CN110007010A

CN110007010A - 源自曲氟尿苷的类似物质的检测方法

Info

Publication number: CN110007010A
Application number: CN201810821041.5A
Authority: CN
Inventors: 武田大典; 小岛章代
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2019-07-12

Abstract

本发明涉及源自曲氟尿苷的类似物质的检测方法。本发明的课题是提供可通过2个利用了梯度条件的阶段、使用高效液相色谱法而从含有曲氟尿苷或其盐的试样中检测源自曲氟尿苷的类似物质的新方法。本发明的解决手段为用于检测源自曲氟尿苷的类似物质的方法，所述方法包括将含有曲氟尿苷或其盐的试样供于高效液相色谱法的步骤，所述高效液相色谱法中使用包含有机相及水相的流动相，其中，所述供于高效液相色谱法的步骤包括满足以下要件的阶段1及阶段2：阶段1：有机相相对于流动相整体的比例为1～14容量％；阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例增加。

Description

源自曲氟尿苷的类似物质的检测方法

技术领域

本发明涉及利用高效液相色谱法对含有曲氟尿苷的制剂的类似物质进行测定的方法。

背景技术

一般而言，医药品的类似物质利用液相色谱法进行测定，经常使用将水及有机溶剂的混合液作为流动相的正相色谱柱体系或反相色谱柱体系。一直以来，曲氟尿苷以Viropic(注册商标)的名称作为用于治疗感染的滴眼剂而进行使用，作为申请人的制品的Lonsurf(日文为“ロンサーフ”)(注册商标)为含有曲氟尿苷及替吡嘧啶的制剂。该含有曲氟尿苷及替吡嘧啶的医药品已作为抗肿瘤药进行销售，关于该制剂已有多项报道(专利文献1、2、3、4)。

而且，作为曲氟尿苷的类似物质，5-三氟甲基尿嘧啶及5-羧基尿嘧啶是已知的，已报道了使用高效液相色谱法对它们进行测定(非专利文献1)。

已报道了作为曲氟尿苷的类似物质的5-三氟甲基尿嘧啶可在各种反相液相色谱法的条件下进行测定(非专利文献2)。

已报道了为了测定曲氟尿苷向肿瘤细胞中的摄入而使用液相色谱法(非专利文献3)。

已报道了在曲氟尿苷的TK1的底物特异性的判断中使用液相色谱法(非专利文献4)。

已报道了在酶合成中的曲氟尿苷的测定中使用液相色谱法(非专利文献5)。

另外，关于含有曲氟尿苷及替吡嘧啶的医药品，已报道了定量的液相色谱法的分析(非专利文献6、7、8)。

已报道了用于测定作为曲氟尿苷的类似物质的5-三氟甲基尿嘧啶的、使用了乙腈的各种高效液相色谱法的条件(非专利文献2)。

已报道了用于测定曲氟尿苷向肿瘤细胞中的摄入的、使用了乙腈的高效液相色谱法的条件(非专利文献3)。

已报道了用于判断曲氟尿苷的TK1的底物特异性的、使用了乙腈的高效液相色谱法的条件(非专利文献4)。

已报道了用于确认酶合成中的曲氟尿苷的、添加三甲基乙酸铵并设置了梯度的高效液相色谱法的条件(非专利文献5)。

已报道了用于定量测定Lonsurf中含有的曲氟尿苷和替吡嘧啶的、使用了乙腈的高效液相色谱法的条件(非专利文献6、7、8)。

关于滴眼剂形式的曲氟尿苷，已报道使用了甲醇的高效液相色谱法的条件(非专利文献9、10)。

关于曲氟尿苷，已报道使用了添加有乙酸缓冲液、三氟乙酸或乙酸的流动相的高效液相色谱法的条件(非专利文献11、12、专利文献6、13)。

另外，虽为了确认曲氟尿苷的纯度而在使用高效液相色谱法，但其条件未有记载(专利文献7)。

但是，这些报道中并没有公开通过2个使用了梯度条件的阶段、使用高效液相色谱法对曲氟尿苷的类似物质进行检测的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2013/122134

专利文献2：WO2013/122135

专利文献3：WO2006/080327

专利文献4：WO96/30346

专利文献5：CN106749194A

专利文献6：CN105198947A

专利文献7：CN105461772A

专利文献8：日本专利4603274

专利文献9：日本专利4441313

专利文献10：日本专利4437786

非专利文献

非专利文献1：P.Horsch等，International Journal of Pharmaceutics 222(2001)，p.205-215

非专利文献2：D.V.Moiseev等，Pharmaceutical Chemistry Journal 41，1(2007)，p.25-33

非专利文献3：N.TANAKA等，Oncology Reports 32(2014)，p.2319-2326

非专利文献4：K.SAKAMOTO等，International Journal of Oncology 46(2015)，p.2327-2334

非专利文献5：A.Fresco-Taboada等，Catalysis Today 259(2015)，p.197-204

非专利文献6：M.S.H.Rizwan等，International Journal of InnovativePharmaceutical Sciences and Research 5(2017)，p.32-42

非专利文献7：S.GODAY等，International Journal of Research in Applied,Natural and Social Sciences 5(2017)，p.93-104

非专利文献8：K.Jogi等，International Journal of Research in Pharmacyand Chemistry 7(2017)，p.63-70

非专利文献9：B.Paw等，Pharmazie 7(1997)，p.551-552

非专利文献10：T.Briggle等，Journal of Chromatography 381(1986)，p.343-355

非专利文献11：M.Riegel等，Journal of Chromatography 568(1991)，p.467-474

非专利文献12：G.Balansard等，Journal of Chromatography 348(1985)，p.299-303

非专利文献13：T.Kawauchi等，Journal of Chromatography 751(2001)，p.325-330

发明内容

发明所要解决的课题

本发明所要解决的课题是提供可通过2个使用了梯度条件的阶段、使用高效液相色谱法而从含有曲氟尿苷或其盐的试样中检测源自曲氟尿苷的类似物质的新方法。

用于解决课题的手段

本申请发明人进行了深入研究，结果发现了通过在特定的条件下使用高效液相色谱法能够高效地检测出曲氟尿苷或其盐的类似物质、并且适于保证其的品质的检测方法。

因此，本发明提供以下[1]～[16]。

[1]用于检测源自曲氟尿苷的类似物质的方法，所述方法包括将含有曲氟尿苷或其盐的试样供于高效液相色谱法的步骤，所述高效液相色谱法中使用包含有机相及水相的流动相，其中，所述供于高效液相色谱法的步骤包括满足以下要件的阶段1及阶段2：

阶段1：有机相相对于流动相整体的比例为1～14容量％；

阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例增加。

[2]如[1]所述的方法，其中，所述类似物质为选自由下述类似物质1～6组成的组中的至少一种：

类似物质1：5-羧基尿嘧啶；

类似物质2：5-羧基-2’-脱氧-尿苷；

类似物质3：2’-脱氧-5-甲氧基羰基尿苷；

类似物质4：三氟胸腺嘧啶；

类似物质5：5-甲氧基羰基尿嘧啶；

类似物质6：5’-(4-氯苯基羧基)-2’-脱氧-5-三氟甲基尿苷。

[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，通过阶段1检测类似物质1～5，通过阶段2检测类似物质6。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，阶段1以等度状态实施。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，有机相为乙腈。

[6]如[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，阶段1中，有机相相对于流动相整体的比例为2～10容量％。

[7]如[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，阶段2结束时，有机相相对于流动相整体的比例为25～70容量％。

[8]如[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，在阶段2中设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例在1分钟内增加0.9容量％以上。

[9]如[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，阶段2的测定时间为10～50分钟。

[10]如[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，阶段2结束时的流速为阶段1的流速的1.0～1.5倍。

[11]如[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，水相还包含磷酸盐。

[12]如[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，水相还包含甲醇。

[13]5-羧基-2’-脱氧-尿苷(类似物质2)，其用于含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂的品质管理。

[14]5-羧基-2’-脱氧-尿苷(类似物质2)，其用作检测含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂中的杂质时的标准品。

[15]2’-脱氧-5-甲氧基羰基尿苷(类似物质3)，其用于含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂的品质管理。

[16]2’-脱氧-5-甲氧基羰基尿苷(类似物质3)，其用作检测含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂中的杂质时的标准品。

[17]5-甲氧基羰基尿嘧啶(类似物质5)，其用于含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂的品质管理。

[18]5-甲氧基羰基尿嘧啶(类似物质5)，其用作检测含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂中的杂质时的标准品。

[19]5’-(4-氯苯基羧基)-2’-脱氧-5-三氟甲基尿苷(类似物质6)，其用于含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂的品质管理。

[20]5’-(4-氯苯基羧基)-2’-脱氧-5-三氟甲基尿苷(类似物质6)，其用作检测含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂中的杂质时的标准品。

发明效果

本发明可利用高效液相色谱法(其中使用包含有机相及水相的流动相)高效地检测出曲氟尿苷或其盐的类似物质，并且适于保证其品质。

附图说明

[图1]示出了实施例1-1的色谱图。

[图2]示出了实施例1-3的色谱图。

[图3]示出了实施例2-1的色谱图。

具体实施方式

本发明中的曲氟尿苷(FTD)是指α,α,α-三氟胸苷，即具有下述结构的化合物。

[化学式1]

本发明中的曲氟尿苷具有光学异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体等异构体时，只要没有明确记载，则任意异构体和混合物均包括在本发明化合物中。

本发明中，只要没有特别地明确记载例外的情况，则盐的含义为药学上允许的盐，可举出碱加成盐或酸加成盐。

作为该碱加成盐，可举出例如钠盐、钾盐等碱金属盐；例如钙盐、镁盐等碱土金属盐；例如铵盐；例如三甲胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、普鲁卡因盐、N,N’-二苄基乙二胺盐等有机胺盐等。

作为该酸加成盐，可举出例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、高氯酸盐等无机酸盐；例如乙酸盐、甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、三氟乙酸盐等有机酸盐；例如甲磺酸盐、羟乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等磺酸盐；等等。

作为本发明中使用的曲氟尿苷或其盐，优选为未形成盐的曲氟尿苷的游离体。

本发明的方法中，通过将曲氟尿苷或其盐和溶剂进行调整制成试样、并将该试样注入至高效液相色谱中，从而可对曲氟尿苷的类似物质进行检测。

本发明中的试样可能含有曲氟尿苷的类似物质。作为类似物质，可举出类似物质1～6的化合物。

[表1]

类似物质1为5-羧基尿嘧啶。有时也称为2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酸。

类似物质2为5-羧基-2’-脱氧-尿苷。有时也称为1-((2R,4R,5R)-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酸。

类似物质3为2’-脱氧-5-甲氧基羰基尿苷。有时也称为1-((2R,4R,5R)-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酸甲酯。

类似物质4为三氟胸腺嘧啶。有时也称为5-(三氟甲基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。

类似物质5为5-甲氧基羰基尿嘧啶。有时也称为2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酸甲酯。

类似物质6为5’-(4-氯苯基羧基)-2’-脱氧-5-三氟甲基尿苷。有时也称为4-氯苯甲酸((2R,3R,5R)-5-(2,4-二氧代-5-(三氟甲基)-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲酯。

作为本发明中使用的试样，不仅可使用由制剂或原料药(日语为“原薬”)本身而制备的试样，还可使用在用于确认稳定性等的试验中制备的试样、为了确认各类似物质的保留时间等而添加有各类似物质的试样、为了确认制剂或原料药的制造步骤而制备的试样等。试样可含有在Lonsurf(注册商标)中配合的替吡嘧啶或其盐，也可实质上不含替吡嘧啶或其盐，还可不含替吡嘧啶或其盐。

本发明可使用的制剂中含有曲氟尿苷或其盐。并且，可根据需要配合药学上允许的载体，基于预防目的或治疗目的而采用各种施予形态，作为该形态，例如口服剂、滴眼剂、注射剂、栓剂、软膏剂、贴剂等均可，优选采用口服剂。这些施予形态可分别利用本领域技术人员已知惯用的制剂方法来制造。

作为药学上允许的载体，可使用作为制剂原料而惯用的各种有机或无机载体物质，并作为固体制剂中的赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、液体制剂中的溶剂、助溶剂、混悬剂、等渗剂、缓冲剂、镇痛剂等进行配合。另外，也可根据需要而使用防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、稳定剂等制剂添加物。

制备口服用固体制剂的情况下，可向曲氟尿苷或其盐中添加赋形剂、并根据需要而添加粘结剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味·矫臭剂等，然后利用常规方法制造片剂、包衣片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等。

制备滴眼剂的情况下，可通过在曲氟尿苷或其盐中使用助溶剂、等渗剂、缓冲剂、防腐剂等来制造。

另外，具有上述施予形态的药剂的每日施予量可根据患者的症状、体重、年龄、性别等适当确定。

本发明所使用的高效液相色谱法中，可使用通常市售的产品。

关于色谱法中使用的色谱柱，将有机相作为流动相来分离具有脂溶性的化合物的正相色谱柱、和将水相作为流动相来分离化合物的反相色谱柱是已知的，高效液相色谱法中多使用反相色谱柱，本发明中也优选反相色谱法。

本发明中可使用的高效液相色谱法的色谱柱选自硅胶色谱柱、表面利用十八烷基甲硅烷基进行了修饰的硅胶色谱柱(ODS色谱柱或C18色谱柱)、表面利用辛基进行了修饰的硅胶色谱柱(C8色谱柱)、表面利用氰基丙基进行了修饰的硅胶色谱柱(CN色谱柱)、表面利用苯乙基进行了修饰的硅胶色谱柱(Ph色谱柱)、表面利用氨基丙基进行了修饰的硅胶色谱柱(NH色谱柱)、表面利用二羟基丙基进行了修饰的硅胶色谱柱(Diol色谱柱)、填充有各种聚合物的色谱柱(聚合物色谱柱)、填充有离子交换树脂的色谱柱(离子交换色谱柱)等，本发明中优选ODS色谱柱。

作为ODS色谱柱，可使用硅胶的粒径、细孔径、十八烷基甲硅烷基的键合方法、十八烷基甲硅烷基的取代度等不同的各种色谱柱。本发明中，使用高纯度硅胶、且用低分子的甲硅烷基化剂对十八烷基化后残留的硅烷醇进行处理而得到的ODS色谱柱(经封端的ODS色谱柱)是优选的。

作为ODS色谱柱，可使用硅胶的粒径、细孔径、十八烷基甲硅烷基的键合方法、十八烷基甲硅烷基的取代度等不同的各种色谱柱。本发明中，硅胶的平均粒径例如优选为2～10μm，更优选为3～5μm。硅胶的平均粒径可利用激光衍射法等进行测定。硅胶的平均细孔径例如优选为6～20nm，更优选为8～13nm。硅胶的平均细孔径可利用气体吸附法等进行测定。作为硅胶中的十八烷基甲硅烷基的键合方式，例如单体方式、聚合方式等是优选的。十八烷基甲硅烷基的取代度可利用各种方法进行测定。硅胶的碳量例如优选为3％以上，更优选为10％以上。硅胶的碳量例如优选为25％以下，更优选为20％以下。硅胶的碳量可利用各种方法进行测定。

作为高效液相色谱法的流动相中使用的有机相，可使用己烷、环己烷、庚烷、乙醚、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷等非极性溶剂；丙酮、二甲基亚砜、乙腈等非质子性极性溶剂；乙酸、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈等。这些溶剂可单独使用一种，或以混合溶剂的形式使用两种以上。作为本发明中的有机相，优选为甲醇或乙腈，更优选为乙腈。另外，有机相中可包含10％以下的水。

关于在高效液相色谱法的流动相中所使用的水相，不是只能仅包含水，还可包含10％以下的有机溶剂，优选为包含相对于水相整体而言为10％以下的甲醇的水相，更优选包含5％以下的甲醇，进一步优选包含2％以下的甲醇，特别优选包含0.1～1％的甲醇。

高效液相色谱法的流动相中，从确保重现性的观点考虑，可添加各种缓冲剂。可添加例如乙酸或其盐、柠檬酸或其盐、酒石酸或其盐、磷酸或其盐。作为乙酸或其盐，可举出乙酸、乙酸钠。作为柠檬酸或其盐，可举出柠檬酸、柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠。对于酒石酸或其盐而言，可举出酒石酸、酒石酸钠，作为磷酸或其盐，可举出磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。作为本发明中的水相的添加剂，从测定物质所具有的性质、在测定时得到的峰的形状及测定的重现性的方面考虑，优选为磷酸盐，更优选为磷酸二氢钠。这些添加剂可单独使用一种，或者组合使用两种以上。

对于本发明中可使用的缓冲剂的浓度而言，只要是在高效液相色谱法的测定中缓冲剂不析出的浓度即可，可进行适当调节。优选为1～50mM，更优选为5～40mM，进一步优选为10～30mM，特别优选为18～20mM。

高效液相色谱法的流动相中，可使用有机相与水相的混合液。本发明中，在类似物质1、2、3、4、5及曲氟尿苷的保留时间内，有机相相对于流动相整体的比例优选为1～14容量％，更优选为2～10容量％，特别优选为3～7容量％。

高效液相色谱法的流动相中，可使用有机相与水相的混合液，在测定中改变它们的比例的情况很多，这被称为设置梯度。通常，考虑到目标化合物的保留时间、以及目标化合物与类似物质的分离而设置梯度的情况很多。

本发明的特征在于，包括阶段1和阶段2的梯度条件。

阶段1：有机相相对于流动相整体的比例为1～14容量％。

阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例进一步增加。

阶段1中，可对流动相设置梯度，也可以是等度状态，优选为等度状态。另外，关于阶段1中的有机相相对于流动相整体的比例，可举出1～14容量％，更优选为2～10容量％，特别优选为3～7容量％。本发明中，所谓“阶段1中的有机相相对于流动相整体的比例为X～Y容量％”，是指在阶段1期间上述比例在X～Y容量％的范围内。

阶段1的开始为将试样注入至高效液相色谱后5分钟以内，优选为3分钟以内，更优选为1分钟以内，特别优选为与注入同时。

阶段1的结束为将试样注入至高效液相色谱之后经过13～30分钟后。为了不使曲氟尿苷与基线的凹陷及假峰(ghost peak)相重叠，阶段1的结束优选为该注入之后经过15～28分钟后，特别优选为经过17～25分钟后。

阶段1中的测定时间只要在上述的开始和结束的范围内则没有特别限制，优选为15～28分钟，更优选为17～25分钟。

阶段1中的流动相的流速的上限为高效液相色谱法中通常使用的流速即可，考虑到各类似物质的保留时间的分离，流速优选为2.5mL/分钟以下，更优选为2.0mL/分钟以下，进一步优选为1.5mL/分钟以下，更进一步优选为1.3mL/分钟以下，特别优选为1.1mL/分钟以下。另外，阶段1中的流动相的流速的范围没有特别限定，例如优选为0.5～2.5mL/分钟，更优选为0.5～2.0mL/分钟，进一步优选为0.7～1.5mL/分钟，更进一步优选为0.8～1.3mL/分钟，特别优选为0.9～1.1mL/分钟。

由此，阶段1中可对选自由类似物质1、2、3、4及5组成的组中的一种以上的曲氟尿苷的类似物质进行检测。优选的是，阶段1中可对类似物质1、2、3、4及5进行检测。

另外，从以更接近于等度状态的状态实施阶段1的观点考虑，在阶段1中类似物质1、2、3、4及5中的至少一种被检测出的情况下，在类似物质1、2、3、4及5中的在阶段1中检测出的各类似物质的保留时间内，有机相相对于流动相整体的比例中的最大值与最小值之差优选为流动相整体的5容量％以下，特别优选为1容量％以下。

阶段2中，对流动相设置梯度以使有机相的比例增加。阶段1中已设置梯度的情况下，在阶段2中以使有机相的比例进一步增加的方式设置梯度。阶段1中为等度状态的情况下，在阶段2中设置梯度以使有机相的比例增加。

阶段2结束时，有机相相对于流动相整体的比例为25～70容量％，更优选为30～65容量％，特别优选为35～60容量％。本发明中，所谓阶段2结束时，是指停止设置阶段2的梯度从而使有机相相对于流动相整体的比例开始下降的时间点。

阶段2的开始只要在阶段1结束后3分钟以内开始则没有特别限定，优选为1分钟以内，更优选为与阶段1的结束同时。

阶段2的结束只要在类似物质6的保留时间之后则没有特别限定，为将试样注入至高效液相色谱之后经过35～65分钟后，更优选为经过40～60分钟后。

对于阶段2中的测定时间而言，只要能够测定类似物质6的保留时间则没有特别限定，优选为10～50分钟，更优选为15～45分钟。

对于阶段2中的梯度而言，只要使有机相相对于流动相整体的比例增加则没有特别限定，优选使有机相相对于流动相整体的比例在1分钟内增加0.9容量％以上，更优选使所述比例在1分钟内增加1.0容量％以上，特别优选使所述比例在1分钟内增加2.0容量％以上。有机相相对于流动相整体的比例的增加上限没有特别限定，例如优选在1分钟内增加10容量％以下等，更优选在1分钟内增加5.0容量％以下等。本说明书中，每单位时间(例如1分钟内)使有机相相对于流动相整体的比例增加X容量％，是指每单位时间使有机相相对于流动相整体的比例相对于流动相整体100容量％而言增加X容量％。另外，本发明中，优选使阶段2的测定时间内的、有机相相对于流动相整体的比例的变化(测定时间内的有机相相对于流动相整体的比例中的最大值与最小值之差)为流动相整体的30容量％以上，特别优选为50容量％以上。阶段2的测定时间内的、有机相相对于流动相整体的比例的变化的上限没有特别限定，例如优选为流动相整体的80容量％以下，特别优选为70容量％以下。

阶段2中的流动相的流速只要是高效液相色谱法中通常使用的流速即可，考虑到各类似物质的保留时间的分离，流速优选为2.5mL/分钟以下，更优选为2.0mL/分钟以下，进一步优选为1.5mL/分钟以下。另外，阶段2中的流动相的流速的范围没有特别限定，例如优选为0.5～2.5mL/分钟，更优选为0.5～2.0mL/分钟，进一步优选为1.0～1.5mL/分钟。从缩短整体测定时间的观点考虑，也可以在阶段2的开始后逐渐地提高流速，阶段2结束时的流速优选为阶段1结束时的流速的1.0～1.5倍。

由此，阶段2中可对类似物质6进行检测。

本发明中，除了上述添加剂以外，还可添加离子对试剂。关于离子对试剂，可使用：戊磺酸钠、己磺酸钠、庚磺酸钠、辛磺酸钠、十二烷基磺酸钠等烷基磺酸钠；十二烷基硫酸钠等烷基硫酸钠；四乙基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵、四丁基氯化铵、四丁基溴化铵等季铵盐；三己胺、三辛胺等叔胺。

本发明中的流动相(典型为水相)的pH可利用上述添加剂等适当调节，优选为2.0～5.0。

本发明的方法中可使用的检测波长可考虑各类似物质的性质而设为208～280nm，优选为208～240nm，更优选为208～212nm。

本发明的方法中可使用的色谱柱内流动相的温度可适当设定。考虑到外部环境的影响、重现性等，优选将该温度保持恒定，更优选为25～50℃，进一步优选为35～45℃，特别优选为40～44℃。需要说明的是，将该温度保持恒定时，不仅可控制色谱柱整体的温度，还可使用预加热混合机(preheat mixer)等。

本发明中的高效液相色谱法中，可适当变更注入量、色谱柱内温度等。

这些类似物质中，类似物质1～5可利用已知方法进行合成，或者可通过市售品而获得。另外，类似物质6可利用已知方法由曲氟尿苷、市售的化合物进行合成，或者可利用后述的方法进行合成。通过将由此得到的类似物质在高效液相色谱法中的保留时间、根据质谱法、光电二极管阵列(PDA)得到的结果与通过本发明检测到的类似物质的上述指标进行比较，可对类似物质进行确定。

此外，也可利用采用外标的方法、采用内标的方法中的任何方法对上述类似物质进行定量测定。

医药品、制剂中可能以杂质的形式含有上述类似物质的情况下，上述类似物质是根据国际人用药品注册技术协调会(日文：医药品規制調和国際会議)的指南(ICH-Q3)而被控制的物质。本发明的方法能够确认是否满足该指南的基准，因此非常有用。

另外，上述类似物质可通过本发明的方法从曲氟尿苷或其盐中检测出。进而，本发明中，可将类似物质1～6中的一种或两种以上作为标准品而用于品质管理，优选为类似物质1～6中的三种以上，更优选为类似物质1～6中的四种以上，特别优选为类似物质2、3、5及6。

用于这样的标准品的曲氟尿苷及源自其的类似物质是高纯度的物质。因此，基于该高效液相色谱法的条件而分离得到的各类似物质可用作标准品。因此，本发明也可以说是该类似物质的制造方法，所述方法的特征在于，从含有曲氟尿苷或盐的复方制剂中进行分离。该类似物质可举出上述类似物质1～6，优选为类似物质2、3、5、6。

本发明中，曲氟尿苷中包含类似物质2、3、5或6这并不是已知的，特别地，类似物质6是新物质。因此，本发明包括用于含有曲氟尿苷或其盐的医药组合物的品质管理的类似物质2、3、5或6，还包括用作检测含有曲氟尿苷或其盐的医药组合物的杂质时的标准品的类似物质2、3、5或6。并且，本发明还包括类似物质2、3、5或6的制造方法，所述方法的特征在于，从含有曲氟尿苷或其盐的医药组合物中进行分离。

本发明中的源自曲氟尿苷的类似物质的检测中，可使用基于高效液相色谱法的方法。

优选为对选自由类似物质1～6组成的组中的至少一种源自曲氟尿苷的类似物质进行检测的方法，所述方法包括以下的阶段1和阶段2的条件。

阶段1：有机相相对于流动相整体的比例为1～14容量％。

阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相的比例进一步增加。

更优选为包括以下阶段1和阶段2的条件的方法。

阶段1：对选自由类似物质1～5组成的组中的至少一种源自曲氟尿苷的类似物质进行检测，有机相相对于流动相整体的比例为1～14容量％，并且为等度状态。

阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相的比例进一步增加，对类似物质6进行检测。

更优选为包括以下的阶段1和阶段2的条件的方法。

阶段1：有机相相对于流动相整体的比例为2～10容量％，并且为等度状态，对类似物质1～5进行检测。

阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例进一步增加，对类似物质6进行检测。

更优选为包括以下的阶段1和阶段2的条件的方法，其中，流动相中的有机相包含乙腈。

阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例进一步增加，阶段2结束时的有机相相对于流动相整体的比例为25～70容量％，对类似物质6进行检测。

更优选为包括以下的阶段1和阶段2的条件的方法，其中，流动相中的有机相包含乙腈，水相包含水，流动相包含磷酸盐。

阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例在1分钟内增加0.9容量％以上，阶段2结束时的有机相相对于流动相整体的比例为30～65容量％，对类似物质6进行检测。

阶段1：有机相相对于流动相整体的比例为3～7容量％，并且为等度状态，对类似物质1～5进行检测。

阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例在1分钟内增加0.9容量％以上，阶段2结束时的有机相相对于流动相整体的比例为35～60容量％，对类似物质6进行检测。

更优选为包括以下的阶段1和阶段2的条件的方法，其中，流动相中的有机相包含乙腈，水相包含水，流动相包含磷酸二氢钠。

阶段1：有机相相对于流动相整体的比例为3～7容量％，并且为等度状态，测定时间为15～28分钟，对类似物质1～5进行检测。

阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例在1分钟内增加0.9容量％以上，阶段2结束时的有机相相对于流动相整体的比例为35～60容量％，测定时间为10～50分钟，对类似物质6进行检测。

阶段2：阶段1之后，设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例在1分钟内增加0.9容量％以上，阶段2结束时的有机相相对于流动相整体的比例为35～60容量％，测定时间为10～50分钟，阶段2结束时的流速为阶段1的流速的1.0～1.5倍，对类似物质6进行检测。

更优选为包括以下的阶段1和阶段2的条件的方法，其中，流动相中的有机相包含乙腈，水相包含水，流动相包含甲醇及磷酸二氢钠。

实施例

基于以下的试验条件实施高效液相色谱法的测定。

·检测器：紫外分光光度计(波长为210nm)

·色谱柱：在内径为4.6mm、长度为15cm的不锈钢管中装入3μm或5μm的液相色谱用十八烷基甲硅烷基化硅胶色谱柱

·柱温：40℃

·流速：记载于各实施例

·流动相：记载于各实施例

·梯度：记载于各实施例

要使用高效液相色谱法进行测定的试样按照下述方式制备。

将曲氟尿苷以使得浓度成为约0.8mg/mL的方式溶解于组成与各测定条件下使用的流动相相同的溶液中，进行适当稀释，将所得溶液作为试样。

本实施例中，各流动相的“％”表示容量％。

实施例1-1

色谱柱：Hydrosphere C18，YMC公司制(3μm)

流速：1.0mL/分钟

流动相A：0.05mol/L的磷酸二氢钠水溶液

流动相B：乙腈

梯度：按照以下方式变更流动相A和流动相B，控制浓度梯度。0～18分钟：A 95％，B5％；18～55分钟：A 95→60％，B 5％→40％；55～55.1分钟：A 60％→95％，B 40％→5％；55.1分钟以后：A 95％，B 5％。

测定结果示于图1。由此，确认到曲氟尿苷的保留时间为17.2分钟。本测定方法中，确认到曲氟尿苷与基线的凹陷及假峰不重叠。

实施例1-2

梯度：按照以下方式变更流动相A和流动相B，控制浓度梯度。0～18分钟：A 95％，B5％；18～48分钟：A 95→60％，B 5％→40％；48～48.1分钟：A 60％→95％，B 40％→5％；48.1分钟以后：A 95％，B 5％。

色谱柱、流速、流动相A及流动相B为与实施例1相同的条件。

通过该测定，确认到曲氟尿苷与假峰不重叠。

实施例1-3

梯度：按照以下方式变更流动相A和流动相B，控制浓度梯度。0～20分钟：A 95％，B5％；20～50分钟：A 95→60％，B 5％→40％；50～50.1分钟：A 60％→95％，B 40％→5％；50.1分钟以后：A 95％，B 5％。色谱柱、流速、流动相A及流动相B为与实施例1相同的条件。

测定结果示于图2。由此，确认到曲氟尿苷的保留时间为17.1分钟。本测定方法中，确认到曲氟尿苷与基线的凹陷及假峰不重叠。

实施例1-3-1

梯度：按照以下方式变更流动相A和流动相B，控制浓度梯度。0～15分钟：A 95％，B5％；15～45分钟：A 95→60％，B 5％→40％；45～45.1分钟：A 60％→95％，B 40％→5％；45.1分钟以后：A 95％，B 5％。色谱柱、流速、流动相A及流动相B为与实施例1相同的条件。

色谱柱：Inertsil ODS-3 GL Sciences公司制(3μm)

流速、流动相A及流动相B为与实施例1-3相同的条件。

通过该测定，确认到曲氟尿苷与假峰不重叠。

实施例1-3-2

色谱柱：Inertsil ODS-4 GL Sciences公司制(3μm)

流速、流动相A及流动相B、梯度为与实施例1-3-1相同的条件。

通过该测定，确认到曲氟尿苷与假峰不重叠。

实施例1-3-3

色谱柱：YMC-Pack Pro C18 RS(3μm)

流速、流动相A及流动相B、梯度为与实施例1-3-1相同的条件。

通过该测定，确认到曲氟尿苷与假峰不重叠。

实施例1-3-4

色谱柱：YMC-Pack Pro C18(3μm)

流速、流动相A及流动相B、梯度为与实施例1-3-1相同的条件。

通过该测定，确认到曲氟尿苷与假峰不重叠。

实施例2-1

色谱柱：Hydrosphere C18，YMC公司制(5μm)

流速：0～21分钟：1.0mL/分钟，21～46分钟：1.0→1.3mL/分钟，46～46.1分钟：1.3→1.0mL/分钟，46.1分钟以后：1.0mL/分钟

流动相A：将3.0g磷酸二氢钠二水合物溶解于1000mL水中，加入磷酸将pH调节至2.2后，加入10mL甲醇。

流动相B：乙腈

梯度：按照以下方式变更流动相A和流动相B，控制浓度梯度。0～21分钟：A 96％，B4％；21～46分钟：A 96→45％，B 4→55％；46～46.1分钟：A 45→96％，B 55→4％；46.1分钟以后：A 96％，B 4％。

测定结果示于图3。由此可知，曲氟尿苷的保留时间为17.4分钟。另外，类似物质1的保留时间为3.1分钟，类似物质2的保留时间为5.6分钟，类似物质3的保留时间为4.1分钟，类似物质4的保留时间为7.9分钟，类似物质5的保留时间为8.8分钟，类似物质6的保留时间为42.9分钟。

关于检测出的各类似物质，与另行购入或合成的各类似物质的保留时间一致，由此确认到是显示类似物质1～6的结构的化合物。

作为结论，该测定方法中，确认到曲氟尿苷与基线的凹陷及假峰不重叠。并且，可知曲氟尿苷的各类似物质及曲氟尿苷能够实现分离。此外，类似物质6的峰与后述的合成的类似物质6的保留时间是一致的，因此，判断该测定中的保留时间为42.9分钟的峰为类似物质6。

实施例2-2

色谱柱：Unison UK-C18，Intakt Corporation制(5μm)

其他的条件与实施例2-1相同。

基于该测定得出的结论与实施例2-1相同。

实施例2-3

流动相A：将3.0g磷酸二氢钠二水合物溶解于1000mL水中，加入磷酸将pH调节至2.2后，加入9mL甲醇。

其他的条件与实施例2-1相同。

基于该测定得出的结论与实施例2-1相同。

实施例2-4

流速：0～21分钟：0.95mL/分钟，21～46分钟：0.95→1.25mL/分钟，46～46.1分钟：1.25→0.95mL/分钟，46.1分钟以后：0.95mL/分钟

其他的条件与实施例2-1相同。

基于该测定得出的结论与实施例2-1相同。

实施例2-5

梯度：按照以下方式变更流动相A和流动相B，控制浓度梯度。0～21分钟：A95.8％，B 4.2％；21～46分钟：A95.8→43％，B4.2→57％；46～46.1分钟：A 43→95.8％，B57→4.2％；46.1分钟以后：A 95.8％，B 4.2％。

其他的条件与实施例2-1相同。

基于该测定得出的结论与实施例2-1相同。

实施例3

色谱柱：Inertsil ODS-2，GL Sciences公司制(5μm)

流速：1.0mL/分钟

流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液

流动相B：乙腈

梯度：按照以下方式变更流动相A和流动相B，控制浓度梯度。0～2分钟：A 85％，B15％；2～7分钟：A 85→60％，B 15→40％；7分钟以后：A 60％，B 40％。

由测定结果可知，曲氟尿苷的保留时间为3.6分钟。另外，类似物质1～5的保留时间集中于1.0～2.5分钟，无法算出它们的峰面积。

作为结论，可知在该测定方法中，虽然曲氟尿苷的类似物质1～5的检出不一定准确，但实现了类似物质6的检出。

实施例2

色谱柱：Inertsil ODS-2，GL Sciences公司制(5μm)

流速：1.0mL/分钟

流动相A：水

流动相B：乙腈

梯度：A 60％、B 40％的等度状态。

由测定结果可知，曲氟尿苷的保留时间为1.8分钟，类似物质6的保留时间为7.6分钟。类似物质1～5的保留时间集中于1.0～2.5分钟，无法算出它们的峰面积，但如上述那样实现了类似物质6的检出。

参考例5’-(4-氯苯基羧基)-2’-脱氧-5-三氟甲基尿苷(类似物质6)的合成

[化学式2]

使市售的曲氟尿苷(2.00g)溶解于吡啶(8mL)中，在冰浴下缓缓添加对氯苯甲酰氯(1.18g)，于室温搅拌1小时。然后，蒸馏除去溶剂，利用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝100/0～91/9)对残渣进行纯化，得到5’-(4-氯苯基羧基)-2’-脱氧-5-三氟甲基尿苷(1.49g，类似物质6)及3’-(4-氯苯基羧基)-2’-脱氧-5-三氟甲基尿苷(238mg，参考化合物1)。

类似物质6：1H-NMR(DMSO-d6,270MHz)δ(ppm)11.91(1H,s),8.03(1H,s),7.95(2H,d,J＝6.75Hz),7.60(2H,d,J＝6.75Hz),6.07(1H,t,J＝6.55Hz),5.48(1H,d,J＝4.29Hz),4.56-4.38(3H,m),4.18-4.16(1H,m)

参考化合物1：1H-NMR(DMSO-d6,270MHz)δ(ppm)11.92(1H,s),8.72(1H,s),8.03(2H,d,J＝8.07Hz),7.63(2H,d,J＝8.07Hz),6.27(1H,t,J＝6.75Hz),5.48-5.42(2H,m),4.28(1H,s),3.72(2H,s)

Claims

1.用于检测源自曲氟尿苷的类似物质的方法，所述方法包括将含有曲氟尿苷或其盐的试样供于高效液相色谱法的步骤，所述高效液相色谱法中使用包含有机相及水相的流动相，其中，所述供于高效液相色谱法的步骤包括满足以下要件的阶段1及阶段2：

阶段1：有机相相对于流动相整体的比例为1～14容量％；

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述类似物质为选自由下述类似物质1～6组成的组中的至少一种：

类似物质1：5-羧基尿嘧啶；

类似物质2：5-羧基-2’-脱氧-尿苷；

类似物质3：2’-脱氧-5-甲氧基羰基尿苷；

类似物质4：三氟胸腺嘧啶；

类似物质5：5-甲氧基羰基尿嘧啶；

类似物质6：5’-(4-氯苯基羧基)-2’-脱氧-5-三氟甲基尿苷。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，通过阶段1检测类似物质1～5，通过阶段2检测类似物质6。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，阶段1以等度状态实施。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，有机相为乙腈。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，阶段1中，有机相相对于流动相整体的比例为2～10容量％。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，阶段2结束时，有机相相对于流动相整体的比例为25～70容量％。

8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，在阶段2中设置梯度以使有机相相对于流动相整体的比例在1分钟内增加0.9容量％以上。

9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，阶段2的测定时间为10～50分钟。

10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，阶段2结束时的流速为阶段1的流速的1.0～1.5倍。

11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，水相还包含磷酸盐。

12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，水相还包含甲醇。

13.5-羧基-2’-脱氧-尿苷(类似物质2)，其用于含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂的品质管理。

14.5-羧基-2’-脱氧-尿苷(类似物质2)，其用作检测含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂中的杂质时的标准品。

15.2’-脱氧-5-甲氧基羰基尿苷(类似物质3)，其用于含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂的品质管理。

16.2’-脱氧-5-甲氧基羰基尿苷(类似物质3)，其用作检测含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂中的杂质时的标准品。

17.5-甲氧基羰基尿嘧啶(类似物质5)，其用于含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂的品质管理。

18.5-甲氧基羰基尿嘧啶(类似物质5)，其用作检测含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂中的杂质时的标准品。

19.5’-(4-氯苯基羧基)-2’-脱氧-5-三氟甲基尿苷(类似物质6)，其用于含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂的品质管理。

20.5’-(4-氯苯基羧基)-2’-脱氧-5-三氟甲基尿苷(类似物质6)，其用作检测含有曲氟尿苷或其盐的复方制剂中的杂质时的标准品。