen Feldes.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im Anschluß an die Bindung der Nucleinsäuren an die nur aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung oder das Ablösen der Nucleinsäuren von der freien oder immobilisierten nur aus Zufallssequenzen bestehenden DNA-Mischung die Nucleinsäuren nachgewiesen werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10 , wobei der Nachweis im Anschluß an eine Amplifikation der Nucleinsäuren erfolgt .
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Nachweis in Form einer optischen, spektrophotome- trischen, luminometrischen, radioaktiven oder elektrischen Detektion erfolgt. - 37 -
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gebundenen Nucleinsäuren durch Erhöhung der Temperatur, insbesondere auf 70°C, in Gegenwart eines Lösemittels von der DNA-Mischung abgelöst werden.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einer Pufferlösung vorliegt.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Lösemittel, das Waschmittel oder beides Wasser, eine physiologischer Kochsalzlösung oder eine Pufferlösung ist.
16. Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, umfassend mindestens eine Probenkammer (210) mit mindestens zwei flächig ausgebildeten Elektroden
(220,220') und mindestens ein nichtleitendes Rahmenteil (230) , wobei die mindestens zwei flächig ausgebildeten Elektroden (220,220') und das Rahmenteil (230) als Wand-, Deckel- oder Bodenteil der Probenkammer ausgeführt sind.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16 , wobei die nur aus Zufallssequenzen (7 , 7 ' , 7 ' ' , 300) bestehende DNA- Mischung an wenigstens einer der Elektroden
(220,220') und/oder dem Rahmenteil (230) immobilisiert ist.
18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17 , wobei die mindestens zwei Elektroden (220,220') aus Gold, - 38 -
Silber, Edelmetall, Silber, Aluminium, Platin oder Graphit bestehen oder dieses einzeln oder in Kombination umfassen.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei das Rahmenteil (230) aus Silicium, Kunststoff oder Glas besteht oder diese einzeln oder in Kombination umfassen.
20. Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäuren aus einer Probe, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend eine nur aus Zufallssequenzen (7,7',7'', 300) bestehende DNA-Mischung, die an einer Matrix (10) immobilisiert ist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei die DNA-Mischung 4X verschiedene DNA- Zufallssequenzen (7 , 7 ' , 7 ' ' , 300) aufweist, mit x gleich der Anzahl der Nucleotide pro DNA- Zufallssequenz, vorzugsweise mit x gleich 5 bis 50, insbesondere 15 bis 30.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei in der DNA-Mischung die Zufallssequenzen
(7, 7 ' , 7 ' ' , 300) zu, vorzugsweise im wesentlichen, gleichen Anteilen vorhanden sind.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei jede Zufallssequenz (7 , 7 ' , 7 ' ' , 300) am 5'- oder 3 '-Ende modifiziert, insbesondere biotiny- liert, ist. - 39 -
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei jede einzelne DNA-Zufallssequenz (7,7 ',7'', 300) am 5'- oder 3 '-Ende eine A inogruppe oder andere gängige funktionelle Gruppen wie Epoxid, Suc- cinimidester etc. aufweist.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 24, wobei die Oberfläche der Matrix (10) immobilisierte Biomoleküle (3) zur Bindung der DNA-Mischung aufweist, insbesondere Streptavidin.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 25, wobei die Oberfläche der Matrix (10), insbesondere der wenigstens einen Elektrode, Aminogruppen aufweist, an die Dialdehydgruppen gebunden sind.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 26, wobei die Matrix (10) als Membran (1), Elektrode
(220,220') oder Säulengel ausgeführt ist.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 27, wobei die Vorrichtung auf der Oberfläche von Partikeln aufgebracht ist.
29. Vorrichtung zur Durchführung eines vorgenannten Verfahrens, umfassend ein flächig ausgebildetes nichtleitendes Rahmenteil (560) , mindestens zwei in dem Rahmenteil (560) integrierte flächig ausgebildete Elektroden (500) sowie ein auf dem Rahmenteil (560) und/oder den Elektroden (500) immobilisiertes nur aus Zufallssequenzen bestehendes DNA-Gemisch
(550) .
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