TW591108B - Mutated hydroxyphenylpyuvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides - Google Patents

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591108 _案號 87118646__^__j__a 五、發明說明（1) 修正

本發明係關於編碼突變的羥苯基丙酮酸鹽二加氧酶 (Η P P D )之核酸序列，包含此序列作為編碼序列之嵌合基 因，及其在分離對某些除草劑具有抗性之植物上的用途。 羥笨基丙酮酸鹽二加氧酶是催化對-羥苯基丙酮酸鹽 (ΗΡΡ)轉殖為黑尿酸鹽之反應的酵素。該反應在鐵（Fe2+)的 存在下和氧的存在下發生（克洛奇（Crouch) N.P.等人， Tetrahedron，53，20，6993-7010， 1997)。可假設該 Η P P D s含有能夠催化該反應的活性部位，其中鐵、受酶質 和水分子被連結在一起，但這種活性位置然到目前為止尚 未有人說明。 亦已知有些分子抑制該酵素，且其與該酵素競爭性地結 合，以便抑制ΗΡΡ轉殖為黑尿酸鹽。有些這種分子已經作 為除草劑使用，因為在植物中抑制該反應，導致被處理之 植物的葉片變白，並使該植物死亡（帕黑特（pa丨丨e 11) Κ·Ε·等人，1997 Pestic· Sci. Μ 83-84)。以HPPD 為目 標，並曾在相關技藝中述及的除草劑特定言之為異噚唑類 (歐、洲專利4 1 8 1 7 5號、歐洲專利47 0 8 5 6號、歐洲專利48 7 3 5 2號、歐洲專利5 2 7 0 3 6號、歐洲專利5 6 0 48 2號、歐洲 專利6 8 2 6 5 9號、美國專利第5 4 24 2 7 6號），特定言之是 異沙服托（i s ox a f 1 u t ο 1 e )，其為玉蜀黍的選擇性除草劑， 二酮腈（歐洲專利4 9 6 6 3 0號、歐洲專利4 9 6 6 3 1號），特定 言之2 -氰基-3 -環丙基-l-(2-S02CH3-4-CF3苯基）丙烷-1，3-二酮和2-氰基-3_環丙基-1-(2-3 02(：113_4-2,3(：12苯基）丙院 -1，3 -二酮，三酮類（歐洲專利6 2 5 5 0 5號、歐洲專利6 2 5 5 0 8號、美國專利第5，5 0 6 , 1 9 5號），特定言之蘇康三_

O:\55\556ll.ptc 591108 _案號 87118646 _年月日_修正 五、發明說明（2) (sulcotrione)，或另夕卜的D比唑啉酸鹽 (pyrazol inates) 〇 使植物能耐受除草劑之主要策略有三種，亦即（1 )利用 可轉殖除草劑或其活性代謝物形成無毒性降解產物的酵素 去除該除草劑之毒性如，例如对受漠氧尼爾（b r 〇 m ο X y n i 1 ) 或巴斯塔（b a s t a)的酵素（歐洲專利2 4 2 2 3 6號、歐洲專利 3 3 7 8 9 9號）；（2 )使目標酵素突變成對該除草劑或其活性 代謝物較不敏感之功能性酵素，如，例如耐受草甘膦賽 (glyphosate)的酵素（歐洲專利2 9 3 3 5 6號，帕吉特 (Padgette) S.R.等人，J. Biol. Chem·, 266， 33， 1 9 9 1 );或（3 )過度表現敏感的酵素，使得目標酵素在該植 物中產生的量充份相當於除草劑的量，由於該酵素的動力 學常數’使得儘管有抑制劑的存在，仍有足夠的功能性 素可以利用。 畔 由於前述的第三個策略可成功地獲得耐受HPPD抑制劑 植物（W 0 9 6 / 3 8 5 6 7 )，因此明瞭到這是第一次成功地使”之 這個簡單地過度表現該（非—突變）敏感之目標酵素的策略 為植物賦與農業水準的除草劑耐受性。 略 儘管已成功利用簡單地過度表現目標酵素之策略，但 需要改善該系統對HPPD抑制劑之耐受性，以便在無論了仍

條件下培養耐受性植物，或是在田野中使用任何商業:， 之除草劑時，均可獲得耐受性。 /、剧量 也 突 因此’本發明首先係關於突變的H p p d，其雖有功炉 就疋所謂保留其催化HPΡ轉殖為黑尿酸鹽之特性，但 變之前的天然HPPD對HPPD抑制劑較不敏感。 —比

O:\55\556li.ptc 591108 修正 年 月 曰 案號 87118646 五、發明說明（3) 一 k抑制作用的競爭特性來看，可假設該H p p D抑制劑與該 酵素之活性部位結合，或在鄰近該活性部位之處結合，以 便阻斷接近該活性部位，並在鐵和水的存在下防止其 轉殖。藉著突變來進行限制抑制劑接近該酵素之活性部 位’同時保護Η PP安全接近該活性部位的突變，則有可能 獲得對HPPD抑^劑較不敏感之功能性突變酵素。 然後發現’藉由酵素C —末端部份發生突變，可能獲得對 HPPD抑制劑較不敏感之功能性HppDs，以使這些功能性 HPPDs在植物中的表現可改善該植物對HppD抑制劑的耐受 性。 因此’本發明係關於新穎的功能性突變HppD，其對HPPD 抑制劑較不敏感，並在其〇末端部份含有至少一處突變。 根據本發明’ π突變π咸了解係指以另一個胺基酸置換原 來序列中的胺基酸。在下文中將使用”突變的胺基酸，，的說 法來表示被另一個胺基酸置換的胺基酸，藉此指出在蛋白 質原來序列中的突變位置。 已經在相關技藝中曾說明數種HPPDs及其原來序列，特 定言之是細菌的HPPDs，如：假單胞菌（Pseudomonas)(魯 奇（Ruetschi)等人，Eur. J· Biochem. 205， 459-466, 1 9 9 2， WO 9 6 / 3 8 5 6 7 )，植物的 HPPDs，如：芥菜 (Arabidopsis)(W0 96/38567， Genebank AF047834)，或 胡蘿 «(WO 96/38567， Genebank 87257)，球蟲的 (HPPD)(Coccidoides)(Genebank COITRP)，或哺乳動物的 Η P P D，如：小白氛或豬。 經由採用相關技藝常用之方法，排列這些已知的序列，

O:\55\55611.ptc 第7頁 591108 案號 87118646 年 月 曰 修正 五、發明說明（4) 如，例如湯普遜（T h 〇 m p s ο η )， J · D.等人說明的方法（克魯 斯塔（C L U S T A L )， W :經由將序列加重、位置-特異性的間 隙罰則和重量母質的選擇，來改善漸進性多重序列的敏感 性（improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, posi t ions-speci f ic gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22; 4 6 7 3 - 4 6 8 0， 1 9 9 4 )，並透過網際網路，利用電腦程式排列 序列，例如：習此技藝者可參照序列與參考序列序之同質 性，並找出關鍵胺基酸或其他限定之共同區域，使其有可 能根據此參考序列，特別地定出〇末端區和N-末端區。 在本發明的案例中，參考序列為假單胞菌的序列，所有 有關特定胺基酸位置的定義和指示均依據原來的假單胞菌 HPPD序列。附圖1說明相關技藝曾說明之數種HPPD序列之 排列；這些序列與作為參考序列的假單胞菌HPPD序列共同 排列，並包括艾菲爾鏈黴菌（Streptomyces avermitilis )(Genebank SAV11864)、胡蘿蔔（Daucus carota)(Genebank DCU 87257)、擬南芬菜（Arabidopsis thaliana)(Genebank AF 04 7 83 4 )、玉蜀黍（Zea mais)、大 麥（Hordeum vulgare)(Genebank HVAJ693)、禾生球腔菌 (Mycosphaere1 la graminicola)(Genebank AF 0 38 1 5 2 )、 伊米提球蟲（Coccicoides immitis)(Genebank COITRP)和 老鼠（Mus musculus)(Genebank MU54HD)的HPPD 序列。該 圖提供假單胞菌序列之胺基酸的編號，及這些序列共同的 胺基酸，以星號標記這些胺基酸。以這種排列為基礎，很

O:\55\55611.ptc 第8頁 591108 ---案號87118646 _年月曰 鉻_ 五、發明說明（5) 谷易藉著其位置及其性質，從假單胞菌胺基酸之定義中判 別認出在另一個HppD序列中相對應的胺基酸位置（將不同 植物、哺乳動物和細菌來源的序列排列，證實熟諳此藝者 已熟知這種排列方法，可概括應用在任何其他序列）。不 同Η P P D序列之排列亦說明於專利申請案^ 〇 g " μ 8 1 6號 端的之差C显末/1部^係酵素之活性^立戶斤在，其與Ν—末 :=單胞菌Η p p D是四聚體、穩而植：Η 4 的所不Λ假單胞菌HPPD *體之三級結構的圖一表=月）所 連接肽使其可能劃；;;酵》獲得此結構。 皁胞菌為例，該肽係位在胺 ° 77 Ν-末端，以假 1)。 隹胺基酸145到157之間（參照圖 因此，C-末端部份之定義 一 r以假單胞菌；二即二 全部序列中，將注意到在位 卜列所出示之 末τ，162)…^:_以兩個因胺此基， HPPD之C-末端部份的Ν_末端 。，因此代表

AsP161上游大約5到15個胺基的於連之接門肽之疋義為位在胺基酸 根據本發明較佳的具“ S突變 大之胺基酸，或以離子化或 I係以位阻較 胺基酸。較佳係在低位阻置換其十之 丞 大變。根據本發

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修正 明’低位阻的較佳胺基酸咸了解為甘胺酸或脯胺酸。 根據本發明之突變，可使用任何比被置換之胺基酸顯示 出具有更大位阻的胺基酸。最好以下列胺基酸來置換突變 位置的胺基酸：白胺酸、異白胺酸或色胺酸。 根據本發明’咸了解離子化或可離子化胺基酸為具有， 除了可進入肽鍵的基團外，尚可具有胺基、羧酸（c〇〇H)4 敍或-C 0 〇-基團之任何胺基酸。具有此性質之較佳胺基酸 如下：穀胺醯胺和穀胺酸。

根據本發明之較佳具體實施例，在數個HPPD序列共同的 C -末端部份之胺基酸上進行突變，有可能藉著序列排列方 法來判別這些序列。 根據本發明特定具體實施例，突變的HPPD在其C-末端部 份包含下列肽序列： -Phe-Xaa-G1u~Xab-Asn-Phe- 其中Xaa和Xab分別代表甘胺酸（Gly)或位阻大於甘胺酸 的胺基酸，咸了解，如果Xaa或Xab代表Gly，此時另一個 胺基酸則與Gly不同。xaa和xab中宜至少有一個代表Leu、 Glu 、Trp 或lie 〇

以假單胞菌HPPD序列而言，突變的胺基酸係選自下列胺 基酸：Pro215 、Gly298 、Gly332 、Phe333 、Gly334和 Gly336，更佳的是胺基酸Pro215和Gly336。 可提及下列較佳的突變實例：Pro215Leu、Gly336Glu、 Gly336Trp 或Gly336Ile 。 咸了解瞭上述突變可成對組合，如，例如胺基酸G 1 y 3 3 4 和G 1 y 3 3 6的雙重突變。

O:\55\55611.ptc 第10頁 591108 案號 87118646 Λ_η 修正 五、發明說明（7) 本發明亦關於編碼上述突變之HP P D之核酸序列。根據本 發明，咸了解π核酸序列π是核苷酸序列，可以是D N A或RN A 型，較佳是D N A型，且特別指雙股，無論其為天然或合成 來源，尤其指其中編碼根據本發明之突變HPPD之編碼子的 D N A序列，將根據在其中表現之宿主生物，利用熟諳此藝 者所熟知之發揮最大效用的方法，使其發揮最大效用。 編碼原始未突變HPPD之序列可以來自任何來源。特定言 之，它可以來自細菌。可被提及的有利實例是假單胞菌屬 的細菌，例如螢光假單胞菌（P s e u d 〇 m ο n a s f luorescens)，或集胞藻屬（Synechocystis)的藍藻細 菌。該序列亦可來自植物，特別是衍生自雙子葉植物者， 如，菸草、芥菜、繳形植物，如：胡蘿蔔，或單子葉植 物，如：玉蜀黍或小麥。該編碼序列，及其分離法和選殖 法均說明於前文提及之參考文獻中，其内容已以提及之方 式併入本文中。 編碼原始未突變之HPPD的核酸序列中，可利用任何適合 使用相當於欲置換之胺基酸的編碼子來置換該序列中編碼 突變胺基酸之編碼子的方法來進行突變，該編碼子已廣泛 地述於文獻中，並係熟諳此技藝者所熟知。 可利用數種分子生物學方法來達成該突變。 第一個方法包括使細胞培養物在突變劑的存在或缺乏 下，接受HPPD抑制劑的長期選拔壓力，此時HPPD基因在該 選拔壓力及適當時在突變劑的影響之下自然突變，該基因 有所改變，而得以編碼能夠在部份或完全抑制未改質之酵 素的條件下表現HPPD活性的突變酵素。該細胞可以是植物

O:\55\5561Lptc 第11頁 591108 案號 87118646 曰 修正 五、發明說明（8) 細胞或細菌，後者可表現天然的Η P P D (屬於細菌來源）或其 他來源的Η P P D (細菌、真菌、藻類或植物），可將這些Η P P D 導入細菌中，此等細菌係呈適當形式用於生成突變，並容 許表現該HPPD，如果有編碼該細菌之天然HPPD的基因存 在，最好已經將其刪除。這類轉殖細菌的方法是熟諳此技 藝者所熟知，並，如同突變的方法已詳細說明於文獻中 (特定言之：山布魯克（Sambrook)等人之分子選殖法：實 驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual)， 第2版，紐約冷泉港冷泉港實驗室出版社（C o 1 d S p r i n g Harbor Laboratory Perss, Cold Spring Harbor, New York))。 當該細胞為表現天然HPPD之植物細胞時，可分離並選殖 突變的Η P P D，或使用傳統的方法，從細胞培養物中再產生 植物。所得的植物所表現之功能性突變HPPD對HPPD抑制劑 之敏感性低於天然Η P P D。該再生方法已詳細述於文獻中 (包括先前摘錄的參考文獻），並係熟諳此技藝者所熟知。 利用適當篩選助劑，選拔具有對HPPD抑制劑較不敏感之 突變Η P P D的細胞。以本發明之目的和尋求解決之道而言， 亦即對HPPD抑制劑較不敏感的HPPD，可簡單操作之筛選助 劑為包括決定出完全抑制原始未突變之Η p P D的Η P P D抑制 劑，且其對表現該未突變之HPPD的細胞是致命的劑量，使 細胞在突變之後接受此預定劑量，分離已經能抵抗該致命 劑量的突變細胞，然後分離並選殖編碼該突變H p p D的基 因。 這種由細胞培養物之進行突變之方法係在表現其天然

O:\55\55611.ptc 第12頁 591108 案號 87118646 Λ_η 曰 修正 五、發明說明（9) Η P P D之非常大量的假單胞菌細胞上進行，（參見，特定言 之下文所述的明確實例）。在所有例子中，藉著上文定義 之選拔法分離出的突變種，為在HPPD之C -末端部份出現突 變的突變種。 另一種其他製備根據本發明之突變核酸序列及相應的蛋 白質的方法，包括在例如數個C -末端部份中之序列中判別 共同的胺基酸，在預先選出一個或多個胺基酸上進行定位 突變，或在一個特定來源的HPPD中嘗試使突變重現，其係 在其他來源之HPPD中進行隨機突變（細胞培養）而獲得突變 種。獲得這些定位突變的方法是熟諳此技藝者所熟知，並 廣泛地述於文獻中 (特定言之：定向突變作用：操作法（Directed Mutagenesis: A Practical Approach, ) 1991，由 M.J.麥 克弗森（McPherson)編輯，irl出版社），或是可能使用商 業套組之方法（例如得自法馬公司（PHARMACIA)之U. S· E.生 成突變套組）。在所有的案例中，在這種定位突變後，適 於使用與上述隨機突變法作用所使用之相同的方法來篩選 比相應之未突變HPPD更不敏感的突變HPPDs。 因此本發明亦關於製備編碼根據本發明之突變HPPD之核 酸序列的方法，該方法如上文中之定義。 本發明亦關於在轉殖植物的方法中，以編碼根據本發明 之突變HPPD的核酸序列作為標記基因，或作為編碼序列之 用法，而有可能賦與植物對屬於HP P D抑制劑之除草劑的耐 受性。當然咸了解，該序列亦可與（一個）其他基因標記 (群），或編碼一種或多種農業特性的序列（群）混合使用。

O:\55\55611.ptc 第13頁 591108 修正 案號 87118646 五、發明說明（10) 本發明亦關於嵌合基因（或表現卡匣），其包括編碼序列 及在5 ’或3 ’位置之異源性調節要素，其在宿主生物中能夠 產生功能，特別是在植物細胞或植物中，而該編碼序列含 有至少一個編碼如同先前定義之突變Η P P D的核酸序列。 咸了解"宿主生物π為任何低等或高等的單細胞或多細胞 生物，為了產製突變HP PD之目的，可將根據本發明之嵌合 基因導入其中。這些生物，特定言之為細菌，例如大腸桿 菌（E· coli)、酵母菌，特別是酒酵母菌（Saccharomyces) 屬或克魯維爾酒酵母菌（Kluyveromyces)屬，畢赤酵母 (Pichia)、真菌，特別是麴菌屬（Aspergillus)、桿狀病 毒，或較佳的是植物細胞或植物。 咸了解根據本發明之π植物細胞π是任何衍生自植物並能 夠形成未分化之組織，（如：癒傷組織），分化的組織 (如：胚芽、植物的一部份、植物或種子）等之細胞。 咸了解，根據本發明之π植物π為能夠產生光合作用之任 何經過分化的多細胞生物，特定言之單子葉或雙子葉生 物，更特別指栽培植物，其可以提供或不提供作為動物或 人類營養用，如：玉蜀黍、小麥、油菜、大豆、稻米、甘 蔗、甜菜根、菸草、棉花等等。 表現編碼ΗPP D之核酸序列所需的調節要素是熟諳此技藝 者已熟知，並依宿主生物而異。特定言之，其包括啟動基 因序列，轉錄活化劑和終止轉錄序列，包括起始和終止編 碼子。判別和選拔調節要素的工具和方法是熟諳此藝者已 熟知，並廣泛述於文獻中。 本發明更特別關於植物的轉殖作用。任何在植物中自然

O:\55\55611.ptc 第14頁 591108 _案號87118646_年月日 H ___ 五、發明說明（13) 已詳細說明於專門文獻中，尤其是在本發明中提及的參考 文獻，更特別的是藉著使用根據本發明之載體。 有一系列方法是利用附接D N A序列之顆粒撞擊細胞、原 生質體或組織。另一個系列的方法是利用已嵌入根癌土壤 桿菌（Agrobaterium tumefaciens)Ti質體或發根土壤桿菌 (Agrobacterium rhizogenes) Ri質體中之嵌合基因轉移 到植物内的方法。其他可使用的方法，如：顯微注射術或 電穿孔法，或使用P E G的直接沉殿法。熟諳此藝者將依據 宿主生物的性質，特別是植物細胞或植物，來選擇最適當 的方法。 本發明亦關於宿主生物，特別是植物細胞或植物，其被0 轉殖且含有包括編碼如上述定義之突變HPPD序列之喪合基 因。 本發明亦關於含有轉殖細胞的植物，特定言之，從轉殖 細胞再生的植物。可藉由任何適當方法獲得該再生作用， 而該方法係依物種的性質而定，例如，述於上述參考文獻 _ 中者。可引用下列專利案或專利申請案，特別是關於轉殖 植物細胞和使植物再生的方法：美國專利第4, 4 5 9，3 5 5 ^ 號、美國專利第4，5 3 6，4 7 5號、美國專利第5，4 6 4, 7 6 3號、 美國專利第5，1 7 7，0 1 0號、美國專利第5，1 8 7，0 7 3號、歐洲 專利第2 6 7, 1 5 9號、歐洲專利第 6 0 4 6 6 2號、歐洲專利第6 7 2 7 5 2號、美國專利第 4 , 9 4 5，0 5 0號、美國專利第5，0 3 6，0 0 6號、美國專利第 5，1 0 0，7 9 2號、美國專利第5，3 7 1，0 1 4號、美國專利第 5，4 7 8，7 4 4號、美國專利第5，1 7 9，0 2 2號、美國專利第

Biiiill Il__ i 1 i 1 O:\55\55611.ptc 第17頁 591108 _案號87118646_年月曰 修正_ 五、發明說明（14) 5，5 6 5，3 4 6號、美國專利第5，4 8 4，9 5 6號、美國專利第 5 , 5 0 8，4 6 8號、美國專利第5 , 5 3 8 , 8 7 7號、美國專利第 5，5 5 4，7 9 8號、美國專利第5，4 8 9，5 2 0號、美國專利第 5 , 5 1 0，3 1 8號、美國專利第5，2 0 4，2 5 3號、美國專利第 5, 4 0 5, 7 6 5號、歐洲專利第4 42 1 74號、歐洲專利第 4 8 6 2 3 3號、歐洲專利第48 6 2 3 4號、歐洲專利第5 3 9 5 6 3 號、歐洲專利第6 74 72 5號、W0 9 1 / 0 2 0 7 1和W0 95/06128 〇 於轉 生出 所獲 米和 化 Λ 於藉 行選 特徵 物萌 物上 於在 或植 田間 草有 種子 於栽 之植 本發 再生植 根據 類、甘 豆、油 本發 的除草 法，該 前，或 發明轉 本發 因轉殖 法包括 劑，其 合基因 本發 嵌合基 明亦關 物而衍 本發明 簾、稻 菜、棉 明亦關 劑，進 方法的 在農作 殖的植 明亦關 之種子 在該片 對該雜 轉殖的 明亦關 因轉殖 殖的植 ，並有 得的轉 玉蜀黍 甜菜根 由 HPPD 擇性除 為在播 芽之後 〇 一片含 物的田 區域上 毒性， 或植物 培已經 物的方 具係由 關該轉殖植 殖植物可以 ’或雙子葉 Λ苜蓿等等 扣Ρ制劑的幫 ^ ’特別在 種農作物之 ’將該除草 有已經利用 間區域中控 施用一份劑 然、而對已經 並無明顯的 根據本發明 & ’該方法 栽培及/或雜交上述 物的種子。 是單子葉類，如：穀 類，如：於草、大 〇 助，特別指先前定義 農作物中除草之方 前、在農作物萌芽之 劑施用在已經根據本 根據本發明之嵌合基 制雜草的方法，該方 量的HPPD抑制劑除草 利用根據本發明之嵌 影響。 ，利用根據本發明之 包括將該經過轉殖之 591108 案號 87118646 Λ_η 曰 修正 五、發明說明（15) 植物的種子栽種於適合栽培該植物的田間區域上，如果出 現雜草，便對該片田間之該區域施用一份劑量之對該雜草 有毒性的除草劑，該除草劑的目標為上文定義之HPPD，對 該轉殖種子或該轉殖植物沒有明顯的影響，然後在其達到 想要的成熟階段時收獲所栽培的植物，且若適當時，分離 所收獲植物的種子。 在上文的兩個方法中，可根據本發明在播種農作物之 前、在農作物萌芽之前，或在農作物萌芽之後，施用以目 標為Η P P D的除草劑。 在本發明之定義中，咸了解π除草劑”為具有獨立除草活 性的物質，或這類物質可與改變其效力之添加物組合， 如：例如增加其活性的製劑（增效劑），或限制其活性的製 劑（安全劑）。Η P P D抑制劑除草劑，特定言之如先前定義 者。當然咸了解，為了其實際上的應用，依其本身已知的 方式，由上述除草劑與農業化學上常用的調配佐劑組合使 用。 當已經根據本發明來轉殖的植物含有其他可耐受其他除 草劑之基因時（例如編碼突變或未突變之EPSPS的基因，其 賦與植物對草甘膦的耐受性），或當經過轉殖之植物天生 對其他除草劑敏感時，根據本發明之方法可包括同時或依 順序先後錯開施用與該除草劑，例如草甘膦，組合的HPPD 抑制劑。 本發明亦關於以編碼突變HP P D之嵌合基因，在植物物種 之”轉殖作用/再生”循環期間，及在選擇上述除草劑時， 作為標記基因的用途。

O:\55\556ll.ptc 第19頁 591108 案號 87118646 曰 修正 五、發明說明（16) 利用下列實驗實例的幫助，將更能明瞭本發明的各種觀 點。 下文說明之此等實例中的所有方法或操作法只供範例， 且可以從中選擇不同的方法來達到相同結果。這個選擇不 影響其結果的品質，因此熟諳此藝者可使用任何適當的方 法來達到相同的結果。操作D N A片段的方法，大部份述於π 最新分子生物學方法（Current Protocols in Molecular Biology)1'第1和2冊，奥斯伯（Ausubel) F.M.等人中，由 葛林出版協會與威利科際公司出版（Greene Publishing Associates and Wiley Interscience)(1989)，或述於在 分子選殖法（Molecular cloning, T, Maniatis), E.F.， 弗利奇（Fritsch), J·山布魯布（Sambrook)， 1982 中。 實例1 :篩選對2-氰基-3-環丙基-l-(2-S〇9CHq-4-CF,茉基） _丙烷-1，3 -二酮具有耐受性之突變種的比色試驗 BJR P C :載體pRP A(述於申請案W0 96/38567中），其含 有基因組DNA片段和為來自螢光假單胞菌A32之HPPD之基因 編碼之編碼區，以N c ο I分解、純化，然後連接表現載體 pKK233 - 2(克隆科技公司（Clontech))内，其本身被Ncol分 解，其位置在此載體中形成獨特的選殖位置。此證實所得 的pRP C載體中，該基因的方向容許在trC啟動基因的控制 下表現。 將含有1 %瓊脂糖（奇布可公司（G i b c ο B R L )超純）、5 mM L -酪胺酸（希格馬藥廠（Sigma))和用於選拔上文提及之pRP C載體之製劑的YT營養液型培養基，以每孔1 〇 〇微升之比例 分配至96孔培養盤中。並取1〇微升在指數生長期，並含有

第20頁 O:\55\5561i.ptc 591108 案號 87118646 年 月 修正 五、發明說明（17) pRP C載體之大腸桿菌的培養物分配至每孔中。在37 °C下 1 6小時之後，僅含有培養基的孔，或接受含有載體 PKK 2 3 3 - 2之大腸桿菌培養物接種的孔是半透明的，而以含 有載體p R P C之大腸桿菌培養物接種的孔則變成棕色的。 以相同的培養基製備一系列試樣，其含有各種不同濃度 (0 mM至14mM)的2 -氰基-3 -環丙基-1-(2-甲基石黃醯基-4-三 氟甲基苯基）丙烷-1,3 -二酮（歐洲專利0 496 631號），將 其溶於水中，並調至1 p Η 7. 5。該分子為二酮腈，公認為 HPPD活性的有效抑制劑（帕黑特（Pal lett) Κ· Ε.等人， 1997， Pestic· Sci· 50, 83-84)。在7 mM 濃度之上述的 化合物的存在下，觀察到含有載體pRP C之細菌培養物完 全沒有變色。 下文中將證實藉由含有濃度7 mM之2 -氰基-3-環丙基 一1一（2-甲基石黃醯基-4 一三氟甲基苯基）丙院一 1,3-二S同的培 養基變成棕色，來選拔藉著定位突變法及隨機突變法所獲 得的Η P P D突變種。 改用2 -氰基-3 -環丙基-1-(2 -甲基石黃酿基-4-(甲硫基）苯 基）丙烧-1，3 -二嗣和氣-3-乙氧基-4_(乙基石黃酿基） 苯甲醯基）-5-甲基-1, 3 -環己二酮（WO 9 3 / 0 3 0 0 9 )取代2 -氰 基-3 -環丙基-1-(2 -甲基石黃酿基-4-三氟甲基苯基）丙烧-1， 3-二酮，獲得相同結果。這兩個分子分別在DMSO中形成終 濃度3 . 5 m Μ和7 m Μ的溶液。 這些結果證實以ΗPPD活性為基礎的試驗，無論該活性的 起源為何，都可判別對異噚唑類和三酮類的HPPD活性抑制 劑具有耐受性的Η P P D活性。

O:\55\5561l.ptc 第21頁 591108 案號 87118646 _年月日_修正 五、發明說明（18) 宜.....劍2 :螢光假單胞菌A32 HPPD基因利用羥胺的突變 洼

利用標準方法萃取含有上述之pRP C載體的大腸桿菌培 養物之質體DNA。在80 °C下，由該DNA與羥胺一起培養i小 時，羥胺為化學突變劑，使用得自上文提及之參考文獻的 標準方法，使胸腺核苷置換胞嘧啶。以所得的有可能突變 之質體DNA來轉殖大腸桿菌K12品系DH10B。使用實例1中所 述的比色篩選試驗，可以在篩選數千個可能突變的純系之 後，判別數個能夠使培養基變成棕色的菌落，亦即即使在 7mM之2 -氰基-3 -環丙基-1 -（2-曱基磺醯基-4 -三良甲基苯 基）丙烷-1,3 -二酮的存在下也能夠轉殖HPP成為黑尿酉^ 鹽0 在定出這些各式各樣突變種的序列後，使用此突變法/ 篩選法顯然已經單離出4株不同突變種，相當於三個不同 的突變位置： —第一個位置·· 由白胺酸置換脯胺酸215 ’該突變種命名為pfL215 -第二位詈: -由絲胺酸置換甘胺酸3 3 4 ’該突變種命名為p f s 3 3 4 -由天冬胺酸置換甘胺酸M4 ’該突變種命名為pfj)334

一第三個位琶·· 由絲胺酸置換甘胺酸336，該突變種命名為PfS336。 這三個突變位置係位在該蛋白質之C -末端區，與未突變 的HPPD相比較，造成有改良的财受性。 藉由隨機突變法造成的改變’可在任何具有Η P P D型活性

O:\55\556ll.ptc 第22頁 591108 修正 案號 87118646 五、發明說明（19) (亦即轉瘦4-羥苯基丙酮酸鹽成為黑尿酸鹽），並可 編碼區的蛋白質上進行。雖然本文中所述的HppDs 、 得自螢光假單胞菌、擬南芥菜、胡蘿蔔、玉蜀黍和曰 屬的HPPDs ’但對熟諳此藝者而言，所有這些改變顯铁 可應用在其他的HPPDs。 ^ g 的定位突變法 藉由排列來自螢光假單胞菌A 3 2、擬南芬菜、小白鼠、 豬和球蟲之蛋白質序列，有可能選出一定數目的胺基酸， 發現其被保留在不同序列中，然後使它們發生突變，而獲 得耐受性HPPDs ;可將文獻所述之其他HPPDs的序列加至^ 1所示的排列中。 序列識別1號 豈·,.倒3 螢光假單数菌A 因利用序列相t押 這些不同序列的排列清楚地顯示出其中一個最徹底的保 留區位在位置333處的苯丙胺酸和位置337處的天冬醯胺之 間。不僅該區域被南度地保留’此外它還包括位置3 3 4和 3 3 6處的兩個甘胺酸，藉由隨機突變法來判別（在序列排列 中以粗字體表示，並以星號標示）。突變法係在pRP C載體 上，利用PharίnaciaU·S·E·突變法套組進行。使用M寡核 苷酸，使苯丙胺酸3 3 3、甘胺酸3 34、甘胺酸33 6和天冬醯

胺337發生突變，亦使雙重甘胺酸334和甘胺酸336突變種 發生突變，如下圖所示（見附錄的序列表，序列識別1號至 序列識別1 2號）： PHE 3 3 3的突變，只被TrP置換

募核普酸1 :GAAGTTGCCC TCGCCCCACC CATCGTCGCC CTT

O:\55\55611.ptc 第23頁 591108 案號 87118646 年 月 曰 修正

五、發明說明（20) PHE 3 3 3的突變，只被LEU & ILE置換 募核苷酸2 :GAAGTTGCCC TCGCCRAKCC GLY 3 3 4的突變，只被TRP置換 募核苷酸3 :CTTGAAGTTG CCCTCCCAAA GLY 3 3 4的突變，只被ASP置換 募核普酸4 :CTTGAAGTTG CCCTCGTCAA GLY 3 3 4的突變，只被SER置換 募核苷酸5 :CTTGAAGTTG CCCTCGCTAA GLY 3 3 4的突變，只被LEU & ILE置換 募核苷酸 6 :CTTGAAGTTG CCCTCRAKAA GLY 3 3 6的突變，只被ASP置換 寡核苔酸 7 :CAGCGCCTTG AAGTTGTCCT GLY 3 3 6的突變，只被GLU置換 寡核苔酸8 :CAGCGCCTTG AAGTTYTCCT GLY 3 3 6的突變，只被TPR置換 募核苔酸 9 :CAGCGCCTTG AAGTTCCACT GLY 3 3 6的突變，只被lie置換 募核普酸 10 :CAGCGCCTTG AAGTTDACTC GLY 334 & GLY336的突變，其被所有其 換，因此可能獲得雙重突變種 募核苔酸 11 :CGCTTGAAGT TNNNCTCNNN ASN 3 3 7的突變，只被LEU & ILE置換 募核脊酸 12 :GAACAGCGCC TTGAARAKGC

CATCGTCGCC CTT

ACCCATCGTC GCC

ACCCATCGTC GCC

ACCCATCGTC GCC

ACCCATCGTC GCC

CGCCAAACCC ATC

CGCCAAACCC ATC

CGCCAAACCC ATC GCCAAACCCA 他的胺基酸來置

AAACCCATCG TC

CCTCGCCAAA CCC 在利用2_氰基-3-環丙基- l- (2-甲基石黃酿基-4 -三氟甲基 苯基）丙烷-1,3 -二酮篩選數百個可能的突變種之後，在我

O:\55\55611.ptc 第24頁 591108 ---案號87118646_年月日 修正 五、發明說明（21) 們的比色檢測試驗中，判別出1 3個突變種，其中有！ 〇個是 單一突變種，有3個是雙重突變種（參見綜合說明表），其 對2 -泉基- 3- ί哀丙基- 1-(2-甲基石黃酿基- 4_三氟甲基苯基） 丙烷-1，3 -二酮抑制劑具有耐受性。必需強調的是有些在 這些定位之突變法的過程中判別之突變種與在實例2中判 別之突變種相同（如：Pf S3 3 4和PfD3 3 4 )。 所得的突變種判別如下 單一突變種 : 命名為Pf W333 命名為Pf L333 命名為Pf W334 命名為Pf D334 命名為Pf S334 命名為Pf P334 命名為Pf L334 命名為Pf 1334 命名為Pf D336 命名為PfQ336 命名為Pf E336 命名為Pf W336 命名為Pf 1336 命名為Pf L337 以色胺酸置換苯丙胺酸3 3 3 以白胺酸置換苯丙胺酸3 3 3 以色胺酸置換甘胺酸3 3 4 以天冬胺酸置換甘胺酸3 3 4 以絲胺酸置換甘胺酸3 3 4 以脯胺酸置換甘胺酸3 3 4 以白胺酸置換甘胺酸3 3 4 以異白胺酸置換甘胺酸3 3 4 以天冬胺酸置換甘胺酸3 3 6 以穀胺醯胺置換甘胺酸3 3 6 以穀胺酸置換甘胺酸3 3 6 以色胺酸置換甘胺酸3 3 6 以異白胺酸置換甘胺酸3 3 6 以白胺酸置換天冬醯胺3 3 7 雙重突變種· 以丙胺酸置換甘胺酸3 3 4並 以丙胺酸置換甘胺酸336 命名為ΡίΑ33^Α：3：3β

O:\55\556ll.ptc 第25頁 591108

案號 8711864R 五、發明說明（22) 以丙胺酸 以精胺酸 以絲胺酸 以組胺酸 此結果 間，且位 得對HPPD 保留在不 良好標的 獲得财受 舉例說明 置換甘胺酸334並 命名為Pf A 33 4 -R336 置換甘胺酸3 3 6 置換甘胺酸3 3 4並 置換甘胺酸336 ^ ^ w 举 π a b 命名為Pf S 3 3 4 -H336

迅實可利=保留在不同HPPDs之蛋白質序列之 在 >；蛋白貝之C—末端部份的胺基酸突變，可能獲 活I*生之抑制劑具有耐受性的H p p J) s。因此，任何 同Η P P D胺基酸序列之間的區域都是獲得突變種的 ’邊突變種有利於分析，決定其耐受性。有可能 性HPPD之任何突變或多重突變，即使是本文中未 的蛋白質’亦是本發明主題的一部份。 該結果亦證實，為了獲得對此等不同抑制劑有良好耐受 性之酵素，C -末端區絕對是使η p p D突變的優良標的。因 此，很難在Ν -末端區定義出保留區，在螢光假單胞菌A 3 2 的例子中，其定義為由胺基酸1號至先前定義之連接肽， 或在其他物種之HPPDs的案例中，則至其同等物。 任何具有HPPD-型活性（亦即能轉殖4 -羥苯基丙酮酸鹽成 為黑尿酸鹽並可選殖其編碼區）的蛋白質可依據，由序列 排列演繹出的資訊為基礎，利用定位突變法進行（多項）改

變。雖然在本文所述的ΗPPDs，特別來自螢光假單胞菌、 擬南芥菜、胡蘿蔔、玉蜀黍和集胞藻屬，但所有的這些改 變顯然均可應用在其他的HPPDs上。 實例4 :螢先假單胞i A32 HPPD基因之定位突變法 藉由實例2所述的隨機突變法獲得的結果，及在排列不 同Η PP D序列後所獲得的結果，清楚地證實了由F # 3 3 3至

O:\55\556ll.ptc 第26頁 591108 案號 87Π8646 Λ_η 曰 修正 五、發明說明（23) F# 3 3 8 (螢光假單胞菌HP PD的編號）所產生的肽在為了獲得 耐受性而致突變的觀點上，是特別感興趣的區域。 就此資料之另一方面發現，藉由分析螢光假單胞菌品系 A 3 2酵素的立體結構’例如（圖1 )，發現該蛋白質單體之c 一 末端部份含有該酵素的催化位置。因此，首先而且主要進 行突變之此C -末端區的胺基酸希望能夠修改蛋白質/抑制 劑交互作用，藉此獲得更具耐受性的酵素。 可能導致Phe333至Phe338之六肽構型改變之點突變，在 此肽未直接突變下，因此可藉由分析螢光假單胞菌HPPD蛋 白質之立體結構來尋找。主要的想法是遠離活性部位相當 遠且未被保留的胺基酸突變會影響此Phe333至Phe338肽之 空間位置，並因此藉由間接效應，誘發對HPPD抑制劑之耐 受性。 因此，在結構中尋找接近此六肽的胺基酸；少數的胺基 酸，如：在位置287處的天冬胺酸和在位置298處的甘胺酸 符合此標準[關於此資訊，該六肽之甘胺酸3 3 4的α碳原子 位在離位於催化位置之鐵原子9.61Α處，而位置298處之 甘胺酸的α碳原子則位在離位置3 3 4處之甘胺酸5. 7 5 A 處]。至於這兩個胺基酸，此甘胺酸2 9 8似乎是最好的候選 者，因為任何突變法將造成胺基酸具有較大的側鏈，而此 甘胺酸被穀胺酸（其側鏈帶負電）置換，就獲得改變的觀點 來看，其具有充份肉眼可見的效果。 此外，當位在位置2 9 8處的甘胺酸被穀胺酸置換時，此 穀胺酸之非常龐大的側鏈’，撞到”沒折疊片的二級結構，其 中有保留的LLQIF要素。此要素的苯丙胺酸312本身之位置

O:\55\556ll.ptc 第27頁 591108 _案號87118646_年月日 修正 五、發明說明（24) 即非常靠近鐵。 測試Gly2 9 8形成GU2 9 8的突變作用。 利用pRP C載體的定位突變法（U. S. E·突變套組，法馬公 司（Pharmacia))，使用第13號募核奋酸（附錄的序列表-序 列識別1 3號），造成G 1 y 2 9 8形成G 1 u 2 9 8的突變： 以穀胺酸置換GLY298

募 此 選培 這 HPPD 無論 全有 螢光 區時 看， 點來 依 在含 衍而 等改 酮酸 質上 假單 HPPD 杈甘毆1 突變種命 養基轉變 點證實有 抑制劑之 該HPPD是 可能塑造 假單胞菌 ，此塑造 5玄區保留 看，它也 據由所塑 或不含抑 來之資料 變可在任 鹽成為黑 進行。而 胞菌、擬 ，但熟諳 :GCCTTCCACGGAAGATTCGTCCAGCAGGATACC 名為PfE2 9 8，會使含有7niM RPA2 0 22 48之篩 為棕色（參見綜合表）。 可能在知道HPPD的立體結構後，來判別就 耐受性的觀點而言有效之一定數目的突變， 屬於細菌、植物或其他來源皆然。因此，完 可利用其蛋白質序列的任何HPPD結構，因為 HPPD的確實結構，係已知者。當塑造(：-末端 過程特別令人感興趣，從原始序列的觀點來 得最好，特別從對HPPD抑制劑之耐受性的觀 是最有把握的。 =^HPPD的立體結構推衍而來的資料或依據 ,1:1所Ϊ得之^結晶*析消,]得的立體結構推 何i右Η用ppt位之突變法引起（多項）改變，此 在；^ I ^安+ 選殖其編碼區的蛋白

f本中睛案中說明的HppD 此藝者咸了解，所有的這m·: 〜改變當然均可應

O:\55\55611.ptc 第28頁 591108 索號 87118646 曰 修正 五、發明說明（25) 用在其他HPPDs上。 實例5 :突轡種螢光假單胞i HPPDs在菸蕈中的表現 A)嵌合基因之構築 pRP - VB3 :以Hindlll和Xbal分解雙載體pBI121(克隆科 技）的DNA，並利用pfu聚合酶（史塔金公司 (Stratagene))，以dNTPs填充末端；純化該載體。以 H i n d I I I和S a c I分解純系p R P - S的D N A，該純系已述於申請 案PCT 9 6 / 3 8 5 6 7的實例2中，且包括序列”雙重組織蛋白啟 動基因-TEV-0TP - HPPD基因- Nos終止轉錄序列”，並利用 p f u聚合酶（史塔金公司），以d N T P s填充末端；然後將經過 純化的嵌插序列連接到前述之經過純化的載體内。利用 S a 1 I分解作用確認方向。因此純系p R p _ V B 3具有下列嵌合 基因結構： RB/Nos啟動基因/NPTII/Nos終止轉錄序列/雙重組織蛋白 啟動基因/tev/otp/HPPD/Nos終止轉錄序歹j_ R B =根癌土壤桿菌T - D N A的右側邊緣 N 〇 s啟動基因=根癌土壤桿菌膽脂鹼合成酶的啟動基因 N P T I I =編碼對康黴素具有抗性的第π型新黴素磷酸轉移酶 的序列 N 0 S終止轉錄序列=根癌土壤桿菌膽脂鹼合成酶的終止轉錄 序列 雙重組織蛋白啟動基因：=述於歐洲專利507 689號中 tev = TEV促進子（加林頓與弗利德公司（Carrington &

O:\55\556ll.ptc 第29頁 591108 案號 87118M6 曰 修正 五、發明說明（27) 載體内，利用pfu聚合酶（史塔金公司），以dNTPs填充其末 端，純化之後，以B a in Η I分解並純化。 pRP - VB83 - g ：以 BstEI I 分解純系 pRP- VB3 之DNA，並利用 pfu聚合酶（史·塔金公司），以dNTPs填充末端；然後將經過 純化的載體與本身連接，藉此排除此載體獨特的B s tE I I位 置。 PRP-RD22 4 ：以 B am Η I 和 S a c I 分解純種系 p R P- V B 3 - f 的 D N A，純化並連接到已經以B a πι Η I和S a c I分解並純化過的載 體PRP-VB3-g内。因此純系pRP-RD2 2 4具有下列的結構：

RB/Nos啟動基因/NPTII/Nos終止轉錄序列/雙重組織蛋白 啟動基因/tev/otp截斷的HPPD/Nos終止轉錄序列/LB » LB=根癌土壤桿菌T-DNA的左側邊緣

pRP - RD 22 4突變種：利用K pn I和B s t E I I分解帶有突變 HPPDs之載體的DNAs和含在載體PKK233-2中的未突變之 HPPD，純化，然後連接到已經利用ΚρηΙ和BstEI I分解並純 化過的載體pRP-RD224内。以ΚρηΙ和BstEII分解，已經整 合了突變HPPD基因之轉化體來選拔嵌插序列之大小。將所 得的純系命名為p R P - RD 2 2 4，在此純系上進行已經在ΗPPD 上完成的突變；依此方式，產生下列純系，例如：pRP RD 2 24 Pf(未突變的酵素），PRP RD2 2 4 PfD3 36 (在位置 336 處具有天冬胺酸的酵素），pRP rD2 2 4 PfQ 3 3 6 (在位置336 處具有穀胺醯胺的酵素），pRP RD2 2 4 PfL 3 3 3 (在位置333

O:\55\556ll.ptc 第31頁 591108 案號 8711864ft 五、發明說明（28) 處具有白胺酸的酵素），及pRP rD2 2 4 PfA 3 3 4- 3 3 6 (在位置 334處和位置33 6處具有丙胺酸的酵素，也就是雙重突變 種）〇 ) 小哈瓦那（Petit havana)n菸草的轉殖作用 利用述於在歐洲專利申請案第〇 5 0 8 9 0 9號之轉殖作用 和再生作用的程序，將前述嵌合基因轉殖到”小哈瓦那”菸 草中。 、 1)轉殖作用·· 將載體載入無致癌基因之根癌土壤桿菌品系EH A丨0 i 中。

2 )再生作用：

使”小哈瓦那”菸草在基礎的Murashige和skoog(MS)培養 基上，從葉片的移植物中再生，該培養基包括3〇克/公升 蔗糠和350毫克/公升西法塔克辛（cef〇taxime)，以及各種 劑量’亦即10 ppm、20 ppm和40 ppm的2 -氰基-1 - [4 -（甲 石黃酿基）-2-三氟曱基苯基]一3 -（1-甲基環丙基）丙烷-1,3 -二_(歐洲專利49 6 6 3 0號），其為2-氰基-3-環丙基-1_(2 -甲磺醯基-4 -三氟甲基苯基）丙烷_1, 3 -二酮的類似物，或 直接給予2或4或8 ppm的2 -氰基-3-環丙基-1 -（2-甲績醯基 - 4-三氟曱基苯基）丙烷-1,3-二酮。從溫室植物中移出葉 片的移植物，並藉著葉片培養盤技術（Science 1985 ,第 2 2 7冊，第1 2 2 9 - 1 2 3 1頁），以三個連續階段進行轉殖之： -首先包括在MS培養基中誘發其發芽15天，該培養基中 添加30克/公升蔗糖，並含有〇· 05毫克/公升萘乙酸（ANA) 和2毫克/公升 胺基嘌呤（B AP )，並含有各種不同劑量之

O:\55\556ii.ptc 第32頁 591108 _案號 87118646 五、發明說明（29) 除草 劑，亦即2 -氰基-1 - [ 4 -（ 基]- 3-(1-甲基環丙基）丙统- _B a__ 甲磺醯基）- 2 -三氟甲基苯 1，3 -二酮（歐洲專利4 9 6 6 3 0 號），或2-氰基-3-環丙基-1-(2 一曱磺醯基-4—三氟甲基苯 基）丙烧-1，3 -二酮。 -然後使在此階段形成的嫩芽在MS培養基中培養丨〇天， 在該培養基中添加30克/升蔗糖並含有各種不同劑量的除 草劑，但不含任何的荷爾蒙。 -然後移出己經發育之嫩芽，並在含有一半濃度的鹽 類、維生素和糖類，及各種不同劑量之異沙服托 (i soxaf 1 utole)，但不含任何荷爾蒙的MS生根培養基中培 養。在大約1 5天後，將已經生根的嫩芽置於土壤中。 C)測定小植株在活體外對除蕈齋丨的射爭性 由選出的製劑與突變種pRP RD224 Pf L 3 3 3、pRP RD224 PfA334_A336 、pRP RD224 PfD336 和pRP RD224 PfQ336 反 應，來完成本實驗。它們證實，在轉殖作用/再生作用分 析法中，在最高劑量之除草劑下使用未突變之HPPD，不能 獲得嫩芽/小植株，相反的，突變種則有可能獲得，其歸 因於改善了該酵素的耐受性，即使在40 ppm 2 -氰基 -1 - [4-(甲石黃酿基）-2-三氟甲基苯基]- 3-(1_甲基環丙基） 丙烷-1,3-二酮（歐洲專利496630號），或8 ppm的2-氰基 -3 -環丙基-1-(2-曱石黃醢基三氟甲基苯基）丙烧-1，3 -二 酮之高劑量處，仍可獲得小植株。此等當使用突變HPPD 時，可在使用高濃度之選出的製劑下獲得之小植株及彼等 當用野生HPPD時不可能獲得的這些小植株，是完全正常的 植株。

O:\55\5561l.ptc 第33頁 591108 案號87118646__年月日 修正_ 五、發明說明（30) 我們可強調，突變種pRP RD224 PfD336和pRP RD224 PfL333，在統計上比突變種pRP RD224 PfQ336和pRP RD224 PfA334-A336是更有效的，因為它們能夠獲得較多 數量的财受性小植株。 螢光假單胞菌之HPPD的综合說明表 HPPD 型 ο 野生型 突變的 PfL215 PfE298 PfL333 PfW333 PfS334 PfD334 PfW334 PfP334 PfL334 ΡΠ334 PfS336 PfD336 PfQ3 3 6 PfE336 PfW336 ΡΠ3 3 6 PfL337 PfA334-A336 PfA334-R336 PfA334-H336 * :篩選試驗述於實例i e 未取得數據 .Μ 性為mοΑ量7 的劑 中的 驗劑試拔 選選 篩用 在使mMlo ο 85 171655 5 1281010108885 7 3 4 - 7 16 5 4 4 - 188 0-8887 5

591108 _案號 87〗〗Sfi4fi 五、發明說明（31) 曰 修正 〜數字1 0相當於與在缺乏抑制劑下，利用未突變iHppD所 獲得的相同程度的高活性，而數字〇相當於受到2 —氰基_ 3 一 ί哀丙基-1 -（2-甲磺醢基-4 -三氟甲基苯基）丙烷—丨，3 -二酮 完全抑制時，或因為突變導致該酵素失去活性時之無活 性；數字1至9相當於中間活性，活性係隨著數字增加。 XI些結果證實將對HPPD活性之抑制劑具有耐受性的HppD 導入植物中’將使植物對這些相同抑制劑具有耐受性，因 此’其耐受性顯然比利用未突變之HppD所獲得的耐受性優 異。 實例6 :集胞藻屬HPPD基因之定位突變法 在螢光假單胞菌Η P P D中選出在對H p p D抑制劑之耐受性有 效的突變位置’並將該位置轉位至另一個H p p 中。 此轉位作用儘可能與螢光假單胞菌2HppD不同，且與其 他已知之HP PDs不同。為了此作業所選用的基因為編碼集 胞藻屬Η P P D的基因，該基因係由有系統地定出藍藻細菌之 基因組的序列而得知，但未曾選殖其本身。因此該基因係 首次分離’然後在大腸桿菌中表現。 1 )基因之分離

利用標準方法萃取和純化藍藻細菌集胞藻屬Pcc 6 8 〇 3的 基因組D N A ’而這在實例1)中藉著加入而被排除。採用聚 合酶鏈反應（PCR)，使用含在其緩衝溶液中之丨.25單位的 pow聚合酶（百靈藥廠（Boehringer))，在含有200 uM dNTP(去氧核醣核苷酸三磷酸鹽）的5〇微升反應體積中，擴 增2 0 0微克此基因組DMA。採用合成的募核苷酸序列16和

O:\55\5561l.ptc 第35頁 591108 案號 87118646 Λ_η 曰 修正 五、發明說明（32) 其係來自已在 1 7 (附錄的序列識別1 6和1 7號）作為引子，

Genebank中公開之集胞藻屬HPPD的序歹*J <

τ ATG 寡核苷酸 16 ATTATGGAAT TCGACTATCT 寡核苷酸 17 CAGTATTCAT AATGTTAATT 利用柏金-艾瑪（Perkin-Elmer) 9600裝置進行擴增程 式，亦即94 °C 5分鐘，然後循環50次之94 °C 1分鐘，49 ^ 1分鐘和7 2 °C 1分鐘，然後在7 2 °C下5分鐘。 2 )基因之選殖和表現 純化P C R所獲得的擴增片段，以E c 〇 R I分解，再度純化， 然後選殖到先以EcoRI和Smal分解過的載體ptrc-99A (法 馬公司（Pharmacia))中。以重組質體轉殖細菌jmi〇5。定 出序列後證實選殖之片段符合已公告的集胞藻屬HPPD序疋 列。 利用前述之比色試驗（參見實例1 )，添加濃度為1 m M之 I P T G (異丙基-β - D -硫代半乳糖吡喃苷），以便誘發表現节 蛋白質’由培養基變成棕色觀察到所獲得之集胞藻屬hppd 之二加氧酶活性。在相同的條件下，但在含有7 2 -氰 基-3 -環丙基-1 -（2-甲磺醯基-4-三氟甲基苯基）丙烷-l 3一 二调之培養基中，沒有使該培養基變成棕色，藉此證實集 胞藻屬HPPD之活性受到2 -氰基-3 -環丙基-1-(2-曱續酿基' - 4-三氟曱基苯基）丙烷—ι，3 -二酮的抑制。 3 )定位突變法 藉由螢光假單胞菌A3 2 HPPD之蛋白質序列和集胞蕩屬 P C C 6 8 0 3 Η P P D排列，推測假單胞菌η p p D位置3 3 4和3 3 6處的 甘胺酸（在實例3的圖中以星號表示的甘胺酸，且其非常高

III圓

O:\55\556ll.ptc 第36頁 591108 _案號87118646_年月 曰 鉻π：_ 五、發明說明（33) 度地保留），是在集胞藻屬HPPD中之位置318和320處（在圖 3中排列的蛋白質序列中以粗字體表示）。 取得螢光假單胞菌之位置3 3 4處的數個突變種後，利用 寡核苷酸MUGLYA和MUGLYB來完成兩個定位突變法實驗 (U . S · Ε ·，法馬公司），該募核醫酸計劃用於利用精胺酸或 絲胺酸，或利用脯胺酸或丙胺酸來置換位置3 1 8處的甘胺 酸（集胞藻屬的位置，相當於螢光假單胞菌之位置3 3 4處的 甘胺酸）（序列識別1 8和1 9號）。 可能以SER & ASN來置換GLY318

暮核苷酸 1 8 CGGGCAAAG GATTTARCCA AGGAAACTTT CAAG 可能以PRO & ALA來置換GLY318

寡核普酸 19 CGGGCAAAAG GATTTSCNCA AGGAAACTTT

CAAG 在這兩個實驗中，突變法後得到之純系使筛選培養基在 7 mM 2-氰基-3-環丙基-1 -（2-甲磺基一 4—三氟甲基苯基） 丙烷-1,3 -二酮下變成棕色（實例1所述的試驗）°定出每實 驗中各一個突變種的序列。 # 以精胺酸置換甘胺酸318，命名為SyN318 ’類似 P f D 3 3 4 (實例 3 )。 、 以丙胺酸置換甘胺酸318，命名為SyA318 ’冑~ 經證實與特定HPPD有 其他物界的另一個

P f A 3 3 4 (在實例3中）。 這些結果證實該突變造成耐受性’ 關的耐受性可轉位至屬於其他物種和 部份中之蛋白質序列的 HPPD 上。 這些結果亦證實在HPPD之C-末端

O:\55\5561I.ptc 第37頁 591108 案说 87118646 年月日 修 五、發明說明（34) 改變，無論HPPD的起源為何（細菌或其他來源），均可造成 對Η P P D抑制劑的而才受性〇 變HPPD的生化研究：集臉溪屬之突變種 檢查先前實例中獲得的突變種SyN318*SyA318，與集胞 藻屬之未突變HPPD比較與HPPD抑制劑（亦即2 -氰基-3 -環丙 基-1-(2-甲磺醯基-4 -三氟甲基苯基）丙烷- i，3 -二酮）有關 之生化特徵K m及I C5G。利用下列方法進行此分析法： a)活性測定法 利用高效液相層析法（Η P L C )測定酵素與其受酶質Η P P — 起培養後形成的產物（亦即黑尿酸鹽）含量，來決定HP Ρ D之 活性。取1 2到4 8毫微莫耳之不同含量的黑尿酸鹽注射到能f 夠測定黑尿酸鹽滞留時間之管柱中，其高峰面積與產物的 注射量有相關係性。 在2 0 0微升終體積中完成活性測定，其中含有：12. 6 抗壞血酸鹽、178//馗鐵（？6 1181〇832，61120)(預先在〇.11^ t r i s -乙酸鹽緩衝溶液，p Η 6中製備）、5 0微克含Η P P D之粗 萃物、352//Μ ΗΡΡ和0·1 M tris-乙酸鹽緩衝溶液，ρΗ 7.

5。首先在30 °C下，由酵素與鐵一起培養1分鐘，然後在3〇 °C下與抗壞企酸鹽一起培養5分鐘，隨後藉著加入受酶質 (亦即HPP)，開始該反應。在30 °C下持續培養！分3〇杪，然 後添加7 0微升2 0 %過氣酸中止該反應。然後在2 〇 及 1 5，3 0 0 r p m下離心5分鐘，排除蛋白質。回收上澄液。然 後取75微升分析用混合物注射至連接HPLC系統的Pi co Tag C 1 8管柱中，分析所形成之黑尿酸鹽量。以1毫升/分鐘之 流速進行溶離。如下述進行等濃度溶離：（1 ) - 〇 %緩衝溶液

591108 a 案號 87118646 五、發明說明（35) B(亦即1 00%緩衝溶液A : 水、3% (體積/體積）乙腈、〇·ι% (體積/體積）三氟乙酸）6分 鐘；（2 ) - 1 0 0 %緩衝溶液Β (1 0 〇 %乙腈）至第η分鐘；（3 ) - 0 % 緩衝溶液Β至第1 9分鐘。在離開管柱時，測定2 § 8 n m吸光度 來k測黑尿S文鹽。糟由色谱上的而峰面積決定所形成產物 量 ° b) Kn之決定 使用不同濃度的Η P P，測量反應的初速，決定出η p p d對 ΗΡΡ的!^。該反應在上述條件下，使用5· 5 # Μ到1 40 0 // Μ的 ΗΡΡ濃度進行。 c) IC5〇之決定 在30°C下，由酵素與鐵、抗壞血酸鹽、濃度1056/zM之 受酶質和各種不同濃度之抑制劑一起培養1 〇分鐘後，在上 述條件下測量該反應之初速，決定I C5()。2 -氰基-3 -環丙基 -1 -（2-甲續醯基-4-三氟曱基笨基）丙烧-i，3 -二酮的使用 濃度從10MG變化至10·4Μ。 計算該酵素對其受酶質，亦即4-羥苯基丙酮酸鹽的Κη 值，並在不相上下的活性下，計算I C5G值，將其記錄在下 表中： 天然的HPPD SyN3 18 SyA318 Km 60 β Μ 320 μ. Μ Ic50 80 ηΜ «0 40 β Μ — 這些結果證實雖然在蛋白質之末端部伤進灯的突變藉 #

國 O:\55\55611.ptc 第39頁 591108 _-_案號___一年月 g_修正 五、發明說明（36) 由減少該酵素對文酶質的親和力（L )而具有影響力，但它 們藉由減少該酵素對抑制劑之親和力（丨C5())甚至具有更強 的影響。因此突變種HPPD之ic5G對未突變HPPD之IC5G的比例 (其反映出對抑制劑之親和力的喪失），對SyN3丨8 *SyA31 8 而言分別是1 0 0 0和5 0 0 ;而突變種{^?1)之]^對未突變心？]) 之1^的比例（其反映出對受酶質之親和力的喪失），對

SyN318和SyA318而言分別是8和5。這點非常妥當地解釋的 事實是雖然這兩個突變種對該酵素之受酶質具有稍低的親 和力，但對該酵素之抑制劑特別具有明顯較低的親和力，

包括2 -氰基-3 -環丙基-1-(2-甲磺醯基-4-三氟甲基苯基） 丙烧-1,3 -二嗣。 這些結果證實，實例1所述的比色篩選試驗確實能夠檢 測出對Η P P D活性之抑制劑具有耐受性的突變H p p D s。因此 該方法可有效用來篩選和判別對HPPD抑制劑具有耐受性之 H P P D突變種。雖然以薛選方法之用法迅速簡便，且這正是 被使用之原因，但為了完成類似的分析，顯然可以使用任 何其他的方法；有可能使用 -測ϊ活性及其抑制作用之篩選方法，其係以H p p的消失 (放射活性分析法、分光光度分析法或其他分析法），或氧 之消耗量，或以黑尿酸鹽的出現為根據基礎（與另一種酵 素活性偶合） ~ 細菌在Η Ρ P D抑制劑的存在 ，藉此而得以只選出具有耐

-活體内偶合篩選法，如： 下，以Η Ρ Ρ為唯一碳源下生長 受性Η P P D之純系 -同樣地完全有可能使用植物轉殖載體、轉殖系統、再

O:\55\556ll.ptc 第40頁 Λ 修正 591108 _案號 87118646 五、發明說明（37) 生系統和選拔系統，利用Η P P D抑制劑，在植株中使用活體 内篩選法如：實例5和8所述。 實例8 :菸草中集胞藻屬未突變和突變的Η P P D ; S ν Ν 3 1 8和 突變的S ν A 3 1 8之評估法 A )構築嵌合基因 為了製造能夠在PBD6型於草植物中表現集胞藻屬 HPPD(野生型或突變種）之構築體而使用的載體命名為 p R D 2 2 4 (述於實例5中）。此載體之初步構想為簡單地置換 此載體在ΚρηΙ和BstEII位置之間之截斷HPPD基因，供選殖 所有假單胞菌HPPD突變種。為了產生導入外來基因的植 物，亦可用來選殖集胞藻屬HPPD基因。 B)選殖策略 置換編碼截斷之螢光假單胞菌HPPD之序列，將編碼集胞 藻屬Η P P D之序列選殖到pRD 2 2 4載體内。然而，不能在 KpnIB到stEI I位置之間直接選殖集胞藻屬HPPD序列，因為 集胞藻屬和螢光假單胞菌HPPD基因的N-末端序列非常不 同。然而，有可能在0ΤΡ之BamHI位置至BstEI I位置之間選 殖。為了這樣做，必須從5 ’末端，該Η P P D序列的上游，再 創造一個B a m Η I位置，接著是編碼〇 τ Ρ的部份，其位在 B a m Η I的下游。 藉著聚合酶鏈反應（PCR)，使用引子Α和Β擴增含在載體 pTRC 99A中的集胞薄屬HPPD基因。寡核苷酸A能夠在HPPD 基因的上游添加BamH I位置，並在BamH I位置和該基因起點 之間添加一部份0ΤΡ序列。募核苷酸β能夠在該基因下游添 加B s t E I I位置。引子A與B示於序列識別2 0和2 1號中：

IMIS s

O:\55\556ll.ptc 第41頁 591108 案號 87118646 曰 修正 五、發明說明（38) 寡核苷酸A : NNNNNNNNNN GGATCCGGTG CATGGAATTC GACTATCTTC3， 寡核苷酸B : NNNNNNNNNN GGTCACCAGT ATTCATAATG TTAATTATG3， 在5 2 °C的雜化溫度下進行該擴增反應。然後在瓊脂糖凝 膠上分離該PCR產物。切下相當於HPPD基因的DNA帶並純 化。 在3 7 °C下，以BamHI分解所擴增的片段1小時，然後在60 。(：下以B s t E I I分解1小時。然後在瓊脂糖凝膠上分離該嵌 插序列。切下相當於HPPD基因的DN A帶並純化。 然後將該片段選殖到雙載體中。後者先經過B am Η I和 B s t Ε I I分解，然後在瓊脂糖凝膠上分離出相當於截斷ΗPPD 之片段。依HPPD基因相同的方式純化此載體。 在16°C下，利用Τ4 DNA連接酶處理16小時，完成雙載體 和插入序列之間的連接。使用連接混合物轉殖大腸桿菌 DH10B細胞。在含有50微克/毫升康黴素的LB培養基上選拔 陽性純糸。在完成迷你製程，並在3 7 °C下以B a in Η I和S a c I 分解質體DN A 1小時後，在瓊脂糖凝膠上檢查在雙載體中 是否出現所需之嵌插序列。然後使用重組載體來轉殖根瘤 土壤桿菌EHA105細胞。在含有50微克/毫升康黴素的LB培 養基上進行選拔。因此该重組載體帶有含康黴素抗藥性基 因之T-DNA，和在雙重組織蛋白啟動基因控制下可編碼 OTP-集胞薄屬HPPD單位的序列，以及Nos終止轉錄序列。 C)PBD6菸草品種的轉殖作用/再生作用 依實例5所述進行轉殖作用，但先使用2 0 0毫克/毫升康

O:\55\55611.ptc 第42頁 591108 案號 87118646 曰 修正 五、發明說明（39) 黴素進行選拔。 另一方面，切下在康黴素上獲得的嫩芽，並分別移至缺 少荷爾蒙的培養基中，以便促進其生根，其中含有2 -氰基 - 3-環丙基-1 -（2 -甲石黃酿基-4-三氟甲基苯基）丙烧-1，3-酮，以便選拔對此除草劑有耐受性之導入外來基因的小植 株。該培養基為MS培養基（希格馬公司Μ- 5 5 1 9 4. 4克/公 升），其中含有350毫克/公升西法塔克辛（Cefotaxime)、 1%蔬糖（重量/體積）和0或8 ppm的2-氰基-3-環丙基-1 -（2 -曱磺醯基-4 -三氟甲基苯基）丙烷-1，3_二酮。在轉殖細胞 中過度產生HPPD，能夠發育出有葉綠素之小植株，其對2 - 氰基-3-環丙基-1 - 4-三氟甲基苯基）丙烧-1, 3 -二酮有耐受性，而衍生自未轉殖細胞的小植株·似乎顯然 全部都是白色，且對除草劑敏感。 兩週後，將充份發育根部的小植株移至土壤中，並在溫 室中培養。 D)結杲 在每種構築體的案例中，從平均6 0個葉片培養盤中再生 約40個嫩芽。在含有氰基-3-環丙基-1-(2-甲績8¾基_4 -三氟曱基苯基）丙烷-1,3 -二酮的培養基上培養2天後，一 些小植株開始轉變為白色。在生根8天後，此變白現象明 顯得足以判斷。在8 ppm的2 -氣基-3 -環丙基-1-(2 -甲續酿 基-4-三氟甲基苯基）丙烷-1,3 -二酮下，觀察到含有野生 型酵素的植物之存活率只有4 0 %，而與含有酵素Sy A 3 1 8的 植物為72%，含有酵素SyN318的植物則為88%。因此，含有 突變酵素的植物具有之耐受性優於含有野生型酵素之植物

1H11 O:\55\55611.ptc 第43頁 591108 案號 87118646 年 月 曰 五、發明說明（40) 的财受性。 在超過一個月之後，在8 ppm之2 -氰基-3 -瓖 以 野 甲磺醯基-4-三氟甲基苯基）丙烷-1,3-二酮下’ ^318時 Η P P D轉殖時，綠色小植株的數目為〇 %，而使用S y 此百分比為1 7%，突變種Sy A 3 1 8則為1 9 %。 _靖醯 同時，如果在濃度從5到10 ppm之2 -氰基-1一 [4>二_ 基）-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基環丙基）丙烷一在下 (歐洲專利4 9 66 30號）（一種較弱的HPPDs抑制劑）的金〆 進行再生作用，這三個基因均有可能獲得在外形上=$變 致的植物。這證實，如果必要時，過度表現突變或未大 的HPPD，能夠在實驗室中獲得耐受性。 g _果 這些結果似乎與在活體外藉由酵素動力學所獲得的二$ 一致，且似乎確實有可能在活體外的生化測定和在活體 所獲得的結果之間建立相關性。 此後項實例證實，在活體外篩選（實例1 )、生化分析（實 例6 )和植物的耐受性之間，至少有部份一致性。 序列一覽表 (1 )共同資訊： (i )申請者 (A) 姓名 (B) 術道 (C) 城市

POULENC AGROCHIMIE Rue Pierre BAIZET RHONE 14-20 LYON (E) 國家：France (F) 郵遞區域：6 9 0 0 9 (i i )發明標題：突變的羥苯基丙酮酸鹽二加氧酶 if

O:\55\55611.ptc 第44頁 591108 案號 87118646 曰 修正 五、發明說明（41) D N A序列，以及含這類基因且耐受除草劑之植物的分離法 (i i i )序列數目：2 1 (i v )電腦可讀形式： (A )媒體形式：軟碟 (B) 電腦：IBM PC可相容的

(C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D)軟體：Patentln Release #1·0，版本 #1·30 (EPO) (2 )序列識別1號之資訊：

4P (i )序列特徵： 33 if (A )長度：3 3個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別1號 GAAGTTGCCC TCGCCCCACC CATCGTCGCC CTT (2 )序列識別2號之資訊： (i )序列特徵： (A )長度：3 3個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別2號

O:\55\556ll.ptc 第45頁 591108 案號 87118646 曰 修正 五、發明說明（42) GAAGTTGCCC TCGCCRAKCC CATCGTCGCC CTT 33 (2 )序列識別3號之資訊： (i )序列特徵： (A )長度：3 3個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別3號 CTTGAAGTTG CCCTCCCAAA ACCCATCGTC GCC 33 (2 )序列識別4號之資訊： (i )序列特徵： (A )長度：3 3個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別4號 CTTGAAGTTG CCCTCGTCAA ACCCATCGTC GCC 33 (2 )序列識別5號之資訊： (i )序列特徵： (A) 長度 (B) 類型 (C) 股型 # 3 3個鹼基對 核苷酸 單股 (D )拓樸學：直線狀

O:\55\556ll.ptc 第46頁 591108 案號 87118646 a 修正 五、發明說明（43) 33 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別5號 CTTGAAGTTG CCCTCGCTAA ACCCATCGTC GCC (2 )序列識別6號之資訊： (i )序列特徵： 33 (A )長度：3 3個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別6號 CTTGAAGTTG CCCTCRAKAA ACCCATCGTC GCC (2 )序列識別7號之資訊： (i )序列特徵： 33 (A )長度：3 3個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別7號 CAGCGCCTTG AAGTTGTCCT CGCCAAACCC ATC (2 )序列識別8號之資訊： (i )序列特徵· (A)長度：33個鹼基對 (B )類型：核苷酸

O:\55\556il.ptc 第47頁 591108 案號 87118646 a 修正 五、發明說明（44) (C)股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別8號 CAGCGCCTTG AAGTTYTCCT CGCCAAACCC ATC (2 )序列識別9號之資訊： (i )序列特徵： (A)長度：33個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別9號 CAGCGCCTTG AAGTTCCACT CGCCAAACCC ATC (2 )序列識別1 0號之資訊： (i )序列特徵： (A )長度：3 2個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別1 0號 CAGCGCCTTG AAGTTDACTC GCCAAACCCA TC (2 )序列識別1 1號之資訊： (i )序列特徵· 33 # 33 32

O:\55\556il.ptc 第48頁 591108 案號 87118646 —年 月 修正 五、發明說明（45) (A)長度：32個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明··序列識別1 1號 CGCTTGAAGT TNNNCTCNNN AAACCCATCG TC (2 )序列識別1 2號之資訊： 32

(i )序列特徵： (A )長度：3 3個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C)股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明··序列識別1 2號 GAACAGCGCC TTGAARAKGC CCTCGCCAAA CCC (2 )序列識別1 3號之資訊： (i )序列特徵： (A )長度：3 3個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型·· DNA (X i )序列說明：序列識別1 3號 GCCTTCCACG GAAGATTCGT CCAGCAGGAT ACC Φ 33 33 9

O:\55\5561i.ptc 第49頁 591108 _案號8Ή18646_年月日_ 五、發明說明（46) (2 )序列識別1 4號之資訊： (i )序列特徵： (A )長度：2 3個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別1 4號 TCGAGAGAGA GGTGACCGAG AGA (2 )序列識別1 5號之資訊： (i )序列特徵： (A )長度：2 3個鹼基對 (B )類型：核苔酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別1 5號 TCGATCTCTC GGTCACCTCT CTC (2 )序列識別1 6號之資訊： (i )序列特徵：

(A)長度：2 1個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA

O:\55\55611.ptc 第50頁 591108 案號 87118646 五、發明說明（47) (X i )序列說明：序列識別1 6號 ATTATGGAAT TCGACTATCT T (2 )序列識別1 7號之資訊： (1 )序列特徵： 修正 2 1 (A)長度 (B )類型 (C )股型 (D )拓樸學 2 3個驗基對 核苷酸 單股 =直線狀 23 (1 1 )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別1 7號 CAGTATTCAT AATGTTAATT ATG (2 )序列識別1 8號之資訊： (i )序列特徵： 34 (A )長度：3 4個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (1 i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別1 8號 CGGGCAAAAG GATTTARCCA AGGAAACTTT CAAG (2 )序列識別1 9號之資訊： (i )序列特徵·· (A) 長度 (B) 類型 (C )股型 3 4個驗基對 核苷酸 單股

O:\55\556il.ptc 第51頁 591108 案號 87118646 曰 修正 五、發明說明（48) (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別1 9號 CGGGCAAAAG GATTTSCNCA AGGAAACTTT CAAG (2 )序列識別2 0號之資訊： (i )序列特徵： (A)長度：40個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別2 0號 NNNNNNNNNN GGATCCGGTG CATGGAATTC GACTATCTTC (2 )序列識別2 1號之資訊： (i )序列特徵：

(A )長度：3 9個鹼基對 (B )類型：核苷酸 (C )股型：單股 (D )拓樸學：直線狀 (i i )分子類型：DNA (X i )序列說明：序列識別2 1號 NNNNNNNNNN GGTCACCAGT ATTCATAATG TTAATTATG 34 # 40 39

O:\55\5561Lptc 第52頁

Claims (1)

108™- 公告本= !號: 82. 12. 1 β |正 年月日 .. 87118646 ^ (坤、、/月 曰 魏. 絛正 六、曱請專利範 1 · 一種功能性突變羥苯基丙酮酸鹽二加氧酶（Η P P D )，其 對Η P P D抑制劑較不敏感，其特徵在於其c _末端部份含有一 或二處突變，其中，就假單胞菌HPPD序列而言，該突變胺 基酸係選自下列胺基酸：Pro215、Gly298、PheJ333、 Gly334 和Gly336 。 2 . —種突變羥苯基丙酮酸鹽二加氧酶（H p p D )，其對H p p D 抑制劑較不敏感，其特徵在於在其C -末端部份含有下列的 序列： -Phe-Xaa-Glu-Xab-Asn-Phe- 其中X a a和X a b分別代表甘胺酸（G 1 y )或位阻大於甘胺 酸的胺基酸，咸了解，如果X a a或X a b代表G 1 y時，另一個 胺基酸則與G 1 y不同。 3.根據申請專利範圍第2項之突變的HPPD，其特徵在於 Xaa和Xab中至少有一個代表Leu、Glu、Trp或lie。 4·根據申請專利範圍第3項之突變的HPPD，其特徵在於 Xab 代表 Glu、Trp 或 I le。 5·根據申請專利範圍第4項之突變的HPPD，其特徵在於 Xab 代表 Trp。 6 ·根據申請專利範圍第1項之突變的Η P P D，其特徵在於 就假單胞菌HPPD序列而言，該突變胺基酸係選自下列胺基 酸：Pro215和Gly336 〇 7·根據申請專利範圍第6項之突變的HPPD，其特徵在於 其含有選自下列的突變：Pro215Leu 、Gly336Glu 、 Gly 3 3 6 Trp 或Gly 3 3 6 I le。

O:\55\55611-921216.ptc 第54頁 4 591108 修正 _案號 87118646 六、申請專利範圍 8 . —種核酸序列，其編碼根據申請專利範圍第1至7項中 任一項之突變的HPPD。 9 . 一種後合基因，其係由編碼序列和位於5 ’和3 ’位置之 異源性調節要素所組成，能夠在宿主生物中發揮功能，特 徵在於該編碼序列含有至少一個根據申請專利範圍第8項 之核酸序列。 1 0 .根據申請專利範圍第9項之嵌合基因，其特徵在於該 宿主生物係選自細菌，酵母菌，畢赤酵母（Pichia)，真 菌，桿狀病毒，或植物細胞和植物。

1 1 .根據申請專利範圍第1 0項之嵌合基因，其中該細菌 為大腸桿菌（E. coli)。 1 2 .根據申請專利範圍第1 0項之嵌合基因，其中該酵母 菌為酒酵母菌屬（Saccharomyces)或克魯維爾酵母菌屬 (K 1 uyveromyces ) 〇 1 3 .根據申請專利範圍第1 0項之嵌合基因，其中該真菌 為麴菌屬（Aspergillus)。 1 4.根據申請專利範圍第1 0項之嵌合基因，其特徵在於 該宿主生物為植物細胞或植物。 1 5 .根據申請專利範圍第1 4項之嵌合基因，其特徵在於 其含有編碼突變HPPD之核酸序列之5’端，編碼植物轉運肽 的核酸序列，將該序列安置在啟動基因區和編碼突變Η P P D 的序列之間，而得以容許其表現轉運肽/突變的HPPD融合 蛋白質。 16. —種轉運肽/突變HPPD融合蛋白質，其中轉運肽係指

O:\55\55611-921216.ptc 第55頁 591108 _案號87118646 日 修正_ 六、申請專利範圍 揮突變HPPD進入質體内且該突變HPPD係如申請專利範圍第 1至7項中任一項所定義者。

O:\55\55611-921216.ptc 第56頁 rvi λ r\n Π lUo公告本 案號 87118646 修正 圖式 槔筘齊挪獠淋踌择 &臻 »>酿酿 ®,»®4>^每漭膝$薄赉^淞^s^ss^» 蛾 it/M^^a.p^$ i^^s0βρί0βρ^0β i ψ <7\0 SI 70 ηω^τζ..........PlfK........KrKMoDKLVTUfGDGVIGDIArKVKDC TSf>LR 丨οϊνΒίοΛ ——W33· « §SFrsQsdLSWUSS8<>3503 TapvRScaARoT---LXXAPLADOMlLDKMYlnlLDKJIODavKDV/VFKVOav ΤΛ PIT AHOCDAA......TA5rfe F»§AARR FcnMJHQ I>VK ω VAUR VTAD> ΤΑΡΥΑΚΟΛΟΑΛ------TAALPS ΓϋιΛΑΑΑΚΛ FAXDHQLAVRAVAX.W VADA T^PYc5paLCS2laTn>eIC^3nQWCSFr(A®ss<5v>IKVKDA TAJnfa rceTrrcaCQQca----AAJ ρζαΓ03δορ!ι5 FAXKHQLANnLA IAJLHVADV T^VIK- -P- ->---TPXQ........arLADnvAEKQDOVVDi-AlKVTDA 33 s------------S.........SSK^»h-3^w<n9?5s9a ‘ ♦ · ! * ! · 20 30 VTFHV〇NAKjQAA5 rYGNXMOFHPLAYTlaLJrroWRKVVSIrv I KKQIC rvrvb VmnrVOK AXOAAmrVTRMO FKR 53aLB TOQ35 VX：S 1 tWUNOTf IT r IL AR1fKV§AKJQVA0nrIT5a3pv7UDCoL.rra3R FFXSliwomlavu rVF VK FVCAD ΑΛ5 ΑΛα » Γ ATAJUIAPtAARS DL8 TOZ3 AMXSoUJl w acaLA FXF <rts5biu»^»^wsroscccsas3z«>5teEwr»s^s?^ Mn3nap>d32s^»5rs»^»2so5Ha52CS^EWJ.W85?^ M«3noo>3H»5^a5rs^r<2Gaew3za<-?3?<««ss VVT><§AKOAA-HY(eTAroHQrVAYcr>o”EMQalLITA5rvLTMOSARFVL· IKLAJBPTPm-LMPIFBCMOrTKVATtlR-----Q3I0D! VIn/rFoaAIMrIr 00 Lno ......2ΤΓΥΝΝ· -KoPKipMaa---------------------aprllpuw ΚΑΡΑΛΡ3ρτδ-----IPAO*dSD............»Γ2------oYRorDI M/vpaAXrVTSoKaKHolprrDmDaYVP—Ar/VAXWGOcn——VKYRon; MPPT^TTPAA 丨 raAAAAVTPSDUlp----Jm-MVKFKI>RSDaFJnrLW3n M 匁 P T P T AAAAGAAVTUVA w ZVABQ AAFRrVG HRNFVRF KTas σ RFUTLAF m HanQKAAVrtw · ^NHDDO/VAS «"aoFKLVQFS KFVKKNP Λ(βσ KFKVKR FIΠI Maxxlo«HABIIirSSNWSHT»p>TFKLVaFNKFVIU\NlpKsalrFAVKRIMa ----ΜΤΟΤΤΗΠΤ----ΡΟΤΛΚΟδρ-----------------PJPVKGMDA -----MADLYHH-------5Q----------------------LMGFEP r O:\55\556ll.ptc 第 頁