WO1994026881A1 - LIQUEFYING ALKALINE α-AMYLASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND DETERGENT COMPOSITION CONTAINING THE SAME - Google Patents

Description

明 細 書

液化型アル力リ α—アミラーゼ、 その製造法及びこれを含有する洗浄剤組成物 技術分野

本発明は洗浄剤の配合成分として有用な液化型アル力リ α—アミラーゼ、 その 製造法及びこれを含有する洗浄剤組成物に関する。 背景技術

α—アミ ラーゼは、 澱粉、 アミ ロース、 アミ ロぺクチン等の澱粉系多糖 類の分子中の _α — 1 4グルコシド結合のみを切断する酵素で、 1 8 3 3年に P a y e nと P e r s o zにより麦芽抽出液より初めて見出されて以来、 バチルス ズブチリス マールブルダ （B a c i l l u s s u b t i l i s Ma r b u r ) ^ バチルス ズブチリス ナツ トウ （B a c i l l u s s u b t i l i s n a t t o ) 、 バチノレス ア ミ ロ リ ケ フ ァ シエ ンス (B a c i l l u s amy l o l i q u e f a c i e n sノ 、 'チノレス リケ ニフォルミ ス （B a c i 1 l u s 1 i c h e n i f o rm i s) バチルス セ レウス （B a c i l l u s c e r e u s ) くチルス サ一キュラ ンス (B a c i l l u s c i r c u l a n s) チルス マセランス

( B a c i 1 l u s ma c e r a n s) 、 シュ一 ドモナス シュッッッエ リ (P s e u d omo n a s s t u t z e r i ) 、 ク レブ'シエラ ァエロケ不ス (K l e b u s i e l l a a e r o g e n e s) 等のバチルス属を中心とする 細菌、 ス ト レプ卜マイセス グリセウス （S t r e p t omy c e s

g r i s e u s ) 等の放線菌、 ァ スペルギルス オ リ ザェ (A s p e r g i l l u s o r y z a e ) 、 ァスぺノレギノレス 二ガー (A s p e r g i l l u s n i g e r) 等のァスペルギルス属を中心とする力 ビ類、 イネ科及びマメ科植物の種子、 ヒ ト及びブタなどの動物の消化腺など多く の生物から結晶標品ぁるいは電気泳動的に均一な標品として得られている。 α—アミラ一ゼは昔から醸造産業で穀類ゃィモ類の糖化、 繊維産業で澱粉糊抜 き剤、 医薬品産業で強力な消化剤としての利用、 食品産業で水飴の製造等に広く 利用されてきた。

最近、 我々は斯かる α—アミラーゼを枝切り酵素と共に食器用洗浄剤及び衣料 用洗浄剤に配合することにより、 主に澱粉汚れに対して洗浄力が飛躍的に向上す ることを見出し、 特許出願した （特開平 2— 1 3 2 1 9 2号公報） 。

しかしながら、 自然界において従来見出されている α—アミラ一ゼのほとんど カ^ 中性乃至酸性領域において最大且つ安定な酵素活性を示す、 所謂中性若しく は酸性の α—アミラーゼに分類されるものであり、 ρΗがアル力リ側にある界面活 性剤含有液中では活性が低下してしまうという欠点があった。 これに対し、 アル 力リ領域で最大活性を示すか、 あるいはアル力リ耐性を有する α—アミラーゼ、 所謂アル力リ α—アミラ一ゼ及びアル力リ耐性 α—アミラーゼは、 かかる欠点が なく、 洗浄剤の配合成分として有用である。 このようなアルカリ α—アミラ一ゼ 及びアル力リ耐性 α—ァミラーゼの存在は、 バチルス Α— 4 0— 2株の生産す る酵素 〔Ag r i c, B i o l . Ch em. ， 3 5, 1 7 8 3 ( 1 9 7 1 ) 〕 、 バチルス NRRL B— 3 8 8 1株の生産する酵素 〔 J. B a c t e r i o l .

1 1 0 , 9 9 2 ( 1 9 7 2 ) 〕 、 ス ト レブ トマイセス属 K S M— 9 (S t r e p t omy c e s s p. K S M _ 9 ) の生産する酵素 （特開昭 6 1

- 2 0 9 5 8 8号公報） 、 バチルス H— 1 6 7 (B a c i l l u s s p. H - 1 6 7) 株の生産する酵素 （特開昭 62— 2 0 8 2 7 8号公報） 、 バチルス アルカ ロサーモ フ ィ ラ ス A 3 — 8 ( B a c i 1 l u s

a l c a l o t h e rmo h i l u s A 3— 8) 株の生産する酵素 （特開平

2 - 4 9 5 8 4号公報） 及びナトロコッカス属 A h— 3 6株 （特開平 4一 2 1 1 3 6 9号公報） が知られているのみである。 尚、 ここでアル力リ α—アミ ラーゼとは、 至適 ρΗがアルカリ領域にあるものをいい、 アルカリ耐性 α—ァミラ —ゼとは、 至適 ρΗは中性から酸性領域にあるが、 アルカリ領域においても至適 ρΗ における活性に比較して充分に活性を有しかつ安定性を保持するものをいう。 ま た、 中性とは ρΗ6〜 8の範囲をいい、 アルカリ性とはそれ以上の ρΗ範囲をいう。 しかしながら、 本発明者らの知るかぎり、 これらのアルカリ酵素のほとんどは、 澱粉又は澱粉系多糖類をグルコース、 マルトース又はマルト トリオースにまで低 分子化させる、 所謂糖化型 α—アミラーゼに属するものであるため、 糖の製造用 酵素としては好適であるが、 洗剤用酵素としては問題があった。 そこで、 本発明 者らは、 界面活性剤に対する耐性を有し、 かつ澱粉又は澱粉系多糖類を高ランダ ムに分解する、 所謂液化型 α —ァミラーゼに着目し検討を行ったところ、 従来の アルカリ α —アミラーゼとしては糖化型の特性を示すものが知られているのみで- 液化型アル力リ α —ァミラ一ゼについては全く報告されていないことが明らかと なった。

また、 上記従来のアル力リ α —アミラーゼの取得には数ステツプの精製工程を 要し、 工業化レベルでの酵素精製方法としては問題があった。 そこで酵素の特性 を利用して簡易に精製酵素を得ることを目的として、 表面電荷が高い酵素蛋白に 着眼したところ、 従来知られているアルカリ —アミラ一ゼの等電点は全て 3 . 0 ~ 8 . 0程度であり、 本発明のような、 8 . 5を超える高い等電点を有す るアルカリ α—アミラーゼについては全く報告されていないことが明らかとなつ た。

従って、 本発明は、 界面活性剤に対する耐性を有し、 至適 ρΗをアルカリ領域に 有し、 液化型、 すなわち澱粉又は澱粉系多糖類を高ランダムに分解するものであ り、 かつ高い等電点を有する α —アミラーゼ及びこれを含有する洗浄剤組成物を 提供することを目的とする。 発明の開示

斯かる実情において、 本発明者らは、 上記条件を具備する液化型アルカリ α— ァミ ラーゼを生産する微生物を自然界に求め、 鋭意探索を続けてきたとこ ろ、 α—アミラーゼ活性とプルラナーゼ活性を有する、 分子量 2 0 0 , 0 0 0土 5 , 0 0 0の酵素を産生する微生物として先に報告 （特開平 3— 1 0 8 4 8 2号 公報） したバチルス属に属する微生物の培養物中に、 液化型反応特性を有する新 規なアル力リ α —アミラーゼを見出し、 更にこの酵素を洗浄剤に配合すると、 従 来の糖化型 α —アミラーゼでは不十分であった、 カレー、 ケチャップ等の食べこ ぼしによる複合的な汚れに対する洗浄力が顕著に向上することを見出し、 本発明 を完成した。

すなわち本発明は、 次の酵素学的性質を有する液化型アル力リ α —アミラ一ゼ、 その製造法、 及びこれを含有する洗浄剤組成物に係るものである。

1 ) 作用

澱粉、 アミ ロース、 アミ 口べクチン及びそれらの部分分解物の α— 1 , 4グル コ シ ド結合を分解し、 ア ミ ロースからはグルコース （G 1 ) 、 マル ト一ス (G 2) 、 マルト ト リオース （G 3) 、 マルトテトラオース （G 4) 、 マルトべ ンタオース （G 5) 及びマルトへキサオース （G 6) を生成する。 ただしプルラ ンには作用しない。

2 ) 等電点

等電点電気泳動法による等電点は 8. 5を超える。 図面の簡単な説明

図 1は、 本発明の液化型アルカリ α—アミラーゼの作用 ρΗを示す図である。 図 2は、 本発明の液化型アルカリ α—アミラーゼの ρΗ安定性を示す図である。 図 3 は、 本発明の液化型アルカリ α—アミラーゼの作用温度範囲を示す図である。 図 4は、 本発明の液化型アルカリ α—アミラーゼの温度安定性を示す図である。 図 5は、 本発明の液化型アル力リ α—アミラ一ゼのソディ ゥム ドデシル硫酸ポリァ ク リルアミ ドゲル電気泳動 （ 1 2. 5 %ポリアク リルアミ ドゲル， 9 5°C, 4分 処理， Qu i c k C B B染色） の結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態

本発明の液化型アル力リ a—アミラ一ゼは、 洗浄剤配合成分としての観点より、 至適 pHを 8. 0-1 0. 0の範囲内に有することが好ましい。

本発明の液化型アル力リ α—アミラーゼを生産する微生物としては、 高ランダ ムに澱粉又は澱粉系多糖類を分解する性質を有し且つ至適 PHがアル力リ領域にあ り、 等電点の高い α—アミラ一ゼを生産する能力を有するものであれば特に限定 されないが、 例えば特開平 3 - 1 0 8 4 8 2号公報記載のバチルス属に属するバ チルス エスピー. （B a c i l l u s s p. ) K S M- A P 1 3 7 8 (F ERM B P— 3 0 4 8 ) が挙げられる。

上記の菌株を用いて本発明の液化型アル力リ α—アミラーゼを得るには、 培地 にこの菌株を接種し、 常法に従って培養すればよい。 培地中には、 資化し得る炭 素源及び窒素源を適当量含有せしめておく ことが好ましい。 この炭素源及び窒素 源については特に制限はないが、 その例としては、 窒素源としてコーングルテン ミール、 大豆粉、 コーンスチープリカー、 カザミ ノ酸、 酵母エキス、 ファーマメ ディァ、 肉エキス、 卜 リプトン、 ソィ トン、 ハイプロ、 アジパワー、 ソィビーン ミール、 綿実油粕、 カルチベーター、 アジブロン、 ゼス トなどの有機窒素源、 及 び硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム、 リ ン酸アンモニゥム、 炭酸アンモニゥ ム、 硝酸ナトリ ウム、 酢酸アンモニゥム等の無機窒素源が挙げられる。 また炭素 源としては、 可溶性澱粉、 不溶性澱粉、 アミ 口べクチン、 グリ コーゲン、 プルラ ン及びこれらの部分分解により生じたオリゴ糖に加え、 資化し得る炭素源、 例え ばグルコース、 マルト一ス、 ァラビノース、 キシロース、 リボース、 マンノース、 フラク トース、 ガラク トース、 麦芽糖、 ショ糖、 乳糖、 トレハロース、 マンニッ ト、 ソルビッ ト、 グリセリ ンゃ資化し得る有機酸、 例えば酢酸などが挙げられる またその他、 リ ン酸塩、 マグネシウム塩、 カルシウム塩、 マンガン塩、 亜鉛塩、 コバル卜塩、 ナ ト リゥム塩、 力リ ゥム塩等の無機塩や、 必要であれば、 無機、 有 機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。

斯く して得られた培養物中からの目的物質である液化型アル力リ α _アミラ一 ゼの採取及び精製は、 一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことができ る。 即ち、 遠心分離又は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養液から除 去して粗酵素を得ることができる。 この粗酵素液は、 そのまま使用することもで きるが、 必要に応じて、 塩析法、 沈澱法、 限外濾過法、 ゲル濾過法等の分離手段 により粗酵素を得、 更に等電点が高いことを利用してゲル等電点電気泳動法、 密 度勾配等電点電気泳動法、 イオン交換クロマ トグラフィ一等により精製結晶化し て、 精製酵素として使用することも可能である。

斯く して得られる、 本発明の α —アミ ラーゼは、 アルカリ側に至適 ρΗを有する のみならず、 高ランダム分解性、 すなわち液化型であり、 かつ等電点が高いとい う従来のアル力リ α —アミラーゼと異なる特異な性質を有するものである。 以下 に、 菌株としてバチルス エスピー. K S M— A P 1 3 7 8 ( F E R M B P— 3 0 4 8 ) を用いて得られた本発明の液化型アル力リ なーアミラーゼの酵素化学 的諸性質について説明する。

なお、 酵素活性の測定は次の緩衝液 （各々 4 OmM) を用い、 以下の方法に従つ て行った。

PH4 ~6 酢酸緩衝液

PH6-8 ト リスー塩酸緩衝液

pH8~ 1 1 グリ シン一食塩一水酸化ナト リウム緩衝液

pHl 1 ~ 1 2 塩化カリウム一水酸化ナト リウム緩衝液

酵素活性測定法 （DN S法によるアミラーゼ活性の測定） ：

各種緩衝液中に可溶性澱粉 （和光純薬社製， 反応系における最終濃度は 0. 5 %) を溶解させた緩衝液 0. に、 酵素液 0. を加え、 4 0 °Cで、 3 0分 間反応させた。 反応後、 3， 5—ジニトロサリチル酸 （DN S) 法にて、 還元糖 の定量を行った。 即ち、 反応液 1. に DN S試薬 1. を加え、 5分間、 1 0 0 °Cで加熱発色させ、 冷却後、 4. の脱イオン水を加えて希釈し、 波長 5 3 5 nmで比色定量した。 酵素の力価は、 1分間に 1 mo £のグルコースに相当 する還元糖を生成する酵素量を 1単位 （ 1 U) とした。

(酵素化学的諸性質）

( 1 ) 作用

澱粉、 アミ ロース、 アミ 口べクチン及びそれらの部分分解物の α— 1 , 4グル コシド結合を分解する。 ただし、 プルランには作用しない。

なお、 種々の基質に対する作用を表〗 に示す。

表 1

( 2 ) 作用 ρΗ及び至適 ρΗ

ρΗ5. 0~ 1 1. 0付近の範囲で作用し、 至適 ρΗは 8. 0 9. 0である （図

1 ) ο

( 3 ) ρΗ安定性

ΡΗ6. 5から 1 0で極めて安定であり、 ρΗ5~ 1 0. 5においても約 5 0 %以 上の活性を維持する （図 2 ) 。

( 4 ) 作用温度範囲及び最適温度

2 0 - 8 0 °Cの広範囲で作用し、 最適作用温度は 4 5 - 5 5 °Cである （図 3 ) 。

( 5 ) 温度安定性

本酵素について pH 8. 5の条件で温度を変化させ、 各温度で 3 0分間処理する ことにより失活の条件を調べると 5 0 °Cまでは極めて安定であった （図 4 ) 。

( 6 ) 分子量

ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法により測定した分子 量は 5 0 , 0 0 0 ± 5, 0 0 0である （図 5 ) 。

( 7 ) 等電点

等電点電気泳動法により測定した等電点は 9. 2付近である。

( 8 ) 金属塩の影響

表 2に示す各種金属塩を反応系に共存させて 5 0°Cで 1 5分間処理してその影 響を調べたところ、 一般に水道水中に含まれる K+、 N a+、 C a²⁺、 Mg²⁺、 Mn²⁺、 B a ² F e ²⁺、 F e ³⁺及び A ^{3 +}に対して極めて安定であった。

表 2

( 9 ) 界面活性剤の影響

各種界面活性剤 （例えば、 直鎖アルキルベンゼンスルフ ォ ン酸ナ ト リ ウム (LAS) 、 アルキル硫酸エステルナ トリウム塩 （AS) 、 ポリオキシエチレン アルキル硫酸エステルナ ト リゥム塩 （E S) 、 アルキルスルフォン酸ナト リウム (SAS) 、 石鹼及びポリオキシエチレンアルキルエーテル） の 0. 0 5%溶液 で 4 0°C, 3 0分間処理しても殆ど活性阻害は受けなかった。

( 1 0) 澱粉の加水分解率

ポテト由来澱粉の分解率は約 3 2%であり、 またアミロース （重合度： ダルコ ース 1 1 7個） からはグルコース （ G 1 ) 、 マルトース （ G 2 ) 、 マルト ト リオ ース （G 3) 、 マルトテトラオース （G 4 ) 、 マルトペン夕オース （G 5) 及び マルトへキサオース （G 6) を分解生成する。

( 1 1 ) N末端ァミノ酸配列の解析 本アミ ラーゼの N末端アミ ノ酸配列をエドマン分解法 （E dm a n, P. ， A c t a C h e m. S c a n d. , 4, 2 8 3 ( 1 9 4 8) によりプロテイン シーケンサー （AB I社製） 4 7 7 Aを用いて測定した結果、 液化型ァミラーゼ 特有の共通配列 （A s n— G l y—T h r - M e t - (M e t ) — G i n— Ty r -P h e -G l u-T r p) が N末端領域に存在することが判った。 なお、 液化型 α—アミ ラーゼの N末端領域に関する文献と しては、 J. B i o c h em. 9 8， 1 1 4 7— 1 1 5 6 ( 1 9 8 5) 、 J. B i o c h em. , 9 8, 9 5 - 1 0 3 ( 1 9 8 5 ) 等が挙げられる。

本発明の洗浄剤組成物への上記液化型アル力 リ α—ア ミ ラーゼの配合量 は、 ポテト由来可溶性澱粉の分解活性にして 1〜 1 0, 0 0 O UZg、 特に 5~ 5 , 0 0 0 UZg、 更に 1 0 ~ 1 , O O O U/gが好ましい。

また、 本発明の洗浄剤組成物には、 公知の洗浄剤成分を配合することができ、 当該公知の洗浄剤成分としては、 例えば次のものが挙げられる。

( 1 ) 界面活性剤 ：

平均炭素数 1 0~ 1 6のアルキル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸 塩、 平均炭素数 1 0~2 0の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、 1分子内に平 均 0. 5〜 8モルのエチレンォキサイ ドを付加したアルキルェトキシ硫酸塩、 平 均炭素数 1 0〜2 0のアルキル基を有するアルキル硫酸塩、 平均 1 0~2 0の炭 素原子を 1分子中に有するォレフィ ンスルホン酸塩、 平均 1 0~2 0の炭素原子 を 1分子中に有するアルカンスルホン酸塩、 平均 1 0〜2 0の炭素原子を 1分子 中に有する α—スルホ脂肪酸メチルあるいはェチルエステル塩、 平均炭素数 8〜 2 0の高級脂肪酸塩、 平均炭素数 1 0〜2 0の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有 し、 1分子内に平均 0. 5 ~ 8モルのエチレンオキサイ ドを付加したアルキルェ —テルカルボン酸塩などのァニオン性界面活性剤；平均炭素数 1 0~2 0のアル キル基を有し、 1〜2 0モルのエチレンォキシ ドを付加したポリオキシエチレン アルキルエーテル、 高級脂肪酸アル力ノールアミ ド又はそのアルキレンォキサイ ド付加物、 またプロピレンォキサイ ドとプロピレンダリ コールとの縮合物にェチ レンォキサイ ドを付加させた、 プルロニックという名称で知られているものなど の非イオン性界面活性剤； その他べタイン型両性界面活性剤 ； スルホン酸型両性 界面活性剤、 リ ン酸エステル系界面活性剤、 アミ ノ酸型界面活性剤、 カチオン性 界面活性剤など。

これらの界面活性剤は洗浄剤組成物中 0. 5 ~6 0重量％ (以下単に％で示す） 配合され、 特に粉体状洗浄剤組成物については 1 0~4 5 液体洗浄剤組成物 については 2 0 ~ 5 0 %配合することが好ましい。 また、 本発明洗浄剤組成物が 漂白洗浄剤、 又は自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、 界面活性剤は一般に 1〜 1 0 %、 好ましく は 1 ~5 %配合される。

( 2 ) 二価金属イオン捕捉剤 ：

ト リポリ リ ン酸塩、 ピロリ ン酸塩、 オルソリ ン酸塩などの縮合リ ン酸塩、 ゼォ ライ トなどのアルミ ノゲイ酸塩、 合成層状結晶性ゲイ酸塩、 二ト リ 口三酢酸塩、 エチレンジァミ ン四酢酸塩、 クェン酸塩、 イソクェン酸塩、 ポリアセタールカル ボン酸塩など。

この二価金属イオン捕捉剤は、 0 ~5 0 好ましくは 5~4 0 %配合される。 また、 リ ンを含有しない二価金属イオン捕捉剤を用いることがより好ましい。

( 3 ) アル力リ剤及び無機塩 ：

ゲイ酸塩、 炭酸塩、 セスキ炭酸塩、 硫酸塩、 アルカノールァミ ンなど。

これらは 0~ 8 0 %, 好ましく は 1〜4 0 %配合される。

( 4 ) 再汚染防止剤 ：

ポリエチレングリ コール、 ポリアク リル酸塩、 ポリアクリル酸コポリマー、 ポ リ ビニルアルコール、 ポリ ビニルピロリ ドン、 カルボキシメチルセルロースなど。 再汚染防止剤の一部は、 二価金属イオン捕捉剤としても使用できる。

再汚染防止剤は 0〜 1 0 %、 好ましく は 1〜5 %配合される。

( 5 ) 酵素 ：

セルラーゼ、 液化型アルカリ α—アミラーゼ以外のアミラーゼ、 リパーゼ、 へ ミセルラ一ゼ、 ；3—グリ コシダーゼ、 グルコースォキシダーゼ、 コレステロール ォキシダーゼ、 プロテアーゼなどの酵素。

( 6 ) 水道水中の有効塩素の捕捉剤又は還元剤 ：

有効塩素の捕捉剤として、 硫酸アンモニゥム、 尿素、 塩酸グァニジン、 炭酸グ ァニジン、 スルファ ミ ン酸グァニジン、 二酸化チォ尿素、 モノエタノールアミ ン、 ジエタノ一ルァミ ン、 ト リエタノールァミ ン、 又グリ シン、 グルタ ミ ン酸ナ 卜 リ ゥム等で代表されるアミノ酸及び牛血清アルブミ ン、 カゼインなどの蛋白質、 更 には蛋白質の加水分解、 肉エキス、 魚肉エキスなどが挙げられる。

還元剤としては、 チォ硫酸塩、 亜硫酸塩、 亜ニチオン酸塩等のアルカリ金属塩、 アルカリ土類金属塩等及びロンガリッ ト C等が挙げられる。 特に亜硫酸塩が好ま しく、 洗濯液中の酵素を安定化させる。

( 7 ) 漂白剤：

過炭酸塩、 過硼酸塩、 スルホン化フタロシアニン亜鉛塩又はアルミニウム塩、 過酸化水素など。 漂白洗浄剤とする場合は、 特に過炭酸ナト リウムが効果的であ り、 配合量は 1 ~ 9 5重量％、 更に 5 ~ 9 5重量％、 特に 2 0 ~ 9 5重量％とす るのが好ましい。

( 8 ) 蛍光染料：

通常洗浄剤に用いられる蛍光染料。

( 9 ) 可溶化剤：

液体洗剤の場合には次のような可溶化剤を用いることができる。

エタノールなどの低級アルコール、 ベンゼンスルホン酸塩、 ρ— トルエンスル ホン酸塩などの低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、 プロピレングリコールなど のポリオ一ル類など。

( 1 0 ) その他：

上記以外に、 従来公知の香料、 ケーキング防止剤、 酵素の活性化剤、 酸化防止 剤、 防腐剤、 色素、 青味付け剤、 漂白活性化剤、 酵素安定化剤、 相調節剤等の洗 剤に常用の成分を必要に応じて配合することができる。

本発明の洗浄剤組成物は、 上記液化型アル力リ α —アミラーゼ及び上記公知の 洗浄成分を組み合せて常法に従い、 製造することができる。 洗浄剤の形態は、 用 途に応じて選択することができ、 例えば液体、 粉末、 顆粒等とすることができる また、 本発明洗浄剤組成物は、 衣料用洗浄剤、 漂白洗浄剤、 自動食器洗浄機用洗 浄剤、 配水管洗浄剤、 義歯洗净剤等として使用することができるが、 特に衣料用 洗浄剤、 漂白洗浄剤又は自動食器洗浄機用洗浄剤として好適に使用することがで きる。 実施例

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例に 何ら限定されるものではない。

実施例 1

特開平 3— 1 0 8 4 8 2号公報の実施例 1 に記載のバチルス エスピー. K SM— A P 1 3 7 8株を 1 %可溶性澱粉 （ポテト由来） 、 1. 0 %ポリべ プトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 1 %KH₂P0₄、 0. 2 5 %N a ₂H P 0₄ • 1 2 H₂0、 0. 0 2 %Mg S 0₄ · 7 H₂0、 0. 0 2 % C a C £ ₂ · 2 H ₂0、 0. 0 0 1 %F e S O₄ * 7 H₂O、 0. 0 0 0 1 %M n C £ ₂ · 4 H ₂0及び 1. 0 %N a ₂C 0₃を含む培地で、 3 0°Cにて 3日間好気的に振盪培養し、 得ら れた培養液から菌体を除き、 上澄液を得た。 次いで、 該上澄液に硫安を 2 0%飽 和になるように加え、 5 °Cにて 2時間攪拌し蛋白を沈澱させ遠心分離にて除去し た。 更に該上澄液に硫安を 4 0%飽和になるように加え、 5°Cにて 1 2時間攪拌 し蛋白を沈澱させた後、 遠心分離により沈澱物を回収し、 1 OmM卜リス一塩酸緩 衝液 （pH8) に懸濁した後、 同緩衝液にて一昼夜透析した。 次いで透析液を高速 液体クロマトを用いたゲル濾過 （TSK— G 3 0 0 0 SWカラム） にて分画し、 その活性画分を集めた。 集められた活性画分は、 限外濾過膜を用いて濃縮した後、 1 OmMトリス一塩酸緩衝液 （pH8) を用いて一夜透析した。 斯く して得られる精 製酵素は、 ソディウムドデシル硫酸 （SD S) ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 (ゲル濃度 7. 5%) で単一のバンドを与え、 活性収率は約 6. 4 %であった。 得られた酵素は前記の酵素化学的性質を有していた。

実 M例 2

本発明の液化型アル力リ α—アミラーゼを配合した洗浄剤と、 従来の α—ァミ ラーゼ活性を有する酵素を配合した洗浄剤の洗浄力を比較した。 なお、 以下にお ける DNS試薬の調製法、 酵素活性の測定 ·算出方法、 汚染布の作製法、 洗浄力 の評価方法を下に示す。

く DN S試薬の調製法〉

水酸化ナト リウム 1 6 gをイオン交換水 2 0 0 に溶解する。 これに DNS 5 gを徐々に添加しながら溶解する。 D N Sを完全に溶解させた後、 酒石酸ナ卜リ ゥムカ リ ウムを 3 0 O g加える。 完全に溶解させた後、 イオン交換水にて 1 0 0 0 に調製する。

く可溶性澱粉分解活性の測定方法 -アミラーゼ配合量の決定） 〉

( 1 ) 基質

ポテト由来可溶性澱粉 （和光純薬社製） の 0. 5 %水溶液

( 2 ) 基質溶液の調製

1. 0 gのポテト由来可溶性澱粉 （和光純薬社製） を 1 0 0； ^のイオン交換水 に溶解する。

( 3 ) サンプルの調製

試験管に基質溶液を 0. 入れ、 そこに 5 OmMリン酸緩衝液 （pH7. 0 ) を 0. 4 、 適当に希釈した酵素液 0. を加え、 4 0 °Cの恒温槽中で 3 0分間 反応させる。 反応終了後、 DN S試薬を 1 添加し、 沸騰水中で正確に 5分間発 色させ、 発色後、 直ちに氷水浴中に入れ冷却する。 冷却後、 イオン交換水 4 ^を 加え、 よく混合し、 速やかに 5 3 5 nmにおける吸光度を測定する。

(4 ) ブランクの調製

試験管に基質溶液を 0. 入れ、 そこに 5 OmMリン酸緩衝液 （pH7. 0 ) を 0. wi、 DNS試薬を 1 添加し、 沸騰水中で正確に 5分間発色させ、 発色後、 直ちに氷水浴中に入れ冷却する。 冷却後、 イオン交換水 4 を加え、 よく混合し、 速やかに 5 3 5 nmにおける吸光度を測定する。

( 5 ) 検量線の作成

試験管に基質溶液を 0. 入れ、 そこに 5 OmMリン酸 （pH7. 0 ) を 0. 4 rd、 これにブドウ糖濃度が 2 6 0〜 1 5 0 0 zMになるように検量線用ブドウ糖 溶液を 0. 1 加える。 そこに DN S試薬を 1 添加し、 沸騰水中で正確に 5分 間発色させ、 発色後、 直ちに氷水浴中に入れ冷却する。 冷却後、 イオン交換水 4 7 ^を加え、 よく混合し、 速やかに 5 3 5 nmにおける吸光度を測定する。 横軸にブ ドウ糖濃度、 縦軸に吸光度をとり傾きを求め、 換算係数 （F) を次式に従って算 出する。

F= 〔 1 / (傾き） 〕 X 〔 1ノ1 5〕 X 〔 1 0. 1〕 ァミロースに対する分解活性を次式に従って算出する。

活性 （ U リ ッ トル） = 5吸光度 X F X希釈倍率

( <5吸光度 =サンプルの吸光度一ブランクの吸光度） く力レー人工汚染布の作製方法〉

ボンカレ一ゴールド中辛 （大塚食品社製） をミキサーにて粉砕し、 綿布をこの 液に接触、 ブラッシングし、 過剰付着汚れを脱落させた後、 1 O cm x 1 O cmの試 験片を調製する。

ぐ洗浄力の評価方法〉

汚染前の原布及び洗浄前後の汚染布の 4 6 0 nmにおける反射率を自記色彩計 (島津製作所社製） にて測定し、 次式から求まる洗浄率 （％) により、 洗浄力を 評価した。

(洗浄後の反射率 -洗浄前の反射率）

洗浄率 （％) X 1 0 0

(原布の反射率 -洗浄前の反射率） く液体洗剤の調製〉

表 3に示す成分の 5倍濃度の溶液を調製し、 l N塩酸にてpHを7 . 0に合わせ る。 次いでイオン交換水で表 3に示す濃度にまで希釈し、 pH 7 . 0の液体洗剤を 得た。

表 3

成 分 配合量 （重量％) 非イオン界面活性剤 " 2 0 ァニオン性界面活性剤 * ² 2 0 クェン酸 5 モノエタノールアミ ン 5 ポリエチレングリコール （平均分子量 =約 1万） 1 エタノール 5 . 0 水 バランス 総計 1 0 0

* 1 ：アルキル基の平均炭素数 1 2 (直鎖） 、 エチレンォキサイ ド平均付加モ ル数 7のポリォキシェチレンアルキルエーテル

* 2 ： 炭素数 1 2〜 1 4の直鎖アルキル基を有し、 エチレンォキサイ ド平均付 加モル数が 2. 5のポリォキシェチレンアルキル硫酸ナ ト リ ウム 得られた液体洗剤 1. 3 を 4 ° D Hの水 1 リ ッ トルに添加し、 更に pH7. 0 において各種の α _Ύミ ラーゼを 1 5 0 UZリ ツ トルとなるよう加えて洗浄液を 調製した （実際の各酵素の添加量は 以下になるので、 酵素添加によるスケー ルアップは無視する。 ） 。 3 0 °Cに調整した該洗浄液 1 リ ッ トルにカレー人工汚 染布を浸漬し、 3 0分間静置する。 静置後、 洗剤溶液と人工汚染布をそのまま夕 ーゴトメ一夕一用ステンレスビーカー （ 1 リ ッ トノレ） に移し、 ターゴトメータ一 にて 1 0 0 rpm2 0で、 1 0分間撹拌する。 流水下で充分すすいだ後、 アイロン プレスを行い、 反射率を測定し、 洗浄率を求めた。 この結果を表 4に示す。 表 4 より、 活性が同じ条件であっても、 本発明の液化型アルカリ α—アミラーゼを配 合した洗浄剤は従来の α—アミ ラーゼを配合した洗浄剤より優れた洗浄力を有す ることがわかる。

表 4

分子量約 5 0 , 0 0 0 (本発明のアミラーゼ）

( 2 ) バチルス サブチリス由来 （和光純薬社製）

( 3 ) バチルス エスピー. K SM— A Ρ 1 3 7 8由来，

分子量約 2 0 0， 0 0 0 (特開平 3 - 1 0 8 4 8 2号公報記載のプ ルラナーゼ活性及び _αーァミラ一ゼ活性を有する酵素）

( 4 ) ァスペルギルス オリザェ由来 （シグマ社製）

( 5 ) ブタ脖臓由来 （シグマ社製）

( 6 ) バチルス リケニホルミス （ターマミル， ノボ社製）

実施例 3

以下のようにして調製した洗剤粒子と、 アル力リ α—アミラーゼの造粒品とを ドライブレンドして表 5に示す組成の粒状洗剤を調製し、 洗浄力を評価した。 く洗浄剤の製法〉

( 1 ) 表 5に示す成分 （α—アミラーゼ以外） のうち、 4 Α型ゼオライ ト 1 0 %. 蛍光增白剤及び香料を除いた成分からなる 5 0 %水分量のスラリー混合 物を調製し、 噴霧乾燥して洗剤生地粒子を得る。 これをハイスピードミキサーに 入れて粉碎造粒し、 先に除いておいた成分を添加して洗剤粒子を得た （本発明品 3 , 6以外） 。

( 2 ) 表 5に示す本発明品 3の成分 （α—アミラーゼ以外） のうち、 非ィォ ン界面活性剤、 4 Α型ゼォライ ト 1 0 %、 吸油担体、 蛍光增白剤及び香料を除い た成分からなる 5 0 %水分量のスラリー混合物を調製し、 噴霧乾燥して洗剤生地 粒子を得る。 これをハイスピードミキサーに入れて粉砕造粒し、 先に除いておい た成分を添加して洗剤粒子を得た （本発明品 3 ) 。

( 3 ) 表 5に示す本発明品 6の成分 （α—アミラ一ゼ以外） のうち、 非ィォ ン界面活性剤、 4 Α型ゼォライ ト 1 0 %、 蛍光增白剤及び香料を除いた成分をレ ディゲミキサーにて撹拌しながら非イオン界面活性剤を徐々に添加する。 添加後、 残る成分を添加して洗剤粒子を得た （本発明品 6 ) 。

( 4 ) 実施例 1で得られた液化型アル力リ α—アミラーゼを芒硝と少量のポ リエチレングリコールで造粒し、 （ 1 ) 〜 （ 3 ) で得た洗剤粒子と ドライブレン ドし、 表 5に示す組成の粒状洗剤を得た。

なお、 得られた粒状洗剤の平均粒径及びカザ密度を下に示す。

本発明品 2， 4， 5， 7 - 9 , 比較品 7 ~ 9 ：

平均粒径 4 0 0〜5 0 0 m, カザ密度 7 5 0〜7 8 0 g/cm³ 本発明品 3 ：平均粒径 4 0 0 πι, カザ密度 7 7 0 g/cm³ 本発明品 6 ：平均粒径 4 5 0 /m, カサ密度 8 0 0 gZcin³ く評価方法〉 '

得られた粒状洗剤を、 4 ° DHの水に添加して 0. 0 8 3 3 %水溶液の洗浄液 を調製した。 3 0 °Cに調整した該洗浄液 1 リ ツ トルに、 実施例 2 と同様にして調 製したカレー人工汚染布を浸潰し、 1 0分間静置する。 静置後、 洗剤溶液と人工 汚染布をそのままターゴトメータ一用ステンレスビーカ一 （ 1 リ ツ トル） に移し、 ターゴトメーターにて 1 0 0 rpm2 0 °C、 1 0分間攪拌する。 流水下で充分すす いだ後、 アイロンプレスを行い、 実施例 2と同様にして反射率を測定し、 洗浄率 を求めた。 この結果を表 5に示す。

* 1 :バチルス エスピー. K SM— AP I 3 7 8由来， 分子量約 5 0 , 0 0 0 (液化型アル力リ α—アミラ一ゼ） ，

比活性 3， 0 0 0 U/g

* 2 ： 炭素数 1 2〜 1 4 , 中和度 1 0 0 %

* 3 ：平均粒径 0. 9 m

* 4 ： ポリオキシエチレンアルキルエーテル

(E 0平均付加モル数 = 8 , アルキル基炭素数 = 1 2 )

* 5 ： 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナ ト リ ウム

(アルキル基炭素数 = 1 2~ 1 6 )

* 6 ： アルキル硫酸ナ ト リ ウム （アルキル基炭素数 == 1 2〜 1 4 )

* 7 :平均分子量約 8， 0 0 0 , 配合量は、 α—アミラーゼ粒子中のものを除

< ο

* 8 ：平均分子量約 1 3, 0 0 0

* 9 ： トクシール NR (徳山曹達社製）

* 1 0 ： チノパール C B S (チバガイギ一社製）

実施例 4

表 6に示す組成の液体洗剤を調製し、 実施例 2と同様に洗浄試験を行い、 洗浄 率を求めた。 この結果を表 6に示す。

表 6

* 1 : バチルス エスピー. K SM— A P I 3 7 8由来，

分子量約 5 0， 0 0 0 (液化型アルカリ ひ—アミラーゼ） ， 比活性

* 2 ： ポリォキシェチレンアルキルエーテル

(£ 0平均付加モル数= 7, アルキル基炭素数 = 1 2〜 1 4 )

* 3 ： ポリォキシェチレンアルキル硫酸ナトリウム

(E O平均付加モル数 = 2. 5 , アルキル基炭素数 = 1 2〜 1 4 )

* 4 ：平均分子量約 8， 0 0 0

* 5 ： チノパール C B S (チバガイギー社製）

実施例 5

表 7に示す組成のうち、 過炭酸ナ ト リ ウムとソ一ダ灰 （デンス灰） を攪拌混合 しながら、 ポリアク リル酸ナ ト リウム 4 0 水溶液及び直鎖アルキルベンゼンス ルホン酸ナト リゥム又は非イオン性界面活性剤を添加した。 次いで実施例 3で用 いた液化型アル力リ α—アミ ラーゼの造粒物を添加し全体的に均一になる程度に 攪拌することにより、 表 7記載の漂白洗浄剤を得た。

漂白条件は 0. 0 5%水溶液、 4 0°C 30分間とする以外は実施例 3と同じ 条件と し、 洗浄率を求めた。 結果を表 7に併せて示した。

表 7

(重量％)

* 1 ：粒径 5 0 0~7 0 0〃m

* 2 ： 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナト リゥム （炭素数 1 2 1 4)

* 3 ： ポリオキシエチレンアルキル テル

(アルキル基の炭素数 1 2~1 4, エチレンォキサイ ド平均付加モル数 1 2)

* 4 ：平均分子量 8 0 0 0

実施例 6

表 8に示す組成の自動食器洗浄用洗剤を、 実施例 5と同様にして調製した。

表 8

(重量

* 1 ： ポリオキシエチレン—ポリオキシプロピレン共重合体 （平均分子量 2 0 0 0 , 旭電化工業社製）

* 2 ：炭素数 1 2〜 1 4の s e c—アルコールのェチレンォキサイ ド 7モル及 びプロピレンォキサイ ド 8 . 5モル付加物 （日本触媒工業社製）

* 3 ：平均分子量 8 0 0 0

得られた自動食器洗浄用洗剤について、 下記条件で洗浄評価を行つたところ、 いずれも優れた洗浄効果が得られ、 アミラーゼを配合しない場合と比べ優位性が 示された。

く汚染皿の調製〉

軟質の炊き上がり米飯を 3 0分間室温に放置し、 3 gを直径 2 5 cmの磁性の皿 に引き伸ばし塗布し、 室温で一昼夜風乾したもの 6枚を試験に供する。

〈米飯汚れの洗浄力評価方法〉

洗浄後の皿の米飯の残存液を、 ョード呈色反応によって、 肉眼判定する。 く洗浄力試験法〉 洗浄条件 ：

•使用機種 ； 松下電器 （株） 製全自動食器洗い機 N P - 7 2 0

洗浄剤水溶液が回転ノズルから噴射され、 その噴射軌道上面に設置された食器 類を洗浄する形式のもの。

•洗浄温度 ； 5でから 5 5 °Cまで徐々に上昇する。

•使用水 ； 硬度 3. 5 ° DHの水

•洗浄剤濃度 ； 0. 2重量％

•洗浄時間 ； 洗浄 2 0分→すすぎ 2 0分

•洗浄時の循環水量； 2. 5 リ ッ トル 産業上の利用可能性

本発明の液化型アル力リ α—アミラ一ゼは、 従来のアル力リ α—ァミラーゼに 比較して澱粉又は澱粉系多糖類等の基質を高ランダムに分解する液化型活性を有 し、 かつアルカリ側に至適 pHを有し （8. 0- 1 0. 0) 、 更に広い pH範囲にお いても極めて安定である。 また、 至適温度も 4 5〜 5 5 °Cであり、 熱安定性も 5 0 °Cまでは極めて安定である。 更に、 界面活性剤等の洗浄剤配合成分によって も殆ど阻害を受けない。 また、 従来知られているアルカリ α—アミラーゼの等電 点が 3. 0〜8. 0程度であるのに対し、 本発明の液化型アルカリ α—アミラー ゼは従来になかった 8. 5を超える高い等電点 （ 8. 7〜9. 7、 具体的には 9. 2付近） を有し、 この酵素の特性を利用してゲル等電点電気泳動法、 密度勾 配等電点法、 イオン交換クロマ トグラフィ一等により簡易に精製酵素を得ること ができるため、 工業的に極めて大きな意義を有するものである。

また、 本発明の液化型アルカリ α—アミラーゼを配合した洗浄剤組成物は、 特 に食べこぼし汚れに対して優れた洗浄力を有するものである。

本発明の液化型アル力リ α—アミラ一ゼが従来のァミラーゼょりも優れた洗浄 力を有する理由と しては、 高ランダム分解性である液化型特性以外にも高い等電 点による影響もあると考えられる。 すなわち、 一般に繊維は水中でマイナスに帯 電するが、 洗濯液の pHが高い場合、 酵素の等電点が低いと酵素もマイナスに帯電 し、 お互いに反発しやすくなる。 しかし本発明の液化型アルカリ α—アミラーゼ は等電点が高いため、 洗濯液中でマイナスに帯電せず、 繊維表面の汚れとの反発 が少なくなる結果、 洗浄力の向上に寄与するものと考えられる。

Claims

請 求 の 範 囲

1. 次の酵素学的性質を有する液化型アル力リ α—アミラーゼ。

1 ) 作用

澱粉、 アミ ロース、 アミ 口べクチン及びそれらの部分分解物の α— 1， 4グル コ シ ド結合を分解し、 ア ミ ロースからはグルコース （ G 1 ) 、 マル ト一ス (G 2 ) 、 マル卜 ト リオ一ス （G 3 ) 、 マル卜テトラオース （G 4 ) 、 マルトべ ンタオース （G 5 ) 及びマルトへキサオース （G 6 ) を生成する。 ただしプルラ ンには作用しない。

2 ) 等電点

等電点電気泳動法による等電点が 8. 5を超える。

2. 等電点が、 8. 7 ~ 9. 7である請求項 1記載の液化型アルカリ ひ—ァ 'ミ ラーセ。

3. 至適 ρΗが、 8. 0〜 1 0. 0である請求項 1又は 2記載の液化型アル力 リ α—アミラーゼ。

4. 次の酵素学的性質を有する液化型アル力リ α—アミラ一ゼ。

1 ) 作用

澱粉、 アミ ロース、 アミ ロぺクチン及びそれらの部分分解物の α— 1， 4グル コ シ ド結合を分解し、 ア ミ ロースからはグルコース （G 1 ) 、 マル トース (G 2 ) 、 マルト トリオース （G 3 ) 、 マルトテトラオース （G 4 ) 、 マルトべ ンタオース （G 5 ) 及びマルトへキサオース （G 6 ) を生成する。 ただしプルラ ンには作用しない。

2 ) 作用 ρΗ及び至適 ρΗ

ρΗ5. 0- 1 1. 0の範囲で作用し、 至適 ρΗは 8. 0 ~ 9. 0である。

3 ) ρΗ安定性

ρΗ6. 5〜 1 0. 0の範囲で極めて安定であり、 ρΗ5. 0- 1 0. 5において も、 5 0 %以上の活性を維持する （ 4 0 °C, 3 0分間処理） 。

4 ) 作用温度範囲及び最適温度

2 0 - 8 0 °Cの範囲で作用し、 最適作用温度は 4 5 ~ 5 5 °Cである。

5 ) 温度安定性 5 0 °C以下で極めて安定である （pH8. 5のグリシン一食塩一水酸化ナト リウ ム緩衝液中， 3 0分間処理） 。

6 ) 分子量

ソディ ウム ドデシル硫酸ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動法による分子量は 50， 0 0 0 ± 5， 00 0である。

7 ) 等電点

等電点電気泳動法による等電点は 9. 2付近である。

8 ) 金属塩の影響

K+、 Na⁺、 C a ² Mg²⁺、 Mn²⁺、 B a ²⁺、 F e ²⁺、 F e³⁺及び A^^{3 +} に対して極めて安定である。

9) 界面活性剤の影響

直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナト リゥム、 アルキル硫酸エステルナトリゥ ム、 ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステルナト リウム、 アルキルスルホン酸 ナト リウム、 石鹼又はポリオキシエチレンアルキルェ一テルの界面活性剤によつ てほとんど活性阻害を受けない。

5. N末端ァミ ノ酸領域に、 A s n— G l y— Th r— Me t— (Me t) - G 1 n-Ty r -Ph e -G l u— T r pの配列を有する請求項 1〜 4のいず れかに記載の液化型アル力リ α—アミラ一ゼ。

6. バチルス属に属する液化型アルカリ α—アミラーゼ生産菌を培養し、 そ の培養物から請求項 1 ~ 5のいずれかに記載の液化型アル力リ α—アミラーゼを 採取することを特徴とする液化型アル力リ アミラーゼの製造法。

7. 液化型アルカ リ α—ア ミ ラーゼ生産菌が、 バチルス エスピー. (B a c i l l u s s p. ) KSM-AP 1 378 (FERM B P -

304 8 ) である請求項 6記載の液化型アル力リ α—アミラーゼの製造法。

8. 請求項 1〜 5のいずれかに記載の液化型アル力リ ーアミラーゼを含有 する洗浄剤組成物。

9. 液化型アルカ リ α — ア ミ ラ ーゼが、 ノくチ ル ス エス ピー . (B a c i l l u s s p. ) KSM-AP 1 378 (FERM BP—

304 8) により生産されたものである請求項 8記載の洗浄剤組成物。

10. 陰イオン性界面活性剤及び 又は非イオン性界面活性剤を 0. 5~6 0 重量％含有する請求項 8又は 9記載の洗浄剤組成物。

11. 液化型アル力リ α—アミラ一ゼの配合量が、 可溶化澱粉に対する分解活 性で、 1〜 1 0, 0 0 0 U/gである請求項 8〜 1 0のいずれかに記載の洗浄剤 組成物。