WO1995014103A1

WO1995014103A1 - Procede de production de diterpene de taxane et procede de recolte de cellules de culture capables de produire du diterpene de taxane a haut rendement

Info

Publication number: WO1995014103A1
Application number: PCT/JP1994/001880
Authority: WO
Inventors: Yukihito Yukimune; Yasuhiro Hara; Yosuke Higashi; Naoto Ohnishi; Homare Tabata; Chuzo Suga; Kouichi Matsubara
Original assignee: Mitsui Petrochemical Industries, Ltd.
Priority date: 1993-11-15
Filing date: 1994-11-09
Publication date: 1995-05-26
Also published as: CN1083011C; US6403343B2; EP1063300B1; DE69433120T2; EP1054065A1; EP1063300A2; CA2153986C; US5968789A; EP1348764A1; KR0172606B1; EP1063299A2; HK1030021A1; DE69426692D1; CN1248630A; US20020012976A1; DE69433120D1; CN1119028A; CN1251391A; DE69431135T2; EP1063299A3

Description

明細書

タキサン型ジテルペンの製造方法及びタキサン型ジテルべン高産生培養細胞の取得方法技術分野

本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソール

(taxol) を含むタキサン（taxane)型ジテルべンの製造方法及びタキサン型ジテルペン高産生培養細胞の取得方法に関する。背景技術

卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソール (Taxol) は、イチィ科イチィ属植物であるタイへィョウイチイ（Taxus brevifolia ΝΙΠΤ) より単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と関連する複雑なエステルグループを有している。タキソ一ルはタイへィョウイチイ植物体中のどの部位にも存在し、その含量は樹皮で最も高いこと力 S報告されている。現在、タキソ一ルは天然の又は栽培された植物体から採取されているが、イチィ属植物は地上 20 c mの高さに成長するのに 10年以上かかる生育の遅い植物であり、また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことから容易に大量のタキソールを得ることは困難である。もし、タキソ一ル又はタキソ一ルの前駆物質であるパッカチン III (baccatin III) 等のタキサン型ジテルペンを組織培養を利用して生産することができれば、樹木を伐採することなく、大量のタキソールを容易に得ることができるので有利である。これまでの植物の培養細胞を利用したタキソ一ル生産法については、タイヘイヨウイチィ（Taxus brevifolia NUH ) 培養細胞による生産法が米国で特許（米国特許第 5019504号）になっているが、そのタキソール生産量は l〜3mg/l と記載されており、工業的生産には不十分である。また、細胞培養によるタキソ一ルの生産性は不安定であり、選抜で一次的に生産性の高い細胞力心得られても、継代培養してその含量を維持することは難しい [E. R. M. ickremesine et al. , World Congress on Cell and Tissue Culture (1992) ] 。

—方、夕キソール生産法の先行技術としては、タキソ一ル生合成前駆体であるパッカチン III からの半合成法が Holtonらの米国特許第 5015744号明細書に開示されている。植物の組織培養法を用いれば、パッカチン III 等の半合成原料の生産も可能であり、前記半合成法によるタキソ一ル生産にも利用できる。発明の開示

本発明の第一の目的は、植物組織培養によるタキサン型ジテルペンの簡便な製造方法を提供することにある。

本発明の第二の目的は、タキサン型ジテルべン高産生培養細胞の取得方法を提供することにある。

本願第一の発明は、タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞をジヤスモン酸類、重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イオン類、重金属ィォン、アミン類及び抗ェチレン剤よりなる群から選ばれた少なくとも一つの存在下に培養し、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法である。

本願第二の発明は、タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気相中の酸素濃度を大気中の酸素濃度未満の条件下に培養初期から制御して培養を行う力 >、或いは組織又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度をその温度における飽和溶存酸素濃度未満である条件下に培養初期から制御して培養を行い、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法である。

本願第三の発明は、タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも一つの層に含まれる細胞を培養し、それらの中からタキサン型ジテルペン高産生培養細胞を選択することを特徴とするタキサン型ジテルべン高産生培養細胞の取得方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の対象となるタキサン型ジテルペンとしては、タキサン骨格を有するジテルペンであれば特に制限はなく、例えばタキソ一ル (taxol) 、 7—ェピタキソール、パッカチン III (baccatin III) 、 7—ェピバッカチン III 、セファロマ二ン（cephalomannine)、 7—ェピセファロマニン、 10—デァセチルバッカチン III 、 10—デァセチルセファロマニン、 10—デァセチル夕キソ一ル、タキサギフイン（taxagiiine)及びその類縁体、タキサン 1 a及びその類縁体、キシロシルセファロマニン、キシロシルタキソール等が挙げられる。

本発明に用いられるタキサン型ジテルべンを産生する植物としては、例えば、セィョウイチイ（Taxus baccata LINN)、ィチイ（T. cus i data SIEB. et ZUCC) 、キャラボク（T. cuspidata SIEB. et ZUCC var. nana REHDER)、タイヘイヨウイチィ（T. brevifolia NUTT) , カナダイチイ（T. canadiensis MARSH) , 中国イチィ (T. chinensis)、 T. media等のイチィ属植物が挙げられる。

本願第一の発明において、前記植物の培養は、植物の組織又は細胞をジャスモン酸類、重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イオン類、重金属イオン、アミン類及び抗ェチレン剤よりなる群から選ばれた少なくとも一つの存在下に培養を行うこと以外は、従来から知られている方法によって行うことができる。

本願第一の発明の対象となるジャスモン酸類としては、一般式（I) ：

[式中、 R^la、 R^]\ R 、 R^la、 R^le及び R "は、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数 1〜6のアルキル基又は炭素数 1〜6のアルコキシ基を表し； R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び R^6aは、それぞ ,水素原子又は炭素数 1〜6のアル -Tリレ基 ¾：し；

C¹ — C² — C³ — C⁴ — C⁵ — C⁶ からなる側鎖は、 1個又は 2個以上の二重結合を含んでいてもよく；

R^SDは水酸基又は一 0-炭水化物残基を表し；

R⁷ は水酸基、 OM (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸ (ここで、 RB は水素原子、炭素数 1〜6のァシル基、炭素数 1~6のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、 0R^S (ここで、 R⁹ は炭素数 1~6のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数 1 〜6のアルキル基を表し；

nは 1〜7の整数を表し；

前記 5員環は、隣接する璟員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物、一般式（II) ：

[式中、 R^la、 R^l R^l R' 1^⁶及び8"は、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数 1〜6のアルキル基又は炭素数 1〜6のアルコキシ基を表し； R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び R⁶ は、それぞれ水素原子又は炭素数 1〜6のアルキル基を表し；

C¹ 一 C² -C³ 一 C⁴ -C⁵ -C⁶ からなる側鎖は、 1個又は 2個以上の二重結合を含んでいてもよく；

R⁷ は水酸基、 0M (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸ (ここで、 R⁸ は水素原子、炭素数 1〜6のァシル基、炭素数 1〜6のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、 OR⁹ (ここで、 FT は炭素数 1~6のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数 1 〜6のアルキル基を表し；

nは 1〜7の整数を表し；

前記 5員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物、及び一般式 (III) ：

(III)

R R¹' (CH₂ ) _n 一 C〇一 R⁷

[式中、 R^la、 R' R^l R^lfl、！^ 及び！^ ま、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数 1〜6のアルキル基又は炭素数 1〜6のアルコキシ基を表し； R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び R⁶ は、それぞれ水素原子又は炭素数 1〜6のアルキル基を表し；

C¹ -C² 一 C³ -C⁴ 一 C⁵ — C⁶ からなる側鎖は、 1個又は 2個以上の二重結合を含んでいてもよく；

R⁷ は水酸基、 OM (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸ (ここで、 R⁸ は水素原子、炭素数 1~6のァシル基、炭素数 1〜6のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、 O R³ (ここで、 R⁹ は炭素数 1〜6のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数 1 ~6のアルキル基を表し；

nは 1〜7の整数を表し；

前記 5員環は、隣接する璟員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物が挙げられる。

前記一般式（ I ) で示されるジャスモン酸類としては、好ましくは一般式 (Γ) ：

[式中、 Rいは水素原子又は水酸基を表し；

C¹ 一 C² 一 C³ -C⁴ — C⁵ — C⁶ からなる側鎖は、 C¹ と C² 、 C² とじ³ 又は C³ と C⁴ の間で二重結合を含んでいてもよく；

R^6bは水酸基又は—◦—炭水化物残基を表し；

R⁷'は水酸基、 OM (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸' (ここで、 R⁸'は水素原子、炭素数 1〜4のァシル基、炭素数 1〜4のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）又は OR^s' (ここで、 R⁹'は炭素数 1~4のアルキル基又は炭水化物残基を表す。 ) を表し； nは 1〜7の整数を表し；

前記 5員璟は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物が挙げられ、前記一般式（Π) で示されるジャスモン酸類としては、好ましくは一般式 (ΙΓ) ：

[式中、 Rいは水素原子又は水酸基を表し；

C 一 C² — C³ — C⁴ 一 C⁵ — C⁶ からなる側鎖は、 C¹ と C² 、 C² と C^: 又は C³ と C⁴ の間で二重結合を含んでいてもよく； R⁷'は水酸基、 OM (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸' (ここで、 R⁸'は水素原子、炭素数 1 4のァシル基、炭素数 1 4のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）又は OR⁹' (ここで、 R³'は炭素数 1 4のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）を表し； nは 1 7の整数を表し；

前記 5員環は、隣接する璟員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物が挙げられ、前記一般式 (III) で示されるジャスモン酸類としては、好ましくは一般式（ΙΙΓ)

(CH₂ ) n - C〇一 R⁷' [式中、 R は水素原子又は水酸基を表し；

C¹ — C² — C³ — C⁴ — C⁵ -C⁶ からなる側鎖は、 C¹ と C² C² とじ³ 又は C³ と ⁴ の間で二重結合を含んでいてもよく；

R⁷'は水酸基、 0M (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸' (ここで、 R⁸'は水素原子、炭素数 1~4のァシル基、炭素数 1 4のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）又は OR⁹' (ここで、 R⁹'は炭素数 1 4のアルキル基又は炭水化物残基を表す。 ) を表し； nは 1 7の整数を表し；

前記 5員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物が挙げられる。

前記一般式（ I ) （II) 及び（III) において、 R^la R¹ R^IC R^lfl R^le R R² R³ R⁴ R⁵ R^B , R^6a R⁷ R⁸ 又は R⁹ で表される炭素数 1 6のアルキル基としては、例えばメチル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、 n -ブチル基、イソブチル基、 sec-ブチル基、 t—ブチル基、 n—ペンチル基、 n—へキシル基が挙げられる。

前記一般式（I ) 、（II) 及び（III) において、 R^la、 R^lb、 R^lc、 R'。、 R^le又は R で表される炭素数 1~6のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、 n—プロポキシ基、イソプロポキシ基、 n—ブトキシ基、イソブトキシ基、 sec-ブ卜キシ基、 t一ブトキシ基、 n—ペンチルォキシ基、 n—へキシルォキシ基が挙げられる。

R⁷ が 0Mである場合において、 Mで表されるアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げられる。

R⁷ が NHR⁸ である場合において、 R^B で表される炭素数 1〜 6のァシル基は、直鎖、分岐鎖のいずれでもよく、例えばホルミル基、ァセチル基、プロピオニル基、プチリル基、バレリル基、へキサノィル基、ァクリロイル基が挙げられる。

R⁷ が NHR⁸ である場合において、 R^B で表されるアミノ酸残基としては、イソロイシル基、チロシル基、トリブトフィル基が挙げられる。

R⁷ が OR³ である場合において、 R⁹.で表される炭水化物残基、及び前記一般式（I) において R^ebがー 0—炭水化物残基である場合における炭水化物残基としては、グルコビラノシル基が挙げられる。

また、前記一般式（I ) 、（II) 及び (III) で示される化合物においては、 5 員環は、隣接する璟員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。

前記一般式（ェ）で示される化合物の具体例としては、以下に示す化合物が挙げられる。

(化合物 A)

(ッベロン酸メチル）

(化合物 C)

(化合物 D)

ί 一般式（II) で示される化合：具体例としては、以下に示す化合物が挙げ :しる。 (化合物 E)

(ククルビン酸）

(化合物 F)

(ククルビン酸メチル）

(化合物 G)

(化合物 H)

前記一般式 (III) で示される化合物の具体例としては、以下に示す化合物が挙げられる。

(化合物 I )

R^la， R^Ib, R^lc， R'。， R^le, R ^If, R² R³ ， R⁴ ， R^s ， R H C³ と C⁴ の間で二重結合形成

R⁷ ：— OH又は一 OCH₃

n： 1〜 3

(化合物 J)

R^la， R^l R^lc， R^1<3， R^le, R^,f, R² R³ ， R⁴ ， R⁵ , R⁶ ： H R⁷ ： -OH

n ： 1

前記一般式（III) で示される化合物において、 R^la、 R' R^lc、 R'\ R^Ie 又は R ^lfが水酸基である化合物、又は 5員環において隣接する環員炭素原子間で二重結合が形成された化合物の具体例としては、.例えば、以下に示す化合物が挙げられる。

(化合物）

(1) n= 1 , R = H

(2) n = 7, R = H

(3) n= 7, R = 0H

(化合物し）

(1) R = H

(2) R =〇H

(化合物 M)

(化合物 N)

前記一般式（I ) 、（II) 又は（III) で示される化合物の好ましいものとしては、 R^la、 R^lb、 R^lc、 R^l R^le、 R^lf、 R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び R⁶ が水素原子であり、 R⁷ が水酸基又はメトキシ基であり、 C¹ -C² — C³ - C⁴ — C⁵ — C⁶ からなる側鎖が、二重結合を含まないか、あるいは C¹ とじ² 、

2 c² と C³ 又は C³ と C⁴ の間で二重結合を含む化合物力挙げられる。

本発明で使用される前記一般式（I) 、（II) 又は（III) で示されるジャスモン酸類には種々の立体異性体（シストランス異性体、光学異性体）が存在するカ^ それぞれの異性体を単独で用いても、混合物の形で用いてもよい。

以上のジャスモン酸類は、全てタキサン型ジテルペンの生産性向上に効果を有するが、中でも前記一般式（ I ) 、（II) 及び（III) において、 R^la、 R'\ R^lc、 R^l R^le、 R^lf、 R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び R⁶ が水素原子であり、 R⁷ が水酸基又はメトキシ基であり、 nが 1であり、 C³ と C⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物であるッベロン酸、又はッベロン酸メチル、ククルビン酸又はククルビン酸メチル、及びジャスモン酸又はジャスモン酸メチルが生産性向上に対する効果の大きさの点から特に好ましい。

これらジャスモン酸類は、合成により、又は植物からの抽出等により調製される（H.Yamane et al.. Agric. Biol. Chem. , 44, 2857-2864 (1980) ) 。

一方、ジャスモン酸類は、生長促進や組織の成熟、病害抵抗性の発現にかかわる諸反応を誘起する植物ホルモン様物質として、種々の植物が自ら生産すること、吉原照彦著、植物細胞工学第 2巻第 4号 523〜531 頁（1390年）に記載されている。

従って、本発明に係るジャスモン酸類は、培養系外から添加するほかに、使用する培養細胞又は培養組織に自ら生産させることもできる。この内在性ジャスモン酸類の培養細胞又は培養組織による生産を促進する方法としては、微生物の培養物又はその抽出物、熱処理物あるいは植物抽出物などの培地への添加を例示することができ、具体的には M.丄 Mueller et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90 (16), 7490-7494 (1933)に記載の、カビ細胞壁画分を添加する方法を例示することができる。また、使用する培養細胞又は培養組織に、機械的に又は紫外線、熱などによって部分的に傷害を与えることによつても、内在性ジャスモン酸の生産量を高めることが可能であり、具体的には、 R.A.Cleeman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89 (11), 4938-4941 (1989) に記載の、機械的に一部の細胞を破壊する方法を例示することができる。

ジャスモン酸類は、水に対して難溶性のため、通常エタノール、メタノール等の有機溶媒、又は界面活性剤等に溶解した後、培地に添加する。また、遊離形のジャスモン酸類は、そのまま用いてもよいし、アルカリで中和して塩にして用いてもよい。

ジャスモン酸類のうち、前記式（ I ) 又は（III) で示される化合物は、 5員環カルボニル基の _α位が、酸、アルカリ、熱によってェピマ一化を起こすため、不安定なシス型より安定なトランス型になりやすい。天然又は合成ジャスモン酸を用いた平衡実験では、トランス型が 9 0 %、シス型が 1 0 %の状態で存在する。一般にはシス型の方が活性が強いとされている力本発明で使用されるジャスモン酸類は、前記式（I ) 又は（III) で示される全ての立体異性体化合物及びその混合物を包含する。

ジャスモン酸類は、培地における濃度が 0. 01~ 1000 μ Μとすること力必要であり、この中でも特にジャスモン酸類の濃度を 0. 1 〜500 Μの範囲に調整することが本願第一の発明の方法にとって好ましい。 .

植物細胞培養物にジャスモン酸類を添加して一部の二次代謝産物が誘導されることはドイツで特許公告 [DE 4122208 C1 ] になっているが、タキサン型ジテルぺン産生植物の組織培養において培地添加物としてジャスモン酸類を存在させて組織培養を行った例は幸 ¾告されておらず、当該特許中に開示されている二次代謝産物とは生合成経路や生合成制御機構が全く異なるタキサン型ジテルぺンの産生量が本願第一の発明の方法によって増大することは予想外のことであった。また、本発明で使用される前記式（I ) 、（II) 又は（III) で示されるジャスモン酸類と構造的に類似したジャスモン又はメチルジャスモンが夕キソ一ルの生産誘導に効果があることが国際公開 TO 93/17121 号公報に記載されている。しかしながら、これらの化合物は、前記ジャスモン酸類と異なり、前記式（ I ) 、

(II) 又は（III) において、式： ― （C H ₂ ) n — C O— R ⁷ で示されるカルボキシル基等を有しておらず、これらのタキソール誘導活性は低いものであった

(比較例 24参照）。

本願第一の発明の対象となる重金属類としては、銅族（the copper group)或いは鉄族（the iron group)に属する重金属類であれば特に限定するものではない、銅族に属する金属類としては特に銀を使用することが好ましく、また鉄族に属する金属類としてはコバルトを使用することが好ましい。更に、銀或いはコバル卜を使用する際は、当該重金属類を含む化合物、当該金属類を含む錯イオン類、又は当該金属イオンの形で使用することが好ましい。また、これらの化合物等は、それぞれ単独で使用してもよく、組み合わせて使用してもよい。

銀を含む化合物類としては、例えば硝酸銀、或いは硫酸銀、或いはフッ化銀、或いは塩素酸銀、或いは過塩素酸銀、或いは酢酸銀、或いは亜硫酸銀、或いはへキサフルォロリン（V) 酸銀、或いはテトラフルォロホウ酸銀、或いはジァミン銀（I ) 硫酸塩、或いはジァミノ銀（I ) 酸カリウム等の化合物類を例示することができる。これらの中でも特に硝酸銀、硫酸銀等を好適な化合物類として例示できる。

銀を含む錯イオン類としては、例えば [Ag(S₂0₃)₂]³_ 、或いは [Ag(S₂0₃) ₃]⁵一、或いは [Ag( H₃)₂]+ 、或いは [Ag(CN)₂]-、或いは [Ag(CN)3]²— 、或いは

[Ag(SCN)₂]一、或いは [Ag(SCN)₄]³-の等の錯イオン類を例示することができる。これらの中でも特に [Ag(S₂0₃)₂]³— 、 [Ag(S₂0₃)₃]^s— 等を好適な錯イオン類として例示できる。

コバルトを含む化合物としては、例えば塩化コバルト、或いは硝酸コバルト、或いは硫酸コバルト、或いはフッ化コバルト、或いは過塩素酸コバルト、或いは臭化コバルト、或いはヨウ化コバルト、或いはセレン酸コバルト、或いはチオシアン酸コバルト、或いは酢酸コバルト、或いは硫酸アンモニゥムコバルト、或いは硫酸コバルト（Π) カリウム、或いはへキサアンミンコバルト（III) 塩化物、或いはペン夕アンミンアクアコバルト（III) 塩化物、或いはニトロペン夕アンミンコバルト（III) 塩化物、或いはジクロロテトラアンミンコバルト（III) 塩化物半水和物、或いはジニトロテトラアンミンコバルト（III) 塩化物、或いはカルボナ卜テ卜ラアンミンコノレ卜（in) 塩化物、或いはテトラニトロジアンミンコバルト（III) 酸アンモニゥム、或いはへキサニトロコバルト（III) 酸ナトリウム、或いはトリス（エチレンジァミン）コバルト（III) 塩化物三水和物、或いはジクロロビス（エチレンジァミン）コバルト（III) 塩化物、或いはトリス（ォキサラト）コバルト（III) 酸カリウム三水和物、或いはへキサシァノコバルト（III) 酸カリウム、或いは（エチレンジアミンテトラァセタト）コノ^レ卜（III) 酸力リウムニ水和物、或いはヒドリドテ卜ラカルボニルコバルト（I ) 、或いはジカルボニル（シクロペンタジェニル）コバルト（I ) 、或いはォクタカルボニルニコバル卜（0 ) 、或いはへキサカルボニル（アセチレン）ニコバルト（0 ) 、ビス（シクロペンタジェニル）コバルト（I ) 、或いは（シクロペンタジェニル）（1， 5-シクロォクタジェン）コバルト（ I ) 等の化合物類を例示することができる。これらの中でも特に塩化コバルト、硝酸コバルト、硫酸コバルト等を好適な化合物類として例示できる。

コバルトを含む錯イオン類としては、ペンタアンミンアクアコバルトイオン、或いはニトロペン夕アンミンコバルトイオン、或いはジクロロテ卜ラアンミンコノ υレ卜イオン、或いはジニ卜口テ卜ラアンミンコバルトイオン、或いはカルボナトテトラアンミンコバルトイオン、或いはテトラニトロジアンミンコバルトィォン、或いはへキサニトロコバルトイオン、或いはトリス（エチレンジァミン）コノレ卜イオン、或いはジクロロビス（エチレンジァミン）コノ \ 'ル卜イオン、或いはトリス（ォキサラ卜）コノルトイオン、或いはへキサシァノコバルトイオン、或いは（エチレンジアミンテトラァセタト）コバルトイオン等の錯イオン類を例示することができる。

前記重金属類の内、銀を含む化合物類、銀を含む錯イオン類、又は銀イオンは、培地における濃度が 10_ ^ΒΜ〜10- 'Μ とすることが好ましく、特に 10— ⁷Μ〜 10— ²Μ の範囲に調整することが更に好ましい。またコバルトを含む化合物類、コバルトを含む錯イオン類、又はコバルトイオンは、培地における濃度が 10— ⁶〜 ΙΟ- ' とすること力子ましく、特に 10— ⁵〜10— の範囲にすることが更に好ましい。

従来、タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織培養に於いて、培地添加物として銀を含む化合物類、銀を含む錯イオン類、又は銀イオンを存在させて組織培養を行った例は報告されていない。またコバルトを含む化合物、又はコバルトイオン類は、イチィ属植物の組織培養用の培地として一般に用いられる培地、例えばリンスマイヤ一 ·スク一グ [Linsmaier Skoog ] の培地、或いはムラシゲ. スクーグ [Murashige Skoog 〗の培地、或いはガンボルグ [Gamborg 〗の8— 5 培地等に培地成分の一つとして含まれているが、当該濃度は 1 Χ 1(Γ ⁷Μ〜4 x 10-⁷ と〔最新バイオテクノロジー全書編集委員会編、木本植物の増殖と育種、農業図書、 P265-268] 、本発明の方法に比べて極めて低い濃度で使用されてい' る。一方、本願第一の発明の如くタキサン型ジテルペンを産生する植物の組織培養に於いて、高濃度のコバルトを含む化合物、又はコバルトイオン類を存在させて組織培養を行った例は、上述の銀化合物同様報告されていない。しかもこれら重金属類存在下で培養することによりタキサン型ジテルペンの産生量が増大することは予想外のことであった。

本願第一の発明において、ァミン類とは、ァミン又はその塩を意味する。本願第一の発明の対象となるアミン類としては、モノアミン類或いはポリアミン類のいずれも利用可能であるが、特にポリアミン類を使用すること力子ましい。

更に、本願第一の発明の対象となるアミン類としては、アルキル基の一部の水素が水酸基で置換されていてもよいモノ、ジ又はトリアルキルァミン、例えばメチルァミン、ェチルァミン、ジメチルァミン、ジェチルァミン、トリェチルアミン、ジエタノールァミン、卜リエ夕ノールァミン、もしくはそれらの塩；或いはポリメチレン部がイミノ基で中断されていても良く、ァミノ基の H力低級アルキル基で置換されていてもよいポリメチレンジァミン、例えばブトレツシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、エチレンジァミン、 Ν,Ν-ジェチル- 1,3- ブ口パンジァミン、卜リエチレンテ卜ラミン、もしくはそれらの塩；或いは環状ァルキルァミン、例えばシクロペンチルァミン、シクロへキシルァミン、もしくはそれらの塩、或いはメセナミン、ピぺラジン等の環状アミン、もしくはそれらの塩が挙げられる。これらァミン類の内で好ましいものとしては、例えばブトレツシン [M₂ (CH₂)₄NH₂] 、カダベリン〔NH₂ (CH₂) ₅NH₂] 、スペルミジン

[NH₂ (CH₂) ₃NH(CH₂) 4NH₂] 、スペルミン [NH₂ (CH₂) ₃NH (CH₂) ₄NH (CH₂) _SNH₂] 、エチレンジァミン〔NH₂ (CH₂) ₂ H₂] 、 Ν,Ν-ジェチル- 1,3- プロパンジァミン

[ (C₂H₅) ₂N(CH₂) ₃NH₂ 〗、ジエチレン卜リアミン〔NH₂ (CH₂) ₂NH(CH₂) ₂NH₂] 等のポリアミン類、もしくはそれらの塩を例示することができる。

前記アミン類は、培地における濃度が 10— 〜10— 'Μ とすること力好ましく、この中でも特に 10-⁷Μ〜10— ²Μの範囲に調整することが更に好ましい。

植物の組織培養物にアミン類を添加して二次代謝産物が誘導されることを示した例としては、二チニチソゥの培養細胞にアミン類を添加することで、インドールアルカロイドの産生力誘導されることを示した、特開平 4— 2 6 2 7 8 8号公報を例示することができる。しかしながら、二チニチソゥとは植物種の異なる、タキサン型ジテルペン産生植物の組織培養に於いて、培地添加物としてアミン類を存在させて組織培養を行った例は報告されておらず、しかもそれによりインド一ルアルカロイドとは生合成経路の全く異なるタキサン型ジテルべンの産生量が増大することは予想外のことであった。

本願第一の発明の対象となる抗エチレン剤としては、培養物のエチレン生合成機構を阻害するか、及び Z又は該培養物内に貯留するかもしくは該培養物を含む培養器内の気相中或いは培地中に存在するェチレンを除去する物質であれば特に限定するものではない。

ェチレン生合成機構を阻害する方法としては、例えば S—アデノシルメチォニンから 1一アミノシクロプロパン一 1—カルボン酸への変換を触媒する酵素の活性を阻害するか、或いは 1一アミノシクロプロパン— 1一力ルボン酸からェチレンへの変換を触媒する酵素の活性を阻害する方法力 s例示され、前者の機能を有する化合物としては、例えばアミノォキシ酢酸、ァセチルサリチル酸、リゾビトキ' シン（Rhizobitoxine) 、アミノエトキシビニルグリシン、メ卜キシビニルグリシン、 α—ァミノイソ酪酸、 2， 4—ジニトロフエノール等を挙げることができる。また、前記に例示する化合物の塩、エステル、アミノ酸誘導体、炭水化物誘導体であってもよい。

塩としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム塩、ェステルとしては、例えばメチル、ェチル、プロピル、ブチルエステル、アミノ酸誘導体としては、例えばグリシン、メチォニン、フヱニルァラニン誘導体、炭水化物誘導体としては、例えばグルコース、マルトース誘導体等が挙げられるが、本発明に係る物質の塩、エステル、アミノ酸誘導体、炭水化物誘導体は当該化合物類に限定されるものではない。

また後者の機能を有する化合物としては、例えば没食子酸、並びに当該化合物の塩、エステル、アミノ酸誘導体及び炭水化物誘導体を挙げることができる〔兵藤宏、昭和 62年度園芸学会秋季大会、シンポジウム講演要旨、 p. 122、倉石晋、植物ホルモン、東京大学出版、 p. Ill ) 。

ここで塩としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム塩、エステルとしては、例えばメチル、ェチル、プロピル、ブチルエステル、ァミノ酸誘導体としては、例えばグリシン、メチォニン、フエ二ルァラニン誘導体、炭水化物誘導体としては、例えばグルコース、マルトース誘導体等が挙げられるが、本発明に係る物質の塩、エステル、アミノ酸誘導体、炭水化物誘導体は当該化合物類に限定されるものではない。

更に、培養物内に貯留するか、又は該培養物を含む培養器内の気相中もしくは培地中に存在するエチレンを除去する物質としては、例えば 1， 5 —シクロォクタジェン、並びにイソチォシアン酸及び当該化合物の塩、エステル（例えばァリルイソチオシァネー卜、ベンジルイソチオシァネート）、アミノ酸誘導体及び炭水化物誘導体を挙げることができる〔宗像恵、植物の化学調節， ^ (1) , 89-93 (1994) ] 。

ここで塩としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム塩、エステルとしては、例えばメチル、ェチル、プロピル、ブチル、ァリルエステル、アミノ酸誘導体としては、例えばグリシン、メチォニン、フエ二ルァラ二ン誘導体、炭水化物誘導体としては、例えばグルコース、マル卜ース誘導体等が挙げられる力本発明に係る物質の塩、エステル、アミノ酸誘導体、炭水化物誘導体は当該化合物類に限定されるものではない。

抗エチレン剤は、培地における濃度が 10— ^ΒΜ 〜10- 'Μ とすることが必要であり、この中でも特に抗ニチレン剤の濃度を iO_ ⁷M ~10" ²M の範囲に調整することが好ましい。

ェチレンは植物ホルモンの一つであり、個体の生長や形態形成或いは老化等、植物内で引き起こされる様々な生理現象に関与することが知られている。また植物の二次代謝産物産生能の向上にエチレンを利用した例としては、例えば Kim, Dong n et al. , Biotechn l . Bioeng. , 38 (4) , 331-339 (1991) に記載の報告を例示することができる。しかしながら、エチレンの制御を二次代謝産物の生産性向上に利用した事例は、前記記載の報告に代表されるように、そのいずれもが植物の組織培養物へのェチレン供給による制御であり、本発明にかかる方法の如くェチレン産生の抑制的な制御を二次代謝産物の生産向上に利用した事例は、現在に至るまで報告されていない。

更に抗エチレン剤は、鮮度保持剤として花卉或いは青果物等に一般的に使用されているが、当該抗エチレン剤を二次代謝産物の生産向上の目的で使用した例は報告されていない。

かかる状況の下、本発明者らはタキサン型ジテルペンを産生する植物の組織及び細胞においては、エチレンがタキサン型ジテルペンの産生能を著しく阻害することを突き止めた。そこで前記知見をふまえ、該組織培養物を抗エチレン剤の存在下で培養した結果、抗ェチレン剤が当該阻害を抑制するのみならず該培養物由来のタキサン型ジテルペンの生産量を飛躍的に向上させる効果を有することを見いだした。タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織培養物を抗エチレン剤の存在下に培養する事で、タキサン型ジテルペンの生産を誘導した例は報告されておらず、しかも本願第一の発明の方法によつて当該二次代謝産物の生産性が増大することは予想外のことであった。

本願第一の発明に使用される培地としては、従来から知られている植物の組織培養に用いられる培地、例えばムラシゲ ·スクーグ（1962 年） [Murashige h Skoog ] の培地、リンスマイヤー 'スクーグ（1965 年） [Linsmaier Skoog ] の培地、ゥッディ一 'プラント 'メディゥム（1981 年） [Woody Plant Medium] 、ガンボルグ [Gamborg ] の B - 5培地、三井の M— 9培地等が挙げられる。

これら培地に植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、アミノ酸等を添加することもできる。

炭素源としては、シュクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら糖源の 2種類以上を適当な比率で混合したものを使用できる。

無機成分としては、例えばリン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシゥム、ィォゥ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナ卜リウム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合物として添加できる。

植物ホルモンとしては、例えばインドール酢酸（IAA) 、ナフタレン酢酸 (NAA) 、 2 , 4—ジクロロフエノキシ酢酸（2, 4- D) 等のオーキシン類、カイネチン、ゼァチン、ジヒドロゼァチン等のサイトカイニン類が用いられる。

ビタミン類としては、例えばピオチン、チアミン（ビタミン B _t ) 、ピリドキシン（ビタミン B ₆ ) 、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用いられる。

アミノ酸類としては、例えばグリシン、フエ二ルァラニン、ロイシン、グルタミン、システィン等を添加できる。

一般に前記の各成分は、炭素源が約 1〜約 30g/l 、無機成分が約 Ο. Ι μ Μ〜約 lOOmM 、植物ホルモン類力'約 0. 01〜約 10 ti M 、ビタミン類及びアミノ酸類がそれぞれ約 0. 1〜約 lOOmg/1 の濃度で用いられる。

なお、本発明には液体培地及び寒天やゲランガム等を通常 0. 1〜1 %含有する固形培地のいずれも使用できるが、通常は液体培地が好ましい。

本発明における組織培養においては、前記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片又は細胞、あるいは.これらを前記培地又は他の従来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用することができる。

た本発明は、 Agrobacterium tumefaciens或いは Agrobacterium rhizogenes を植物組織に感染することによって得られる腫瘍細胞及び Z又は毛状根にも適用できる。

これらの組織又は細胞をジャスモン酸類、重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イオン類、重金属イオン、アミン類及び抗ェチレン剤よりなる群から選ばれた少なくとも一つの存在下に培養すると、通常の培養条件下で組織培養した場合と比較して、タキサン型ジテルべン生産性の高レ、培養組織又は培養細胞が得られる。

重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イオン類、重金属イオン、アミン類及び抗エチレン剤よりなる群から選ばれた少なくとも一つと前記一般式（I ) 、 (II) 又は（III) で示されるジャスモン酸類とを併用すると、本願第一の発明の効果を高めることができる。

以上のようにして得られた培養組織、培養細胞、培地等の培養物から、メタノール等の有機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを分離することができる。また、培地中に適当な吸着剤や有機溶媒を共存させ、培養中連続的にタキサン型ジテルペンを回収することもできる。

本発明における組織培養の好ましい一例としては、次の方法が挙げられる。先ず、イチィ属に属する植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたゥッディー 'プラン卜

•メディゥム上に置床し、 10〜35°Cで 14〜60日程度経過させて組織片の一部を力ルス化させる。このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速度力斬次高まり安定化したカルスが得られる。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカルスの一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態を保持する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものをいう。

この安定化したカルスを増殖に適した液体培地、例えば液体ゥッディー ·ブラン卜 ·メディゥムに移して増殖させる。液体培地において更に生育速度力 '高められる。本発明では、この安定化したカルス又は該カルスを構成する細胞は、ジャスモン酸類、重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イオン類、重金属イオン、ァミン類及び抗ェチレン剤よりなる群から選ばれた少なくとも一つの存在下に固体培地又は液体培地で培養される。また、この安定化カルス又は該カルスを構成する細胞は、比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも 1つの層に含まれる細胞をジャスモン酸類、重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イオン類、重金属イオン、アミン類及び抗ェチレン剤よりなる群から選ばれた少なくとも一つを含有する培地で培養してもよい。

細胞を比重によって分離する方法としては、一般に遠心分離用媒体を用いて密度勾配を作成し、細胞を重層した後、遠心分離する方法が知られている。

遠心分離用媒体としては、 Ficoll、 Percoll (共に Pharmacia LKB

Biotechnology社製）、ショ糖、塩化セシウム等が用いられる。実施例 5等では、 Ficollを用いて密度勾配を作成したが、細胞に傷害を与えないものであれば特に制限はない。

密度勾配を形成する層の数に特に制限はない。各層の比重差は、特に限定されるものではなく、また各比重差は同じであっても異なっていてもよい。

従って、この密度勾配の定義には勾配力 S連続的に変化する場合（密度勾配を形成する層の数力 s'無限大、各層の比重差が 0に近い状態）も含む。

このようにして密度勾配を形成し、細胞を重層、遠心分離することにより細胞を比重の違いにより複数の層に分けることができる。

作成する層の比重は、通常1. 00〜1. 20 /1!11、好ましくは 1. 03〜l . l lg/mlの範囲である。培養の対象となる層としては、少なくとも 1つの層を選択し、また全ての層を選択して培養してもよい。

複数の層を選択して培養する場合、これらの複数の層は、それぞれ個別に培養することもできるが、選択した複数の層のうちの 2層以上の層を混合して培養することもできる。

タキサン型ジテルペン産生能の高い培養細胞は、通常、比重が 1. 07以下の層に含まれる細胞を培養して得られるが、培養する細胞や培養の条件により変動する場合があり、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。また、単に比重の違いによって分画しただけでは、比重の高い層の細胞の方がタキサン型ジテルペン含量が高くなる傾向が認められる。従って、より確実にタキサン型ジテルペン高産生培養細胞を取得するためには、分画された全ての層の細胞を一定期間培養した後、各層の細胞に含まれるタキサン型ジテルペン濃度を測定し、それらの中からタキサン型ジテルべン高産生細胞を含む層を選択すること力望ましい。

また、例えば i . 07g/mlのように、ある 1つの特定の比重の遠心分離媒体を作成し、前述の方法で遠心分離することによつても、培養細胞を比重の違いにより複数の層に分けることができる。

更に、本願第一の発明は、本願第二の発明である、培養器内の気相中の酸素濃度を培養初期より大気中の酸素濃度未満の条件下に制御して培養を行うか、或いは組織又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度を培養初期よりその温度に於ける飽和溶存酸素濃度未満である条件下に制御して培養する方法とも併用することができる。ここで、培養初期とは、培養開始時ないし培養開始後 7日目をいい、培養器内の気相中の酸素濃度、又は組織もしくは細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度の制御は、培養開始時から行うことが好ましい。また、制御の期間としては、培養全期間を通して該条件に制御してもよいし、培養全期間中の一部期間のみを制御してもよく、特に限定するものではないが、全培養期間中の、少なくとも 3日間制御すること力'好ましい。

培養器内の気相中の酸素濃度は、 4ないし 15%に制御すること;^必要であり、特に 6ないし 12%に制御すること力子ましい。また、流動性の培地中の溶存酸素濃度は、その温度における飽和溶存酸素濃度値の 1ないし 75%に制御することが必要であり、特に 10ないし 75%に制御すること力好ましい。

本願第一の発明と、本願第二の発明及び本願第三の発明との 3つの方法をすベて組み合わせることも可能である。

本願第一の発明において、ジャスモン酸類は、培養細胞の対数増殖期（exponen tial growth phase)ないし定常期に添加することが効果的であり、この中でも特に対数増殖期から定常期に移行する時期にジャスモン酸類を添加することが好ましい。また、内在性ジャスモン酸類の生産量を高めるための処理の時期についてもこれと同様である。例えば、 21日おきに細胞を移植している場合には 7〜16日目がジャスモン酸類の添加又は内在性ジャスモン酸類の生産量を高めるための処理の適期にあたり、対数増殖期、例えば 7〜i4日目の細胞を移植する際には、移植直後が適期にあたる。また、ジャスモン酸類の添加及び内在性ジャスモン酸類の生産量を高める処理は、一度に行っても、複数回に分けて行ってもよいし、また連続的に行ってもよい。

重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イオン類、又は重金属イオンは、培養開始時ないし培養細胞が対数増殖期から定常期に移行する B寺期までに添加することが効果的であり、特に培養開始時に添加すること力好ましい。また当該化合物又はイオンの添加は、一度に行っても良いし、数回に分けて行っても良い。アミン類は、細胞力³'対数増殖期から定常期に移行する時期までに添加することが効果的であり、特に培養開始時に添加することが好ましい。また当該化合物は、一度に行ってもよいし、数回に分けて行ってもよい。抗ェチレン剤は、細胞が対数増殖期から定常期に移行する時期までに添加することカカ果的であり、特に定常期に移行した直後に添加する事力好ましい。また当該化合物は、一度に行っても良いし、数回に分けて行っても良い。

本願第一の発明における組織培養の培養温度としては、通常は約 10〜約 35°C、特に約 23〜28°Cが増殖速度が大きいので好適である。また、培養期間としては、 14〜42日間が好適である。

本願第一の発明における培養において液体培地を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーシヨンまたは濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞および,または培地から目的とする汐キサン型ジテルべンを有機溶媒による抽出等の方法によって分離することができる。

以下、本願第二の発明について説明する。

本願第二の発明において、植物の培養は、植物の組織又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気相中の酸素濃度を大気中の酸素濃度未満の条件下に培養初期から制御して培養を行う力或いは組織又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度をその温度における飽和溶存酸素濃度未満である条件下に培養初期から制御して培養を行うこと以外は、従来から知られている方法によって行うことができる。

従来、タキサン型ジテルペン産生植物の培養において、組織又は細胞を培養する培養器に供給する気相中の酸素濃度、或いは組織又は細胞と接する培地の溶存酸素濃度を、大気中の酸素濃度未満の条件下に制御して培養を行うか、或いは飽和溶存酸素濃度未満の条件下に制御して培養を行った例は報告されておらず、しかもそれにりタキサン型ジテルべンの産生量が増大することは予想外のことであつ 7こ。

本願第二の発明において、組織又は細胞を培養する培養器内の気相中の酸素濃度は、 4ないし 1：； 'に制御することが必要であり、特に 6ないし 12%に制御することが好ましい。また、組織又は細胞と接する流動性の培干の溶存酸素濃度は、その温度における飽和溶存酸素濃度値の 1ないし 75%に制御すること力 s'必要であり、特に 10ないし 75%に制御すること力好ましい。

本願第二の発明に使用される培地としては、従来から知られている植物の組織培養に用いられる培地、例えばムラシゲ ·スクーグ（1962 年） [Murashige & Sk oog ] の培地、リンスマイヤ一 ·スクーグ（1965年） [Linsmaier Skoog ] の培地、ゥッディー 'ブラント ·メディゥム（1981 年） [Woody Plant Medium] 、ガンボルグ [Gamborg ] の B— 5培地、三井の M— 9培地等が挙げられる。

炭素源としては、シュクロース、マルトース、ラク卜ース等の二糖類、グルコ —ス、フルク卜ース、ガラク卜ース等の単糖類、デンプン或いはこれら糖源の 2 種類以上を適当な比率で混合したものを使用できる。

無機成分としては、例えばリン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシゥム、ィォゥ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合物として添加できる。

植物ホルモンとしては、例えばインドール酢酸（IAA) 、ナフタレン酢酸 (NAA) 、 2 , 4 —ジクロロフエノキシ酢酸（2, 4- D) 等のオーキシン類、カイネチン、ゼァチン、ジヒドロゼァチン等のサイトカイニン類が用いられる。

ビタミン類としては、例えばピオチン、チアミン（ビタミン B , ) 、ピリドキシン（ビタミン B ₆ ) 、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用いられる。

アミノ酸類としては、例えばグリシン、フエ二ルァラニン、ロイシン、グル夕ミン、システィン等を添加できる。

一般に前記の各成分は、炭素源が約 1〜約 30g/l 、無機成分が約 0. 1 M〜約 100 、植物ホルモン類力⁵'約 0. 01〜約 10 、ビタミン類及びァミノ酸類がそれぞれ約 0. 1 〜約 100mg/i の濃度で用いられる。

なお、本願第二の発明には液体培地及び寒天やゲランガム等を通常 0. 1 〜1 % 含有する固形培地のいずれも使用できる。

本願第二の発明における組織培養においては、前記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、力等の組織片又は細胞、或いはこれらを前記培地或いは他の従来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用することができる。

また、本願、第—の発日月は、 A robacterium tumefaciens 又は Agrobacterium による感染によって得られる腫瘍細胞及び又は毛状根に適用することもできる。

これらの組織又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気相中の酸素濃度を大気中の酸素濃度未満の条件下に培養初期から制御して培養を行うか、或いは組織又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度をその温度における飽和溶存酸素濃度未満である条件下に培養初期から制御して培養を行うと、通常の培養条件下で組織培養した場合と比較してタキサン型ジテルべン生産性の高い培養組織又は培養細胞力得られる。 '

本願第二の発明において、培養初期とは、培養開始時ないし培養開始後 7曰目をいい、培養器内の気相中の酸素濃度、又は組織又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度の制御は、培養開始時から行うことが好ましい。

また、制御の期間としては、培養全期間を通して該条件に制御してもよいし、培養全期間中の一部期間のみを制御してもよく、特に限定するものではないが、全培養期間中の、少なくとも 3日間制御することが好ましい。

本願第二の発明の製造方法は、各種のタキサン型ジテルペンの生産促進物質の存在下に培養する方法と併用することにより、タキサン型ジテルペンの生産性を更に高めることができる。

タキサン型ジテルペンの生産促進物質としては、例えば、前述した本願第一の発明に用いる前記一般式（I ) 、（II) 又は（III) で示されるジャスモン酸類、重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イオン類、重金属イオン、アミン類、抗エチレン剤が挙げられる。

また、本願第二の発明は、後において詳述する本願第三の発明である、細胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも 1つの層に含まれる細胞を培養する方法と併用することもできる。

また、本願第二の発明の製造方法は、前述したジャスモン酸類等の存在下に培養する本願第一の発明の方法と細胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも 1つの層に含まれる細胞を培養する本願第三の発明の方法の両者と併用することもできる。

以上のようにして得られた培養組織、培養細胞、培地等の培養物から、メタノ一ル等の有機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを分離することができる。

本願第二の発明における組織培養の好ましい一例としては、次の方法が挙げられる。

先ず、イチィ属に属する植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたゥッディー 'プラント •メディゥム上に置床し、 10〜35°Cで 14〜60日程度経過させて組織片の一部を力ルス化させる。このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速度力 S漸次高まり安定化したカルスが得られる。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカルスの一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態を保持する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものをいう。

この安定化したカルスを増殖に適した液体培地、例えば液体ゥッディー ·ブラント ·メディウムに移して増殖させる。液体培地において更に生育速度が高められる。本発明では、この安定化したカルス又は該カルスを構成する細胞は、培養器内の気相中の酸素濃度が大気中の酸素濃度未満に培養初期から制御されているか、或いは組織及び Z又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度がその温度における飽和溶存酸素濃度未満に培養初期から制御された培養条件下にて培養される。

組織又は細胞は、酸素を消費（呼吸）することで自らの個体の維持又は増殖に必要なエネルギーを獲得する。一般に組織又は細胞を培養すると、培養日数の経過に伴い細胞量力曽加し、これと共に酸素の消費量も増加することが知られている。従って、系外から強制的に通気ガスを供給しない限り、組織又は細胞を含むフラスコ等の培養器内の気相中の酸素濃度、或いは組織又は細胞と接する培地中の溶存酸素濃度も、培養日数の経過に伴い自然に大気中の酸素濃度未満、或いはその温度における飽和溶存酸素濃度未満の値に低下して行くこととなる。

本発明は、組織又は細胞を含む培養器内の気相中の酸素濃度或いは培地中の溶存酸素濃度を、大気中の酸素濃度未満か或いはその温度における飽和溶存酸素濃度未満である条件下に積極的に制御した条件下で培養を行うという点で前述の知見とは内容を異にする。

特に本発明の効果を高める方法として、培養器内の気相中の酸素濃度或いは流動性の培地中の溶存酸素濃度を、組織又は細胞を該培養器内に移植するより前に、予め大気中の酸素濃度未満か或いはその温度における飽和溶存酸素濃度未満に制御する方法が例示される。

また、制御の期間としては、前述したように、特に制限はないが、全培養期間中の、少なくとも 3日間制御すること力 s好ましい。 .

更に制御の方法としては、組織又は細胞を含む培養器内の気相中の酸素濃度、或いは組織又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度を、大気中の酸素濃度未満か、或いはその温度における飽和溶存酸素濃度未満に制御可能な培養条件下であれば特に制限はなく、例えば空気に窒素等を混合して酸素濃度を低下させることにより酸素濃度を調節した気体を、培養器内の気相中及び又は培地中に直接通気するか、或いは通気槽等の培養器外で培地中に直接通気した後、該培地を培養器内に灌流する力或いは該培養器内に供給する空気等の気体を供給速度を制限して気相中及び/又は培地中に直接通気する力或いは通気槽等の培養器外で該気体を供給速度を制限して培地中に直接通気した後、該培地を培養器内に灌流するカ\ 或いは培養器を低酸素雰囲気下に置き培養する力 \ 或いは酸素吸着剤存在下で培養する方法等が挙げられる。

本発明における組織培養の培養温度としては、通常は約 10〜約 35°C、特に約 23 〜約 28°Cが増殖速度が大きいので好適である。また、培養期間としては、 14〜42 日間が好適である。

本発明における培養において液体培地を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーシヨン又は濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞及びノ又は培地から目的とするタキサン型ジテルペンを有機溶媒による抽出等の方法によって分離することができる。また、吸着剤や適当な有璣溶媒を培養系内に共存させ、培養中連続的に目的化合物を回収することもできる。

以下、本願第三の発明について説明する。

本願第三の発明において、培養後、タキサン型ジテルペン産生能の高くなる培養細胞を含む層としては、例えば、比重 1. 07以下の層を挙げることができる。細胞を比重によって分離する方法としては、一般に遠心分離用媒体を用いて密度勾配を作成し、細胞を重層した後、遠心分離する方法が知られている。

遠心分離闬媒体としては、 Ficoli、 Percoll (共に Pharmacia LKB

Biotechnology社製）、ショ糖、塩化セシウム等が用いられる。実施例では、 Ficollを用いて密度勾配を作成したが、細胞に傷害を与えないものであれば特に制限はない。 Ficollは、細胞顆粒等の分離 (Hess, R. et al. , Nature, 208 (1965) , 856-858)や動物細胞の分離 (Walder, L A. et al. , Proc. Soc. exptl. Biol. Med. , 112 (1963) 494-496 ) 等に用いられている。

密度勾配を形成する層の数に特に制限はない。

実施例では、比重 1. 03, 1. 05, 1. 07, 1. 09, し 11 (g/ml)のように各層の比重差が 0. 02の密度勾配を作成しているが、比重差はこの値に限定されるものではなく、また各比重差は同じであっても異なっていてもよい。

従って、この密度勾配の定義には勾配力 s連続的に変化する場合（密度勾配を形成する層の数力 $ '無限大、各層の比重差が 0に近い状態）も含む。

作成する層の比重は通常 i.00〜1· 20g/ml、好ましく ¾ 1. 03-1. lig/mlの範囲である。培養の対象となる層としては、少なくとも 1つの層を選択し、また全ての層を選択して培養してもよい。

複数の層を選択して培養する場合、これらの複数の層は、それぞれ個別に培養することもできる力選択した複数の層のうちの 2層以上の層を混合して培養することもできる。

タキサン型ジテルペン産生能の高い培養細胞は、通常、比重が 1. 07以下の層に含まれる細胞を培養して得られるが、培養する細胞や培養の条件により変動する場合があり、必ずしもこの範囲に限定されるものではない。また、単に比重の違いによって分画しただけでは、比重の高い層の細胞の方がタキサン型ジテルペン含量が高くなる傾向が認められる。従って、より確実にタキサン型ジテルペン高産生培養細胞を取得するためには、分画されたすべての層の細胞を一定期間培養した後、各層の細胞に含まれるタキサン型ジテルペン濃度を測定し、それらの中カらタキサン型ジテルペン高産生細胞を含む層を選択すること力 S望ましい。従来、タキサン型ジテルペン産生植物の培養細胞を細胞の比重によって分画後培養した例は報告されておらず、比重の違いによりタキサン型ジテルペン産生能がそれぞれ異なる細胞の層に分けることができ、しかも、分画した時点においてタキサン型ジテルペン含量のそれほど高くない比重 1. 07以下に含まれる細胞を培養することによりタキサン型ジテルべン高産生細胞が取得できることは予想外のことであった。

また、本発明では、例えば l. '07g/mlのように、ある 1つの特定の比重の遠分離用媒体を作成し、上述の方法で遠心分離することによつても、培養細胞を比重の違いにより複数の層に分けることができる。

本発明で使用される培地は、普通の培地成分を含有する。このような成分として一般に無機成分及び炭素源が用いられ、これに ί直物ホルモン類、ビタミン類を添加し、更に必要に応じてアミノ酸類を添加することができる。炭素源としては、シュクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクト —ス、ガラク卜一ス等の単糖類、デンプンあるいはこれら糖源の 2種類以上を適当な比率で混合したものを使用できる。

無機成分としては、例えばリン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシゥム、ィォゥ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸 1水素カリウム、リン酸 2 水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウィヒカリウム、塩ィヒコバルト等の化合物として添加できる。植物ホルモンとしては、例えばインドール酢酸（IAA) 、ナフタレン酢酸 (NAA) 、 2 , 4—ジクロロフエノキシ酢酸（2, 4- D) 等のオーキシン類、カイネチン、ゼァチン、ジヒドロゼァチン等のサイトカイニン類が用いられる。

ビタミン類としては、例えばビォチン、チアミン（ビタミン B i ) 、ピリドギシン（ビタミン B _s ) 、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用いられアミノ酸類としては、例えばグリシン、フエ二ルァラニン、ロイシン、グルタミン、システィン等を添加できる。

一般に前記の各成分は、無機成分が約 0. 1 u 、ないし動 M 、炭素源が約 1 〜約 3Dg/l 、植物ホルモン類力 5'約 0. 01〜約 10 、ビタミン類及びアミノ酸類がそれぞれ約 0. 1 〜約 lOOmg/1 の濃度で用いられる。

本発明における組織培養に用いられる培地としては、従来から知られている植物の組織培養に用いられる培地、例えばムラシゲ ·スクーグ（1962 年） [Murash ige Ei Skoog 〗の培地、リンスマイヤー ·スクーグ（1965 年） [ Linsmaier Skoog 〗の培地、ゥディ一'プラン卜 'メディゥム（1981 年） [Woody Plant Medium] 、ガンボルグ [Gamborg ] の B - 5培地、三井の M— 9培地等に前記の植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて前記した炭素源、ビタミン類、ァミノ酸等を添加して調製される培地を例示できる。

本発明には液体培地及び寒天やゲランガム等を通常 0. 1 ~1 %含有する固形培地のいずれも使用できるが、通常は液体培地が好ましい。

本発明の組織培養においては、前記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片又は細胞、あるいはこれらを前記培地あるいは他の従来の培地によつて組織培養して得られる培養細胞を使用することができる。

これらの細胞を本発明により特定の比重範囲に分画後、培養すると、分画をしなかつた対照区と比較してタキサン型ジテルべン高産生培養細胞が得られる。この培養細胞から、メタノール等の有機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを分離することができる。

本発明における組織培養の好ましい一例としては、次の方法が挙げられる。先ずイチィ属に属する植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたゥ、ソディー ·ブラント ' メディゥム上に置床し、 10〜35°Cで 14〜60日程度経過させて組織片の一部をカルス化させる。このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが得られる。ここで、安定化したカルスとは、培養中に力ルスの一部がシュ一卜や根に分化しないでカルスの状態を保持する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものをいう。

この安定化したカルスを増殖に適した液体培地、例えば液体ゥッディー 'ブラント ·メディゥムに移して増殖させる。液体培地において更に生育速度が高められる。

本発明における組織培養の培養温度としては、通常は約 10〜約 35°C、特に約 23 〜28°Cが増殖速度が大きいので好適である。また、培養期間としては、 14〜42曰間が好適である。

本発明における培養において液体培地を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーシヨン又は濾過等の方法によって培地から分離し、このものから目的とするタキサン型ジテルペンを有機溶媒による抽出等の方法によって分離することができる。

本願第一の発明及び本願第二の発明によれば、タキサン型ジテルぺンを大量にかつ簡便に得ることカ^!能になる。

本願第三の発明によれば、タキサン型ジテルぺン高産生培養細胞を簡易な操作により取得すること力可能になる。

本願第一ないし第三の発明を工業的に実施するに当たっては、以下に示す本願第四ないし第七の発明を、単独又はその組み合わせの形態で採用することにより更に効率を高め得る。

即ち、タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するにあたつて、培養液に酸素含有ガスを供給する必要がある。通常は、この目的で空気を用いるが、本発明者らは鋭意検討した結果、タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養槽を用いて培養するにあたって、槽内に導入する酸素含有ガスとして 0. 03〜10%、好ましくは 0. 1〜5 %の炭酸ガスを含有するガスを用いることにより、タキサン型ジテルペンの生産が効率的に行われることを見出し、本願第四の発明の発明を完成した。

また、タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するにあたって、次工程におけるタキサン型ジテルペンの生産に対して活性化された組織又は細胞を得るために、酸化剤又は水溶性の含酸素有機化合物を添加した培地を用いて行う一段目培養と、タキサン型ジテルペンの生産を促進する条件下で行う二段目培養の二つの工程からなる二段培養を行うことによって、培養物中のタキサン型ジテルぺン生産性が顕著に向上するとともに、継代培養にともなうタキサン型ジテルペン生産性の変動力抑えられることを見出し、本願第五の発明の発明を完成した。ここで、酸化剤としてはペルォキソ二硫酸カリウム等のペルォキソ二硫酸塩、過酸化水素等を、また水溶性の含酸素有機ィヒ合物としてはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール等を例示できる。前記添加物の培地における総濃度は、添加直後に、 1 0—⁶Μ〜1 O - ' Mとすることが好ましく、特に 1 0—⁵Μ〜1〇—²Mの範囲に調整することが更に好ましい。また、タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、糖濃度が 2〜50g/l 、好ましくは 10〜30g/i 及び Z又は硝酸イオン濃度が 2 〜50删 ol/l、好ましくは 10〜30醒 Dl/iである培地に組織又は細胞を移植した後、当該培地の初期容量に対して 1日当たり 0. 2〜5 g/l 、好ましくは 0. 5〜3 g/l の糖及び Z又は 0. 2~ 5丽01/1、好ましくは 0. 5~ 3醒 ol/lの硝酸イオンを含む栄養源溶液を連続的又は間欠的に添加して培養すると、当該組織又は細胞の高密度培養が可能になり、これによつて培養器当たりのタキサン型ジテルべン生産量が飛躍的に向上することを見出し、本願第六の発明を完成した。ここに密度とは培養槽中の培養液容積当たりの細胞量を表し、培養液 1 リツトル当たりの乾燥細胞重量（g ) で示す。本願第六の発明においては、栄養源溶液を添加するに際して、同容量の培地を組織又は細胞から分離して抜き出すことによって培地を更新しながら培養を行い、得られる培養物、培養途中に抜き出しによって回収される培地及び培養終了時に得られる培地から選ばれる少なくとも 1種以上からタキサン型ジテルペンを回収すること力 S好ましい。なお、本願第六の発明は、培養開始時の当該植物の組織又は細胞の密度が培地容量に対して 50g新鮮重 / 1以上の高密度培養において、タキサン型ジテルペンの生産性向上に対する効果力 ^s特に大きい。

更に、通常は高密度の細胞が得られた段階で培養を終了する力本発明者らは鋭意検討を積み重ねた結果、細胞を抜き出しながら培養を継続することにより連続培養を実現し、更に検討を加えて本願第七の発明である連続培養法を完成した。即ち、培養槽中の培養液の総容量を V、新鲜培地の供給速度を、組織又は細胞の比増殖速度をとするとき、無次元数 F = V z ZVZ で定義する培地の比更新率を 0. 1〜10の範囲となるように連続的又は間欠的に新鮮培地を添加し、連続的もしくは間欠的に槽外に抜き出される組織もしくは細胞を含む培養液及び/又は連続的もしくは間欠的に槽外に抜き出される組織もしくは細胞を含まなし、培養液からタキサン型ジテルペンを回収することにより従来の方法では到底不可能と予測される高い効率でタキサン型ジテルペンを製造することカ坷能になり、本願第七の発明を完成した。培地の比更新率 Fは Q. 5〜5とすることが更に好ましい。培養液の糖濃度は 5〜40g/l 、培養液の硝酸イオン濃度は 10〜40n™ol /1であること力子ましい。細胞密度は 1 リツトル当たり生細胞重量で 50~500 g で当該発明の効果が達成されるが、極端に強い撹拌力必要とされない範囲で高い方が効率よくタキサン型ジテルペンを生産でき、 1 リットル当たり 200 g以上が好ましい。

なお、前記本願第四ないし第七の発明を前記本願第三の発明と組み合わせるためには、本願第三の発明により取得した細胞を本願第四ないし第七の発明に従つて培養し、目的とするタキサン型ジテルペンを製造すればよい。図面の簡単な説明

図 1は、ジャスモン酸メチル 100 Mを添加後の培地中のタキソール収量の変化を示す図である。

図 2は、ジャスモン酸メチル 100 を添加後の培地中のパッカチン III 4又量の変化を示す図である。

図 3は、本願第二の発明により組織培養を行うに当たって用いられる培養装置の例を示した図である。図 3における各符号は以下の意味を有する。

1 空気供給管 2 窒素供給管

3 培養槽

4 酸素含有ガス供給口

5 溶存酸素濃度計

6 溶存酸素濃度制御装置

7 ガス排気管

8 バルブ

9 酸素流量制御バルブ

10 エアフィルター

11 撹拌翼

図 4は、分画培養後の生育を示す図である。

図 5は、分画培養後のタキサン含量を示す図である。

図 6は、分画時の細胞の存在比を示す図である。

図 7は、分画時のタキサン含量（細胞中）を示す図である。

図 8は、本願第六又は第七の発明により組織培養を行うに当たって用いられる培養装置の例を示した図である。図 8における各符号は以下の意味を有する。

12 培地供給管

13 培地供給口

1 培養液のみ（組織又は細胞を含まない培養液）を排出させるフィルターを取り付けた抜き出し口

15 培養液排出管

16 酸素含有ガス通気管

17 撹拌翼

18 培養混合物（組織又は細胞を含む培養液）排出管

19 加圧流体送入口

a , b , c , d , e バルブ発明を実施するための最良の形態

以下、実施例及び比較例により本発明を更に具体的に説明する力本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

(実施例 1 )

ナフタレン酢酸を 10— ⁵Mの濃度になるように添加した固体ゥッディ一 ·ブラント 'メディウム（ゲランガム 0.25重量％) に、前もって 2%アンチホルミン溶液又は 70%ェタノール溶液等で滅菌処理したセィヨウイチィ（Taxus baccata LINN) の茎の一部を置床し、 25°Cで暗所にて静置培養してセィヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス 1 g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディー ·プラン卜 ·メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移し、ロータリ一シェ —カー上で旋回培養（振幅 25mm、 120rpm) し、 21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。

このようにして得られた培養細胞 1 g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加したゥッディー ·プラント ·メディウムの液体培地 20ml入りの三角フラスコに移して 25°Cで 14日間振盪培養した。培養 14曰目に一般式（I ) で示される化合物としてッベロン酸のメチルエステル（前記式（I ) において、 R^la、 R^lb、 R^lc、 R^ia、 R^le、 R^lf、 R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び R ^6aが水素原子であり、 R ⁶ が水酸基であり、 R ⁷ がメ卜キシ基であり、 nが 1であり、 C ³ と ⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物）をその終濃度が 0.01〜1000)L Mになるように添加し、更に 7日間培養した。

培養終了後、セィョウイチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後その乾燥重量を測定し、液体培地 1 L当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、パッカチン III と比較定量することによってタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表 1に示す。

(比較例 1 )

実施例 1において、ッベロン酸のメチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 1に示す。

(実施例 2 )

実施例 1において、ッベロン酸のメチルエステルを培養 7日目より 1曰置きに計 4回逐次添加（一回当たりの終濃度は 25 M、合計 100 u M ) した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 1に示す。

(実施例 3 )

実施例 1において、ッベロン酸のメチルエステル 100 . u Mを培養 1曰目に添加し、更に 20日間培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 1に示す。

(実施例 4 )

実施例 1において、ッベロン酸のメチルエステル 100 μ Μを培養 7日目に添加し、更に 14日間培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 1に示す。

表 1

"収量は、総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。

(実施例 5 )

実施例 1の方法で得られる生育速度の速められた細胞を、まず、

ッシュにより 250 〜840 mのサイズの細胞集塊に分別した。次に、 Ficollを用いて、比重 1. 07 (g/ml)の密度の媒体を作成し、前記細胞を重層し、 700 回転で 6 分間遠心を行った。細胞は、比重の違いによって 2層に分離した。 1. 07g/ml以下の層に含まれる細胞を分画し、 2 %ショ糖液で最低 3回以上洗浄し、 Ficoiiを洗い流した。洗浄後細胞 1 g (新鮮重）を液体ゥッディー ·プラント .メディウム 20ml入りの三角フラスコに移して 25°Cで 14日間振盪培養した。培養 14日目にッベロン酸のメチルエステルをその終濃度が 250 u Mになるように添加し、更に 7曰間培養した。培養終了後は、実施例 1 と同様に操作した。その結果を表 2に示特定比重の細胞の選別とッベロン酸メチルエステルの添加とを組み合わせる：::とによりタキサン型ジテルべンの生産性を大幅に向上することができた。 (比較例 2 )

実施例 5において、ッベロン酸のメチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 2に示す。 .

7 2

"収量は、総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。

(実施例 6 )

実施例 1と同様の方法によって得られるタイへィョウイチイの培養細胞（培養 14日目）にッベロン酸のメチルエステル 250 を添加して 7日間培養を行つた。培養終了後は、該実施例と同様に操作した。その結果を表 3に示す。

(比較例 3 )

実施例 6において、ッベロン酸のメチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 3に示す。

(実施例 7 )

実施例 6において、 L mediaの培養細胞を用いる以外は、該実施例と同様に操作した。その結果を表 3に示す。

(比較例 4 )

実施例 7において、ッベロン酸のメチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 3に示す。表 3

*' 収量は、総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。

(実施例 8)

ナフタレン酢酸を 10— ⁵Mの濃度になるように添加したゥッディー 'プラント ' メディウムの固体培地（ゲランガム 0.25重量％) に、前もって 2%アンチホルミン溶液又は 70%エタノール溶液等で滅菌処理したセィョウイチイ（Taxus baccata LINN)の茎の一部を置床し、 25°Cで暗所にて静置培養してセィヨウィイカルスを得た。次にこのカルス 1 g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥ、ソディー ·プラント ·メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅 25mm 120rpm) し、 21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。

このようにして得られた培養細胞 1 g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディ一 ·プラン卜 ·メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移して 25°Cで 14日間振盪培養した。培養 14日目にジャスモン酸類としてククルビン酸のメチルエステル（前記式（II) において、 R'^a R^lb R^lc R^lfl R^le R^lf R² R³ R⁴ R⁵ 及び R^e が水素原子であり、 R⁷ がメトキシ基であり、 nが 1であり、 C³ と C⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物）をその終濃度が 0.0i~1000 Mになるように添加し、更に 7日間培養した。

培養終了後、セィヨウィチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、液体培地 1 L当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソ一ル、セファロマニン、パッカチン III と比較定量することによってタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表 4に示す。

(比較例 5 )

実施例 8において、ククルビン酸のメチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 4に示す。

(実施例 9 )

実施例 8において、ククルビン酸のメチルエステルを培養 7日目より 1日置きに計 4回逐次添加（一回当たりの終濃度は 25 μ Μ、合計 100 u M ) する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 4に示す。

(実施例 10)

実施例 8において、ククルビン酸のメチルエステル 100 JLI Mを培養 1曰目に添加し、更に 20日間培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 4に示す。

(実施例 11)

実施例 8において、ククルビン酸のメチルエステル 100 IX Mを培養 7日目に添加し、更に 14日間培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 4に示す。

4 表 4

"収量は、総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。

(実施例 12)

実施例 8の方法で得られる生育速度の速められた細胞を、まず、

ッシュにより 250 〜840 mのサイズの細胞集塊に分別した。次に、 Ficollを用いて、比重 1. 07 (g/mi)の密度の媒体を作成し、前記細胞を重層し、 700 回転で 6 分間遠心を行った。細胞は、比重の違いによって 2層に分離した。 1. 07g/ml以下の層に含まれる細胞を分画し、 2 %ショ糖液で最低 3回以上洗浄し、 Ficollを洗い流した。洗浄後細胞 l g (新鮮重）を液体ゥッディ一 ·プラン卜，メディウム 20ml入りの三角フラスコに移して 25°Cで 14曰間振盪培養した。培養 14日目にククルビン酸のメチルエステルをその終濃度が 250 / Μになるように添加し、更に 7 日間培養した。培養終了後は、実施例 8と同様に操作した。その結果を表 5に示す。特定比重の細胞の選別とククルビン酸メチルエステルの添加とを組み合わせることによりタキサン型ジテルペンの生産性を大幅に向上することができた。

(比較例 6 )

実施例 12において、ククルビン酸のメチルエステルを添加しなし、以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 5に示す。表 5

"収量は、総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。

(実施例 13)

実施例 8と同様の方法によつて得られるタイへィョウイチイの培養細胞（培養 14日目）にククルビン酸のメチルエステル 250 u M を添加して 7日間培養を行つた。培養終了後は、該実施例と同様に操作した。その結果を表 6に示す。

(比較例 7 )

実施例 13において、ククルビン酸のメチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 6に示す。

(実施例: )

実施例 13において、 T. mediaの培養細胞を用いる以外は、該実施例と同様に操作した。その結果を表 6に示す。

(比較例 8 )

実施例 14において、ククルビン酸のメチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 6に示す。

衣 D

収量は、総生産量（細胞中 +培地中）により算出した (実施例 15)

ナフタレン酢酸を 10— ⁵M の濃度になるように添加したゥッディ一 ·プラント · メディウムの固体培地（ゲランガム 0.25重量％) に、前もって 2%アンチホルミン溶液又は 70%エタノール溶液等で滅菌処理したセィヨウイチィ（Taxus baccata LI腿)の茎の一部を置床し、 25°Cで暗所にて静置培養してセィヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス lg (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディ一 'プラント 'メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅 25mm、 120rpm) し、 21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。

このようにして得られた培養細胞 1 g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディー 'プラント ·メディゥム 20ηύ入りの三角フラスコに移して 25°Cで 14日間振盪培養した。培養 14日目にジャスモン酸類としてジャスモン酸のメチルエステル（前記式（III) において、 R ^{l a}、 R ^lb、 R ^{l c}、 R^{l fl}、 R^le、 R ^{l f}、 R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R^B 及び R⁶ が水素原子であり、 R⁷ がメトキシ基であり、 nが 1であり、 C³ と C⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物、トランス型 90%, シス型 10%) をその終濃度が 0.01〜1000 Mになるように添加し、更に 7日間培養した。

培養終了後、セィョウイチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、液体培地 i L当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、パッカチン III と比較定量することによってタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表 7に示す。

(比較例 9)

実施例 15において、ジャスモン酸メチルエステルを添加しなし、以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 7に示す。

(実施例 16)

実施例 15において、ジャスモン酸メチルエステルを培養 7日目より 1日置きに計 4回逐次添加（一回当たりの終濃度は 25 M、合計 100 iiM) する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 7に示す。

(実施例 Π)

実施例 15において、ジャスモン酸メチルエステル 100 を培養 1日目に添加し、更に 20日間培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 7に示す。 '

(実施例 18) .

実施例 15において、ジャスモン酸メチルエステル 100 nU を培養 7日目に添加し、更に 14日間培養した以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 7に示す。

(実施例 19)

実施例 15において、ジャスモン酸類としてジャスモン酸（式（III) において、 R】^a R^lb R^{l c} R' R^{l e} R R² R³ R⁴ R^s 及び R⁶ が水素原子であり、 R⁷ が水酸基であり、 nが 1であり、 C³ と C⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物、トランス型 90%，シス型 10%) をその終濃度が 0.01 1000u Mになるように添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 8に示す。

(比較例 1G)

実施例 19において、ジャスモン酸を添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 8に示す。

(実施例 20)

実施例 15において、ジャスモン酸メチルエステル 100 Mを添加する前、添加後 3日目、及び 7日目の培地中に存在するタキサン型ジテルべンを分析した結果を図 1及び 2に示す。培養 7曰目には、タキソールの約 5害 ij、パッカチン III の約 7害 ljが培地に漏出していた。

(比較例 11)

実施例 20において、ジャスモン酸メチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を図 1及び図 2に示す。

(実施例 21)

実施例において得られる生育速度の速められた細胞を、先ず、ッシュにより 250 -840 mのサイズの細胞集塊に分別した。次に、 Ficollを用いて、比重 1. 07 (g/_ml)の密度の媒体を作成し、前記細胞を重層し、 700 回転で 6 分間遠心を行った。細胞は、比重の違いによって 2層に分離した。 1. 07g/ml以下の層に含まれる細胞を分画し、 2 %ショ糖液で最低 3回以上洗浄し、 Ficollを洗い流した。洗浄後、細胞 1 g (新鮮重）を液体ゥッディ一，ブラン卜 ·メディゥム 20m 1入りの三角フラスコに移して 25°Cで 14曰間振盪培養した。培養 14曰目にジャスモン酸メチルエステルをその終濃度が 250 M になるように添加し、更に 7日間培養した。培養終了後は、実施例 15と同様に操作した。その結果を表 9に示す。特定比重の細胞の選別とジャスモン酸メチルエステルの添加とを組み合わせることによりタキサン型ジテルペンの生産性を大幅に向上することができた。 (比較例 12)

実施例 21において、ジャスモン酸メチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 9に示す。

(実施例 22)

実施例 15と同様の方法によって得られるタイへィョウイチイの培養細胞（培養 14曰目）にジャスモン酸メチルエステル 250 M を添加して 7日間培養を行つた。培養終了後は、該実施例と同様に操作した。その結果を表 10に示す。

(比較例 13)

実施例 22において、ジャスモン酸メチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 10に示す。

(実施例 23)

実施例 22において、 T. mediaの培養細胞を用いる以外は、該実施例と同様に操作した。その結果を表 10に示す。

(比較例 14)

実施例 23において、ジャスモン酸メチルエステルを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 10に示す。表 7

収量は総生産】 (細胞中 +培地中） .より算出した表 8

：収量は総生産量（細胞中 +培地中）により算出した表 9

( *' ：収量は総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。）

(実施例 24)

ナフタレン酢酸を 10— の濃度になるように添加した固体ゥッディー ·プラント 'メディウム（ゲランガム 0. 25重量％) に、前もって 2 %アンチホルミン溶液または 70%エタノール溶液等で滅菌処理したセィヨウイチィ（Taxus baccata LIN N)の茎の一部を置床し、 25°Cで暗所にて静置培養してセィヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス l g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディー 'プラント ♦メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェ一力一上で旋回培養（振幅 25顏、 lOOrpm) し、 21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。

このようにして得られた培養細胞 1 g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディ一 ·ブラント ·メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移した後、重金属を含む化合物として [Ag (S₂0₃) ₂] ³一をその終濃度が 10— 〜iMになるように添加した。そして 25°Cで 21日間、旋回培養を行った。培養終了後、セィョウイチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、生育倍率を求めた。得られた乾燥カルスからメタノール等を闬いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、パッカチン III と匕交定量することによつてタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表 11に示す。

(実施例 25)

実施例 24において、 [A S₂0₃) ₂]³一をその終濃度が 10_³Μ になるよう培養開始 7曰目に添加し、更に 14日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 11に示す。

(実施例 26)

実施例 24において、 [Ag (S₂0₃) ₂]^s- をその終濃度が 10— になるよう培養開始 14曰目に添加し、更に 7日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 11に示す。

(実施例 27)

実施例 24において、 [Ag(S₂0₃)₂]³- をその終濃度が 10— ³M になるよう培養開始 18日目に添加し、更に 3日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 11に示す。

(実施例 28)

実施例 24において、 [Ag(S₂0₃) ₂] ³— を培養開始時（0 日目）より 4日置きに計 5回逐次添加（ 1回当たりの終濃度は 2 X10_⁴M 、合計 10— ³M ) すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 11に示す。

(実施例 29)

例 24において、培養 14曰目にジャスモン酸類としてジャスモン酸のメチルエステル（前記式（III) において、 R^la、 R】^b、 R^lc、 R^lfl、 R^le、 R"、 R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び Rs が水素原子であり、 R⁷ がメトキシ基であり、 nが 1であり、 C³ とじ⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物）をその終濃度が 10-⁴ になるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 Uに示す。

(実施例 30) 実施例 24において、該フラスコを気体供給口と排出口を有する容器（内容量 3000ml) 内に入れ密閉した後、空気と窒素を用いて、該培養細胞に供給する酸素濃度が 10%となるよう混合比を調節し、更に毎分 25mlの割合で該気体を供給口より供給すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 11に示す。

(実施例 31)

実施例 30において、培養 14日目にジャスモン酸のメチルエステルを、その終濃度が 10— ⁴M になるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 11に示す。

(実施例 32)

実施例 24において、 [Ag(S₂0₃)₂]³— の代わりに硝酸銀 (AgN0₃) 10"³M を、培養開始時（0日目）に添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 11に示す。

(実施例 33)

実施例 32において、硝酸銀 101 を、培養開始 14日目に添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 11に示す。

(比較例 15)

実施例 24において、 [Ag(S₂0₃)₂]³_ を添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 11に示す。

(実施例 34)

実施例 24において、重金属を含む化合物として [Ag(S₂0₃) ₂]³一の代わりに塩化コバルト（CoCl₂) を、その終濃度が 10— 〜iMになるように添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 12に示す。

(実施例 35)

実施例 34において、 [Ag (S₂0₃) zV- の代わりに塩化コバルトをその終濃度が 10-⁵Μ になるよう培養開始 7日目に添加し、更に 14日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 12に示す。

(実施例 36)

実施例 34において、塩ィヒコバルトをその終濃度が^ Τ⁵Μ になるよう培養開始 14 日目に添加し、更に 7日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 12に示す。

(実施例 37)

実施例 34において、塩化コバルトをその終濃度が 10- ⁵M になるょ培養開始 18 曰目に添加し、更に 3日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 12に示す。

(実施例 38)

実施例 34において、塩化コバルトを培養開始時（0日目）より 4日置きに計 5 回逐次添加（ 1回当たりの終濃度は 2 X10— 、合計 10_ ) すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 12に示す。

(実施例 39)

実施例 34において、培養 14日目にジャスモン酸類としてジャスモン酸のメチルエステル（前記式（III) において、 R^la、 R^l R^lc、 R^ld、 R^le、 R^lf、 R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び R⁶ が水素原子であり、 R⁷ がメ卜キシ基であり、 nが 1であり、 C³ とじ⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物）をその終濃度が 10-⁴M になるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 12に示す。

(実施例 40)

実施例 34において、該フラスコを気体供給口と排出口を有する容器（内容量 3000ml) 内に入れ密閉した後、空気と窒素を用いて、該培養細胞に供給する酸素濃度が 10%となるよう混合比を調節し、更に毎分 25mlの割合で該気体を供給口より供給すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 12に示す。

(実施例 41)

実施例 40において、培養 14曰目にジャスモン酸のメチルエステルを、その終濃度が 10— ⁴Μ になるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 12に示す。表 1 1

en

t

[·> ：収量は総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。〕

〔^b) ：総収量はパッカチン III、セファロマニン及びタキソ一ルの各収量の合計により算出した。〕

表 1 2

cn

O

：収量は総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。〕

〔^b) ：総収量はパッカチン III、セファロマニン及びタキソールの各収量の合計にょリ算出した。〕

(実施例 42)

ナフタレン酢酸を 10_ の濃度になるように添加した固体ゥッディー 'プラント 'メディウム（ゲランガム 0. 25重量％) に、前もって 2 %アンチホルミン溶液又は 70%エタノール溶液等で滅菌処理したセィョウイチイ（Taxus baccata LINN) の茎の一部を置床し、 25°Cで暗所にて静置培養してセィヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス l _g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディー ·プラン卜 ·メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェ一力一上で旋回培養（振幅 25rnm、 lOOrpin) し、 21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。

このようにして得られた培養細胞 1 g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディー 'プラン卜 'メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移した後、アミン類としてスペルミジンをその終濃度が 10— 〜iMになるように添加した。そして 25°Cで 21日間、旋回培養を行った。

培養終了後、セィョウイチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、生育倍率を求めた。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、パッカチン III と比較定量することによつてタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表 13に示す。

(実施例 43)

実施例 42において、スペルミジンをその終濃度が 10— になるよう培養開始 7 日目に添加し、更に 14日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 13に示す。

(実施例 44)

実施例 42において、スペルミジンをその終濃度が 10—^SM になるよう培養開始 14 日目に添加し、更に 7日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 13に示す。

(実施例 45)

実施例 42において、スペルミジンをその終濃度が 1CT⁵M になるよう培養開始 18 日目に添加し、更に 3日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 13に示す。

(実施例 46)

実施例 42において、スペルミジンを培養開始時（0日目）より 4日置きに計 5 回逐次添加（ 1回当たりの終濃度は 2 xlO— 、合計 10— ) すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 13に示す。

(実施例 47) .

実施例 42において、培養 14日目にジャスモン酸類としてジャスモン酸のメチルエステル（前記式（III) において、 R^{l a}、 R'。、 R^lc、 R^ia、 R^le、 R^lf、 R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び R^s が水素原子であり、 R⁷ がメ卜キシ基であり、 nが 1であり、 C³ とじ⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物）をその終濃度が 10"⁴M になるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 13に示す。

(実施例 48) .

実施例 42において、該フラスコを気体供給口と排出口を有する容器（内容量 3000ml) 内に入れ密閉した後、空気と窒素を用いて、該培養細胞に供給する酸素濃度が 10%となるよう混合比を調節し、更に毎分 25mlの割合で該気体を供給口より供給すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 13に示す。

(実施例 49)

実施例 48において、培養 14曰目にジャスモン酸のメチルエステルを、その終濃度が 10— ⁴M になるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 13に示す。

(比較例 16)

実施例 42において、スペルミジンを添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 13〜15に示す。

(実施例 50)

実施例 42において、スペルミジンに代えてスペルミンを、その終濃度が 10—^SM 〜iMになるように添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 14に示す。

(実施例 51) 実施例 42において、スペルミジンに代えてブトレツシンを、その終濃度が 10_ ⁹ M〜1Μになるように添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 15に示す。

表 1 3

αι

(·' ：収量は総生産量（細胞中 +培地中）によリ算出した。〕

〔^b) ：総収量はパッカチン IIしセファロマニン及びタキソ一ルの各収量の合計により算出した。〕

表 1 4

[*' ：収量は総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。〕

〔^b) ：総収量はパッカチン IIしセファロマニン及びタキソールの各収量の合計により算出した。〕表 1 5

〔^a) ：収量は総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。〕

〔^b) ：総収量はパッカチン IIしセファロマニン及びタキソールの各収量の合計により算出した。〕 (実施例 52 )

ナフタレン酢酸を 10— ⁵M の濃度になるように添加した固体ゥッディー ·プラント 'メディウム（ゲランガム 0. 25重量％.) に、前もって 2 %アンチホルミン溶液または 70% 夕ノール溶液等で滅菌処理したセィョウイチイ（Taxus baccata LIN N)の茎のを置床し、 25°Cで暗所にて静置培養してセィヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス l g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディ一 'フ。ラント 'メディゥム 20mi入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェ一力一上で旋回培養（振幅 25卿、 lOOrpm) し、 21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。

このようにして得られた培養細胞 1 g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥ、ソディー 'プラント ·メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移し、 25°Cで 14日間旋回培養を行った。そして培養開始 14日目に抗エチレン剤としてァセチルサリチル酸（H00CC₆H₄0C0CH₃ ) をその終濃度が 10— ⁹M ~1Μになるように添加した後、更に 7日間培養を行った。

培養終了後、セィョウイチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、生育倍率を求めた。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキゾール、セファロマニン、パッカチン III と比較定量することによつてタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表 16に示す。

(実施例 53)

実施例 52において、ァセチルサリチル酸をその終濃度が 10— になるよう培養開始時（0日目）に添加し、 21日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 16に示す。

(実施例 54)

実施例 52において、ァセチルサリチル酸をその終濃度が 10— ⁵Μ になるよう培養開始 7日目に添加し、更に 14日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 16に示す。

(実施例 55)

実施例 52において、ァセチルサリチル酸をその終濃度が 10— になるよう培養開始 18日目に添加し、更に 3日間培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。その結果を表 16に示す。

(実施例 56)

実施例 52において、ァセチルサリチル酸を培養開始 7曰目より、 2日置きに計' 5回逐次添加（1 回当たりの終濃度は 2 X10_ 、合計 10— ) すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 16に示す。

(実施例 57)

実施例 52において、培養 14日目にジャスモン酸類としてジャスモン酸のメチルエステル（前記式（III) において、 R^la R^lb R'^c R' R^le R R² R³ R⁴ R⁵ 及び R^s が水素原子であり、 R⁷ がメ卜キシ基であり、 nが 1であり、 C³ と C⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物）をその終濃度が 10-⁴M になるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 16に示す。

(実施例 58)

実施例 52において、該フラスコを気体供給口と排出口を有する容器（内容量 3000ml) 内に入れ密閉した後、空気と窒素を用いて、該培養細胞に供給する酸素濃度が 10%となるよう混合比を調節し、更に毎分 25mlの割合で該気体を供給口より供給すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 16に示す。

(実施例 59)

実施例 58において、培養 14曰目にジャスモン酸のメチルエステルを、その終濃度が 10— ⁴M になるよう添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 16に示す。

(比較例 Π)

実施例 52において、ァセチルサリチル酸を添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 16に示す。

(参考例 1 )

実施例 52において、ァセチルザリチル酸の代わりにェチレン発生剤としてエスレル (Ethrel) (C₂K₆0₃C1P ) 10"³ を、培養開始時（0曰目）に添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 16に示す。 (参考例 2)

実施例 52において、ァセチルサリチル酸の代わりにエスレル 10— ³M を、培養開始 14日目に添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 16に示す。

(実施例 SO)

実施例 52において、抗エチレン剤としてアミノォキシ酢酸 .塩酸塩 [ (H₂N0CH₂ C00H) ₂-HC.l] を、その終濃度が 10— ⁹M〜1Mになるように添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 17に示す。

(実施例 61)

実施例 52において、抗エチレン剤として没食子酸プロピル

[ (HO) ₃C₆H₂C00CH₂CH₂CH₃ ] を、その終濃度が 10—^SM〜薦こなるように添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 18に示す。

表 1 6

）：収量は総^ (細胞中 +培地中）により算出した。 ]

'：総収量はパッカチン III 、セファロマニン及びタキツールの各収量の合計により算出した。 ]

表 1

¹¹：収量は総 (細胞中 +培地中）により算出した。 ]

³¹：総収量はパッカチン III 、セファロマニン及びタキソ一ルの各 !{¾め合計により算出した。

表 1 8

）：収量は総^ * (細胞中 +培地中）により算出した。 ]

[^{b )} : 総収量はパッカチン in 、セファロマニン及びタキソ一ルの各 il¾の合計により算出した。 (実施例 62 )

ナフタレン酢酸を 10— ⁵M の濃度になるように添加した固体ゥッディー .プラント 'メディウム（ゲランガム 0. 25重量％) に、前もって 2 %アンチホルミン溶液又は 70%エタノール溶液等で滅菌処理したセィョウイチイ（Taxus baccata LINN) の茎の一部を置床し、 25でで暗所にて静置培養してセィヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス 1 _g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加したゥッディ — 'プラント 'メディウムの液体培地 20ml入りの三角フラスコに移し、ロータリーシヱ一力一上で旋回培養（振幅 25MK lOOrpm) し、 21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。

このようにして得られた培養細胞 1 g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディー 'ブラント 'メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移植した後、該フラスコを気体供給口と排出口を有する容器（内容量 3000ml) 内に入れ密閉した。そして空気と窒素を用いて、該培養細胞に供給する酸素濃度が 4ないし 15%となるよう混合比を調節後、毎分 25mlの割合で該気体を供給口より供給しながら、 25°Cで 21日間旋回培養を行った。

培養終了後、セィョウイチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後、その草乞燥重量を測定し、生育倍率を求めた。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、パッカチン III と比較定量することによってタキサン型ジテルべン収量を測定した。その結果を表 19に示す。

(比較例 18)

実施例 62において、細胞に供給する酸素濃度が 20%になるよう調節した混合気体を供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 19に示す。

(参考例 3 )

実施例 62において、培養細胞を移植したフラスコを大気中で培養すること以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 19に示す。

(実施例 63)

実施例 62において、細胞に供給する酸素濃度が 10%になるよう調節した混合気体を、培養開始時から 3日間供給した後、培養終了時まで（18日間）空気を供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 19に示す。

(実施例 64)

実施例 62において、細胞に供給する酸素濃度が 10%になるよう調節した混合気体を、培養開始時から 7日間供給した後、培養終了時まで（14日間）空気を供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 19に示す。

(実施例 65)

実施例 62において、細胞に供給する酸素濃度が 10%になるよう調節した混合気体を、培養開始時から 14日間供給した後、培養終了時まで（7日間）空気を供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 19に示す。

(実施例 66)

実施例 62において、培養 14日目にジャスモン酸類としてジャスモン酸のメチルエステル（前記式（III) において、 R^la R' R^lc R' R^le R R² R³ R⁴ 、 R^s 及び R⁶ が水素原子であり、 R⁷ がメトキシ基であり、 nが 1であり、じ³ と C⁴ の間で二重結合を含んでいる化合物、トランス型 90 , シス型 10%) をその終濃度が 10ないし lOOOwMになるよう添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 20に示す。低濃度酸素供給処理とジヤスモン酸のメチルエステルの添加とを組み合わせることによりタキサン型ジテルぺンの生産性を大幅に向上させることができた。

(実施例 67)

実施例 62において得られる生育の早くなつた培養細胞 85 g (新鮮重）を、溶存酸素濃度計及び溶存酸素濃度制御装置を備えた通気撹拌培養槽（内容量 3000 ml) に液体ゥッディー 'プラン卜 'メディゥム 1700mlを入れた後、移植した。そして空気と窒素を用いて、該培地中の溶存酸素濃度が 0. lppm以下になるよう混合比を調節しながら 25°Cで 21日間通気撹拌培養を行った。培養装置の概略図を図 3 に示すと共に、結果を表 21に示す。

(実施例 68)

実施例 67において、溶存酸素濃度が lppm以下になるよう混合比を調節したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 21に示す。

(実施例 69) 実施例 67において、溶存酸素濃度が 2 ppm以下になるよう混合比を調節したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 21に示す。

(実施例 70)

実施例 67において、溶存酸素濃度が 4 ppm以下になるよう混合比を調節したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 21に示す。

(実施例 71 )

実施例 67において、溶存酸素濃度が 6 ppm以下になるよう混合比を調節したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 21に示す。

(比較例 19)

実施例 67において、空気を通気したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 21に示す。

〔実施例 72 )

実施例 67において、培養開始時から 3日間培地の溶存酸素濃度が 4 ppm以下になるよう混合比を調節しながら培養した後、培養終了時までの間（18日間）空気を供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 21に示す。 (実施例 73)

実施例 67において、培養開始時から 7日間培地の溶存酸素濃度が 4 ppm以下になるよう混合比を調節しながら培養した後、培養終了時まで（14日間）空気を供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 21に示す。

(実施例 74)

実施例 67において、培養開始時から 14日間培地の溶存酸素濃度が 4 ppm以下になるよう混合比を調節しながら培養した後、培養終了時まで（7日間）空気を供給したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 21に示す。表 1 9

収量は総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。 ]

総収量はパッカチン I II 、セファロマニン及びタキソールの各収量の合計により算出した左記数字は混合気体供給期間中の培養器内気相中の最大酸素濃度値を示す。 ] 表 2 0

[^a) ：収量は総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。〕

[^bl ：総収量はパッカチン III 、セファロマニン及びタキソールの各収量の合計により算出した。 ]

表 2

収量は総生産量（細胞中 +培地中》により算出した。〕

総収量はパッカチン III 、セファロマニン及び夕キソ一ルの各収量の合計により算出した。〕

( ) 内数字は 25でにおける飽和溶存酸素濃度値（8卯 m) に対する比較例及び

各実施例の最大溶存酸素濃度値の割合を％で表示した。〕

左記数字は混合気体供給期間中の培地中の最大溶存酸素濃度値を示す。 ]

( ) 内数字は混合気体供給期間中の 25°Cにおける飽和溶存酸素濃度値（8pp_m)

に対する各実施例の最大溶存酸素濃度値の割合を％で表示した。〕

(実施例 75 )

ナフタレン酢酸を 10— ⁵M の濃度になるように添加した固体ゥッディー 'ブラント 'メディウム（ゲランガム 0. 25重量％) に、前もって 2 %アンチホルミン溶液又は 70%エタノール溶液等で滅菌処理したセィョウイチイ（Taxus baccata LINN) の茎の一部を置床し、 25°Cで暗所にて静置培養してセィヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス l _g (新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加した液体ゥッディー 'プラント 'メディゥム 20ml入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェ一力一上で旋回培養（振幅 25誦、 lOOrpm) し、 21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。

このようにして得られた培養細胞 l g (新鮮重）を、まず、ステンレスメッシュにより 250 〜840 mのサイズの細胞集塊に分別した。次に、 Ficollを用いて、比重 1. 03, 1. 05, 1. 07, 1. 09 , l. ll (g/ml) の密度勾配を作成し、前記細胞を重層し、 700 回転で 6分間遠心を行った。細胞は、比重の違いによって各層に分離した。それぞれの層に分離した細胞を混ざらないように分画し、 2 %ショ糖液で最低 3回以上洗浄し、 Ficollを洗い流した。洗浄後約 0. 1 g (新鮮重） .を液体ゥッディー ·ブラント 'メディウム 0. 8ml 入りの内径 IS劃ゥヱルに移して 25°C で 21日間振盪培養した。 21日間培養後、細胞全量を前記液体培地 3 mi入りの内径 36m ゥヱルに移して 25°Cで更に 28日間振盪培養した。

培養終了後、セィョウイチイ培養細胞を濾過により探取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、液体培地 1 L当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得られた乾喿カルスからメタノール等を闬いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クコマトグラフィ一を用いて標準品タキソール、セファロマニン、パッカチン III と比較定量することによってタキサン型ジテルペン含量を測定した。その結果を表 22、図 4及び図 5に示す。

(比較例 20)

実施例 75において、ステンレスメッシュにより細胞集塊を分別後、密度勾配による分画を行わない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 22、図 4及び図 5に示す。

(実施例 76) 実施例 75において、親植物は同じであるが、カルス化誘導時期の異なる培養細胞を用いた以外は該実施例と同様に操作した。但し、比重 1. 07以上の層に含まれる細胞は一つにまとめた後、培養を行った。その結果を表 22に示す。

(比較例 21)

実施例 76において、ステンレスメッシュにより細胞集塊を分別後、密度勾配による分画を行わない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 22に示す。

表 2 2

：含量は総生産量（細胞中 +培地中） Z培養細胞生育量により算出した。 ] (参考例 4 )

実施例 75において、比重範囲 1. 03以下の層に分画後培養した細胞（表 22) 約 0. 2 g (新鲜重）を、液体ゥッディ一·ブラント ·メディウム 3 ml入りの内径 36誦ゥエルに移して 25°Cで更に 28日間振盪培養した。培養終了後、細胞を比重 1. 03, 1. 05, 1. 07, 1- 09, 1. U (g/ml)の密度勾配により再度分画した。密度勾配分画直後に細胞を回収し、分画された細胞の存在比、タキサン型ジテルペン含量を定量した。その結果を表 23, 図 6及び図 7に示す。表 2 3

[ * ' ：含量は細胞中の生産量/培養細胞生育量により算出した。 ]

(実施例 77)

実施例 1で用いたのと同じ培養細胞 1 g (新鮮重）を、ペルォキソ二硫酸カリゥムを iO— ⁵M l(T ²M含む液体培地 20ml入りの三角フラスコに移して 25°Cで 21日間振盪し、一段目の培養を行った。

培養終了後、咅養細胞を濾過により採取し、一部を二段目培養の種細胞として用い、残りの細胞は培養細胞の生育重量及び細胞中のタキサン含量の測定に供した。即ち、採取した培養細胞の 1 g (新鮮重）を、ナフタレン酢酸を 10— の濃度になるように添加した液体ゥッディー ·プラント ·メディウム 20ml入りの三角フラスコに移し、 25°Cで 14日間振盪培養した。培養 14日目にジャスモン酸メチルを、培地中の濃度が 100 Mになるように添加し、更に 7日間培養した。一方、一段目培養で得られた細胞の中の残った培養細胞を凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、液体培地 1 L当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得られた乾燥細胞のタキソ一ル含量を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。二段目培養についても一段目培養と同様にして細胞収量及びタキソール収量を測定した。その結果を表 24に示す。

(比較例 22)

実施例 77において、ペルォキソ二硫酸力リゥムを用いない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 24に示す。表 2 4

(実施例 78)

実施例 1で用いたのと同じ培養細胞 100 g (新鮮重）を、標準の液体ゥッディ一 ' プラン卜 'メディゥム 1 リットル（蔗糖濃度： 20g/l 、硝酸イオン濃度： . 7mM α—ナフタレン酢酸： 10- ^SM ) に 2 の [Ag (S₂0₃) ₂ ] ³— を添加した培地を仕込んだ通気撹拌培養槽（内容量 2リットル；図 8 ) に移植して、 2 5 °C、暗所下、撹拌速度 40rpm 、通気速度毎分 0. 1リットルで空気を通気しながら培養を開始し、培養 2日目から 1 4日目の期間に、 20g/l の蔗糖及び 20mMの硝酸ナ卜リゥムを含む培地を 1日当たりの蔗糖添加量が 2 g/1 かつ 1日当たり硝酸イオン添加量が 2 mmol/1となるように連続的に添加し、当該栄養源溶液の添加と同じ速度で、栄養源添加口とは別の、 100 メッシュのステンレスフィルターを取り付けた抜き出し口より培養液を連続的に抜き出しながら（培養器内の培地更新率： 10% Z日） 21日間通気撹拌培養を行った。培養終了後、培養細胞及び培地を回収し、前記実施例 1 と同様の方法でタキソール収量を測定した。その結果を表 25に示す。

(比較例 23)

実施例 78において、栄養源の途中添加を実施しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表 25に示す。表 25

(実施例 79)

実施例 1で用いたのと同じ培養細胞 50 g (新鮮重）と、液体ゥッディー ·ブラント · メディゥム 1 リットルを容積 2 リットルの培養槽に移し、通気速度毎分 0. 1 リットル、撹拌速度 40rpm、 25°C, 暗所で日間培養を行った後、培養開始 14日目に細胞の沈降容積（PCV) を測定した結果、 PCVは 0.2リットルであつた。 14日目から、初期培地と同じ組成の培地に、

₂】³- を添加した新鮮培地の供給と、細胞を含まない培養液の抜き出しを開始した。新鮮培地の供給量は 1日当たり該時点の PCVの 2/5容とし、細胞を含まない培養液は培養液量を 1 リツトルに保つように抜き出した。培養開始 35日目に PCVは 0,6 リットルに達していた。以後、毎日 1回細胞を含む培養液を抜き出して平均の PCVを 0.6リツトルに保ちながら、細胞を含まない培養液を抜き出すことによって培養液量を 1 リツトルに保って定常状態を得た。培養開始後 90日まで培養を継続した。 60日間の定常状態において供給した新鲜培地の量は 15リットル、培養槽から取り出された培地量は 14リツトル、得られた細胞の量は 0.15kg (乾燥重量）で、比増殖速度 μは 0.08 (day— 、平均の培地比更新率は 2.88であった。定常状態で培養槽から取り出された細胞及び培地を分析した結果、タキソール 525 mgが生産されたこと力分かった。これは 8.8mgZリットル Ζ曰の生産性に相当す細胞中及び培地中に含まれるタキソールの量は、実施例 1と同様の方法で定量した。

(実施例 80)

実施例 1で用いたのと同じ培養細胞 50 g (新鮮重）と、液体ゥッディ一·ブラ

Claims

ン卜 'メディウム 1 リツトルを容積 2リットルの培養槽に移し、炭酸ガス 2 %を加えた空気を毎分 0. 1 リットルで通気し、撹拌速度 40rpm 、 25°C、暗所で 14日間培養を行った。培養終了後に細胞及び培地を回収し、乾燥細胞 15. 2 gを得た。細胞及び培地中に含まれるタキソールの量を実施例 1と同様の方法で定量した結果、タキソール 31mgが生産されたことが分かった。 (比較例 24) 実施例 1において、ッベロン酸メチルに代えてジャスモンをその終濃度が 0. 1 〜1000 ^ Μになるように添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を ^： 6 (こ不す。 (比較例 25) 比較例 24において、ジヤスモンを添加しない以外は該比較例と同様に操作した。その結果を表 26に示す。表 2 6 ( *' ：収量は総生産量（細胞中 +培地中）により算出した。）産業上の利用分野本発明によれば、卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型ジテルペンを工業的に生産することが可能になる。

1. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞をジャスモン酸類、重金属を含む化合物類、重金属を含む錯ィォン類、重金属ィオン、アミン類及び抗エチレン剤よりなる群から選ばれた少なくとも一つの存在下に培養し、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。

2. ジャ:：' モン酸類の存在下に培養する請求の範囲第 1項記載の製造方法。

3. ジャスモン酸類;^一般式主冃（I) ：

車

囲 I)

[式中、 R^la、 R¹⁶、 R"、 R 、 1^ 及び!^ は、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数 1〜6のアルキル基又は炭素数 1〜6のアルコキシ基を表し； R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び R^6aは、それぞれ水素原子又は炭素数 1〜6のアルキル基を表し；

C¹ — C² — C³ - C⁴ 一 C⁵ — C⁶ からなる側鎖は、 1個又は 2個以上の二重結合を含んでいてもよく；

は水酸基又は— 0—炭水化物残基を表し；

R⁷ は水酸基、 0M (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸ (ここで、 R⁸ は水素原子、炭素数 1〜6のァシル基、炭素数 1〜6のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、 OR⁹ (ここで、 R³ は炭素数 1〜6のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数 1 〜 6のアルキル基を表し；

nは 1〜7の整数を表し；前記 5員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物である請求の範囲第 2項記載の製造方法。

4. 前記一般式（I ) で示されるジャスモン酸類が一般式（Γ) ：

[式中、 R】'は水素原子又は水酸基を表し；

C】 — C² — C³ — C⁴ -C⁵ -C⁶ からなる側鎖は、 C¹ と C² 、 C² と C³ 又は C³ との間で二重結合を含んでいてもよく；

は水酸基又は一 0—炭水化物残基を表し；

R⁷'は水酸基、 0M (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸' (ここで、 R⁸'は水素原子、炭素数 1~4のァシル基、炭素数 1〜4のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）又は OR⁹' (ここで、 R⁹'は炭素数 1〜4のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）を表し； nは 1〜7の整数を表し；

前記 5員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物である請求の範囲第 3項記載の製造方法。

5. 前記一般式（I ) で示される化合物が、ッベロン酸又はッベロン酸メチルである請求の範囲第 3項記載の製造方法。

6. ジャスモン酸類が一般式（II) ：

R^ld R^le (CH₂ ) _n -C0-R⁷

[式中、 R^la、 R^lb、 R"、 R^lfl、 R^Ie及び R^lfは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数 1〜6のアルキル基又は炭素数 1〜6のアルコキシ基を表し； R²、 R³ 、 R⁴ 、 R⁵ 及び R^s は、それぞれ水素原子又は炭素数 1~6のアルキル基を表し；

C¹ — C² - C³ — C⁴ 一 C⁵ — C⁶ からなる側鎖は、 1個又は 2個以上の二重結合を含んでいてもよく；

R⁷ は水酸基、 OM (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸ (ここで、 R⁸ は水素原子、炭素数 1〜6のァシル基、炭素数 1~6のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、 OR⁹ (ここで、 R⁹ は炭素数 1〜6のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数 1 〜6のアルキル基を表し；

nは 1~7の整数を表し；

前記 5員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物である請求の範囲第 2項記載の製造方法。

7. 前記一般式（II) で示されるジャスモン酸類が一般式 (ΙΓ) ：

[式中、 Rいは水素原子又は水酸基を表し；

C' — C² -C³ 一 C⁴ -C⁵ -C⁶ からなる側鎖は、 C¹ と C² 、 C² と C³ 又は C³ と C⁴ の間で二重結合を含んでいてもよく；

R⁷'は水酸基、 OM (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸' (ここで、 R⁸'は水素原子、炭素数 1~4のァシル基、炭素数 1〜4のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）又は OR⁹' (ここで、 FT'は炭素数 1〜4のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）を表し； nは 1~7の整数を表し；

前記 5員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物である請求の範囲第 6項記載の製造方法。

8. 前記一般式（Π) で示される化合物が、ククルビン酸又はククルビン酸メチルである請求の範囲第 6項記載の製造方法。

9 酸類が一般式 (III)

[式中、 R^la、 R' R"、 R' 1^¹⁶及び1^ は、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数 1〜6のアルキル基又は炭素数 1〜6のアルコキシ基を表し；

R² 、 R³ 、 R⁴ 、 R^B 及び R^s は、それぞれ水素原子又は炭素数 1〜 6のアルキル基を表し；

C' — C² -C³ — C⁴ 一 C⁵ -C⁶ からなる側鎖は、 1個又は 2個以上の二重結合を含んでいてもよく；

R⁷ は水酸基、 0M (ここで、 Mはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は NH₄ を表す。）、 NHR⁸ (ここで、 R⁸ は水素原子、炭素数 1~6のァシル基、炭素数 1~6のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、 OR⁹ (ここで、 R⁹ は炭素数 1〜6のアルキル基又は炭水化物残基を表す c 又は炭素数 1 〜 6のアルキル基を表し；

nは 1〜7の整数を表し；

10. 前記一般式（III) で示されるジャスモン酸類力'—般式（ΠΓ)：

(CH₂ ) _η 一 CO— R⁷'

[式中、 R''は水素原子又は水酸基を表し；

C' 一 C² — C³ -C⁴ -C⁵ -C⁶ からなる側鎖は、 C' と C²、 C² と ³ 又は C³ と C⁴ の間で二重結合を含んでいてもよく；

R⁷'は水酸基、 0Μ (ここで、 Μはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は ΝΗ₄ を表す。）、 NHR⁸' (ここで、 RB'は水素原子、炭素数 1〜4のァシル基、炭素数 1〜4のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）又は OR^s' (ここで、 R⁹'は炭素数 1〜4のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）を表し； nは 1〜7の整数を表し；

前記 5員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ] で示される化合物である請求の範囲第 9項記載の製造方法。

11. 前記一般式（III) で示される化合物が、ジャスモン酸又はジャスモン酸メチルである請求の範囲第 9項記載の製造方法。

12. 組織培養培地中のジャスモン酸類の濃度が 0.01〜1000 ILL Mである請求の範囲第 2項記載の製造方法。

13. ジャスモン酸類を、培養細胞の対数増殖期ないし定常期に添加することを特徵とする請求の範囲第 2項記載の製造方法。

14. ジャスモン酸類を、複数回に分けて又は連続的に培養培地に添加することを特徴とする請求の範囲第 2項記載の製造方法。

15. 重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イオン類及び重金属イオンよりなる群から選ばれた少なくとも一^ ^の存在下に培養する請求の範囲第 1'項記載の製造方法。

16. 重金属が銀である請求の範囲第 1 5項記載の製造方法。

17. 銀を含む化合物類が、硝酸銀及び硫酸銀よりなる群から選ばれる少なくとも 1種類以上である請求の範囲第 1 6項記載の製造方法。

18. 銀を含む化合物類が、フッ化銀、塩素酸銀、過塩素酸銀、酢酸銀、亜硫酸銀、へキサフルォロリン（V ) 酸銀、テ卜ラフルォロホウ酸銀、ジァミン銀

( I ) 硫酸塩及びジァミノ銀（ I ) 酸力リウムよりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 1 6項記載の製造方法。

19. 銀を含む錯イオン類が、 [Ag (S₂0₃) ₂] ³一及び [Ag (S₂0₃) ₃] ⁵—よりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 1 6項記載の製造方法。

20. 銀を含む錯イオン類が、 [Ag (NH₃) ₂ ] ⁺ 、 [Ag (CN) ₂] - 、 [Ag (CN) ₃] ²—、 [Ag (SCN) ₂ ] ― 及び [Ag (SCN ] ³—よりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 1 6項記載の製造方法。

21. 銀を含む化合物類、銀を含む錯イオン類、.又は銀イオンの濃度カ^ 10— 〜 10- 'Μ である請求の範囲第 1 6項記載の製造方法。

22. 銀を含む化合物類、銀を含む錯イオン類、又は銀イオンの濃度が、 10— ⁷Μ 〜 10- ² である請求の範囲第 1 6項記載の製造方法。

23. 重金属が、コバルトである請求の範囲第 1 5項記載の製造方法。

24. コバルトを含む化合物類が、塩ィヒコバルト、硝酸コバルト及び硫酸コバルトよりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 2 3項記載の製造方法。

25. コバルトを含む化合物類が、フッ化コノ \'ルト、過塩素酸コバルト、臭化コバルト、ヨウ化コバルト、セレン酸コバルト、チォシアン酸コバルト、酢酸コバルト、硫酸アンモニゥムコバルト、硫酸コバルト（II) カリウム、へキサアンミンコバルト（III) 塩化物、ペンタアンミンアクアコバルト（III) 塩化物、ニトロべン夕アンミンコバルト（III) 塩化物、ジクロロテトラアンミンコバルト（III) 塩化物半水和物、ジニトロテ卜ラアンミンコバルト（III) 塩化物、カルボナトテ卜ラアンミンコノ^レ卜（III) 塩化物、テトラニトロジアンミンコバルト（III) 酸ァンモニゥム、へキサニトロコバルト（III) 酸ナトリウム、トリス（エチレンジァミン）コバルト（III) 塩化物三水和物、ジクロロビス（エチレンジァミン）コバル卜（III) 塩化物、卜リス（ォキサラ卜）コバルト（III) 酸カリウム三水和物、へキサシァノコバル卜（III) 酸カリウム、（エチレンジアミンテ卜ラァセタト）コバルト（II I) 酸カリウム二水和物、ヒドリドテトラカルボニルコバルト ( I ) 、ジカルボニル（シクロペンタジェニル）コバルト（ I ) 、才クタカルボニルニコバルト（0 ) 、へキサカルボニル（アセチレン）ニコバル卜（0 ) 、ビス（シクロペンタジェニル）コバルト（ I ) 及び（シクロペンタジェニル）（1, 5 -シクロォクタジェン）コバルト（I ) よりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 2 3項記載の製造方法。

26. コバルトを含む錯イオン類が、ペン夕アンミンアクアコバルトイオン、ニト口ペンタアンミンコバルトイオン、ジクロロテトラアンミンコバルトイオン、ジニトロテトラアンミンコバルトイオン、カルボナトテトラアンミンコバルトィォン、テトラニトロジアンミンコバルトイオン、へキサニトロコバルトイオン、：トリス（エチレンジァミン）コバルトイオン、ジクロロビス（エチレンジァミン）コバルトイオン、トリス（ォキサラト）コノ υレトイオン、へキサシァノコバル卜イオン及び（エチレンジアミンテトラァセタト）コバルトイオンよりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 2 3項記載の製造方法。

27. コバルトを含む化合物類、コバルトを含む錯イオン類、又はコバルトイオンの濃度が、 10— 〜10— 1 である請求の範囲第 2 3項記載の製造方法。

28. コバルトを含む化合物類、コバルトを含む錯イオン類、又はコバルトイオンの濃度が、 10— ⁵Μ〜10_²Μ である請求の範囲第 2 3項記載の製造方法。

29. 重金属を含む化合物類、重金属を含む錯イオン類及び重金属イオンよりなる群から選ばれた少なくとも一つとジャスモン酸類の存在下に培養する請求の範囲第 1 5項記載の製造方法。

30. アミン類の存在下に培養する請求の範囲第 1項記載の製造方法。

31. ァミン類が、ポリアミン類である請求の範囲第 3 0項記載の製造方法。

32. ポリアミン類が、ブトレツシン、力ダべリン、スペルミジン、スペルミン、エチレンジァミン、 Ν, Ν-ジェチル- 1 , 3- プロパンジァミン、ジエチレントリアミン、及びこれらの化合物の塩よりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 3 1項記載の製造方法。

33. ポリアミン類の濃度が、 10—⁸Μ〜10—^ である請求の範囲第 3 1項記載の製造方法。

34. ポリアミン類の濃度が、 10—⁷M〜1CT ²M である請求の範囲第 3 1項記載の製造方法。

35. アミン類及びジャスモン酸類の存在下に培養する請求の範囲第 3 0項記載の製造方法。

36. 抗エチレン剤の存在下に培養する請求の範囲第 1項記載の製造方法。

37. 抗エチレン剤が、 S - アデノシルメチ才ニンから 1—アミノシクロプロパン - 1 -力ルボン酸への変換を触媒する酵素の活性を阻害する化合物である請求の範囲第 3 6項記載の製造方法。

38. 抗エチレン剤が、アミノォキシ酢酸、ァセチルサリチル酸、リゾビ卜キシン、アミノエ卜キシビニルグリシン、メトキシビュルグリシン及び c—アミノィソ酪酸並びにこれらの化合物の塩、エステル、アミノ酸誘導体及び炭水化物誘導体よりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 3 7項記載の製造方法。

39. 抗エチレン剤が、 1一アミノシクロプロパン一 1—カルボン酸からエチレンへの変換を触媒する酵素の活性を阻害する化合物である請求の範囲第 3 6項記載の製造方法。

40. 抗エチレン剤が、没食子酸、並びに当該化合物の塩、エステル、アミノ酸誘導体及び炭水化物誘導体よりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 3 9項記載の製造方法。

41. 抗エチレン剤が、培養物内に貯留するか、又は該培養物を含む培養器内の気相中もしくは培地中に存在するエチレンを除去する物質である請求の範囲第 3 6 項記載の製造方法。

42. 抗エチレン剤が、 1 , 5 - シクロォクタジェン、並びにイソチォシアン酸、及び当該化合物の塩、エステル、アミノ酸誘導体及び炭水化物誘導体よりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 4 1項記載の製造方法。

43. 抗エチレン剤の濃度が、 10_⁸M〜10— である請求の範囲第 3 6項記載の製造方法。

44. 抗エチレン剤の濃度が、 iO—⁷M〜10— である請求の範囲第 3 6項記載の製造方法。

45. 抗エチレン剤及びジャスモン酸類の存在下に培養する請求の範囲第 3 6項記載の製造方法。

46. タキサン型ジテルペンがタキソ一ル、 7 -ェピタキツール、パッカチン III 、 7 —ェピバ、ソカチン III 、セファロマニン、 7—ェピセファロマニン、 10 —デァセチルバッカチン III 、 10—デァセチルセファロマニン、 10—デァセチルタキソール、夕キサギフイン、キシロシルセファロマニン及びキシロシルタキソ —ルょりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 1項記載の製造方法。

47. タキサン型ジテルペンを産生する植物がィチイ（Taxus) 属植物である請求の範囲第 1項記載の製造方法。

48. イチィ属植物が、セィョウイチイ（Taxus baccata LINN)、ィチイ（T. cuspidata SIEB. et ZUCC) 、キャラボク（T. cuspidata SIEB. et ZUCC var. nana REHDER) タイへィョウイチイ（T. brevifolia NUTT)、カナダイチイ（T. canadiensis MARSH) , 中国イチィ (T. chinensis)及び T. mediaよりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 4 7項記載の製造方法。

49. タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも 1つの層に含まれる細胞を培養することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の製造方法。

50. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気相中の酸素濃度を培養初期より大気中の酸素濃度未満の条伴下に制御して培養を行う力或いは組織又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度を培養初期よりその温度に於ける飽和溶存酸素濃度未満である条件下に制御して培養することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の製造方法。

51. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、酸化剤又は水溶性の含酸素有機化合物を添加した培地を用いて行う一段目培養と、請求の範囲第 1項記載の製造方法に従って行う二段目培養の二つの工程からなる二段培養を行い、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルべンの製造方法。

52. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、糖濃度が 2〜50g/i 及び又は硝酸イオン濃度が 2〜50腳 ol/lである培地に組織又は細胞を移植した後、当該培地の初期容量に対して 1日当たり 0. 2~ 5 g/l の糖及び又は（. 2〜5删01/1の硝酸イオンを含む栄養源溶液を連続的又は間欠的に添加して培養し、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の製造方法。

53. 栄養源溶液を添加するに際して、同容量の培地を組織又は細胞から分離して抜き出すことによって培地を更新しながら培養を行い、得られる培養物、培養途中に抜き出しによって回収される培地及び培養終了時に得られる培地から選ばれる少なくとも 1種以上からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とする請求の範囲第 5 2項記載の製造方法。

54. 培養槽中の培養液の総容量を V、新鮮培地の供給速度を V , 、組織又は細胞の比増殖速度を； Xとするとき、無次元数 F ^ V i ZVZ Iで定義する培地の比更新率を 0. 1〜10の範囲となるように連続的又は間欠的に新鮮培地を添加し、連続的もしくは間欠的に糟外に抜き出される組織もしくは細胞を含む培養液及び Z又は連続的もしくは間欠的に槽外に抜き出される組織もしくは細胞を含まない培養液からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の製造方法。

δδ. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養槽を用いて培養するにあたって、槽内に導入する酸素含有ガスとして 0. 03〜10%の炭酸ガスを含有するガスを用いて培養することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の製造方法。

56. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気相中の酸素濃度を大気中の酸素濃度未満の条件下に培養初期から制御して培養を行う力 \ 或いは組織又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度をその温度における飽和溶存酸素濃度未満である条件下に培養初期から制御して培養を行い、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。

57. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気相中の酸素濃度を 4ないし 15%に制御するか、或いは組織又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度をその温度における飽和溶存酸素濃度値の 1ないし 75%に制御することを特徴とする請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

58. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気相中の酸素濃度を 6ないし 12%に制御するか、或いは組織又は細胞と接する、流動性の培地中の溶存酸素濃度をその温度における飽和溶存酸素濃度値の 10ないし 75%に制御することを特徴とする請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

59. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、培養器内の気相中の酸素濃度又は流動性の培地中の溶存酸素濃度を、培養器及び /又は培地に供給する気体の酸素濃度を調節することによって制御するか、或いは培養器及び Z又は培地に供給する気体の供給速度を調節することによって制御することを特徴とする請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

60. 培養器内の気相中の酸素濃度、又は組織もしくは細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度の制御を培養開始時ないし培養開始後 7日目に開始し、その後少なくとも 3日間行うことを特徴とする請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

61. タキサン型ジテルペンがタキソ一ル、 7—ェピタキソール、パッカチン III 、 7—ェピパッカチン III 、セファロマニン、 7—ェピセファロマニン、 10 一デァセチルバッカチン III 、 10—デァセチルセファロマニン、 10—デァセチルタキソ一ル、タキサギフィン、キシロシルセファロマニン及びキシロシルタキソ —ルよりなる群から選ばれた少なくとも一つである請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

62. タキサン型ジテルペンを産生する植物がイチィ属 f直物であることを特徴とする請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

63. ジャスモン酸類の存在下に培養する請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

64. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、酸化剤又は水溶性の含酸素有機化合物を添加した培地を用いて行う一段目培養と、請求の範囲第 5 6項記載の製造方法に従って行う二段目培養の二つの工程からなる二段培養を行い、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。

65. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養するに当たり、糖濃度が 2〜50g/l 及び Z又は硝酸イオン濃度が 2〜50mmol/lである培地に組織又は細胞を移植した後、当該培地の初期容量に対して 1日当たり G. 2〜5 g/1 の糖及び Z又は 0. 2~ 5ranol/lの硝酸ィオンを含む栄養源溶液を連続的又は間欠的に添加して培養し、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とする請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

66. 栄養源溶液を添加するに際して、同容量の培地を組織又は細胞から分離して抜き出すことによって培地を更新しながら培養を行い、得られる培養物、培養途中に抜き出しによって回収される培地及び培養終了時に得られる培地から選ばれる少なくとも 1種以上からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とする請求の範囲第 6 5項記載の製造方法。

67. 培養槽中の培養液の総容量を V、新鮮培地の供給速度を V i 、培養物から組織又は細胞を分離した培養液を槽外に抜き出す速度を V _L 、組織又は細胞を含む培養液を槽外に抜き出す速度を V _c 、組織又は細胞の比増殖速度をとするとき、無次元数 F = V , /VZiiで定義する培地の比更新率を 0. 1〜10の範囲となるように連続的又は間欠的に新鲜培地を添加し、連続的もしくは間欠的に槽外に抜き出される組織もしくは細胞を含む培養液及び Ζ又は連続的もしくは間欠的に槽外に抜き出される組織もしくは細胞を含まない培養液からタキサン型ジテルべンを回収することを特徴とする請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

68. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養槽を用いて培養するにあたって、槽内に導入する酸素含有ガスとして 0.03〜10%の炭酸ガスを含有するガスを用いて培養することを特徴とする請求の範囲第 5 6項記載の製造方法。

69. タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織又は細胞を培養槽を用いて培養するにあたって、槽内に導入する酸素含有ガスとして 0, 03〜10%の炭酸ガスを含有するガスを用いて培養し、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルべンの製造方法。

70. タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも一つの層に含まれる細胞を培養し、それらの中からタキサン型ジテルべン高産生培養細胞を選択することを特徴とするタキサン型ジテルぺン高産生培養細胞の取得方法。

71 . タキサン型ジテルペンを産生する植物がイチィ属植物である請求の範囲第 7 0項記載の方法。

72. 比重 1. 07以下の層に含まれる細胞を培養することを特徴とする請求の範囲第 7 0項記載の方法。