CN1251391A - 获得紫杉烷类双萜的高生产性培养细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获得紫杉烷类双萜的高生产性培养细胞的方法,其中按照其比重差异将产生紫杉烷类双萜的植物培养细胞分配于多层中,并且对至少一层中所含的细胞进行培养,然后从这些培养细胞中选择出紫杉烷类双萜的高生产性培养细胞。

Description

获得紫杉烷类双萜的高生产性培养细胞的方法
本申请是申请号为94191435.6、申请日为1994年11月9日、发明名称为“紫杉烷类双萜的生产方法以及获得以高产量产生紫杉烷类双萜的培养细胞的方法”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及适于用作卵巢癌、乳腺癌和肺癌等的治疗剂的紫杉烷类双萜(包括紫杉酚)的生产方法，以及获得以高产量产生紫杉烷类双萜的培养细胞的方法。
紫杉醇适于用作卵巢癌、乳腺癌和肺癌等的治疗剂，它是从短叶紫杉中分离后鉴定出的紫杉烷类双萜，短紫杉是一种紫杉属、紫杉科植物，并且具有与其活性相关的复合酯基。在短叶紫杉的植物体的所有部分中均可发现紫杉醇，但是据报道，树皮中紫杉醇的含量超过了所有其它部分中的含量。目前，从天然的或培养的植物体中收集紫杉醇，但是紫杉属植物生长缓慢，而且其生长至距地20cm需要10年以上，这还不算剥掉树皮后树会死亡，因此不易得到大量紫杉醇。如果能够通过组织培养制备紫杉烷类双萜如紫杉醇和作为紫杉醇前体的浆果赤霉素III，那么可以容易地获得大量紫杉醇而不需要砍树，因此是有利的。
作为通过利用培养的植物细胞生产紫杉醇的常规方法，美国专利公开了利用培养的短叶紫杉的生产方法(US5,019,504)，但是，其中所述紫杉醇的产率为1-3mg/l，这不足以工业化生产。此外，通过细胞培养生产紫杉醇不稳定，甚至当可以通过选择得到高生产率的初生细胞时，也难以通过传代培养保持其含量[E.R.M.Wickremesine等，细胞与组织培养国际会仪(1992)]。
另一方面，作为紫杉醇生产的现有技术，Holton等的US5,015,744说明书中描述了由浆果赤霉素III(紫杉醇生物合成中的前体)开始的半合成方法。通过使用植物组织培养物，可以制备用于半合成方法的原料如浆果赤霉素III，因此该植物组织培养物也可以通过上述半合成方法用于生产紫杉醇。
本发明的第一个目的是提供通过植物组织培养物生产紫杉烷类双萜的简单方法。
本发明的第二个目的是提供获得以高产量产生紫杉烷类双萜的培养细胞的方法。
本申请的第一个发明是生产紫杉烷类双萜的方法，其中在至少一种选自茉莉酮酸类化合物(jasmonic acids)、含重金属的化合物、含重金属的复合离子、重金属离子、胺和抗乙烯(antiethylene)剂的物质存在下，培养产生紫杉烷类双萜的植物组织或细胞，然后从所得培养物中回收紫杉烷类双萜。
本申请的第二个发明是生产紫杉烷类双萜的方法，其中通过自培养开始阶段控制培养瓶中气相氧的浓度低于大气中氧的浓度，或者通过自培养开始阶段控制与组织或细胞接触的液体培养基中溶解的氧浓度低于此温度下饱和溶解的氧的浓度，对产生紫杉烷类双萜的植物组织或细胞进行培养，然后从所得培养物中回收紫杉烷类双萜。
本申请的第三个发明是获得以高产量产生紫杉烷类双萜的培养细胞的方法，其中产生紫杉烷类双萜的植物细胞因其比重不同而分成许多层，双至少一层中的细胞进行培养，然后从培养细胞中选择以高产量产生紫杉烷类双萜的培养细胞。
下面将更详细地描述本发明。
本发明的紫杉烷类双萜没有具体限定为任何双萜，只要它具有紫杉烷骨架即可，其说明性实例包括紫杉醇、7-表紫杉醇、浆果赤霉素III、7-表浆果赤霉素III、cephalomannine、7-epicephalomannine、10-脱乙酰基浆果赤霉素III、10-脱乙酰基cephalomannine、10-脱乙酰基紫杉醇、taxagifine及其类似物、紫杉烷1a及其类似物、木糖基cephalomannine和木糖基紫杉醇等。
本发明用于生产紫杉烷类双萜的植物是例如：紫杉属，例如欧洲紫杉、东北紫杉、东北紫杉var.nana REHDER、短叶紫杉、加拿大紫杉、红豆杉和米堤亚紫杉。
按照本申请的第一个发明，可以通过已知的方法进行上述植物培养，只是要在至少一种下述物质存在下培养产生紫杉烷类双萜的植物组织或细胞，这些物质是茉莉酮酸类化合物、含重金属的化合物、含重金属的复合离子、重金属离子、胺和抗乙烯剂。
用于本申请第一个发明的茉莉酮酸类化合物的实例包括通式(I)所示的化合物：[其中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e和R1f各自表示氢原子、羟基、具有1-6个碳原子的烷基、或具有1-6个碳原子的烷氧基；R2、R3、R4、R5和R6a各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6组成的侧链可以含有一个或多个双键；R6b表示羟基或-O-糖残基；R7表示羟基，OM(其中M是碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NHR8(其中R8表示氢原子、具有1-6个碳原子的酰基、具有1-6个碳原子的烷基或氨基酸残基)、OR9(其中R9是具有1-6个碳原子的烷基或糖残基)、或具有1-6个碳原子的烷基；n是1-7的整数；并且在上述五元环中，可以在相邻的碳原子之间形成双键]，
通式(II)所示的化合物：[其中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e和R1f各自表示氢原子、羟基、具有1-6个碳原子的烷基、或具有1-6个碳原子的烷氧基；R2、R3、R4、R5和R6各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6组成的侧链可以含有一个或多个双键；R7表示羟基，OM(其中M是碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NHR8(其中R8表示氢原子、具有1-6个碳原子的酰基、具有1-6个碳原子的烷基或氨基酸残基)、OR9(其中R9是具有1-6个碳原子的烷基或糖残基)、或具有1-6个碳原子的烷基；n是1-7的整数；并且在上述五元环中，可以在相邻的碳原子之间形成双键]，
通式(III)所示的化合物：
Figure A9911015200062
[其中，R1a、R1b、R1c、R1d、R1e和R1f各自表示氢原子、羟基、具有1-6个碳原子的烷基、或具有1-6个碳原子的烷氧基；R2、R3、R4、R5和R6各自表示氢原子或具有1-6个碳原子的烷基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6组成的侧链可以含有一个或多个双键；R7表示羟基，OM(其中M是碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NHR8(其中R8表示氢原子、具有1-6个碳原子的酰基、具有1-6个碳原子的烷基或氨基酸残基)、OR9(其中R9是具有1-6个碳原子的烷基或糖残基)、或具有1-6个碳原子的烷基；n是1-7的整数；并且在上述五元环中，可以在相邻的碳原子之间形成双键]。
优选的上述通式(I)所示的茉莉酮酸类化合物的实例包括通式(I′)所示化合物：
Figure A9911015200071
[其中，R1′表示氢原子或羟基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6组成的侧链可以在C1与C2、C2与C3或C3与C4之间含有一个双键；R6b表示羟基或-O-糖残基；R7′表示羟基，OM(其中M是碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NHR8′(其中R8′表示氢原子、具有1-4个碳原子的酰基、具有1-4个碳原子的烷基或氨基酸残基)、OR9′(其中R9′是具有1-4个碳原子的烷基或糖残基)；n是1-7的整数；并且在上述五元环中，可以在相邻的碳原子之间形成双键]，
优选的上述通式(II)所示的茉莉酮酸类化合物的实例包括通式(II′)所示化合物：
Figure A9911015200081
[其中，R1′表示氢原子或羟基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6组成的侧链可以在C1与C2、C2与C3或C3与C4之间含有一个双键；R7′表示羟基，OM(其中M是碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NHR8′(其中R8′表示氢原子、具有1-4个碳原子的酰基、具有1-4个碳原子的烷基或氨基酸残基)、OR9′(其中R9′是具有1-4个碳原子的烷基或糖残基)；n是1-7的整数；并且在上述五元环中，可以在相邻的碳原子之间形成双键]，
优选的上述通式(III)所示的茉莉酮酸类化合物的实例包括通式(III′)所示化合物：
Figure A9911015200082
[其中，R1′表示氢原子或羟基；由C1-C2-C3-C4-C5-C6组成的侧链可以在C1与C2、C2与C3或C3与C4之间含有一个双键；R7′表示羟基，OM(其中M是碱金属原子、碱土金属原子或NH4)、NHR8′(其中R8′表示氢原子、具有1-4个碳原子的酰基、具有1-4个碳原子的烷基或氨基酸残基)、OR9′(其中R9′是具有1-4个碳原子的烷基或糖残基)；n是1-7的整数；并且在上述五元环中，可以在相邻的碳原子之间形成双键]。
在上述通式(I)、(II)和(III)中，以R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5、R6、R6a、R7、R8或R9表示的具有1-6个碳原子的烷基的实例包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。
在上述通式(I)、(II)和(III)中，以R1a、R1b、R1c、R1d、R1e或R1f表示的具有1-6个碳原子的烷氧基的实例包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基和正己氧基。
当R7是OM时，以M表示的碱金属原子或碱土金属原子的实例包括例如钠、钾和钙。
当R7是NHR8时，以R8表示的具有1-6个碳原子的酰基可以是直链的或支链的，其实例包括例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基和丙烯酰基。
当R7是NHR8时，以R8表示的氨基酸残基的实例包括异亮氨酰基、酪氨酰基和色氨酰基。
当R7是OR9时，以R9表示的糖残基的实例是吡喃葡糖基，并且当上述通式(I)中的R6b是-O-糖残基时，糖残基的实例是吡喃葡糖基。
在上述通式(I)、(II)和(III)所示的化合物中，可以在五元环中相邻的碳原子之间形成双键。
通式(I)所示化合物的说明性实例包括下述化合物：(化合物A)(化合物B)(化合物C)
Figure A9911015200103
(化合物D)
Figure A9911015200104
通式(II)所示化合物的说明性实例包括下述化合物：(化合物E)
Figure A9911015200111
(化合物F)
Figure A9911015200112
(化合物G)
Figure A9911015200113
(化合物H)
Figure A9911015200114
通式(III)所示化合物的说明性实例包括下述化合物：(化合物I)R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5、R6：HC3与C4之间形成双键R7：-OH或-OCH3n：1-3(化合物J)R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5、R6：HR7：-OHn：1。
其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e或R1f是羟基或者在五元环中的相邻碳原子之间形成双键的通式(III)所示化合物的说明性实例包括下述化合物：(水合物K)
              (1)n＝1，R＝H
              (2)n＝7，R＝H
              (3)n＝7，R＝OH(化合物L)
Figure A9911015200122
(1)R＝H(2)R＝OH(化合物M)
Figure A9911015200131
(化合物N)
Figure A9911015200132
通式(I)、(II)或(III)所示化合物的优选实例包括：其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6是氢原子，R7是羟基或甲氧基，由C1-C2-C3-C4-C5-C6组成的侧链不含双键或者在C1与C2、C2与C3或C3与C4之间含有一个双键的化合物。
用于本发明的以通式(I)、(II)或(III)表示的茉莉酮酸类化合物具有各种立体异构体(顺-反异构体和旋光异构体)，每个异构体可以单独使用或者以混合物的形式使用。
上述所有的茉莉酮酸类化合物都可以改善紫杉烷类双萜的生产率，但是，从其高效改善生产率的角度出发，特别优选的是块根油酮酸(tuberonic acid)、块根油酮酸甲酯(methyl tuberonate)、南瓜子酸(cucurbic acid)、南瓜子酸甲酯(methyl cucurbate)、茉莉酮酸和茉莉酮酸甲酯(它们是其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6是氢原子，R7是羟基或甲氧基，n是1，且在C3与C4之间形成双键的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物)。
这些茉莉酮酸类化合物是通过合成或者提取等方法从植物中产生的(H.Yamane等，Agric.Biol.Chem.，44，2857-2864(1980))。
附带说一下，有关于各种植物本身以植物激素类物质的形式产生茉莉酮酸类化合物的说明，所述植物激素类物质可引起各种与生长促进、组织成熟和表现为抵抗疾病有关的各种反应(TeruhikoYoshihara.Shokubutsu Saibo Kogaku，Vol 2，No.4 523-531(1990))。
因此，本发明所涉及的茉莉酮酸类化合物不仅能从培养体系的外部加入，也可以由培养细胞或培养组织自身产生。促进培养细胞或培养组织产生这种内源性茉莉酮酸类化合物的方法的实例包括向培养基中加入微生物培养物、其提取物或其热处理的物质或者植物提取物，这种方法的说明性实例是加入真菌细胞壁部分，参见M.J.Mueller等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(16)，7490-9494(1993))。通过用机械方法或者用紫外线处理或加热的方法部分损伤培养细胞或培养组织，也可以增加内源性茉莉酮酸类化合物的产量，这种方法的一个说明性实例是将一部分细胞机械破碎(R.A.Cleeman等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(11)，4938-4941(1989))。
由于茉莉酮酸类化合物难溶于水，因此通常将其溶于有机溶剂如乙醇和甲醇中，或者将其溶于表面活性剂等中，然后加至培养基中。可以使用游离形式的茉莉酮酸类化合物本身，或者使用其用碱中和的盐的形式。
在茉莉酮酸类化合物中，以通式(I)或(III)表示的化合物中倾向于以稳定的反式而非不稳定的顺式形式存在，因为通过酸、碱或加热可在五元环中羰基的α-位发生差向异构作用。在使用天然或合成茉莉酮酸类化合物的平衡试验中，反式茉莉酮酸类化合物以90％的比例存在，而顺式茉莉酮酸类化合物以10％的比例存在。一般认为顺式茉酮酸类化合物具有更高的活性。但是，本发明所用的茉莉酮酸类化合物包括上述式(I)或(III)所示化合物的所有立体异构体及其混合物。
培养基中茉莉酮酸类化合物的浓度需要为0.01-1000μM，并且按照本申请的第一个发明，特别优选的是控制茉莉酮酸类化合物的浓度为0.1-500μM。
在DE 4122208 C1中描述了通过向植物细胞培养物中加入茉莉酮酸类化合物诱导产生某些次级代谢产物，但是，未见有关在茉莉酮酸类化合物作为培养基添加剂存在下对产生紫杉烷类双萜的植物进行组织培养的报道，而且出乎所有预料的是通过本申请第一个发明的方法增加了紫杉烷类双萜的产量，这里紫杉烷类双萜与上述专利中所述次级代谢产物具有完全不同的生物合成途径或生物合成控制机理。
在国际专利公开WO 93/17121中描述了茉莉酮或甲基茉莉酮可以有效地诱导紫杉醇产生，这里所述的茉莉酮或甲基茉莉酮具有与式(I)、(II)或(III)所示茉莉酮酸类化合物相似的结构。但是这些化合物不象茉莉酮酸类化合物那样具有式(I)、(II)或(III)中由式-(CH2)n-CO-R7所示的基团例如羧基，而且发现这些化合物的紫杉醇诱导活性很低(参见比较实施例24)。
用于本申请第一个发明的重金属没有特别限定为任何重金属，只要其属于铜或铁族即可，但是作为铜族的金属，特别优选使用银，作为铁族的金属，特别优选使用钴。除此之外，当使用银或钴时，优选以含有所述重金属的化合物、含有所述金属的复合离子形式或以所述金属离子的形式使用。这些化合物可以单独使用或者结合使用。
含银化合物的说明性实例包括硝酸银、硫酸银、氟化银、氯酸银、高氯酸银、醋酸银、亚硫酸银、六氟磷酸银(V)、四氟硼酸银、硫酸双胺合银(I)和二氨基合银酸(I)钾(potassium diamiuoargentate)等。其中，可以列举的特别优选的化合物是硝酸银和硫酸银等。
含银复合离子的说明性实例包括：[Ag(S2O3)2]3-、[Ag(S2O3)3]5-、[Ag(NH3)2]+、[Ag(CN)2]-、[Ag(CN)3]2-、[Ag(SCN)2]-和[Ag(SCN)4]3-等。其中，可以列举的特别优选的复合离子是[Ag(S2O3)2]3-和[Ag(S2O3)3]5-等。
含钴化合物的说明性实例包括：氯化钴、硝酸钴、硫酸钴、氟化钴、高氯酸钴、溴化钴、碘化钴、硒酸钴、硫氰酸钴、醋酸钴、硫酸钴铵、硫酸钴(II)钾、氯化六胺合钴(III)、氯化五胺合钴(III)、氯化硝基五胺合钴(III)、氯化二氯四胺合钴(III)半水合物、氯化二硝基四胺合钴(III)、氯化碳酸根四胺合钴(III)、四硝基二胺合钴酸(III)铵、六硝基合钴酸(III)钠、氯化三(乙二胺)合钴(III)三水合物、氯化二氯二(乙二胺)合钴(III)、三(草酸根)合钴酸(III)钾三水合物、六氰基合钴酸(III)钾、(乙二胺四乙酸根)合钴酸(III)钾二水合物、氢四羰基合钴(I)、二羰基(环戊二烯基)合钴(I)、八羰基合二钴(O)、六羰基乙炔合二钴(O)、二(环戊二烯基)合钴(I)和(环戊二烯基)(1，5-环辛二烯)合钴(I)等。
含钴复合离子的说明性实例包括：五胺水合(aqua)钴离子、硝基五胺合钴离子、二氯四胺合钴离子、二硝基四胺合钴离子、碳酸根四胺合钴离子、四硝基二胺合钴离子、六硝基合钴离子、三(乙二胺)合钴离子、二氯二(乙二胺)合钴离子、三(草酸根)合钴离子、六氰基合钴离子和(乙二胺四乙酸根)合钴离子等。
在所述重金属中，含银化合物、含银复合离子或银离子在培养基中的浓度优选为10-8M-10-1M，进一步优选的浓度为10-7M-10-2M。含钴化合物、含钴复合离子或钴离子在培养基中的浓度优选为10-6M-10-1M，进一步优选的浓度为10-5M-10-2M。
迄今为止，未见有关在含银化合物、含银复合离子或银离子作为培养基添加剂存在下对产生紫杉烷类双萜的植物进行组织培养的报道。尽管在通常用作紫杉属植物组织培养的培养基(例如linsmaier-Skoog培养基。Murashige-Skoog培养基和Gamborg’s B-5培养基)中包括作为培养基成分之一的含钴化合物或钴离子，但是其使用浓度为1×10-7M-4×10-7M[Growth and breeding of a woody plant，由thelatest biotechnology complete works editors committee编辑，NogyoTosho，第265-268页]，这远低于本发明方法所用的浓度。同时，象上述银化合物的情况一样，未见有关在本申请第一个发明中所用的高浓度的含钴化合物或钴离子存在下对产生紫杉烷类双萜的植物进行组织培养的报道。此外，出乎所有预料的是通过在这些重金属存在下进行培养，增加了紫杉烷类双萜的产量。
按照本申请的第一个发明，术语“胺类”是指胺或其盐。作为用于本申请第一个发明的胺类，可以使用单胺类或多胺类，但是，特别优选使用多胺类。
此外，用于本申请第一个发明的胺类的实例包括：单-、二-或三烷基胺，其中烷基的部分氢原子可以被羟基取代，例如甲胺、乙胺、二甲胺、二乙胺、三乙胺、二乙醇胺、三乙醇胺或其盐；多亚甲基二胺，其中多亚甲基部分可以被亚氨基中断，并且氨基中的氢可以被低级烷基取代，例如腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、乙二胺、N，N-二乙基-1，3-丙二胺、三亚乙基四胺或其盐；环烷胺例如环戊胺、环己胺或其盐；或环胺如六亚甲基四胺和哌嗪或其盐。在这些胺中，可以列举的优选的胺是多胺如腐胺[NH2(CH2)4NH2]、尸胺[NH2(CH2)5NH2]、亚精胺[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2]、精胺[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2]、乙二胺[NH2(CH2)2NH2]、N，N-二乙基-1，3-丙二胺[(C2H5)2N(CH2)3NH2]、二亚乙基三胺[NH2(CH2)2NH(CH2)2NH2]等或其盐。
所述胺在培养基中的浓度优选为10-8M-10-1M，进一步优选的浓度为10-7M-10-2M。
通过向植物组织培养物中加入胺诱导产生次级代谢产物的一个说明性实例可见于日本专利公开4-262788，其中通过向长春化的培养细胞中加入胺诱导了吲哚生物碱的产生。但是，未见有关在胺作为培养基添加剂存在下对产生紫杉烷类双萜的植物(这是与长春花不同种的植物)进行组织培养的报道，并且出乎所有预料的是，由此可以增加紫杉烷类双萜的产量，这里紫杉烷类双萜与吲哚生物碱具有完全不同的生物合成途径。
用于本申请第一个发明的抗乙烯剂没有特别限定为任何具体的物质，只要它是抑制培养物的乙烯生物合成机理的物质和/或去除培养物中保留的乙烯或者去除在含培养物的培养瓶中于气相中或培养基中存在的乙烯的物质即可。
抑制乙烯生物合成机理的方法的说明性实例包括如下：抑制将S-腺苷甲硫氨酸催化转化为1-氨基环丙烷-1-甲酸的酶的活性的方法和抑制将1-氨基环丙烷-1-甲酸催化转化为乙烯的酶的活性的方法，具有前一功能的化合物的说明性实例包括：氨基羟乙酸(aminoxyaceticacid)、乙酰水杨酸、Rhizobitoxine、氨基乙氧基乙烯基甘氨酸、甲氧基乙烯基甘氨酸、α-氨基异丁酸和2，4-二硝基苯酚等。还可以包括所述化合物的盐、酯、氨基酸衍生物和糖衍生物。
盐的说明性实例包括钠、钾、钙和镁盐；酯的说明性实例包括甲酯、乙酯、丙酯和丁酯；氨基酸衍生物的说明性实例包括甘氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸衍生物；糖衍生物的说明性实例包括葡萄糖和麦芽糖衍生物。本发明的盐、酯、氨基酸衍生物和糖衍生物不仅仅限于上述化合物。
具有后一功能的化合物的说明性实例包括五倍子酸、其盐、酯、氨基酸衍生物和糖衍生物[Hiroshi Hyodo，Society of HorticultureAutumn Convention 1987 Symposium Summary，p.122，SusumuKuraishi，Phytohormone，Tokyo University Publication，p.111]。
盐的说明性实例包括钠、钾、钙和镁盐；酯的说明性实例包括甲酯、乙酯、丙酯和丁酯；氨基酸衍生物的说明性实例包括甘氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸衍生物；糖衍生物的说明性实例包括葡萄糖和麦芽糖衍生物。本发明的盐、酯、氨基酸衍生物和糖衍生物不仅仅限于上述化合物。
去除培养物中保留的乙烯或者去除在含培养物的培养瓶中于气相中或培养基中存在的乙烯的物质的说明性实例包括：1，5-环辛二烯和异硫氰酸及其盐、酯(例如异硫氰酸烯丙酯和异硫氰酸苄酯)、氨基酸衍生物和糖衍生物[Megumi Munakata，Chemical control in plants，29(1)，89-93(1994)]。
盐的说明性实例包括钠、钾、钙和镁盐；酯的说明性实例包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯和烯丙酯；氨基酸衍生的说明性实例包括甘氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸衍生物；糖衍生物的说明性实例包括葡萄糖和麦芽糖衍生物。本发明的盐、酯、氨基酸衍生物和糖衍生物不仅仅限于上述化合物。
抗乙烯剂在培养基中的所需浓度为10-8M-10-1M，特别优选的是控制抗乙烯剂的浓度为10-7M-10-2M。
已知乙烯是一种植物激素，参与许多植物中出现的各种生理现象，例如个体生长、形态发生和老化。Kim，Dong II等在Biotechnol.Bioeng.，38(4)，331-339(1991)中报道了一个利用乙烯提高植物次级代谢产物的生产率的说明性实例。但是，正如上述报道中通常表明的那样，在所有利用控制乙烯来提高次级代谢产物的生产率的实例中，都是控制对植物组织培养物补充乙烯，而迄今为止，未见有关象本发明方法一样利用对抑制乙烯产生的控制来改善次级代谢产物生产的报道。
此外，抗乙烯剂一般用作花、水果和蔬菜的保鲜剂，而未见有关将抗乙烯剂用于改善次级代谢产物生产的报道。
在这种情况下，本发明人发现，乙烯通过产生紫杉烷类双萜的植物组织和细胞大大抑制了紫杉烷类双萜的产生。因此，基于上述发现，发明人在抗乙烯剂存在下对所述组织培养物进行了培养，结果发现，抗乙烯剂不仅控制了上述抑制作用，而且还明显提高了从培养物中获得紫杉烷类双萜的量。到目前为止，未见有关通过在抗乙烯剂存在下培养产生紫杉烷类双萜的植物组织培养物诱导紫杉烷类双萜产生的报道，并且出乎所有预料的是上述次级代谢产物的生产率甚至可以通过本申请第一个发明的方法得以提高。
用于本申请第一个发明的培养基的实例包括植物组织培养惯用的那些已知培养基，例如Murashige & Skoog培养基(1962)、linsmaier& Skoog培养基(1965)、木本植物培养基(1981)、Gamborg’s B-5培养基和Mitsui’s M-9培养基。
植物激素，以及如果需要，碳源、无机成分、维生素、氨基酸等也可以加入这些培养基中。
作为碳源，可以使用二糖如蔗糖、麦芽糖和乳糖，单糖如葡萄糖、果糖和半乳糖，淀粉或者以适当比例混合的两种或更多种这些糖源的混合物。
无机成分的说明性实例包括：磷、氮、钾、钙、镁、硫、铁、锰、锌、硼、铜、钼、氯、钠、碘和钴，这些成分可以以化合物的形式加入，例如：硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙、氯化钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸钠、磷酸亚铁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、硫酸铜、钼酸钠、三氧化钼、碘化钾和氯化钴等。
作为植物激素，可以使用例如植物生长素如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及细胞激动素如激动素、玉米素和二氢玉米素。
作为维生素，可以使用例如生物素、硫胺(维生素B1)、吡哆素(维生素B6)、泛酸、肌醇和烟酸等。
作为氨基酸，可以使用例如甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸等。
一般来说，碳源的使用浓度约为1-30g/l，无机成分的使用浓度约为0.1μM-100mM，植物激素的使用浓度约为0.01-10μM，而维生物和氨基酸的使用浓度分别为约0.01-100mg/l。
按照本发明，液体培养基和通常含有0.1-1％琼脂和gelan胶的固体培养基都可以使用，但是，一般优选使用液体培养基。
本发明的组织培养可以使用所述植物的一部分根的组织或细胞、生长点、叶、茎、种子、花粉、花药及花萼等，或者使用在上述培养基或其它常用培养基中通过其组织培养得到的培养细胞。
本发明还可以用于通过用根瘤土壤杆菌或发根病土壤杆菌感染植物获得的赘生性细胞/或发根。
通过在至少一种选自茉莉酮酸类化合物、含重金属的化合物、含重金属的复合离子、重金属离子、胺和抗乙烯剂的物质存在下对这些组织和细胞进行培养，可以得到比在一般培养条件下进行组织培养所得到的培养组织或培养细胞具有更高紫杉烷类双萜生产率的培养组织或培养细胞。
当至少一种选自含重金属的化合物、含重金属的复合离子、重金属离子、胺和抗乙烯剂的物质与上述通式(I)、(II)或(III)所示的茉莉酮酸类化合物一起使用时，本申请第一个发明的作用得以加强。
通过用有机溶剂如甲醇萃取，可以从培养物例如按照上述方法获得的培养组织、培养细胞和培养基中分离出紫杉烷类双萜。通过使合适的吸附剂或有机溶剂共存于培养基中，还可以在培养过程中连续回收紫杉烷类双萜。
对本发明一个优选的组织培养实例可以进行如下说明。
将一片紫杉属植物的植物体，例如根、生长点、叶、茎、和种子等灭菌，置于用gelan胶固化的木本植物培养基中，于10-35℃保持约14-60天，这样一部分组织碎片就变成了愈伤组织。通过将如此得到的愈伤组织传代培养，生长速度逐渐增加，并且得到稳定的愈伤组织。术语稳定的愈伤组织是指在培养过程中保持愈伤组织状态而没有分化成茎叶或根，并且它的细胞生长速度均匀的愈伤组织。
将这种稳定的愈伤组织转入适于生长的液体培养基例如液体木本植物培养基中，并使其生长。在液体培养基中生长速度进一步增加。按照本发明，使稳定的愈伤组织或构成上述愈伤组织的细胞在至少一种选自茉莉酮酸类化合物、含重金属的化合物、含重金属的复合离子、重金属离子、胺和抗乙烯剂的物质存在下，于固体培养基或液体培养基中生长。而且，还可以根据稳定的愈伤组织或构成所述愈伤组织的细胞的比重的不同将其分成多层，并且使至少一层中所含有的细胞在含有至少一种选自茉莉酮酸类化合物、含重金属的化合物，含重金属的复合离子、重金属离子、胺和抗乙烯剂的物质的培养基中生长。
在一般的按其比重将细胞分层的已知方法中，由用于离心分离的培养基形成密度梯度，将细胞在其上分层，然后进行离心分离。
作为离心分离用的培养基，可以使用Ficoll、Percoll(均由Pharmacia LKB Biotechnology Co.Ltd.生产)、蔗糖和氯化铯等。在包括实施例5在内的实施例中，通过使用Ficoll产生密度梯度，培养基没有特别限定为任何物质，只要其不损伤细胞即可。
形成密度梯度的层数没有别限定。对各层的比重之差没有具体限制，而且各层的比重之差可以相同或不同。
因此，密度梯度的定义包括其中梯度连续变化的情况(即其中形成密度梯度的层数接近于无穷大，而且各层间的比重差接近于0)。
通过如此形成密度梯度、使细胞分层和进行离分分离，可以按其比重的差别将细胞分成多层。
所形成的层的比重一般为1.00-1.20g/ml、优选1.03-1.11g/ml。作为用于培养的层，至少选择一层，但是也可以选择所有的层，并对其进行培养。
当选择了多层并对所选层中所含的细胞进行培养时，可以将细胞在各层中分别培养，但是，也可以将所选多层的两层或更多层中的细胞混合并进行培养。
通过培养比重为1.07或更低的层中所含的细胞，一般可以得到具有高紫杉烷类双萜生产率的培养细胞，但是也不总是限定在这样的比重范围内，因为比重会随所培养的细胞或培养条件而波动。还有一种趋势，就是当按比重差异进行分层时，较高比重层中的细胞具有较高的紫杉烷类双萜含量。因此，为了确保可以得到以高产量生产紫杉烷类双萜的培养细胞，需要将分配在所有层中的细胞培养一段时间，然后测定各层细胞中紫杉烷类双萜的浓度，并从这些层中选择含有以高产量生产紫杉烷类双萜的培养细胞的层。
通过制备具有特定比重(如1.07g/ml)的离心分离用培养基并按上述方法进行离心分离，也可以按比重的差异将细胞分成多层。
再者，本申请第一个发明可以与本申请第二个发明一起使用，其中通过自培养的开始阶段控制培养瓶中气相氧的浓度低于大气中氧的浓度、或者通过自培养的开始阶段控制与组织或细胞接触的液体培养基中溶解氧的浓度低于在同样温度下饱和溶解的氧浓度，进行培养。
在这里，术语“培养的开始阶段”是指从开始培养至培养开始后的第7天这一段时间，而控制培养瓶中气相氧的浓度或者控制与组织或细胞接触的液体培养基中溶解氧的浓度优选从培养开始时进行。控制时间没有特别的限制，并且在所述条件下的控制可以在整个培养期间进行，或者只是在整个培养期间的一部分时间内进行，但是优选在整个培养期间至少控制3天。
培养瓶中气相氧的浓度需要控制在4-15％、特别优选控制在6-12％。液体培养基中溶解氧的浓度需要控制在于同样温度下饱和溶解氧浓度的1-75％、特别优选控制在10-75％。
还可以将本申请的第一个发明、本申请的第二个发明与本申请的第三个发明全部结合在一起。
按照本申请的第一个发明，当培养细胞处于指数生长期或平稳期时加入茉莉酮酸类化合物是有效的，并且特别优选在从指数生长期至平稳期的过渡阶段中加入茉莉酮酸类化合物。同样可以述及的是旨在增加内源性茉莉酮酸类化合物产量的处理时间。例如，当对细胞进行各为21天的传代培养时，第7-16天是加入茉莉酮酸类化合物或者进行处理以增加内源性茉莉酮酸类化合物产量的适宜时间，而且当细胞在指数生长期、例如在7-14天进行传代培养时，适宜的时间是移植后的当即。加入茉莉酮酸类化合物或者进行处理以增加内源性茉莉酮酸类化合物产量可以一次性、分多次或连续进行。
在培养开始后以及在培养细胞从指数生长期至平稳期的过渡阶段前加入含重金属的化合物、含重金属的复合离子或重金属离子是有效的，特别优选在培养开始时加入。所述化合物或离子的加入可以一次性或分多次进行。
在细胞从指数生长期至平稳期的过渡阶段前加入胺是有效的，特别优选在培养开始时加入。所述化合物的加入可以一次性或分多次进行。
在细胞从指数生长期至平稳期的过渡阶段前加入抗乙烯剂是有效的，特别优选在过渡到平稳期后立即加入。所述化合物的加入可以一次性或分多次进行。
本申请第一个发明的组织培养温度一般为约10-35℃，根据高生长速度，优选约23-28℃。培养周期优选为14-42天。
当液体培养基用于本申请第一个发明的培养时，在培养完成后可以通过例如倾析或过滤等方法从培养基中分离出培养细胞，并且通过例如用有机溶剂萃取等方法，可以从培养的细胞和/或培养基中分离出所需的紫杉烷类双萜。
下面说明本申请的第二个发明。
按照本申请的第二个发明，培养植物是指培养植物的组织或细胞，其中按常规的已知方法进行培养，不同的是：自培养的开始阶段通过控制培养瓶中气相氧的浓度低于大气中氧的浓度、或者自培养的开始阶段通过控制与组织或细胞接触的液体培养基中溶解氧的浓度低于在同样温度下饱和溶解的氧浓度，进行培养。
迄今为止，在生产紫杉烷类双萜的植物的培养中，未见有关在如此条件下进行培养的报道，所述条件是：补充给进行组织或细胞培养的培养瓶的气相氧的浓度或者与组织或细胞接触的培养基中溶解氧的浓度低于大气中氧的浓度或者低于饱和溶解的氧浓度，并且出乎所有预料的是由此增加了紫杉烷类双萜的产量。
按照本申请的第二个发明，进行组织或细胞培养的培养瓶中气相氧的浓度需要控制在4-15％、特别优选控制在6-12％。与组织或细胞接触的液体培养基中溶解氧的浓度需要控制在同样温度下饱和溶解氧浓度的1-75％、特别优选控制在10-75％。
用于本申请第二个发明的培养基的实例包括植物组织培养惯用的那些已知培养基，例如Murashige & Skoog培养基(1962)、Linsmaier& Skoog培养基(1965)、木本植物培养基(1981)、Gamborg’s B-5培养基Mitsui’s M-9培养基等。
植物激素，以及如果需要，碳源、无机成分、维生素、氨基酸等也可以加入这些培养基中。
作为碳源，可以使用二糖如蔗糖、麦芽糖和乳糖，单糖如葡萄糖、果糖和半乳糖，淀粉或者以适当比例混合的两种或更多种这些糖源的混合物。
无机成分的说明性实例包括：磷、氮、钾、钙、镁、硫、铁、锰、锌、硼、铜、钼、氯、钠、碘和钴，这些成分可以以化合物的形式加入，例如：硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙、氯化钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸钠、磷酸亚铁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、硫酸铜、钼酸钠、三氧化钼、碘化钾和氯化钴等。
作为植物激素，可以使用例如植物生长素如吲哚乙酸(LAA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及细胞激素如激动素、玉米素和二氢玉米素。
作为维生素，可以使用例如生物素、硫胺(维生素BI)、吡哆素(维生素B6)、泛酸、肌醇和烟酸等。
作为氨基酸，可以使用例如甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸等。
一般来说，碳源的使用浓度约为1-30g/l，无机成分的使用浓度约为0.1μM-100mM，植物激素的使用浓度约为0.01-10μM，而维生物和氨基酸的使用浓度分别为约0.01-100mg/l。
按照本申请的第二个发明，液体培养基和通常含有0.1-1％琼脂和gelan胶的固体培养基都可以使用。
本申请第二个发明的组织培养可以使用所述植物根的组织碎片或细胞、生长点、叶、茎、种子、花粉、花药及花萼等，或者使用在上述培养基或其它常用培养基中通过其组织培养得到的培养细胞。
本申请第二个发明还可以用于通过用根瘤土壤杆菌或发根病土壤杆菌感染植物获得的赘生性细胞/或发根。
当自培养的开始阶段通过控制培养瓶中气相氧的浓度低于大气中氧的浓度、或者自培养的开始阶段通过控制与组织或细胞接触的液体培养基中溶解氧的浓度低于同样温度下饱和溶解的氧浓度，对这些组织或细胞进行培养时，可以得到比一般培养条件下进行组织培养所得到的培养组织或培养细胞具有更高紫杉烷类双萜生产率的培养组织或培养细胞。
按照本申请的第二个发明，“培养的开始阶段”是指从开始培养至培养开始后的第7天这一段时间，而控制培养瓶中气相氧的浓度、或者控制与组织或细胞接触的液体培养基中溶解氧的浓度优选从培养开始时进行。
控制时间没有特别的限制，并且在所述条件下的控制可以在整个培养期间进行，或者只是在整个培养期间的一部分时间内进行，但是优选在整个培养期间至少控制3天。
可以将本申请第二个发明的制备方法与在各种紫杉烷类双萜生产促进物质存在下进行的培养方法一起使用，以进一步提高紫杉烷类双萜的生产率。
紫杉烷类双萜生产促进物质的实例包括例如用于上述本申请第一个发明的、上述通式(I)、(II)或(III)所示的茉莉酮酸类化合物、含重金属的化合物、含重金属的复合离子、重金属离子、胺和抗乙烯剂。
还可以将申请的第二个发明与下面将要详述的本申请的第三个发明一起使用，其中按照其比重的差异将细胞分配于多层中，并且对至少一层中所含的细胞进行培养。
可以将本申请第二个发明的制备方法与所述本申请第一个发明的方法(其中在茉莉酮酸类化合物等存在下进行培养)以及本申请第三个发明的方法(其中按照其比重的差异将细胞分配于多层中，并且对至少一层中所含的细胞进行培养)一起使用。
通过用有机溶剂如甲醇萃取，可以从培养物例如按照上述方法获得的培养组织、培养细胞和培养基中分离出紫杉烷类双萜。
对本申请第二个发明的一个优选的组织培养实例可以进行如下说明。
将一片紫杉属植物的植物体，例如根、生长点、叶、茎、和种子等灭菌，置于用gelan胶固化的木本植物培养基中，于10-35℃保持约14-60天，这样一部分组织碎片就变成了愈伤组织。通过将如此得到的愈伤组织传代培养，生长速度逐渐增加，并且得到稳定的愈伤组织。术语稳定的愈伤组织是指在培养过程中保持愈伤组织状态而没有分化成茎叶或根，并且它的细胞生长速度均匀的愈伤组织。
将这种稳定的愈伤组织转入适于生长的液体培养基例如液体木本植物培养基中，并使其生长。在液体培养基中生长速度进一步增加。按照本发明，使稳定的愈伤组织或构成上述愈伤组织的细胞在下述培养条件下生长，其中自培养的开始阶段控制培养瓶中气相氧的浓度低于大气中氧的浓度、或者自培养的开始阶段控制与组织或细胞接触的液体培养基中溶解氧的浓度低于同样温度下饱和溶解的氧浓度。
通过消耗氧(呼吸作用)，组织或细胞获得用于维持和个体生长所需的能量。众所周知，当培养组织或细胞时，随着培养时间的推移，细胞质量增加，氧的消耗也增加。因此，除非从体系外部强行补充流通气体，否则随着培养时间的推移，含有组织或细胞的培养瓶(例如烧瓶)中气相氧的浓度、或者与组织或细胞接触的培养基中溶解氧的浓度自然下降到低于大气中氧的浓度或者同样温度下饱和溶解的氧浓度。
本发明与上述发现的不同之处在于通过将含有组织或细胞的培养瓶中气相氧的浓度、或者培养基中溶解氧的浓度能动地控制在低于大气中氧的浓度或同样温度下饱和溶解的氧浓度，进行培养。
在增强本发明效果的一个说明性方法中，在增养瓶中的组织或细胞进行传代培养之前，将培养瓶中气相氧的浓度或者液体培养基中溶解氧的浓度预先控制在低于大气中氧的浓度或者同样温度下饱和溶解的氧浓度。
如上所述，控制时间没有特别的限制，但是优选在整个培养期间至少控制3天。
此外，控制方法没有特别的限制，只要该方法可以将含有组织或细胞的培养瓶中气相氧的浓度、或者与组织或细胞接触的液体培养基中溶解氧的浓度控制在低于大气中氧的浓度或者同样温度下饱和溶解的氧浓度即可，该方法的某些实例是：将通过使空气与氮气等混合(以降低氧浓度)得到的、具有控制的氧浓度的气体直接通入培养瓶中的气相中或培养基中；或者将这样的气体直接通入培养瓶外面的培养基中(即在通气罐等中)，然后将该培养基倒入培养瓶中；或者将补充到培养瓶中的气体(如空气)以控制喂入速度的方式直接通入气相或培养基中；或者将此气体直接通入培养瓶外面的培养基中(即在通气罐等中)，然后将此培养基倒入培养瓶中；或者将培养瓶置于低氧气氛下进行培养；或者在氧吸附剂存在下进行培养。
本发明的组织培养温度一般为约10-35℃，根据高生长速度，优选约23-28℃。培养周期优选为14-42天。
当液体培养基用于本发明的培养时，在培养完成后可以通过例如倾析或过滤等方法从培养基中分离出培养细胞，并且通过例如用有机溶剂萃取等方法，可以从培养的细胞和/或培养基中分离出所需的紫杉烷类双萜。通过使吸附剂或合适的有机溶剂共存于培养体系中，还可以在培养过程中连续回收所需的化合物。
下面说明本申请的第三个发明。
按照本申请的第三个发明，可以列举的含有培养细胞(所述细胞经培养后显示了高紫杉烷类双萜生产率)的层是比重为1.07或更低的层。
在一般的按其比重将细胞分层的已知方法中，由用于离心分离的培养基形成密度梯度，将细胞在其上分层，然后进行离心分离。
作为离心分离用的培养基，可以使用Ficoll、Percoll(均由Pharmacia LKB Biotechnology Co.Ltd.生产)、蔗糖和氯化铯等。在实施例中，通过使用Ficoll产生密度梯度，但是培养基没有特别限定为任何物质，只要其不损伤细胞即可。Ficoll已经用于分离核外粒体等(Hess，R.等，Nature 208(1965)，856-858)或者用于分离动物细胞(Walder，I.A.等，Proc.Soc.Exptl.Biol.Med.，112(1963)494-496)等。
形成密度梯度的层数没有特别限定。
在实施例中，由比重为1.03、1.05、1.07、1.09和1.11(g/ml)的层形成了各层比重之差为0.02的密度梯度，但是比重之差并不限于该值，而且各层比重之差可以相同或不同。
因此，密度梯度的定义包括其中梯度连续变化的情况(即其中形成密度梯度的层数接近于无穷大，而且各层间的比重差接近于0)。
通过如此形成密度梯度、使细胞分层和进行离心分离，可以按其比重的差异将细胞分成多层。
所形成的层的比重一般为1.00-1.20g/ml、优选1.03-1.11g/ml。作为用于培养的层，至少选择一层，但是也可以选择所有的层，并对其进行培养。
当选择了多层并对所选层中所含的细胞进行培养时，可以将细胞在各层中分别培养，但是，也可以将所选多层的两层或更多层中的细胞混合并进行培养。
通过培养比重为1.07或更低的层中所含的细胞，一般可以得到具有高紫杉烷类双萜生产率的培养细胞，但是也不总是限定在这样的比重范围内，因为比重会随所培养的细胞或培养条件而波动。还有一种趋势，就是当按比重的差异进行分层时，较高比重层中的细胞具有较高的紫杉烷类双萜含量。因此，为了确保可以得到以高产量生产紫杉烷类双萜的培养细胞，需要将分配在所有层中的细胞培养一段时间，然后测定各层细胞中紫杉烷类双萜的浓度，并从这些层中选择含有以高产量生产紫杉烷类双萜的培养细胞的层。
迄今为止，未见有关在按照细胞的比重将其分配之后、对产生紫杉烷类双萜的植物培养细胞进行培养的报道，并且出乎所有预料的是，按照比重之差可以将细胞分成具有不同紫杉烷类双萜生产率的多个细胞层，而且通过培养比重为1.07或更低的层中所含的且在被分配时其紫杉烷类双萜的含量并没有如此之高的细胞可以得到以高产量生产紫杉烷类双萜的细胞。
按照本发明，还可以根据比重的不同，通过制备具有特定比重(例如1.07g/ml)的、用于离心分离的培养基，并按照上述方法进行离心分离，将培养细胞分成多层。
本发明所用培养基包括通常的培养基成分。作为这样的成分，通常使用无机成分和碳源，还可以加入植物激素、维生素、以及(如果需要)氨基酸。作为碳源，可以使用二糖如蔗糖、麦芽糖和乳糖，单糖如葡萄糖、果糖和半乳糖，淀粉或者以适当比例混合的两种或更多种这些糖源的混合物。
无机成分的说明性实例包括：磷、氮、钾、钙、镁、硫、铁、锰、锌、硼、铜、钼、氯、钠、碘和钴，这些成分可以以化合物的形式加入，例如：硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙、氯化钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸钠、磷酸亚铁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、硫酸铜、钼酸钠、三氧化钼、碘化钾和氯化钴等。
作为植物激素，可以使用例如植物生长素如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及细胞激动素如激动素、玉米素和二氢玉米素。
作为维生素，可以使用例如生物素、硫胺(维生素B1)、吡哆素(维生素B6)、泛酸、肌醇和烟酸等。
作为氨基酸，可以使用例如甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸等。
一般来说，无机成分的使用浓度约为0.1μM-100mM，碳源的使用浓度约为1-30g/l，植物激素的使用浓度约为0.01-10μM，而维生物和氨基酸的使用浓度分别为约0.01-100mg/l。
用于本发明的培养基的实例包括植物组织培养惯用的那些已知培养基，例如Murashige & Skoog培养基(1962)、Linsmaier & Skoog培养基(1965)、木本植物培养基(1981)、Gamborg’s B-5培养基和Mitsui’s M-9培养基。其中可以加入上述植物激素、以及(如果需要)上述碳源、维生素和氨基酸。
按照本发明，液体培养基和通常含有0.1-1％琼脂和gelan胶的固体培养基都可以使用，但是优选使用液体培养基。
本发明的组织培养可以使用所述植物根的组织碎片或细胞、生长点、叶、茎、种子、花粉、花药及花萼等，或者使用在上述培养基或其它常用培养基中通过其组织培养得到的培养细胞。
与没有进行分层的对照区域相比，通过将这些细胞分成特定的比重范围、然后按照本发明对其进行培养，可以得到具有较高紫杉烷类双萜生产率的培养细胞。通过用有机溶剂如甲醇萃取，可以从这些培养细胞中分离出紫杉烷类双萜。
本发明一个优选的组织培养实例可以进行如下说明。
将一片紫杉属植物的植物体，例如根、生长点、叶、茎、和种子等灭菌，置于用gelan胶固化的木本植物培养基中，于10-35℃保持约14-60天，这样一部分组织碎片就变成了愈伤组织。通过将如此得到的愈伤组织传代培养，生长速度逐渐增加，并且得到稳定的愈伤组织。术语稳定的愈伤组织是指在培养过程中保持愈伤组织状态而没有分化成茎叶或根，并且它的细胞生长速度均匀的愈伤组织。
将这种稳定的愈伤组织转入适于生长的液体培养基例如液体木本植物培养基中，并使其生长。在液体培养基中生长速度进一步增加。
本发明的组织培养温度一般为约10-35℃，根据高生长速度，优选约23-28℃。培养周期优选为14-42天。
当液体培养基用于本发明的培养时，在培养完成后可以通过例如倾析或过滤等方法从培养基中分离出培养细胞，并且通过例如用有机溶剂萃取等的方法，可以从中分离出所需的紫杉烷类双萜。
按照本申请的第一个发明的第二个发明，可以容易地获得大量紫杉烷类双萜。
按照本申请的第三个发明，可以通过简单的操作获得以高产量生产紫杉烷类双萜的培养细胞。
当本申请的第一个、第二个或第三个发明工业化实施时，通过单独或者结合使用本申请的下列第四、第五、第六或第七个发明，可以进一步增加其效率。
这就是说，必需向培养液中补充含氧气体以培养产生紫杉烷类双萜的植物组织或细胞。空气一般用于此目的，但是，经过深入的研究之后，本发明发现：通过使用含有0.03-10％、优选0.1-5％二氧化碳的气体作为通入对产生紫杉烷类双萜的植物组织或细胞进行培养的罐中的气体，可以有效地生产紫杉烷类双萜，从而完成了本申请的第四个发明。
本申请人还发现：通过对产生紫杉烷类双萜的植物组织或细胞进行两阶段培养，可以明显提高培养物中紫杉烷类双萜的生产率，并且可以控制因传代培养所造成的紫杉烷类双萜生产率的波动，所述两阶段包括第一阶段和第二阶段，在第一阶段中使用加入了氧化剂或水溶性含氧有机化合物的培养基，以便获得在随后的阶段中用于生产紫杉烷类双萜的活化的组织或细胞，第二阶段是在促进紫杉烷类双萜生产的条件下进行的，这样便完成了本申请的第五个发明。在此，氧化剂的实例包括过硫酸盐如过硫酸钾和过氧化氢，水溶性含氧有机化合物的实例包括二甲基甲酰胺、二甲亚砜和乙二醇等。上述添加剂在培养基中的总浓度在加入后的当即优选为10-6M-10-1M，更优选的是将其浓度控制在10-5M-10-2M。
本发明人还发现：通过将组织或细胞接种于含有浓度为2-50g/l、优选10-30g/l的糖化物和/或浓度为2-50mmol/l、优选10-30mmol/l的硝酸根离子的培养基中，然后通过每天向培养基中连续或间歇加入含有0.2-5g/l、优选0.5-3g/l糖化物和/或0.2-5mmol/l、优选0.5-3mmol/l硝酸根离子的营养源(相对于所述培养基的初始体积)，可以对产生紫杉烷类双萜的植物组织或细胞进行高密度培养，由此每一培养瓶中紫杉烷类双萜的产量可以明显提高，这样便完成了本申请的第六个发明。在此，我们称“密度”为培养瓶中单位体积培养溶液的细胞质量，表示为干细胞质量(g)/升培养溶液。按照本申请的第六个发明，优选在进行培养的同时，通过加入上述营养源溶液、同时从组织或细胞中分离和取出相同体积的培养基对培养基进行更新，并且从至少一种选自所得培养物、培养过程中取出的回收培养基和培养结束时所得的培养基的所得物中回收紫杉烷类双萜。本申请的第六个发明对于改善高密度培养中紫杉烷类双萜的生产率特别有效，其中在开始培养时相对于培养基体积的上述植物的组织或细胞的密度为50g鲜重/升或者更高。
再者，尽管当获得高密度细胞时一般就终止培养，但是，本发明人经过深入的研究，完成了在移出细胞的同时继续培养的连续培养，并且经过进一步检验之后最终完成了连续培养方法，这就是本申请的第七个发明。这就是说，通过下述方法可以以常规方法难以实现的高速度产生紫杉烷类双萜，所述方法是：以0.1-10的特定更新比例(该比例由无量纲数F＝VI/V/μ定义，其中V是培养罐中培养基的总体积，VI是补充新鲜培养基的速度，μ是组织或细胞的具体生长速度)连续或间歇加入新鲜的培养基，并且从连续或间歇从培养罐中取出的、含组织或细胞的培养基中和/或连续或间歇从培养罐中取出的、既不含组织也不含细胞的培养溶液中回收紫杉烷类双萜，这样便完成了本申请的第七个发明。更优选的是将培养基的特定更新比例F设置为0.5-5。培养溶液中糖化物的浓度优选为5-40g/l，培养溶液中硝酸根离子的浓度优选为10-40mmol/l。对于每升中细胞鲜重为50-500g的细胞密度，本发明是有效的，但是，只要其所处的密度范围不需要极剧烈的搅拌，那么密度越高，越能有效地生产紫杉烷类双萜，因此优选的密度为每升200g或者更高。
为了将本申请的上述第四、第五、第六或第七个发明与本申请上述第三个发明结合，可以按照本申请的第四、第五、第六或第七个发明，对本申请第三个发明所得到的细胞进行培养，以生产所需的紫杉烷类双萜。
附图的简要说明
图1是表示在加入100μM茉莉酮酸甲酯后，培养基中紫杉醇产量的变化图。
图2是表示在加入100μM茉莉酮酸甲酯后，培养基中浆果赤霉素III产量的变化图。
图3是对按照本申请第二个发明进行组织培养所使用的培养装置的一个实例的图解说明。图3中所用的每个数字具有如下含义。1空气供入管2氮气供入管3培养瓶4补充含氧气体的分布器5溶解氧的电极6溶解氧的浓度控制器7出口8阀门9氧气流控制阀10空气过滤器11高速搅拌机
图4是表示分层后在培养物中的生长图。
图5是表示分层后培养物中紫杉烷含量的图。
图6是表示细胞在各层中分布的图。
图7是表示各层中紫杉烷含量(在细胞中)的图。
图8是对按照本申请第六或第七个发明进行组织培养所使用的培养装置的一个实例的图解说明。图8中所用的每个数字和字母具有如下含义。12培养基喂入管13培养基喂入口14只用于取出培养基(该培养基不含组织和细胞)的带有过滤器的开口15培养基出口管16补充含氧气体的分布器17高速搅拌机18培养混合物(含组织或细胞的培养溶液)的排出管19加压流入口a、b、c、d和e阀门
实施本发明的最佳方式
用下列实施例和比较实施例进一步说明本发明，但是这些实施例不构成对本发明范围的限制。[实施例1]
将预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等灭菌的欧洲紫杉的一部分茎置于已加有萘乙酸(浓度为10-5M)的固体木本植物培养基(含有0.25％重量的gelan胶)中，在25℃、于黑暗处进行静态培养，以得到欧洲紫杉的愈伤组织。将1克(鲜重)愈伤组织接种于含20ml液体木本植物培养基的锥瓶中，培养基中加有上述成分以达到同样的浓度，并在旋转摇动器上进行摇动培养(振幅25mm，120rpm)，每21天对愈伤组织进行传代培养，以加快其生长速度。
将1克(鲜重)如此得到的培养细胞接种于含有20ml液体木本培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在25℃进行为期14天的摇动培养。在开始培养后的第14天，加入作为通式(I)所示化合物的tuberonic acid的甲酯(通式(I)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6a表示氢原子，R6b是羟基，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之间有一个双键)，以使最终浓度达到0.01-1000μM，然后再培养7天。
培养完成后，经过滤和冷冻干燥收集欧洲紫杉的培养细胞，然后称量干重，得到每升液体培养基中培养细胞的产量。用甲醇等从干燥的愈伤组织中萃取紫杉烷类双萜，通过采用高效液相色谱法与标准的紫杉醇、cephalomannine和浆果赤霉素III比效对其进行测定，以测定紫杉烷类双萜的产量。所得结果示于表1中。[比较实施例1]
实施实施例1的方法，只是不加入tuberonic acid的甲酯。所得结果示于表1中。[实施例2]
实施实施例1的方法，只是从开始培养后的第7天开始，每2天一次，连续4次加入tuberonic acid的甲酯(每次达到25μM的最终浓度，并达到100μM的总浓度)。所得结果示于表1中。[实施例3]
实施实施例1的方法，只是在开始培养后的第一天加入100μM的tuberonic acid的甲酯，然后再进行20天的培养。所得结果示于表1中。[实施例4]
实施实施例1的方法，只是在开始培养后的第7天加入100μM的tuberonic acid的甲酯，然后再进行14天的培养。所得结果示于表1中。
                                        表1
  methyltuberonate的浓度(μM)   细胞产量(g/l)   浆果赤霉素III的产量*)(mg/l)   紫杉醇的产量*)(mg/l)   cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例1实施例1″″″″″″″实施例2实施例3实施例4   00.010.1110100250500100010(25×4)100100   14.314.313.513.213.012.712.511.67.512.97.112.5   0.40.40.50.70.912.214.515.01.213.51.010.5   3.54.65.56.914.816.521.110.63.922.54.015.6   1.21.31.51.82.22.42.22.31.82.31.32.1
*)以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。[实施例5]
首先用不锈钢筛对由实施例1的方法得到的加快生长速度的细胞进行筛分，得到粒度为250-840μM的细胞簇。用Ficoll制备比重为1.07(g/ml)的培养基，将上述细胞铺于其上，并以700rpm的转速离心6分钟。细胞按其比重不同分为两层。分出比重为1.07g/ml或更低的层中所含的细胞，用2％蔗糖溶液洗涤三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗涤后，将1克(鲜重)细胞转入含20ml液体木本植物培养基的锥瓶中，并在25℃摇动培养14天。在培养开始后的第14天，加入tuberonic acid的甲酯，使其最终浓度达到250μM，再培养7天。培养完成后，实施实施例1的方法。所得结果示于表2中。通过将选择具有特定比重的细胞与添加tuberonic acid的甲酯相结合，可以大大提高紫杉烷类双萜的生产率。[比较实施例2]
实施实施例5的方法，只是不加tuberonic acid的甲酯。所得结果示于表2中。
                                      表2
  methyltuberonate的浓度(μM)   细胞产量(g/l)   浆果赤霉素III的产量*)(mg/l)   紫杉醇的产量*)(mg/l)   cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例2实施例5   0250   14.212.2   0.517.4   5.428.3   1.53.1
*)以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。[实施例6]
向按实施例1的方法开始培养后的第14天获得的短叶紫杉的培养细胞中加入250μM tuberonic acid的甲酯，再进行7天的培养。培养完成后，实施实施例1的方法。所得结果示于表3中。[比较实施例3]
实施实施例6的方法，只是不加入tuberonic acid的甲酯。结果示于表3中。[实施例7]
实施实施例6的方法，只是使用米堤亚紫杉的培养细胞。结果示于表3中。[比较实施例4]
实施实施例7的方法，只是不加入tuberonic acid的甲酯。结果示于表3中。
                                    表3
  methyltuberonate的浓度(μM)   细胞产量(g/l)   浆果赤霉素III的产量*)(mg/l)   紫杉醇的产量*)(mg/l)   cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例3实施例6比较实施例4实施例7   02500250   12.510.013.69.5   0.11.40.210.4   0.23.30.35.4   0.20.50.10.5
*)以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。[实施例8]
将预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等灭菌的欧洲紫杉的一部分茎置于已加有萘乙酸(浓度为10-5M)的固体木本植物培养基(含有0.25％(重量)的gelan胶)中，在25℃、于黑暗处进行静态培养，以得到欧洲紫杉的愈伤组织。将1克(鲜重)愈伤组织接种于含20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在旋转摇动器上进行摇动培养(振幅25mm，120rpm)，每21天对愈伤组织进行传代培养，以加快其生长速度。
将1克(鲜重)如此得到的培养细胞接种于含有20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在25℃进行为期14天的摇动培养。在开始培养后的第14天，加入作为一种茉莉酮酸类化合物的cucurbic acid的甲酯(通式(II)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氢原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之间有一个双键)，以使最终浓度达到0.01-1000μM，然后再培养7天。
培养完成后，经过滤和冷冻干燥收集欧洲紫杉的培养细胞，然后称量干重，得到每升液体培养基中培养细胞的产量。用甲醇等从干燥的愈伤组织中萃取紫杉烷类双萜，通过采用高效液相色谱法与标准的紫杉醇、cephalomannine和浆果赤霉素III比较对其进行测定，以测定紫杉烷类双萜的产量。所得结果示于表4中。[比较实施例5]
实施实施例8的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。所得结果示于表4中。[实施例9]
实施实施例8的方法，只是从开始培养后的第7天开始，每2天一次，连续4次加入cucurbic acid的甲酯(每次达到25μM的最终浓度，并达到100μM的总浓度)。所得结果示于表4中。[实施例10]
实施实施例8的方法，只是在开始培养后的第一天加入100μM的cucurbic acid的甲酯，然后再进行20天的培养。所得结果示于表4中。[实施例11]
实施实施例8的方法，只在在开始培养后的第7天加入100μM的cucurbic acid的甲酯，然后再进行14天的培养。所得结果示于表4中。
                                          表4
  methylcucurbate的浓度(μM)   细胞产量(g/l)   浆果赤霉素III的产量*)(mg/l)   紫杉醇的产量*)(mg/l)   cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例5实施例8″″″″″″″实施例9实施例10实施例11   00.010.1.1101002505001000100(25×4)100100   11.311.311.110.410.49.89.69.35.710.56.19.5   0.20.30.30.30.57.210.612.01.214.60.88.4   3.34.35.46.711.315.717.713.14.218.23.916.8   2.42.63.13.34.04.45.33.02.84.12.84.1
*)以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。[实施例12]
首先用不锈钢筛对由实施例8的方法得到的加快生长速度的细胞进行筛分，得到粒度为250-840μM的细胞簇。用Ficoll制备比重为1.07(g/ml)的培养基，将上述细胞铺于其上，并以700rpm的转速离心6分钟。细胞按其比重不同分为两层。分出比重为1.07g/ml或更低的层中所含的细胞，用2％蔗糖溶液洗涤三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗涤后，将1克(鲜重)细胞接种至含20ml液体木本植物培养基的锥瓶中，并在25℃摇动培养14天。在培养开始后的第14天，加入cucurbic acid的甲酯，使其最终浓度达到250μM，再进行7天的培养。培养完成后，实施实施例8的方法。所得结果示于表5中。通过将选择具有特定比重的细胞与添加cucurbic acid的甲酯相结合，可以大大提高紫杉烷类双萜的生产率。[比较实施例6]
实施实施例12的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。所得结果示于表5中。
                                      表5
  methylcucurbate的浓度(μM)   细胞产量(g/l) 浆果赤霉素III的产量*)(mg/l) 紫杉醇的产量*)(mg/l)   cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例6实施例12   0250   11.59.7 0.322.2 4.329.7   2.83.8
*)以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。[实施例13]
向按实施例8的方法开始培养后的第14天获得的短叶紫杉的培养细胞中加入250μM cucurbic acid的甲酯，再进行7天的培养。培养完成后，实施实施例8的方法。所得结果示于表6中。[比较实施例7]
实施实施例13的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。结果示于表6中。[实施例14]
实施实施例13的方法，只是使用米堤亚紫杉的培养细胞。结果示于表6中。[比较实施例8]
实施例14的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。结果示于表6中。
                                      表6
methylcucurbate的浓度(μM)   细胞产量(g/l) 浆果赤霉素III的产量*)(mg/l)   紫杉醇的产量*)(mg/l)   cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例7实施例13比较实施例8实施例14 02500250   12.511.013.612.3 0.11.20.25.2   0.21.30.33.9   0.20.30.10.2
*)以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。[实施例15]
将预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等灭菌的欧洲紫杉的一部分茎置于已加有萘乙酸(浓度为10-5M)的固体木本植物培养基(含有0.25％(重量)的gelan胶)中，在25℃、于黑暗处进行静态培养，以得到欧洲紫杉的愈伤组织。将1克(鲜重)愈伤组织接种于含20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在旋转摇动器上进行摇动培养(振幅25mm，120rpm)，每21天对愈伤组织进行传代培养，以加快其生长速度。
将1克(鲜重)如此得到的培养细胞接种于含有20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在25℃进行为期14天的摇动培养。在开始培养后的第14天，加入作为一种茉莉酮酸类化合物的茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氢原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之间有一个双键，其中90％是反式，10％是顺式)，以使最终浓度达到0.01-1000μM，然后再培养7天。
培养完成后，经过滤和冷冻干燥收集欧洲紫杉的培养细胞，然后称量干重，得到每升液体培养基中培养细胞的产量。用甲醇等从干燥的愈伤组织中萃取紫杉烷类双萜，通过采用高效液相色谱法与标准的紫杉醇、cephalomannine和浆果赤霉素III比较对其进行测定，以测定紫杉烷类双萜的产量。所得结果示于表7中。[比较实施例9]
实施实施例15的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。所得结果示于表7中。[实施例16]
实施实施例15的方法，只是从开始培养后的第7天开始，每2天一次，连续4次加入茉莉酮酸甲酯(每次达到25μM的最终浓度，并达到100μM的总浓度)。所得结果示于表7中。[实施例17]
实施实施例15的方法，只是在开始培养后的第一天加入100μM的茉莉酮酸甲酯，然后再进行20天的培养。所得结果示于表7中。[实施例18]
实施实施例15的方法，只是在开始培养后的第7天加入100μM的茉莉酮酸甲酯，然后再进行14天的培养。所得结果示于表7中。[实施例19]
实施实施例15的方法，只是加入作为一种茉莉酮酸类化合物的茉莉酮酸(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氢原子，R7是羟基，n是1，C3和C4之间有一个双键，其中90％是反式，10％是顺式)，以使最终浓度达到0.01-1000μM。所得结果示于表8中。[比较实施例10]
实施实施例19的方法，只是不加入茉莉酮酸。结果示于表8中。[实施例20]
在加入100μM茉莉酮酸甲酯之前、加入后的第3天以及加入后的第7天，实施例15的培养基中所含的紫杉烷类双萜的分析结果示于图1和图2中。在培养的第7天，约一半紫杉醇和约70％浆果霉素III渗入培养基中。
[比较实施例11]
实施实施例20的方法，只是不加茉莉酮酸甲酯。结果示于图1和图2中。
[实施例21]
首先用不锈钢筛对由实施例15的方法得到的加快生长速度的细胞进行筛分，得到粒度为250-840μM的细胞簇。用Ficoll制备比重为1.07(g/ml)的培养基，将上述细胞铺于其上，并以700rpm的转速离心6分钟。细胞按其比重不同分为两层。分出比重为1.07g/ml或更低的层中所含的细胞，用2％蔗糖溶液洗涤三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗涤后，将1克(鲜重)细胞接种至含20ml液体木本植物培养基的锥瓶中，并在25℃摇动培养14天。在培养开始后的第14天，加入茉莉酮酸甲酯，使其最终浓度达到250μM，再进行7天的培养。培养完成后，实施实施例15的方法，所得结果示于表9中。通过将选择具有特定比重的细胞与添加茉莉酮酸甲酯相结合，可以大大提高紫杉烷类双萜的生产率。[比较实施例12]
实施实施例21的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。所得结果示于表9中。[实施例22]
向按实施例15的方法开始培养后的第14天获得的短叶紫杉的培养细胞中加入250μM茉莉酮酸甲酯，再进行7天的培养。培养完成后，实施实施例15的方法。所得结果示于表10中。[比较实施例13]
实施实施例22的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。结果示于表10中。[实施例23]
实施实施例22的方法，只是使用米堤亚紫杉的培养细胞。结果示于表10中。[比较实施例14]
实施实施例23的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。结果示于表10中。
                                        表7
  茉莉酮酸甲酯的浓度(μM)   细胞产量(g/l)   浆果赤霉素III的产量*)(mg/l)   紫杉醇的产量*)(mg/l)   cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例9实施例15″″″″″″″″实施例16实施例17实施例18   00.010.1110501002505001000100(25×4)100100   12.212.212.111.311.310.99.810.010.65.910.77.29.7   0.20.30.30.40.73.19.212.913.01.214.91.210.6   2.83.24.24.910.810.913.515.112.63.116.74.514.2   1.51.61.61.82.12.22.02.01.91.82.21.72.1
*)以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。
                                        表8
  茉莉酮酸的浓度(μM)   细胞产量(g/l) 浆果赤霉素III的产量*)(mg/l)   紫杉醇的产量*)(mg/l)   cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例10实施例19″″″″″″″″   00.010.1110501002505001000   12.212.212.211.611.511.410.310.110.26.7 0.20.30.30.30.52.57.210.612.01.2   1.22.23.45.98.310.212.814.711.11.2   0.40.60.60.82.62.23.02.71.10.5
*)以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。
                                          表9
  茉莉酮酸甲酯的浓度(μM)   细胞产量(g/l)   浆果赤霉素III的产量*)(mg/l)   紫杉醇的产量*)(mg/l)   cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例12实施例21   0250   12.610.2   0.518.7   6.343.1   2.23.2
*)以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。
                                      表10
  茉莉酮酸甲酯的浓度(μM)   细胞产量(g/l) 浆果赤霉素III的产量*)(mg/l)   紫杉醇的产量*)(mg/l)   cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例13实施例22   0250   12.510.2 0.13.4   0.24.3   0.20.5
比较实施例14实施例23   0250   14.212.6 0.212.4   0.34.4   0.10.2
*)以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。[实施例24]
将预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等灭菌的欧洲紫杉的一部分茎置于已加有萘乙酸(浓度为10-5M)的固体木本植物培养基(含有0.25％(重量)的gelan胶)中，在25℃、于黑暗处进行静态培养，以得到欧洲紫杉的愈伤组织。将1克(鲜重)愈伤组织接种于含20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在旋转摇动器上进行摇动培养(振幅25mm，100rpm)，每21天对愈伤组织进行传代培养，以加快其生长速度。
将1克(鲜重)如此得到的培养细胞接种于含有20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，加入作为含重金属化合物的[Ag(S2O3)2]3-，使其最终浓度达到10-9M-1M。然后在25℃进行为期21天的摇动培养。
培养完成后，过滤和冷冻干燥收集欧洲紫杉的培养细胞，然后称量干重，得到其生长速度。用甲醇等从干燥的愈伤组织中萃取紫杉烷类双萜，通过采用高效液相色谱法与标准的紫杉醇、cephalomannine和浆果赤霉素III比较对其进行测定，以测定紫杉烷类双萜的产量。所得结果示于表11中。[实施例25]
实施实施例24的方法，只是在开始培养后的第7天加入[Ag(S2O3)2]3-，使其最终浓度达到10-3M，再进行14天的培养。培养完成后，实施实施例24的方法。结果示于表11中。[实施例26]
实施实施例24的方法，只是在开始培养后的第14天加入[Ag(S2O3)2]3-，使其最终浓度达到10-3M，再进行7天的培养。培养完成后，实施实施例24的方法。结果示于表11中。[实施例27]
实施实施例24的方法，只是在开始培养后的第18天加入[Ag(S2O3)2]3-，使其最终浓度达到10-3M，再进行3天的培养。培养完成后，实施实施例24的方法。结果示于表11中。[实施例28]
实施实施例24的方法，只是从开始培养(第0天)起，以4天的间隔，连续5次加入[Ag(S2O3)2]3-(每次达到2×10-4M的最终浓度，并达到10-3M的总浓度)。所得结果示于表11中。[实施例29]
实施实施例24的方法，只是在开始培养后的第14天加入茉莉酮酸甲酯(通式(II)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氢原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之间有一个双键)，以使最终浓度达到10-4M。所得结果示于表11中。[实施例30]
实施实施例24的方法，只是将烧瓶置于有气体入口和气体出口的瓶子(容量3000ml)中，然后将瓶子密封，使空气和氮气混合，以使补充到所培养细胞中的气体中氧的浓度达到10％，并且以每分钟25ml的速度经入口补充该气体。所得结果示于表11中。[实施例31]
实施实施例30的方法，只是在培养的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最终浓度达到10-4M。所得结果示于表11中。[实施例32]
实施实施例24的方法，只是在培养开始时(第0天)加入10-3M的硝酸银Ag(NO3)，代替[Ag(S2O3)2]3-。所得结果示于表11中。[实施例33]
实施实施例32的方法，只是在培养的第14天加入10-3M的硝酸银Ag(NO3)代替[Ag(S2O3)2]3-。所得结果示于表11中。[比较实施例15]
实施实施例24的方法，只是不加[Ag(S2O3)2]3-。所得结果示于表11中。[实施例34]
实施实施例24的方法，只是加入氯化钴(CoCl2)代替[Ag(S2O3)2]3-作为含重金属的化合物，使最终浓度达到10-9M-1M。所得结果示于表12中。[实施例35]
实施实施例34的方法，只是在开始培养后的第7天加入氯化钴(CoCl2)代替[Ag(S2O3)2]3-，使最终浓度达到10-5M。再进行14天的培养。培养完成后，实施实施例34的方法。结果示于表12中。[实施例36]
实施实施例34的方法，只是在开始培养后的第14天加入氯化钴，使最终浓度达到10-5M。再进行7天的培养。培养完成后，实施实施例34的方法，结果示于表12中。[实施例37]
实施实施例34的方法，只是在开始培养后的第18天加入氯化钴，使最终浓度达到10-5M。再进行3天的培养。培养完成后，实施实施例34的方法，结果示于表12中。[实施例38]
实施实施例34的方法，只是从开始培养(第0天)起，以4天的间隔，连续5次加入氯化钴(每次达到2×10-6M的最终浓度，并达到10-5M的总浓度)。所得结果示于表12中。[实施例39]
实施实施例34的方法，只是在开始培养后的第14天加入茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氢原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之间有一个双键)，以使最终浓度达到10-4M。所得结果示于表12中。[实施例40]
实施实施例34的方法，只是将烧瓶置于有气体入口和气体出口的瓶子(容量3000ml)中，然后将瓶子密封，使空气和氮气混合，以使补充到所培养细胞中的气体中氧的浓度达到10％，并且以每分钟25ml的速度经入口补充该气体。所得结果示于表12中。[实施例41]
实施实施例40的方法，只是在培养的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最终浓度达到10-4M。所得结果示于表12中。
                                                            表11
  硫代硫酸银的浓度(M)   硝酸银的浓度(M)     茉莉酮酸甲酯的浓度(M)   气相中最大氧浓度(％)     生长速度(倍数)     浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)     cephalomannine的产量a)(mg/l)     紫杉醇的产量a)(mg/l)     紫杉烷的总产量b)(mg/l)
比较实施例15实施例24″″″″″″″″″实施例25实施例26实施例27实施例28实施例29实施例30实施例31实施例32实施例33   010-910-810-710-610-510-410-310-210-1110-310-310-310-310-310-310-300   00000000000000000010-310-3     00000000000000010-4010-400   2020202020202020202020202020202010102020     2.72.72.82.72.62.72.72.72.31.91.22.22.52.92.42.72.72.72.82.8     0.140.200.290.341.061.137.6227.900.720.260.0811.712.290.284.1525.1422.8127.003.012.18     0.560.560.972.472.864.105.115.965.502.150.364.863.831.447.2712.579.0812.347.546.49     0.280.330.761.571.807.9514.5325.135.801.370.2010.644.471.5520.9433.6127.4534.7312.6611.91     0.981.092.024.385.7213.1827.2658.9912.023.780.6427.2110.593.2732.3671.3259.3474.0723.2120.58
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加计算总产量。]
                                                          表12
    氯化钴的浓度(M)     茉莉酮酸甲酯的浓度(M)   气相中最大氧浓度(％)     生长速度(倍数)   浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)   cephalomannine的产量a)(mg/l)     紫杉醇的产量a)(mg/l)     紫杉烷的总产量b)(mg/l)
比较实施例15实施例34″″″″″″″″″实施例35实施例36实施例37实施例38实施例39实施例40实施例41     010-910-810-710-610-510-410-310-210-1110-510-510-510-510-510-510-5     00000000000000010-4010-4   202020202020202020202020202020201010     2.72.52.62.62.43.22.72.21.40.80.63.23.12.92.62.52.72.4   0.140.150.150.162.255.681.641.570.440.1104.362.011.175.3223.0017.6125.85   0.560.560.610.635.796.503.462.030.780.4205.984.371.116.589.467.9915.21     0.280.270.290.298.3216.114.924.380.920.55010.227.101.3215.7630.3226.6433.77     0.980.981.051.0816.3628.2910.027.982.141.08020.5613.483.6027.6662.7852.2474.83
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加计算总产量。][实施例42]
将预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等灭菌的欧洲紫杉的一部分茎置于已加有萘乙酸(浓度为10-5M)的固体木本植物培养基(含有0.25％(重量)的gelan胶)中，在25℃、于黑暗处进行静态培养，以得到欧洲紫杉的愈伤组织。将1克(鲜重)愈伤组织接种于含20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在旋转摇动器上进行摇动培养(振幅25mm，100rpm)，每21天对愈伤组织进行传代培养，以加快其生长速度。
将1克(鲜重)如此得到的培养细胞接种于含有20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，然后加入作为胺的亚精胺，使其最终浓度达到10-9M-1M。然后在25℃进行为期21天的摇动培养。
培养完成后，经过过滤和冷冻干燥收集欧洲紫杉的培养细胞，然后称量干重，得到其生长速度。用甲醇等从干燥的愈伤组织中萃取紫杉烷类双萜，通过采用高效液相色谱法与标准的紫杉醇、cephalomannine和浆果赤霉素III比较对其进行测定，以测定紫杉烷类双萜的产量。所得结果示于表13中。[实施例43]
实施实施例42的方法，只是在开始培养后的第7天加入亚精胺，使其最终浓度达到10-5M，再进行14天的培养。培养完成后，实施实施例42的方法。结果示于表13中。[实施例44]
实施实施例42的方法，只是在开始培养后的第14天加入亚精胺，使其最终浓度达到10-5M，再进行7天的培养。培养完成后，实施实施例42的方法。结果示于表13中。[实施例45]
实施实施例42的方法，只是在开始培养后的第18天加入亚精胺，使其最终浓度达到10-5M，再进行3天的培养。培养完成后，实施实施例42的方法。结果示于表13中。[实施例46]
实施实施例42的方法，只是从开始培养(第0天)起，以4天的间隔，连续5次加入亚精胺(每次达到2×10-6M的最终浓度，并达到10-5M的总浓度)。所得结果示于表13中。[实施例47]
实施实施例42的方法，只是在开始培养后的第14天加入作为一种茉莉酮酸类化合物的茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氢原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之间有一个双键)，以使最终浓度达到10- 4M。所得结果示于表13中。[实施例48]
实施实施例42的方法，只是将烧瓶置于有气体入口和气体出口的瓶子(容量3000ml)中，然后将瓶子密封，使空气和氮气混合，以使补充到所培养细胞中的气体中氧的浓度达到10％，并且以每分钟25ml的速度经入口补充该气体。所得结果示于表13中。[实施例49]
实施实施例48的方法，只是在培养的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最终浓度达到10-4M。所得结果示于表13中。[比较实施例16]
实施实施例42的方法，只是不加亚精胺。所得结果示于表13-15中。[实施例50]
实施实施例42的方法，只是加入精胺代替亚精胺，使最终浓度达到10-9M-1M。所得结果示于表14中。[实施例51]
实施实施例42的方法，只是加入腐胺代替精胺，使最终浓度达到10-9M-1M。所得结果示于表15中。
                                                            表13
    亚精胺的浓度(M)     茉莉酮酸甲酯的浓度(M)   气相中最大氧浓度(％)     生长速度(倍数)   浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)     cephalomannine的产量a)(mg/l)     紫杉醇的产量a)(mg/l)     紫杉烷的总产量b)(mg/l)
比较实施例16实施例42″″″″″″″″″实施例43实施例44实施例45实施例46实施例47实施例48实施例49     010-910-910-710-610-510-410-310-210-1110-510-510-510-510-510-510-5     00000000000000010-4010-4   202020202020202020202020202020201010     2.72.93.13.13.23.13.12.92.02.11.42.92.93.02.92.62.72.6   0.140.310.661.343.616.592.782.630.820.410.106.085.462.956.3018.9613.4319.65     0.560.581.745.796.047.306.494.592.421.000.036.135.322.906.019.747.818.57     0.280.321.9911.7613.5119.2812.9610.093.891.940.0815.2410.205.6315.4321.5519.0529.67     0.981.214.3918.8923.1633.1722.2317.317.133.350.2127.4520.9811.4827.7450.2540.2957.89
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加计算总产量。]
                                            表14
  精胺的浓度(M)   生长速度(倍数)   浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)   cephalomannine的产量a)(mg/l)   紫杉醇的产量a)(mg/l)   紫杉烷的总产量b)(mg/l)
比较实施例16实施例50″″″″″″″″″   010-910-810-710-610-510-410-310-210-11   2.72.92.32.42.42.12.32.02.11.41.0   0.140.500.620.680.892.091.640.760.700.390.10   0.560.641.011.321.975.634.092.681.540.320.04   0.280.721.792.174.039.466.234.781.060.580.08   0.981.863.424.176.8917.1811.968.223.301.290.22
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加，计算总产量。]
                                              表15
    腐胺的浓度(M)     生长速度(倍数)     浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)   cephalomannine的产量a)(mg/l)   紫杉醇的产量a)(mg/l)   紫杉烷的总产量b)(mg/l)
比较实施例16实施例51″″″″″″″″″     010-910-810-710-510-510-410-310-210-11     2.72.82.82.73.03.12.62.21.81.11.0     0.140.360.401.105.746.986.601.951.130.800.01   0.560.701.022.315.515.375.251.880.990.970.22   0.280.691.523.478.1911.4410.803.071.060.970.13   0.981.752.946.8819.4423.7922.656.903.182.740.36
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加，计算总产量。][实施例52]
将预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等灭菌的欧洲紫杉的一部分茎置于已加有萘乙酸(浓度为10-5M)的固体木本植物培养基(含有0.25％(重量)的gelan胶)中，在25℃、于黑暗处进行静态培养，以得到欧洲紫杉的愈伤组织。将1克(鲜重)愈伤组织接种于含20m1液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在旋转摇动器上进行摇动培养(振幅25mm，100rpm)，每21天对愈伤组织进行传代培养，以加快其生长速度。
将1克(鲜重)如此得到的培养细胞接种于含有20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在25℃进行为期14天的摇动培养。在培养开始后的第14天加入作为抗乙烯剂的乙酰水杨酸(HOOCC6H4OCOCH3)，使其最终浓度达到10- 9M-1M。再进行7天的培养。
培养完成后，经过滤和冷冻干燥收集欧洲紫杉的培养细胞，然后称量干重，得到其生长速度。用甲醇等从干燥的愈伤组织中萃取紫杉烷类双萜，通过采用高效液相色谱法与标准的紫杉醇、cephalomannine和浆果赤霉素III比较对其进行测定，以测定紫杉烷类双萜的产量。所得结果示于表16中。[实施例53]
实施实施例52的方法，只是在培养开始时(第0天)加入乙酰水杨酸，使其最终浓度达到10-5M，再进行21天的培养。培养完成后，实施实施例52的方法。结果示于表16中。[实施例54]
实施实施例52的方法，只是在开始培养后的第7天加入乙酰水杨酸，使其最终浓度达到10-5M，再进行14天的培养。培养完成后，实施实施例52的方法。结果示于表16中。[实施例55]
实施实施例52的方法，只是在开始培养后的第18天加入乙酰水杨酸，使其最终浓度达到10-5M，再进行3天的培养。培养完成后，实施实施例52的方法。结果示于表16中。[实施例56]
实施实施例52的方法，只是从开始培养后的第7天开始，以2天的间隔，连续5次加入乙酰水杨酸(每次达到2×10-6M的最终浓度，并达到10-5M的总浓度)。所得结果示于表16中。[实施例57]
实施实施例52的方法，只是在开始培养后的第14天加入茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R4和R6表示氢原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之间有一个双键)，以使最终浓度达到10-4M。所得结果示于表16中。[实施例58]
实施实施例52的方法，只是将烧瓶置于有气体入口和气体出口的瓶子(容量3000ml)中，然后将瓶子密封，使空气和氮气混合，以使补充到所培养细胞中的气体中氧的浓度达到10％，并且以每分钟25ml的速度经入口补充该气体。所得结果示于表16中。[实施例59]
实施实施例58的方法，只是在培养的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最终浓度达到10-4M。所得结果示于表16中。[比较实施例17]
实施实施例52的方法，只是不加乙酰水杨酸。所得结果示于表16中。[参照实施例1]
实施实施例52的方法，只是在培养开始时(第0天)加入10-3M的乙烯利(C2H6O3CIP)代替乙酰水杨酸作为抗乙烯剂。所得结果示于表16中。[参照实施例2]
实施实施例52的方法，只是在培养开始后的第14天加入10-3M的Ethrel代替乙酰水杨酸。所得结果示于表16中。[实施例60]
实施实施例52的方法，只是加入盐酸氨基羟乙酸[(H2NOCH2COOH)2HCl]作为抗乙烯剂，使最终浓度达到10-9M-1M。所得结果示于表17中。[实施例61]
实施实施例52的方法，只是加入五倍子酸丙酯[(HO)3C6H2COOCH2CH2CH3]作为抗乙烯剂，使最终浓度达到10-9M-1M。所得结果示于表18中。
                                                            表16
    乙酰水杨酸的浓度(M)     茉莉酮酸甲酯的浓度(M)   气相中最大氧浓度(％)     乙烯浓度(M)     生长速度(倍数)     浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)     cephalomannine的产量a)(mg/l)     紫杉醇的产量a)(mg/l)     紫杉烷的总产量b)(mg/l)
比较实施例17实施例52″″″″″″″″″实施例53实施例54实施例55实施例56实施例57实施例58实施例59参照实施例1参照实施例2     010-910-810-710-610-510-410-310-210-1110-510-510-510-510-510-510-500     00000000000000010-4010-400   2020202020202020202020202020202010102020     00000000000000000010-310-3     2.72.72.82.92.52.72.72.62.62.01.52.62.72.72.62.42.42.32.72.7     0.140.250.790.790.831.521.481.061.010.580.010.420.911.221.0911.527.2814.790.120.05     0.560.620.641.272.736.966.543.300.700.1201.763.556.395.466.606.466.690.140.16     0.280.480.890.903.0013.4211.154.441.610.700.012.984.229.5810.0215.1111.8018.910.140.09     0.981.352.322.966.5621.9019.178.803.321.400.025.168.6817.1916.5733.2325.5440.390.400.30
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加计算总产量。]
                                                表17
  氨基羟乙酸的浓度(M)   生长速度(倍数)   浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)   cephalomannine的产量a)(mg/l)   紫杉醇的产量a)(mg/l)     紫杉烷的总产量b)(mg/l)
  比较实施例17实施例60″″″″″″″″″   010-910-810-710-610-510-410-310-210-11   2.72.31.81.71.51.71.71.51.51.20.9   0.140.210.610.661.081.301.921.110.320.330   0.560.580.620.650.731.161.220.710.710.260   0.280.590.771.021.191.352.661.610.900.440     0.981.382.002.333.003.815.803.431.931.030
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加，计算总产量。]
                                                表18
    五倍子酸丙酯的浓度(M)     生长速度(倍数)     浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)   cephalomannine的产量a)(mg/l)   紫杉醇的产量a)(mg/l)     紫杉烷的总产量b)(mg/l)
  比较实施例17实施例61″″″″″″″″″     010-910-810-710-610-510-410-310-210-11     2.72.72.72.73.13.03.03.22.91.91.1     0.140.410.420.551.912.820.870.840.690.480.01   0.560.590.680.724.385.074.424.302.010.250   0.280.370.741.527.668.246.986.964.330.650     0.981.371.742.7913.9516.1312.2712.107.031.380.01
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加，计算总产量。][实施例62]
将预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等灭菌的欧洲紫杉的一部分茎置于已加有萘乙酸(浓度为10-5M)的固体木本植物培养基(含有0.25％(重量)的gelan胶)中，在25℃、于黑暗处进行静态培养，以得到欧洲紫杉的愈伤组织。将1克(鲜重)愈伤组织接种于含20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在旋转摇动器上进行摇动培养(振幅25mm，100rpm)，每21天对愈伤组织进行传代培养，以加快其生长速度。
将1克(鲜重)如此得到的培养细胞接种于含有20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并烧瓶置于有气体入口和气体出口的室式容器(容量3000ml)中，然后将室密封，使空气和氮气混合，以使补充到所培养细胞中的气体中氧的浓度达到4-15％，并且以每分钟25ml的速度经入口补充该气体，在25℃进行为期21天的摇动培养。
培养完成后，经过滤和冷冻干燥收集欧洲紫杉的培养细胞，然后称量干重，得到其生长速度。用甲醇等从干燥的愈伤组织中萃取紫杉烷类双萜，通过采用高效液相色谱法与标准的紫杉醇、cephalomannine和浆果赤霉素III比较对其进行测定，以测定紫杉烷类双萜的产量。所得结果示于表19中。[比较实施例18]
实施实施例62的方法，只是将补充到所培养细胞中的气体中氧的浓度控制在20％。所得结果示于表19中。[参照实施例3]
实施实施例62的方法，只是在大气中对接种于培养瓶中的培养细胞进行培养。所得结果示于表19中。[实施例63]
实施实施例62的方法，只是将补充到所培养细胞中的气体中氧的浓度控制在10％，并从培养开始起补充该混合气体，共补充3天，然后补充空气至培养结束(18天)。所得结果示于表19中。[实施例64]
实施实施例62的方法，只是将补充到所培养细胞中的气体中氧的浓度控制在10％，并从培养开始起补充该混合气体，共补充7天，然后补充空气至培养结束(14天)。所得结果示于表19中。[实施例65]
实施实施例62的方法，只是将补充到所培养细胞中的气体中氧的浓度控制在10％，并从培养开始起补充该混合气体，共补充14天，然后补充空气至培养结束(7天)。所得结果示于表19中。[实施例66]
实施实施例62的方法，只是在开始培养后的第14天，加入作为一种茉莉酮酸类化合物的茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氢原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之间有一个双键；其中90％是反式，10％是顺式)，以使最终浓度达到1000μM。所得结果示于表20中。通过将补充低浓度氧与添加茉莉酮酸甲酯相结合，可以显著提高紫杉烷类双萜的生产率。[实施例67]
将85克(鲜重)由实施例62的方法得到的加快生长速度的培养细胞接种于用于搅拌罐培养的罐(容量3000ml)中，该罐具有一个用于测定溶解氧浓度的电极和溶解氧浓度控制器，在该罐中已经倒入了1700ml液体木本植物培养基。然后在25℃进行为期21天的搅拌罐培养，同时通过调节空气与氮气的混合比例，将培养基中溶解氧的浓度控制在0.1ppm或者更低。培养装置的图解示于图3中，所得结果示于表21中。[实施例68]
实施实施例67的方法，只是通过调节混合比例，将溶解氧的浓度控制在1ppm或者更低。所得结果示于表21中。[实施例69]
实施实施例67的方法，只是通过调节混合比例，将溶解氧的浓度控制在2ppm或者更低。所得结果示于表21中。[实施例70]
实施实施例67的方法，只是通过调节混合比例，将溶解氧的浓度控制在4ppm或者更低。所得结果示于表21中。[实施例71]
实施实施例67的方法，只是通过调节混合比例，将溶解氧的浓度控制在6ppm或者更低。所得结果示于表21中。[比较实施例19]
实施实施例67的方法，只是补充空气。所得结果示于表21中。[实施例72]
实施实施例67的方法，只是从培养开始起，通过调节混合比例，将培养基中溶解氧的浓度控制在4ppm或者更低，共控制3天，然后补充空气至培养结束(18天)。所得结果示于表21中。[实施例73]
实施实施例67的方法，只是从培养开始起，通过调节混合比例，将培养基中溶解氧的浓度控制在4ppm或者更低，共控制7天，然后补充空气至培养结束(14天)。所得结果示于表21中。[实施例74]
实施实施例67的方法，只是从培养开始起，通过调节混合比例，将培养基中溶解氧的浓度控制在4ppm或者更低，共控制14天，然后补充空气至培养结束(7天)。所得结果示于表21中。
                                              表19
    气相中最大氧浓度(％)   生长速度(倍数)   浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)   cephalomannine的产量a)(mg/l)   紫杉醇的产量a)(mg/l)   紫杉烷的总产量b)(mg/l)
  比较实施例18实施例62″″″实施例63实施例64实施例65参照实施例3     2047101510c)10c)10c)20   3.012.092.602.902.822.792.622.663.03   0.781.653.373.193.181.333.213.170.77   1.715.247.257.516.864.887.167.161.23   1.461.782.492.962.181.741.751.920.95   3.958.6713.1113.6612.227.9512.1212.252.95
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加计算总产量。][c)：该值表示在补充混合气体期间室式容器中的最大气相氧浓度。]
                                              表20
  气相中最大氧浓度(％)   茉莉酮酸甲酯的浓度(μM)     生长速度(倍数)   浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)   紫杉醇的产量a)(mg/l)   cephalo-mannine的产量a)(mg/l)   紫杉烷的总产量b)(mg/l)
  比较实施例18实施例62实施例66″″   2010101010   00101001000     3.012.902.822.451.47   0.783.192.2611.322.10   1.717.5110.2422.445.04   1.462.961.732.291.47   3.9513.6614.7336.058.61
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加，计算总产量。]
                                            表21
    培养基中最大溶解氧的浓度(ppm) 生长速度(倍数)     浆果赤霉素III的产量a)(mg/l)   紫杉醇的产量a)(mg/l)   cephalo-mannine的产量a)(mg/l)   紫杉烷的总产量b)(mg/l)
  比较实施例19实施例67实施例68实施例69实施例70实施例71实施例72实施例73实施例74 8       (100c))0.1     (1.25c))1       (12.5c))2       (25c))4       (50c))6       (75c))4d)    (50e))4d)    (50e))4d)    (50e))  3.012.202.252.492.752.982.892.622.75     0.580.701.052.443.912.521.623.323.19   1.742.053.695.548.145.694.028.467.72   0.911.121.222.701.801.231.543.082.65   3.233.875.9610.6813.859.447.1814.8613.56
[a)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。][b)：通过将浆果赤霉素III的产量、cephalomannine的产量和紫杉醇的产量相加，计算总产量。][c)：括号中的数字表示在25℃下在比较实施例和各个实施例中最大溶解氧的浓度相对于饱和溶解氧浓度(8ppm)的比例(％)。][d)：该值表示在补充混合气体期间培养基中的最大溶解氧浓度。][e)：括号在数字表示在25℃、在补充混合气体期间各个实施例中最大溶解氧的浓度相对于饱和溶解氧浓度(8ppm)的比例(％)。][实施例75]
将预先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等灭菌的欧洲紫杉的一部分茎置于已加有萘乙酸(浓度为10-5M)的固体木本植物培养基(含有0.25％(重量)的gelan胶)中，在25℃、于黑暗处进行静态培养，以得到欧洲紫杉的愈伤组织。将1克(鲜重)愈伤组织接种于含20ml液体木本植物培养基(向其中加入上述成分以达到同样的浓度)的锥瓶中，并在旋转摇动器上进行摇动培养(振幅25mm，100rpm)，每21天对愈伤组织进行传代培养，以加快其生长速度。
首先用不锈钢筛对将1克(鲜重)如此得到的培养细胞进行筛分，得到粒度为250-840μM的细胞簇。用Ficoll制备比重为1.03、1.05、1.07、1.09和1.11(g/ml)的密度梯度，将上述细胞铺于其上，并以700rpm的转速离心6分钟。细胞按其比重不同分配在各层中。分出每层中所含的细胞，使其不彼此混合，用2％蔗糖溶液洗涤三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗涤后，将约0.1克(鲜重)细胞转入内径为18mm、含0.8ml液体木本植物培养基的培养井中，并在25℃摇动培养21天。培养21天后，将全部细胞转入内径为36mm、含3ml上述液体培养基的培养井中，再于25℃继续摇动培养28天。
培养完成后，经过滤和冷冻干燥收集欧洲紫杉的培养细胞，然后称量干重，得到其在每升液体培养基中的生长量。用甲醇等从干燥的愈伤组织中萃取紫杉烷类双萜，通过采用高效液相色谱法与标准的紫杉醇、cephalomannine和浆果赤霉素III比较对其进行测定，以测定紫杉烷类双萜的产量。所得结果示于表22、图4和图5中。[比较实施例20]
实施实施例75的方法，只是在用不锈钢筛分离细胞簇后，不按密度梯度进行分配。所得结果示于表22、图4和图5中。[实施例76]
实施实施例75的方法，只是使用具有相同母体植物、但在不同阶段形成愈伤组织的培养细胞。条件是：在一组中，收集比重为1.07或更高的层中所含的细胞，并进行培养。所得结果示于表22中。[比较实施例21]
实施实施例76的方法，只是在用不锈钢筛分离细胞簇后，不按密度梯度进行分配。所得结果示于表22中。
                                                表22
  比重范围     细胞产量(g/l)   浆果赤霉素III的含量*)(ppm)     紫杉醇的含量*)(ppm)   cephalomannine的含量*)(ppm)
比较实施例20    -     12.6   1.5     13.0   27.5
实施例75   ＜1.031.03-1.051.05-1.071.07-1.091.09-1.111.11＜     12.512.512.212.611.913.5   7.932.116.30.00.00.0     184.090.893.53.92.12.5   170.3123.7114.112.38.66.3
比较实施例21   -     9.3   256.5     864.0   662.5
实施例76   1.03-1.051.05-1.071.07＜     9.09.99.5   151.3155.719.0     1660.51140.8333.1   1050.2804.0161.3
[*)：用总产量(细胞中+培养基中)除以细胞产量，计算含量。][参照实施例4]
将约0.2克(鲜重)实施例75中得到的、分配于比重为1.03或更低(表22)的层中之后进行培养的细胞接种于内径为36mm、含3ml液体木本植物培养基的培养井中，再于25℃摇动培养28天。培养完成后，细胞再依比重为1.03、1.05、1.07、1.09和1.11(g/ml)的密度梯度进行分配。一经密度梯度分配后，立即收集细胞，并且测定分配细胞的分布及紫杉烷类双萜的含量。所得结果示于表23、图6和图7中。
                                        表23
  比重范围   细胞的分布(％)   浆果赤霉素III的含量*)(ppm)     紫杉醇的含量*)(ppm)   cephalomannine的含量*)(ppm)
参照实施例4   ＜1.031.03-1.051.05-1.071.07-1.091.09-1.111.11＜   20.229.815.18.16.220.5   13.928.171.796.2123.5195.2     123.9216.1315.5475.8619.4609.6   66.5128.7226.0382.6511.8460.2
[*)：用细胞中的产量除以细胞产量，计算含量。][实施例77]
将1克(鲜重)实施例1中所用的相同培养细胞接种于含20ml液体(其中含10-5M-10-2M过硫酸钾)的锥瓶中，并在25℃进行为期21天的第一阶段培养。
培养完成后，经过滤收集培养细胞，一部分细胞用作第二阶段培养的细胞，对剩余的细胞进行细胞产量和细胞中紫杉烷含量的测定。因此，将1克(鲜重)的培养细胞接种于含20ml液体木本植物培养基(向其中加入萘乙酸使浓度达到10-5M)的锥瓶中，在25℃进行为期14天的摇动培养。在培养的第14天，向培养基中加入茉莉酮酸甲酯，使其在培养基中的浓度达到100μM，再继续培养7天。另一方面，将第一阶段培养中所得的剩余细胞冻干，然后测量干重，以得到其在每升液体培养基中的细胞产量。通过高效液相色谱法测定干细胞中紫杉醇的含量。通过与对第一阶段培养中所得细胞进行测定的同样方式，测定第二阶段培养中所得细胞的细胞产量和紫杉醇产量。所得结果示于表24中。[比较实施例22]
实施实施例77的方法，只是不使用过硫酸钾。所得结果示于表24中。
                                    表24
         第一阶段培养所用的添加剂        第一阶段培养的结果          第二阶段培养的结果
    培养基中过硫酸钾的浓度   添加时间     细胞产量(g/l)   紫杉醇的含量(ppm)   细胞产量(g/l)   紫杉醇的产量(mg/l)
实施例77     10-5M10-4M5×10-4M10-3M5×10-3M   第1天″″″″     17.116.215.515.214.0   972501838445   15.615.014.413.012.1   14.020.416.313.611.7
比较实施例22     -   -     16.5   53   15.4   10.1
[实施例78]
将100克(鲜重)实施例1中所用的相同培养细胞接种于装有1升标准液体木本植物培养基(蔗糖浓度：20g/l，硝酸根离子浓度：14.7mM，α-萘乙酸：10-5M)(其中加有2mM[Ag(S2O3)2]-3)、用于搅拌罐培养的罐(容量2升；图8)中，以40rpm的搅拌速度在25℃、于黑暗中开始培养，同时以每分钟0.1升的速度通入空气，从培养的第2天开始至第14天连续补充含20g/l蔗糖和20mM硝酸钠的培养基，使得1天加入的蔗糖量为2g/l，1天加入的硝酸根离子的量为2mmol/l，并且通过排出口(这不同于营养源供入口，而且其上连有一个100目的不锈钢过滤器)连续取出培养溶液，该取出速度与加入营养源溶液的速度(培养瓶中，培养基的更新比例为每天10％)相同，以此进行为期21天的搅拌罐培养。培养完成后，收集培养细胞和培养基，按与所述实施例1中所用相同的方法测定紫杉醇的产量。所得结果示于表25中。[比较实施例23]
实施实施例78的方法，只是中途不加入营养源。所得结果示于表25中。
                               表25
    细胞产量(g干重/l)               紫杉醇的产量(mg/l)
    细胞中     培养基中     总量
实施例78     38     31     89     125
比较实施例23     22     33     27     60
[实施例79]
将约50克(鲜重)实施例1中所用的相同培养细胞和1升液体木本植物培养基转入培养罐(容量2升)中，以40rpm的搅拌速度和每分钟0.1升的通气速度在25℃、于黑暗中进行为期14天的培养。在开始培养后的第14天测量的沉淀细胞体积(PCV)为0.2升。从第14天开始，补充新鲜的培养基(其中在与初始培养基具有同样组成的培养基中加入了[Ag(S2O3)2]-3)、并取出不含细胞的培养溶液。新鲜培养基每天的补充量为在同一时间PCV的2/5，而不含细胞的培养溶液的取出量则控制在1升。在培养开始后的第35天，PCV达到0.6升。此后，通过每天一次取出含细胞的培养溶液，以保持平均PCV为0.6升，并且通过取出不含细胞的培养溶液，保持培养溶液的量为1升，从而保持平稳状态。在培养开始后进行为期90天的培养。在60天的平稳期内补充的新鲜培养基的量为15升，从培养罐中取出的培养基的量为14天，得到的细胞量为0.15kg(干重)，特定生长速度μ为0.08(天-1)，平均培养基更新比例为2.88。在平稳期从培养罐中取出的细胞和培养基的分析结果表明：产生了525mg紫杉酚。这相当于8.8mg/升/天的生产率。
按与实施例1中所用相同的方法测定细胞和培养基中紫杉醇的含量。[实施例80]
将50克(鲜重)实施例1中所用的相同培养细胞和1升液体木本植物培养基转入培养罐(容量2升)中，以40rpm的搅拌速度在25℃、于黑暗中进行为期14天的培养，同时以每分钟0.1升的速度通入加有2％二氧化碳的空气。培养完成后，收集细胞和培养基，得到15.2克干燥的细胞。按与实施例1中所用相同的方法测定细胞和培养基中紫杉醇的含量，结果表明产生了31克紫杉醇。[比较实施例24]
实施实施例1的方法，只是加入茉莉酮代替methyl tuberonate，以使最终浓度达到0.01-1000μM。所得结果示于表26中。[比较实施例25]
实施比较实施例24的方法，只是不加茉莉酮。所得结果示于表26中。
                                      表26
    茉莉酮的浓度(μM)   细胞产量(g/l) 浆果赤霉素III的产量*)(mg/l)     紫杉醇的产量*)(mg/l)     cephalomannine的产量*)(mg/l)
比较实施例24″″″″比较实施例25     0.111010010000   12.212.111.311.310.912.2 0.30.40.30.30.20.2     3.03.23.33.22.52.8     1.21.00.80.60.81.5
[*)：以总产量(细胞中+培养基中)为基础计算产量。]
工业实用性
本发明可以工业化生产紫杉烷类双萜，包括适于用作卵巢癌、乳腺癌和肺癌等的治疗剂的紫杉醇。

Claims (3)

1.获得紫杉烷类双萜的高生产性培养细胞的方法，其中按照其比重差异将产生紫杉烷类双萜的植物培养细胞分配于多层中，并且对至少一层中所含的细胞进行培养，然后从这些培养细胞中选择出紫杉烷类双萜的高生产性培养细胞。
2.按照权利要求1的方法，其中产生紫杉烷类双萜的植物是紫杉属植物。
3.按照权利要求1的方法，其中对在比重为1.07或者更低的层中所含的细胞进行培养。
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