TWI721349B - 源自三氟胸苷及/或替吡嘧啶之相關物質的檢測方法 - Google Patents

源自三氟胸苷及/或替吡嘧啶之相關物質的檢測方法 Download PDF

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Abstract

一種用以檢測源自三氟胸苷之相關物質及源自替吡嘧啶之相關物質之一者或兩者的方法，含有以下步驟：將含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之試料供於高效液相層析，且該高效液相層析使用由有機相及水相構成之移動相。

Description

源自三氟胸苷及/或替吡嘧啶之相關物質的檢測方法
本發明有關於包含於三氟胸苷(Trifluridine)及替吡嘧啶(Tipiracil)含有製劑之其等物質之相關物質(related substances)的測定方法。
一般而言，醫藥品相關物質之測定是利用液相層析來進行，且常使用以水及有機溶劑之混合液作為移動相之正相或逆相管柱系統。
申請人製品之LONSURF(註冊商標)為含有三氟胸苷及替吡嘧啶之製劑。
該含有三氟胸苷及替吡嘧啶之醫藥品是以抗腫瘤劑來販售，且就該製劑已有多數的報告(專利文獻1、2、3、4)。然後，在三氟胸苷的相關物質方面，已知5-三氟甲基尿嘧啶(三氟胸腺嘧啶)及5-羧基尿嘧啶，且有報告以高效液相層析來測定該等(非專利文獻1)。又，在替吡嘧啶的相關物質方面，已知5-氯-6-{(2-側氧基吡咯啶-1-基)甲基}嘧啶-2,4-(1H、3H)-二酮為替吡嘧啶的合成中間物(專利文獻5)。
有報告提出，為了測定三氟胸苷相關物質之5-三氟甲基尿嘧啶，使用有乙腈之各式各樣高效液相層析的條件(非專利文獻2)。
有報告提出，為了測定腫瘤細胞對三氟胸苷的攝取，使用有乙腈之高效液相層析的條件(非專利文獻3)。
有報告提出，為了判斷三氟胸苷之TK1的受質專一性，使用有乙腈之高效液相層析的條件(非專利文獻4)。
有報告提出，為了確認酵素合成中的三氟胸苷，添加乙酸三甲銨，並施加有梯度之高效液相層析的條件(非專利文獻5)。
有報告提出，為了定量測定LONSURF所含有之三氟胸苷與替吡嘧啶，使用有乙腈之高效液相層析的條件(非專利文獻6、7、8)。
針對作為點眼劑之三氟胸苷，有報告提出使用有甲醇之高效液相層析的條件(非專利文獻9、10)。
針對三氟胸苷，有報告提出使用了添加有乙酸緩衝液、三氟乙酸或乙酸之移動相之高效液相層析的條件(非專利文獻11、12、專利文獻6、13)。
又，為了確認三氟胸苷的純度，是使用高效液相層析，然卻未記載其條件(專利文獻7)。
有報告提出，為了測定血漿中的替吡嘧啶，使用了添加有乙酸銨之甲醇之高效液相層析的條件(非專利文獻13)，及使用有乙腈之條件(非專利文獻14)。然後，作為替吡嘧啶之合成中間體，已知5-氯-6-(氯甲基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(專利文獻4)。
為了該醫藥品之生產管理，須要使主成分與其等之相關物質波鋒分離，且在短時間內以良好重現性進行分析。但，迄今，針對將源自三氟胸苷及替吡嘧啶之相關物質以相同條件之高效液相層析進行檢測的方法，並無報告。又，2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷是可能被包含在該含有三氟胸苷及替吡嘧啶之醫藥品中的相關物質一事為未知。
先行技術文獻 專利文獻 專利文獻1：WO2013/122134 專利文獻2：WO2013/122135 專利文獻3：WO2006/080327 專利文獻4：WO96/30346 專利文獻5：CN106749194A 專利文獻6：CN105198947A 專利文獻7：CN105461772A 專利文獻8：日本特許4603274 專利文獻9：日本特許4441313 專利文獻10：日本特許4437786
非專利文獻 非專利文獻1：P. Horsch等, International Journal of Pharmaceutics 222(2001), p. 205-215 非專利文獻2：D. V. Moiseev等, Pharmaceutical Chemistry Journal 41, 1(2007), p. 25-33 非專利文獻3：N. TANAKA等, Oncology Reports 32(2014), p. 2319-2326 非專利文獻4：K. SAKAMOTO等, International Journal of Oncology 46(2015), p. 2327-2334 非專利文獻5：A. Fresco-Taboada等, Catalysis Today 259(2015), p. 197-204 非專利文獻6：M. S. H. Rizwan等, International Journal of Innovative Pharmaceutical Sciences and Research 5(2017), p. 32-42 非專利文獻7：S. GODAY等, International Journal of Research in Applied, Natural and Social Sciences 5(2017), p. 93-104 非專利文獻8：K. Jogi等, International Journal of Research in Pharmacy and Chemistry 7(2017), p. 63-70 非專利文獻9：B. Paw等, Pharmarize 7(1997), p. 551-552 非專利文獻10：T. Briggle等, Journal of Chromatography 381(1986), p. 343-355 非專利文獻11：M. Riegel等, Journal of Chromatography 568(1991), p. 467-474 非專利文獻12：G. Balansard等, Journal of Chromatography 348(1985), p. 299-303 非專利文獻13：T. Kawauchi等, Journal of Chromatography 751(2001), p. 325-330 非專利文獻14：J. Lee等, Cancer Chemother Pharmacol 77(2016), p. 515-526
發明概要 發明欲解決之課題 本發明要解決之課題是提供一種方法，可利用相同順序檢測含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之試料中所含有之源自三氟胸苷之相關物質、源自替吡嘧啶之相關物質。
本發明人等全心探討，結果發現一種方法，藉由將含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之試料供於高效液相層析，且該高效液相層析使用由有機相及水相構成之移動相，可將源自三氟胸苷或替吡嘧啶之相關物質，不須利用各別方法，而可利用相同的方法來檢測。
因此，本發明典型上是提供如下之[1]~[12]。
[1] 一種用以檢測源自三氟胸苷之相關物質及源自替吡嘧啶之相關物質之一者或兩者的方法，含有以下步驟： 將含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之試料供於高效液相層析，且該高效液相層析使用由有機相及水相構成之移動相。
[2] 如[1]之方法，其中前述相關物質是選自於由下述相關物質1~5所構成群組中之至少1者： 相關物質1：三氟胸腺嘧啶， 相關物質2：2-亞胺基吡咯啶， 相關物質3：5-氯-6-{(2-側氧基吡咯啶-1-基)甲基}嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮， 相關物質4：2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷， 相關物質5：5-羧基尿嘧啶。
[3] 如[2]之方法，其中前述相關物質含有相關物質3，且在高效液相層析中，相關物質3與三氟胸苷之滯留時間相差1.0分以上。
[4] 如[2]或[3]之方法，其中，在相關物質1~5、三氟胸苷及替吡嘧啶之滯留時間內，有機相對移動相整體之比例皆為7~15體積%。
[5] 如[1]至[4]中任1項之方法，其中前述有機相含有甲醇。
[6] 如[1]至[5]中任1項之方法，其中水相含有磷酸或其鹽，或者其等之混合物。
[7] 如[2]至[6]中任1項之方法，其中，在相關物質1、3、4及三氟胸苷之滯留時間內，在有機相對移動相整體之比例中，最大值與最小值之差為移動相整體的5體積%以下。
[8] 如[1]至[7]中任1項之方法，其中移動相之pH為2.0~5.0。
[9] 一種2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷(相關物質4)，是用於含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑的品質管理。
[10] 一種2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷(相關物質4)，是用作為在含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑之雜質檢測時的標準品。
[11] 一種2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷(相關物質4)作為標準品之用途，該標準品是在含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑之品質管理時的標準品。
[12] 一種含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑之雜質檢測時的標準品，是由2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷(相關物質4)構成。
[13] 一種2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷(相關物質4)之製造方法，特徵在於從含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑分離。
[14] 一種含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑的製造方法，含有實施如[1]至[8]中任1項之方法的步驟。
[15] 一種含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑的品質管理方法，含有實施如[1]至[8]中任1項之方法的步驟。
發明效果 透過本發明，可將含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之試料中所含有之源自三氟胸苷之相關物質及源自替吡嘧啶之相關物質以相同的方法來檢測。因此，藉由本發明之方法，可簡便且迅速的進行含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之製劑的品質管理。
用以實施發明之形態 本發明中的替吡嘧啶(TPI)是5-氯-6-(2-亞胺基吡咯啶-1-基)甲基-2,4(1H、3H)-嘧啶二酮，且為具有下述結構之化合物。
[化學式1]
Figure 02_image001
本發明中的三氟胸苷(FTD)是α,α,α-三氟胸苷，且為具有下述結構之化合物。
[化學式2]
Figure 02_image003
本發明中，當三氟胸苷及替吡嘧啶具有光學異構物、立體異構物、旋轉異構物、互變異構物等異構物時，在無特別明記之下，使用任一異構物，及使用其等與替吡嘧啶及/或三氟胸苷之混合物作為試料之方法亦包含在本發明中。
本發明中，在無特別明記並非如此之下，所謂鹽意指藥學上容許的鹽，可舉鹼加成鹽或酸加成鹽。
該鹼加成鹽可舉例如鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；例如鈣鹽、鎂鹽等鹼土類金屬鹽；例如銨鹽；例如三甲基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽、三乙醇胺鹽、普魯卡因鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽等有機胺鹽等。
該酸加成鹽可舉例如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、過氯酸鹽等無機酸鹽；例如乙酸鹽、甲酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、三氟乙酸鹽等有機酸鹽；例如甲烷磺酸鹽、羥乙磺酸酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等磺酸鹽等。
可用於本發明的三氟胸苷或其鹽宜為未形成鹽之三氟胸苷自由體。又，可用於本發明之替吡嘧啶或其鹽宜為替吡嘧啶鹽酸鹽。可用於本發明之含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之試料宜為含有三氟胸苷自由體及替吡嘧啶鹽酸鹽之試料。
本發明之方法是將含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之試料，不須進行複數次測定，而可利用1次高效液相層析，來檢測該等之相關物質的方法。此外，若為在試料中含有源自三氟胸苷之相關物質及源自替吡嘧啶之相關物質二者時可透過一次的測定來檢測出此二者之方法，則即便在因試料中僅含有源自三氟胸苷之相關物質及源自替吡嘧啶之相關物質之一者或者不含相關物質，結果使得該二者之相關物質皆未被檢測出的情況下，該方法仍是包含在本發明中。
本發明中的試料可含有源自三氟胸苷或替吡嘧啶之相關物質。相關物質可舉相關物質1~6化合物。
[表1]
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相關物質1是三氟胸腺嘧啶，為源自三氟胸苷之相關物質。有時亦稱為5-(三氟甲基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
相關物質2是2-亞胺基吡咯啶，為源自替吡嘧啶之相關物質。
相關物質3是5-氯-6-{(2-側氧基吡咯啶-1-基)甲基}嘧啶-2,4-(1H、3H)-二酮，為源自替吡嘧啶之相關物質。
相關物質4是2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷，為源自三氟胸苷之相關物質。有時亦稱為1-((2R,4R,5R)-4-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基)-2,4-二側氧-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-羧酸甲酯。
相關物質5是5-羧基尿嘧啶，為源自三氟胸苷之相關物質。有時亦稱為2,4-二側氧-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-羧酸。
相關物質6是5-氯-6-(氯甲基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮，為源自替吡嘧啶之相關物質。
可用於本發明之試料，不僅可使用製劑或從原藥本身調製而成之試料，亦可使用為了確認穩定性等之在試驗中所調製之試料、為了確認各相關物質之滯留時間(層析圖之波峰)等而添加有各相關物質之試料、為了確認製劑或原藥之製造步驟所調製之試料等。
在本發明可使用之製劑(有時亦記載為摻合劑、組成物等)中，含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽。並且，可視需要摻合藥學上容許之載劑，並可視預防或治療目的而採用各種投予形態，該形態可為例如口服劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、貼片劑等任一，且宜採用口服劑。該等投予形態可藉由各種習於此藝者所公知慣用的製劑方法來製造。
藥學上容許之載劑可使用在製劑素材上慣用的各種有機或無機載劑物質，且可作為固態製劑中的賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑來摻合，或可作為液狀製劑中的溶劑、助溶劑、懸浮劑、等張劑、緩衝劑、無痛劑等來摻合。又，視需要亦可使用防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甘味劑、穩定劑等製劑添加物。
在調製口服用固態製劑時，可在本發明化合物中添加賦形劑，且視需要添加結合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、矯味/氣味改善劑等，之後，可依常法製造錠劑、被覆錠劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑等。
又，具有上述投予形態之藥劑的每1日投予量可依患者之症狀、體重、年齡、性別等適宜決定。
本發明中所使用的高效液相層析可使用通常市售者。
在高效液相層析中，可將有機相及水相混合做成移動相，並將其注入管柱，藉此用於醫藥品的分析。在本發明當中，因試料中含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽，因此需要各自以三氟胸苷、替吡嘧啶為基礎的測定條件。若可在1個高效液相層析之測定條件下測定三氟胸苷、源自三氟胸苷之相關物質、替吡嘧啶、源自替吡嘧啶之相關物質，則在品質管理上會非常有用。
針對色層分析所使用的管柱，已知將有機相做成移動相並分離具有脂溶性之化合物的正相管柱，與將水相做成移動相並分離化合物的逆相管柱，然在高效液相層析中，大多使用逆相管柱，而在本發明中亦宜使用逆相色層分析。
本發明中可使用的高效液相層析管柱可自以下管柱選擇：矽膠管柱、表面經十八烷基矽基修飾的矽膠管柱(ODS管柱或C18管柱)、表面經辛基修飾的矽膠管柱(C8管柱)、表面經氰丙基修飾的矽膠管柱(CN管柱)、表面經苯乙基修飾的矽膠管柱(Ph管柱)、表面經胺基丙基修飾的矽膠管柱(NH管柱)、表面經二羥基丙基修飾的矽膠管柱(Diol管柱)、經各種聚合物填充的管柱(聚合物管柱)、經離子交換樹脂填充的管柱(離子交換管柱)等；然本發明中宜為ODS管柱。
ODS管柱方面，可使用矽膠粒徑、細孔徑、十八烷基矽基之鍵結方法、十八烷基矽基之取代度等不同的各種ODS管柱。本發明中，矽膠之平均粒徑例如宜為2~10μm，且以3~5μm為佳。矽膠之平均粒徑可藉由雷射繞射法等來測定。矽膠之平均細孔徑例如宜為6~20nm，且以8~13nm為佳。矽膠之平均細孔徑可藉由氣體吸附法等來測定。矽膠中十八烷基矽基的鍵結形式例如宜為單體形式、聚合物形式等。矽膠之碳量例如宜為3~25%，且以8~25%為佳、以10~20%更佳。矽膠之碳量可藉由各種方法測定。在本發明中，從鹼性化合物之替吡嘧啶及其相關物質之波峰形狀的改善及分離容易度的觀點來看，宜為將十八烷基化後殘存之矽醇以低分子矽基化劑處理過的ODS管柱(經終結(end capping)之ODS管柱)，且以終結使碳量為10%以上之ODS管柱為佳。特別以Wakosil-II 5C18 RS(和光純藥製)或Inertsil ODS-4(GL SCIENCES公司製)更佳。
可用於高效液相層析之移動相的有機相可使用己烷、環己烷、庚烷、二乙基醚、四氫呋喃、氯仿、氯化亞甲基等非極性溶劑；丙酮、二甲基亞碸、乙腈等非質子性極性溶劑；乙酸、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈等。該等溶劑可1種單獨使用，或做成2種以上之混合溶劑來使用。本發明中的有機相宜為甲醇或乙腈，且以甲醇為佳。又，有機相中亦可含有10%以下的水。
可用於高效液相層析之移動相的水相中，可不只含有水，而亦可含有10%以下之上述有機溶劑，然宜僅為水。
從確保重現性之觀點來看，高效液相層析之移動相可添加各式緩衝劑。可添加例如乙酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、酒石酸或其鹽、磷酸或其鹽。乙酸或其鹽可舉乙酸、乙酸鈉。檸檬酸或其鹽可舉檸檬酸、檸檬酸一鈉、檸檬酸二鈉、檸檬酸三鈉。酒石酸或其鹽可舉酒石酸、酒石酸鈉，磷酸或其鹽可舉磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀。本發明中水相之添加劑方面，從測定物質具有之性質、測定時獲得之波峰形狀及測定之重現性的觀點來看，宜為磷酸或其鹽，且以磷酸、磷酸二氫鈉為佳。該等添加劑可1種單獨使用，或2種以上組合使用。
本發明可使用之緩衝劑之濃度，若為在高效液相層析之測定中緩衝劑不會析出之濃度，則可適宜調整。宜為1~50mM，且以5~20mM為佳、以9~11mM更佳。
高效液相層析之移動相可使用有機相與水相之混合液。在本發明中，在選自於由相關物質1、3、4及三氟胸苷所構成群組之1或2種以上物質之滯留時間(宜為相關物質1、3、4及三氟胸苷之滯留時間)內，有機相對移動相整體之比例宜為移動相整體之5~20體積%，且以7~15體積%為佳。又，本發明中，在相關物質1、2、3、4、三氟胸苷及替吡嘧啶之滯留時間內，有機相對移動相整體之比例以皆為7~15體積%特別為佳。
本發明中，移動相是由甲醇及水相構成，且在選自於由相關物質1、3、4及三氟胸苷構成群組之1或2種以上物質之滯留時間(宜為相關物質1、3、4及三氟胸苷之滯留時間)內，甲醇對移動相整體之比例為移動相整體之5~20體積%為佳。移動相是由甲醇及含有磷酸或磷酸二氫鈉之水相構成，且在選自於由相關物質1、3、4及三氟胸苷所構成群組之1或2種以上物質之滯留時間(宜為相關物質1、3、4及三氟胸苷之滯留時間)內，甲醇對移動相整體之比例為移動相整體之5~20體積%為佳。移動相是由甲醇及含有磷酸或磷酸二氫鈉之水相構成，且在選自於由相關物質1、3、4及三氟胸苷所構成群組之1或2種以上物質之滯留時間(宜為相關物質1、3、4及三氟胸苷之滯留時間)內，甲醇對移動相整體之比例為移動相整體之7~15體積%更佳。
高效液相層析之移動相可使用有機相與水相之混合液，且常會使其等之比例在測定中變化，並稱為施加梯度。通常，考慮到作為目的化合物之滯留時間及作為目的之化合物與相關物質的分離，常會施加梯度。
本發明中，在相關物質1、3、4及三氟胸苷之滯留時間內，在有機相對移動相整體之比例中，最大值與最小值之差宜為移動相整體之5體積%以下，且以1體積%以下為佳、以等度(isocratic)狀態更佳。又，本發明中，在測定時間中，宜將有機相對移動相整體之比例的變化(測定時間中，在有機相對移動相整體之比例中，最大值與最小值之差)做到移動相整體之5體積%以下，且以1體積%以下為佳、以等度狀態更佳。
本發明中除了上述添加劑之外，還可添加離子對試劑，其對於使相關物質滯留在管柱中扮演重要角色。離子對試劑可使用丙基磺酸鈉、丁基磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、十二烷磺酸鈉等烷基磺酸或其鹽(宜為烷基磺酸鈉、且以碳數7~12之直鏈或支鏈狀烷基磺酸鈉為佳)，十二烷基硫酸鈉，四乙基氫氧化銨、四丁基氫氧化銨、四丁基氯化銨、四丁基溴化銨等4級銨鹽，三己基胺、三辛基胺等3級胺。本發明中的離子對試劑宜為碳數7~12之直鏈或支鏈狀烷基磺酸或其鹽(特別是碳數7~12之直鏈或支鏈狀烷基磺酸鈉)，且以1-庚烷磺酸或其鹽(特別是1-庚烷磺酸鈉)為佳。該等離子對試劑可1種單獨使用，或2種以上組合使用。
本發明中移動相之pH可藉由上述添加劑等適宜調整，且宜為2.0~5.0、以2.6~2.8為佳。
在本發明中之方法可使用的檢測波長，考慮到各相關物質之性質而可設為205~230nm，且宜為208~220nm、以208~212nm為佳。
在本發明中之方法可使用之管柱內移動相的溫度可適宜設定。考慮到外部環境的影響、重現性等，宜將該溫度保持在一定，且以25~50℃為佳、以35~45℃更佳、以38~42℃特別為佳。再者，該溫度在保持一定時，不僅可控制管柱整體的溫度，還可使用預熱混合器(preheat mixer)等。
本發明中的高效液相層析可適宜變更移動相之流速、注入量等。本發明中，移動相之流速並無特別限定，然宜為0.5~2.0mL/min，且以0.7~1.3mL/min為佳。
本發明之相關物質可藉由眾所皆知的方法合成，或可自市售品獲得。藉由將如此獲得之相關物質之高效液相層析的滯留時間、質譜、自光二極體陣列(PDA)之結果，與經本發明檢測出之相關物質的該等結果進行比較，而可特定出相關物質。
進一步，該等相關物質可藉由使用外部標準之方法、使用內部標準之方法的任一方法來進行定量測定。
該等相關物質可能以雜質形式含在醫藥品或製劑中時，該等相關物質可依照國際醫藥法規協和會之規範(ICH-Q3)來控制。本發明方法可用來確認是否滿足該規範之基準，因此非常有用。
又，該等相關物質可藉由本發明之方法而從三氟胸苷或其鹽、替吡嘧啶或其鹽中檢測出。進一步，本發明可將相關物質1~5中之1或2種以上作為標準品而用於品質管理，且宜為相關物質4。
可用於如此標準品之三氟胸苷、替吡嘧啶及源自其等之相關物質為高純度者。作為標準品之純度宜為99.0%以上，且以99.9%以上為佳。因此，透過該高效液相層析之條件而分離的各相關物質可用作為標準品。就此，亦可換句話說，本發明是一種該相關物質之製造方法，特徵在於自含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑中分離。該相關物質可舉上述相關物質1~5，且宜為相關物質4。
本發明中的源自三氟胸苷或替吡嘧啶之相關物質的檢測中，可使用利用高效液相層析的方法。
宜為使用下述高效液相層析之方法：在相關物質1、3、4、三氟胸苷之滯留時間內，有機相為移動相整體之5~20體積%。
以利用下述高效液相層析之方法為佳：移動相是由甲醇及水相構成，且在相關物質1、3、4、三氟胸苷之滯留時間內，甲醇為移動相整體之5~20體積%。
以利用下述高效液相層析之方法為佳：移動相是由甲醇及含有磷酸或磷酸二氫鈉之水相構成，且在相關物質1、3、4、三氟胸苷之滯留時間內，甲醇為移動相整體之5~20%。
以利用下述高效液相層析之方法為佳：移動相是由甲醇及含有磷酸或磷酸二氫鈉之水相構成，且在相關物質1、3、4、三氟胸苷之滯留時間內，甲醇為移動相整體之7~15%。
以利用下述高效液相層析之方法為佳：移動相是由甲醇及含有磷酸或磷酸二氫鈉之水相構成，且在相關物質1、3、4、三氟胸苷之滯留時間內，甲醇為移動相整體之7~15%，並且，在測定時間中，令有機相與水相之比例變化為移動相整體之5%以下。
以利用下述高效液相層析之方法為佳：移動相是由甲醇及含有磷酸或磷酸二氫鈉之水相構成，在相關物質1、3、4、三氟胸苷之滯留時間內，甲醇為移動相整體之7~15%，在測定時間中，有機相與水相之比例變化為移動相整體之5%以下，且使用1-庚烷磺酸鈉作為離子對試劑。
在本發明中，若三氟胸苷及替吡嘧啶之滯留時間過短，則無法分離相關物質1~5。又，若三氟胸苷及替吡嘧啶之滯留時間過長，則在測定時間上需要長的時間。本發明中，三氟胸苷之滯留時間可舉5~30分，且宜為5~20分。又，本發明中，替吡嘧啶之滯留時間可舉5~30分，且宜為10~25分。
本發明中，相關物質1與相關物質4在高效液相層析中之滯留時間有非常接近的傾向。為避免該傾向，相關物質1與相關物質4之滯留時間的差可舉0.2分以上，且宜為0.4分以上、以0.5分以上為佳。
又，相關物質3與三氟胸苷在高效液相層析中之滯留時間亦有非常接近的傾向。為避免該傾向，相關物質3與三氟胸苷之滯留時間的差可舉0.2分以上，且宜為0.5分以上、以1.0分以上為佳。
進一步，由於本發明可檢測源自三氟胸苷及源自替吡嘧啶之相關物質，因此可個別的從三氟胸苷或其鹽中僅檢測源自三氟胸苷之相關物質，相同的，亦可從替吡嘧啶或其鹽中僅檢測源自替吡嘧啶之相關物質。
從三氟胸苷或其鹽中僅檢測源自三氟胸苷之相關物質的方法是遵照上述之用以從三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽中檢測源自三氟胸苷之相關物質或源自替吡嘧啶之相關物質之一者或二者之方法，且適合之實施形態是與該方法相同。
從替吡嘧啶或其鹽中僅檢測源自替吡嘧啶之相關物質的方法是遵照上述之用以從三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽中檢測源自三氟胸苷之相關物質或源自替吡嘧啶之相關物質之一者或二者之方法。因此，以下所示事項之外的實施形態可採用上述之實施形態。
將本發明用於從替吡嘧啶或其鹽中僅檢測源自替吡嘧啶之相關物質的方法時，高效液相層析中可使用之管柱可使用與上述相同之管柱，且宜為ODS管柱、以Wakosil-II 5C18 RS(和光純藥製)、或Inertsil　ODS-3(GL SCIENCES公司製)為佳。
可用於高效液相層析之移動相的有機相可使用上述之有機溶劑，且宜為甲醇或乙腈、以乙腈為佳。
可用於高效液相層析之移動相的水相可不僅含水，亦可含有10%以下的有機溶劑，然宜僅為水。
從確保重現性的觀點來看，可在高效液相層析之移動相添加各式緩衝劑。可添加之緩衝劑可舉上述之添加劑，且宜為磷酸或其鹽、以磷酸二氫鉀為佳。
緩衝劑之濃度可使用上述之濃度，且宜為1~50mM、以2~20mM為佳、以3~10mM特別為佳。
在高效液相層析之移動相可使用上述之有機相與水相的混合液，在相關物質3或替吡嘧啶之滯留時間(宜為相關物質3及替吡嘧啶之滯留時間)內，有機相對移動相整體之比例宜為移動相整體之5~20體積%，且以7~15體積%為佳。
在高效液相層析之移動相，宜為移動相是由乙腈及水相構成，且在相關物質3或替吡嘧啶之滯留時間(宜為相關物質3及替吡嘧啶之滯留時間)內，乙腈對移動相整體之比例為移動相整體之5~20體積%。宜為，移動相是由乙腈及含有磷酸或其鹽之水相構成，且在相關物質3及替吡嘧啶之滯留時間內，乙腈對移動相整體之比例為移動相整體之5~20體積%。更佳的是，移動相是由乙腈及含有磷酸或磷酸二氫鈉之水相構成，且在相關物質3及替吡嘧啶之滯留時間內，乙腈對移動相整體之比例為移動相整體之7~15體積%。
高效液相層析之移動相中可添加離子對試劑，且可使用上述之離子對試劑。宜為烷基磺酸鈉，且以碳數4~12之烷基磺酸鈉為佳、以1-庚烷磺酸鈉更佳。
高效液相層析之移動相的流速並無特別限定，宜為0.5~2.0mL/min，且以0.6~1.5mL/min為佳、以0.7~1.3mL/min更佳。
在利用高效液相層析之源自替吡嘧啶之相關物質的測定中，可分別分離相關物質2、3、6及替吡嘧啶即可。各個相關物質之滯留時間因條件而異，然相互之滯留時間的差為0.5分以上即可。
從替吡嘧啶或其鹽中檢測源自替吡嘧啶之相關物質中，可使用利用高效液相層析的方法。
宜為使用下述高效液相層析的方法：在相關物質3及替吡嘧啶之滯留時間內，有機相為移動相整體之5~20體積%。 以利用下述高效液相層析的方法為佳：有機相是由乙腈構成，且在相關物質3及替吡嘧啶之滯留時間內，乙腈為移動相整體之5~20體積%。
以利用下述高效液相層析的方法為佳：移動相是由乙腈及含有磷酸或磷酸二氫鉀之水相構成，且在相關物質3及替吡嘧啶之滯留時間內，乙腈為移動相整體之5~20%。 以利用下述高效液相層析的方法為佳：移動相是由乙腈及含有磷酸或磷酸二氫鉀之水相構成，且在相關物質3及替吡嘧啶之滯留時間內，乙腈為移動相整體之7~15%。
以利用下述高效液相層析的方法為佳：移動相是由乙腈及含有磷酸二氫鉀之水相構成，在相關物質3及替吡嘧啶之滯留時間內，乙腈為移動相整體之7~15%，且在測定時間中，令有機相與水相之比例變化為移動相整體之5%以下。
以利用下述高效液相層析的方法為佳：移動相是由乙腈及含有磷酸二氫鉀之水相構成，在相關物質3及替吡嘧啶之滯留時間內，乙腈為移動相整體之7~15%，在測定時間中，有機相與水相之比例變化為移動相整體之5%以下，且使用1-庚烷磺酸鈉作為離子對試劑。
如上述，透過本發明之方法，可將源自三氟胸苷之相關物質從三氟胸苷或其鹽中分離，並進行檢測。又，透過本發明之方法，可將源自替吡嘧啶之相關物質從替吡嘧啶或其鹽中分離，並進行檢測。又，透過本發明之方法，可將源自三氟胸苷及替吡嘧啶之各相關物質各別分離，並進行檢測。因此，在含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之組成物的生產管理上，透過使用本發明，可獲得使該等相關物質之含量降低的組成物。如前述，相關物質1與相關物質4在高效液相層析中之滯留時間有非常近值的傾向。又，相關物質3與三氟胸苷在高效液相層析中之滯留時間亦有非常近值的傾向。因此，關於該等相關物質之分離的發明是特別有用。
例如，透過本發明，可獲得一含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑，特徵在於實質上不含前述相關物質(例如相關物質4)。又，透過本發明，可獲得一含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑，其含有前述相關物質(例如相關物質4)，且該相關物質(例如相關物質4)之含量(質量)在預定量以下，例如，摻合劑所含有之三氟胸苷整體的0.05質量%以下。在該實施形態中，該摻合劑中之該相關物質(例如相關物質4)的含量(質量)下限並無特別限定。
因此，在本發明中，可將前述相關物質(例如相關物質4)用於含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑的品質管理(例如，相關物質含量之管理(調整))。進一步，透過本發明，亦可將前述相關物質(例如相關物質4)用作為在含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑之雜質檢測時的標準品。又，透過本發明，亦可提供一種前述相關物質(例如相關物質4)之製造方法，特徵在於從含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑中分離。該等發明效果不僅在相關物質4上，針對相關物質1~3及5、6亦可說有相同效果。
本發明提供之品質管理方法是含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑的品質管理方法，且含有實施上述本發明方法的步驟。本發明之品質管理方法，例如，當上述相關物質(例如，相關物質1~6之任1以上)之含量(質量)在預定量以下時，可評價為摻合劑滿足有關品質管理的基準。
本發明亦提供一種含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑的製造方法，含有實施上述本發明方法之步驟。本發明之製造方法，例如亦可含有以下步驟：製造三氟胸苷或其鹽之步驟，製造替吡嘧啶或其鹽之步驟，混合獲得之三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之步驟，以及，實施上述方法(宜為進行含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑的品質管理)之步驟。
實施例 利用以下試驗條件進行高效液相層析的測定。 ・檢測器：紫外吸光光度計(波長為210nm) ・管柱：內徑4.6mm、長度15cm之不鏽鋼管裝入5μm液相層析用十八烷基矽基化矽膠管柱 ・管柱溫度：40℃ ・流量：0.6~1.0mL/分 ・移動相：記載於各實施例 ・梯度：記載於各實施例 以高效液相層析測定之試料是如下調製。
使三氟胸苷、替吡嘧啶鹽酸鹽溶解在與各測定條件下可使用之移動相同樣組成之溶液中，以使得三氟胸苷之濃度成為約1mg/mL且替吡嘧啶鹽酸鹽之濃度成為約0.5mg/mL，並將經適當稀釋之溶液作為試料。
實施例1 管柱：Inertsil ODS-4，GL SCIENCES公司製 移動相：將磷酸二氫鈉二水合物1.4g及1-庚烷磺酸鈉0.9g溶解於水900mL中，添加磷酸並調整到pH2.7。於該液體中添加甲醇100mL做成移動相。
測定結果顯示於圖1。藉此可確認到，三氟胸苷之滯留時間為12.0分，且確認到替吡嘧啶之滯留時間為19.6分。又，可確認到相關物質1之滯留時間為6.8分、相關物質4之滯留時間為7.6分、相關物質3之滯留時間為11.0分、相關物質2之滯留時間為15.3分。又，可確認到相關物質5之滯留時間為3.1分。藉此，確認是可分離相關物質1與4，且可分離相關物質3與三氟胸苷的測定條件。
又，經檢測之各相關物質與另行購入或合成之各相關物質的滯留時間一致，因此確認為顯示有相關物質1~6結構的化合物。
實施例2 管柱：Inertsil ODS-4，GL SCIENCES公司製 移動相：將磷酸二氫鈉二水合物1.5g及1-庚烷磺酸鈉0.9g溶解於水900mL中，添加磷酸並調整到pH2.7。於該液體中添加甲醇100mL做成移動相。
測定結果與實施例1相同。
實施例3 管柱：Inertsil ODS-4，GL SCIENCES公司製 移動相：將磷酸二氫鈉二水合物1.4g及1-庚烷磺酸鈉1.0g溶解於水900mL中，添加磷酸並調整到pH2.8。於該液體中添加甲醇100mL做成移動相。
測定結果與實施例1相同。
實施例4 管柱：Inertsil ODS-4，GL SCIENCES公司製 移動相：將磷酸二氫鈉二水合物1.4g及1-庚烷磺酸鈉0.9g溶解於水900mL中，添加磷酸並調整到pH2.7。於該液體中添加甲醇95mL做成移動相。
測定結果與實施例1相同。
實施例5 管柱：Wakosil-II 5C18 RS，和光純藥製 移動相：將磷酸二氫鈉二水合物1.4g及1-庚烷磺酸鈉0.9g溶解於水900mL中，添加磷酸並調整到pH2.7。於該液體中添加甲醇100mL做成移動相。
測定結果與實施例1相同。
實施例6 管柱：Wakosil-II 5C18 RS，和光純藥製 移動相：將磷酸二氫鈉二水合物3.1g及1-庚烷磺酸鈉2.0g溶解於水2000mL中，添加磷酸並調整到pH2.7。於該液體950mL中添加甲醇50mL做成移動相。
測定結果可確認到，三氟胸苷之滯留時間在21.0分~23.0分之間，且確認到替吡嘧啶之滯留時間在41.0分~43.0分之間。又，可確認到相關物質1之滯留時間在9.0分~10.0分之間、相關物質4之滯留時間在8.0分~9.0分之間、相關物質3之滯留時間在15.0~17.0分之間、相關物質2之滯留時間在28.0分~30.0分之間。
實施例7 管柱：Wakosil-II 5C18 RS，和光純藥製 移動相：將磷酸二氫鉀1.25g及1-庚烷磺酸鈉1.01g溶解於水920mL中，添加乙腈80mL做成移動相。
測定結果可確認到，三氟胸苷之滯留時間為8.4分，且確認到替吡嘧啶之滯留時間為12.2分。又，可確認到相關物質1之滯留時間為6.1分。
實施例8 管柱：Inertsil ODS-3，GL SCIENCES公司製 移動相：將1-庚烷磺酸鈉1.88g溶解於水1860mL中，添加乙腈140mL、添加磷酸並調整到pH2.7。
測定結果可確認到，三氟胸苷之滯留時間為13.1分，且確認到替吡嘧啶之滯留時間為24.7分。又，可確認到相關物質1之滯留時間為8.6分、相關物質3之滯留時間為10.3分、相關物質2之滯留時間為17.1分。
實施例9 管柱：Wakosil-II 5C18 RS，和光純藥製 移動相：取1-庚烷磺酸鈉1.01g，添加水做成1000mL。於該液體850mL中添加甲醇150mL，添加磷酸並調整到pH2.7。
測定結果可確認到，三氟胸苷之滯留時間在8.0~10.0分之間，且確認到替吡嘧啶之滯留時間在14~17分之間。又，可確認到相關物質3之滯留時間為6.3分。
實施例10 使替吡嘧啶鹽酸鹽之濃度成為約0.8mg/mL來溶解在水/乙腈混合溶液(23：2)中，並將經適當稀釋之溶液作為僅含有替吡嘧啶之試料。
管柱：Wakosil-II 5C18　RS，和光純藥製；或Inertsil ODS-3，GL SCIENCES公司製 移動相：將磷酸二氫鉀1.25g及1-庚烷磺酸鈉1.01g溶解於水920mL中，添加乙腈80mL做成移動相。
測定結果可確認到，替吡嘧啶之滯留時間為9.1分。又，可確認到相關物質3之滯留時間為5.2分、相關物質2之滯留時間為7.0分、相關物質6之滯留時間為7.7分。藉此，藉此可確認是可分離相關物質2、3、6及替吡嘧啶的測定條件。
(無)
圖1顯示實施例1之層析圖。 圖2顯示實施例10之層析圖。
(無)

Claims (9)

  1. 一種用以檢測源自三氟胸苷(trifluridine)之相關物質及源自替吡嘧啶(tipiracil)之相關物質之一者或兩者的方法，含有以下步驟：將含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之試料供於高效液相層析，且該高效液相層析使用由有機相及水相構成之移動相；前述相關物質是選自於由下述相關物質1~5所構成群組中之至少1者：相關物質1：三氟胸腺嘧啶，相關物質2：2-亞胺基吡咯啶，相關物質3：5-氯-6-{(2-側氧基吡咯啶-1-基)甲基}嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮，相關物質4：2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷，相關物質5：5-羧基尿嘧啶；前述有機相是選自於由非質子性極性溶劑、乙酸、甲醇、乙醇、異丙醇所構成群組中之至少1種或2種以上。
  2. 如請求項1之方法，其中前述相關物質含有相關物質3，且在高效液相層析中，相關物質3與三氟胸苷之滯留時間相差1.0分以上。
  3. 如請求項1之方法，其中，在相關物質1~5、三氟胸苷及替吡嘧啶之滯留時間內，有機相對移動相整體之比例皆為7~15體積%。
  4. 如請求項1之方法，其中前述有機相含有甲醇。
  5. 如請求項1之方法，其中水相含有磷酸或其鹽，或者其等之混合物。
  6. 如請求項1之方法，其中，在相關物質1、3、4及三氟胸苷之滯留時間內，在有機相對移動相整體之比例中，最大值與最小值之差為移動相整體的5體積%以下。
  7. 如請求項1之方法，其中移動相之pH為2.0~5.0。
  8. 一種2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷(相關物質4)作為HPLC標準品之用途，該標準品是在含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑之品質管理時的標準品。
  9. 一種2’-去氧-5-甲氧基羰基尿苷(相關物質4)之製造方法，特徵在於從含有三氟胸苷或其鹽及替吡嘧啶或其鹽之摻合劑以HPLC進行分離。
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