CN112362791A - 一种曲氟尿苷与其异构体的hplc分离方法 - Google Patents

一种曲氟尿苷与其异构体的hplc分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法，包括：A)将曲氟尿苷及其异构体在衍生化试剂、溶剂和缚酸剂的存在下分别进行衍生化，得到曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品；B)采用高效液相色谱对曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品进行检测；色谱参数为：色谱柱为C18柱；柱温为35℃～45℃；检测波长为238nm～242nm，流动相流速为0.8mL/min～1.2mL/min，所述流动相为梯度洗脱；流动相A为7.2g/L～8.4g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈。本发明通过对曲氟尿苷及其异构体进行类苯酰基衍生化，采用反相色谱柱，实现了曲氟尿苷及其异构体的分离。

Description

一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法。
背景技术
三氟胸苷作为一种癌症治疗药物，目前主要用于结直肠癌的治疗。经对其结构进行逆合成分析，该化合物为由2-脱氧-D-核糖、尿嘧啶、三氟甲基三个重要结构单元组成。因此，2-脱氧-D-核糖与尿嘧啶的缩合是制备曲氟尿苷的主要策略。曲氟尿苷是含有3个手性中心的多手性化合物，具体如式(I)结构。因此，在原料药质量控制中，立体异构体的控制就尤其关键。
Figure BDA0002828985360000011
详细的文献调研，确认了上述分析。目前报道的曲氟尿苷的合成路线主要是该路线以5-三氟甲基尿嘧啶和2-脱氧-D-核糖为起始原料，分别经硅基化保护和甲基化、对氯苯甲酰基化、氯代后经缩合、脱保护共经历六步反应制得曲氟尿苷，具体如式(II)所示。
Figure BDA0002828985360000012
结合曲氟尿苷结构和其主要的合成路线进行综合分析可知，其3,4位的手性结构可能来自呋喃糖结构，其杂质产生的概率较小。其主要的异构体杂质应为在合成工艺中形成的曲氟尿苷呋喃糖环1位的手性异构体。
因此，曲氟尿苷原料药质量控制应着重关注该异构体的含量。因此，开发一种检测该异构体的方法是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法，本发明方法分离度高，检测结果准确。
本发明提供了一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法，包括：
A)将曲氟尿苷及其异构体在衍生化试剂、溶剂和缚酸剂的存在下分别进行衍生化，得到曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品；
B)采用高效液相色谱对曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品进行检测；
色谱参数为：
色谱柱为C18柱；柱温为35℃～45℃；检测波长为238nm～242nm，流动相流速为0.8mL/min～1.2mL/min，所述流动相为梯度洗脱；
流动相A为7.2g/L～8.4g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈。
优选的，所述曲氟尿苷异构体是指曲氟尿苷呋喃糖环1位的手性异构体。
优选的，所述衍生化试剂为苯甲酰氯、苯甲酸酐、对甲基苯甲酰氯、对甲基苯甲酸酐、对氯苯甲酰氯、对氯苯甲酸酐、对硝基苯甲酰氯或对硝基苯甲酸酐中的一种或几种。
优选的，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃中的一种或几种；所述缚酸剂为三乙胺或吡啶。
优选的，所述衍生化的温度为30℃～50℃，衍生化的时间为2～50min。
优选的，步骤A)所述衍生化后还包括加入1mol/L稀盐酸猝灭，经萃取后，浓缩，即得。
优选的，所述色谱柱为Waters Symmetry C18，5μm，4.6×150mm或Inertsil ODS-3，4.6×150mm 5μm；所述色谱柱温度为40℃；所述检测波长为240nm。
优选的，所述流动相A为7.8g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈；流动相流速为1.0mL/min；进样量为10μL。
优选的，所述梯度洗脱具体为：
0～10min流动相A为40％，流动相B为60％；
10～20min流动相A为40％～20％，流动相B为60～80％；
20～21min流动相A为20％～40％，流动相B为80％～60％；
21～30min流动相A为40％，流动相B为60％。
优选的，曲氟尿苷衍生化样品与异构体衍生化样品分离度为2以上。
与现有技术相比，本发明提供了一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法，包括：A)将曲氟尿苷及其异构体在衍生化试剂、溶剂和缚酸剂的存在下分别进行衍生化，得到曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品；B)采用高效液相色谱对曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品进行检测；色谱参数为：色谱柱为C18柱；柱温为35℃～45℃；检测波长为238nm～242nm，流动相流速为0.8mL/min～1.2mL/min，所述流动相为梯度洗脱；流动相A为7.2g/L～8.4g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈。本发明通过对曲氟尿苷及其异构体进行类苯酰基衍生化，在增加曲氟尿苷及其异构体紫外吸收的基础上，采用反相色谱柱，实现了曲氟尿苷及其异构体的分离。本发明具有操作简单、衍生化完全(回收率高)、曲氟尿苷与其异构体分离度大，专属性好，中间精密度高的特点。
附图说明
图1为本发明实施例2测定曲氟尿苷衍生化样品、曲氟尿苷异构体衍生化样品色谱图；
图2为曲氟尿苷异构体衍生化标品色谱图；
图3为混合标品的色谱图；
图4为本发明实施例4合成样品的色谱图；
图5为本发明对比例1测定结果色谱图；
图6为本发明对比例2测定结果色谱图；
图7为本发明对比例3测定结果色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法，包括：
A)将曲氟尿苷及其异构体在衍生化试剂、溶剂和缚酸剂的存在下分别进行衍生化，得到曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品；
B)采用高效液相色谱对曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品进行检测；
色谱参数为：
色谱柱为C18柱；柱温为35℃～45℃；检测波长为238nm～242nm，流动相流速为0.8mL/min～1.2mL/min，所述流动相为梯度洗脱；
流动相A为7.2g/L～8.4g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈。
本发明提供的曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法旨在分离曲氟尿苷与其异构体。所述曲氟尿苷异构体是指曲氟尿苷呋喃糖环1位的手性异构体。从而对曲氟尿苷原料药质量控制具有积极的意义。
本发明首先将曲氟尿苷及其异构体在衍生化试剂、溶剂和缚酸剂的存在下分别进行衍生化，得到曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品。
本发明所述衍生化试剂优选为苯甲酰氯、苯甲酸酐、对甲基苯甲酰氯、对甲基苯甲酸酐、对氯苯甲酰氯、对氯苯甲酸酐、对硝基苯甲酰氯或对硝基苯甲酸酐中的一种或几种；更优选为苯甲酰氯、苯甲酸酐、对甲基苯甲酰氯、对甲基苯甲酸酐或对氯苯甲酰氯中的一种或几种。
所述溶剂优选为二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃中的一种或几种；所述缚酸剂为三乙胺或吡啶。本发明对于所述衍生化试剂、溶剂和缚酸剂的来源不进行限定，市售即可。
本发明所述衍生化的温度优选为30℃～50℃，更优选为35℃～45℃，衍生化的时间优选为2～50min；更优选为10～40min。
本发明所述反应后还包括加入1mol/L稀盐酸猝灭，经萃取后，浓缩，即得。优选衍生化后还包括加入1mol/L稀盐酸，搅拌，分液，经萃取后，弃去水相，有机相以5mL×2水洗涤后，减压浓缩，即得曲氟尿苷样品及其异构体对照品衍生化样品。
采用高效液相色谱对曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品进行检测。
色谱参数为：
色谱柱为C18柱；所述色谱柱优选为Waters Symmetry C18，5μm，4.6×150mm或Inertsil ODS-3，4.6×150mm 5μm。
色谱仪包括但不限于Agilent 1260高效液相色谱仪。
柱温优选为35℃～45℃；更优选为37℃～43℃；最优选为40℃。
检测波长优选为238nm～242nm；更优选为239nm～241nm；最优选为240nm。
流动相流速优选为0.8mL/min～1.2mL/min；更优选为0.9mL/min～1.1mL/min；最优选为1.0mL/min。
本发明所述流动相为梯度洗脱；
按下面方法配置流动相A和B：
流动相A为7.2g/L～8.4g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈。
在本发明其中一部分优选实施方式中，流动相A为7.5g/L～8.2g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈。
在本发明其中一部分优选实施方式中，流动相A为7.8g/L～8.0g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈。
在本发明其中一部分优选实施方式中，流动相A为7.8g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈。
本发明进样量优选为10μL～20μL；更优选为10μL。
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述梯度洗脱具体为：
0～10min流动相A为40％，流动相B为60％；
10～20min流动相A为40％～20％，流动相B为60～80％；
20～21min流动相A为20％～40％，流动相B为80％～60％；
21～30min流动相A为40％，流动相B为60％。
本发明所述曲氟尿苷衍生化样品的进样浓度为1mg/mL；曲氟尿苷异构体样品进样浓度为1mg/mL。
本发明曲氟尿苷衍生化样品和氟尿苷异构体样品均采用面积归一化法测定含量。
本发明的方法能够很好的分离曲氟尿苷衍生化样品和氟尿苷异构体样品，上述色谱条件下，色谱峰型良好，基线平稳，分离度高，本发明曲氟尿苷衍生化样品与异构体衍生化样品分离度为1.5以上。
本发明提供了一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法，包括：A)将曲氟尿苷及其异构体在衍生化试剂、溶剂和缚酸剂的存在下分别进行衍生化，得到曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品；B)采用高效液相色谱对曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品进行检测；色谱参数为：色谱柱为C18柱；柱温为35℃～45℃；检测波长为238nm～242nm，流动相流速为0.8mL/min～1.2mL/min，所述流动相为梯度洗脱；流动相A为7.2g/L～8.4g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈。本发明通过对曲氟尿苷及其异构体进行类苯酰基衍生化，在增加曲氟尿苷及其异构体紫外吸收的基础上，采用反相色谱柱，实现了曲氟尿苷及其异构体的分离。本发明具有操作简单、衍生化完全(回收率高)、曲氟尿苷与其异构体分离度大，专属性好，中间精密度高的特点。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法进行详细描述。
实施例1：曲氟尿苷及其异构体的衍生化
分别取曲氟尿苷样品及其异构体对照品各2.0g，分别置于反应瓶中。向反应瓶中，依次加入二氯甲烷20ml和苯甲酰氯2.3g。室温下向体系中滴加三乙胺2ml。滴加完毕，维持体系45℃，搅拌30min。加入1mol/L稀盐酸，搅拌5min。分液，弃去水相，有机相以5ml×2水洗涤后，减压浓缩，即得曲氟尿苷样品及其异构体对照品衍生化样品。
实施例2：衍生化曲氟尿苷的检验
取曲氟尿苷衍生化样品、曲氟尿苷异构体衍生化样品各适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含曲氟尿苷衍生化样品1.0mg、曲氟尿苷异构体0.05mg溶液，作为系统溶液。取曲氟尿苷衍生化样品适量，精密称定，加乙腈稀释制成每1ml约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液。用Waters Symmetry C18(5μm，4.6×150mm)的色谱柱，以7.8g无水磷酸二氢钠，加水溶解成1000ml的溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱。流速为1.0ml/min，检测波长为240nm，柱温40℃。精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。采用面积归一化法测定曲氟尿苷中异构体的含量。检测结果见表2和图1，图1为本发明实施例2测定曲氟尿苷衍生化样品、曲氟尿苷异构体衍生化样品色谱图。
表1
Figure BDA0002828985360000071
表2
Figure BDA0002828985360000072
由图1和表2可以看出，本发明基线稳定，峰型良好，稳定性良好，分离度好。
实施例3：方法学专属性评价
分别将异构体衍生化标品及其混合标品采用实施例2所述的色谱方法进行检验，色谱图分别见图2～3，图2为曲氟尿苷异构体衍生化标品色谱图；图3为混合标品的色谱图；其中表3为曲氟尿苷异构体衍生化标品的色谱数据结果，表4为混合标品的色谱数据结果。
表3
Figure BDA0002828985360000081
表4
Figure BDA0002828985360000082
由图2～3可见，曲氟尿苷衍生化样品与异构体衍生化样品在该色谱条件下，分离度良好(分离度远远大于1.5)。其他杂质对上述样品无干扰。该实验结果说明，该方法专属性良好。
实施例4 样品测定
按专利(申请号：CN201510817481.X)描述方法，合成曲氟尿苷样品，将合成的样品采用本发明实施例2的方法进行测定，结果如图4所示，图4为本发明实施例4合成样品的色谱图，表5为本发明实施例4合成样品的色谱数据结果。
表5
Figure BDA0002828985360000091
由图4可见，曲氟尿苷衍生化样品与异构体衍生化样品在该色谱条件下，分离度良好(分离度远远大于1.5)。其他杂质对上述样品无干扰。
实施例5
按表6参数要求，改变色谱条件，其余条件同实施例2。取曲氟尿苷衍生化样品适量，精密称定，加乙腈稀释制成每1ml约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液。采用面积归一化法测定曲氟尿苷中异构体的含量。检测结果见表7。
表6 参数考察条件
Figure BDA0002828985360000092
表7 试验测定结果
Figure BDA0002828985360000093
Figure BDA0002828985360000101
注：①试验条件为：色谱柱：Waters Symmetry C18(5μm，4.6×150mm)的色谱柱，柱温40℃，波长240nm，流速1.0ml/min。
②此列分离度数据来源于耐用性试验各条件下的系统溶液。
结论：由上述数据可知，改变流速(±0.2ml/min)、改变柱温(±5℃)、改变波长(±2nm)及更换色谱柱、更换仪器的试验条件下，曲氟尿苷衍生化样品及曲氟尿苷衍生化异构体的含量、理论板数、拖尾因子及总杂变化不大，且曲氟尿苷衍生化样品与曲氟尿苷衍生化异构体的分离度均符合规定。
对比例1
取曲氟尿苷衍生化样品、曲氟尿苷异构体衍生化样品各适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含曲氟尿苷衍生化样品1.0mg、曲氟尿苷异构体0.05mg溶液，作为系统溶液。用Waters Symmetry C18(5μm，4.6×150mm)的色谱柱，以7.7g乙酸铵，加水溶解成1000ml的溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，流动相A:流动相B(60：40)。流速为1.0ml/min，检测波长为240nm，柱温40℃。精密量取系统溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如图5所示，图5为本发明对比例1测定结果色谱图。从图5可以看出，可知，主峰在15.096min出峰，异构体在14.489min出峰，主峰与异构体的分离度为1.3，小于1.5，分离度不佳。
对比例2
取曲氟尿苷衍生化样品、曲氟尿苷异构体衍生化样品各适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含曲氟尿苷衍生化样品1.0mg、曲氟尿苷异构体0.05mg溶液，作为系统溶液。用Waters Symmetry C18(5μm，4.6×150mm)的色谱柱，以7.8g无水磷酸二氢钠，加水溶解成1000ml的溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，流动相A:流动相B(30：70)。流速为1.0ml/min，检测波长为240nm，柱温40℃。精密量取系统溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。如图6，图6为本发明对比例2测定结果色谱图。从图6上可知，主峰在7.6min出峰，未找到异构体的峰。
对比例3
取曲氟尿苷衍生化样品、曲氟尿苷异构体衍生化样品各适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含曲氟尿苷衍生化样品1.0mg、曲氟尿苷异构体0.05mg溶液，作为系统溶液。用Waters Symmetry C18(5μm，4.6×150mm)的色谱柱，以7.8g无水磷酸二氢钠，加水溶解成1000ml的溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，流动相A:流动相B(40：60)。流速为1.0ml/min，检测波长为240nm，柱温40℃。精密量取系统溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图7，图7为本发明对比例3测定结果色谱图。从图7上可知，主峰在11.4min出峰，异构体约在9.9min出峰。曲氟尿苷与曲氟尿苷异构体分离度虽然大于1.5，符合要求，但有未知峰未检出，影响结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种曲氟尿苷与其异构体的HPLC分离方法，其特征在于，包括：
A)将曲氟尿苷及其异构体在衍生化试剂、溶剂和缚酸剂的存在下分别进行衍生化，得到曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品；
B)采用高效液相色谱对曲氟尿苷衍生化样品和曲氟尿苷异构体样品进行检测；
色谱参数为：
色谱柱为C18柱；柱温为35℃～45℃；检测波长为238nm～242nm，流动相流速为0.8mL/min～1.2mL/min，所述流动相为梯度洗脱；
流动相A为7.2g/L～8.4g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述曲氟尿苷异构体是指曲氟尿苷呋喃糖环1位的手性异构体。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述衍生化试剂为苯甲酰氯、苯甲酸酐、对甲基苯甲酰氯、对甲基苯甲酸酐、对氯苯甲酰氯、对氯苯甲酸酐、对硝基苯甲酰氯或对硝基苯甲酸酐中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃中的一种或几种；所述缚酸剂为三乙胺或吡啶。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述衍生化的温度为30℃～50℃，衍生化的时间为2～50min。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤A)所述衍生化后还包括加入1mol/L稀盐酸猝灭，经萃取后，浓缩，即得。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters Symmetry C18，5μm，4.6×150mm或Inertsil ODS-3，4.6×150mm 5μm；所述色谱柱温度为40℃；所述检测波长为240nm。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述流动相A为7.8g/L的磷酸二氢钠溶液；流动相B为乙腈；流动相流速为1.0mL/min；进样量为10μL。
9.根据权利要求8所述的分离方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
0～10min流动相A为40％，流动相B为60％；
10～20min流动相A为40％～20％，流动相B为60～80％；
20～21min流动相A为20％～40％，流动相B为80％～60％；
21～30min流动相A为40％，流动相B为60％。
10.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，曲氟尿苷衍生化样品与异构体衍生化样品分离度为2以上。
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