TW202235433A - 治療腫瘤之方法 - Google Patents

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金賈爾 桑海維
曉誠 趙
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Abstract

本發明提供包含抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體之醫藥組合物。在一些態樣中，醫藥組合物經調配用於皮下遞送。在一些態樣中，該等醫藥組合物進一步包含內切糖苷酶水解酵素。本發明之其他態樣係關於皮下遞送包含抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體之醫藥組合物的方法。

Description

治療腫瘤之方法
本發明提供一種使用檢查點抑制劑，例如免疫療法治療罹患腫瘤之個體的方法。
人類癌症具有許多基因及表觀遺傳改變，產生潛在可由免疫系統識別之新抗原(Sjoblom等人, Science (2006) 314(5797):268-274)。由T及B淋巴球構成之適應性免疫系統具有強大的抗癌潛能，對不同腫瘤抗原作出反應的能力廣泛且特異性敏銳。另外，免疫系統展現相當大的可塑性及記憶分量。成功駕馭適應性免疫系統之所有此等特性將使得免疫療法在所有癌症治療模式當中成為獨一無二的。
直至最近，癌症免疫療法已將大量精力集中於藉由活化效應細胞之授受轉移、針對相關抗原之免疫或提供諸如細胞介素之非特異性免疫刺激劑來增強抗腫瘤免疫反應的方法上。然而，在過去十年中，開發特異性免疫檢查點路徑抑制劑之密集努力已開始為治療癌症提供新的免疫治療方法，包括開發特異性結合至計劃性死亡-1 (PD-1)受體且阻斷抑制性PD-1/PD-1配位體路徑的抗體，諸如納武單抗(nivolumab)及派立珠單抗(pembrolizumab) (以前稱為拉立珠單抗(lambrolizuma)；USAN Council Statement, 2013) (Topalian等人, 2012a, b；Topalian等人, 2014；Hamid等人, 2013；Hamid及Carvajal, 2013；McDermott及Atkins, 2013)。
當前遞送抗PD-1及/或抗PD-L1抗體之方法使用定期靜脈內投與，由臨床醫師通常在診所或醫院進行投與。治療之不便及侵襲性可能會不利地影響患者體驗。諸如經由使用自動注射器或可穿戴泵之皮下遞送可極大提高患者順應性。然而，在此項技術中仍需要包含適用於皮下遞送至患者之抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體之調配物。
本發明之某些態樣係關於一種治療有需要之個體的方法，其包含向該個體皮下投與一定劑量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含(i)特異性結合PD-1或PD-L1且抑制PD-1與PD-L1之相互作用的抗體(分別為「抗PD-1抗體」或「抗PD-L1抗體」)，及(ii)內切糖苷酶水解酵素；其中該劑量包含一或多個皮下單位劑量；且其中該劑量包含至少約300 mg至至少約2400 mg抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。
在一些態樣中，劑量包含兩個或更多個皮下單位劑量，其中兩個或更多個皮下單位劑量係同時或相繼投與。在一些態樣中，兩個或更多個皮下單位劑量係相繼投與，其中兩個或更多個皮下單位劑量中之每一者在皮下單位劑量之間約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約一小時、約兩小時、約三小時、約四小時、約五小時、約六小時、約九小時、約十二小時、約十八小時或約二十四小時的時間間隔內投與。在一些態樣中，約每一週、兩週、三週、四週、六週、八週投與該劑量。
在一些態樣中，抗體包含抗PD-1抗體。在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之250 mg至約600 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之約250 mg、約260 mg、約270 mg、約280 mg、約290 mg、約300 mg、約310 mg、約320 mg、約330 mg、約340 mg、約350 mg、約360 mg、約370 mg、約380 mg、約390 mg、約400 mg、約410 mg、約420 mg、約430 mg、約440 mg、約450 mg、約460 mg、約470 mg、約480 mg、約490 mg、約500 mg、約510 mg、約520 mg、約530 mg、約540 mg、約550 mg、約560 mg、約570 mg、約580 mg、約590 mg或約600 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之約300 mg。在一些態樣中，抗體之劑量包含約300 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以約2 mL總體積投與之約300 mg之單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體之劑量包含(i)兩個皮下單位劑量，其中兩個皮下單位劑量中之每一者包含約150 mg抗體；或(ii)三個皮下單位劑量，其中三個皮下單位劑量中之每一者包含約100 mg抗體。在一些態樣中，(i)向個體之相同身體位置投與兩個皮下單位劑量或(ii)向個體之相同身體位置投與三個皮下單位劑量中之至少兩者。
在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約300 mg至約900 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg、約500 mg、約510 mg、約520 mg、約530 mg、約540 mg、約550 mg、約560 mg、約570 mg、約580 mg、約590 mg、約600 mg、約610 mg、約620 mg、約630 mg、約640 mg、約650 mg、約660 mg、約670 mg、約680 mg、約690 mg、約700 mg、約710 mg、約720 mg、約730 mg、約740 mg、約750 mg、約760 mg、約770 mg、約780 mg、約790 mg、約800 mg、約810 mg、約820 mg、約830 mg、約840 mg、約850 mg、約860 mg、約870 mg、約880 mg、約890 mg或約900 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約600 mg。在一些態樣中，抗體之劑量包含單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個、三個或至少四個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個皮下單位劑量，其中兩個皮下單位劑量各自包含約300 mg抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，向個體之相同身體位置投與皮下單位劑量中之至少兩者。
在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之900 mg至約1500 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約900、約950、約1000 mg、約1010 mg、約1020 mg、約1030 mg、約1040 mg、約1050 mg、約1060 mg、約1070 mg、約1080 mg、約1090 mg、約1100 mg、約1110 mg、約1120 mg、約1130 mg、約1140 mg、約1150 mg、約1160 mg、約1170 mg、約1180 mg、約1190 mg、約1200 mg、約1210 mg、約1220 mg、約1230 mg、約1240 mg、約1250 mg、約1260 mg、約1270 mg、約1280 mg、約1290 mg、約1300 mg、約1310 mg、約1320 mg、約1330 mg、約1340 mg、約1350 mg、約1360 mg、約1370 mg、約1380 mg、約1390 mg、約1400 mg、約1410 mg、約1420 mg、約1430 mg、約1440 mg、約1450 mg、約1460 mg、約1470 mg、約1480 mg、約1490 mg或約1500 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約1200 mg。在一些態樣中，抗體之劑量包含單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含四個皮下單位劑量，其中四個皮下單位劑量各自包含約300 mg抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於2 mL之抗體。在一些態樣中，向個體之相同身體位置投與皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，在同一天投與兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體包含抗PD-L1抗體。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約900 mg至約1800 mg抗體。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約900、約950、約1000、約1010 mg、約1020 mg、約1030 mg、約1040 mg、約1050 mg、約1060 mg、約1070 mg、約1080 mg、約1090 mg、約1100 mg、約1110 mg、約1120 mg、約1130 mg、約1140 mg、約1150 mg、約1160 mg、約1170 mg、約1180 mg、約1190 mg、約1200 mg、約1210 mg、約1220 mg、約1230 mg、約1240 mg、約1250 mg、約1260 mg、約1270 mg、約1280 mg、約1290 mg、約1300 mg、約1310 mg、約1320 mg、約1330 mg、約1340 mg、約1350 mg、約1360 mg、約1370 mg、約1380 mg、約1390 mg、約1400 mg、約1410 mg、約1420 mg、約1430 mg、約1440 mg、約1450 mg、約1460 mg、約1470 mg、約1480 mg、約1490 mg、約1500 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週約1200 mg。在一些態樣中，劑量包含約1200 mg總投與體積大於約5 mL之單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，劑量包含兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含四個皮下單位劑量，其中四個皮下單位劑量各自包含約300 mg抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，向個體之相同身體位置投與皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，在同一天投與兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與內切糖苷酶水解酵素一起投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與內切糖苷酶水解酵素同時投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與內切糖苷酶水解酵素依序投與。
在一些態樣中，醫藥組合物以至少約1,000單位至至少約30,000單位內切糖苷酶水解酵素之劑量投與。在一些態樣中，醫藥組合物以至少約1000單位、至少約1500單位、至少約2000單位、至少約2500單位、至少約3000單位、至少約3500單位、至少約4000單位、至少約4500單位、至少約5000單位、至少約6000單位、至少約7000單位、至少約8000單位、至少約9000單位、至少約10,000單位、至少約11,000單位、至少約12,000單位、至少約13,000單位、至少約14,000單位、至少約15,000單位、至少約16,000單位、至少約17,000單位、至少約18,000單位、至少約19,000單位、至少約20,000單位、至少約21,000單位、至少約22,000單位、至少約23,000單位、至少約24,000單位、至少約25,000單位、至少約26,000單位、至少約27,000單位、至少約28,000單位、至少約29,000單位或至少約30,000單位內切糖苷酶水解酵素之劑量投與。在一些態樣中，醫藥組合物以約4000單位內切糖苷酶水解酵素之劑量投與。
在一些態樣中，醫藥組合物以(i)約300 mg抗體及(ii)約4000單位內切糖苷酶水解酵素之劑量投與，約每週一次。在一些態樣中，醫藥組合物以(i)約600 mg抗體及(ii)約8000單位內切糖苷酶水解酵素之劑量投與，約每兩週一次。在一些態樣中，醫藥組合物以(i)約1200 mg抗體及(ii)約20,000單位內切糖苷酶水解酵素之劑量投與，約每四週一次。在一些態樣中，醫藥組合物以(i)約1200 mg抗體及(ii)約8000單位內切糖苷酶水解酵素之劑量投與，約每兩週一次。在一些態樣中，醫藥組合物以(i)約1800 mg抗體及(ii)約12,000單位內切糖苷酶水解酵素之劑量投與，約每三週一次。
在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素在己糖胺酶β(1-4)或(1-3)鍵處裂解玻尿酸。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含玻尿酸酶PH-20 (HuPH20)、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4或HYALPS1之催化域。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸36-490具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含玻尿酸酶。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含選自由以下組成之群的玻尿酸酶：HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、其任何變異體及任何同功異型物。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含rHuPH20或其片段。
在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶包含一或多個胺基酸取代。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶在α-螺旋區中包含一或多個胺基酸取代。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶在連接子區中包含一或多個胺基酸取代。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，其中相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶，一或多個N末端及/或C末端胺基酸經缺失。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之rHuPH20，其中經修飾之rHuPH20包含：i.相對於野生型rHuPH20，在α-螺旋區、連接子區或α-螺旋區及連接子區兩者中之一或多個胺基酸取代；ii.相對於野生型rHuPH20，一或多個N末端胺基酸、一或多個C末端胺基酸或一或多個N末端胺基酸及一或多個C末端胺基酸之缺失；或iii.(i)及(ii)兩者。
在一些態樣中，抗PD-1抗體包含選自由以下組成之群的抗體：納武單抗(nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、PDR001、MEDI-0680、測米匹單抗(cemiplimab)、特瑞普利單抗(toripalimab)、替雷利珠單抗(tislelizumab)、INCSHR1210、TSR-042、GLS-010、AM-0001、STI-1110、AGEN2034、MGA012、BCD-100、IBI308及其任何組合。在一些態樣中，抗PD-1抗體與納武單抗交叉競爭結合至人類PD-1。在一些態樣中，抗PD-1抗體包含納武單抗。在一些態樣中，抗PD-1抗體包含派立珠單抗。
在一些態樣中，抗PD-L1抗體包含選自由以下組成之群的抗體：BMS-936559、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、阿維魯單抗(avelumab)、STI-1014、CX-072、KN035、LY3300054、BGB-A333、CK-301及其任何組合。
在一些態樣中，個體罹患癌症。在一些態樣中，癌症選自由以下組成之群：鱗狀細胞癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、鱗狀NSCLC、非鱗狀NSCLC、神經膠質瘤、胃腸癌、腎癌、透明細胞癌、卵巢癌、肝癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、腎細胞癌(RCC)、前列腺癌、激素難治性前列腺腺癌、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、膠質母細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、頭頸癌、胃癌、生殖細胞腫瘤、小兒肉瘤、鼻腔鼻竇自然殺手、黑素瘤、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門區癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、直腸癌、兒童實體腫瘤、尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦癌、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、環境誘發之癌症(包括石棉誘發之癌症)、病毒相關癌症或病毒起源之癌症(例如人類乳頭狀瘤病毒(HPV相關或起源之腫瘤))及其任何組合。
在一些態樣中，醫藥組合物係使用自動注射器投與。在一些態樣中，醫藥組合物係使用可穿戴泵投與。
在一些態樣中，藉由皮下輸注向個體投與醫藥組合物少於約10分鐘。在一些態樣中，藉由皮下輸注向個體投與醫藥組合物少於約5分鐘。
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含至少兩種抗氧化劑。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑係選自甲硫胺酸、色胺酸、組胺酸、半胱胺酸、抗壞血酸、甘胺酸、DTPA及EDTA。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含(i)甲硫胺酸及EDTA或(ii)甲硫胺酸及DTPA。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含至少約1至約20 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含至少約1 mM、至少約1.5 mM、至少約2 mM、至少約2.5 mM、至少約3 mM、至少約3.5 mM、至少約4 mM、至少約4.5 mM、至少約5 mM、至少約5.5 mM、至少約6 mM、至少約6.5 mM、至少約7 mM、至少約7.5 mM、至少約8 mM、至少約8.5 mM、至少約9 mM、至少約9.5 mM、至少約10 mM、至少約11 mM、至少約12 mM、至少約13 mM、至少約14 mM、至少約15 mM、至少約16 mM、至少約17 mM、至少約18 mM、至少約19 mM或至少約20 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含約5 mM甲硫胺酸。
在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含至少約10 µM至約200 µM DTPA。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含至少約10 µM、至少約15 µM、至少約20 µM、至少約25 µM、至少約30 µM、至少約35 µM、至少約40 µM、至少約45 µM、至少約50 µM、至少約55 µM、至少約60 µM、至少約65 µM、至少約70 µM、至少約75 µM、至少約80 µM、至少約85 µM、至少約90 µM、至少約95 µM、至少約100 µM、至少約110 µM、至少約120 µM、至少約130 µM、至少約140 µM、至少約150 µM、至少約160 µM、至少約170 µM、至少約180 µM、至少約190 µM或至少約200 µM DTPA。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含約50 µM DTPA。
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含張力調節劑及/或穩定劑。在一些態樣中，張力調節劑及/或穩定劑包含糖、胺基酸、多元醇、鹽或其組合。在一些態樣中，張力調節劑及/或穩定劑係選自由以下組成之群：蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、甘露糖醇、甘油、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、氯化鈉、脯胺酸、精胺酸、組胺酸及其任何組合。在一些態樣中，張力調節劑包含蔗糖。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約10 mM至至少約500 mM蔗糖。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約10 mM、至少約20 mM、至少約30 mM、至少約40 mM、至少約50 mM、至少約60 mM、至少約70 mM、至少約80 mM、至少約90 mM、至少約100 mM、至少約110 mM、至少約120 mM、至少約130 mM、至少約140 mM、至少約150 mM、至少約160 mM、至少約170 mM、至少約180 mM、至少約190 mM、至少約200 mM、至少約210 mM、至少約220 mM、至少約230 mM、至少約240 mM、至少約250 mM、至少約260 mM、至少約270 mM、至少約280 mM、至少約290 mM、至少約300 mM、至少約310 mM、至少約320 mM、至少約330 mM、至少約340 mM、至少約350 mM、至少約360 mM、至少約370 mM、至少約380 mM、至少約390 mM、至少約400 mM、至少約410 mM、至少約420 mM、至少約430 mM、至少約440 mM、至少約450 mM、至少約460 mM、至少約470 mM、至少約480 mM、至少約490 mM或至少約500 mM蔗糖。在一些態樣中，醫藥組合物包含約250 mM蔗糖。
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含緩衝劑。在一些態樣中，緩衝劑係選自組胺酸、丁二酸鹽、緩血酸胺、磷酸鈉、乙酸鈉及檸檬酸鈉。在一些態樣中，緩衝劑包含組胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約5 mM至至少約100 mM組胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約5 mM、至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約60 mM、至少約70 mM、至少約80 mM、至少約90 mM或至少約100 mM組胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含約20 mM組胺酸。
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含界面活性劑。在一些態樣中，界面活性劑選自由以下組成之群：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及泊洛沙姆188。在一些態樣中，界面活性劑包含聚山梨醇酯80。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.01% w/v至至少約0.1% w/v聚山梨醇酯80。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.01% w/v、至少約0.02% w/v、至少約0.03% w/v、至少約0.04% w/v、至少約0.05% w/v、至少約0.06% w/v、至少約0.07% w/v、至少約0.08% w/v、至少約0.09% w/v或至少約0.1% w/v聚山梨醇酯80。在一些態樣中，醫藥組合物包含約0.05% w/v聚山梨醇酯80。
在一些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約120 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸(pentetic acid)；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。
在一些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約120 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。
在一些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，醫藥組合物包含約5.2至約6.8之pH。在一些態樣中，醫藥組合物包含約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7或約6.8之pH。在一些態樣中，醫藥組合物包含約6.0之pH。
本發明之某些態樣係關於用於本文所揭示之任何方法之醫藥組合物。本發明之某些態樣係關於一種醫藥組合物，其包含(i)特異性結合PD-1之抗體(「抗PD-1抗體」)、(ii)內切糖苷酶水解酵素及(iii)至少兩種抗氧化劑。
在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約50 U/mL至至少約5000 U/mL內切糖苷酶水解酵素。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約50 U/mL、至少約100 U/mL、至少約150 U/mL、至少約200 U/mL、至少約250 U/mL、至少約300 U/mL、至少約350 U/mL、至少約400 U/mL、至少約450 U/mL、至少約500 U/mL、至少約750 U/mL、至少約1000 U/mL、至少約1500 U/mL、至少約2000 U/mL、至少約2500 U/mL、至少約3000 U/mL、至少約3500 U/mL、至少約4000 U/mL、至少約4500 U/mL、至少約5000 U/mL、至少約5500 U/mL、至少約6000 U/mL、至少約6500 U/mL、至少約7000 U/mL、至少約7500 U/mL、至少約8000 U/mL、至少約8500 U/mL、至少約9000 U/mL、至少約9500 U/mL、至少約10,000 U/mL內切糖苷酶水解酵素。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約500 U/mL內切糖苷酶水解酵素。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約1000 U/mL內切糖苷酶水解酵素。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約2000 U/mL內切糖苷酶水解酵素。
在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素在己糖胺酶β(1-4)或(1-3)鍵處裂解玻尿酸。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含玻尿酸酶PH-20 (HuPH20)、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4或HYALPS1之催化域。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸36-490具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含玻尿酸酶。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含選自由以下組成之群的玻尿酸酶：HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、其任何變異體及任何同功異型物。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含rHuPH20或其片段。
在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶包含一或多個胺基酸取代。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶在α-螺旋區中包含一或多個胺基酸取代。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶在連接子區中包含一或多個胺基酸取代。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，其中相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶，一或多個N末端及/或C末端胺基酸經缺失。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之rHuPH20，其中經修飾之rHuPH20包含：(i)相對於野生型rHuPH20，在α-螺旋區、連接子區或α-螺旋區及連接子區兩者中之一或多個胺基酸取代；(ii)相對於野生型rHuPH20，一或多個N末端胺基酸、一或多個C末端胺基酸或一或多個N末端胺基酸及一或多個C末端胺基酸之缺失；或(iii) (i)及(ii)兩者。
在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑係選自甲硫胺酸、色胺酸、組胺酸、半胱胺酸、抗壞血酸、甘胺酸、DTPA及EDTA。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含(i)甲硫胺酸及EDTA或(ii)甲硫胺酸及DTPA。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含至少約1至約20 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含至少約1 mM、至少約1.5 mM、至少約2 mM、至少約2.5 mM、至少約3 mM、至少約3.5 mM、至少約4 mM、至少約4.5 mM、至少約5 mM、至少約5.5 mM、至少約6 mM、至少約6.5 mM、至少約7 mM、至少約7.5 mM、至少約8 mM、至少約8.5 mM、至少約9 mM、至少約9.5 mM、至少約10 mM、至少約11 mM、至少約12 mM、至少約13 mM、至少約14 mM、至少約15 mM、至少約16 mM、至少約17 mM、至少約18 mM、至少約19 mM或至少約20 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含約5 mM甲硫胺酸。
在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含至少約10 µM至約200 µM DTPA。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含至少約10 µM、至少約15 µM、至少約20 µM、至少約25 µM、至少約30 µM、至少約35 µM、至少約40 µM、至少約45 µM、至少約50 µM、至少約55 µM、至少約60 µM、至少約65 µM、至少約70 µM、至少約75 µM、至少約80 µM、至少約85 µM、至少約90 µM、至少約95 µM、至少約100 µM、至少約110 µM、至少約120 µM、至少約130 µM、至少約140 µM、至少約150 µM、至少約160 µM、至少約170 µM、至少約180 µM、至少約190 µM或至少約200 µM DTPA。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含約50 µM DTPA。
在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約20 mg/mL至至少約200 mg/mL抗PD-1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約135 mg/mL至至少約180 mg/mL抗PD-1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約108 mg/mL至至少約132 mg/mL抗PD-1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約20 mg/mL、至少約30 mg/mL、至少約40 mg/mL、至少約50 mg/mL、至少約60 mg/mL、至少約70 mg/mL、至少約80 mg/mL、至少約90 mg/mL、至少約100 mg/mL、至少約110 mg/mL、至少約120 mg/mL、至少約130 mg/mL、至少約140 mg/mL、至少約150 mg/mL、至少約160 mg/mL、至少約170 mg/mL、至少約180 mg/mL、至少約190 mg/mL或至少約200 mg/mL抗PD-1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含約120 mg/mL抗PD-1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含約150 mg/mL抗PD-1抗體。
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含張力調節劑及/或穩定劑。在一些態樣中，張力調節劑及/或穩定劑包含糖、胺基酸、多元醇、鹽或其組合。在一些態樣中，張力調節劑及/或穩定劑係選自由以下組成之群：蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、甘露糖醇、甘油、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、氯化鈉、脯胺酸、精胺酸、組胺酸及其任何組合。在一些態樣中，張力調節劑包含蔗糖。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約10 mM至至少約500 mM蔗糖。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約10 mM、至少約20 mM、至少約30 mM、至少約40 mM、至少約50 mM、至少約60 mM、至少約70 mM、至少約80 mM、至少約90 mM、至少約100 mM、至少約110 mM、至少約120 mM、至少約130 mM、至少約140 mM、至少約150 mM、至少約160 mM、至少約170 mM、至少約180 mM、至少約190 mM、至少約200 mM、至少約210 mM、至少約220 mM、至少約230 mM、至少約240 mM、至少約250 mM、至少約260 mM、至少約270 mM、至少約280 mM、至少約290 mM、至少約300 mM、至少約310 mM、至少約320 mM、至少約330 mM、至少約340 mM、至少約350 mM、至少約360 mM、至少約370 mM、至少約380 mM、至少約390 mM、至少約400 mM、至少約410 mM、至少約420 mM、至少約430 mM、至少約440 mM、至少約450 mM、至少約460 mM、至少約470 mM、至少約480 mM、至少約490 mM或至少約500 mM蔗糖。在一些態樣中，醫藥組合物包含約250 mM蔗糖。
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含緩衝劑。在一些態樣中，緩衝劑係選自組胺酸、丁二酸鹽、緩血酸胺、磷酸鈉、乙酸鈉及檸檬酸鈉。在一些態樣中，緩衝劑包含組胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約5 mM至至少約100 mM組胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約5 mM、至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約60 mM、至少約70 mM、至少約80 mM、至少約90 mM或至少約100 mM組胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含約20 mM組胺酸。
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含界面活性劑。在一些態樣中，界面活性劑選自由以下組成之群：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及泊洛沙姆188。在一些態樣中，界面活性劑包含聚山梨醇酯80。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.01% w/v至至少約0.1% w/v聚山梨醇酯80。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.01% w/v、至少約0.02% w/v、至少約0.03% w/v、至少約0.04% w/v、至少約0.05% w/v、至少約0.06% w/v、至少約0.07% w/v、至少約0.08% w/v、至少約0.09% w/v或至少約0.1% w/v聚山梨醇酯80。在一些態樣中，醫藥組合物包含約0.05% w/v聚山梨醇酯80。
在一些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約120 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，醫藥組合物包含約5.2至約6.8之pH。在一些態樣中，醫藥組合物包含約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7或約6.8之pH。在一些態樣中，醫藥組合物包含約6.0之pH。
本發明之某些態樣係關於一種包含本文所揭示之任何醫藥組合物的單位劑量。
本發明之某些態樣係關於一種單位劑量，其包含：(a)約120 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
本發明之某些態樣係關於一種單位劑量，其包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含第二治療劑。在一些態樣中，第二治療劑為抗體。在一些態樣中，第二治療劑為檢查點抑制劑。在一些態樣中，檢查點抑制劑為抗CTLA-4抗體、抗LAG-3抗體、抗TIM3抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、抗NKG2a抗體、抗OX40抗體、抗ICOS抗體、抗MICA抗體、抗CD137抗體、抗KIR抗體、抗TGFβ抗體、抗IL-10抗體、抗IL-8抗體、抗-B7-H4抗體、抗Fas配位體抗體、抗CXCR4抗體、抗間皮素抗體、抗CD27抗體、抗GITR或其任何組合。在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含第三治療劑。在一些態樣中，第二治療劑、第三治療劑或兩者包含IL-2 (例如貝培阿地介白素(bempegaldesleukin))或IL12-Fc (例如BMS-986415)。
本發明之某些態樣係關於包含本文所揭示之任何醫藥組合物或本文所揭示之任何單位劑量的小瓶。
在一些態樣中，該小瓶為自動注射器。本發明之某些態樣係關於包含本文所揭示之任何醫藥組合物或本文所揭示之任何單位劑量的自動注射器。
在一些態樣中，該小瓶為可穿戴泵。本發明之某些態樣係關於包含本文所揭示之任何醫藥組合物或本文所揭示之任何單位劑量的可穿戴泵。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年12月28日申請之美國臨時申請案第US 63/131,240號；2021年2月17日申請之US 63/150,420；及2021年5月4日申請之US 63/184,082之優先權及權益；其各自以全文引用之方式併入本文中。
當前遞送抗PD-1及/或抗PD-L1抗體之方法需要定期靜脈內投與，由臨床醫師通常在診所或醫院進行投與。此方案通常給患者帶來很大不便，且治療本身之性質會對患者體驗產生負面影響。皮下遞送，諸如經由使用自動注射器或可穿戴泵可極大提高患者順應性，可能使患者在自己舒適的家中接受此可能挽救生命的療法。本發明提供一種治療有需要之個體的方法，其包含向個體皮下投與一定劑量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含(i)特異性結合PD-1或PD-L1且抑制PD-1與PD-L1之相互作用的抗體(分別為「抗PD-1抗體」或「抗PD-L1抗體」)。在一些態樣中，該醫藥組合物進一步包含(ii)內切糖苷酶水解酵素。在一些態樣中，劑量包含一或多個皮下單位劑量。
在一些態樣中，該醫藥組合物不包含內切糖苷酶水解酵素。在一些態樣中，皮下單位劑量中之至少一者的總體積為小於約5 mL (例如，小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約3 mL或小於約2.5 mL)。在某些態樣中，劑量包含至少約250 mg至至少約2400 mg抗體。 I.   術語
為了使本發明更易理解，首先定義某些術語。如本申請案中所用，除非本文中另外明確提供，否則以下術語中之每一者應具有以下闡述之含義。額外的定義在整個申請案中均有闡述。
應瞭解每當本文中用語言「包含」描述態樣時，則亦提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」所描述之類似態樣。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。舉例而言，the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 第3版, 1999, Academic Press；及the Oxford Dictionary of Biochemistry And Molecular Biology, 經修訂, 2000, Oxford University Press向此項技術者提供本發明中所用之許多術語的通用辭典。
單位、字首及符號以其國際單位制(Système International de Unites；SI)公認之形式表示。數值範圍包括界定該範圍之數字。除非另外指示，否則核苷酸序列沿5'至3'方向自左向右書寫。胺基酸序列以胺基至羧基取向自左向右書寫。本文提供之標題並非本發明之各種態樣或態樣的限制，其可作為整體由說明書提及。因此，下文緊接著定義之術語由整個說明書更充分定義。
「投與」係指使用熟習此項技術者已知之多種方法及傳遞系統中之任一中以將包含治療劑之組合物物理引入至個體。投與可指免疫療法之任何形式投與，例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體包括靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、脊椎或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。片語「皮下投與」及「皮下注射」可互換使用且係指投與模式，其中物質，例如包含特異性結合PD1或PD-L1且抑制PD1與PD-L1之相互作用之抗體的組合物在皮膚下、在真皮與例如肌肉之間遞送至個體。
皮下投與可使用任何方法達成。在一些態樣中，皮下投與係使用短針或複數個短針達成。在一些態樣中，該針或該複數個針中之至少一者小於約1吋、小於約7/8吋、小於約6/8吋、小於約5/8吋、小於約1/2吋。在一些態樣中，該針或該複數個針中之至少一者之長度為約5/8吋。
投與可例如執行一次、複數次及/或經一或多個延長之週期。因此，如本文所用，投與可指單一單位劑量或超過一個單位劑量。
如本文所用，術語「劑量(dose)」或「劑量(dosage)」定義為可在給定點投與之治療劑的量。劑量或劑量可為足以達成或至少部分達成所需作用之量，但此類所需作用可能不可見或不可偵測。藥物或治療劑之「治療有效量」或「治療有效劑量」為當單獨或與另一治療劑組合使用時，促進疾病消退的藥物之任何量，該疾病消退由以下證明：疾病症狀之嚴重程度降低、疾病無症狀時段之頻率及持續時間增加、總存活期增加(自診斷出疾病(諸如癌症)的日期或對疾病起始治療開始，診斷患有該疾病的患者仍存活的時間長度)或預防因患病所致之損傷或失能。藥物之量或劑量包括「預防有效量」或「預防有效劑量」，其為當單獨或與另一治療劑組合向具有患上疾病或罹患疾病復發之風險的個體投與時，抑制該疾病之發展或復發的藥物之任何量。治療劑促進疾病消退或抑制疾病發展或復發之能力可使用熟習此項技術者可用之多種方法(諸如在臨床試驗期間在人類個體中、在預測人類中之功效的動物模型系統中，或藉由在活體外分析中分析藥劑之活性)來評價。「劑量」可包含單一單位劑量或多個單位劑量。在一些態樣中，劑量包含單一單位劑量。在一些態樣中，劑量包含多個單位劑量。
如本文所用，皮下「單位劑量」係指藉由皮下注射，例如自單一小瓶、單一自動注射器及/或單一注射器遞送之物質的單一量。在一些態樣中，投與多個皮下劑量以達成治療有效劑量。當投與多個單位劑量時，可同時或依序投與個別單位劑量。在一些態樣中，治療有效劑量之各單位劑量在同一天投與。各單位劑量可在相同身體位置或在不同身體位置投與。在一些態樣中，第一單位劑量係在第一身體位置處投與，且第二單位劑量係在第二身體位置處投與。此項技術中已知適合於皮下遞送之任何身體位置均可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，向選自手臂(例如上臂之側面或背面)、腹部及大腿前部之身體位置投與該劑量之至少一個皮下單位劑量。
如本文所用，「不良事件」(AE)為與醫學治療之使用相關聯之任何不利且一般不希望或不合意跡象(包括異常實驗室研究結果)、症狀或疾病。舉例而言，不良事件可與回應於治療之免疫系統活化或免疫系統細胞(例如T細胞)擴增相關聯。醫學治療可具有一或多個相關AE且各AE可具有相同或不同的嚴重程度水準。提及能夠「改變不良事件」之方法意謂降低與不同治療方案之使用相關之一或多個AE的發生率及/或嚴重程度的治療方案。
「抗體」(Ab)應包括但不限於特異性結合至抗原且包含藉由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈的醣蛋白免疫球蛋白或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為V H )及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個恆定結構域C H 1、C H 2及C H 3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為V L )及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個恆定域C L 。V H 及V L 區可進一步細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插有稱為構架區(FR)之更保守區。各V H 及V L 包含三個CDR及四個FR，其自胺基端至羧基端按以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括與免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)的結合。因此，術語「抗PD-1抗體」包括具有特異性結合至完全抗體之PD-1及抗原結合部分之兩條重鏈及兩條輕鏈的完全抗體。抗原結合部分之非限制性實例展示於本文別處。
免疫球蛋白可來源於任一通常已知同型，包括但不限於IgA、分泌性IgA、IgG及IgM。IgG子類亦為熟習此項技術者所熟知，且包括但不限於人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別或子類(例如，IgM或IgG1)。術語「抗體」包括例如天然存在與非天然存在之抗體；單株及多株抗體；嵌合及人類化抗體；人類或非人類抗體；完全合成抗體；以及單鏈抗體。非人類抗體可藉由重組方法進行人類化以降低其在人體中之免疫原性。在未明確陳述之情況下，且除非上下文另外指示，否則術語「抗體」亦包括任一前述免疫球蛋白的抗原結合片段或抗原結合部分，且包括單價及二價片段或部分，及單鏈抗體。
在一些態樣中，本發明之「抗體」能夠結合至超過一種抗原，例如「多特異性」抗體或「雙特異性」抗體。如本文所用，「雙特異性」抗體為能夠特異性結合兩種抗原之抗體，其中第一及第二抗原相同或不同。如本文所用，「多特異性」抗體能夠特異性結合超過一種抗原，例如至少兩種(亦即「雙特異性」抗體)、至少三種(亦即「三特異性」抗體)、至少四種、至少五種或至少六種抗原。已知多種多特異性抗體且可用於本文所揭示之組合物及/或方法中，包括但不限於結合PD-1及第二標靶之雙特異性抗體及結合PD-L1及第二標靶之雙特異性抗體。在一些態樣中，多特異性抗體為T細胞依賴性雙特異性抗體。在一些態樣中，多特異性抗體為靶向B細胞譜系標記FcRH5及CD3之抗FcRH5/CD3雙特異性抗體，例如用於治療多發性骨髓瘤。
在一些態樣中，本發明之「抗體」經工程化以在目標位點處活化，例如「前抗體」。在一些態樣中，抗體(例如前抗體)在目標組織(例如腫瘤)處蛋白水解裂解。
「經分離抗體」係指基本上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合至PD-1之經分離抗體基本上不含特異性結合至除PD-1以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合PD-1之經分離抗體可與其他抗原，諸如來自不同物種之PD-1分子具有交叉反應性。此外，經分離抗體可基本上不含其他細胞材料及/或化學物質。
術語「單株抗體」(「mAb」)係指分子組成單一的非天然存在之抗體分子製劑，亦即，初級序列實質上一致且對特定抗原決定基展現單一結合特異性及親和力的抗體分子。單株抗體為分離抗體之一實例。單株抗體可藉由融合瘤、重組、轉殖基因或熟習此項技術者已知之其他技術產生。
「人類抗體」(HuMAb)係指具有可變區的抗體，其中構架區與CDR區均來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。另外，若該抗體含有恆定區，則該恆定區亦來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定點誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文所用，術語「人類抗體」並不意欲包括源自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系之CDR序列已移植於人類構架序列上的抗體。術語「人類抗體」與「完全人類抗體」同義使用。
「人類化抗體」係指一種抗體，其中非人類抗體CDR外部之一些、大部分或所有胺基酸經來源於人類免疫球蛋白的相應胺基酸置換。在抗體之人類化形式的一個態樣中，CDR外部之一些、大部分或所有胺基酸已經來自人類免疫球蛋白的胺基酸置換，而一或多個CDR內定一些、大部分或所有胺基酸不變。胺基酸之少量添加、缺失、插入、取代或修飾為可容許的，只要其不消除抗體結合至特定抗原之能力即可。「人類化抗體」保留類似於原始抗體之抗原特異性。
「嵌合抗體」係指其中可變區來源於一種物種而恆定區來源於另一物種之抗體，諸如其中可變區來源於小鼠抗體而恆定區來源於人類抗體之抗體。
「抗抗原抗體」係指特異性結合至抗原之抗體。舉例而言，抗PD-1抗體特異性結合至PD-1，且抗PD-L1抗體特異性結合至PD-L1。
抗體之「抗原結合部分」(亦稱為抗原結合片段)係指抗體之一或多個片段，該等片段保留特異性結合至全抗體所結合之抗原之能力。已顯示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來進行。涵蓋在本文所述之術語抗體(例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體)之「抗原結合部分」內之結合片段之實例包括：(i) Fab片段(來自番木瓜蛋白酶裂解之片段)或類似一價片段，其由V L、V H、LC及CH1域組成；(ii) F(ab')2片段(來自胃蛋白酶裂解之片段)或類似二價片段，其包含藉由鉸鏈區處之二硫橋鍵連接之兩個Fab片段；(iii) Fd片段，其由V H及CH1域組成；(iv) Fv片段，其由抗體之單一臂之V L及V H域組成；(v) dAb片段(Ward等人, (1989) Nature341:544-546)，其由V H域組成；(vi)經分離之互補決定區(CDR)；及(vii)兩個或更多個經分離之CDR的組合，該等CDR可視情況藉由合成連接子接合。此外，儘管Fv片段之兩個域(V L及V H)由各別基因編碼，然而其可使用重組方法、藉由合成連接子連接，該合成連接子能夠使其以單一蛋白質鏈形式產生，其中V L與V H區成對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如Bird等人, (1988) Science242:423-426；及Huston等人, (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA85:5879-5883)。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術來獲得，且以與完整抗體相同之方式來篩選供使用之片段。抗原結合部分可藉由重組型DNA技術，或藉由完整免疫球蛋白之酶促或化學裂解來產生。
「癌症」係指特徵為異常細胞在體內不受控生長之一組廣泛的多種疾病。不受控細胞分裂及生長分裂且生長導致形成侵入鄰近組織且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部分的惡性腫瘤。
術語「免疫療法」係指藉由包含誘導、提高、抑制或以其他方式改良免疫反應之方法治療罹患疾病或處於感染或遭受疾病復發之風險中的個體。個體之「治療」或「療法」係指在個體上進行之任何類型之介入或過程，或向個體投與活性劑，目標為逆轉、緩解、改善、抑制、減緩或防止發作、進展、發展、嚴重程度或復發症狀、併發症或病狀或與疾病相關之生物化學標誌。
「計劃性死亡-1」(PD-1)係指屬於CD28家族之免疫抑制性受體。PD-1在活體內主要在先前活化之T細胞上表現，且結合至兩種配位體PD-L1與PD-L2。如本文所用，術語「PD-1」包括人類PD-1 (hPD-1)、hPD-1之變異體、同功異型物及物種同源物，及具有hPD-1之至少一種常見抗原決定基之類似物。可依據GenBank寄存編號U64863找到完整的hPD-1序列。
「計劃性死亡配位體-1」(PD-L1)為PD-1之兩種細胞表面醣蛋白配位體之一(另一者為PD-L2)，其在結合至PD-1後下調T細胞活化及細胞介素分泌。如本文所用，術語「PD-L1」包括人類PD-L1 (hPD-L1)、hPD-L1之變異體、同功異型物及物種同源物，以及與hPD-L1具有至少一個共同抗原決定基之類似物。可依據Genbank寄存編號Q9NZQ7找到完整hPD-L1序列。人類PD-L1蛋白由人類CD274基因(NCBI基因ID：29126)編碼。
如本文所用，「玻尿酸酶」係指能夠催化玻尿酸裂解之酶。玻尿酸為N-乙醯基-葡糖胺及葡糖醛酸之重複聚合物，其存在於皮下空間中且促成皮膚之細胞外基質之可溶性凝膠狀組分且藉由快速轉換(再合成)恢復。在一些態樣中，玻尿酸酶包含rHuPH20，其為醣基化447個胺基酸之單鏈多肽，在皮膚中之注射部位局部解聚皮下空間中之玻尿酸。玻尿酸酶對玻尿酸之解聚係藉由多醣聚合物之水解實現。玻尿酸之解聚使得細胞外基質之凝膠狀相的黏度瞬時降低且增加水力傳導，促進共投與治療劑之分散及吸收。因此，玻尿酸酶，例如rHuPH20可藉由充當滲透增強劑來改良可注射生物製劑及藥物之皮下遞送速度及簡易性。在某些態樣中，玻尿酸酶包含ENHANZE TM。
「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括但不限於脊椎動物，諸如非人類靈長類動物、羊、狗及嚙齒動物，諸如小鼠、大鼠及天竺鼠。在較佳態樣中，個體為人類。術語「個體」與「患者」在本文中可互換使用。
關於本發明之方法及劑量使用的術語「均一劑量」意謂向患者投與的不考慮患者體重或體表面積(BSA)之劑量。因此，均一劑量不以mg/kg劑量形式提供，而實際上以藥劑(例如抗PD-1抗體)之絕對量形式提供。舉例而言，60 kg人及100 kg人應接受相同劑量之抗體(例如，240 mg抗PD-1抗體)。
如本文所提及，術語「基於體重之劑量」意謂投與至患者之劑量係基於患者之重量而計算的。舉例而言，當60 kg體重之患者需要3 mg/kg抗PD-1抗體時，吾人可計算及使用適當量之抗PD-1抗體(亦即，180 mg)進行投與。
舉例而言，「抗癌劑」促進個體內之癌症消退。在一些態樣中，治療有效量之藥物促進癌症消退至消除癌症之點。「促進癌症消退」意謂投與有效量的單獨或與抗腫瘤劑組合之藥物，使得腫瘤生長或尺寸減小、腫瘤壞死、至少一種疾病症狀的嚴重程度降低、無疾病症狀之時間段之頻率及持續時間增加，或防止由於疾病病痛而損傷或失能。另外，關於治療之術語「有效」及「有效性」包括藥理學有效性及生理學安全性兩者。藥理學效用係指藥物促進患者中之癌症消退之能力。生理學安全性係指由藥物投藥引起的毒性水準或細胞、器官及/或生物體水準下之其他不良生理學作用(副作用)。
作為腫瘤之治療之實例，與未經治療之個體相比，治療有效量之抗癌劑較佳抑制細胞生長或腫瘤生長至少約20%，較佳至少約40%，更佳至少約60%，且更佳至少約80%。在本發明之其他較佳態樣中，可觀測到腫瘤消退且持續至少約20天、更佳至少約40天或甚至更佳至少約60天之時段。不管治療有效性之此等最終量測結果，免疫治療藥物的評估必須亦考慮到免疫相關反應模式。
「免疫反應」如在此項技術中所理解，且一般係指脊椎動物內針對外來藥劑或異常(例如癌細胞)之生物反應，該反應保護生物體免受此等藥劑及由其造成之疾病的影響。免疫反應由免疫系統之一或多種細胞(例如T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞或嗜中性球)及由此等細胞中之任一者或肝臟產生之可溶性大分子(包括抗體、細胞介素及補體)的作用介導，該作用引起對侵入性病原體、感染有病原體之細胞或組織、癌細胞或其他異常細胞或在自體免疫或病理性炎症之情況下之正常人類細胞或組織的選擇性靶向、與其結合、使其受損、受到破壞及/或自脊椎動物中消除。免疫反應包括例如對T細胞(例如效應T細胞、Th細胞、CD4 +細胞、CD8 +T細胞或Treg細胞)之活化或抑制，或對免疫系統之任何其他細胞(例如NK細胞)的活化或抑制。
「免疫相關反應模式」係指用藉由誘導癌症特異性免疫反應或藉由改良原生免疫過程產生抗腫瘤作用之免疫治療劑治療的癌症患者中通常觀測到的臨床反應模式。此反應模式特徵為在腫瘤負荷之最初增加或新病灶出現(其在傳統化學治療劑的評估中將歸類為疾病進展且將與藥物失效同義)之後的有益治療作用。因此，免疫治療劑之適當評估可能需要長期監測此等試劑對目標疾病之作用。
如本文所用，關於調配物或藥品之術語「穩定」為一或多種抗體或其中之分子在儲存時基本上保持其物理及化學穩定性及完整性的術語。可在所選時段之後在所選溫度下量測本文中調配物之穩定性。舉例而言，聚集體形成或低分子量物種之增加為不穩定性之指標。在整個存放期內保持原始透明度及/或顏色亦為用於監測穩定性之指標。在一些態樣中，「穩定」藥品為如下藥品：其中當調配物在2-8℃下儲存至少約一年時，聚集增加小於約5%，且較佳小於約3%，如藉由高分子量物種百分比(%HMW)之增加所量測。
如本文所使用，術語「治療(treat/treating/treatment)」係指以逆轉、緩解、改善、抑制或減緩或預防疾病相關症狀、併發症、病況或生物化學標誌之進展、發展、嚴重程度或復發或增強總存活期為目標，來對個體執行之任何類型的干預或方法或向個體投與活性劑。可治療患有疾病之個體或未患疾病之個體(例如用於預防)。
如本文所用，術語「約每週」、「約每兩週」或任何其他類似給藥時間間隔術語意謂近似數值。「約每週」可包括每七天±一天，亦即每六天至每八天。「約每兩週」可包括每十四天±三天，亦即每十一天至每十七天。類似近似值例如適用於約每三週、約每四週、約每五週、約每六週及約每十二週。在一些態樣中，約每六週或約每十二週之給藥時間間隔意謂第一劑量可在第一週中之任一天投與且接著下一劑量可分別在第六週或第十二週中之任一天投與。在其他態樣中，約每六週或約每十二週之給藥時間間隔意謂第一劑量在第一週之特定天(例如星期一)投與且接著下一劑量分別在第六或第十二週之相同天(亦即星期一)投與。當投與多個皮下單位劑量以達到劑量時，給藥時間間隔係指在投與第一有效劑量之第一皮下單位劑量與第二有效劑量之第一皮下單位劑量之間的時段。舉例而言，在該方法包含約每兩週投與約600 mg之劑量的情況下，其中抗體之劑量包含兩個皮下單位劑量，其中兩個皮下單位劑量中之每一者包含約300 mg抗體，在第1天投與約300 mg第一抗體有效劑量之第一皮下單位劑量且在約第14天投與約300 mg第二抗體有效劑量之第一皮下單位劑量。在此實例中，可在第1天或在投與約300 mg第二抗體有效劑量之第一皮下單位劑量之前的任何其他時間投與約300 mg第一抗體有效劑量之第二單位劑量。
使用替代方案(例如「或」)應理解為意謂替代方案中之一者、兩者或其任何組合。應理解，如本文所用，不定冠詞「一種(a)」或「一種(an)」係指任何敍述或列舉之組分的「一或多者」。
術語「約」或「基本上包含」係指如藉由一般熟習此項技術者所確定，在特定值或組合物之可接受誤差範圍內之值或組合物，其將部分地取決於如何量測或確定值或組合物，亦即量測系統之侷限性。舉例而言，「約」或「基本上由……構成」可意謂根據此項技術中之實踐在一個或大於一個標準偏差內。或者，「約」或「基本上包含」可意謂至多10%之範圍。此外，尤其在生物系統或方法方面，該等術語可意謂值之至多一個數量級或至多5倍。當特定值或組合物提供於本申請案及申請專利範圍中時，除非另外陳述，否則「約」或「基本上包含」之含義應假設為在特定值或組合物之可接受的誤差範圍內。
如本文所述，除非另外規定，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所列舉範圍內之任何整數值及(在適當時)其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。
在以下子章節中進一步詳細描述本發明之各種態樣。    II.   本發明之方法
本發明之一些態樣係關於治療有需要之個體的方法，其包含向個體皮下投與一定劑量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含(i)特異性結合PD-1或PD-L1且抑制PD-1與PD-L1之相互作用的抗體(分別為「抗PD-1抗體」或「抗PD-L1抗體」)。在一些態樣中，醫藥組合物包含(ii)內切糖苷酶水解酵素。在一些態樣中，劑量可為治療有效劑量。在一些態樣中，劑量包含一或多個皮下單位劑量。在一些態樣中，劑量包含至少約300 mg至至少約2400 mg抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。
在一些態樣中，該醫藥組合物不包含內切糖苷酶水解酵素。在一些態樣中，皮下單位劑量中之至少一者的總體積為小於約5 mL (例如，小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約3 mL或小於約2.5 mL。在某些態樣中，治療有效劑量包含至少約250 mg至至少約2400 mg抗體。在一些態樣中，醫藥組合物不包含促進皮下遞送之酶。在某些態樣中，醫藥組合物不包含玻尿酸酶。 II.A.   給藥
在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含單一皮下單位劑量，例如整個劑量作為單一單位劑量投與。在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含兩個或更多個皮下單位劑量，例如有效單位劑量分為兩個或更多個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含至少兩個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含至少三個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含至少四個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含至少五個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含至少六個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含至少七個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含至少八個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含至少九個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之治療有效劑量包含十個或更多個皮下單位劑量。
在一些態樣中，各皮下單位劑量在同一天投與。在一些態樣中，在第一天投與一或多個皮下單位劑量，且在第二天投與相同治療有效劑量之一或多個皮下單位劑量。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係依序投與。在一些態樣中，相同有效劑量之第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係依序投與，其中第二皮下單位劑量係在第一皮下單位劑量之後小於約5分鐘、小於約10分鐘、小於約15分鐘、小於約20分鐘、小於約25分鐘、小於約30分鐘、小於約45分鐘、小於約60分鐘、小於約75分鐘、小於約90分鐘、小於約2小時、小於約2.5小時、小於約3小時、小於約3.5小時、小於約4小時、小於約4.5小時、小於約5小時、小於約5.5小時、小於約6小時、小於約7小時、小於約8小時、小於約9小時、小於約12小時、小於約18小時或小於約24小時投與。在一些態樣中，兩個或更多個皮下單位劑量係相繼投與，其中兩個或更多個皮下單位劑量中之每一者係在皮下單位劑量小於約10分鐘、小於約15分鐘、小於約20分鐘、小於約25分鐘、小於約30分鐘、小於約45分鐘、小於約1小時、小於約2小時、小於約3小時、小於約4小時、小於約5小時、小於約6小時、小於約7小時、小於約8小時、小於約9小時、小於約10小時、小於約11小時、小於約12小時、小於約15小時、小於約18小時、小於約21小時或小於約24小時之時間間隔內投與。
在一些態樣中，一或多個皮下單位劑量係在一或多個身體位置投與。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在相同身體位置投與。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置及第二身體位置處投與，其中該第一身體位置與該第二身體位置不相同。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，其中該第一身體位置與該第二身體位置不相同。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量及第四皮下劑量係在第二身體位置處投與，其中該第一身體位置與該第二身體位置不相同。在一些態樣中，第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，其中該第一身體位置、該第二身體位置及該第三身體位置不同。在一些態樣中，第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與，其中該第一身體位置、該第二身體位置、該第三身體位置及該第四身體位置不同。
如本文所用，其中至少兩個皮下單位劑量係在相同身體位置投與，該兩個皮下劑量可在精確相同的注射部位處或在相同身體位置內之鄰近注射部位處投與。舉例而言，向單一身體位置投與之兩個皮下劑量均可向個體之右臂投與。在此實例中，只要向例如右臂投與兩個皮下劑量，則向如本文所用之相同「身體位置」投與兩個皮下單位劑量。
治療有效劑量及/或皮下劑量可如本文所揭示使用任何方法或裝置皮下投與。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下劑量係使用注射器投與。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下劑量係使用自動注射器投與。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下劑量係使用注射筆投與。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下劑量係使用可穿戴泵投與。
在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下單位劑量係藉由皮下輸注投與小於約30分鐘、小於約25分鐘、小於約20分鐘、小於約15分鐘、小於約14分鐘、小於約13分鐘、小於約12分鐘、小於約11分鐘、小於約10分鐘、小於約9分鐘、小於約8分鐘、小於約7分鐘、小於約6分鐘、小於約5分鐘、小於約4分鐘、小於約3分鐘或小於約2分鐘。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下單位劑量係藉由皮下輸注投與小於約90秒、小於約75秒、小於約60秒、小於約45秒、小於約30秒、小於約15秒或小於約10秒。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下單位劑量係藉由皮下輸注投與小於約15分鐘。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下單位劑量係藉由皮下輸注投與小於約10分鐘。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下單位劑量係藉由皮下輸注投與小於約5分鐘。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下單位劑量係藉由皮下輸注投與小於約4分鐘。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下單位劑量係藉由皮下輸注投與小於約3分鐘。在一些態樣中，治療有效劑量及/或皮下單位劑量係藉由皮下輸注投與小於約2分鐘。 II.A.1. 抗PD-1抗體給藥
在本發明之某些態樣中，抗體包含抗PD-1抗體。任何抗PD-1抗體均可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，抗PD-1抗體包含納武單抗。在一些態樣中，抗PD-1抗體包含派立珠單抗。
在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每週投與約250 mg至約600 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每週投與約250 mg至約550 mg、約250 mg至約500 mg、約250 mg至約450 mg、約250 mg至約400 mg、約250 mg至約350 mg、約250 mg至約300 mg、約275 mg至約400 mg、約275 mg至約375 mg、約275 mg至約350 mg、約275 mg至約325 mg、約275 mg至約300 mg、約300 mg至約600 mg、約300 mg至約550 mg、約300 mg至約400 mg、約300 mg至約450 mg、約300 mg至約400 mg、約300 mg至約350 mg或約300 mg至約325 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每週投與約250 mg至約400 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每週投與約250 mg至約350 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每週投與約275 mg至約325 mg抗體。
在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與約250 mg、約260 mg、約270 mg、約275 mg、約280 mg、約290 mg、約300 mg、約310 mg、約320 mg、約325 mg、約330 mg、約340 mg、約350 mg、約360 mg、約370 mg、約375 mg、約380 mg、約390 mg、約400 mg、約410 mg、約420 mg、約425 mg、約430 mg、約440 mg、約450 mg、約460 mg、約470 mg、約475 mg、約480 mg、約490 mg、約500 mg、約510 mg、約520 mg、約525 mg、約530 mg、約540 mg、約550 mg、約560 mg、約570 mg、約575 mg、約580 mg、約590 mg或約600 mg。在某些態樣中，抗體之劑量為約每週投與約250 mg。在某些態樣中，抗體之劑量為約每週投與約275 mg。在某些態樣中，抗體之劑量為約每週投與約300 mg。在某些態樣中，抗體之劑量為約每週投與約325 mg。在某些態樣中，抗體之劑量為約每週投與約350 mg。
在一些態樣中，抗體之劑量包含約300 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以約2 mL總體積投與之約300 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以大於約2 mL總體積投與之約300 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個皮下單位劑量，其中兩個皮下單位劑量各自包含約150 mg抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之兩個不同身體位置投與兩個皮下單位劑量。
在一些態樣中，劑量包含三個皮下單位劑量，其中三個皮下單位劑量各自包含約100 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約100 mg總體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與三個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與。
在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每兩週投與之約300 mg至約900 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每兩週投與之約300 mg至約850 mg、約300 mg至約800 mg、約300 mg至約750 mg、約300 mg至約700 mg、約300 mg至約650 mg、約300 mg至約600 mg、約350 mg至約900 mg、約350 mg至約850 mg、約350 mg至約800 mg、約350 mg至約750 mg、約350 mg至約700 mg、約350 mg至約650 mg、約350 mg至約600 mg、約400 mg至約900 mg、約400 mg至約850 mg、約400 mg至約800 mg、約400 mg至約750 mg、約400 mg至約700 mg、約400 mg至約650 mg、約400 mg至約600 mg、約450至約900 mg、約450至約850 mg、約450至約800 mg、約450 mg至約750 mg、約450 mg至約700 mg、約450 mg至約650 mg、約450 mg至約600 mg、約500 mg至約900 mg、約500 mg至約850 mg、約500 mg至約800 mg、約500 mg至約700 mg、約500 mg至約650 mg、約500 mg至約600 mg、約550 mg至約900 mg、約550 mg至約850 mg、約550 mg至約800 mg、約550 mg至約750 mg、約550 mg至約700 mg、約550 mg至約650 mg、約550 mg至約600 mg、約600 mg至約900 mg、約600 mg至約850 mg、約600 mg至約800 mg、約600 mg至約750 mg、約600 mg至約700 mg、約600 mg至約650 mg、約575 mg至約625 mg、約575 mg至約600 mg或約600 mg至約625 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每兩週投與之約400 mg至約800 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每兩週投與之約500 mg至約700 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每兩週投與之約550 mg至約650 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每兩週投與之約575 mg至約625 mg抗體。
在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg、約500 mg、約510 mg、約520 mg、約530 mg、約540 mg、約550 mg、約560 mg、約570 mg、約580 mg、約590 mg、約600 mg、約610 mg、約620 mg、約630 mg、約640 mg、約650 mg、約660 mg、約670 mg、約680 mg、約690 mg、約700 mg、約710 mg、約720 mg、約730 mg、約740 mg、約750 mg、約760 mg、約770 mg、約780 mg、約790 mg、約800 mg、約810 mg、約820 mg、約830 mg、約840 mg、約850 mg、約860 mg、約870 mg、約880 mg、約890 mg或約900 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約500 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約550 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約575 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約600 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約625 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約650 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約700 mg。
在一些態樣中，抗體之劑量包含約600 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以約2 mL總體積投與之約600 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以大於約2 mL總體積投與之約600 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以大於約5 mL總體積投與之約600 mg之單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體之劑量包含約600 mg總投與體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個皮下單位劑量，其中兩個皮下單位劑量各自包含約300 mg抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在某些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積小於約2 mL之抗體。在一些態樣中，向個體之單一身體位置投與兩個皮下單位劑量。在一些態樣中，向個體之兩個不同身體位置投與兩個皮下單位劑量。
在一些態樣中，約600 mg之抗體劑量包含三個皮下單位劑量。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之每一者包含約200 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與三個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與。
在一些態樣中，約600 mg之抗體劑量包含至少四個皮下單位劑量。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與四個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，該第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，該第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，該第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且該第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與。
在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每四週投與之約900 mg至約1500 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每四週投與之約900 mg至約1450 mg、約900 mg至約1400 mg、約900 mg至約1350 mg、約900 mg至約1300 mg、約900 mg至約1250 mg、約900 mg至約1200 mg、約950 mg至約1500 mg、約950 mg至約1450 mg、約950 mg至約1400 mg、約950 mg至約1350 mg、約950 mg至約1300 mg、約950 mg至約1250 mg、約950 mg至約1200 mg、約1000 mg至約1500 mg、約1000 mg至約1450 mg、約1000 mg至約1400 mg、約1000 mg至約1350 mg、約1000 mg至約1300 mg、約1000 mg至約1250 mg、約1000 mg至約1200 mg、約1050至約1500 mg、約1050至約1450 mg、約1050至約1400 mg、約1050 mg至約1350 mg、約1050 mg至約1300 mg、約1050 mg至約1250 mg、約1050 mg至約1200 mg、約1100 mg至約1500 mg、約1100 mg至約1450 mg、約1100 mg至約1400 mg、約1100 mg至約1350 mg、約1100 mg至約1300 mg、約1100 mg至約1250 mg、約1100 mg至約1200 mg、約1150 mg至約1500 mg、約1150 mg至約1450 mg、約1150 mg至約1400 mg、約1150 mg至約1350 mg、約1150 mg至約1300 mg、約1150 mg至約1250 mg、約1150 mg至約1200 mg、約1200 mg至約1500 mg、約1200 mg至約1450 mg、約1200 mg至約1400 mg、約1200 mg至約1350 mg、約1200 mg至約1300 mg、約1200 mg至約1250 mg、約1175 mg至約1225 mg、約1175 mg至約1200 mg或約1200 mg至約1225 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每四週投與之約1000 mg至約1400 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每四週投與之約1100 mg至約1300 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體之劑量為約每四週投與之約1150 mg至約1250 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每四週投與之約1175 mg至約1225 mg抗體。
在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約900 mg、約950 mg、約1000 mg、約1010 mg、約1020 mg、約1030 mg、約1040 mg、約1050 mg、約1060 mg、約1070 mg、約1080 mg、約1090 mg、約1100 mg、約1110 mg、約1120 mg、約1130 mg、約1140 mg、約1150 mg、約1160 mg、約1170 mg、約1180 mg、約1190 mg、約1200 mg、約1210 mg、約1220 mg、約1230 mg、約1240 mg、約1250 mg、約1260 mg、約1270 mg、約1280 mg、約1290 mg、約1300 mg、約1310 mg、約1320 mg、約1330 mg、約1340 mg、約1350 mg、約1360 mg、約1370 mg、約1380 mg、約1390 mg、約1400 mg、約1410 mg、約1420 mg、約1430 mg、約1440 mg、約1450 mg、約1460 mg、約1470 mg、約1480 mg、約1490 mg或約1500 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約1100 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約1150 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約1175 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約1200 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約1225 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約1250 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約1300 mg。
在一些態樣中，抗體之劑量包含約1200 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以約2 mL總體積投與之約1200 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以大於約2 mL總體積投與之約1200 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以大於約5 mL總體積投與之約1200 mg之單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體之劑量包含約1200 mg總投與體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個皮下單位劑量，其中兩個皮下單位劑量各自包含約600 mg抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在某些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積小於約2 mL之抗體。在一些態樣中，向個體之單一身體位置投與兩個皮下單位劑量。在一些態樣中，向個體之兩個不同身體位置投與兩個皮下單位劑量。
在一些態樣中，約1200 mg之抗體劑量包含三個皮下單位劑量。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之每一者包含約400 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與三個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與。
在一些態樣中，約1200 mg之抗體劑量包含四個皮下單位劑量。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與四個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，該第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，該第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，該第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且該第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與。
在一些態樣中，約1200 mg之抗體劑量包含六個皮下單位劑量。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與六個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第五皮下單位劑量及第六皮下單位劑量係在第三身體位置處投與。在一些態樣中，該第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，該第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，該第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，該第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與，該第五皮下單位劑量係在第五身體位置處投與，且該第六皮下單位劑量係在第六身體位置處投與。
在一些態樣中，約1200 mg之抗體劑量包含至少八個皮下單位劑量。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與八個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，第五皮下單位劑量及第六皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且第七皮下單位劑量及第八皮下單位劑量係在第四身體位置處投與。
在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每八週投與之約1800 mg至約3000 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體(例如納武單抗)之劑量為約每八週投與之約1800 mg至約3000 mg抗體。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約1900 mg、約1950 mg、約2000 mg、約2010 mg、約2020 mg、約2030 mg、約2040 mg、約2050 mg、約2060 mg、約2070 mg、約2080 mg、約2090 mg、約2100 mg、約2110 mg、約2120 mg、約2130 mg、約2140 mg、約2150 mg、約2160 mg、約2170 mg、約2180 mg、約2190 mg、約2200 mg、約2210 mg、約2220 mg、約2230 mg、約2240 mg、約2250 mg、約2260 mg、約2270 mg、約2280 mg、約2290 mg、約2300 mg、約2310 mg、約2320 mg、約2330 mg、約2340 mg、約2350 mg、約2360 mg、約2370 mg、約2380 mg、約2390 mg、約2400 mg、約2410 mg、約2420 mg、約2430 mg、約2440 mg、約2450 mg、約2460 mg、約2470 mg、約2480 mg、約2490 mg、約2500 mg、約2510 mg、約2520 mg、約2530 mg、約2540 mg、約2550 mg、約2560 mg、約2570 mg、約2580 mg、約2590 mg或約2600 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2300 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2350 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2375 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2400 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2425 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2450 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2475 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2500 mg。
在一些態樣中，抗體之劑量包含約2400 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以大於約5 mL總體積投與之約2400 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以約5 mL總體積投與之約2400 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含約2400 mg總投與體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，約2400 mg之抗體劑量包含四個皮下單位劑量。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與四個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，該第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，該第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，該第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且該第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與。
在一些態樣中，約2400 mg之抗體劑量包含六個皮下單位劑量。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與六個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第五皮下單位劑量及第六皮下單位劑量係在第三身體位置處投與。在一些態樣中，該第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，該第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，該第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，該第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與，該第五皮下單位劑量係在第五身體位置處投與，且該第六皮下單位劑量係在第六身體位置處投與。
在一些態樣中，約2400 mg之抗體劑量包含至少八個皮下單位劑量。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與八個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，第五皮下單位劑量及第六皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且第七皮下單位劑量及第八皮下單位劑量係在第四身體位置處投與。
在一些態樣中，抗PD-1抗體包含派立珠單抗，其約每週一次、約每兩週一次、約每三週一次或約每四週一次皮下投與。在一些態樣中，約每兩週一次皮下投與約100 mg至約300 mg派立珠單抗。在一些態樣中，約每兩週一次皮下投與約100 mg、約110 mg、約120 mg、約130 mg、約140 mg、約150 mg、約160 mg、約170 mg、約180 mg、約190 mg、約200 mg、約210 mg、約220 mg、約230 mg、約240 mg、約250 mg、約260 mg、約270 mg、約280 mg、約290 mg或約300 mg派立珠單抗。在一些態樣中，約每兩週一次皮下投與至少約150 mg派立珠單抗。在一些態樣中，約每兩週一次皮下投與至少約200 mg派立珠單抗。在一些態樣中，約每四週一次皮下投與至少約300 mg派立珠單抗。在一些態樣中，約每四週一次皮下投與至少約400 mg派立珠單抗。在一些態樣中，以至少約2 mL至至少約4 mL之體積投與派立珠單抗之劑量。
在一些態樣中，抗PD-1抗體包含薩桑利單抗，其約每週一次、約每兩週一次、約每三週一次或約每四週一次皮下投與。在一些態樣中，約每四週一次皮下投與約200 mg至約400 mg薩桑利單抗。在一些態樣中，約每四週一次皮下投與約200 mg、約210 mg、約220 mg、約230 mg、約240 mg、約250 mg、約260 mg、約270 mg、約280 mg、約290 mg、約300 mg、約310 mg、約320 mg、約330 mg、約340 mg、約350 mg、約360 mg、約370 mg、約380 mg、約390 mg或約400 mg薩桑利單抗。在一些態樣中，約每四週一次皮下投與至少約250 mg薩桑利單抗。在一些態樣中，約每四週一次皮下投與至少約200 mg薩桑利單抗。在一些態樣中，約每四週一次皮下投與至少約250 mg薩桑利單抗。在一些態樣中，約每四週一次皮下投與至少約300 mg薩桑利單抗。在一些態樣中，薩桑利單抗之劑量以至少約2 mL之體積以單次注射投與。在一些態樣中，薩桑利單抗之劑量以至少約6 mL之體積以至少三次注射投與。
在一些態樣中，抗PD-1抗體包含KN035，其約每週一次、約每兩週一次、約每三週一次或約每四週一次皮下投與。在一些態樣中，約每週一次皮下投與約100 mg至約200 mg KN035。在一些態樣中，約每週一次皮下投與約100 mg、約110 mg、約120 mg、約130 mg、約140 mg、約150 mg、約160 mg、約170 mg、約180 mg、約190 mg或約200 mg KN035。在一些態樣中，約每週一次皮下投與至少約150 mg KN035。在一些態樣中，約每週一次皮下投與約2.5 mg/kg KN035。在一些態樣中，約每三週一次皮下投與約200 mg至約400 mg KN035。在一些態樣中，約每三週一次皮下投與約200 mg、約210 mg、約220 mg、約230 mg、約240 mg、約250 mg、約260 mg、約270 mg、約280 mg、約290 mg、約300 mg、約310 mg、約320 mg、約330 mg、約340 mg、約350 mg、約360 mg、約370 mg、約380 mg、約390 mg或約400 mg KN035。在一些態樣中，約每三週一次皮下投與至少約300 mg KN035。在一些態樣中，約每四週一次皮下投與至少約300 mg KN035。在一些態樣中，約每四週一次皮下投與至少約400 mg KN035。在一些態樣中，KN035之劑量以小於約1 mL之體積投與。 II.A.2. 抗PD-L1抗體給藥
在本發明之一些態樣中，抗體包含抗PD-L1抗體。此項技術中已知及/或本文所揭示之任何抗PD-L1抗體均可用於本文所揭示之方法中。在某些態樣中，抗PD-L1抗體包含阿特珠單抗。在某些態樣中，抗PD-L1抗體包含德瓦魯單抗。在某些態樣中，抗PD-L1抗體包含阿維魯單抗。
在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每週投與之約300 mg至約900 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-1抗體之劑量為約每週投與約300 mg至約850 mg、約300 mg至約800 mg、約300 mg至約750 mg、約300 mg至約700 mg、約300 mg至約650 mg、約300 mg至約600 mg、約350 mg至約900 mg、約350 mg至約850 mg、約350 mg至約800 mg、約350 mg至約750 mg、約350 mg至約700 mg、約350 mg至約650 mg、約350 mg至約600 mg、約400 mg至約900 mg、約400 mg至約850 mg、約400 mg至約800 mg、約400 mg至約750 mg、約400 mg至約700 mg、約400 mg至約650 mg、約400 mg至約600 mg、約450至約900 mg、約450至約850 mg、約450至約800 mg、約450 mg至約750 mg、約450 mg至約700 mg、約450 mg至約650 mg、約450 mg至約600 mg、約500 mg至約900 mg、約500 mg至約850 mg、約500 mg至約800 mg、約500 mg至約700 mg、約500 mg至約650 mg、約500 mg至約600 mg、約550 mg至約900 mg、約550 mg至約850 mg、約550 mg至約800 mg、約550 mg至約750 mg、約550 mg至約700 mg、約550 mg至約650 mg、約550 mg至約600 mg、約600 mg至約900 mg、約600 mg至約850 mg、約600 mg至約800 mg、約600 mg至約750 mg、約600 mg至約700 mg、約600 mg至約650 mg、約575 mg至約625 mg、約575 mg至約600 mg或約600 mg至約625 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每週投與之約400 mg至約800 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每週投與之約500 mg至約700 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每週投與之約550 mg至約650 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每週投與之約575 mg至約625 mg抗體。
在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg、約500 mg、約510 mg、約520 mg、約530 mg、約540 mg、約550 mg、約560 mg、約570 mg、約580 mg、約590 mg、約600 mg、約610 mg、約620 mg、約630 mg、約640 mg、約650 mg、約660 mg、約670 mg、約680 mg、約690 mg、約700 mg、約710 mg、約720 mg、約730 mg、約740 mg、約750 mg、約760 mg、約770 mg、約780 mg、約790 mg、約800 mg、約810 mg、約820 mg、約830 mg、約840 mg、約850 mg、約860 mg、約870 mg、約880 mg、約890 mg或約900 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之約500 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之約550 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之約575 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之約600 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之約625 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之約650 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每週投與之約700 mg。
在一些態樣中，抗體之劑量包含約600 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含約600 mg總投與體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以約2 mL總體積投與之約600 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以約5 mL總體積投與之約600 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以大於約5 mL總體積投與之約600 mg之單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個皮下單位劑量，其中兩個皮下單位劑量各自包含約300 mg抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在某些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積小於約2 mL之抗體。在一些態樣中，向個體之單一身體位置投與兩個皮下單位劑量。在一些態樣中，向個體之兩個不同身體位置投與兩個皮下單位劑量。
在一些態樣中，約600 mg之抗體劑量包含三個皮下單位劑量。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之每一者包含約200 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與三個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與。
在一些態樣中，約600 mg之抗體劑量包含至少四個皮下單位劑量。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與四個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，該第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，該第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，該第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且該第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與。
在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每兩週投與之約900 mg至約1800 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每兩週投與之約900 mg至約1750 mg、約900 mg至約1700 mg、約900 mg至約1650 mg、約900 mg至約1600 mg、約900 mg至約1550 mg、約900 mg至約1500 mg、約900 mg至約1450 mg、約900 mg至約1400 mg、約900 mg至約1350 mg、約900 mg至約1300 mg、約900 mg至約1250 mg、約900 mg至約1200 mg、約950 mg至約1500 mg、約950 mg至約1450 mg、約950 mg至約1400 mg、約950 mg至約1350 mg、約950 mg至約1300 mg、約950 mg至約1250 mg、約950 mg至約1200 mg、約1000 mg至約1500 mg、約1000 mg至約1450 mg、約1000 mg至約1400 mg、約1000 mg至約1350 mg、約1000 mg至約1300 mg、約1000 mg至約1250 mg、約1000 mg至約1200 mg、約1050至約1500 mg、約1050至約1450 mg、約1050至約1400 mg、約1050 mg至約1350 mg、約1050 mg至約1300 mg、約1050 mg至約1250 mg、約1050 mg至約1200 mg、約1100 mg至約1500 mg、約1100 mg至約1450 mg、約1100 mg至約1400 mg、約1100 mg至約1350 mg、約1100 mg至約1300 mg、約1100 mg至約1250 mg、約1100 mg至約1200 mg、約1150 mg至約1500 mg、約1150 mg至約1450 mg、約1150 mg至約1400 mg、約1150 mg至約1350 mg、約1150 mg至約1300 mg、約1150 mg至約1250 mg、約1150 mg至約1200 mg、約1200 mg至約1500 mg、約1200 mg至約1450 mg、約1200 mg至約1400 mg、約1200 mg至約1350 mg、約1200 mg至約1300 mg、約1200 mg至約1250 mg、約1175 mg至約1225 mg、約1175 mg至約1200 mg或約1200 mg至約1225 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每兩週投與之約1000 mg至約1400 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每兩週投與之約1100 mg至約1300 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每兩週投與之約1150 mg至約1250 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每兩週投與之約1175 mg至約1225 mg抗體。
在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約900 mg、約950 mg、約1000 mg、約1010 mg、約1020 mg、約1030 mg、約1040 mg、約1050 mg、約1060 mg、約1070 mg、約1080 mg、約1090 mg、約1100 mg、約1110 mg、約1120 mg、約1130 mg、約1140 mg、約1150 mg、約1160 mg、約1170 mg、約1180 mg、約1190 mg、約1200 mg、約1210 mg、約1220 mg、約1230 mg、約1240 mg、約1250 mg、約1260 mg、約1270 mg、約1280 mg、約1290 mg、約1300 mg、約1310 mg、約1320 mg、約1330 mg、約1340 mg、約1350 mg、約1360 mg、約1370 mg、約1380 mg、約1390 mg、約1400 mg、約1410 mg、約1420 mg、約1430 mg、約1440 mg、約1450 mg、約1460 mg、約1470 mg、約1480 mg、約1490 mg、約1500 mg、約1550 mg、約1600 mg、約1650 mg、約1700 mg、約1750 mg或約1800 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約1100 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約1150 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約1175 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約1200 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約1225 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約1250 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每兩週投與之約1300 mg。
在一些態樣中，抗體之劑量包含約1200 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含約1200 mg總投與體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以約2 mL總體積投與之約1200 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以約5 mL總體積投與之約1200 mg之單一皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含以大於約5 mL總體積投與之約1200 mg之單一皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個皮下單位劑量，其中兩個皮下單位劑量各自包含約600 mg抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在某些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積小於約2 mL之抗體。在一些態樣中，向個體之單一身體位置投與兩個皮下單位劑量。在一些態樣中，向個體之兩個不同身體位置投與兩個皮下單位劑量。
在一些態樣中，約1200 mg之抗體劑量包含三個皮下單位劑量。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之每一者包含約400 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與三個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與。
在一些態樣中，約1200 mg之抗體劑量包含四個皮下單位劑量。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與四個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，該第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，該第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，該第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且該第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與。
在一些態樣中，約1200 mg之抗體劑量包含六個皮下單位劑量。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約200 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與六個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第五皮下單位劑量及第六皮下單位劑量係在第三身體位置處投與。在一些態樣中，該第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，該第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，該第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，該第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與，該第五皮下單位劑量係在第五身體位置處投與，且該第六皮下單位劑量係在第六身體位置處投與。
在一些態樣中，約1200 mg之抗體劑量包含至少八個皮下單位劑量。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約150 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與八個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，第五皮下單位劑量及第六皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且第七皮下單位劑量及第八皮下單位劑量係在第四身體位置處投與。
在一些態樣中，在同一天投與兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每四週投與之約2100 mg至約2700 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每四週投與之約2100 mg至約2650 mg、約2100 mg至約2600 mg、約2100 mg至約2550 mg、約2100 mg至約2500 mg、約2100 mg至約2450 mg、約2100 mg至約2400 mg、約2200 mg至約2700 mg、約2200 mg至約2650 mg、約2200 mg至約2600 mg、約2200 mg至約2550 mg、約2200 mg至約2500 mg、約2200 mg至約2450 mg、約2200 mg至約2400 mg、約2300 mg至約2700 mg、約2300 mg至約2650 mg、約2300 mg至約2600 mg、約2300 mg至約2550 mg、約2300 mg至約2500 mg、約2300 mg至約2450 mg、約2300 mg至約2400 mg、約2350 mg至約mg、約2350 mg至約2700 mg、約2350 mg至約2650 mg、約2350 mg至約2600 mg、約2350 mg至約2550 mg、約2350 mg至約2500 mg、約2350 mg至約2450 mg、約2350 mg至約2400 mg、約2400 mg至約2700 mg、約2400 mg至約2650 mg、約2400 mg至約2600 mg、約2400 mg至約2550 mg、約2400 mg至約2500 mg、約2400 mg至約2450 mg、約2400 mg至約2425 mg、約2375 mg至約2425 mg或約2375 mg至約2400 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每四週投與之約2200 mg至約2600 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每四週投與之約2300 mg至約2500 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每四週投與之約2350 mg至約2450 mg抗體。在一些態樣中，抗體，例如抗PD-L1抗體之劑量為約每四週投與之約2375 mg至約2425 mg抗體。
在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2100 mg、約2150 mg、約2200 mg、約2250 mg、約2300 mg、約2350 mg、約2400 mg、約2450 mg、約2500 mg、約2550 mg、約2600 mg、約2650 mg或約2700 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2300 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2350 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2400 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2450 mg。在一些態樣中，抗體之劑量為約每四週投與之約2500 mg。
在一些態樣中，抗體之劑量包含單一皮下劑量，其包含約2400 mg抗體。在一些態樣中，抗體之單一皮下劑量包含約2400 mg總體積大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，單一皮下單位劑量包含約2400 mg總體積大於約5 mL之抗體。
在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。在一些態樣中，抗體之劑量包含兩個皮下單位劑量，其中兩個皮下單位劑量各自包含約1200 mg抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約1200 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約1200 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約1200 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約1200 mg總體積小於約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在某些態樣中，兩個皮下單位劑量中之至少一者包含約1200 mg總體積小於約2 mL之抗體。在一些態樣中，向個體之單一身體位置投與兩個皮下單位劑量。在一些態樣中，向個體之兩個不同身體位置投與兩個皮下單位劑量。
在一些態樣中，約2400 mg之抗體劑量包含三個皮下單位劑量。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約800 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之每一者包含約800 mg抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約800 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約800 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約800 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，三個皮下單位劑量中之至少一者包含約800 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與三個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與。
在一些態樣中，約2400 mg之抗體劑量包含四個皮下單位劑量。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，四個皮下單位劑量中之至少一者包含約600 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與四個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，且第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與。在一些態樣中，該第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，該第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，該第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且該第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與。
在一些態樣中，約2400 mg之抗體劑量包含六個皮下單位劑量。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，六個皮下單位劑量中之至少一者包含約400 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與六個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，且第五皮下單位劑量及第六皮下單位劑量係在第三身體位置處投與。在一些態樣中，該第一皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，該第二皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，該第三皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，該第四皮下單位劑量係在第四身體位置處投與，該第五皮下單位劑量係在第五身體位置處投與，且該第六皮下單位劑量係在第六身體位置處投與。
在一些態樣中，約2400 mg之抗體劑量包含至少八個皮下單位劑量。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為約2 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約2 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為大於約5 mL之抗體。在一些態樣中，八個皮下單位劑量中之至少一者包含約300 mg總體積為約5 mL (例如小於約4.5 mL、小於約4.0 mL、小於約3.5 mL、小於約3.0 mL、小於約2.5 mL或小於約2.0 mL)之抗體。在一些態樣中，向個體之至少兩個不同身體位置投與八個皮下單位劑量中之至少兩者。在一些態樣中，第一皮下單位劑量及第二皮下單位劑量係在第一身體位置處投與，第三皮下單位劑量及第四皮下單位劑量係在第二身體位置處投與，第五皮下單位劑量及第六皮下單位劑量係在第三身體位置處投與，且第七皮下單位劑量及第八皮下單位劑量係在第四身體位置處投與。
在一些態樣中，在同一天投與兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。
在一些態樣中，抗PD-L1抗體包含阿特珠單抗，其約每週一次、約每兩週一次、約每三週一次或約每四週一次皮下投與。在一些態樣中，約每兩週一次皮下投與約1000 mg至約1400 mg阿特珠單抗。在一些態樣中，約每兩週一次皮下投與約1100 mg、約1110 mg、約1120 mg、約1130 mg、約1140 mg、約1150 mg、約1160 mg、約1170 mg、約1180 mg、約1190 mg、約1200 mg、約1210 mg、約1220 mg、約1230 mg、約1240 mg、約1250 mg、約1260 mg、約1270 mg、約1280 mg、約1290 mg或約1300 mg阿特珠單抗。在一些態樣中，約每兩週一次皮下投與至少約1200 mg阿特珠單抗。在一些態樣中，約每三週一次皮下投與約1700 mg至約1900 mg阿特珠單抗。在一些態樣中，約每三週一次皮下投與約1700 mg、約1710 mg、約1720 mg、約1730 mg、約1740 mg、約1750 mg、約1760 mg、約1770 mg、約1780 mg、約1790 mg、約1800 mg、約1810 mg、約1820 mg、約1830 mg、約1840 mg、約1850 mg、約1860 mg、約1870 mg、約1880 mg、約1890 mg或約1900 mg阿特珠單抗。在一些態樣中，約每三週一次皮下投與至少約1800 mg阿特珠單抗。在一些態樣中，以至少約2 mL至至少約20 mL之體積投與阿特珠單抗之劑量。 II.A.3. 內切糖苷酶水解酵素給藥
在一些態樣中，醫藥組合物包含內切糖苷酶水解酵素。任何內切糖苷酶水解酵素均可用於本文所揭示之醫藥組合物中。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素在己糖胺酶β(1-4)或(1-3)鍵處裂解玻尿酸。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含玻尿酸酶PH-20 (HuPH20)、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4或HYALPS1之催化域。
在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含玻尿酸酶。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含選自由以下組成之群的玻尿酸酶：HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、其任何變異體及任何同功異型物。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含rHuPH20或其片段。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸36-490具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含rHuPH20 (UniProt標識號P38567-1)之催化域。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含rHuPH20成熟肽(SEQ ID NO: 1A之胺基酸36-490)。 表1A：rHuPH20之胺基酸序列
Figure 02_image001
信號肽：加底線；成熟蛋白：粗體；前肽：斜體。
在一些態樣中，皮下注射係基於Halozyme Therapeutics之ENHANZE®藥物遞送技術(參見美國專利第7,767,429號，其以全文引用之方式併入本文中)。ENHANZE®使用抗體與重組人類玻尿酸酶(rHuPH20)之共調配物，消除了由於細胞外基質而對可皮下遞送之生物製劑及藥物體積的傳統限制(參見美國專利第7,767,429號)。在一些態樣中，本發明之醫藥組合物可進一步包含重組人類玻尿酸酶，例如rHuPH20。
重組人類玻尿酸酶PH20 (rHuPH20，Halozyme Therapeutics Inc.)為醣基化447個胺基酸之單鏈重組人類多肽，其在注射部位局部解聚皮下(SC)空間中之玻尿酸。玻尿酸為N-乙醯基葡糖胺及葡糖醛酸之重複聚合物，有助於皮膚細胞外基質之可溶性凝膠狀組分。rHuPH20對玻尿酸之解聚使得細胞外基質之凝膠狀相的黏度瞬時降低且增加水力傳導，促進注射藥物之分散及吸收(參見rHuPH20 IB)。使用rHuPH20使得能夠遞送大量體積用於快速SC注射(例如，大約2 mL至20 mL)，其可縮短劑量投與時間、降低投與頻率且使得有可能改善共投與藥物之PK概況，包括改善的吸收、增加的生物可用性、加速的達到最大濃度之時間(Tmax)、增加的最大濃度(Cmax)及降低的PK變化性。
rHuPH20在皮膚中之半衰期為＜30分鐘，且此等組織中之局部滲透障壁在注射玻尿酸酶後24小時至48小時內恢復至注射前水準。研究展示，在以10,000 U及30,000 U劑量進行SC投與之後，健康志願者及患者全身不可偵測到rHuPH20。另一項rHuPH20之PK研究(Halozyme Study HALO-104-104)表明，對於10,000或30,000個單位rHuPH20之IV劑量，rHuPH20之血漿濃度迅速下降，t1/2極短(≤10.4分鐘)，且血漿濃度在IV輸注結束後1.5小時內變得不可偵測(＜0.03 ng/mL)。
皮下注射rHuPH20在健康參與者、脫水兒科參與者、臨終關懷及姑息照護參與者、患有1型及2型糖尿病之參與者及患有類風濕性關節炎之參與者中通常為良好耐受的。皮下注射單獨或與以下各者共投與之rHuPH20的耐受性良好：乳酸林格氏液、生理鹽水、共注射藥物(嗎啡鹼、頭孢曲松、胰島素及胰島素類似物)或生物製品(免疫球蛋白G [IgG]及阿達木單抗)。
在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶包含一或多個胺基酸取代。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶在α-螺旋區中包含一或多個胺基酸取代。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶在連接子區中包含一或多個胺基酸取代。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，其中相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶，一或多個N末端及/或C末端胺基酸經缺失。
在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之rHuPH20，其中相對於野生型rHuPH20，該經修飾之rHuPH20包含在α-螺旋區、連接子區或α-螺旋區及連接子區兩者中之一或多個胺基酸取代。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之rHuPH20，其中相對於野生型rHuPH20，該經修飾之rHuPH20包含一或多個N末端胺基酸、一或多個C末端胺基酸或一或多個N末端胺基酸及一或多個C末端胺基酸之缺失。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之rHuPH20，其中相對於野生型rHuPH20，該經修飾之rHuPH20包含在α-螺旋區、連接子區或α-螺旋區及連接子區兩者中之一或多個胺基酸取代；且其中相對於野生型rHuPH20，該經修飾之rHuPH20包含一或多個N末端胺基酸、一或多個C末端胺基酸或一或多個N末端胺基酸及一或多個C末端胺基酸之缺失。
內切糖苷酶水解酵素之額外非限制性實例見於EP3636752中，其以全文引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素為以下各者中所揭示之具有內切糖苷酶水解酵素活性之任何多肽：美國專利第US 9,447,401號；第US 10,865,400號；第US 11,041,149號；第US 11,066,656號；第US 8,927,249號；第US 9,284,543號；第US 10,588,983號；第US 10/328,130號；及/或第US 9,993,529號，其各自以全文引用之方式併入本文中。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素為以下各者中所揭示之具有內切糖苷酶水解酵素活性之任何多肽：國際公開案第WO/13/102144號、第WO/10/077297號、第WO/15/003167號、第WO/04/078140號、第WO/09/128917號、第WO/12/174478號及/或第WO/12/174480號，其各自以全文引用之方式併入本文中。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含與選自SEQ ID NO: 5-52中所示之胺基酸序列的胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含選自SEQ ID NO: 5-52中所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素為以下各者中所揭示之具有內切糖苷酶水解酵素活性之任何多肽：美國專利申請公開案第US2021155913A1號及/或第US2021363270A1號；及/或國際公開案第WO/20/022791號、第WO/20/197230號及/或第WO/21/150079號；各文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含與選自SEQ ID NO: 53-263中所示之胺基酸序列的胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含與SEQ ID NO: 92中所示之胺基酸序列至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致的胺基酸序列。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含選自SEQ ID NO: 53-263中所示之胺基酸序列的胺基酸序列。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素包含SEQ ID NO: 92中所示之胺基酸序列。在一些態樣中，內切糖苷酶水解酵素為HP46 (國際公開案第WO/20/197230號之SEQ ID NO: 44)。
在某些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含玻尿酸酶。在一些態樣中，醫藥組合物包含足以投與至少約20,000單位玻尿酸酶之玻尿酸酶濃度。在一些態樣中，玻尿酸酶為rHuPH20。在其他態樣中，醫藥組合物不包含玻尿酸酶。
在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與內切糖苷酶水解酵素(例如rHuPH20)一起投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與內切糖苷酶水解酵素(例如rHuPH20)同時投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與內切糖苷酶水解酵素(例如rHuPH20)依序投與。
在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體及內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)存在於單一醫藥組合物中。
在一些態樣中，劑量包含至少約5000單位至至少約100,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，劑量包含至少約5000單位、至少約10,000單位、至少約15,000單位、至少約20,000單位、至少約25,000單位、至少約30,000單位、至少約35,000單位、至少約40,000單位、至少約45,000單位、至少約50,000單位、至少約55,000單位、至少約60,000單位、至少約65,000單位、至少約70,000單位、至少約75,000單位、至少約80,000單位、至少約85,000單位、至少約90,000單位、至少約95,000單位或至少約100,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如rHuPH20)。在一些態樣中，劑量包含至少約20,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，劑量包含至少約30,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，劑量包含至少約40,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，劑量包含至少約50,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，劑量包含至少約60,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，劑量包含至少約70,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，劑量包含至少約80,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，劑量包含至少約90,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，劑量包含至少約100,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。
一般熟習此項技術者將顯而易見，內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)之量可以單位或量表示，或內切糖苷酶水解酵素(例如，HuPH20)之量可以mg (或以其他基於重量之單位)表示。舉例而言，在一些態樣中，劑量包含表示為至少約500 U或至少約0.00455 mg之量的內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在另一實例中，在一些態樣中，劑量包含表示為至少約2000 U或至少約0.0182 mg之量的內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。 II.B.   適用於本發明之抗PD-1抗體
此項技術中已知之抗PD-1抗體可用於本發明所描述之組合物及方法中。以高親和力特異性地結合至PD-1之各種人類單株抗體已揭示於美國專利第8,008,449號中。已證明美國專利第8,008,449號中所揭示之抗PD-1人類抗體展現以下特徵中之一或多者：(a)以1×10 - 7M或更小的K D結合至人類PD-1，如藉由表面電漿子共振使用Biacore生物感測器系統所測定；(b)基本上不結合至人類CD28、CTLA-4或ICOS；(c)在混合淋巴球反應(MLR)分析中增加的T細胞增殖；(d)在MLR分析中增加的干擾素-γ生產；(e)在MLR分析中增加的IL-2分泌；(f)結合至人類PD-1及食蟹獼猴PD-1；(g)抑制PD-L1及/或PD-L2與PD-1之結合；(h)刺激抗原特異性記憶反應；(i)刺激抗體反應；及(j)抑制活體內腫瘤細胞生長。可用於本發明中之抗PD-1抗體包括特異性結合至人類PD-1且展現至少一種、在一些態樣中至少五種前述特徵之單株抗體。
其他抗PD-1單株抗體已描述於例如美國專利第6,808,710號、第7,488,802號、第8,168,757號及第8,354,509號；美國公開案第2016/0272708號；及PCT公開案第WO 2012/145493號、第WO 2008/156712號、第WO 2015/112900號、第WO 2012/145493號、第WO 2015/112800號、第WO 2014/206107號、第WO 2015/35606號、第WO 2015/085847號、第WO 2014/179664號、第WO 2017/020291號、第WO 2017/020858號、第WO 2016/197367號、第WO 2017/024515號、第WO 2017/025051號、第WO 2017/123557號、第WO 2016/106159號、第WO 2014/194302號、第WO 2017/040790號、第WO 2017/133540號、第WO 2017/132827號、第WO 2017/024465號、第WO 2017/025016號、第WO 2017/106061號、第WO 2017/19846號、第WO 2017/024465號、第WO 2017/025016號、第WO 2017/132825號及第WO 2017/133540號中，其中之每一者均以全文引用之方式併入。
在一些態樣中，抗PD-1抗體選自由以下組成之群：納武單抗(亦稱為OPDIVO®、5C4、BMS-936558、MDX-1106及ONO-4538)、派立珠單抗(Merck；亦稱為KEYTRUDA®、拉立珠單抗及MK-3475；參見WO2008/156712)、PDR001 (諾華；參見WO 2015/112900)、MEDI-0680 (AstraZeneca；亦稱為AMP-514；參見WO 2012/145493)、測米匹單抗(Regeneron；亦稱為REGN-2810；參見WO 2015/112800)、JS001 (TAIZHOU JUNSHI PHARMA；亦稱為特瑞普利單抗；參見Si-Yang Liu等人, J . Hematol . Oncol . 10:136 (2017))、BGB-A317 (Beigene；亦稱為替雷利珠單抗；參見WO 2015/35606及US 2015/0079109)、INCSHR1210 (Jiangsu Hengrui Medicine；亦稱為SHR-1210；參見WO 2015/085847；Si-Yang Liu等人, J . Hematol . Oncol . 10:136 (2017))、TSR-042 (Tesaro Biopharmaceutical；亦稱為ANB011；參見WO2014/179664)、GLS-010 (Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals；亦稱為WBP3055；參見Si-Yang Liu等人, J . Hematol . Oncol . 10:136 (2017))、AM-0001 (Armo)、STI-1110 (Sorrento Therapeutics；參見WO 2014/194302)、AGEN2034 (Agenus；參見WO 2017/040790)、MGA012 (Macrogenics，參見WO 2017/19846)、BCD-100 (Biocad；Kaplon等人, mAbs 10 ( 2 ):183-203 (2018)、IBI308 (Innovent；參見WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/132825及WO 2017/133540)；及薩桑利單抗(PF-06801591)。
在一個態樣中，抗PD-1抗體為納武單抗。納武單抗為全人類IgG4 (S228P) PD-1免疫檢查點抑制劑抗體，其選擇性地預防與PD-1配位體(PD-L1及PD-L2)之相互作用，由此阻斷抗腫瘤T細胞功能下調(美國專利第8,008,449號；Wang等人, 2014 Cancer Immunol Res . 2 ( 9 ):846-56)。納武單抗之重鏈可變區及輕鏈可變區展示於表1B中(SEQ ID NO: 2及3)。在一些態樣中，抗PD-1抗體包含重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 2中所闡述之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 3中所闡述之胺基酸序列。在一些態樣中，抗體包含重鏈互補決定區(CDR) 1、CDR2及CDR3序列，其包含SEQ ID NO: 2之重鏈CDR1、CDR2及CDR3的胺基酸序列。在一些態樣中，抗體包含輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列，其包含SEQ ID NO: 3之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3的胺基酸序列。 表1B：抗PD-1抗體序列
抗PD-1抗體重鏈可變區 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND DYWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 2)
抗PD-1抗體輕鏈可變區 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIK (SEQ ID NO: 3)
在另一態樣中，抗PD-1抗體為派立珠單抗。派立珠單抗為針對人類細胞表面受體PD-1 (計劃性死亡-1或計劃性細胞死亡-1)之人類化單株IgG4 (S228P)抗體。派立珠單抗描述於例如美國專利第8,354,509號及第8,900,587號中。
可用於所揭示之組合物及方法中之抗PD-1抗體亦包括特異性結合至人類PD-1且與本文揭示之任何抗PD-1抗體(例如納武單抗)交叉競爭結合至人類PD-1之經分離抗體(參見例如美國專利第8,008,449號及第8,779,105號；WO 2013/173223)。在一些態樣中，抗PD-1抗體結合與本文所述之任何抗PD-1抗體，例如納武單抗相同之抗原決定基。抗體交叉競爭結合至抗原之能力指示此等單株抗體結合至抗原之同一抗原決定區，且在空間上阻礙其他交叉競爭抗體與該特定抗原決定區之結合。藉助於此等交叉競爭抗體與參考抗體(例如納武單抗)結合至PD-1之相同抗原決定基區，預期其具有極類似的功能特性。交叉競爭抗體可基於其與納武單抗交叉競爭之能力而在標準PD-1結合分析，諸如Biacore分析、ELISA分析或流式細胞測量術中容易地鑑別(參見例如WO 2013/173223)。
在某些態樣中，與納武單抗交叉競爭結合至人類PD-1或與納武單抗結合至人類PD-1抗體之相同抗原決定基區域之抗體為單株抗體。為了向人類個體投與，此等交叉競爭抗體為嵌合抗體、工程化抗體或者人類化或人類抗體。此類嵌合、工程化、人類化或人類單株抗體可藉由此項技術中熟知之方法來加以製備及分離。
可用於本發明之組合物及方法中的抗PD-1抗體亦包括以上抗體之抗原結合部分。已充分表明抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。
適用於所揭示之方法或組合物中的抗PD-1抗體為以高特異性及親和力結合至PD-1、阻斷PD-L1及或PD-L2之結合且抑制PD-1信號傳導路徑之免疫抑制作用的抗體。在任一本文揭示之組合物或方法中，抗PD-1「抗體」包括與PD-1受體結合且展現類似於全抗體抑制配位體結合及上調免疫系統之功能特性的抗原結合部分或片段。在某些態樣中，抗PD-1抗體或其抗原結合部分與納武單抗交叉競爭結合至人類PD-1。
在一些態樣中，抗PD-1抗體以每2、3、4、5、6、7或8週一次介於0.1 mg/kg至20.0 mg/kg體重，例如每2、3或4週一次介於0.1 mg/kg至10.0 mg/kg體重範圍內之劑量投與。在其他態樣中，抗PD-1抗體以每2週一次約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg或10 mg/kg體重之劑量投與。在其他態樣中，抗PD-1抗體以每3週一次約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg或10 mg/kg體重之劑量投與。在其他態樣中，抗PD-1抗體以約每3週一次約5 mg/kg體重之劑量投與。在另一態樣中，抗PD-1抗體，例如納武單抗以約每2週一次約3 mg/kg體重之劑量投與。在其他態樣中，抗PD-1抗體，例如派立珠單抗以約每3週一次約2 mg/kg體重之劑量投與。
適用於本發明之抗PD-1抗體可以均一劑量形式投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體以約100至約1000 mg、約100 mg至約900 mg、約100 mg至約800 mg、約100 mg至約700 mg、約100 mg至約600 mg、約100 mg至約500 mg、約200 mg至約1000 mg、約200 mg至約900 mg、約200 mg至約800 mg、約200 mg至約700 mg、約200 mg至約600 mg、約200 mg至約500 mg、約200 mg至約480 mg或約240 mg至約480 mg之均一劑量投與。在一個態樣中，抗PD-1抗體在約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週之給藥時間間隔下以至少約200 mg、至少約220 mg、至少約240 mg、至少約260 mg、至少約280 mg、至少約300 mg、至少約320 mg、至少約340 mg、至少約360 mg、至少約380 mg、至少約400 mg、至少約420 mg、至少約440 mg、至少約460 mg、至少約480 mg、至少約500 mg、至少約520 mg、至少約540 mg、至少約550 mg、至少約560 mg、至少約580 mg、至少約600 mg、至少約620 mg、至少約640 mg、至少約660 mg、至少約680 mg、至少約700 mg或至少約720 mg之均一劑量投與。在另一態樣中，抗PD-1抗體在約1、2、3或4週之給藥時間間隔下以約200 mg至約800 mg、約200 mg至約700 mg、約200 mg至約600 mg、約200 mg至約500 mg之均一劑量投與。
在一些態樣中，抗PD-1抗體約每3週一次以約200 mg之均一劑量投與。在其他態樣中，抗PD-1抗體約每2週一次以約200 mg之均一劑量投與。在其他態樣中，抗PD-1抗體約每2週一次以約240 mg之均一劑量投與。在某些態樣中，抗PD-1抗體約每4週一次以約480 mg之均一劑量投與。
在一些態樣中，納武單抗約每2週一次以約240 mg之均一劑量投與。在一些態樣中，納武單抗約每3週一次以約240 mg之均一劑量投與。在一些態樣中，納武單抗約每3週一次以約360 mg之均一劑量投與。在一些態樣中，納武單抗約每4週一次以約480 mg之均一劑量投與。在一些態樣中，納武單抗約每6週一次以約720 mg之均一劑量投與。在一些態樣中，納武單抗約每8週一次以約960 mg之均一劑量投與。
在一些態樣中，派立珠單抗約每2週一次以約200 mg之均一劑量投與。在一些態樣中，派立珠單抗約每3週一次以約200 mg之均一劑量投與。在一些態樣中，派立珠單抗約每4週一次以約400 mg之均一劑量投與。
在一些態樣中，醫藥組合物含有包含第一抗原結合部分及第二抗原結合部分之雙特異性抗體或多特異性抗體，其中第一抗原結合部分包含抗PD-1抗原結合部分(例如納武單抗之scFv)。在一些態樣中，第二抗原結合部分為本文所揭示之抗體中之任一者的抗原結合部分。在一些態樣中，第二抗原結合部分為抗LAG-3抗體，例如瑞拉單抗之抗原結合部分。
在一些態樣中，醫藥組合物含有包含第一抗原結合部分、第二抗原結合部分及至少第三抗原結合部分之多特異性抗體，其中第一抗原結合部分包含抗PD-1抗原結合部分(例如納武單抗之scFv)。 II.C.   適用於本發明之抗PD-L1抗體
在某些態樣中，抗PD-L1抗體在本文所揭示之任何方法中取代抗PD-1抗體。任何抗PD-L1抗體均可用於本發明之組合物及方法中。適用於本發明之組合物及方法中之抗PD-L1抗體之實例包括美國專利第9,580,507號中所揭示之抗體。已證明美國專利第9,580,507號中揭示之抗PD-L1人類單株抗體表現出以下一種或多種特徵：(a)以1×10 - 7M或更小的K D結合人類PD-L1，如使用Biacore生物感測器系統藉由表面電漿子共振所測定；(b)在混合淋巴細胞反應(MLR)分析中增加T細胞增生；(c)在MLR分析中增加干擾素-γ產生；(d)在MLR分析中增加IL-2分泌；(e)刺激抗體反應；(f)逆轉T調控細胞對T細胞效應細胞及/或樹突細胞的作用。可用於本發明中之抗PD-L1抗體包括特異性結合至人類PD-L1且展現至少一種、在一些態樣中至少五種前述特徵之單株抗體。
在某些態樣中，抗PD-L1抗體係選自由以下組成之群：BMS-936559 (亦稱為12A4、MDX-1105；參見例如美國專利第7,943,743號及WO 2013/173223)、阿特珠單抗(Roche；亦稱為TECENTRIQ®；MPDL3280A、RG7446；參見US 8,217,149；亦參見Herbst等人 (2013) J Clin Oncol 31(增刊):3000)、德瓦魯單抗(AstraZeneca；亦稱為IMFINZI™、MEDI-4736；參見WO 2011/066389)、阿維魯單抗(Pfizer；亦稱為BAVENCIO®、MSB-0010718C；參見WO 2013/079174)、STI-1014 (Sorrento；參見WO2013/181634)、CX-072 (Cytomx；參見WO2016/149201)、KN035 (3D Med/Alphamab；參見Zhang等人, Cell Discov. 7:3 (2017年3月)、LY3300054 (Eli Lilly Co.；參見例如WO 2017/034916)、BGB-A333 (BeiGene；參見Desai等人, JCO 36 ( 第 15 增刊 ):TPS3113 (2018))及CK-301 (Checkpoint Therapeutics；參見Gorelik等人, AACR:Abstract 4606 (2016年4月))。
在某些態樣中，PD-L1抗體為阿特珠單抗(TECENTRIQ®)。阿特珠單抗為完全人類化IgG1單株抗PD-L1抗體。
在某些態樣中，PD-L1抗體為德瓦魯單抗(IMFINZI™)。德瓦魯單抗為人類IgG1 κ單株抗PD-L1抗體。
在某些態樣中，PD-L1抗體為阿維魯單抗(BAVENCIO®)。阿維魯單抗為人類IgG1λ單株抗PD-L1抗體。
可用於所揭示之組合物及方法中的抗PD-L1抗體亦包括特異性地結合至人類PD-L1且與本文所揭示之任何抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗、德瓦魯單抗及/或阿維魯單抗)交叉競爭結合至人類PD-L1的經分離抗體。在一些態樣中，抗PD-L1抗體結合與本文所述之抗PD-L1抗體中之任一者，例如阿特珠單抗、德瓦魯單抗及/或阿維魯單抗相同的抗原決定基。抗體交叉競爭與抗原結合之能力指示此等抗體與抗原之相同抗原決定基區結合且空間上阻礙其他交叉競爭抗體與特定抗原決定基區之結合。藉助於此等交叉競爭抗體與參考抗體(例如阿特珠單抗及/或阿維魯單抗)結合至PD-L1之相同抗原決定基區，預期其具有極類似的功能特性。交叉競爭抗體可基於其與阿特珠單抗及/或阿維魯單抗交叉競爭之能力而在標準PD-L1結合分析，諸如Biacore分析、ELISA分析或流式細胞測量術中容易地鑑別(參見例如WO 2013/173223)。
在某些態樣中，與阿特珠單抗、德瓦魯單抗及/或阿維魯單抗交叉競爭結合至人類PD-L1，或與其結合至人類PD-L1抗體之相同抗原決定區的抗體為單株抗體。為了向人類個體投與，此等交叉競爭抗體為嵌合抗體、工程化抗體或者人類化或人類抗體。此類嵌合、工程化、人類化或人類單株抗體可藉由此項技術中熟知之方法來加以製備及分離。
可用於本發明之組合物及方法中的抗PD-L1抗體亦包括以上抗體之抗原結合部分。已充分表明抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。
適用於所揭示之方法或組合物中的抗PD-L1抗體為以高特異性及親和力結合至PD-L1、阻斷PD-1之結合且抑制PD-1信號傳導路徑之免疫抑制作用的抗體。在本文所揭示之任一組合物或方法中，抗PD-L1「抗體」包括結合至PD-L1且展現功能特性在抑制受體結合及上調免疫系統方面類似於全抗體之彼等功能特性的抗原結合部分或片段。在某些態樣中，抗PD-L1抗體或其抗原結合部分與阿特珠單抗、德瓦魯單抗及/或阿維魯單抗交叉競爭結合至人類PD-L1。
適用於本發明之抗PD-L1抗體可為特異性結合至PD-L1之任何PD-L1抗體，例如與德瓦魯單抗、阿維魯單抗或阿特珠單抗交叉競爭結合至人類PD-1之抗體，例如與德瓦魯單抗、阿維魯單抗或阿特珠單抗結合至相同抗原決定基之抗體。在特定態樣中，抗PD-L1抗體為德瓦魯單抗。在其他態樣中，抗PD-L1抗體為阿維魯單抗。在一些態樣中，抗PD-L1抗體為阿特珠單抗。
在一些態樣中，抗PD-L1抗體以介於以下範圍內之劑量投與：約0.1 mg/kg至約20.0mg/kg體重、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg、約10 mg/kg、約11 mg/kg、約12 mg/kg、約13 mg/kg、約14 mg/kg、約15 mg/kg、約16 mg/kg、約17 mg/kg、約18 mg/kg、約19 mg/kg或約20 mg/kg，約每2、3、4、5、6、7或8週一次。
在一些態樣中，抗PD-L1抗體以約每3週一次約15 mg/kg體重之劑量投與。在其他態樣中，抗PD-L1抗體以約每2週一次約10 mg/kg體重之劑量投與。
在其他態樣中，適用於本發明之抗PD-L1抗體為均一劑量。在一些態樣中，抗PD-L1抗體以約200 mg至約1600 mg、約200 mg至約1500 mg、約200 mg至約1400 mg、約200 mg至約1300 mg、約200 mg至約1200 mg、約200 mg至約1100 mg、約200 mg至約1000 mg、約200 mg至約900 mg、約200 mg至約800 mg、約200 mg至約700 mg、約200 mg至約600 mg、約700 mg至約1300 mg、約800 mg至約1200 mg、約700 mg至約900 mg或約1100 mg至約1300 mg之均一劑量投與。在一些態樣中，抗PD-L1抗體以至少約240 mg、至少約300 mg、至少約320 mg、至少約400 mg、至少約480 mg、至少約500 mg、至少約560 mg、至少約600 mg、至少約640 mg、至少約700 mg、至少720 mg、至少約800 mg、至少約840 mg、至少約880 mg、至少約900 mg、至少960 mg、至少約1000 mg、至少約1040 mg、至少約1100 mg、至少約1120 mg、至少約1200 mg、至少約1280 mg、至少約1300 mg、至少約1360 mg或至少約1400 mg之均一劑量，以約1、2、3或4週之給藥時間間隔投與。在一些態樣中，抗PD-L1抗體約每3週一次以約1200 mg之均一劑量投與。在其他態樣中，抗PD-L1抗體約每2週一次以約800 mg之均一劑量投與。在其他態樣中，抗PD-L1抗體約每2週一次以約840 mg之均一劑量投與。
在一些態樣中，阿特珠單抗約每3週一次以約1200 mg之均一劑量投與。在一些態樣中，阿特珠單抗約每2週一次以約800 mg之均一劑量投與。在一些態樣中，阿特珠單抗約每2週一次以約840 mg之均一劑量投與。
在一些態樣中，阿維魯單抗約每2週一次以約800 mg之均一劑量投與。
在一些態樣中，德瓦魯單抗約每2週一次以約10 mg/kg之劑量投與。在一些態樣中，德瓦魯單抗約每2週一次以約800 mg/kg之均一劑量投與。在一些態樣中，德瓦魯單抗約每3週一次以約1200 mg之均一劑量投與。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) PD-L1及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) PD-L1及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 II.D.   組合療法
在本發明之一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物與額外抗癌療法組合投與。在本發明之一些態樣中，本文所揭示之方法包含投與抗PD-1抗體(或抗PD-L1抗體)與額外抗癌療法之組合。額外抗癌療法可包含用於治療個體之腫瘤的任何療法及/或如本文所揭示之任何標準照護療法。在一些態樣中，額外抗癌療法包含手術、放射線療法、化學療法、免疫療法或其任何組合。在一些態樣中，額外抗癌療法包含化學療法，包括本文所揭示之任何化學療法。在一些態樣中，額外抗癌療法包含免疫療法。在一些態樣中，額外抗癌療法包含投與特異性結合以下各者之抗體或其抗原結合部分：CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM3、NKG2a、OX40、ICOS、MICA、CD137、KIR、TGFβ、IL-10、IL-8、B7-H4、Fas配位體、CXCR4、間皮素、CD27、GITR或其任何組合。在一些態樣中，額外抗癌療法包含投與IL-2 (例如經修飾之IL-2，例如聚乙二醇化IL-2，例如貝培阿地介白素)。在一些態樣中，第二治療劑、第三治療劑或兩者包含IL12-Fc (例如BMS-986415)。
在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體根據本文所揭示之任何方法皮下投與，且額外抗癌療法藉由此項技術中已知之任何適合途徑投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體根據本文所揭示之任何方法皮下投與，且額外抗癌療法係皮下投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體根據本文所揭示之任何方法皮下投與，且額外抗癌療法係靜脈內投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與額外抗癌療法同時投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與額外抗癌療法依序投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與額外抗癌療法在同一天投與。在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與額外抗癌療法在不同天投與。
在一些態樣中，抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體及額外抗癌療法，例如檢查點抑制劑係在單一調配物中組合。
在一些態樣中，該方法包含投與治療有效量之抗PD-1抗體及抗CTLA-4抗體，例如伊匹單抗。在其他態樣中，該方法包含投與治療有效量之包含抗PD-L1抗體及抗CTLA-4抗體之組合物。以高親和力特異性地結合至CTLA-4之人類單株抗體已揭示於美國專利第6,984,720號中。其他抗CTLA-4單株抗體已描述於例如美國專利第5,977,318號、第6,051,227號、第6,682,736號及第7,034,121號以及國際公開案第WO 2012/122444號、第WO 2007/113648號、第WO 2016/196237號及第WO 2000/037504號中，該等專利各自以全文引用之方式併入本文中。在某些態樣中，CTLA-4抗體選自由以下組成之群：伊匹單抗(亦稱為YERVOY®、MDX-010,10D1；參見美國專利第6,984,720號)、MK-1308 (Merck)、AGEN-1884 (Agenus Inc.；參見WO 2016/196237)及曲美單抗(AstraZeneca；亦稱為替西單抗，CP-675,206；參見WO 2000/037504及Ribas, Update Cancer Ther.2(3): 133-39 (2007))。在特定態樣中，抗CTLA-4抗體為伊匹單抗。在特定態樣中，CTLA-4抗體為曲美單抗。在特定態樣中，CTLA-4抗體為MK-1308。在特定態樣中，CTLA-4抗體為AGEN-1884。
在一些態樣中，該方法包含投與治療有效量之抗PD-1抗體及抗LAG-3抗體。在其他態樣中，該方法包含投與治療有效量之包含抗PD-1抗體及抗LAG-3抗體，例如瑞拉單抗之單一調配物。在一些態樣中，抗LAG-3抗體為瑞拉單抗，例如如PCT/US13/48999中所述之BMS-986016，該案之教示內容以引用之方式併入本文中。在一些態樣中，抗LAG-3抗體與瑞拉單抗交叉競爭結合至人類LAG-3。在一些態樣中，抗LAG-3抗體與瑞拉單抗結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，抗LAG-3抗體為瑞拉單抗之生物類似物。在一些態樣中，抗LAG-3抗體為LAG-525、MK-4280、REGN3767、TSR-033、TSR-075、Sym022、FS-118或其任何組合。
在一些態樣中，該方法包含投與治療有效量之根據本文所揭示之任何方法的抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體及化學療法。在一些態樣中，化學療法包含基於鉑之療法。在一些態樣中，基於鉑之療法包含選自由以下組成之群的基於鉑之抗腫瘤劑：順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、萘達鉑、四硝酸三鉑、菲鉑、吡鉑、賽特鉑及其任何組合。在某些態樣中，基於鉑之療法包含順鉑。在一個特定態樣中，基於鉑之療法包含卡鉑。在一些態樣中，化學療法包含選自由以下組成之群的抗癌劑：鉑劑(例如順鉑、卡鉑)、紫杉烷劑(例如紫杉醇、白蛋白結合型紫杉醇、多西他賽(docetaxel))、長春瑞賓、長春鹼、依託泊苷(etoposide)、培美曲唑、吉西他濱(gemcitabine)、貝伐單抗(bevacizumab) (AVASTIN®)、埃羅替尼(erlotinib) (TARCEVA®)、克卓替尼(crizotinib) (XALKORI®)、西妥昔單抗(cetuximab) (ERBITUX®)及其任何組合。在某些態樣中，化學療法包含基於鉑之雙重化學療法。 II.E.   腫瘤
本發明之某些態樣係關於治療有需要之個體的方法，其包含皮下遞送抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，個體罹患癌症(例如源自癌症之腫瘤)。在一些態樣中，腫瘤源自選自由以下組成之群的癌症：鱗狀細胞癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、鱗狀NSCLC、非鱗狀NSCLC、神經膠質瘤、胃腸癌、腎癌、透明細胞癌、卵巢癌、肝癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、腎細胞癌(RCC)、前列腺癌、激素難治性前列腺腺癌、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、膠質母細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、頭頸癌、胃癌、生殖細胞腫瘤、小兒肉瘤、鼻腔鼻竇自然殺手、黑素瘤、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門區癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、直腸癌、兒童實體腫瘤、尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦癌、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、環境誘發之癌症(包括石棉誘發之癌症)、病毒相關癌症或病毒起源之癌症(例如人類乳頭狀瘤病毒(HPV相關或起源之腫瘤))及其任何組合。在某些態樣中，個體已接受一種、兩種、三種、四種、五種或更多種先前癌症治療。在其他態樣中，個體未接受過治療。在一些態樣中，個體在其他癌症治療時進展。在某些態樣中，先前癌症治療包含免疫療法。在其他態樣中，先前癌症治療包含化學療法。在一些態樣中，腫瘤已復發。在一些態樣中，腫瘤為轉移性的。在其他態樣中，腫瘤不為轉移性的。在一些態樣中，腫瘤為局部晚期的。
在一些態樣中，個體已接受先前療法來治療腫瘤且腫瘤為復發性或難治性的。在某些態樣中，至少一種先前療法包含標準照護療法。在一些態樣中，至少一種先前療法包含手術、放射線療法、化學療法、免疫療法或其任何組合。在一些態樣中，至少一種先前療法包含化學療法。在一些態樣中，個體已接受先前免疫腫瘤學(I-O)療法以治療腫瘤且腫瘤為復發性或難治性的。在一些態樣中，個體已接受超過一種先前療法來治療腫瘤且個體為復發性或難治性的。在其他態樣中，個體已接受抗PD-1或抗PD-L1抗體療法。
在一些態樣中，先前療法方案包含化學療法。在一些態樣中，化學療法包含基於鉑之療法。在一些態樣中，基於鉑之療法包含選自由以下組成之群的基於鉑之抗腫瘤劑：順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、萘達鉑、四硝酸三鉑、菲鉑、吡鉑、賽特鉑及其任何組合。在某些態樣中，基於鉑之療法包含順鉑。在一個特定態樣中，基於鉑之療法包含卡鉑。
在一些態樣中，至少一種先前療法選自包含投與選自由以下組成之群的抗癌劑之療法：鉑劑(例如順鉑、卡鉑)、紫杉烷劑(例如紫杉醇、白蛋白結合型紫杉醇、多西他賽)、長春瑞賓、長春鹼、依託泊苷、培美曲唑、吉西他濱、貝伐單抗(AVASTIN®)、埃羅替尼(TARCEVA®)、克卓替尼(XALKORI®)、西妥昔單抗(ERBITUX®)及其任何組合。在某些態樣中，至少一種先前療法包含基於鉑之雙重化學療法。
在一些態樣中，個體在至少一種先前療法之後已經歷疾病進展。在某些態樣中，個體已接受至少兩種先前療法、至少三種先前療法、至少四種先前療法或至少五種先前療法。在某些態樣中，個體已接受至少兩種先前療法。在一個態樣中，個體在至少兩種先前療法之後已經歷疾病進展。在某些態樣中，至少兩種先前療法包含第一先前療法及第二先前療法，其中該個體在第一先前療法及/或第二先前療法之後已經歷疾病進展，且其中該第一先前療法包含手術、放射線療法、化學療法、免疫療法或其任何組合；且其中該第二先前療法包含手術、放射線療法、化學療法、免疫療法或其任何組合。在一些態樣中，第一先前療法包含基於鉑之雙重化學療法，且第二先前療法包含單一藥劑化學療法。在某些態樣中，單一藥劑化學療法包含多西他賽。
在某些態樣中，腫瘤為PD-L1陽性腫瘤。如本文所用，「PD-L1陽性」可與「至少約1%之PD-L1表現」互換使用。可藉由此項技術中已知之任何方法量測PD-L1表現。在一些態樣中，藉由自動化IHC量測PD-L1表現。因此，PD-L1陽性腫瘤可具有至少約1%、至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%表現PD-L1之腫瘤細胞，如藉由自動化IHC所量測。在某些態樣中，「PD-L1陽性」意謂存在至少100個在細胞表面上表現PD-L1之細胞。
為了評估PD-L1表現，在一個態樣中，測試組織樣品係獲自需要本文所揭示之療法的患者。在另一態樣中，PD-L1表現之評估係在不獲得測試組織樣品之情況下達成。在一些態樣中，選擇適合之患者包括(i)視情況提供獲自組織癌症患者之測試組織樣品，該測試組織樣品包含腫瘤細胞及/或腫瘤浸潤炎性細胞；及(ii)基於測試組織樣品中表現細胞表面上之PD-L1之細胞的比例高於預定臨限值的評估來評估測試組織樣品中表現細胞表面上之PD-L1之細胞的比例。
然而，在包含量測測試組織樣品中之PD-L1表現的任何方法中，應理解，包含提供獲自患者之測試組織樣品的步驟為視情況選用之步驟。亦應理解，在某些態樣中，鑑別或確定測試組織樣品中表現PD-L1 (例如表現細胞表面上之PD-L1)之細胞數目或比例的「量測」或「評估」步驟係藉由分析PD-L1表現之轉化方法，例如藉由進行反轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析或IHC分析來進行。在某些其他態樣中，不包括轉化步驟且PD-L1表現係藉由例如審查來自實驗室之測試結果報告來評估。在某些態樣中，至多(且包括)評估PD-L1表現之方法步驟提供中間結果，該中間結果可提供給醫師或其他保健提供者以用於選擇抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體療法之適合候選物。在某些態樣中，提供中間結果之步驟由開業醫師或在開業醫師指導下行動的某人執行。在其他態樣中，此等步驟由獨立實驗室或由諸如實驗室技術員之獨立個人執行。
在任何本發明方法之某些態樣中，表現PD-L1之細胞之比例係藉由執行分析以確定PD-L1 RNA的存在來評估。在其他態樣中，藉由RT-PCR、原位雜交或RNA酶保護來確定PD-L1 RNA的存在。在其他態樣中，表現PD-L1之細胞之比例係藉由執行分析以確定PD-L1多肽的存在來評估。在其他態樣中，藉由免疫組織化學(IHC)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、活體內成像或流動式細胞測量術來確定PD-L1多肽之存在。在一些態樣中，藉由IHC分析PD-L1表現。在所有此等方法之其他態樣中，使用例如IHC或活體內成像來分析PD-L1之細胞表面表現。
成像技術已在癌症研究及治療中提供重要工具。分子成像系統之最新發展，包括正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)、螢光反射率成像(FRI)、螢光介導之斷層攝影術(FMT)、生物發光成像(BLI)、雷射掃描共聚焦顯微術(LSCM)及多光子顯微術(MPM)將可能預示此等技術在癌症研究中的應用會更加廣泛。此等分子成像系統中之一些使臨床醫師不僅可見腫瘤在體內之位置，且亦可目視影響腫瘤行為及/或對治療藥物之反應之特定分子、細胞及生物過程的表現及活性(Condeelis及Weissleder, 「In vivo imaging in cancer」, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(12):a003848 (2010))。抗體特異性，連同PET之靈敏度及解析度使得免疫PET成像對於監測及分析組織樣品中抗原之表現特別有吸引力(McCabe及Wu, 「Positive progress in immunoPET-not just a coincidence」, Cancer Biother. Radiopharm. 25(3):253-61 (2010)；Olafsen等人, 「ImmunoPET imaging of B-cell lymphoma using 124I-anti-CD20 scFv dimers (diabodies)」, Protein Eng. Des. Sel. 23(4):243-9 (2010))。在任何本發明方法之某些態樣中，PD-L1表現係藉由免疫PET成像分析。在任何本發明方法之某些態樣中，測試組織樣品中表現PD-L1之細胞的比例係藉由執行分析以確定測試組織樣品中之細胞表面上PD-L1多肽的存在來評估。在某些態樣中，測試組織樣品為FFPE組織樣品。在其他態樣中，藉由IHC分析確定PD-L1多肽之存在。在其他態樣中，使用自動化方法執行IHC分析。在一些態樣中，使用結合至PD-L1多肽之抗PD-L1單株抗體執行IHC分析。
在本發明方法之一個態樣中，使用自動化IHC方法分析FFPE組織標本中之細胞表面上PD-L1的表現。本發明提供用於偵測測試組織樣品中人類PD-L1抗原之存在或定量人類PD-L1抗原之含量或樣品中表現抗原之細胞比例的方法，該等方法包含在允許在抗體或其部分與人類PD-L1之間形成複合物之條件下，使測試樣品及陰性對照樣品與特異性結合至人類PD-L1之單株抗體接觸。在某些態樣中，測試及對照組織樣品為FFPE樣品。隨後偵測複合物形成，其中測試樣品與陰性對照樣品之間複合物形成的差異指示樣品中存在人類PD-L1抗原。使用各種方法定量PD-L1表現。
在一個特定態樣中，自動化IHC方法包含：(a)在自動染色儀中對固定的組織切片進行脫蠟及再水化；(b)使用解蔽槽(decloaking chamber)及pH 6緩衝液回收抗原，加熱至110℃後維持10分鐘；(c)在自動染色儀上設置試劑；(d)運行自動染色儀以包括中和組織標本中之內源性過氧化酶的步驟；阻斷載玻片上之非特異性蛋白質結合位點；用一級抗體培育載玻片；與一級後阻斷劑一起培育；與NovoLink Polymer一起培育；添加色素原受質且顯影；且用蘇木精複染。
為了評估腫瘤組織樣品中之PD-L1表現，病理學家在顯微鏡下檢查各視野中之膜PD-L1 + +腫瘤細胞之數目，且在內心估計陽性細胞之百分比，然後對其取平均值以得出最終百分比。不同染色強度定義為0/陰性、1+/弱、2+/中等及3+/強。通常，首先將百分比值分配給0及3+桶，且接著考慮中間的1+及2+強度。對於高度異質的組織，將標本劃分為多個區域，且對各區域單獨評分，且接著組合為單組百分比值。自各區域確定不同染色強度之陰性及陽性細胞的百分比，且對於各區域給出中值。對於各染色強度類別之組織給出最終百分比值：陰性、1+、2+及3+。所有染色強度之總和必須為100%。在一個態樣中，需要為PD-L1陽性之細胞的臨限數目為至少約100個、至少約125個、至少約150個、至少約175個或至少約200個細胞。在某些態樣中，需要為PD-L1陽性之細胞的臨限數目為至少約100個細胞。
亦在腫瘤浸潤炎性細胞，諸如巨噬細胞及淋巴球中評估染色。在大多數情況下，巨噬細胞充當內部陽性對照，因為在大部分巨噬細胞中觀測到染色。雖然不需要以3+強度染色，但應考慮不存在巨噬細胞染色，以排除任何技術故障。評估巨噬細胞及淋巴球之質膜染色，且僅將所有樣品記錄為對於各細胞類別呈陽性或陰性。染色亦根據外部/內部腫瘤免疫細胞名稱進行表徵。「內部」意謂免疫細胞在腫瘤組織內及/或在腫瘤區域之邊界上，而不物理插入腫瘤細胞之間。「外部」意謂與腫瘤無物理關聯，免疫細胞位於與結締組織或任何相關鄰近組織相關的周邊。
在此等評分方法之某些態樣中，樣品由獨立操作的兩名病理學家評分，且隨後合併評分。在某些其他態樣中，使用適當軟體對陽性及陰性細胞之鑑定進行評分。
組織評分(亦描述為H評分)用作IHC資料之更定量量測。組織評分計算如下： 組織評分 = [(% 腫瘤 × 1 (低強度)) + (% 腫瘤 × 2 (中等強度)) + (% 腫瘤 × 3 (高強度)]
為了確定組織評分，病理學家估計標本內各強度類別中之染色細胞的百分比。由於大多數生物標記之表現係異質的，所以組織評分為整體表現之更真實表示。最終組織評分範圍為0 (無表現)至300 (最大表現)。
定量測試組織樣品IHC中之PD-L1表現的一種替代方法為確定調整後的炎症評分(AIS)評分，該評分定義為炎症密度乘以腫瘤浸潤炎性細胞之PD-L1表現百分比(Taube等人, 「Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape」, Sci . Transl . Med . 4 ( 127 ):127ra37 (2012))。 III. 本發明之組合物
包含抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體之醫藥組合物亦在本發明之範疇內。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法調配醫藥組合物用於皮下投與。在一些態樣中，醫藥組合物經調配以使得其與不含兩種抗氧化劑或至少一種抗氧化劑之組合物相比展現改良之特性。本發明之治療劑可以組合物形式構成，例如含有抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。較佳地，含有抗體之組合物的載劑適合於靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸注)，而含有抗體及/或細胞介素之組合物的載劑適合於非腸胃外，例如經口投與。在某些態樣中，醫藥組合物不包含玻尿酸酶。
在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約10 mg/mL至至少約500 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約10 mg/mL至至少約500 mg/mL、至少約10 mg/mL至至少約400 mg/mL、至少約10 mg/mL至至少約300 mg/mL、至少約10 mg/mL至至少約250 mg/mL、至少約10 mg/mL至至少約200 mg/mL、至少約10 mg/mL至至少約190 mg/mL、至少約10 mg/mL至至少約180 mg/mL、至少約10 mg/mL至至少約170 mg/mL、至少約10 mg/mL至至少約160 mg/mL、至少約10 mg/mL至至少約150 mg/mL、至少約20 mg/mL至至少約500 mg/mL、至少約20 mg/mL至至少約400 mg/mL、至少約20 mg/mL至至少約300 mg/mL、至少約20 mg/mL至至少約250 mg/mL、至少約20 mg/mL至至少約200 mg/mL、至少約20 mg/mL至至少約190 mg/mL、至少約20 mg/mL至至少約180 mg/mL、至少約20 mg/mL至至少約170 mg/mL、至少約20 mg/mL至至少約160 mg/mL、至少約20 mg/mL至至少約150 mg/mL、至少約50 mg/mL至至少約200 mg/mL、至少約100 mg/mL至至少約200 mg/mL、至少約150 mg/mL至至少約200 mg/mL、至少約135 mg/mL至至少約180 mg/mL、至少約100 mg/mL至至少約200 mg/mL、至少約150 mg/mL至至少約200 mg/mL、至少約100 mg/mL至至少約130 mg/mL或至少約108 mg/mL至至少約132 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約50 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約60 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約70 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約75 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約80 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約90 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約100 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約108 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約110 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約120 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約130 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約132 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約135 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約140 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約150 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約160 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約170 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約175 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約180 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約190 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約200 mg/mL抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。 III.A.  內切糖苷酶水解酵素
在一些態樣中，醫藥組合物包含內切糖苷酶水解酵素。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約50 U/mL至至少約48000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約50 U/mL至至少約5000 U/mL之內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約50 U/mL、至少約100 U/mL、至少約150 U/mL、至少約200 U/mL、至少約250 U/mL、至少約300 U/mL、至少約350 U/mL、至少約400 U/mL、至少約450 U/mL、至少約500 U/mL、至少約750 U/mL、至少約1000 U/mL、至少約1500 U/mL、至少約2000 U/mL、至少約2500 U/mL、至少約3000 U/mL、至少約3500 U/mL、至少約4000 U/mL、至少約4500 U/mL、至少約5000 U/mL、至少約5500 U/mL、至少約6000 U/mL、至少約6500 U/mL、至少約7000 U/mL、至少約7500 U/mL、至少約8000 U/mL、至少約8500 U/mL、至少約9000 U/mL、至少約9500 U/mL、至少約10,000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約500 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約1000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約2000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約2500 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約3000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約3500 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，該醫藥組合物包含至少約4000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約4500 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約5000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約6000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約7000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約8000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約9000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約10,000 U/mL內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。
在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約50單位至至少約100,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約50單位、至少約100單位、至少約150單位、至少約200單位、至少約250單位、至少約300單位、至少約400單位、至少約500單位、至少約600單位、至少約700單位、至少約800單位、至少約900單位、至少約1000單位、至少約1500單位、至少約2000單位、至少約2500單位、至少約3000單位、至少約4000單位、至少約5000單位、至少約10,000單位、至少約15,000單位、至少約20,000單位、至少約25,000單位、至少約30,000單位、至少約35,000單位、至少約40,000單位、至少約45,000單位、至少約48,000單位、至少約50,000單位、至少約55,000單位、至少約60,000單位、至少約65,000單位、至少約70,000單位、至少約75,000單位、至少約80,000單位、至少約85,000單位、至少約90,000單位、至少約95,000單位或至少約100,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約20,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約30,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約40,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約50,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約60,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約70,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約80,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約90,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約100,000單位內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。
一般熟習此項技術者將顯而易見，內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)之量可以單位或U/mL表示，或內切糖苷酶水解酵素(例如，HuPH20)之量可以mg/mL (或以其他基於重量之單位)表示。舉例而言，在一些態樣中，醫藥組合物包含表示為至少約500 U/mL或至少約0.00455 mg/mL之量的內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。在另一實例中，在一些態樣中，醫藥組合物包含表示為至少約2000 U/mL或至少約0.0182 mg/mL之量的內切糖苷酶水解酵素(例如，rHuPH20)。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約120 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約120 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約120 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約120 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。
在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約120 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約120 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約120 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約120 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。
在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸，及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含(a)約672 mg納武單抗；(b)約8.68 mg組胺酸；(c)約11.8 mg組胺酸HCl H 2O；(d)約479 mg蔗糖；(e)約2.80 mg聚山梨醇酯80；(f)約0.110 mg噴替酸；(g)約4.18 mg甲硫胺酸；(h)約0.102 mg rHuPH20；其中(a)-(h)在水中復原至至少約5.6 mL之最終體積。 III.B.  抗氧化劑
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含抗氧化劑。任何抗氧化劑均可用於本文所揭示之醫藥組合物中。在一些態樣中，抗氧化劑選自甲硫胺酸、色胺酸及組胺酸、半胱胺酸、抗壞血酸、甘胺酸、噴替酸(DTPA)及EDTA。在某些態樣中，醫藥組合物包含甲硫胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少兩種抗氧化劑。在一些態樣中，超過一種抗氧化劑，例如兩種抗氧化劑防止調配物組分氧化及/或提高抗體穩定性。在一些態樣中，至少兩種抗氧化劑包含(i)甲硫胺酸及EDTA或(ii)甲硫胺酸及噴替酸(DTPA)。
在一些態樣中，醫藥組合物包含抗PD-1抗體、甲硫胺酸及噴替酸(DTPA)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.1 mM至至少約100 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約1 mM、至少約1.5 mM、至少約2 mM、至少約2.5 mM、至少約3 mM、至少約3.5 mM、至少約4 mM、至少約4.5 mM、至少約5 mM、至少約5.5 mM、至少約6 mM、至少約6.5 mM、至少約7 mM、至少約7.5 mM、至少約8 mM、至少約8.5 mM、至少約9 mM、至少約9.5 mM、至少約10 mM、至少約11 mM、至少約12 mM、至少約13 mM、至少約14 mM、至少約15 mM、至少約16 mM、至少約17 mM、至少約18 mM、至少約19 mM或至少約20 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約10 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約9 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約8 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約7 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約6 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約4 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約3 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約2 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約1 mM甲硫胺酸。
在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約1 µM至至少約250 µM噴替酸(DTPA)。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約1 µM、至少約5 µM、至少約10 µM、至少約15 µM、至少約20 µM、至少約25 µM、至少約30 µM、至少約35 µM、至少約40 µM、至少約45 µM、至少約50 µM、至少約55 µM、至少約60 µM、至少約65 µM、至少約70 µM、至少約75 µM、至少約80 µM、至少約85 µM、至少約90 µM、至少約95 µM、至少約100 µM、至少約110 µM、至少約120 µM、至少約130 µM、至少約140 µM、至少約150 µM、至少約160 µM、至少約170 µM、至少約180 µM、至少約190 µM或至少約200 µM DTPA。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約75 µM噴替酸(DTPA)。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約70 µM噴替酸(DTPA)。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約65 µM噴替酸(DTPA)。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約60 µM噴替酸(DTPA)。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約55 µM噴替酸(DTPA)。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約50 µM噴替酸(DTPA)。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約45 µM噴替酸(DTPA)。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約40 µM噴替酸(DTPA)。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約35 µM噴替酸(DTPA)。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約30 µM噴替酸(DTPA)。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約25 µM噴替酸(DTPA)。 III.C.  張力調節劑/穩定劑
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含張力調節劑及/或穩定劑。任何張力調節劑及/或任何穩定劑均可用於本文所揭示之醫藥組合物中。在一些態樣中，張力調節劑及/或穩定劑包含糖、胺基酸、多元醇、鹽或其任何組合。在一些態樣中，張力調節劑及/或穩定劑選自由以下組成之群：蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、甘露糖醇、甘油、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、氯化鈉、脯胺酸、精胺酸、多元醇、胺基酸及鹽。
在某些態樣中，醫藥組合物包含蔗糖。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約1 mM至至少約500 mM蔗糖。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約10 mM至至少約500 mM、至少約10 mM至至少約400 mM、至少約50 mM至至少約400 mM、至少約100 mM至至少約400 mM、至少約150 mM至至少約400 mM、至少約200 mM至至少約400 mM、至少約250 mM至至少約400 mM、至少約300 mM至至少約400 mM、至少約350 mM至至少約400 mM、至少約50 mM至至少約350 mM、至少約100 mM至至少約300 mM、至少約100 mM至至少約250 mM、至少約100 mM至至少約200 mM、至少約100 mM至至少約150 mM、至少約200 mM至至少約400 mM、至少約200 mM至至少約300 mM蔗糖或至少約200 mM至至少約250 mM。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約10 mM、至少約20 mM、至少約30 mM、至少約40 mM、至少約50 mM、至少約60 mM、至少約70 mM、至少約80 mM、至少約90 mM、至少約100 mM、至少約110 mM、至少約120 mM、至少約130 mM、至少約140 mM、至少約150 mM、至少約160 mM、至少約170 mM、至少約180 mM、至少約190 mM、至少約200 mM、至少約210 mM、至少約220 mM、至少約230 mM、至少約240 mM、至少約250 mM、至少約260 mM、至少約270 mM、至少約280 mM、至少約290 mM、至少約300 mM、至少約310 mM、至少約320 mM、至少約330 mM、至少約340 mM、至少約350 mM、至少約360 mM、至少約370 mM、至少約380 mM、至少約390 mM、至少約400 mM、至少約410 mM、至少約420 mM、至少約430 mM、至少約440 mM、至少約450 mM、至少約460 mM、至少約470 mM、至少約480 mM、至少約490 mM或至少約500 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約200 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約210 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約220 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約230 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約240 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約250 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約260 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約270 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約280 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約290 mM蔗糖。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約300 mM蔗糖。 III.D.  緩衝劑
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含緩衝劑。在一些態樣中，緩衝劑係選自組胺酸、丁二酸鹽、緩血酸胺、磷酸鈉、乙酸鈉及檸檬酸鈉。在某些態樣中，醫藥組合物包含組胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含檸檬酸鹽。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約1 mM至至少約100 mM組胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約5 mM至至少約100 mM、至少約10 mM至至少約100 mM、至少約15 mM至至少約100 mM、至少約20 mM至至少約100 mM、至少約25 mM至至少約100 mM、至少約30 mM至至少約100 mM、至少約35 mM至至少約100 mM、至少約40 mM至至少約100 mM、至少約45 mM至至少約100 mM、至少約50 mM至至少約100 mM、至少約10 mM至至少約75 mM、至少約10 mM至至少約50 mM、至少約10 mM至至少約40 mM、至少約10 mM至至少約30 mM、至少約15 mM至至少約30 mM、至少約10 mM至至少約25 mM或至少約15 mM至至少約25 mM組胺酸。
在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約5 mM、至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約60 mM、至少約70 mM、至少約80 mM、至少約90 mM或至少約100 mM組胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約10 mM組胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約15 mM組胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約20 mM組胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約25 mM組胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約30 mM組胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約35 mM組胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約40 mM組胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約45 mM組胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約50 mM組胺酸。
在一些態樣中，醫藥組合物包含約5.2至約6.8之pH。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約5.2。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約5.3。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約5.4。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約5.5。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約5.6。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約5.7。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約5.8。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約5.9。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約6.0。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約6.1。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約6.2。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約6.3。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約6.4。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約6.5。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約6.6。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約6.7。在一些態樣中，醫藥組合物之pH為約6.8。 III.E.  界面活性劑
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含界面活性劑。任何界面活性劑均可用於本文所揭示之醫藥組合物中。在一些態樣中，界面活性劑選自由以下組成之群：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及泊洛沙姆188。在某些態樣中，醫藥組合物包含聚山梨醇酯80。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.001%至至少約1% w/v聚山梨醇酯80。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.01%至至少約0.1%、至少約0.02%至至少約0.1%、至少約0.03%至至少約0.1%、至少約0.04%至至少約0.1%、至少約0.05%至至少約0.1%、至少約0.01%至至少約0.09%、至少約0.01%至至少約0.8%、至少約0.01%至至少約0.7%、至少約0.01%至至少約0.6%、至少約0.01%至至少約0.5%、至少約0.02%至至少約0.09%、至少約0.03%至至少約0.08%、至少約0.04%至至少約0.07%或至少約0.04%至至少約0.06% w/v 聚山梨醇酯80。在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.01%至至少約0.1% w/v聚山梨醇酯80。
在一些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.01% w/v、至少約0.02% w/v、至少約0.03% w/v、至少約0.04% w/v、至少約0.05% w/v、至少約0.06% w/v、至少約0.07% w/v、至少約0.08% w/v、至少約0.09% w/v或至少約0.1% w/v聚山梨醇酯80。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.03% w/v聚山梨醇酯80。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.04% w/v聚山梨醇酯80。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.05% w/v聚山梨醇酯80。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.06% w/v聚山梨醇酯80。在某些態樣中，醫藥組合物包含至少約0.07% w/v聚山梨醇酯80。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約120 mg/mL抗PD1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約120 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。
在一些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗PD-1抗體，例如納武單抗；(b)檢查點抑制劑，例如抗CTLA-4抗體；(c)約20 mM組胺酸；(d)約250 mM蔗糖；(e)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(f)約50 µM噴替酸；及(g)約5 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗PD-1抗體，例如納武單抗；(b)檢查點抑制劑，例如抗CTLA-4抗體；(c)約20 mM組胺酸；(d)約250 mM蔗糖；(e)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(f)約50 µM噴替酸；(g)約5 mM甲硫胺酸；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗PD-1抗體，例如納武單抗；(b)檢查點抑制劑，例如抗LAG-3抗體；(c)約20 mM組胺酸；(d)約250 mM蔗糖；(e)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(f)約50 µM噴替酸；及(g)約5 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗PD-1抗體，例如納武單抗；(b)檢查點抑制劑，例如抗LAG-3抗體；(c)約20 mM組胺酸；(d)約250 mM蔗糖；(e)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(f)約50 µM噴替酸；(g)約5 mM甲硫胺酸；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約120 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約120 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約120 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約120 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，本文所述之單位劑量包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含(a)約672 mg納武單抗；(b)約8.68 mg L-組胺酸；(c)約11.8 mg組胺酸HCl H2O；(d)約479 mg蔗糖；(e)約2.80 mg聚山梨醇酯80；(f)約0.110 mg噴替酸；(g)約4.18 mg甲硫胺酸；其中(a)-(g)在水(例如注射用無菌水，SWFI)中復原至至少約5.6 mL之最終體積。 III.F.  容器及遞送裝置
本發明之一些態樣係關於一種包含本文所揭示之醫藥組合物的小瓶。在一些態樣中，該小瓶包含單位劑量之醫藥組合物。在一些態樣中，小瓶包含(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM L-組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，該小瓶不包含玻尿酸酶。
在一些態樣中，該小瓶為注射器。任何注射器均可用於本文所揭示之組合物及方法中。在一些態樣中，注射器包含一或多個改良皮下投與之機械元件。
在一些態樣中，該小瓶為自動注射器。通常，自動注射器之工作原理為患者僅經由在注射部位施加壓力來驅動針頭及後續藥物流動。壓力引起針頭護罩的驅動，該護罩與針頭接合且使得裝置注射藥物。因此，本發明之一些態樣係關於一種自動注射器，其包含(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM L-組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，自動注射器不包含玻尿酸酶。
在一些態樣中，小瓶為筆式注射器。標準筆式注射器需要患者激活按鈕，該按鈕將針頭驅動至目標註射部位。因此，本發明之一些態樣係關於注射筆，其包含(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM L-組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，注射筆不包含玻尿酸酶。
在一些態樣中，該小瓶為可穿戴泵或可穿戴裝置。在一些態樣中，可穿戴泵為貼片泵。因此，本發明之一些態樣係關於一種可穿戴泵，其包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM L-組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在一些態樣中，可穿戴泵不包含玻尿酸酶。
本發明之一些態樣係關於一種自動注射器，其包含(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM L-組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。
在一些態樣中，小瓶為筆式注射器。標準筆式注射器需要患者激活按鈕，該按鈕將針頭驅動至目標註射部位。因此，本發明之一些態樣係關於一種注射筆，其包含(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM L-組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。
在一些態樣中，該小瓶為可穿戴泵或可穿戴裝置。在一些態樣中，可穿戴泵為貼片泵。因此，本發明之一些態樣係關於一種可穿戴泵，其包含(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM L-組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約0.0182 mg/mL rHuPH20。 III.G. 額外治療劑
在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含第二治療劑(例如抗PD-1抗體及額外治療劑，或抗PD-L1抗體及額外治療劑)。在一些態樣中，醫藥組合物進一步包含第三治療劑。額外治療劑可包含用於治療個體之腫瘤的任何療法及/或如本文所揭示之任何標準照護療法。在一些態樣中，額外治療劑包含第二抗體。在一些態樣中，額外治療劑包含特異性結合以下各者之抗體或其抗原結合部分：CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM3、NKG2a、OX40、ICOS、MICA、CD137、KIR、TGFβ、IL-10、IL-8、B7-H4、Fas配位體、CXCR4、間皮素、CD27、GITR或其任何組合。在一些態樣中，第二治療劑、第三治療劑或兩者包含IL-2 (例如貝培阿地介白素)。在一些態樣中，第二治療劑、第三治療劑或兩者包含IL12-Fc (例如BMS-986415)。
在一些態樣中，抗體為多特異性抗體。在一些態樣中，抗體為雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為三特異性抗體。在一些態樣中，抗體特異性結合(i) PD-1及(ii)第二抗原。在一些態樣中，抗體特異性結合(i) PD-1，(ii)第二抗原，及(iii)第三抗原。在一些態樣中，抗體特異性結合(i) PD-L1及(ii)第二抗原。在一些態樣中，抗體特異性結合(i) PD-L1、(ii)第二抗原及(iii)第三抗原。在一些態樣中，第二抗原與第三抗原相同。在一些態樣中，第二抗原與第三抗原不同。在一些態樣中，第二抗原為CD3。
在一些態樣中，抗體特異性結合(i) TIGIT及(ii)表現於T細胞、NK細胞或兩者上之抑制性受體。在一些態樣中，抗體特異性結合(i) CD40及(ii) CD20。
在一些態樣中，第二抗體包含抗CTLA-4抗體。抗CTLA-4抗體可為結合CTLA-4且抑制其活性之任何抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，抗CTLA-4抗體為本文所揭示之任何抗CTLA-4抗體。在一些態樣中，第二抗體包含曲美單抗。在一些態樣中，第二抗體包含伊匹單抗。
在一些態樣中，第二抗體包含抗LAG3抗體。抗LAG3抗體可為結合LAG-3且抑制其活性之任何抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，抗LAG3抗體包含本文所揭示之任何抗LAG3抗體。在一些態樣中，第二抗體包含25F7。
在一些態樣中，第二抗體包含抗CD137抗體。抗CD137抗體可為結合CD137且抑制其活性之任何抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，抗CD137抗體包含本文所揭示之任何抗CD137抗體。在一些態樣中，第二抗體包含烏瑞魯單抗。
在一些態樣中，第二抗體包含抗KIR抗體。抗KIR抗體包含結合KIR且抑制其活性之任何抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，抗KIR抗體包含本文所揭示之任何抗KIR抗體。在一些態樣中，第二抗體包含利瑞路單抗。
在一些態樣中，第二抗體包含抗GITR抗體。抗GITR抗體可為結合GITR且抑制其活性之任何抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，抗GITR抗體包含本文所揭示之任何抗GITR抗體。在一些態樣中，第二抗體包含MK4166。在一些態樣中，第二抗體包含TRX518。
在一些態樣中，第二抗體包含抗CD96抗體。在一些態樣中，第二抗體包含抗TIM3抗體。在一些態樣中，第二抗體包含抗VISTA抗體。在一些態樣中，第二抗體包含抗NKG2a抗體。在一些態樣中，第二抗體包含抗ICOS抗體。在一些態樣中，第二抗體包含抗OX40抗體。在一些態樣中，第二抗體包含抗IL8抗體，諸如HuMax®-IL8 (BMS-986253)。 III.G.1.    抗CTLA-4抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗CTLA-4抗體。此項技術中已知之抗CTLA-4抗體可用於本發明之組合物及方法中。本發明之抗CTLA-4抗體結合至人類CTLA-4，以便破壞CTLA-4與人類B7受體之相互作用。因為CTLA-4與B7之相互作用轉導引起攜有CTLA-4受體之T細胞失活的信號，所以該相互作用之破壞有效地誘導、增強或延長此類T細胞之活化，藉此誘導、增強或延長免疫反應。
以高親和力特異性地結合至CTLA-4之人類單株抗體已揭示於美國專利第6,984,720號中。其他抗CTLA-4單株抗體已描述於例如美國專利第5,977,318號、第6,051,227號、第6,682,736號及第7,034,121號以及國際公開案第WO 2012/122444號、第WO 2007/113648號、第WO 2016/196237號及第WO 2000/037504號中，其中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。已證明美國專利第6,984,720號中揭示之抗CTLA-4人類單株抗體表現出以下一種或多種特徵：(a)以由至少約10 7M -1、或約10 9M -1、或約10 10M -1至10 11M -1或更高之平衡締合常數(K a )反映的結合親和力特異性結合至人類CTLA-4，如藉由Biacore分析所測定；(b)至少約10 3、約10 4或約10 5m -1s -1之動力學締合常數(k a )；(c)至少約10 3、約10 4或約10 5m -1s -1之動力學解離常數(k d )；及(d)抑制CTLA-4與B7-1 (CD80)及B7-2 (CD86)之結合。適用於本發明之抗CTLA-4抗體包括特異性結合至人類CTLA-4且展現前述特徵中之至少一個、至少兩個或至少三個的單株抗體。
在某些態樣中，CTLA-4抗體選自由以下組成之群：伊匹單抗(亦稱為YERVOY®、MDX-010,10D1；參見美國專利第6,984,720號)、MK-1308 (Merck)、AGEN-1884 (Agenus Inc.；參見WO 2016/196237)及曲美單抗(AstraZeneca；亦稱為替西單抗，CP-675,206；參見WO 2000/037504及Ribas, Update Cancer Ther .2(3): 133-39 (2007))。在特定態樣中，抗CTLA-4抗體為伊匹單抗。
在特定態樣中，CTLA-4抗體為用於本文揭示之組合物及方法的伊匹單抗。伊匹單抗為完全人類IgG1單株抗體，其阻斷CTLA-4與其B7配位體之結合，藉此刺激T細胞活化且改善患有晚期黑素瘤之患者中的總存活期(OS)。
在特定態樣中，CTLA-4抗體為曲美單抗。在特定態樣中，CTLA-4抗體為MK-1308。在特定態樣中，CTLA-4抗體為AGEN-1884。
在一些態樣中，CTLA-4抗體為非岩藻醣基化或低岩藻醣基化的。在一些態樣中，CTLA-4抗體展現增強之ADCC及/或ADCP活性。在一些態樣中，CTLA-4抗體為如PCT/US18/19868中所述之BMS-986218。
可用於所揭示之組合物及方法中之抗CTLA-4抗體亦包括特異性結合至人類CTLA-4且與本文揭示之任何抗CTLA-4抗體(例如伊匹單抗及/或曲美單抗)交叉競爭結合至人類CTLA-4之經分離抗體。在一些態樣中，抗CTLA-4抗體與本文所述之任一抗CTLA-4抗體(例如伊匹單抗及/或曲美單抗)結合相同抗原決定基。抗體交叉競爭與抗原結合之能力指示此等抗體與抗原之相同抗原決定基區結合且空間上阻礙其他交叉競爭抗體與特定抗原決定基區之結合。藉助於此等交叉競爭抗體與參考抗體(例如伊匹單抗及/或曲美單抗)結合至CTLA-4之相同抗原決定基區，預期其具有極類似的功能特性。交叉競爭抗體可基於其與伊匹單抗及/或曲美單抗交叉競爭之能力而在標準CTLA-4結合分析，諸如Biacore分析、ELISA分析或流動式細胞測量術中容易地鑑別(參見例如WO 2013/173223)。
在某些態樣中，與伊匹單抗及/或曲美單抗交叉競爭結合至人類CTLA-4，或與其結合至人類CTLA-4抗體之相同抗原決定基區的抗體為單株抗體。為了向人類個體投與，此等交叉競爭抗體為嵌合抗體、工程化抗體或者人類化或人類抗體。此類嵌合、工程化、人類化或人類單株抗體可藉由此項技術中熟知之方法來加以製備及分離。
可用於所揭示發明之組合物及方法中的抗CTLA-4抗體亦包括以上抗體之抗原結合部分。已充分表明抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。
在一些態樣中，抗CTLA-4抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗CTLA-4抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗CTLA-4抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗CTLA-4抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗CTLA-4抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
適用於所揭示之方法或組合物中的抗CTLA-4抗體為以高特異性及親和力結合至CTLA-4、阻斷CTLA-4之活性以及破壞CTLA-4與人類B7受體之相互作用的抗體。在本文揭示之組合物或方法中之任一者中，抗CTLA-4「抗體」包括抗原結合部分或片段，其結合至CTLA-4且在抑制CTLA-4與人類B7受體之相互作用及上調免疫系統中展現與全抗體之彼等類似的功能特性。在某些態樣中，抗CTLA-4抗體或其抗原結合部分與伊匹單抗及/或曲美單抗交叉競爭結合至人類CTLA-4。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) CTLA-4及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) CTLA-4及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.2.    抗LAG-3抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗LAG-3抗體，例如瑞拉單抗。本發明之抗LAG-3抗體結合至人類LAG-3。結合至LAG-3之抗體已揭示於國際公開案第WO/2015/042246及美國公開案第2014/0093511號及第2011/0150892號中，該等公開案各自以全文引用之方式併入本文中。
適用於本發明之例示性LAG-3抗體為25F7 (描述於美國公開案第2011/0150892號中)。適用於本發明之額外例示性LAG-3抗體為BMS-986016 (瑞拉單抗)。在一些態樣中，適用於本發明之抗LAG-3抗體與25F7或BMS-986016交叉競爭。在一些態樣中，適用於本發明之抗LAG-3抗體與25F7或BMS-986016結合至相同抗原決定基。在一些態樣中，抗LAG-3抗體包含六個25F7或BMS-986016之CDR。
其他此項技術中公認的可用於本發明之方法及/或組合物中之抗LAG-3抗體包括US 2011/007023中所述之IMP731 (H5L7BW)；WO2016028672及美國公開案第2020/0055938號中所述之MK-4280 (28G-10，法韋澤利單抗(favezelimab))；Burova E等人, J. Immunother. Cancer (2016); 4(增刊1):P195及美國專利第10,358,495號中所述之REGN3767 (弗安利單抗(fianlimab))；WO2017/019894中所述之人類化BAP050；GSK2831781；美國專利第10,711,060號及美國公開案第2020/0172617號中所述之IMP-701 (LAG525；埃拉利單抗(ieramilimab))；aLAG3(0414)；aLAG3(0416)；Sym022；TSR-033；TSR-075；XmAb841 (先前為XmAb22841)；MGD013 (特泊利單抗(tebotelimab))；BI754111；FS118；P 13B02-30；AVA-017；AGEN1746；RO7247669；INCAGN02385；IBI-110；EMB-02；IBI-323；LBL-007；及ABL501。適用於所主張之本發明中之此等及其他抗LAG-3抗體可見於例如以下各者中：US 10,188,730、WO 2016/028672、WO 2017/106129、WO2017/062888、WO2009/044273、WO2018/069500、WO2016/126858、WO2014/179664、WO2016/200782、WO2015/200119、WO2017/019846、WO2017/198741、WO2017/220555、WO2017/220569、WO2018/071500、WO2017/015560、WO2017/025498、WO2017/087589、WO2017/087901、WO2018/083087、WO2017/149143、WO2017/219995、US2017/0260271、WO2017/086367、WO2017/086419、WO2018/034227、WO2018/185046、WO2018/185043、WO2018/217940、WO19/011306、WO2018/208868、WO2014/140180、WO2018/201096、WO2018/204374及WO2019/018730中。此等參考文獻中之每一者之內容以全文引用之方式併入。
可用於本發明之方法及/或組合物中之抗LAG-3抗體亦包括特異性結合至人類LAG-3且與本文所揭示之任何抗LAG-3抗體，例如瑞拉單抗交叉競爭結合至人類LAG-3的經分離抗體。在一些態樣中，抗LAG-3抗體結合與本文所述之抗LAG-3抗體中之任一者，例如瑞拉單抗相同的抗原決定基。
在一些態樣中，與本文所揭示之任何抗LAG-3抗體(例如瑞拉單抗)交叉競爭結合至人類LAG-3或結合至相同抗原決定基區之抗體為單株抗體。為了向人類個體投與，此等交叉競爭抗體為嵌合抗體、工程化抗體或者人類化或人類抗體。此類嵌合、工程化、人類化或人類單株抗體可藉由此項技術中熟知之方法來加以製備及分離。
抗體交叉競爭與抗原結合之能力指示抗體與抗原之相同抗原決定基區結合且空間上阻礙其他交叉競爭抗體與特定抗原決定基區之結合。藉助於此等交叉競爭抗體與參考抗體(例如瑞拉單抗)結合至相同抗原決定基區，預期其具有極類似的功能特性。交叉競爭抗體可基於其與交叉競爭之能力而在標準結合分析，諸如Biacore分析、ELISA分析或流動式細胞測量術中容易地鑑別(參見例如WO 2013/173223)。
可用於本發明之方法及/或組合物中之抗LAG-3抗體亦包括以上全長抗體中之任一者之抗原結合部分。已充分表明抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。
在一些態樣中，抗LAG-3抗體為全長抗體。
在一些態樣中，抗LAG-3抗體為單株、人類、人類化、嵌合或多特異性抗體。在一些態樣中，多特異性抗體為雙親和力再靶向抗體(DART)、DVD-Ig或雙特異性抗體。
在一些態樣中，抗LAG-3抗體為F(ab')2片段、Fab'片段、Fab片段、Fv片段、scFv片段、dsFv片段、dAb片段或單鏈結合多肽。
在一些態樣中，抗LAG-3抗體為BMS-986016 (瑞拉單抗)、IMP731 (H5L7BW)、MK4280 (28G-10，法韋澤利單抗)、REGN3767 (弗安利單抗)、GSK2831781、人類化BAP050、IMP-701 (LAG525，埃拉利單抗)、aLAG3(0414)、aLAG3(0416)、Sym022、TSR-033、TSR-075、XmAb841 (XmAb22841)、MGD013 (特泊利單抗)、BI754111、FS118、P 13B02-30、AVA-017、25F7、AGEN1746、RO7247669、INCAGN02385、IBI-110、EMB-02、IBI-323、LBL-007、ABL501，或包含其抗原結合部分。
在一些態樣中，抗LAG-3抗體為瑞拉單抗。
在一些態樣中，抗LAG-3抗體為MGD013 (特泊利單抗)，其為雙特異性PD-1 × LAG-3 DART。
在一些態樣中，抗LAG-3抗體為REGN3767 (弗安利單抗)。
在一些態樣中，抗LAG-3抗體為LAG525 (埃拉利單抗)。
在一些態樣中，抗LAG-3抗體為MK4280 (法韋澤利單抗)。
在一些態樣中，抗LAG-3抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗LAG-3抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)瑞拉單抗。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗LAG-3抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)瑞拉單抗；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗LAG-3抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)瑞拉單抗。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗LAG-3抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)瑞拉單抗；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
適用於本發明之例示性LAG-3抗體為25F7 (描述於美國公開案第2011/0150892號中)。適用於本發明中之額外例示性LAG-3抗體為BMS-986016。在一個態樣中，適用於組合物之抗LAG-3抗體與25F7或BMS-986016交叉競爭。在另一態樣中，適用於組合物之抗LAG-3抗體與25F7或BMS-986016結合至相同抗原決定基。在其他態樣中，抗LAG-3抗體包含六個25F7或BMS-986016之CDR。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) LAG-3及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) LAG-3及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.3.    抗CD137抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗CD137抗體。抗CD137抗體特異性結合至CD137表現性免疫細胞且使其活化，刺激針對腫瘤細胞之免疫反應尤其細胞毒性T細胞反應。結合至CD137之抗體已揭示於美國公開案第2005/0095244號及美國專利第7,288,638號、第6,887,673號、第7,214,493號、第6,303,121號、第6,569,997號、第6,905,685號、第6,355,476號、第6,362,325號、第6,974,863號及第6,210,669號中。
在一些態樣中，抗CD137抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗CD137抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗CD137抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗CD137抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗CD137抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗CD137抗體為美國專利第7,288,638號中所述之烏瑞魯單抗(BMS-663513) (20H4.9-IgG4 [10C7或BMS-663513])。在一些態樣中，抗CD137抗體為美國專利第7,288,638號中所述之BMS-663031 (20H4.9-IgG1)。在一些態樣中，抗CD137抗體為美國專利第6,887,673號中所述之4E9或BMS-554271。在一些態樣中，抗CD137抗體為美國專利第7,214,493號；第6,303,121號；第6,569,997號；第6,905,685號；或第6,355,476號中所揭示之抗體。在一些態樣中，抗CD137抗體為美國專利第6,362,325號中所述之1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3E1。在一些態樣中，抗CD137抗體為頒予之美國專利第6,974,863號中所揭示的抗體(諸如53A2)。在一些態樣中，抗CD137抗體為頒予之美國專利第6,210,669號中所揭示的抗體(諸如1D8、3B8或3E1)。在一些態樣中，抗體為Pfizer之PF-05082566 (PF-2566)。在其他態樣中，適用於本發明之抗CD137抗體與本文所揭示之抗CD137抗體交叉競爭。在一些態樣中，抗CD137抗體與本文揭示之抗CD137抗體結合至相同抗原決定基。在其他態樣中，適用於本發明之抗CD137抗體包含本文所揭示之抗CD137抗體的六個CDR。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) CD137及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) CD137及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.4.    抗KIR抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗KIR3抗體。特異性結合至KIR之抗體阻斷NK細胞上殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)與其配位體之間的相互作用。阻斷此等受體促進NK細胞活化，且後者可能破壞腫瘤細胞。抗KIR抗體之實例已揭示於國際公開案第WO/2014/055648號、第WO 2005/003168號、第WO 2005/009465號、第WO 2006/072625號、第WO 2006/072626號、第WO 2007/042573號、第WO 2008/084106號、第WO 2010/065939號、第WO 2012/071411號及第WO/2012/160448號中。
在一些態樣中，抗KIR抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗KIR抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗KIR抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗KIR抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗KIR抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
適用於本發明中之一種抗KIR抗體為利瑞路單抗(亦稱為BMS-986015、IPH2102或1-7F9之S241P變異體)，其首先描述於國際公開案第WO 2008/084106號中。適用於本發明之另一抗KIR抗體為國際公開案第WO 2006/003179號中所述之1-7F9 (亦稱為IPH2101)。在一個態樣中，本發明組合物之抗KIR抗體與利瑞路單抗或I-7F9交叉競爭結合至KIR。在另一態樣中，抗KIR抗體與利瑞路單抗或I-7F9結合至相同抗原決定基。在其他態樣中，抗KIR抗體包含利瑞路單抗或I-7F9之六個CDR。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) KIR及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) KIR及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.5.    抗GITR抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗GITR抗體。抗GITR抗體包含特異性結合至人類GITR標靶且活化糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體(GITR)的任何抗GITR抗體。GITR為在包括調控性T細胞、效應T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞及活化樹突狀細胞之多種類型免疫細胞之表面上表現的TNF受體超家族的成員(「抗GITR促效型抗體」)。特定言之，GITR活化增加效應T細胞之增殖及功能，以及消除由活化T調控細胞誘導之抑制。另外，GITR刺激藉由增加諸如NK細胞、抗原呈現細胞及B細胞之其他免疫細胞之活性來促進抗腫瘤免疫性。抗GITR抗體之實例已揭示於國際公開案第WO/2015/031667號、第WO2015/184,099號、第WO2015/026,684號、第WO11/028683號及第WO/2006/105021號、美國專利第7,812,135號及第8,388,967號以及美國公開案第2009/0136494號、第2014/0220002號、第2013/0183321號及第2014/0348841號中。
在一些態樣中，抗GITR抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗GITR抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗GITR抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗GITR抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗GITR抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一個態樣中，適用於本發明中之抗GITR抗體為TRX518 (描述於例如Schaer等人 Curr Opin Immunol .(2012) 4月; 24(2): 217-224及WO/2006/105021中)。在另一態樣中，抗GITR抗體選自MK4166、MK1248及WO11/028683及U.S. 8,709,424中所述之抗體，且包含例如包含SEQ ID NO: 104之VH鏈及包含SEQ ID NO: 105之VL鏈(其中SEQ ID NO來自WO11/028683或U.S. 8,709,424)。在某些態樣中，抗GITR抗體為WO2015/031667中所揭示之抗GITR抗體，例如含有分別包含WO2015/031667之SEQ ID NO: 31、71及63的VH CDR 1-3及包含WO2015/031667之SEQ ID NO: 5、14及30的VL CDR 1-3之抗體。在某些態樣中，抗GITR抗體為WO2015/184099中所揭示之抗GITR抗體，例如抗體Hum231#1或Hum231#2，或其CDR，或其衍生物(例如pab1967、pab1975或pab1979)。在某些態樣中，抗GITR抗體為JP2008278814、WO09/009116、WO2013/039954、US20140072566、US20140072565、US20140065152或WO2015/026684中所揭示之抗GITR抗體，或為INBRX-110 (INHIBRx)、LKZ-145 (Novartis)或MEDI-1873 (MedImmune)。在某些態樣中，抗GITR抗體為PCT/US2015/033991中所述之抗GITR抗體(例如，包含28F3、18E10或19D3之可變區的抗體)。
在某些實施例中，抗GITR抗體與本文所述之抗GITR抗體，例如TRX518、MK4166或包含本文所述之VH域及VL域胺基酸序列的抗體交叉競爭。在一些態樣中，抗GITR抗體所結合之抗原決定基與本文所述之抗GITR抗體(例如，TRX518、MK4166或包含本文所述之VH域及VL域胺基酸序列的抗體)所結合之抗原決定基相同。在某些態樣中，抗GITR抗體包含TRX518、MK4166之六個CDR或包含本文所述之VH域及VL域胺基酸序列之抗體的六個CDR。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) GITR及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) GITR及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.6.    抗TIM3抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗TIM3抗體。在一些態樣中，抗TIM3抗體包含選自以下各者中所揭示之抗TIM3抗體：國際公開案第WO2018013818號、第WO/2015/117002號(例如MGB453，Novartis)、第WO/2016/161270號(例如TSR-022，Tesaro/AnaptysBio)、第WO2011155607號、第WO2016/144803號(例如STI-600，Sorrento Therapeutics)、第WO2016/071448號、第WO17055399號；第WO17055404號、第WO17178493號、第WO18036561號、第WO18039020號(例如Ly-3221367，Eli Lilly)、第WO2017205721號、第WO17079112號；第WO17079115號；第WO17079116號、第WO11159877號、第WO13006490號、第WO2016068802號、第WO2016068803號、第WO2016/111947號、第WO/2017/031242號。
在一些態樣中，抗TIM3抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗TIM3抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗TIM3抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗TIM3抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗TIM3抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) TIM-3及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) TIM-3及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.7.    抗OX40抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗OX40 (亦稱為CD134、TNFRSF4、ACT35及/或TXGP1L)抗體。在一些態樣中，抗OX40抗體包含國際公開案第WO20160196228號中所述之BMS-986178 (Bristol-Myers Squibb Company)。在一些態樣中，抗OX40抗體包含選自以下各者中所述之抗OX40抗體：國際公開案第WO95012673號、第WO199942585號、第WO14148895號、第WO15153513號、第WO15153514號、第WO13038191號、第WO16057667號、第WO03106498號、第WO12027328號、第WO13028231號、第WO16200836號、第WO 17063162號、第WO17134292號、第WO 17096179號、第WO 17096281號及第WO 17096182號。
在一些態樣中，抗OX40抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗OX40抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗OX40抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗OX40抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗OX40抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) OX40及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) OX40及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.8.    抗NKG2A抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗NKG2A抗體。NKG2A為表現於自然殺手(NK)細胞及T淋巴細胞子組上之C型凝集素受體家族的成員。特定言之，NKG2A主要表現於腫瘤浸潤性先天性免疫效應NK細胞以及一些CD8+ T細胞上。其天然配位體人類白細胞抗原E (HLA-E)在實體及血液腫瘤上進行表現。NKG2A為遮蔽HLA-E之抑制性受體。
在一些態樣中，抗NKG2A抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗NKG2A抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗NKG2A抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗NKG2A抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗NKG2A抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗NKG2A抗體包含BMS-986315，一種阻斷NKG2A與其配位體HLA-E之相互作用，由此允許抗腫瘤免疫反應活化的人類單株抗體。在一些態樣中，抗NKG2A抗體包含使T細胞、NK細胞及/或腫瘤浸潤性免疫細胞活化之檢查點抑制劑。在一些態樣中，抗NKG2A抗體包含選自例如以下各者中所述之抗NKG2A抗體：WO 2006/070286 (Innate Pharma S.A.；University of Genova)；美國專利第8,993,319號(Innate Pharma S.A.；University of Genova)；WO 2007/042573 (Innate Pharma S/A；Novo Nordisk A/S；University of Genova)；美國專利第9,447,185號(Innate Pharma S/A；Novo Nordisk A/S；University of Genova)；WO 2008/009545 (Novo Nordisk A/S)；美國專利第8,206,709號；第8,901,283號；第9,683,041號(Novo Nordisk A/S)；WO 2009/092805 (Novo Nordisk A/S)；美國專利第8,796,427號及第9,422,368號(Novo Nordisk A/S)；WO 2016/134371 (Ohio State Innovation Foundation)；WO 2016/032334 (Janssen)；WO 2016/041947 (Innate)；WO 2016/041945 (Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. LUMC)；WO 2016/041947 (Innate Pharma)；及WO 2016/041945 (Innate Pharma)。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) NKG2A及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) NKG2A及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.9.    抗ICOS抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗ICOS抗體。ICOS為作為CD28超家族之成員的免疫檢查點蛋白質。ICOS係一種55-60 kDa I型跨膜蛋白，在T細胞活化後表現於T細胞上，且在與其配位體ICOS-L (B7H2)結合後共刺激T細胞活化。ICOS亦稱為誘導性T細胞共刺激子、CVID1、AILIM、誘導性共刺激子、CD278、活化誘導性淋巴球免疫介導性分子及CD278抗原。
在一些態樣中，抗ICOS抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗ICOS抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗ICOS抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗ICOS抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗ICOS抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗ICOS抗體包含BMS-986226，一種結合至且刺激人類ICOS之人類化IgG單株抗體。在一些態樣中，抗ICOS抗體包含選自例如以下各者中所述之抗ICOS抗體：WO 2016/154177 (Jounce Therapeutics、Inc.)、WO 2008/137915 (MedImmune)、WO 2012/131004 (INSERM，French National Institute of Health and Medical Research)、EP3147297 (INSERM，French National Institute of Health and Medical Research)、WO 2011/041613 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center)、EP 2482849 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center)、WO 1999/15553 (Robert Koch Institute)、美國專利第7,259,247號及第7,722,872號(Robert Kotch Institute)；WO 1998/038216 (Japan Tobacco Inc.)、美國專利第7,045,615號、第7,112,655號及第8,389,690號(Japan Tobacco Inc.)、美國專利第9,738,718號及第9,771,424號(GlaxoSmithKline)及WO 2017/220988 (Kymab Limited)。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) ICOS及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) ICOS及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.10.  抗TIGIT抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗TIGIT抗體。在一些態樣中，抗TIGIT抗體包含BMS-986207。在一些態樣中，抗TIGIT抗體包含純系22G2，如WO 2016/106302中所述。在一些態樣中，抗TIGIT抗體包含MTIG7192A/RG6058/RO7092284或純系4.1D3，如WO 2017/053748中所述。在一些態樣中，抗TIGIT抗體包含選自例如以下各者中所述之抗TIGIT抗體：WO 2016/106302 (Bristol-Myers Squibb Company)及WO 2017/053748 (Genentech)。
在一些態樣中，抗TIGIT抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗TIGIT抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗TIGIT抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗TIM3抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗TIGIT抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) TIGIT及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體包含TIGIT雙特異性抗體，其特異性結合(i) TIGIT；及(ii)表現於T細胞、NK細胞或T細胞及NK細胞兩者上之抑制性受體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) TIGIT及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.11.  抗IL-12抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗IL-12抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗IL-12抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗IL-12抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗IL-12抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗IL-12抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗IL-12抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗IL-12抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗IL-12抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) IL-12及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) IL-12及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.12.  抗IL-13抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗IL-13抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗IL-13抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗IL-13抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗IL-13抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗IL-13抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗IL-13抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗IL-13抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗IL-13抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) IL-13及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) IL-13及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.13.  抗IL-15抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗IL-15抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗IL-15抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗IL-15抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗IL-15抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗IL-15抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗IL-15抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗IL-15抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗IL-15抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) IL-15及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) IL-15及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.14.  抗SIRPα抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗SIRPα抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗SIRPα抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗SIRPα抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗SIRPα抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗SIRPα抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗SIRPα抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗SIRPα抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗SIRPα抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) SIRPα及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) SIRPα及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.15.  抗CD47抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗CD47抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗CD47抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗CD47抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗CD47抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗CD47抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗CD47抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗CD47抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗CD47抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) CD47及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) CD47及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.16.  抗CCR8抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗CCR8抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗CCR8抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗CCR8抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗CCR8抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗CCR8抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗CCR8抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗CCR8抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗CCR8抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) CCR8及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) CCR8及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.17.  抗MICA抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗MICA抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗MICA抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗MICA抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗MICA抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗MICA抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗MICA抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗MICA抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗MICA抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) MICA及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) MICA及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.18.  抗ILT4抗體
在一些態樣中，第二抗體包含抗ILT4抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗ILT4抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；及(f)約5 mM甲硫胺酸。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)抗ILT4抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗ILT4抗體可與抗PD-1抗體一起在本文所揭示之任一調配物中調配為單一調配物。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗ILT4抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL抗PD-1抗體；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗ILT4抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；及(g)抗ILT4抗體。在某些態樣中，醫藥組合物包含：(a)約150 mg/mL納武單抗；(b)約20 mM組胺酸；(c)約250 mM蔗糖；(d)約0.05% w/v聚山梨醇酯80；(e)約50 µM噴替酸；(f)約5 mM甲硫胺酸；(g)抗ILT4抗體；及(h)約2000 U/mL rHuPH20。
在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) ILT4及(ii)第二抗原之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些態樣中，抗體為特異性結合至(i) ILT4及(ii) CD3之多特異性抗體，例如雙特異性抗體。 III.G.19.  額外抗癌劑
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗IL-10抗體。在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)長效IL-10分子。在一些態樣中，長效IL-10分子包含IL-10-Fc融合分子。在一些態樣中，長效IL-10分子包含聚乙二醇化IL-10，諸如AM0010 (ARMO BioSciences)。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗IL-2抗體。在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)長效IL-2分子。在一些態樣中，長效IL-2包含聚乙二醇化IL-2，諸如NKTR-214 (Nektar；參見US 8,252,275、WO12/065086及WO15/125159)。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗VISTA抗體。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體及(ii)抗CD96抗體。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗IL-8抗體，例如HuMax®-IL8。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體及(ii)抗TGFβ抗體。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗B7-H4抗體。在某些態樣中，抗B7-H4抗體為國際公開案第WO/2009/073533號中所揭示之抗B7-H4。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗Fas配位體抗體。在某些態樣中，抗Fas配位體抗體為國際公開案第WO/2009/073533號中所揭示之抗Fas配位體。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗CXCR4抗體。在某些態樣中，抗CXCR4抗體為美國公開案第2014/0322208號中所揭示之抗CXCR4 (例如尤洛庫單抗(Ulocuplumab) (BMS-936564))。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗間皮素抗體。在某些態樣中，抗間皮素抗體為美國公開案第8,399,623號中所揭示之抗間皮素。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗HER2抗體。在某些態樣中，抗HER2抗體為Herceptin (美國專利第5,821,337號)、曲妥珠單抗或曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(ado-trastuzumab emtansine) (Kadcyla，例如WO/2001/000244)。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗CD27抗體。在一些態樣中，抗CD-27抗體為瓦里木單抗(Varlilumab) (亦稱為「CDX-1127」及「1F5」)，其為作為人類CD27之促效劑的人類IgG1抗體，如例如美國專利第9,169,325號中所揭示。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗CD73抗體。在某些態樣中，抗CD73抗體為CD73.4.IgG2C219S.IgG1.1f。
在一些態樣中，本文所揭示之醫藥組合物包含(i)抗PD-1或抗PD-L1抗體及(ii)抗MICA/B抗體。在某些態樣中，抗MICA/B抗體為特異性結合人類MICA/B之任何抗體或其抗原結合部分，包括但不限於國際公開案第WO 2019/183551號中所揭示之任何抗MICA/B抗體，該案以全文引用之方式併入本文中。
上文所引用之所有參考文獻以及本文中所所引用之所有參考文獻均以全文引用之方式併入本文中。
以下實例係為了說明，而非為了限制而提供。 實例 實例1 -  皮下注射調配物開發
本實例論述開發納武單抗之穩定、穩健皮下(SC)調配物及適合於商業規模生產之製造方法。作為調配物研究的一部分，評估各種不同醫藥學上可接受之賦形劑對納武單抗穩定性的影響。亦進行研究以選擇與所選調配物相容之加工及封裝組件。另外，進行使用時間研究以支持經由皮下注射投與藥品。
為開發納武單抗SC注射液而進行之此等研究的目標包括：1.鑑定及開發適用於臨床使用及最終商業化的用於納武單抗SC注射液之穩定可注射調配物；2.鑑定與納武單抗SC注射液相容之製造設備及包裝組件；3.開發及優化藥品製造製程；4.製造用於長期穩定性研究和3期臨床試驗之三批納武單抗SC注射液；及5.將產品製造技術轉移至商業生產設施且製造PPQ批次。 調配物開 發 緩衝系統及 pH 之選擇
與開發用於納武單抗之靜脈內(IV)調配物相關的先前研究使用毛細管差示掃描熱量測定(DSC)評估隨溶液pH而變之蛋白質穩定性，DSC量測蛋白質去摺疊之熱力學；且進一步評估納武單抗在將適合於在pH 6.0及7.0下調配之緩衝液中的物理穩定性。基於兩個研究之結果，選擇pH 6.0下之20 mM檸檬酸鹽緩衝液用於納武單抗之IV調配物。
儘管已證明檸檬酸鹽為IV納武單抗藥品之適合緩衝液，但檸檬酸鹽不會成為皮下投與產品之較佳緩衝液，因為已知檸檬酸鹽緩衝液會在SC投與後引起刺痛及灼痛。
致力於鑑定適用於SC調配物之目標pH為6.0的其他緩衝液，進行了一項研究以檢查高濃度(100 mg/mL)納武單抗在pH介於5.5至6.5範圍內之20 mM組胺酸緩衝調配物中的穩定性。在40℃應力條件下儲存之樣品的穩定性資料呈現於表2中。儘管高分子量物種之形成速率在整個pH範圍內相對一致，但在40℃下儲存兩個月之後，HMWS含量在pH 6.0樣品中最低。亦觀測到，根據iCIEF之主峰面積在pH 6.0之樣品中最高。基於此等研究之結果，選擇目標pH為6.0之20 mM組胺酸緩衝液來調配納武單抗SC注射液。
表 2 ： 溶液pH 對在40 ℃下 儲存2 個月之 納武單抗SC 注射液 穩定性的影響
pH 時間 ( 月 ) pH 蛋白質濃度 (mg/mL) HMWS 面積 % LMWS 面積 % 根據iCIEF 之主峰面積 % 不可目視微粒物質 ( 粒子 / 毫升 )
≥ 10-µm ≥ 25-µm
5.5 0 1 2 5.51 5.49 5.51 102 100 99 0.65 1.38 2.49 0.00 0.08 0.17 67.0 48.9 27.7 1 1 5 0 0 0
5.7 0 1 2 5.72 5.71 5.73 101 99 97 0.68 1.32 2.29 0.00 0.07 0.15 66.6 50.3 29.6 3 0 1 0 0 0
6.0 0 1 2 5.96 5.97 5.96 101 102 103 0.72 1.34 2.16 0.00 0.06 0.12 66.1 49.7 31.8 3 1 8 0 0 0
6.3 0 1 2 6.29 6.29 6.31 102 100 103 0.76 1.44 2.19 0.00 0.05 0.10 66.6 49.0 30.5 0 0 4 0 0 0
6.5 0 1 2 6.47 6.49 6.47 102 101 102 0.79 1.53 2.28 0.00 0.05 0.10 66.2 48.4 30.4 1 1 4 0 0 0
調配物緩衝液濃度選擇
進行研究以評估組胺酸緩衝液濃度對納武單抗之溶液穩定性的影響。溶液樣品在pH 6.0下以100 mg/mL之納武單抗濃度製備。將組胺酸濃度調節至10 mM、20 mM及30 mM。各調配物亦含有250 mM蔗糖、0.05% w/w聚山梨醇酯80及50 µM噴替酸。將樣品填充至3 cc玻璃小瓶中，將玻璃小瓶在25℃之加速儲存條件下儲存至多6個月。
在整個研究中，所有樣品之外觀均為透明至略微乳白色、無色至淺黃色。額外穩定性結果呈現於表3及表4中。在三種組胺酸濃度中，溶液pH或蛋白質濃度無變化。高分子量及低分子量物種之含量在儲存6個月期間以相同的大致速率隨時間增加。不可目視微粒含量較低，無明顯趨勢。
表 3 ： 組胺酸濃度對在25 ℃ 下儲存6 個月之納武單抗之穩定性的影響
組胺酸濃度 (mM) 時間 ( 月 ) pH 蛋白質濃度 (mg/mL) HMWS ( 面積 % ) LMWS ( 面積 % ) 不可目視微粒物質 ( 粒子 / 毫升 )
≥ 10-µm ≥ 25-µm
10 mM 0 3 6 6.14 6.16 6.09 101 101 100 0.98 1.38 1.42 0.07 0.09 0.08 8 12 40 0 0 0
20 mM 0 3 6 6.10 6.11 6.13 102 101 102 0.94 1.16 1.31 0.07 0.08 0.10 10 7 25 0 0 0
30 mM 0 3 6 6.12 6.11 6.14 100 99 101 0.91 1.04 1.30 0.07 0.09 0.08 7 7 32 0 0 2
表4呈現根據還原性及非還原性CE-SDS之尺寸變異體之資料。在加速25℃條件下儲存6個月內，根據還原性及非還原性CE-SDS之純度百分比不變。根據iCIEF之電荷變異體之資料亦呈現於表4中。在25℃下儲存6個月內，所有3種調配物之酸性物種含量增加約8%。酸性物種增加伴隨著主峰面積之大致相等減小。鹼性物種之含量在6個月儲存期內幾乎不變。基於此研究之結果，選擇20 mM組胺酸緩衝液濃度來調配納武單抗SC注射液。
表 4 ： 組胺酸濃度對在25 ℃ 下儲存6 個月之納武單抗之穩定性的影響
組胺酸濃度 (mM) 時間 ( 月 ) 根據 CE-SDS 之純度 iCIEF 結果
還原 ( 面積 %) 非還原 ( 面積 %) 酸基 ( 面積 %) 主峰 ( 面積 %) 鹼基 ( 面積 %)
10 mM 0 3 6 100.0 100.0 100.0 99.6 99.8 99.7 30.2 34.9 38.6 65.1 60.3 55.9 4.6 4.8 5.6
20 mM 0 3 6 100.0 100.0 100.0 99.6 99.6 99.7 30.5 34.4 37.9 64.8 60.5 57.5 4.7 5.1 4.6
30 mM 0 3 6 100.0 100.0 100.0 99.6 99.7 99.8 30.4 35.2 38.1 64.8 60.2 57.5 4.8 4.6 4.5
張力調節劑之選擇
進行研究以評估蔗糖對高濃度蛋白質調配物中納武單抗之穩定性的影響。溶液用20 mM組胺酸緩衝液，pH 6.0中100 mg/mL之納武單抗濃度製備，其中蔗糖濃度在200 mM至400 mM範圍內。在25℃之加速條件下監測樣品長達7個月。所有樣品之外觀均保持透明至略微乳白色、無色至淺黃色。表5中呈現之研究結果展示調配物pH或納武單抗濃度無變化。所有樣品之不可目視微粒含量較低，無明顯趨勢。高分子量及低分子量物種形成速率在研究中所評估之蔗糖濃度範圍內一致。
表 5 ： 蔗糖濃度對在25 ℃ 下儲存7 個月之納武單抗SC 注射液穩定性的影響
蔗糖濃度 (mM) 時間 ( 月 ) pH 蛋白質濃度 (mg/mL) HMWS 面積 % LMWS 面積 % 不可目視微粒物質 ( 粒子 / 毫升 )
≥ 10-µm ≥ 25-µm
200 0 3 7 5.98 6.00 6.02 102 101 101 0.65 0.92 1.02 0.00 0.00 0.03 2 10 3 2 1 0
250 0 3 7 5.97 6.01 6.02 101 99 99 0.65 0.92 1.03 0.00 0.01 0.03 2 0 5 0 0 0
330 0 3 7 5.98 6.04 5.98 100 101 99 0.65 0.90 1.02 0.00 0.00 0.03 5 1 2 0 0 1
400 0 3 7 5.97 5.99 6.01 102 101 99 0.65 0.90 1.01 0.00 0.00 0.01 5 0 3 0 0 0
基於穩定性研究之結果，選擇250 mM (85.6 g/L)之蔗糖濃度作為納武單抗SC注射調配物之張力調節劑。如圖1中所呈現，調配物黏度及重量莫耳滲透濃度均隨著蔗糖濃度增加而增加。但基於表5中之結果，發現蔗糖濃度增加對調配物之品質屬性影響極小。 界面活性劑濃度之選擇
針對用於調配物中評估聚山梨醇酯80，一種非離子界面活性劑。評估四種不同濃度之聚山梨醇酯80，0.01% w/v、0.03% w/v、0.05% w/v及0.07% w/v連同無聚山梨醇酯80之樣品對納武單抗SC注射液之穩定性的影響。在研究之初始篩選部分中，製備調配物且接著使其經過六個凍融循環(-60℃至25℃)。調配物亦在室溫/室內光照下在腕式振盪器上劇烈攪拌60分鐘。當暴露於凍融或攪拌時，在無聚山梨醇酯80之樣品中觀測到許多可見粒子。儘管數目減少，但亦在暴露於凍融或攪拌之0.01% w/v/聚山梨醇酯80樣品中觀測到可見粒子。在含有0.03% w/v、0.05% w/v或0.07% w/v聚山梨醇酯80濃度之樣品中未觀測到可見粒子。因此，得出以下結論：對於納武單抗SC注射液，低於0.01% w/v之聚山梨醇酯80濃度不足以防止由於凍融或劇烈攪拌之應力而形成可見粒子。
在此研究之第二部分中，檢查聚山梨醇酯80濃度對納武單抗SC注射液穩定性的影響。將具有0.03% w/v、0.05% w/v及0.07% w/v聚山梨醇酯80濃度之樣品儲存於40℃之應力條件下且監測穩定性兩個月。在整個研究時段中溶液外觀無變化且如表6中所呈現，pH或蛋白質濃度無變化。在三種聚山梨醇酯80濃度下，高分子量及低分子量物種之形成速率相對類似。所有樣品之不可目視微粒含量均較低，無明顯趨勢。基於此研究之結果，選擇0.05% w/v之目標聚山梨醇酯80濃度來調配納武單抗SC注射液。
表 6 ： 聚山梨醇酯80 濃度對在40 ℃下 儲存2 個月之 納武單抗SC 注射液 穩定性的影響
聚山梨醇酯 80 濃度 (% w/v) 時間 ( 月 ) pH 蛋白質濃度 (mg/mL) HMWS 面積 % LMWS 面積 % 不可目視微粒物質 ( 粒子 / 毫升 )
≥ 10-µm ≥ 25-µm
0.03 0 1 2 5.97 5.99 5.98 118 119 121 0.61 2.09 4.26 0.05 0.12 0.22 0 5 6 0 0 0
0.05 0 1 2 5.98 6.01 5.99 119 120 120 0.61 2.14 4.41 0.06 0.13 0.24 0 6 8 0 0 0
0.07 0 1 2 5.97 5.99 6.01 120 120 119 0.61 2.27 4.70 0.05 0.13 0.22 1 6 6 0 0 0
添加金屬離子螯合劑
將EDTA及DTPA (噴替酸)評估為待併入至納武單抗SC注射液之調配物中的潛在金屬螯合劑。進行初步篩選研究以比較當含有納武單抗之樣品中摻加金屬時，EDTA相對於噴替酸之效能。在此研究中，製備在20 mM組胺酸與260 mM蔗糖，pH 6.0中含有10 mg/mL納武單抗之溶液。向樣品中摻加金屬至500 ppb鐵、15 ppb鉻、15 ppb鎳、30 ppb銅、10 ppb鉬及10 ppb錳之濃度。亦製備未摻加之樣品以充當對照。製備以下六種調配物：1.調配物A：未摻加金屬，無EDTA或噴替酸；2.調配物B：未摻加金屬，50 µM噴替酸；3.調配物C：未摻加金屬，50 µM EDTA；及4.調配物D：摻加金屬，無EDTA或噴替酸；5.調配物E：摻加金屬，50 µM噴替酸；及6.調配物F：摻加金屬，50 µM EDTA。
將樣品置於40℃之應力條件下且監測HMWS及LMWS含量至多4週。表7中呈現之資料展示添加之金屬離子螯合劑之益處。對於調配物D，其中樣品摻加金屬但未添加螯合劑，在40℃下儲存4週內，HMWS含量自0.27%增加至7.07%且LMWS含量自0.12%增加至0.32%。對於摻加金屬之樣品，50 µM濃度之EDTA (調配物F)能夠將HMWS及LMWS含量增加分別限制為3.75%及0.18%。然而，在50 µM噴替酸中觀測到摻加金屬之樣品的最佳效能，其中在4週研究時段內，HMWS含量僅增加至0.55%，且LMWS含量無變化。即使未摻加之調配物A、B及C亦展示添加金屬離子螯合劑之益處。在不添加螯合劑之情況下，在40℃下儲存之4週內，HMWS含量自0.27%增加至1.94%，且LMWS含量自0.12%增加至0.17%。當調配物中包括50 µM噴替酸或50 µ EDTA時，HMWS增加對於噴替酸自0.26%降至0.48%，且對於EDTA自0.26%降至0.52%。含有金屬離子螯合劑之樣品之LMWS含量在4週儲存期內不變。基於此研究之結果，選擇噴替酸作為納武單抗SC注射調配物之金屬離子螯合劑。
表 7 ： 在摻加金屬離子之後 ，EDTA 與噴替酸對在40 ℃ 下儲存4 週之納武單抗之穩定性的影響
調配物 時間 ( 週 ) HMWS 面積 % LMWS 面積 %
調配物A：未摻加金屬，無EDTA或噴替酸 0 2 4 0.27 0.50 1.94 0.12 0.14 0.17
調配物B：未摻加金屬，50 µM噴替酸 0 2 4 0.26 0.32 0.48 0.12 0.13 0.12
調配物C：未摻加金屬，50 µM EDTA 0 2 4 0.26 0.34 0.52 0.12 0.13 0.12
調配物D：摻加金屬，無EDTA或噴替酸 0 2 4 0.27 4.66 7.07 0.12 0.33 0.32
調配物E：摻加金屬，50 µM噴替酸 0 2 4 0.26 0.34 0.55 0.12 0.13 0.12
調配物F：摻加金屬，50 µM EDTA 0 2 4 0.26 1.23 3.75 0.12 0.22 0.18
為了進一步研究金屬離子螯合劑在防止因存在痕量金屬離子而可能發生之降解中的益處，進行第二次更深入的研究以評估噴替酸對納武單抗SC注射液之穩定性的影響。此研究中測試之調配物為含120 mg/mL納武單抗之20 mM組胺酸緩衝液，pH 6.0，具有250 mM蔗糖及0.05% w/v聚山梨醇酯80。溶液摻加濃金屬溶液，使得摻加金屬之樣品中之總金屬濃度為1.5 ppm (鐵、鉻及銅各0.5 ppm)。如同前述研究，亦製備未摻加之樣品以充當對照。製備以下五種調配物：1.調配物A：未摻加金屬，無噴替酸；2.調配物B：未摻加金屬，50 µM噴替酸；3.調配物C：摻加1.5 ppm金屬，無噴替酸；4.調配物D：摻加1.5 ppm金屬，50 µM噴替酸；及5.調配物E：摻加1.5 ppm金屬，100 µM噴替酸。
將樣品填充至3 cc玻璃小瓶中，將玻璃小瓶塞住且在40℃之應力條件下儲存，且監測穩定性兩個月。在整個研究時段中溶液外觀無變化且如表8中所呈現，pH或蛋白質濃度無變化。所有樣品之不可目視微粒含量均較低，無明顯趨勢。在40℃下儲存2個月之後，調配物C (摻加金屬、未添加噴替酸之溶液)中之HMWS及LMWS含量最高。在分別含有50 µM及100 µM噴替酸之調配物D及E中觀測到HMWS及LMWS含量較低且相等。來自未摻加之調配物A及B之結果亦展示所添加噴替酸之益處。在未添加螯合劑(調配物A)之情況下，在40℃下儲存2個月內，HMWS含量自0.61%增加至4.34%且LMWS含量自0.05%增加至0.25%。當調配物中包括50 µM噴替酸(調配物B)時，2個月時間點處之HMWS含量僅為2.97%且2個月時間點處之LMWS含量僅為0.20%。基於此研究之結果，選擇50 µM之目標噴替酸濃度來調配納武單抗SC注射液。
表 8 ： 摻加痕量金屬及噴替酸 對在40 ℃下 儲存2 個月之 納武單抗SC 注射液 穩定性的影響
調配物 時間 ( 月 ) pH 蛋白質濃度 (mg/mL) HMWS 面積 % LMWS 面積 % 不可目視微粒物質 ( 粒子 / 毫升 )
≥ 10-µm ≥ 25-µm
調配物A： 未摻加金屬， 無噴替酸 0 1 2 5.92 5.92 5.91 118 117 118 0.61 2.11 4.34 0.05 0.12 0.25 1 5 11 0 0 0
調配物B： 未摻加金屬， 50 µM噴替酸 0 1 2 5.93 5.92 5.90 117 117 117 0.60 1.67 2.97 0.05 0.10 0.20 1 9 2 0 0 0
調配物C： 摻加1.5 ppm金屬， 無噴替酸 0 1 2 5.93 5.91 5.92 116 118 119 0.61 3.13 5.90 0.06 0.17 0.30 1 4 9 1 0 0
調配物D： 摻加1.5 ppm金屬， 50 µM噴替酸 0 1 2 5.93 5.90 5.91 116 119 118 0.61 1.86 3.39 0.06 0.11 0.20 0 9 7 1 0 0
調配物E： 摻加1.5 ppm金屬， 100 µM噴替酸 0 1 2 5.92 5.91 5.90 118 117 118 0.62 1.85 3.39 0.06 0.11 0.20 0 5 9 0 0 0
蛋白質濃度之選擇
進行許多實驗以幫助選擇用於納武單抗SC注射液之目標蛋白濃度。發現調配物在處理過程中穩定，且超濾運行允許達到高達200 mg/mL之納武單抗濃度。然而，發現黏度在大於150 mg/mL之納武單抗濃度下快速增加。
L-精胺酸為已知降低溶液黏度之胺基酸。為了評估精胺酸對調配物黏度之影響，進行研究，其中將75 mM精胺酸添加至140 mg/mL納武單抗SC調配物(於20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v聚山梨醇酯80、50 µM噴替酸，pH 6.0中)，且接著使用10 kDa膜及離心機濃縮。添加之精胺酸對調配物黏度之影響展示於圖2中。在大於100 mg/mL之納武單抗濃度下，75 mM精胺酸引起溶液黏度降低。舉例而言，140 mg/mL納武單抗調配物在20℃下在無精胺酸之情況下的黏度為13.3 cP，但在75 mM精胺酸之情況下的黏度為9.1 cP。在20℃下進行黏度量測。
接著進行研究以評估75 mM精胺酸對納武單抗SC注射液(ELN A0C6F-023、ELN A259D-007)之穩定性的影響。在20 mM組胺酸pH 6.0與250 mM蔗糖、0.05% w/v聚山梨醇酯及50 µM噴替酸中製備小批量納武單抗。納武單抗濃度為100 mg/mL或140 mg/mL且溶液係在具有及不具有75 mM精胺酸之情況下製備。為監測之品質屬性生成了典型穩定性資料，除了在3個月40℃時間點，在含精胺酸之調配物中觀測到許多小的白色可見粒子。在無精胺酸之調配物中未觀測到可見粒子。基於此等穩定性結果，決定在納武單抗SC注射液調配物中將不包括精胺酸。
為納武單抗SC注射液選擇之目標納武單抗濃度為120 mg/mL。為FIH臨床試驗選擇之調配物為20 mM組胺酸緩衝液，pH 6.0，與250 mM蔗糖、0.05% w/v聚山梨醇酯80及50 µM噴替酸。將藥物物質提供於同一調配物中，但目標濃度為150 mg/mL且儲存於-60℃下。 納武單抗 SC 注射液之實驗室批次之穩定性資料
製備兩個實驗室規模批次之納武單抗SC注射液且置於穩定狀態。兩個批次均使用所選FIH調配物：20 mM組胺酸緩衝液，pH 6.0、250 mM蔗糖、0.05% w/v聚山梨醇酯80及50 µM噴替酸。為了包括為FIH調配物選擇之120 mg/mL蛋白質濃度，一個批次之納武單抗濃度為100 mg/mL且另一個批次之濃度為140 mg/mL。製備調配物且將小等分試樣無菌過濾至3 cc I型玻璃小瓶中。將小瓶塞住、密封且置於5℃、25℃及40℃下之台上。在指定時間點，自穩定台取出樣品且測試外觀、pH、蛋白質濃度、根據SE-HPLC之尺寸均一性、根據HIAC之不可目視微粒物質、根據iCIEF之電荷變異體及根據CE-SDS (R&NR)之分子尺寸變異體。
所有樣品在所有時間點之視覺外觀均為透明至略微乳白色、無色至淺黃色溶液。額外穩定性資料提供於表9至11中。如表9中所示，對於100 mg/mL及140 mg/mL樣品，在整個研究中pH或蛋白質濃度未觀測到變化。在5℃下儲存之12個月內，100 mg/mL樣品之HMWS含量增加0.56%且140 mg/mL樣品之HMWS含量增加0.73%。對於加速25℃條件，儲存6個月之後，100 mg/mL樣品之HMWS含量增加0.88%且140 mg/mL樣品之HMWS含量增加1.15%。在40℃應力條件下，對於100 mg/mL及140 mg/mL樣品，HMWS含量在儲存3個月內分別增加3.17%及3.92%。對於在5℃及25℃下儲存之樣品，LMWS含量幾乎無變化，但對於在40℃下儲存3個月之樣品，LMWS含量增加約0.2%。
表 9 ： 100 mg /mL 及140 mg /mL 納武單抗SC 注射液之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) pH 蛋白質濃度 (mg/mL) SE-HPLC HMWS ( 面積 %) SE-HPLC 單體 ( 面積 %) SE-HPLC LMWS ( 面積 %)
100 mg/ mL 140 mg/ mL 100 mg/ mL 140 mg/ mL 100 mg/ mL 140 mg/ mL 100 mg/ mL 140 mg/ mL 100 mg/ mL 140 mg/ mL
初始 0 6.14 6.20 100 141 0.69 0.75 99.19 99.14 0.12 0.11
5℃ 3 6 9 12 6.20 6.17 6.14 6.16 6.21 6.17 6.16 6.18 102 99 101 98 139 133 137 137 0.89 0.97 1.19 1.25 1.04 1.16 1.41 1.48 99.00 98.91 98.69 98.61 98.85 98.72 98.47 98.38 0.12 0.12 0.12 0.14 0.11 0.12 0.12 0.14
25℃ 3 6 6.19 6.18 6.21 6.19 104 101 142 135 1.30 1.57 1.57 1.90 98.57 98.29 98.31 97.97 0.13 0.14 0.12 0.13
40℃ 1 3 6.18 6.20 6.22 6.21 98 101 141 141 1.29 3.86 1.60 4.67 98.59 95.86 98.29 95.04 0.12 0.28 0.11 0.29
表10呈現不可目視微粒及電荷變異體之結果。所有樣品在所有時間點處之不可目視微粒含量均較低且無明顯趨勢。酸性物種之含量在所有儲存條件下隨時間增加。在5℃下儲存之12個月內，100 mg/mL樣品之酸性物種增加6.3%且140 mg/mL樣品之酸性物種增加5.8%。在加速25℃條件下，100 mg/mL樣品之酸性物種增加26.0%且140 mg/mL樣品之酸性物種增加23.8%。在40℃應力條件下，對於100 mg/mL及140 mg/mL樣品，酸性物種含量在儲存3個月內分別增加44.9%及43.9%。酸性物種增加伴隨著主峰面積之大致相等減小。對於所有樣品，鹼性物種含量在整個研究時段中幾乎不變。
表 10 ： 100 mg /mL 及140 mg /mL 納武單抗SC 注射液之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) 不可目視微粒 ≥ 10-µm ( 粒子 /mL) 不可目視微粒 ≥ 25-µm ( 粒子 i/mL) iCIEF 酸基 ( 面積 %) iCIEF 主峰 ( 面積 %) iCIEF 鹼基 ( 面積 %)
100 mg/ mL 140 mg/ mL 100 mg/ mL 140 mg/ mL 100 mg/ mL 140 mg/ mL 100 mg/ mL 140 mg/ mL 100 mg/ mL 140 mg/ mL
初始 0 2 3 0 0 27.7 29.1 67.8 65.9 4.4 5.0
5℃ 3 6 9 12 4 2 13 5 7 2 5 5 0 1 1 0 3 0 5 2 29.7 30.3 31.2 34.0 31.0 31.0 31.3 34.9 66.4 64.2 63.7 61.4 64.7 65.5 63.8 60.4 3.9 5.6 5.1 4.5 4.4 3.5 4.8 4.7
25℃ 3 6 7 8 4 0 2 0 1 0 41.4 53.7 41.6 52.9 52.9 39.9 52.4 40.6 5.8 6.5 5.9 6.4
40℃ 1 3 5 15 1 4 0 0 0 0 48.3 72.6 48.1 73.0 46.1 22.1 45.3 21.5 5.6 5.3 6.6 5.5
表11呈現根據還原性及非還原性CE-SDS之尺寸變異體的資料。在5℃下儲存之12個月內，100 mg/mL及140 mg/mL樣品根據還原性及非還原性CE-SDS之純度百分比不變。在加速25℃條件下，在儲存6個月內，100 mg/mL樣品根據還原性CE-SDS之純度百分比不變且140 mg/mL樣品之純度百分比降低0.2%。在40℃應力條件下，100 mg/mL樣品在儲存3個月內根據還原性CE-SDS之純度百分比降低1.0%且140 mg/mL樣品降低1.4%。對於非還原性CE-SDS，100 mg/mL樣品在25℃下儲存之6個月內純度百分比降低2.2%。對於140 mg/mL樣品，純度百分比降低為1.8%。在40℃應力條件下，對於100 mg/mL及140 mg/mL樣品，在儲存3個月內根據非還原性CE-SDS之純度百分比降低分別為2.6%及3.1%。
表 11 ： 100 mg /mL 及140 mg /mL 納武單抗SC 注射液之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) 根據 CE-SDS 之純度 ( 還原 ) ( 面積 %) 根據 CE-SDS 之純度 ( 非還原 ) ( 面積 %)
100 mg/mL 140 mg/mL 100 mg/mL 140 mg/mL
初始 0 99.5 99.8 99.3 99.2
5℃ 3 6 9 12 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 99.5 99.3 99.3 99.3 99.5 98.9 99.2 99.2
25℃ 3 6 99.8 99.6 99.8 99.6 98.8 97.1 98.9 97.4
40℃ 1 3 99.9 98.5 99.9 98.4 98.4 96.7 98.2 96.1
選擇用於 FIH 臨床試驗之藥品之描述及組成
選擇用於FIH臨床試驗之藥品為納武單抗注射劑，960 mg/小瓶(120 mg/mL)。其描述為無菌、非熱原性、透明至極乳白色、無色至黃色液體。在一些情況下，可存在與蛋白質粒子之外觀一致的少數微粒。藥品為用於皮下(SC)投與之單次使用、無防腐劑、等張水溶液。納武單抗SC 注射液包裝在10 cc 1型燧石玻璃小瓶中，該等小瓶用20 mm Daikyo D21-7S Flurotec®塗層丁基瓶塞塞住，該等瓶塞用帶翻蓋的20 mm鋁密封件固定。包括各組分之品質標準及功能的納武單抗SC注射液組成呈現於表12中。各小瓶中均包括過量填充之納武單抗SC注射液，以確保可向患者投與8.0 mL標記量。在確定藥品之過量填充時，考慮以下因素：1. 0.5 mL用於產品使用期間小瓶、針頭及注射器(VNS)中之損失(符合USP ＜1151＞最小推薦過量填充量)；2. 0.2 mL用於封閉系統轉移裝置(若使用)中之損失；3. 0.5 mL用於翼式輸液套件(若使用)中之啟動損失；及4. 0.3 mL用於裝填機變化性。
基於在劑量製備及投與過程中可能損失之納武單抗SC注射液的量，各小瓶藥品中包括1.5 mL之過量填充。
表 12 ： 用於FIH 臨床研究之納武單抗注射液 ，960 mg / 小瓶 (120 mg /mL ) 之組成
組分 品質標準 功能 每小瓶之量 (mg) a
納武單抗 BMS規格 活性成分 1,140
L-組胺酸 USP、Ph.Eur.、JP 緩衝劑 14.7
L-組胺酸HCl H 2O Ph.Eur.、JP 緩衝劑 20.0
蔗糖 NF、Ph.Eur.、JP 張力調節劑 813
聚山梨醇酯80 NF、Ph.Eur.、JP 界面活性劑 4.75
噴替酸 USP 金屬離子螯合劑 0.187
注射用水 USP、Ph.Eur.、JP 溶劑 q.s至9.50 mL
a目標填充包括1.5 mL過量填充，以考慮小瓶、針頭及注射器(VNS)滯留、裝填機變化性及投與組分滯留 USP=美國藥典，Ph.Eur.=歐洲藥典，NF=國民處方集，JP=日本藥典，q.s.=足量 IND 為 FIH 調配物提供穩定批次
製造開發實驗室批次之納武單抗SC注射液(FIH調配物)且將其置於穩定狀態。批量大小為3,000 mL，且在檢查後產生291個小瓶。將藥品填充(目標填充量為9.5 mL)至Schott 10 cc I型燧石玻璃小瓶中，該等小瓶用20 mm Daikyo D-21-7-S Flurotec塗層丁基橡膠塞封閉。小瓶用帶翻蓋的20 mm West鋁密封件密封。將藥品小瓶置於5℃、25℃及40℃下之台上。在指定時間點，自穩定台取出樣品且進行測試。十二個月之穩定性資料呈現於表13至表16中。
所有樣品在所有時間點之視覺外觀均為透明至略微乳白色、無色至淺黃色溶液。額外穩定性資料提供於表13至16中。如表13中所示，在整個研究過程中pH或蛋白質濃度未觀測到變化。在5℃下儲存之12個月內，HMWS含量增加0.3%。在加速25℃條件下，在儲存6個月之後，HMWS含量增加0.6%。在40℃應力條件下，HMWS含量在儲存3個月內增加3.3%。對於在5℃及25℃下儲存之樣品，LMWS含量幾乎無變化，但對於在40℃下儲存3個月之樣品，LMWS含量增加1.1%。
表 13 ： 納武單抗SC 注射液 ，960 mg / 小瓶 (120 mg /mL ) 之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) 外觀 溶液 pH 納武單抗濃度 (mg/mL) SE-HPLC
HMWS ( 面積 %) 單體 ( 面積 %) LMWS ( 面積 %)
初始 0 符合 a 5.9 121.9 0.7 99.2 0.1
5℃ 1 3 6 9 12 符合 符合 符合 符合 符合 6.0 5.9 5.9 5.8 5.8 125.6 126.5 121.8 122.6 125.6 0.7 0.8 0.8 1.0 1.0 99.3 99.1 99.1 98.9 99.0 ＜0.1 0.1 ＜0.1 0.1 ＜0.1
25℃/60%RH 1 3 6 符合 符合 符合 5.9 6.0 5.9 125.6 126.3 124.3 0.9 1.1 1.3 99.0 98.8 98.6 ＜0.1 0.1 ＜0.1
40℃/75%RH 0.5 1 3 符合 符合 符合 5.9 6.0 5.9 123.8 126.8 125.9 1.2 1.6 4.0 98.7 98.3 94.8 0.1 0.1 1.2
a符合=透明至極乳白色、無色至黃色液體，可存在輕(少量)微粒(外觀與蛋白質微粒一致)。
表14呈現根據還原性及非還原性CE-SDS之尺寸變異體的資料。在5℃下儲存之12個月內，根據還原性及非還原性CE-SDS之純度百分比均不變。在加速25℃條件下，在儲存6個月內，根據還原性CE-SDS之純度百分比降低0.2%。在40℃應力條件下，在儲存3個月內，根據還原性CE-SDS之純度百分比降低2.9%。對於非還原性CE-SDS，純度百分比在25℃下儲存6個月內降低1.2%且在40℃應力條件下儲存3個月內降低4.4%。
表 14 ： 納武單抗SC 注射液 ，960 mg / 小瓶 (120 mg /mL ) 之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) CE-SDS ( 還原 ) CE-SDS ( 非還原 )
純度 ( 面積 %) 次峰之和 ≥ LOQ ( 面積 %) 純度 ( 面積 %) 次峰之和 ≥ LOQ ( 面積 %)
初始 0 99.6 ＜0.5 98.4 0.8
5℃ 1 3 6 9 12 99.3 99.7 99.7 99.7 99.7 0.5 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 98.3 99.3 98.5 98.5 98.3 1.0 0.7 1.3 0.9 1.0
25℃/60%RH 1 3 6 99.3 99.5 99.4 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 98.1 98.9 97.2 1.0 0.8 2.3
40℃/75%RH 0.5 1 3 99.0 98.8 96.7 0.5 ＜0.5 1.9 98.2 96.8 94.0 0.9 2.4 4.2
酸性物種之含量在所有儲存條件下隨時間增加。在5℃下儲存之12個月內，酸性物種增加0.8%。在加速25℃條件下，酸性物種在儲存6個月內增加11.3%。在40℃應力條件下，酸性物種含量在儲存3個月內增加38.8%。在5℃下儲存之12個月期間，鹼性物種含量幾乎不變。在25℃條件下，鹼性物種含量在6個月內增加1.6%且在40℃下儲存3個月之後，鹼性物種含量增加2.6%。在酸性及鹼性物種中觀測到的增加伴隨著主峰面積之大致相等減小。
表 15 ： 納武單抗SC 注射液 ，960 mg / 小瓶 (120 mg /mL ) 之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) iCIEF
酸基 ( 面積 %) 主峰 ( 面積 %) 鹼基 ( 面積 %)
初始 0 31.4 63.8 4.8
5℃ 1 3 6 9 12 31.2 32.5 33.3 32.9 32.2 63.8 62.8 62.2 62.1 62.9 5.0 4.8 4.5 4.9 4.9
25℃/60%RH 1 3 6 34.1 37.6 42.7 60.7 56.7 50.9 5.2 5.8 6.4
40℃/75%RH 0.5 1 3 40.4 47.1 70.2 52.5 45.1 22.4 7.0 7.8 7.4
表16呈現活性結合ELISA、基於細胞之生物分析及不可目視微粒之結果。在所有溫度及時間點，活性結合ELISA之結果在95%至112%範圍內，且基於細胞之生物分析在79%至105%範圍內。所有樣品在所有時間點處之不可目視微粒含量均較低且無明顯趨勢。
表 16 ： 納武單抗SC 注射液 ，960 mg / 小瓶 (120 mg /mL ) 之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) 活性結合 ELISA % 基於細胞之生物分析 % 微粒物質
粒子 / 小瓶 ≥ 10 微米 粒子 / 小瓶 ≥ 25 微米
初始 0 109 79 43 0
5℃ 1 3 6 9 12 103 108 97 105 102 101 95 89 78 96 56 32 56 112 40 0 0 0 5 5
25℃/60%RH 1 3 6 110 100 96 105 84 88 77 45 45 3 0 0
40℃/75%RH 0.5 1 3 110 112 95 79 97 94 19 53 27 0 0 3
臨床批量製造 ( FIH 調配物 )
製造了使用FIH調配物之納武單抗SC注射液的兩個臨床批次，批次1及批次2。兩個批次之最終批次規模均約為20升，將其裝入約1,800個小瓶中。兩個批次均通過所有最終測試，且被投入臨床使用。此前兩個臨床批次之納武單抗SC注射液之投放測試結果呈現於表17中。
製造程序之簡要說明提供如下。將含150 mg/mL納武單抗藥物物質之20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% (w/v)聚山梨醇酯80及50 µM噴替酸，pH 6.0在室溫下解凍，避光，在容器之間留有足夠空間以確保解凍效率。藥物物質完全解凍後，手動混合袋子2至3分鐘以確保均勻性。製備調配物緩衝溶液(20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% (w/v)聚山梨醇酯80及50 µM噴替酸，pH 6.0)且接著經由0.22 µm過濾器過濾。向藥物物質中添加特定量之緩衝溶液以將蛋白質濃度調節至120 mg/mL。取出樣品用於蛋白質濃度測定、pH及內毒素測試。經由0.45 µm預過濾器過濾120 mg/mL藥品溶液。取出樣品進行生物負荷測試。經由兩個0.22 µm過濾器過濾藥品溶液。對過濾器進行過濾前及過濾後完整性測試。隨後將無菌過濾溶液填充至經洗滌、滅菌、去熱源之小瓶中。小瓶用滅菌塞子塞住且用鋁密封件密封。在填充過程期間，以規律時間間隔進行填充重量檢查。100%目視檢查密封小瓶是否存在缺陷。經檢查之小瓶被貼上標籤且包裝。
表 17 ： 120 mg /mL 納武單抗SC 注射液之前 兩個臨床批次在投放測試結果
測試 批次 1 批次 2
外觀 符合 符合
pH 5.9 5.8
標識：肽圖及濃度 樣品鑑定為納武單抗 樣品鑑定為納武單抗
119.5 mg/mL 120.6 mg/mL
蛋白質濃度(A 280) 119.5 mg/mL 120.6 mg/mL
活性結合ELISA 105% 100%
基於細胞之生物分析 105% 99%
SE-HPLC 單體：99.2面積% HMW：0.6面積% LMW：0.1面積% 單體：99.3面積% HMW：0.6面積% LMW：0.1面積%
CE-SDS (非還原) 99面積% 次峰之和≥ LOQ：1面積% 99面積% 次峰之和≥ LOQ：1面積%
CE-SDS (還原) 100面積% 次峰之和≥ LOQ：＜ 0.5面積% 100面積% 次峰之和≥ LOQ：＜ 1面積%
iCIEF 主峰：62.2面積% 酸基：33.1面積% 鹼基：4.6面積% 主峰：63.2面積% 酸基：32.0面積% 鹼基：4.8面積%
內毒素(LAL) ＜ 0.01 EU/mg蛋白質 ＜ 0.01 EU/mg蛋白質
微粒物質 ≥ 10 μm：32個粒子/小瓶 ≥ 25 μm：0個粒子/小瓶 ≥ 10 μm：64個粒子/小瓶 ≥ 25 μm：5個粒子/小瓶
重量莫耳滲透濃度 336 mOsm/kg 323 mOsm/kg
無菌性 符合 符合
容器中之可提取體積 9.4 mL 9.3 mL
聚山梨醇酯80 460 µg/mL 0.05 %w/v
正式使用時間 / 相容性研究
進行使用時間研究以支持納武單抗注射液，960 mg/小瓶(120 mg/mL)之皮下臨床投與。在初始臨床研究中，使用兩種方法中之一者向患者皮下(SC)投與納武單抗。對於方法1，在添加小等分試樣之生理鹽水(NS)及rHuPH20 (ENHANZE Drug Product (EDP))以將小瓶中之納武單抗濃度調節至109.1 mg/mL且將rHuPH20濃度調節至2,000 U/mL之後，納武單抗以2至4毫升/分鐘之速率進行皮下彈丸注射，劑量為480 mg、720 mg及960 mg。在109.1 mg/mL之濃度下，4.4 mL、6.6 mL及8.8 mL之SC投與體積分別提供480 mg、720 mg及960 mg之納武單抗劑量。對於方法2，使用注射泵在大約30分鐘內(約0.27毫升/分鐘)投與960 mg (8 mL，120 mg/mL)之劑量(不添加NS及EDP)。為模擬此使用時間研究中之最壞情況條件，在穿過27G 1/2''針時，溶液流動速率高達4毫升/分鐘。此外，一旦藥品進入投與注射器，在2-8℃下最多可保持24小時，其中24小時中有4小時在室溫/室內光照(RT/RL)下。
對於方法1，將0.76 mL NS及0.19 mL EDP添加至納武單抗SC注射液之小瓶中，接著輕輕地旋動及倒置以混合。將小瓶內容物抽取至單獨的10 cc注射器中。在初始時間點，小瓶內容物經由翼式輸液套件(27G 1/2''針頭)以4毫升/分鐘之速率排出至採樣容器中。將尖端帽應用於另一組填充注射器，將其在RT/RL下保持4小時，接著在2-8℃下避光再保持20小時。在24小時時間點，小瓶內容物再次以4毫升/分鐘之速率經由翼式輸液套件排出至採樣容器中。對於方法2，將小瓶內含物(不添加NS或EDP)抽吸至單獨的10 cc注射器中。如關於方法1在上文所述地進行樣品收集、儲存及取樣。
來自使用時間研究之結果呈現於表18-21中。表18展示根據SE-HPLC之蛋白質濃度及尺寸均一性的結果。在整個研究時段內，蛋白質濃度或高分子量或低分子量物種含量無變化。
表 18 ： 蛋白質濃度及尺寸均一性之測試結果
製備 時間 蛋白質濃度 (mg/mL) 單體 面積 % HMWS 面積 % LMWS 面積 %
方法1：將0.76 mL NS及0.19 mL EDP添加至小瓶納武單抗SC注射液且將溶液儲存於注射器中24小時。 初始 24小時 109 110 0.7 0.7 98.7 98.7 0.6 0.6
方法2：將納武單抗SC注射液儲存於注射器中24小時。 初始 24小時 120 119 0.7 0.7 98.7 98.7 0.6 0.6
表19呈現溶液外觀、pH、結合活性及不可目視微粒物質之測試結果。溶液pH及活性結合在整個研究時段內均幾乎不變。樣品中之不可目視微粒含量較低且無明顯趨勢。
表 19 ： 外觀、pH 、活性結合ELISA 及不可目視微粒物質之測試結果
製備 時間 外觀 pH 活性結合 ELISA (%) 不可目視微粒物質，粒子 / 毫升
≥ 10-µm ≥ 25-µm
方法1：將0.76 mL NS及0.19 mL EDP添加至小瓶納武單抗SC注射液且將溶液儲存於注射器中24小時。 初始 24小時 符合(a) 符合 5.7 5.8 103 110 63 15 1 0
方法2：將納武單抗SC注射液儲存於注射器中24小時。 初始 24小時 符合 符合 5.7 5.8 106 109 16 47 0 0
a符合指示略微黃色、極乳白色溶液，基本上不含可見粒子。
表20展示根據CE-SDS之純度百分比及所有次峰之和(≥0.3%)的資料。結果展示對於所有樣品，在整個研究時段內尺寸變異體含量不變。
表 20 ： 尺寸變異體之測試結果
製備 時間 CE-SDS-NR (%) CE-SDS-R (%)
純度 所有次峰之和 ( ≥ 0.3%) 純度 所有次峰之和 ( ≥ 0.3%)
方法1：將0.76 mL NS及0.19 mL EDP添加至小瓶納武單抗SC注射液且將溶液儲存於注射器中24小時。 初始 24小時 98.1 98.0 1.2 1.5 98.9 98.9 0.8 0.9
方法2：將納武單抗SC注射液儲存於注射器中24小時。 初始 24小時 98.0 98.1 1.2 1.2 98.8 98.9 0.9 0.9
表21呈現根據iCIEF之酶活性及電荷變異體之資料。結果顯示，酶活性在整個研究時段內相對不變。酸性物種、主峰及鹼性物種之含量在24小時研究時段內不變。
表 21 ： rHuPH20 酶活性及電荷變異體之測試結果
製備 時間 根據 iCIEF 之電荷變異體
酶活性 (U/mL) 酸性物種 (%) 主峰 (%) 鹼性物種 (%)
方法1：將0.76 mL NS及0.19 mL EDP添加至小瓶納武單抗SC注射液且將溶液儲存於注射器中24小時。 初始 24小時 2,164 2,070 35.0 34.9 60.3 60.3 4.7 4.8
方法2：將納武單抗SC注射液儲存於注射器中24小時。 初始 24小時 未測試 未測試 34.5 34.5 60.5 60.6 4.9 4.9
基於此使用時間研究之結果，得出以下結論：1.納武單抗SC注射液在用0.76 mL 0.9%氯化鈉注射液(NS)及0.19 mL EHANZE Drug Product (EDP)稀釋至蛋白質濃度為109 mg/mL且在2-8℃下儲存於塑膠注射器中至多24小時(其中24小時中有4小時在室溫及室內光照下)時穩定；2. 120 mg/mL之納武單抗SC注射液當在2-8℃下儲存於塑膠注射器中至多24小時(其中24小時中有4小時在室溫及室內光照下)時穩定；3.用NS及EDP稀釋至蛋白質濃度為109 mg/mL之納武單抗SC 注射液及120 mg/mL之納武單抗SC注射液與PVC投與組分相容，且能夠以高達4毫升/分鐘之流動速率穿過注射器針頭。 商業調配物開發
在上文論述之初始臨床試驗中，剛好在向患者皮下投與劑量之前將rHuPH20酶添加至納武單抗SC注射液之小瓶中。本研究評估了將rHuPH20添加至調配物中，以便可自單一小瓶製備用於納武單抗SC注射液之商業調配物的劑量。
在初始臨床試驗中，將ENHANZE® Drug Product (EDP，Halozyme Therapeutics)添加至納武單抗中且混合，隨後在注射器中抽取。EDP為無菌、非熱原性、單次使用、無防腐劑、等張水溶液。EDP在含有10 mM組胺酸，pH 6.5、130 mM氯化鈉、10 mM甲硫胺酸及0.02% w/w聚山梨醇酯80之調配物中提供1 mg/mL rHuPH20。EDP包裝於2 cc I型燧石玻璃小瓶中，用氯丁基橡膠塞塞住，且用鋁密封件密封。
對於共調配藥品，在調配物中使用rHuPH20藥物物質替代EDP。此藥物物質提供10 mg/mL之較高rHuPH20濃度，且與10 mM組胺酸及130 mM 氯化鈉(pH 6.5)一起調配。rHuPH20藥物物質以瓶中之冷凍溶液形式提供，在使用前將冷凍溶液解凍且輕輕混合。如同FIH臨床研究，商業共調配藥品中之酶濃度保持於2,000 U/mL。 初始可行性研究
進行初始可行性研究以評估當包裝於玻璃小瓶中時，在5℃、25℃及40℃下，在存在2,000 U/mL rHuPH20之情況下，100 mg/mL納武單抗之穩定性。製備具有及不具有2,000 U/mL rHuPH20之調配物，填充至3 cc 玻璃小瓶中，加塞，密封且置於工作台上。在初始時間點測試且在第1週、第2週及第4週再次測試樣品之溶液外觀、pH、蛋白質濃度、根據SE-HPLC之尺寸均一性及根據HIAC之不可目視微粒物質。此外，藉由iCIEF測定電荷變異體，藉由CE-SDS (R&NR)測定分子量分佈，且使用盤式比濁法測定酶活性。
此研究中產生之結果(呈現於表22至26中)表明調配物中存在2,000 U/mL rHuPH20對納武單抗之品質屬性無影響。經由在5℃、25℃及40℃下儲存4週，當將含酶調配物之結果與無酶對照之結果進行比較時，溶液外觀、pH、蛋白質濃度或不可目視微粒含量無差異。在根據SE-HPLC之尺寸均一性、根據iCIEF之電荷變異體或根據CE-SDS (R&NR)之分子量變異體的結果中亦未觀測到差異。在5℃及25℃下觀察到酶活性之類似結果，但由於酶之Tm相對較低，在40℃條件下儲存時活性快速降低。
表 22 ： 在5 ℃、25 ℃ 及40 ℃ 下儲存 四 週之樣品之溶液外觀、蛋白質濃度及pH 的測試結果
儲存條件 時間 ( 週 ) 溶液 外觀 蛋白質濃度 (mg/mL) 溶液 pH
具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20 具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20 具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20
初始 0 符合 a 符合 101 102 6.15 6.15
5℃ 1 2 4 符合 符合 符合 符合 符合 符合 101 101 101 102 101 101 6.15 6.15 6.17 6.18 6.16 6.18
25℃ 1 2 4 符合 符合 符合 符合 符合 符合 102 101 99 101 100 102 6.17 6.17 6.17 6.16 6.14 6.17
40℃ 1 2 4 符合 符合 符合 符合 符合 符合 101 102 101 102 102 101 6.16 6.16 6.18 6.15 6.16 6.18
a透明至略微乳白色、無色至淺黃色溶液
表 23 ： 在5 ℃、25 ℃ 及40 ℃ 下儲存四週之樣品之高分子量物種、低分子量物種及酶活性的測試結果
儲存條件 時間 ( 週 ) SE-HPLC HMWS ( 面積 %) SE-HPLC LMWS ( 面積 %) 酶活性 (U/mL)
具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20 具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20 具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20
初始 0 0.54 0.56 0.05 0.05 2,209 N/A a
5℃ 1 2 4 0.59 0.61 0.64 0.58 0.60 0.63 0.06 0.07 0.08 0.07 0.07 0.07 2,212 2,288 2,263 N/A N/A N/A
25℃ 1 2 4 0.70 0.78 0.87 0.70 0.77 0.86 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.08 2,219 2,236 2,202 N/A N/A N/A
40℃ 1 2 4 0.98 1.18 1.52 0.96 1.16 1.51 0.08 0.08 0.09 0.07 0.09 0.09 497 ND bND N/A N/A N/A
a不適用， b未偵測
表 24 ： 在5 ℃、25 ℃ 及40 ℃ 下儲存四週之樣品之根據iCIEF 之 電荷變異體的測試結果
儲存條件 時間 ( 週 ) 酸基 ( 面積 %) 主峰 ( 面積 %) 鹼基 ( 面積 %)
具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20 具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20 具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20
初始 0 31.4 31.5 64.3 64.8 4.3 3.7
5℃ 1 2 4 31.3 32.2 32.2 31.6 31.9 32.3 64.8 64.0 63.6 65.3 63.8 63.6 3.9 3.8 4.3 3.1 4.2 4.1
25℃ 1 2 4 31.5 33.0 33.8 31.1 33.1 33.6 64.8 62.6 61.5 65.2 62.3 61.8 3.7 4.4 4.7 3.7 4.6 4.7
40℃ 1 2 4 34.7 39.4 47.0 33.9 39.5 47.4 60.6 54.4 45.8 61.2 54.4 45.7 4.7 6.3 7.2 5.0 6.1 6.9
表 25 ： 在5 ℃、25 ℃ 及40 ℃ 下儲存四週之樣品之根據CE -SDS ( 還原性及非還原性 ) 之 尺寸變異體的測試結果
儲存條件 時間 ( 週 ) 純度百分比， CE-SDS (R) ( 面積 %) 純度百分比， CE-SDS (NR) ( 面積 %)
具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20 具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20
初始 0 100.0 100.0 98.4 98.5
5℃ 1 2 4 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 98.4 98.7 99.3 98.5 98.7 99.3
25℃ 1 2 4 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 98.4 98.8 99.3 98.4 98.8 99.4
40℃ 1 2 4 100.0 99.8 99.8 100.0 99.8 99.8 98.4 98.3 98.9 98.4 98.2 98.9
表 26 ： 在5 ℃、25 ℃ 及40 ℃ 下儲存四週之樣品之根據HIAC 之 不可目視微粒物質的測試結果
儲存條件 時間 ( 週 ) 粒子 / 毫升 ， ≥ 10-µm 粒子 / 毫升 ， ≥ 25-µm
具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20 具有 rHuPH20 不具有 rHuPH20
初始 0 3 3 0 0
5℃ 1 2 4 4 3 1 3 0 4 3 0 0 1 0 0
25℃ 1 2 4 0 3 5 4 1 0 0 0 0 2 0 0
40℃ 1 2 4 6 5 1 9 1 5 0 1 0 0 0 0
商業調配物開發 - 添加 rHuPH20
開發納武單抗SC注射液之商業調配物的主要目標為將rHuPH20添加至FIH臨床調配物中。如同FIH給藥，商業藥品中之目標酶活性為2,000單位/毫升。rHuPH20藥物物質之目標蛋白濃度為10 mg/ml，目標酶活性為110,000單位/毫克，且20℃下之密度為1.010 g/mL。因此，對於2,000單位/毫升之酶活性，每公升成品藥品所需之rHuPH20藥物物質的理論量為：2,000 kU/L DP × 1 mg rHuPH20/110 kU × 1 mL/10 mg × 1.010 g/mL = 1.84 g/L。
每公升藥品1.84 g rHuPH20藥物物質產生0.0182 mg/mL之藥品酶濃度，來自：1.84 g/L × 1 mL/1.010 g × 10 mg/mL × 1 L/1,000 mL = 0.0182 mg rHuPh20/mL藥品。
藥品製造過程中添加之rHuPH20藥物物質的實際量係基於rHuPH20藥物物質之蛋白質濃度及酶活性確定，其範圍可分別為8.5至12.5 mg/mL及80至140 kU/mg。 添加甲硫胺酸作為犧牲性抗氧化劑
為防止rHuPH20氧化，進行了一項研究，其中將甲硫胺酸添加至調配物中作為犧牲性抗氧化劑。為了對調配物施加應力，將濃度為1 mM之過氧化物添加至含有濃度為0 mM、5 mM及10 mM之甲硫胺酸的調配物中。1 mM 含量之過氧化物係基於文獻中之資訊選擇的，該資訊表明當在40℃下儲存長達5週時，可在含有0.05% w/v聚山梨醇酯80之溶液中形成大約0.15 mM過氧化物。
在此實驗中，以20 mM組胺酸緩衝液，pH 6.0與250 mM蔗糖、0.05% w/v聚山梨醇酯80、50 µM噴替酸及2,000 U/mL rHuPH20中120 mg/mL之納武單抗濃度製備溶液。如下調節各溶液中之過氧化物及甲硫胺酸濃度：1.調配物A：無過氧化物，無甲硫胺酸；2.調配物B：無過氧化物，10 mM甲硫胺酸；3.調配物C：1 mM過氧化物，無甲硫胺酸；4.調配物D：1 mM過氧化物，5 mM甲硫胺酸；及5.調配物E：1 mM過氧化物，10 mM甲硫胺酸。
在25℃之加速條件下將樣品置於工作台上且監測長達6個月。所有樣品之外觀均保持透明至略微乳白色、無色至淺黃色。額外穩定性結果呈現於表27中。資料展示基本上未觀測到調配物pH、納武單抗濃度或高分子量及低分子量物種含量的差異。另外，所有樣品之不可目視微粒含量較低，無明顯趨勢。觀測到的一個差異為調配物C之酶活性顯著低於其他4種調配物之酶活性，調配物C含有過氧化物但不含甲硫胺酸。即使調配物中具有1 mM過氧化物，調配物D及E亦完全保留酶活性。基於此穩定性研究之結果，選擇5 mM之甲硫胺酸濃度用於商業藥品。
表 27 ： 對於添加及未添加甲硫胺酸之樣品 ，1 mM 過氧化物對在25 ℃ 下儲存6 個月之納武單抗SC 注射液之穩定性的影響
調配物 時間 ( 月 ) pH 蛋白質濃度 (mg/mL) HMWS ( 面積 % ) LMWS ( 面積 % ) 酶活性 (U/mL) 不可目視微粒物質 ( 粒子 / 毫升 )
≥ 10-µm ≥ 25-µm
調配物A (無過氧化物，無甲硫胺酸) 0 1 3 6 5.94 5.96 5.99 5.94 117 119 116 118 0.63 0.93 1.12 1.21 0.06 0.08 0.08 0.12 2,266 2,130 2,031 2,015 1 9 11 14 0 0 1 0
調配物B (無過氧化物，10 mM甲硫胺酸) 0 1 3 6 5.93 5.95 5.97 5.94 118 118 119 119 0.62 0.90 1.09 1.18 0.06 0.07 0.08 0.13 2,292 2,262 2,055 2,023 0 3 9 10 0 0 0 0
調配物C (1 mM過氧化物，無甲硫胺酸) 0 1 3 6 5.93 5.94 5.96 5.92 119 117 118 116 0.62 0.89 1.08 1.19 0.07 0.08 0.09 0.13 2,248 2,038 1,856 1,792 0 6 13 11 0 0 0 0
調配物D (1 mM過氧化物，5 mM甲硫胺酸) 0 1 3 6 5.92 5.94 5.99 5.91 117 119 120 116 0.62 0.92 1.10 1.18 0.06 0.09 0.08 0.12 2,261 2,239 2,081 2,044 0 5 24 8 0 0 0 0
調配物E (1 mM過氧化物，10 mM甲硫胺酸) 0 1 3 6 5.93 5.94 5.97 5.95 118 119 117 121 0.62 0.90 1.08 1.17 0.06 0.08 0.08 0.13 2,285 2,211 2,036 2,047 0 10 9 8 0 0 0 0
當調配物摻加 1 . 5 ppm 金屬時納武單抗 SC 注射液之 穩定性 - 評估噴替酸及甲硫胺酸之保護作用
如先前所論述，選擇50 μM噴替酸作為調配物之組分以防止痕量金屬催化之納武單抗降解，且選擇5 mM甲硫胺酸作為犧牲性抗氧化劑以防止過氧化物誘導之rHuPH20氧化。進行了一項研究，以評估當此兩種賦形劑均包括於調配物中時對納武單抗SC注射液之穩定性的影響。在此實驗中，以20 mM組胺酸緩衝液，pH 6.0與250 mM蔗糖及0.05% w/v聚山梨醇酯80中120 mg/mL之納武單抗濃度製備溶液。如下調節各調配物中之噴替酸及甲硫胺酸濃度：1.調配物A：無噴替酸，無甲硫胺酸；2.調配物B：50 µM噴替酸，無甲硫胺酸；3.調配物C：無噴替酸，5 mM甲硫胺酸；及4.調配物D：50 µM噴替酸，5 mM甲硫胺酸。
各調配物摻加濃金屬溶液，以使金屬之最終調配物濃度為1.5 ppm (鐵、鉻及銅各0.5 ppm)。將各調配物之樣品填充至小瓶中，置於40℃應力條件下之台上且監測長達2個月。所有樣品之外觀均保持透明至略微乳白色、無色至淺黃色。表28中呈現之額外穩定性結果未展示調配物pH、納武單抗濃度或不可目視微粒含量之差異。在40℃下儲存2個月之後，不含噴替酸或甲硫胺酸之調配物A中之高分子量物種含量最高，且含有此兩種賦形劑之調配物D中之高分子量物種含量最低。比較調配物B與C中之HMWS含量展示50 µM噴替酸比5 mM甲硫胺酸更能夠防止HMWS形成。因此，此研究之結果支持在納武單抗SC注射液之商業調配物中包括50 µM噴替酸及5 mM甲硫胺酸兩者。
表 28 ： 對於具有及不具有50 µM 噴替酸或5 mM 甲硫胺酸之樣品 ，1 .5 ppm 金屬對在40 ℃ 下儲存2 個月之納武單抗SC 注射液之穩定性的影響
調配物 時間 ( 月 ) pH 蛋白質濃度 (mg/mL) HMWS ( 面積 % ) LMWS ( 面積 % ) 不可目視微粒物質 ( 粒子 / 毫升 )
≥ 10-µm ≥ 25-µm
調配物A (摻加1.5 ppm金屬， 無噴替酸， 無甲硫胺酸) 0 1 2 5.94 5.97 5.93 117 117 118 0.68 3.55 6.01    0.08 0.17 0.28 2 10 9 1 0 2   
調配物B (摻加1.5 ppm金屬， 50 µM噴替酸， 無甲硫胺酸) 0 1 2 5.97 5.93 5.95    116 118 116 0.68 2.03 3.37 0.07 0.13 0.18 5 6 10 0 0 0
調配物C (摻加1.5 ppm金屬， 無噴替酸， 5 mM甲硫胺酸) 0 1 2 5.95 5.93 5.96 119 119 118 0.68 2.93 5.18 0.08 0.15 0.25 2 9 10 0 0 1
調配物D (摻加1.5 ppm金屬， 50 µM噴替酸， 5 mM甲硫胺酸) 0 1 2 5.95 5.95 5.92 119 116 119 0.68 1.83 2.87 0.07 0.12 0.18 4 8 5 0 0 0
IND 為商業調配物提供穩定批次
製造實驗室批次之納武單抗SC注射液，120 mg/mL (商業調配物)且將其置於穩定狀態。調配物為含120 mg/mL納武單抗之20 mM組胺酸緩衝液pH 6.0，該緩衝液具有250 mM蔗糖、0.05% w/v聚山梨醇酯80、50 µM噴替酸、5 mM甲硫胺酸及2,000 U/mL rHuPH20。批量大小為3,000 mL大小，且經檢查後產生368個小瓶(此批次中之800 mL用於其他開發活動)。將藥品填充(目標填充量為5.67 mL，標籤濃度為600 mg/小瓶)至Schott 10R I型燧石玻璃小瓶中，該等小瓶用20 mm Daikyo D-21-7-S Flurotec塗層丁基橡膠塞封閉。小瓶用帶翻蓋的20 mm West鋁密封件密封。將藥品小瓶置於5℃、25℃及40℃下之台上。在指定時間點，自穩定台取出樣品且進行測試。十二個月之IND穩定性資料呈現於表29至表32中。
所有樣品在所有時間點之視覺外觀均符合規格(透明至極乳白色、無色至黃色液體，可存在輕(少量)微粒(外觀與蛋白質微粒一致))。額外穩定性資料提供於表29至32中。如表29中所示，在整個研究過程中pH或蛋白質濃度未觀測到變化。在5℃下儲存之12個月內，HMWS含量增加1.X%。在加速25℃條件下，在儲存6個月之後，HMWS含量增加0.6%。在40℃應力條件下，HMWS含量在儲存3個月內增加3.3%。對於在5℃及25℃下儲存之樣品，LMWS含量幾乎無變化，但對於在40℃下儲存3個月之樣品，LMWS含量增加1.1%。
表 29 ： 納武單抗SC 注射液 ，600 mg / 小瓶 (120 mg /mL ) 之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) 外觀 溶液 pH 納武單抗濃度 (mg/mL) SE-HPLC
HMWS ( 面積 %) 單體 ( 面積 %) LMWS ( 面積 %)
初始 0 符合 a 5.8 123.3 0.6 99.3 0.1
5℃ 1 3 6 9 12 符合 符合 符合 符合 符合 5.8 5.9 5.8 5.8 5.9 124.5 128.2 130.9 125.7 121.6 0.9 0.8 0.8 0.8    99.0 99.1 99.0       0.1 ＜0.1 0.2      
25℃/60%RH 1 3 6 符合 符合 符合 5.8 5.9 5.8 127.2 127.5 129.9 1.0 1.1 1.3 98.9 98.7 98.5 0.1 0.1 0.2
40℃/75%RH 0.5 1 3 符合 符合 符合 5.9 5.8 5.9 123.0 124.7 126.1 1.0 1.6 3.1 98.9 98.3 95.9 0.1 0.1 1.0
a符合 =透明至極乳白色、無色至黃色液體，可存在輕(少量)微粒(外觀與蛋白質微粒一致)。
表30呈現根據還原性及非還原性CE-SDS之尺寸變異體的資料。在5℃下儲存之12個月內，根據還原性及非還原性CE-SDS之純度百分比均不變。在加速25℃條件下，在儲存6個月內，根據還原性CE-SDS之純度百分比降低0.2%。在40℃應力條件下，在儲存3個月內，根據還原性CE-SDS之純度百分比降低2.9%。對於非還原性CE-SDS，純度百分比在25℃下儲存6個月內降低1.2%且在40℃應力條件下降低4.4%。
表 30 ： 納武單抗SC 注射液 ，600 mg / 小瓶 (120 mg /mL ) 之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) CE-SDS ( 還原 ) CE-SDS ( 非還原 )
純度 ( 面積 %) 次峰之和 ≥ LOQ ( 面積 %) 純度 ( 面積 %) 次峰之和 ≥ LOQ ( 面積 %)
初始 0 100.0 ＜1 99.0 1.0
5℃ 1 3 6 9 12 99.6 99.7 99.7       ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5       98.7 98.6 98.4       0.9 0.9 0.9      
25℃/60%RH 1 3 6 99.6 99.4 99.4 ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5 99.3 97.9 97.9 0.7 1.5 1.5
40℃/75%RH 0.5 1 3 99.2 99.2 97.1 ＜0.5 ＜0.5 2.0 98.3 97.0 94.1 0.5 2.2 5.0
酸性物種之含量在所有儲存條件下隨時間增加。在5℃下儲存之12個月內，酸性物種增加1.5%。在加速25℃條件下，酸性物種在儲存6個月內增加11.3%。在40℃應力條件下，酸性物種含量在儲存3個月內增加38.8%。在5℃下儲存之12個月期間，鹼性物種含量幾乎不變。在25℃條件下，鹼性物種含量在6個月內增加1.6%且在40℃下儲存3個月之後，鹼性物種含量增加2.6%。酸性及鹼性物種增加伴隨著主峰面積之大致相等減小。
表 31 ： 納武單抗SC 注射液 ，600 mg / 小瓶 (120 mg /mL ) 之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) iCIEF 聚山梨醇酯 80 (% w/v) 酶活性 (U/mL)
酸基 ( 面積 %) 主峰 ( 面積 %) 鹼基 ( 面積 %)
初始 0 31.9 63.5 4.6 0.04 2,110
5℃ 1 3 6 9 12 33.5 33.2 35.6       61.7 61.8 60.0       4.8 4.9 4.4       - - - 2129 2079 1910      
25℃/60%RH 1 3 6 35.2 38.5 47.6 59.2 55.4 47.0 5.6 6.1 5.5 - - 0.04 2087 2105 1870
40℃/75%RH 0.5 1 3 37.2 46.8 66.7 55.6 45.4 25.5 7.3 7.8 7.8 - - 0.04 900 487 NR
表32呈現活性結合ELISA、基於細胞之生物分析及不可目視微粒之結果。在所有溫度及時間點，活性結合ELISA之結果在95%至112%範圍內，且基於細胞之生物分析在79%至105%範圍內。所有樣品在所有時間點處之不可目視微粒含量均較低且無明顯趨勢。
表 32 ： 納武單抗SC 注射液 ，600 mg / 小瓶 (120 mg /mL ) 之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 月 ) 活性結合 ELISA % 基於細胞之生物分析 % 微粒物質
粒子 / 小瓶 ≥ 10 微米 粒子 / 小瓶 ≥ 25 微米
初始 0 110 93 53 0
5℃ 1 3 6 9 12 103 102 97 102 95 94 88 87 91 93 15 33 18       0 0 2      
25℃/60%RH 1 3 6 95 92 99 86 77 77 35 48 25 2 0 0
40℃/75%RH 0.5 1 3 100 100 97 82 88 89 80 27 32 0 0 0
調配物穩健性
進行一項研究以檢查選擇用於商業藥品之調配物的穩健性。該研究設計要求製備13種不同的調配物。製備了九種調配物用於主效應篩選，兩種調配物在目標處製備，且製備兩個軸向運行以確定蛋白質濃度之效應。為目標調配物之一準備額外小瓶且在-60℃下冷凍儲存。此等冷凍樣品在各時間點解凍及測試，以評估分析(時間點之間)變化。五個因素在製備之調配物中有所變化，且包括蛋白質濃度(105 mg/mL至135 mg/mL)、pH (5.5至6.5)、聚山梨醇酯80濃度(0.025% w/v至0.075% w/v)、噴替酸濃度(25 µM至75 µM)及甲硫胺酸濃度(2.5 mM至7.5 mM)。為穩健性研究製備之調配物呈現於表33中。
表 33 ： 為穩健性研究製備之調配物
調配物編號 調配物描述 蛋白質濃度 (mg/mL) pH PS80 濃度 (% w/v) 噴替酸濃度 (µM) 甲硫胺酸濃度 (mM)
1 主效應篩選 135 6.5 0.075 75 7.5
2 主效應篩選 105 6.5 0.025 25 7.5
3 軸向蛋白質濃度 105 6.0 0.050 50 5.0
4 中心點 120 6.0 0.050 50 5.0
5 主效應篩選 135 5.5 0.025 75 2.5
6 中心點 120 6.0 0.050 50 5.0
7 主效應篩選 135 6.5 0.025 25 2.5
8 主效應篩選 135 5.5 0.075 25 7.5
9 主效應篩選 105 5.5 0.075 25 2.5
10 主效應篩選 105 5.5 0.025 25 2.5
11 主效應篩選 105 5.5 0.025 75 7.5
12 主效應篩選 105 6.5 0.075 75 2.5
13 軸向蛋白質濃度 135 6.0 0.050 50 5.0
14 中心點(儲存於-60℃下) 120 6.0 0.050 50 5.0
藉由首先解凍約一公升經純化藥物物質(150 g/L納武單抗於20 mM組胺酸、250 mM蔗糖，pH 6.0中)來製備調配物。接著使用切向流過濾交換緩衝液且將一半體積調節至pH 5.5，且將另一半調節至pH 6.5。對於pH 6.0之中間目標，將pH 5.5之經純化藥物物質添加至pH 6.5之經純化藥物物質，直至達到6.0之目標pH。對於14種調配物，各製備50 mL體積。藉由添加不同量之濃摻加溶液來調節各調配物中聚山梨醇酯80、噴替酸及甲硫胺酸之濃度。製備後，使各調配物穿過0.22 µm滅菌過濾器，接著填充至被塞住且密封之3 cc玻璃小瓶中。接著將經填充小瓶置於5℃之推薦儲存條件下以及25℃之加速穩定條件下的工作台上。
在初始時間點測試各組樣品之溶液外觀、pH、蛋白質濃度、根據SE-HPLC之尺寸均一性及根據HIAC之不可目視微粒物質。此外，藉由iCIEF測定電荷變異體，藉由CE-SDS (R&NR)測定分子量分佈，且使用盤式比濁法測定酶活性。在25℃加速條件下儲存1個月及3個月之後以及在5℃下儲存6個月及12個月之後再次測試樣品。穩定性結果呈現於表34至表39中。
在初始時間點，在所有四組中，溶液外觀、pH或納武單抗濃度均無變化。對於第1、3及4組之根據SE-HPLC之尺寸均一性、根據iCIEF之電荷變異體、根據CE-SDS (R&NR)之尺寸變異體及酶活性觀測到類似初始結果。第2組樣品(室溫、室內光照及30℃儲存)之HMWS含量比對照高0.21%且第2組樣品之酸性物種含量比對照高1.4%。所有樣品之根據HIAC之不可目視微粒物質均極低。在初始時間點，第2組樣品之酶活性比對照之酶活性低2.5%。
在25℃加速條件下儲存六個月之後，在所有四組中，溶液外觀、pH或納武單抗濃度均無變化。第1、3及4組之HMWS含量類似且第2組之HWWS含量比對照之HWWS含量高0.15%。所有四組之LMWS含量相同，均為0.13%。對於根據iCIEF之電荷變異體，第2組之酸性物種含量比對照之酸性物種含量高2.7%，且與第1組及第3組之對照類似。在六個月時間點處，所有四組之鹼性物種均在5.9%至6.0%範圍內。所有四組之分子尺寸變異體含量對於還原性CE-SDS在99.7%至99.8%範圍內，且對於非還原性CE-SDS在96.5%至97.2%範圍內。在六個月時間點處，所有樣品之根據HIAC之不可目視微粒物質計數均極低，無明顯趨勢，且所有組之酶活性經確定在對照之99.2%及105.6%內。
表 34 ： 儲存於25 ℃ 下之納武單抗SC 注射液的穩定性資料
調配物 時間 ( 25 ℃下之月數 ) 外觀 溶液 pH 納武單抗濃度 (mg/mL) SE-HPLC
HMWS ( 面積 %) 單體 ( 面積 %) LMWS ( 面積 %)
1 0 1 3 符合(a) 符合 符合 6.46       127       0.72       99.17       0.10      
2 0 1 3 符合 符合 符合 6.41       102       0.66       99.22       0.12      
3 0 1 3 符合 符合 符合 5.99       102       0.62       99.27       0.11      
4 0 1 3 符合 符合 符合 5.97       117       0.62       99.28       0.09      
5 0 1 3 符合 符合 符合 5.49       133       0.59       99.32       0.09      
6 0 1 3 符合 符合 符合 5.96       118       0.62       99.28       0.10      
7 0 1 3 符合 符合 符合 6.46       132       0.73       99.15       0.12      
8 0 1 3 符合 符合 符合 5.49       129       0.58       99.32       0.10      
9 0 1 3 符合 符合 符合 5.57       103       0.57       99.34       0.10      
10 0 1 3 符合 符合 符合 5.56       103       0.57       99.35       0.08      
11 0 1 3 符合 符合 符合 5.55       102       0.57       99.32       0.11      
12 0 1 3 符合 符合 符合 6.42       102       0.70       99.20       0.10      
13 0 1 3 符合 符合 符合 6.00       130       0.66       99.25       0.09      
14 0 1 3 符合 符合 符合 5.98       116       0.65       99.24       0.12      
a符合 = 透明至略微乳白色、無色至淺黃色溶液
表 35 ： 儲存於 25 ℃ 下之納武單抗 SC 注射液的穩定性資料
調配物 時間 (25 ℃ 下之月數 ) iCIEF 酶活性 (U/mL)
酸基 ( 面積 %) 主峰 ( 面積 %) 鹼基 ( 面積 %)
1 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
2 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
3 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
4 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
5 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
6 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
7 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
8 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
9 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
10 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
11 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
12 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
13 0 1 3 35.6       59.8       4.7       1,956      
14 0 3 6 35.6       59.8       4.7       1,956      
表 36 ： 儲存於 25 ℃ 下之納武單抗 SC 注射液的穩定性資料
調配物 時間 (25 ℃ 下之月數 ) CE-SDS (R) 純度 ( 面積 %) CE-SDS (NR) 純度 ( 面積 %) 微粒物質
粒子 /mL ≥ 10 微米 粒子 /mL ≥ 25 微米
1 0 1 3 100.0       98.8       1       0      
2 0 1 3 100.0       98.8       5       1      
3 0 1 3 100.0       98.8       3       1      
4 0 1 3 100.0       98.8       6       3      
5 0 1 3 100.0       98.8       0       0      
6 0 1 3 100.0       98.8       1       0      
7 0 1 3 100.0       98.8       1       1      
8 0 1 3 100.0       98.8       1       0      
9 0 1 3 100.0       98.8       4       0      
10 0 1 3 100.0       98.8       7       1      
11 0 1 3 100.0       98.8       3       0      
12 0 1 3 100.0       98.8       1       0      
13 0 1 3 100.0       98.8       5       1      
14 0 1 3 100.0       98.8       8       2      
表 37 ： 儲存於5 ℃ 下之納武單抗SC 注射液的穩定性資料
調配物 時間 (5 ℃ 下之月數 ) 外觀 溶液 pH 納武單抗濃度 (mg/mL) SE-HPLC
HMWS ( 面積 %) 單體 ( 面積 %) LMWS ( 面積 %)
1 0 6 12 符合(a) 符合 符合 6.46       127       0.72       99.17       0.10      
2 0 6 12 符合 符合 符合 6.41       102       0.66       99.22       0.12      
3 0 6 12 符合 符合 符合 5.99       102       0.62       99.27       0.11      
4 0 6 12 符合 符合 符合 5.97       117       0.62       99.28       0.09      
5 0 6 12 符合 符合 符合 5.49       133       0.59       99.32       0.09      
6 0 6 12 符合 符合 符合 5.96       118       0.62       99.28       0.10      
7 0 6 12 符合 符合 符合 6.46       132       0.73       99.15       0.12      
8 0 6 12 符合 符合 符合 5.49       129       0.58       99.32       0.10      
9 0 6 12 符合 符合 符合 5.57       103       0.57       99.34       0.10      
10 0 6 12 符合 符合 符合 5.56       103       0.57       99.35       0.08      
11 0 6 12 符合 符合 符合 5.55       102       0.57       99.32       0.11      
12 0 6 12 符合 符合 符合 6.42       102       0.70       99.20       0.10      
13 0 6 12 符合 符合 符合 6.00       130       0.66       99.25       0.09      
14 0 6 12 符合 符合 符合 5.98       116       0.65       99.24       0.12      
a符合 = 透明至略微乳白色、無色至淺黃色溶液
表 38 ： 儲存於 5 ℃ 下之納武單抗 SC 注射液的穩定性資料
調配物 時間 (5 ℃ 下之月數 ) iCIEF 酶活性 (U/mL)
酸基 ( 面積 %) 主峰 ( 面積 %) 鹼基 ( 面積 %)
1 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
2 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
3 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
4 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
5 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
6 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
7 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
8 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
9 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
10 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
11 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
12 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
13 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
14 0 6 12 35.6       59.8       4.7       1,956      
表 39 ： 儲存於 5 ℃ 下之納武單抗 SC 注射液的穩定性資料
調配物 時間 (5 ℃ 下之月數 ) CE-SDS (R) 純度 ( 面積 %) CE-SDS (NR) 純度 ( 面積 %) 微粒物質
粒子 /mL ≥ 10 微米 粒子 /mL ≥ 25 微米
1 0 6 12 100.0       98.8       1       0      
2 0 6 12 100.0       98.8       5       1      
3 0 6 12 100.0       98.8       3       1      
4 0 6 12 100.0       98.8       6       3      
5 0 6 12 100.0       98.8       0       0      
6 0 6 12 100.0       98.8       1       0      
7 0 6 12 100.0       98.8       1       1      
8 0 6 12 100.0       98.8       1       0      
9 0 6 12 100.0       98.8       4       0      
10 0 6 12 100.0       98.8       7       1      
11 0 6 12 100.0       98.8       3       0      
12 0 6 12 100.0       98.8       1       0      
13 0 6 12 100.0       98.8       5       1      
14 0 6 12 100.0       98.8       8       2      
測定小瓶目標填充體積及過量填充
納武單抗之標記SC劑量為480 mg，其為120 mg/mL納武單抗濃度之藥品的4 mL注射液。各小瓶中均包括納武單抗SC注射液之過量填充，以考慮在使用產品期間小瓶、針頭及注射器(VNS)中之損失(符合USP ＜1151＞最小推薦過量填充量)及考慮裝填機之變化性。過量填充確保可自小瓶中抽取標示量的納武單抗SC注射液。
進行研究以確定小瓶、針頭及注射器中之實際納武單抗SC注射液滯留體積。小瓶用恰好4.50 mL之藥品填充，塞住且密封。五名參與者使用20G 1.5''針頭使用5 cc塑膠注射器抽取小瓶內容物。將20G 1.5''針頭替換為25G 5/8''針頭，且將注射器內容物排出至一個小燒杯中。將排出之藥品的重量轉換為體積且自4.50 mL之小瓶填充體積中減去。5名參與者之滯留體積在0.29 mL至0.35 mL範圍內，平均為0.32 mL。應注意，此值類似於USP ＜1151＞推薦的6 cc小瓶尺寸過量0.34 mL (外推值)。
封閉系統轉移裝置(CSTD)在許多設施中使用以保護健康照護提供者免於接觸藥物。用於直接SC注射之CSTD通常由3部分組成，且包括小瓶轉接器、注射器轉接器及針頭轉接器。為確定CSTD中之滯留體積，相同的5名參與者使用6種最常用的CSTD重複研究。一旦CSTD連接至小瓶，便無法輕易移除，因此，此部分研究將測定小瓶中之滯留體積加上CSTD及注射器中之滯留體積。
如同前述研究小組，6R小瓶用恰好4.50 mL之納武單抗注射液填充，接著塞住且密封。五名參與者使用CSTD小瓶轉接器及CSTD注射器轉接器將小瓶內容物抽取至5 cc塑膠注射器中。注射器與小瓶分離，添加CSTD針頭轉接器及25G 5/8''針頭，且將注射器內容物排出至小燒杯中。將排出之藥品的重量轉換為體積且自4.50 mL之小瓶填充體積中減去。5名參與者之滯留體積呈現於表40中。在產生之30個結果中，平均小瓶加上CSTD滯留體積為0.46 mL，標準差為0.06 mL。然而，6種不同CSTD中之每一者之最高滯留體積在0.46 mL至0.58 mL範圍內。所選滯留體積則為0.58 mL + 0.06 mL = 0.64 mL。在3%裝填機變化性下，所選目標填充量為(4.00 mL + 0.64 mL)/0.97 = 4.78 mL。
表 40 ： 納武單抗 SC 注射液之小瓶加上 CSTD 滯留體積
CSTD 滯留體積 1 (mL) 滯留體積 2 (mL) 滯留體積 3 (mL) 滯留體積 4 (mL) 滯留體積 5 (mL) 平均 滯留體積 (mL) 最高 滯留體積 (mL)
PhaSeal 0.41 0.50 0.51 0.51 0.43 0.47 0.51
ChemoLock 0.53 0.51 0.58 0.49 0.45 0.51 0.58
ChemoClave 0.44 0.40 0.45 0.51 0.41 0.44 0.51
OnGuard 0.42 0.46 0.34 0.52 0.43 0.43 0.52
Equashield 0.42 0.35 0.34 0.46 0.42 0.40 0.46
CareFusion 0.48 0.41 0.57 0.55 0.49 0.50 0.57
商業調配物之描述及組成
納武單抗SC注射液，600 mg/小瓶(120 mg/mL)之商業調配物為無菌、非熱原性、透明至極乳白色、無色至黃色液體。可存在與蛋白質粒子之外觀一致的少數微粒。藥品為用於皮下(SC)投與之單次使用、無防腐劑、等張水溶液。納武單抗SC 注射液包裝在6R 1型燧石玻璃小瓶中，該等小瓶用20 mm Daikyo D21-7S Flurotec®塗層丁基瓶塞塞住，該等瓶塞用帶翻蓋的20 mm鋁密封件固定。包括各組分之品質標準及功能的納武單抗SC注射液組成呈現於表41中。各小瓶中均包括過量填充之納武單抗SC注射液，以確保可向患者投與5.0 mL標記量。
表 41 ： 納武單抗SC 注射液，600 mg / 小瓶 (120 mg /mL ) 商業調配物之組成
組分 品質標準 功能 每小瓶之量 (mg) a
納武單抗 BMS規格 活性成分 780
L-組胺酸 b USP、Ph.Eur. 緩衝劑 10.1
L-組胺酸HCl H 2O Ph.Eur. 緩衝劑 13.7
蔗糖 NF、Ph.Eur. 張力調節劑 556
聚山梨醇酯80 NF、Ph.Eur. 界面活性劑 3.25
噴替酸 USP 金屬離子螯合劑 0.128
甲硫胺酸 USP、Ph.Eur. 抗氧化劑 4.85
rHuPH20 BMS/Halozyme 內切糖苷酶 0.118
氯化鈉 b NA NA NA
注射用水 USP、Ph.Eur. 溶劑 q.s.至6.50 mL
a目標填充包括1.5 mL過量填充，以考慮小瓶、針頭及注射器(VNS)滯留、裝填機變化性及投與組分滯留。 b氯化鈉及組胺酸存在於rHuPH20藥物物質中，但對最終組合物之貢獻無足輕重。USP=美國藥典，Ph.Eur.=歐洲藥典，NF=國民處方集，q.s. = 足量 所選物理及化學特性
150 mg/mL納武單抗藥物物質、120 mg/mL納武單抗藥品及稀釋緩衝液之所選物理及化學特性呈現於表42中。
表 42 ： 150 mg /mL 納武單抗藥物物質、120 mg /mL 納武單抗藥品及稀釋緩衝液之所選物理及化學特性
特性 藥物物質 藥品 稀釋緩衝液
納武單抗濃度 150 mg/mL (135-180 mg/mL) 120 mg/mL (108-132 mg/mL) 0 mg/mL
調配物 (目標值) 20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80、50 µM噴替酸 20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80、50 µM噴替酸、5 mM甲硫胺酸、2 kU/mL HuPH20 20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80、50 µM噴替酸、25 mM甲硫胺酸、10 kU/mL HuPH20 a
溶液pH (在18-22℃下) 6.0 ± 0.5 6.0 ± 0.5 6.0 ± 0.5
密度(在15-25℃下) 1.078 g/mL 1.069 g/mL 1.033 g/mL
黏度 37 cP於5℃下 17 cP 20℃ 13 cP於5℃下 7 cP 20℃ 1.8 cP於5℃下 1.6 cP 20℃
表面張力(在22℃下) 46 mN/m 45 mN/m 42 mN/m
重量莫耳滲透濃度(mOsm/kg) TBD 350 ± 20% 330 ± 20%
外觀 無色至黃色、透明至極乳白色液體 無色至黃色、透明至極乳白色液體，可存在輕(少量)微粒(外觀與蛋白質微粒一致)。 無外觀描述，因為過程內中間物
推薦的儲存及運輸條件 ≤ -35℃，避光 2-8℃，避光及冷凍 2-8℃，避光及冷凍
a稀釋緩衝液中之甲硫胺酸及rHuPH20的確切量將取決於用於製造批次之藥物物質的納武單抗濃度。ref：ELN A0C6F-067、-079、-083、-085 -086。 應力研 究 短期室溫及室內光照研究
此研究之目標為評估短期室溫/室內光照(RT/RL)暴露對納武單抗SC注射液之影響。在此短期研究中生成之資料有助於瞭解用於長期應力研究之暴露時長。此研究中所用之藥品調配物為含120 mg/mL納武單抗之20 mM組胺酸緩衝液pH 6.0，該緩衝液具有250 mM蔗糖、0.05% w/v聚山梨醇酯80、50 µM噴替酸、5 mM甲硫胺酸及2,000 U/mL rHuPH20。將本體溶液(5.67 mL等分試樣)填充至10 cc玻璃小瓶中，塞住且密封。接著使小瓶分別承受以下應力。將小瓶置於水平位置以進行最壞情況下的光暴露：25C/RL暴露-在RT/RL下7天、14天及28天之後進行測試；25C/RL避光*-在RT下7天、14天及28天後進行測試(*藉由用鋁箔包裹小瓶以避光)。
光源為裝入塑膠管中之鹵代磷酸鹽燈泡。將未標記之小瓶置於白紙上，以水平位置放在塑膠托盤上。在各時間點，所有四個角處之UV儀錶讀數均為0 µW/cm 2。在各時間點獲取四個角處之測光儀讀數，且範圍為933勒克斯至1023勒克斯。在自暴露於應力條件取出後，將樣品儲存於5℃下。所有樣品在研究結束時一起測試。測試包括外觀、pH、蛋白質濃度、SE-HPLC、根據HIAC之不可目視微粒含量、CE-SDS (R&NR)、iCIEF及酶活性。
來自研究之穩定性資料呈現於表43至45中。如表43中所呈現，所有樣品在所有時間點之視覺外觀均為透明至略微乳白色、無色至淺黃色溶液。對於28天研究中之任何樣品，均未觀測到pH或蛋白質濃度變化。在加速25℃避光條件下儲存之樣品的HMWS含量增加了0.12%，且在25℃及1,000勒克斯光照下儲存之樣品的HMWS含量增加了1.00%。經過28天時間點，所有樣品之LMWS含量均幾乎不變。
表 43 ： 納武單抗 SC 注射液之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 天 ) 外觀 溶液 pH 納武單抗濃度 (mg/mL) SE-HPLC
HMWS ( 面積 %) 單體 ( 面積 %) LMWS ( 面積 %)
25℃/黑暗 0 7 14 28 符合 符合 符合 符合 5.98 5.99 5.97 6.00 118 117 119 121 0.85 0.89 0.92 0.97 99.07 99.03 99.00 98.94 0.08 0.08 0.08 0.09
25℃/ 1,000勒克司 0 7 14 28 符合 符合 符合 符合 5.98 5.98 6.01 5.96 118 119 118 118 0.85 1.15 1.35 1.85 99.07 98.77 98.57 98.05 0.08 0.08 0.08 0.09
a符合 = 透明至略微乳白色、無色至淺黃色溶液。
表44呈現根據iCIEF之電荷變異體及酶活性的穩定性資料。在28天儲存期內，在25℃下在黑暗中儲存之樣品的酸性物種含量增加了1.0%，而在25℃/1,000勒克斯下儲存之樣品的酸性物種含量增加了5.6%。兩種儲存條件下之鹼性物種含量均幾乎不變。酸性物種含量中觀測到的增加伴隨著主峰面積之大致相等減小。在25℃下在黑暗中儲存之樣品的酶活性幾乎不變，但儲存於25℃/1,000勒克斯下之樣品的酶活性每天降低約2%。
表 44 ： 納武單抗 SC 注射液之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 天 ) iCIEF 酶活性 (U/mL)
酸基 ( 面積 %) 主峰 ( 面積 %) 鹼基 ( 面積 %)
25℃/黑暗 0 7 14 28 34.6 34.3 34.8 35.6 60.2 60.2 59.3 58.5 5.3 5.5 5.9 5.9 2,022 1,996 2,022 2,000
25℃/ 1,000勒克司 0 7 14 28 34.6 36.5 37.1 40.2 60.2 58.0 57.2 54.2 5.3 5.5 5.7 5.6 2,022 1,696 1,362 994
表45呈現CE-SDS還原性、CE-SDS非還原性及不可目視微粒物質之資料。在28天研究時段內，無論儲存於光照下或黑暗中，還原性CE-SDS之百分比純度均不變。在28天儲存期內，對於暴露於室內光照及避光之樣品，非還原性CE-SDS之百分比純度均降低0.4%。不可目視微粒含量較低，無明顯趨勢。
表 45 ： 納武單抗 SC 注射液之穩定性資料
儲存條件 時間 ( 天 ) CE-SDS (R) 純度 ( 面積 %) CE-SDS (NR) 純度 ( 面積 %) 微粒物質
粒子 /mL ≥ 10 微米 粒子 /mL ≥ 25 微米
25℃/黑暗 0 7 14 28 100.0 100.0 100.0 100.0 99.5 99.4 99.2 99.1 5 8 5 2 2 0 0 0
25℃/ 1,000勒克司 0 7 14 28 100.0 100.0 100.0 100.0 99.5 99.3 99.2 99.1 5 8 8 8 2 0 0 0
基於此研究之結果，建議限制藥品暴露於室內光照。 儲存於 25 - 40 ℃下之 納武單抗 SC 注射液中 rHuPH20 的短期穩定性
進行一項研究，以評估當納武單抗SC注射液在25℃至40℃之溫度範圍內儲存至多24小時時，儲存溫度對rHuPH20酶活性的影響。將單獨的藥品小瓶在25℃、32℃、36℃及40℃下在黑暗中儲存至多24小時。在儲存期之後，測試樣品之rHuPH20活性。一式三份地測試各樣品。亦測試在5℃下連續儲存之樣品作為對照。結果呈現於表46中。
表 46 ： 當納武單抗SC 注射液在不同溫度下在黑暗中儲存24 小時時 ， 儲存溫度對酶活性之影響
儲存溫度 分析 #1 ( 單位 / 毫升 ) 分析 #2 ( 單位 / 毫升 ) 分析 #3 ( 單位 / 毫升 ) 平均 酶活性 ( 單位 / 毫升 ) 5 ℃ 儲存對照之 % 形式的酶活性
5℃ (對照) 2039 1982 1826 1949 100.0   
25℃ 2043 1937 1891 1957 100.4   
32℃ 2005 1797 1809 1870 95.9   
36℃ 2006 1916 1774 1899 97.4   
40℃ 1337 1565 1546 1483 76.1   
儘管酶活性結果展示大量變化性，但觀測到穩定性隨著溫度升高而降低之趨勢。因此，必須限制在高於25℃下之藥品儲存時間。 物理應力研究
進行一項研究以檢驗物理應力對納武單抗SC注射液之穩定性的影響。施加在藥品上之物理應力類似製造、運輸或使用過程中通常可能經歷的物理應力。應力包括凍融(第1組)、室溫暴露、室內光照暴露、高溫偏移(第2組)、搖晃及振盪(第3組)以及在5℃下連續避光儲存(第4組-對照)。製備一批納武單抗SC注射液，且將3.0 mL等分試樣之藥品填充至6 cc小瓶中，接著將其塞住且密封。填充之小瓶承受各種應力，接著在25℃下置於加速穩定狀態。
對於研究之凍融組(第1組)，填充之小瓶在-20℃與5℃之間循環四次，在-20℃下之最短冷凍時間為16小時，且在5℃下之最短解凍時間為8小時。觀測到小瓶中之溶液在-20℃下儲存2至3小時後完全凍結，且在5℃下儲存6至7小時後完全解凍。對於研究之室溫、室內光照及高溫偏移組(第2組)，小瓶在25℃下避光儲存22天。第2組小瓶亦經歷自此25℃/黑暗儲存條件之兩次偏移：在25℃下在1,000勒克斯光照下72小時(3天)及在30℃下避光72小時(3天)。對於搖晃及振盪應力(第3組)，使小瓶自36吋高度掉落五次，且接著以最壞情況水平位置放置在120 rpm之迴轉式振盪器上24小時。在5℃及環境室溫(大約22℃)兩者下進行小瓶掉落及迴轉式振盪。藥品第4組(對照組)之樣品保持於5℃避光儲存。
在初始時間點測試各組樣品之溶液外觀、pH、蛋白質濃度、根據SE-HPLC之尺寸均一性及根據HIAC之不可目視微粒物質。此外，藉由iCIEF測定電荷變異體，藉由CE-SDS (R&NR)測定分子量分佈，且使用盤式比濁法測定酶活性。樣品在25℃加速條件下儲存3個月及6個月後再次進行測試。穩定性結果呈現於表47至表49中。
表 47 物理應力穩定性研究資料
應力條件 時間 (25 ℃ 下之月數 ) 外觀 溶液 pH 納武單抗濃度 (mg/mL) SE-HPLC
HMWS ( 面積 %) 單體 ( 面積 %) LMWS ( 面積 %)
第1組 (4 X F/T， -20℃至+5℃) 0 3 6 符合(a) 符合 符合 5.96 6.01 5.97 121 119 123 0.86 1.00 1.29 99.07 98.88 98.58 0.07 0.12 0.13
第2組 (25℃，30℃， RT/RL) 0 3 6 符合 符合 符合 5.93 5.99 5.92 119 120 121 1.06 1.15 1.45 98.86 98.71 98.42 0.08 0.13 0.13
第3組 (搖晃及振盪) 0 3 6 符合 符合 符合 5.94 5.98 5.93 119 118 121 0.87 1.00 1.30 99.06 98.90 98.56 0.08 0.10 0.13
第4組 (5℃/黑暗儲存對照) 0 3 6 符合 符合 符合 5.95 6.02 5.94 121 122 120 0.85 0.97 1.30 99.06 98.94 98.58 0.08 0.09 0.13
                       
a符合 = 透明至略微乳白色、無色至淺黃色溶液。
表 48 ： 物理應力穩定性研究資料
應力條件 時間 (25 ℃ 下之月數 ) iCIEF 酶活性 (U/mL)
酸基 ( 面積 %) 主峰 ( 面積 %) 鹼基 ( 面積 %)
第1組 4 X F/T，(-20℃至+5℃) 0 3 6 35.6 40.1 40.5 59.8 54.0 53.6 4.7 5.9 5.9 1,956 1,936 2,025
第2組 25℃，30℃， RT/RL 0 3 6 37.0 40.9 44.0 57.8 53.2 49.9 5.3 5.9 6.0 1,855 1,816 1,901
第3組 搖晃及振盪 0 3 6 35.6 39.4 41.3 59.8 55.0 52.8 4.6 5.6 5.9 1,940 1,936 1,959
第4組 5℃/黑暗儲存對照 0 3 6 35.6 39.0 41.3 59.8 55.1 52.8 4.6 5.9 6.0 1,903 1,952 1,917
表 49 ： 物理應力穩定性研究資料
應力條件 時間 (25 ℃ 下之月數 ) CE-SDS (R) 純度 ( 面積 %) CE-SDS (NR) 純度 ( 面積 %) 不可目視 微粒物質
粒子 / 毫升 ≥ 10 微米 粒子 / 毫升 ≥ 25 微米
第1組 4 X F/T， (-20℃至+5℃) 0 3 6 100.0 99.9 99.7 98.8 99.4 97.2 8 8 10 0 3 1
第2組 25℃，30℃， RT/RL 0 3 6 100.0 99.9 99.7 98.5 99.2 96.5 8 5 6 0 1 0
第3組 搖晃及振盪 0 3 6 100.0 99.9 99.8 98.8 99.3 96.8 3 7 4 1 0 0
第4組 5℃/黑暗儲存對照 0 3 6 100.0 99.9 99.8 98.6 99.3 96.8 17 6 14 3 0 2
在初始時間點，在所有四組中，溶液外觀、pH或納武單抗濃度均未觀測到變化。對於第1、3及4組之根據SE-HPLC之尺寸均一性、根據iCIEF之電荷變異體、根據CE-SDS (R&NR)之尺寸變異體及酶活性觀測到類似初始結果。第2組樣品(室溫、室內光照及30℃儲存)之HMWS含量比對照高0.21%且第2組樣品之酸性物種含量比對照高1.4%。所有樣品之根據HIAC之不可目視微粒物質均極低。在初始時間點，第2組樣品之酶活性比對照之酶活性低2.5%。
在25℃加速條件下儲存六個月之後，在所有四組中，溶液外觀、pH或納武單抗濃度均無變化。第1、3及4組之HMWS含量類似且第2組之HWWS含量比對照之HWWS含量高0.15%。所有四組之LMWS含量相同，均為0.13%。對於根據iCIEF之電荷變異體，第2組之酸性物種含量比對照之酸性物種含量高2.7%，且與第1組及第3組之對照類似。在六個月時間點處，所有四組之鹼性物種均在5.9%至6.0%範圍內。所有四組之分子尺寸變異體含量對於還原性CE-SDS在99.7%至99.8%範圍內，且對於非還原性CE-SDS在96.5%至97.2%範圍內。在六個月時間點處，所有樣品之根據HIAC之不可目視微粒物質計數均極低，無明顯趨勢，且所有組之酶活性經確定在對照之99.2%及105.6%內。 冷藏時間及室內光照時間
納武單抗SC注射液之推薦儲存條件為2-8℃，避光。基於自短期室溫/室內光照研究、rHuPH20在25-40℃下之短期穩定性及物理應力研究收集之資料，可確定藥品之冷藏時間及室內光照時間。短期RT/RL研究展示對室內光照的敏感性，rHuPH20研究展示酶對較高溫度的敏感性，且物理應力研究資料展示應力對品質屬性之影響與藥品製造、運輸或使用過程中可能發生的影響相比最小。基於此等研究之結果，可推薦成品藥品之冷藏時間/室內光照時間(TOR/TARL)。此TOR/TARL涵蓋開始於對小瓶施加密封且結束於開始準備向患者投與之時段，且包括灌裝後活動(小瓶處理、檢查、取樣、貼標籤、二次包裝及運輸準備)及運輸過程中之溫度偏移，直至開始準備用於患者投與之劑量。
納武單抗SC注射液之推薦儲存條件為2-8℃，避光。允許在至多25℃之溫度下自推薦的儲存條件偏移至多28天，包括在室溫及室內光照下儲存至多72小時，及在30℃下儲存至多72小時。 小瓶中藥品之凍結溫度
作為物理應力評估之一部分，進行了一項研究以確定當填充於6 cc玻璃小瓶中且在零下溫度下儲存相對較短時段時，納武單抗SC注射液凍結的溫度。將六小瓶3 mL/小瓶之納武單抗SC注射液置於溫控水浴中。將浴溫降至-8℃ (溫度用校準的熱電偶確認)且保持9小時。在9小時的時間點，檢查小瓶以確定小瓶中之溶液是否已凍結。接著將浴溫降至-10℃且再保持15小時。在-10℃下15小時後，再次檢查小瓶以確定小瓶中之溶液是否已凍結。接著將浴溫降至-12℃且保持9小時。在-12℃下儲存9小時後，所有6個小瓶均已凍結。
研究之結果呈現於下表中。在-8℃下9小時，接著在-10℃下15小時後，所有樣品仍處於溶液狀態。在-12℃下9小時後，所有六個小瓶均已凍結。因此，納武單抗SC注射液在填充至玻璃小瓶時之凍結溫度介於-12℃與-10℃之間，且當在低至-10℃之溫度下儲存至多15小時時，小瓶中之溶液不會凍結。
表 50 ： 冷凍溫度研究結果
浴溫及保持時段 保持步驟結束時凍結 (+) 或未凍結 (-)
小瓶 1 小瓶 2 小瓶 3 小瓶 4 小瓶 5 小瓶 6
-8.0℃持續9小時 - - - - - -
-10.0℃持續15小時 - - - - - -
-12.0℃持續9小時 + + + + + +
一般產品資訊
關於藥物物質及藥品之一些一般資訊提供如下。納武單抗藥物物質在≤ -35℃下避光儲存於12 L FFTp袋中。藥品之儲存條件為2-8℃，避光。藥物物質及藥品之組成列於表51中，藥物物質、藥品及稀釋緩衝液之所選特性呈現於表52中。
表 51
描述 藥物物質 藥 品 60 mg/ 小瓶及 600 mg/ 小瓶
納武單抗 (BMS-986298) 目標150 mg/mL (135 -180 mg/mL) 120 mg/mL
組胺酸/組胺酸HCl單水合物 20 mM b 20 mM b
蔗糖 250 mM 250 mM
聚山梨醇酯80 0.05 % w/v 0.05 % w/v
噴替酸 50 µM 50 µM
甲硫胺酸 N/A a 5 mM
rHuPH20 N/A a 2,000 U/mL
氯化鈉 N/A b N/A b
目標pH 6.0 6.0
a將甲硫胺酸及rHuPH20添加至稀釋緩衝液中，接著將其添加至藥物物質中以產生藥品。 b氯化鈉及組胺酸存在於rHuPH20藥物物質中，但對最終組合物之貢獻無足輕重
表 52 ： 藥物物質、藥品及稀釋緩衝液之所選特性
特性 藥物物質 藥品 稀釋緩衝液
納武單抗濃度 150 mg/mL (135-180 mg/mL) 120 mg/mL (108-132 mg/mL) 0 mg/mL
溶液pH (在18-22℃下) 6.0 ± 0.5 6.0 ± 0.5 6.0 ± 0.5
密度(在15-25℃下) 1.078 g/mL 1.069 g/mL 1.033 g/mL
黏度 37 cP於5℃下，17 cP 20℃ 13 cP於5℃下，7 cP 20℃ 1.8 cP於5℃下，1.6 cP 20℃
表面張力(在22℃下) 46 mN/m 45 mN/m 42 mN/m
實例2 - 具有或不具有rHuPH20之皮下納武單抗
在一項正在進行的1/2期研究中，跨實體腫瘤(轉移性黑色素瘤、RCC、NSCLC、HCC及CRC)評估了對患者皮下(SC)投與具有或不具有玻尿酸酶rHuPH20之納武單抗單藥療法的PK、安全性、功效及耐受性，該等實體腫瘤中納武單抗在IV投與之後的PK、功效、安全性及免疫原性已得到充分表徵。其他實體腫瘤，其中IV納武單抗之PK得到充分表徵(允許胃食管交界處[GEJ]、胃癌(GC)、轉移性尿道上皮癌(mUC)及SCCHN)。
為部分A選擇之起始SC劑量為720 mg Q4W。根據部分A之初步PK及後續建模，此研究按計劃進行，部分B之第二劑量為960 mg Q4W。
對於部分A及B，表徵了單次劑量SC納武單抗(具有及不具有rHuPH20)之PK，接著為第4週之IV納武單抗480 mg Q4W。此等SC PK資料用於更新現有的IV PPK模型。接著使用組合SC/IV PPK模型選擇1200 mg Q4W之SC納武單抗給藥方案用於後續研究。
部分C及D將在部分C (大約45名患者)及部分D (大約36名患者)中SC投與1200 mg Q4W後提供額外的PK及安全性資料。部分C經設計以表徵在自IV轉換(自部分A及B過渡)之情況下連續給與SC納武單抗1200 mg Q4W的PK及研究安全性。部分D包括自治療啟動開始連續給與SC納武單抗1200 mg Q4W之PK及安全性。將進行中期分析，包括評估給藥前第2週期第1天PK及大約10名服用1200 mg劑量之個體的早期安全性。
部分A-D之主要目標為描述具有或不具有rHuPH20之SC納武單抗的PK，如藉由包括Cavgd28、Cmind28及Cmax1的多種量測所評估。
部分A-D研究之主要目標為描述在具有或不具有rHuPH20之情況下皮下投與之納武單抗的藥物動力學，且終點為Cmax、Tmax、AUC(TAU)及Ctau (部分A、B及D)及Ctau (部分C)。次要目標包括(i)評估SC納武單抗之安全概況；(ii)評估過敏性反應之廣泛標準化MedDRA查詢(SMQ)及所選AE過敏反應/輸注反應類別中的AE發生率；及(iii)評估納武單抗之免疫原性。次要終點包括(i) AE、SAE、導致停藥之AE、死亡及實驗室異常的發生率；(ii)研究藥物投與後2天內發生的過敏性反應廣泛SMQ中的AE發生率；(iii)研究藥物投與後2天內發生的過敏反應/輸注反應所選AE類別內的事件發生率；及(iv)若適用，抗納武單抗抗體及中和抗體之發生率。探索性目標包括(i)評估所有參與者中之初步功效；(ii)表徵免疫功能及腫瘤遺傳學及基因體學之生物標記量測；(iii)評估rHuPH20之免疫原性；及(iv)評估參與者對SC或IV投與納武單抗之初步體驗及偏好。探索性終點包括(i) ORR、PFS及OS；(ii)腫瘤特有之各種生物標記及分子相對於基線之變化(或變化%)的彙總量測；(iii)若適用，抗rHuPH20抗體及中和抗體之發生率；及(iv)患者體驗/偏好調查表及定性患者訪談。
結果
三十二名個體已用與rHuPH20共投與之經由SC注射投與之單次劑量納武單抗(720 mg或960 mg)，接著用IV納武單抗治療。在部分B (第3組)中之所有個體完成1個SC納武單抗週期後進行中期分析。分析了部分A-第1組(720 mg+rHuPH20)中之22名個體及部分B-第3組(960 mg+rHuPH20)中之10名個體的PK及早期安全性資料。由於隨訪時間短，在鎖定時未獲得正式的功效輸出。
截至DBL (所有部分B第3組之最小給藥前第2週期第1天)，部分A-第1組(N=22)之中值隨訪時間為4.4個月(範圍：2.4-8.8個月)且在部分B-第3組(N=10)中為2.5個月(範圍：2.1-3.5個月)。
研究參與者之基線疾病特徵展示於表53中。有14名男性及18名女性。所有患者之中值(範圍)年齡為66.5 (48-90)歲。32名個體代表不同的患者群體，包括在晚期/轉移性情況下具有一系列年齡、體重及腫瘤(NSCLC、CRC、RCC、HCC、黑色素瘤及SCCHN)的個體。 表 53A ：基線特徵
   個體數目(%)
部分A - GRP 1 N = 22 部分B - GRP 3 N = 10 總N = 32
腫瘤類型         
大腸直腸癌 6 ( 27.3) 3 ( 30.0) 9 ( 28.1)
肝細胞癌 2 ( 9.1) 0 2 ( 6.3)
黑色素瘤 2 ( 9.1) 0 2 ( 6.3)
非小細胞肺癌 7 ( 31.8) 3 ( 30.0) 10 ( 31.3)
腎細胞癌 5 ( 22.7) 3 ( 30.0) 8 ( 25.0)
未報導* 0 1 ( 10.0) 1 ( 3.1)
在基線時可量化PD-L1之個體(N(%)) 18 ( 81.8) 3 ( 30.0) 21 ( 65.6)
基線PD-L1表現＞=1%之個體 9 ( 50.0) 3 (100.0) 12 ( 57.1)
基線PD-L1表現＜1%之個體 9 ( 50.0) 0 9 ( 42.9)
基線PD-L1表現＞=5%之個體 7 ( 38.9) 2 ( 66.7) 9 ( 42.9)
基線PD-L1表現＜ 5%之個體 11 ( 61.1) 1 ( 33.3) 12 ( 57.1)
基線PD-L1表現＞=50%之個體 3 ( 16.7) 0 3 ( 14.3)
基線PD-L1表現＜50%之個體 15 ( 83.3) 3 (100.0) 18 ( 85.7)
先前療法方案         
0 2 ( 9.1) 2 ( 20.0) 4 ( 12.5)
1 0 0 0
2 13 ( 59.1) 4 ( 40.0) 17 ( 53.1)
＞=3 5 ( 22.7) 4 ( 40.0) 9 ( 28.1)
未報導 2 ( 9.1) 0 2 ( 6.3)
機能狀態(ECOG) [%]         
0 9 ( 40.9) 3 ( 30.0) 12 ( 37.5)
1 13 ( 59.1) 7 ( 70.0) 20 ( 62.5)
預先安全性資料
第1組(720 mg+rHuPH20 SC劑量繼之以IV)：在10名(45.5%)個體中報告了任何級別之治療相關AE (TRAE)，且為納武單抗IV計劃中通常已知的AE (表54B)。3名(14%)個體報告了SC注射部位處的低度紅斑、刺激及腫脹。
第3組(960 mg+rHuPH20 SC劑量繼之以IV)：在3名(30%)個體中報告了任何級別之TRAE，其中包括1-2級免疫介導之皮疹、網狀青斑及局部部位反應。2名(20%)個體報告了皮下注射部位處的低度紅斑、搔癢及腫脹。在DBL時，第3組中未報告治療相關SAE (TRSAE)。
接受SC納武單抗720 mg+rHuPH20 (第1組)及960 mg SC+rHuPH20 (第3組)之個體的早期安全性分析係描述性的(且不旨在用於跨組比較)。除SC局部反應之外，單次劑量SC納武單抗繼之以IV (第2+週期)之臨床安全概況亦反映先前在納武單抗IV IB中報告之治療相關AE及SAE。對於SC注射之局部AE，不存在意外的局部部位反應，且所有報告的事件均為低級別且可控的。第1組及第3組中之所有32名個體分別以6 mL或8 mL之單次手動注射投與第1週期第1天SC納武單抗(720 mg或960 mg)+rHuPH20劑量。
在研究中由於進行性疾病發生了兩例死亡(均未歸因於研究藥物)。
AE、TRAE及TRSAE之概述分別提供於表2A-2C中。
表54A：                     不良事件概述-所有經治療個體，第1組及第3組-中期分析
   部分A - GRP 1，N = 22 部分B - GRP 3，N = 10
任何級別(%) 3-4級(%) 5級(%) 任何級別(%) 3-4級(%) 5級(%)
任何AE 21 (95.5) 4 (18.2) 2 (9.1)a 10 (100) 2 (20) 0
藥物相關AE 10 (45.5) 1 (4.5) 0 3 (30) 0 0
導致DC之藥物相關AE 1 (4.5) 1 (4.5) 0 0 0 0
SAE 5 (22.7) 5 (22.7) 2 (9.1)a 3 (30) 3 (30) 0
藥物相關SAE 1 (4.5) 1 (4.5) 0 0 0 0
a5級：因惡性贅瘤進展而死亡，50歲男性，RCC伴肺轉移；因惡性贅瘤進展而死亡，76歲男性，CRC 表 54B ：按最差CTC等級之藥物相關不良事件概述-所有經治療個體，第1組及第3組-中期分析
系統器官類別(%)優先項(%) 部分A - GRP 1 N = 22 部分B - GRP 3 N = 10
任何級別 3-4級 5級 任何級別 3-4級 5級
具有事件之總個體 10 ( 45.5) 1 ( 4.5) 0 3 ( 30.0) 0 0
一般病症及投與部位病況 4 ( 18.2) 0 0 2 ( 20.0) 0 0
疲勞 2 ( 9.1) 0 0 0 0 0
注射部位紅斑 2 ( 9.1) 0 0 1 ( 10.0) 0 0
投與部位紅斑 0 0 0 1 ( 10.0) 0 0
注射部位刺激 1 ( 4.5) 0 0 0 0 0
注射部位搔癢 0 0 0 1 ( 10.0) 0 0
注射部位腫脹 1 ( 4.5) 0 0 1 ( 10.0) 0 0
肌肉骨胳及結締組織病症 3 ( 13.6) 0 0 0 0 0
關節痛 2 ( 9.1) 0 0 0 0 0
關節炎 1 ( 4.5) 0 0 0 0 0
牛皮癬性關節病 1 ( 4.5) 0 0 3 0 0
內分泌失調 2 ( 9.1) 0 0 0 0 0
甲狀腺高能症 2 ( 9.1) 0 0 0 0 0
皮膚及皮下組織病症 2 ( 9.1) 0 0 2 ( 20.0) 0 0
搔癢 2 ( 9.1) 0 0 0 0 0
青斑 0 0 0 1 ( 10.0) 0 0
黃斑疹 0 0 0 1 ( 10.0) 0 0
心臟病症 1 ( 4.5) 1 ( 4.5) 0 0 0 0
充血性心臟衰竭 1 ( 4.5) 1 ( 4.5) 0 0 0 0
腸胃疾病 1 ( 4.5) 0 0 0 0 0
腹瀉 1 ( 4.5) 0 0 0 0 0
損傷、中毒及手術併發症 1 ( 4.5) 0 0 0 0 0
輸注相關反應 1 ( 4.5) 0 0 0 0 0
腎及泌尿病症 1 ( 4.5) 1 ( 4.5) 0 0 0 0
小管間質性腎炎 1 ( 4.5) 1 ( 4.5) 0 0 0 0
表 54C ：藥物相關嚴重不良事件概述-所有經治療個體，第1組及第3組-中期分析
系統器官類別(%)優先項(%) 部分A - GRP 1 N = 22 部分B - GRP 3 N = 10
任何級別 3-4級 5級 任何級別 3-4級 5級
具有事件之總個體 1 ( 4.5) 1 ( 4.5) 0 0 0 0
心臟病症 1 ( 4.5) 1 ( 4.5) 0 0 0 0
充血性心臟衰竭 1 ( 4.5) 1 ( 4.5) 0 0 0 0
腎及泌尿病症 1 ( 4.5) 1 ( 4.5) 0 0 0 0
腎炎 1 ( 4.5) 1 ( 4.5) 0 0 0 0
對組合納武單抗 SC / IV 資料之群體藥物動力學分析
使用群體藥物動力學(PPK)建模及模擬方法來表徵SC納武單抗PK及優化SC納武單抗之劑量選擇。此基於建模之分析之目標為建立PPK模型，該模型描述當藉由SC及IV投與途徑投與時的納武單抗濃度資料。正在進行的試驗部分A及B之第一劑量SC投與後的納武單抗濃度資料可自29名個體獲得，跨越2個劑量，包括720 mg SC納武單抗+ rHuPH20(部分A-第1組)及960 mg SC納武單抗+ rHuPH20(部分B-第3組)。將此等資料與現有IV濃度資料合併，以便為納武單抗開發組合SC/IV PPK模型。將血管外吸收組分添加至現有的已建立IV PPK模型中，且隨後估計適當吸收參數，包括BA (F1)及吸收速率常數(ka)。來自組合SC/IV模型之PK參數估計值概述於表55中。
表55：                        來自納武單抗之組合SC/IV PPK模型之PK參數估計值
參數 a,b [ 單位 ] 估計值 c 標準誤差 (RSE%) d 95% 信賴區間 e,BS
固定效應         
CL [L/h] 0.0109 3.17E-04 (2.90) 0.0105 - 0.0114
VC [L] 4.26 0.0398 (0.936) 4.19 - 4.32
Q [L/h] 0.0335 0.00203 (6.07) 0.0305 - 0.0377
VP [L] 2.61 0.0831 (3.18) 2.46 - 2.73
CL BBWT 0.588 0.0315 (5.36) 0.532 - 0.639
CL GFR 0.147 0.0230 (15.6) 0.111 - 0.184
CL SEX -0.163 0.0161 (9.83) -0.191 - -0.137
CL PS 0.165 0.0137 (8.32) 0.141 - 0.187
CL OTH 0.0243 0.0184 (76.0) -0.005 - 0.0537
VC BBWT 0.628 0.0358 (5.70) 0.570- 0.685
VC SEX -0.136 0.0180 (13.2) -0.167 - -0.107
CL GC 0.185 0.0489 (26.5) 0.101 - 0.267
CL EMAX -0.316 0.0321 (10.2) -0.377 - -0.275
CL T50 1.40E+03 73.7 (5.27) 1.27E+03 - 1.52E+03
CL HILL 2.78 0.512 (18.4) 2.06 - 3.78
CL RAAA 0.0573 0.0396 (69.1) -0.0066 - 0.122
CL RAAS -0.0766 0.0258 (33.7) -0.121 - -0.0356
CL CHL -0.321 0.0272 (8.47) -0.366 - -0.275
KA 0.0127 0.00121 (9.52) 0.0108 - 0.0151
F1 0.676 0.0430 (6.36) 0.60 - 0.75
隨機效應         
ω2CL[-] 0.112 (0.335) 0.00560 (5.00) 0.102 - 0.120
ω2VC[-] 0.127 (0.356) 0.0138 (10.9) 0.102- 0.150
ω2VP[-] 0.231 (0.480) 0.0245 (10.6) 0.194 - 0.282
ω2EMAX[h] 0.0504 (0.224) 0.00893 (17.7) 0.0379 - 0.0664
ω2KA 0.172 (0.414) 0.0634 (36.9) 0.070 - 0.262
ω2F1 0.625 (0.791) 0.239 (38.2) 0.230 - 1.046
ω2CL: ω2VC 0.0354 (0.297) 0.00347 (9.80) 0.0294 - 0.0419
ω2KA:F1 0.253 (0.773) 0.0684 (27.0) 0.127 - 0.360
殘餘誤差         
比例誤差 ƒ 0.205 0.00512 (2.50) 0.196 - 0.213
a 具有固定值(未估計)之參數在名稱後用上標『ƒ』表示，固定值在估計值欄中給出。b 含有冒號(:)之隨機效應及殘餘誤差參數名稱表示相關參數。c 隨機效應及殘餘誤差參數估計顯示為對角線元素(ωi,i或σi,i)之方差(標準偏差)及非對角線元素(ωi,i或σi,i)之協方差(相關性)。d  RSE%為相對標準誤差(估計值百分比形式之標準誤差)。e 隨機效應及殘餘誤差參數之信賴區間用於方差或協方差。BS 信賴區間值獲自引導計算(總共1000個中有934個成功)。
結構PK模型由2個隔室組成：用於IV投與之零級吸收及用於SC投與之一級吸收。模型確定之納武單抗BA為67%，具有高精度(95% CI：60%-75%)。採用PPK建模及模擬方法來表徵SC納武單抗PK及優化SC納武單抗之劑量選擇。此基於建模之分析之目標為建立PPK模型，該模型描述當藉由SC及IV投與途徑投與時的納武單抗濃度資料。正在進行的試驗(部分A及B)之第一劑量SC投與後的納武單抗濃度資料可自29名個體獲得，跨越2個劑量，包括720 mg SC納武單抗+ rHuPH20(部分A-第1組)及960 mg SC納武單抗+ rHuPH20(部分B-第3組)。將此等SC資料與現有IV濃度資料合併，以便為納武單抗開發組合SC/IV PPK模型。將血管外吸收組分添加至現有的已建立IV PPK模型中，且隨後估計適當吸收參數，包括BA (F1)及吸收速率常數(ka)。來自組合SC/IV模型之PK參數估計值概述於表55中。
結構PK模型由2個隔室組成：用於IV投與之零級吸收及用於SC投與之一級吸收。模型確定之納武單抗BA為67%，具有高精度(95% CI：60%-75%)。採用PPK建模及模擬方法來表徵SC納武單抗PK及優化SC納武單抗之劑量選擇。此基於建模之分析之目標為建立PPK模型，該模型描述當藉由SC及IV投與途徑投與時的納武單抗濃度資料。正在進行的CA2098KX (部分A及B)之第一劑量SC投與後的納武單抗濃度資料可自29名個體獲得，跨越2個劑量，包括720 mg SC納武單抗+ rHuPH20(部分A-第1組)及960 mg SC納武單抗+ rHuPH20(部分B-第3組)。將此等資料與現有IV濃度資料合併，以便為納武單抗開發組合SC/IV PPK模型。將血管外吸收組分添加至現有的已建立IV PPK模型中，且隨後估計適當吸收參數，包括BA (F1)及吸收速率常數(ka)。來自組合SC/IV模型之PK參數估計值概述於表55中。
結構PK模型由2個隔室組成：用於IV投與之零級吸收及用於SC投與之一級吸收。模型確定之納武單抗BA為67%，具有高精度(95% CI：60%-75%)。
組合SC/IV PPK模型經歷內部驗證練習，以確保該模型能夠預測SC投與後觀測到的濃度值。視覺預測檢查(圖4)表明組合SC/IV模型充分捕獲且描述觀測到的SC納武單抗濃度資料。
使用上述模型，進行確定性模擬以生成用CA2098KX中可用之PK資料治療之個體的暴露量度。表56中提供了按劑量之暴露量度的概述。 表 56 ：經治療個體按劑量之預測暴露的概述
劑量SC Q4W Cavgd28 (ug/ml) 幾何平均值(%CV) Cmind28 (ug/ml) 幾何平均值(%CV) Cmax1 (ug/ml) 幾何平均值n(%CV) Tmax1 (小時) 平均值(SD)
720 mg (N=22) 36.9 (44.2) 22 (56.8) 51.3 (24.7) 141 (63.8)
960 mg (N=9) 61.8 (27.2) 40.6 (24.3) 83.5 (31.3) 136 (48)
縮寫：Cavgd28=第28天之平均濃度；Cmax1=第一劑量之後的最大濃度；Cmind28=第28天之最小濃度；CV=變異係數；GeoMean=幾何平均值；Q4W=每4週；SC=皮下；SD=標準差；Tmax1=第一劑量後達到最大血漿濃度之時間。
RCC 個體之單組擴增群組
該試驗將被擴展以包括具有晚期/轉移性RCC之單組、單腫瘤、擴展群組(部分E) (圖3)。部分E之主要目標為藉由比較模型預測之SC及IV暴露來證明SC納武單抗1200 mg + rHuPH20 (共調配物) Q4W相對於IV給藥(3 mg/kg Q2W)之PK非劣效性。非劣效性定義為幾何平均比率至少為0.8之雙側90% CI的下限，用於量測暴露(並列主要終點：Cavgd28；Cmind28)。Cavgd28及Cmind28非劣效性之論證將確保SC納武單抗Q4W之功效將維持在與IV納武單抗3 mg/kg Q2W相當的水準。
部分E之次要目標為(i)評估與rHuPH20共調配之SC納武單抗的PK；(ii)評估與rHuPH20共調配之SC納武單抗的安全性；(iii)評估納武單抗之免疫原性；及(iv)評估研究者評定之反應。次要終點包括(i) Cmax1、AUC(TAU)、Cavg(ss)及Cmin(ss)；(ii) AE、SAE、導致停藥之AE、死亡及實驗室異常的發生率；(iii)若適用，抗納武單抗抗體及中和抗體之發生率；及(iv) ORR。探索性目標包括(i)探索所有參與者中之功效；(ii)探索免疫功能及腫瘤遺傳學及基因體學之生物標記量度；(iii)探索rHuPH20之免疫原性；及(iv)探索SC納武單抗之參與者體驗。探索性終點包括(i) PFS、OS、反應時間及反應持續時間；(ii)腫瘤/血液之不同生物標記及分子特徵相對於基線的變化；(iii)若適用，抗rHuPH20抗體及中和抗體的發生率；及(iv)患者體驗/偏好調查表及定性患者訪談。
選擇RCC作為部分E之腫瘤類型得到廣泛的歷史PK資料以及腫瘤類型中IV納武單抗之完善PPK及E-R模型的支持。在1 mg/kg至10 mg/kg之劑量範圍內，RCC中之功效及安全性之納武單抗E-R曲線平坦(資料未示出)。鑒於在廣泛的測試劑量範圍內RCC及黑色素瘤中已確立的平坦E-R關係，部分E中SC納武單抗之益處/風險評估可合理地支持外推至IV納武單抗已被證實安全且有效之所有腫瘤類型。選擇3 mg/kg IV Q2W作為虛擬IV治療組係基於：關於3 mg/kg IV Q2W之暴露、功效及安全性的穩健資料。大多數研究，包括針對所有已批准適應症之關鍵研究評估了3 mg/kg IV Q2W劑量之納武單抗。因此，此劑量可獲得充分表徵的功效、安全性及PK概況。跨越3 mg/kg IV Q2W方案之RCC及黑色素瘤中公認的E-R展示暴露與安全性/功效無顯著關聯。SC劑量相對於3 mg/kg Q2W IV劑量之PK非劣效性的論證足以得出SC納武單抗之益處-風險特徵在晚期/轉移性RCC中與IV納武單抗相當的結論，且出於以下原因外推至其他腫瘤類型：
3 mg/kg IV Q2W之功效已在跨腫瘤類型進行之劑量範圍及關鍵研究中得到證實。因此，若使用1200 mg Q4W之SC給藥方案達成類似或更大的Cavgd28及Cmind28，則預期SC納武單抗之安全性及功效概況將與IV納武單抗相當。
納入 / 排除標準 / 患者特徵
關鍵的納入標準包括：(i)未接受過PD-L1治療；(ii)具有透明細胞成分之RCC之組織學證實(必須在晚期或轉移性環境中接受至少1個且不超過2個先前的全身治療方案，且必須在接受最後一個治療方案之時或之後以及在研究入組前6個月內有進展的證據)；(iii) 研究開始時，個體需要福馬林固定、石蠟包埋的腫瘤組織塊或未染色的腫瘤樣品(存檔或近期)載玻片用於生物標記評估；(iv)男性及女性參與者在知情同意時的年齡必須≥12歲；(v)必須藉由免疫組織化學(IHC)評估參與者之腫瘤PD-L1表現；(vi)根據實體腫瘤反應評估標準(RECIST) 1.1版標準之可量測疾病；(vii)參與者之ECOG機能狀態必須為0或1；以及(viii)所有參與者必須有能力遵守治療、患者報告的結果、PK、藥效學樣品收集及研究隨訪要求。
關鍵的排除標準包括(i)在隨機分組/治療前2週內接受過植物製劑(例如草藥補充劑或中藥)治療以治療所研究疾病；(ii)患有活動性自體免疫疾病或任何其他需要在隨機分組後14天內用皮質類固醇(＞ 10 mg每日普賴松等效物)治療或在隨機分組後30天內用其他免疫抑制藥物治療之病狀的參與者(在無活動性自體免疫疾病存在下，允許吸入或局部類固醇，及＞10 mg每日普賴松等效物的腎上腺替代類固醇劑量)；(iii)患有I型糖尿病、僅需要激素替代之甲狀腺功能低下、不需要全身治療之皮膚病症(諸如白斑病、牛皮癬或禿頭症)或在無外部觸發存在下預期不會復發之病狀的參與者將允許入組；(iv) 未經治療之症狀性中樞神經系統(CNS)轉移(若CNS轉移無症狀且不需要立即治療，或已接受治療且患者之神經功能已恢復至基線(與CNS治療相關之殘留病徵或症狀除外)，則患者符合條件)；此外，患者必須在入組前至少2週停止使用皮質類固醇，或每日服用≤ 10 mg普賴松(或等效物)之穩定或遞減劑量)；(v) 患有已知人類免疫缺陷病毒(HIV)，在過去一年內患有定義為機會性感染之後天免疫缺乏症候群(AIDS)或當前分化簇4 (CD4)計數＜ 350個細胞/μL的患者；(vi)基於基線實驗室評估的器官功能不足；(vii)併發惡性腫瘤需要治療之患者(若在註冊前至少2年完成治療且患者無疾病證據，則患有先前經過治療之惡性腫瘤的患者符合條件；以及併發惡性腫瘤臨床穩定且不需要針對腫瘤之治療的患者亦符合條件)；(viii)患有嚴重或不受控醫學病症之患者；(ix) HBV病毒負荷超過定量極限之慢性B型肝炎病毒(HBV)感染的血清學證據。患有慢性HBV感染之參與者必須同時接受病毒抑制療法；(x)當前C型肝炎病毒(HCV)感染且HCV病毒負荷超過定量極限之血清學證據；(xi)在首次治療後30天內已接種活疫苗/減毒疫苗之參與者；(xii)對研究藥物成分過敏或過敏反應史；及(xiii)先前用抗PD-1、抗PD-L1、抗細胞毒性T淋巴球相關抗原4 (CTLA-4)抗體或任何其他特異性靶向T細胞共刺激或檢查點途徑之抗體或藥物治療。
SC 劑量選擇之基本原理
PPK建模及模擬方法用於SC納武單抗之劑量選擇。在與rHuPH20共投與之2個劑量(720 mg及960 mg)上收集來自部分A及B之第一劑量SC投與後的納武單抗濃度資料。將此等資料與現有IV濃度資料合併，以便為納武單抗開發組合SC及IV PPK模型。將血管外吸收組分添加至現有的已建立IV PPK模型中，且隨後估計適當吸收參數，包括BA及ka。使用此組合SC/IV PPK模型進行模擬，以預測在體重範圍內投與一系列劑量後的全身暴露。在考慮所測試BA中之潛在不確定性的各種情況下，確定SC納武單抗1200 mg Q4W方案將引發與IV納武單抗3 mg/kg Q2W相當的益處風險概況。此係基於以下基本原理：此給藥方案能夠遞送Cavgd28及Cmin28暴露量，該等暴露量類似於或大於與IV納武單抗3 mg/kg Q2W相關的暴露量，同時保持所有體重之所有暴露量測值低於與IV納武單抗10 mg/kg Q2W相關的暴露量測值。此外，在考慮之最保守情境下之臨床試驗模擬(低生物可用性，在體重傾向於較高之RCC群體中)表明SC納武單抗1200 mg Q4W在SC相對於IV試驗中達成非劣效性標準之概率相對高於960 mg Q4W 。
關於1200 mg SC劑量之預期安全概況，所預測暴露量預期不會超過納武單抗10 mg/kg Q2W IV產生之暴露量，該劑量之安全性已得到充分表徵且顯示為類似於3 mg/kg Q2W IV。鑒於3 mg/kg與10 mg/kg Q2W IV之IV暴露之間的AE發生率無臨床上有意義的差異，1200 mg + rHuPH20 Q4W SC為適當劑量，其將提供等於或大於3 mg/kg Q2W IV的暴露量且在由10 mg/kg Q2W IV產生之暴露量內。此將作為正在進行的修訂的一部分進行評估，以表徵1200 mg SC劑量(部分C及D)之實際PK，且將在部分E開始之前審查初步結果。
對來自組A將組B患者之確定性模擬的暴露量進行進一步比較，以確定SC納武單抗1200 mg Q4W相對於3 mg/kg Q2W的暴露是否存在基於腫瘤類型之任何差異。此等模擬考慮了吸收、生物可用性、全身PK參數及個體共變數資訊之個體參數。在此研究中收集之腫瘤類型中，所有暴露量量測之幾何平均比(GMR)均無明顯趨勢或差異。所有GMR均等於或大於1，表明腫瘤類型不太可能影響對非劣效暴露量的解釋，且體重將繼續為SC 1200 Q4W及3 mg/kg Q2W IV給藥之暴露量差異的主要因素(圖5A-5C)。 實例3 - 具有或不具有rHuPH20之皮下納武單抗
為支持皮下(SC)納武單抗投與之臨床研究，在食蟹獼猴中進行了非臨床研究，以評估當作為具有及不具有rHuPH20之SC調配物投與兩次(間隔3週)時對納武單抗之局部耐受性及全身暴露量。SC納武單抗以154.57 mg/mL提供，且藉由SC注射以0 mg/kg (媒劑)、50 mg/kg (無rHuPH20)或50 mg/kg (具有rHuPH20，2000 U/mL)之劑量向每個性別3隻猴子的組投與兩次(第1天及第22/20天[雄性/雌性])。所有劑量均在由20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05%聚山梨醇酯-80及50 μM噴替酸(組胺酸緩衝液)組成之媒劑/載劑中以0.5 mL/kg投與。在第1天給藥後收集用於毒理動力學分析之樣品，且在第22/21天(男性/女性)給藥後72小時進行預定的屍體剖檢。
具有rHuPH20之50 mg/kg平均納武單抗全身暴露量(AUC[0-T])通常與不具有rHuPH20之彼等暴露量類似(表57)。在具有或不具有rHuPH20之情況下，達到最大血漿濃度之平均時間(Tmax)分別為給藥後32小時或68小時。此等結果表明，儘管與rHuPH20共投與之Tmax較早，但在此非臨床研究中，rHuPH20對整體納武單抗全身暴露量無實質性影響。
表57：                        毒理動力學概述-平均性別組合值
參數 所有猴子/排除具有可偵測治療出現的抗納武單抗抗體之猴子a
   納武單抗50 mg/kg (不具有rHuPH20) 納武單抗50 mg/kg (具有rHuPH20)
AUC(0-T) (μg•h/mL) 187,000/166,000 184,000/182,000
Cmax (μg/mL) 537/454 647/647
Tmax (h) 68/60 32/24
縮寫：AUC=濃度-時間曲線下面積；Cmax=最大濃度；Tmax=達到最大血漿濃度之時間。 a計算所有/排除具有可偵測治療出現的抗納武單抗抗體之猴子的值。
在具有或不具有rHuPH20之6隻猴子中之1者中偵測到治療出現的納武單抗抗藥物抗體(ADA)。然而，一般而言，治療出現的ADA對納武單抗暴露量無實質性影響。
在此非臨床研究中，以50 mg/kg投與的具有及不具有rHuPH20(2000 U/mL)之納武單抗耐受性良好，在SC注射部位無臨床觀測及局部耐受性問題，且納武單抗暴露量在存在或不存在rHuPH20之情況下不存在有意義的差異。 實例3 -皮下納武單抗與重組人類玻尿酸酶之組合用於先前治療之晚期、復發性或轉移性非小細胞肺癌
將進行一項3期研究，以評估向患有先前治療之晚期、復發性或轉移性非小細胞肺癌(NSCLC)的參與者投與與重組人類PH20 (rHuPH20)共調配之皮下(SC)納武單抗相對於靜脈內(IV)納武單抗。此研究旨在確立每4週(Q4W)SC投與之與20,000單位rHuPH20共調配之1200 mg納武單抗與每2週(Q2W) IV投與之3 mg/kg納武單抗相比的藥物動力學(PK)及功效非劣效性。在整個方案中，納武單抗與rHuPH20之共調配物將被稱為SC納武單抗，且納武單抗之IV調配物將被稱為IV納武單抗。
患有組織學證實的IIIB/IIIC/IV期NSCLC (鱗狀或非鱗狀)之18歲或以上(或當地成年年齡)的男性或女性在針對晚期或轉移性疾病之1次先前全身療法期間或之後經歷了疾病復發或進展。目標及終點呈現於表58中。 表 58 ：目標及終點
目標 終點
協同主要
●      為證明SC納武單抗1200 mg Q4W相對於IV納武單抗3 mg/kg Q2W之PK非劣效性。 ●      Cmind28
●      為證明SC納武單抗1200 mg Q4W相對於IV納武單抗3 mg/kg Q2W之ORR非劣效性。 ●      根據BICR之ORR，至少6個月的隨訪
次要
●      為評估SC納武單抗1200 mg Q4W及IV納武單抗3 mg/kg Q2W之PK。 ●      Cavgd28、Cmax1、Tmax、Cminss、Cavgss
●      為評估SC納武單抗1200 mg Q4W及IV納武單抗3 mg/kg Q2W之功效。 1)     根據BICR之ORR，至少12個月的隨訪及研究結束時 2)     根據BICR之DCR，至少6及12個月的隨訪及研究結束時 3)     PFS，至少6及12個月的隨訪及研究結束時 4)     OS，至少6及12個月的隨訪及研究結束時 5)     DoR，至少6及12個月的隨訪及研究結束時 6)     TTR，至少6及12個月的隨訪及研究結束時
●      為評估SC納武單抗及IV納武單抗之安全概況。 7)     AE、SAE、導致停藥之AE、死亡及實驗室異常的發生率
●      為評估過敏性反應之廣泛標準化MedDRA查詢(SMQ)、SC納武單抗組及IV納武單抗組中之AE ●      過敏、過敏反應及全身輸注反應之發生率。 ●      研究藥物投與後2天內發生注射及局部輸注部位反應之發生率
●      為評估SC納武單抗及IV納武單抗之免疫原性 ●      若適用，產生抗納武單抗抗體及中和抗體之參與者的百分比
探索性
●      為探索SC納武單抗及IV納武單抗臨床活性之轉譯生物標記 ●      腫瘤炎症之瘤內標記相對於基線之變化(或變化%)的彙總量測 ●      免疫活化周邊標記相對於基線之變化(或變化%)的彙總量測 ●      兩個治療組中瘤內及周邊生物標記之基線水準的彙總量測，以鑑定潛在不平衡
●      為探究rHuPH20之免疫原性 ●      若適用，產生抗rHuPH20抗體及中和抗體之參與者百分比以及抗rHuPH20抗體對AE、投與相關反應及MedDRA SMQ過敏性反應事件的影響
●      為探索SC納武單抗及IV納武單抗之免疫原性的影響 ●      若適用，產生抗納武單抗抗體及中和抗體之參與者百分比，抗納武單抗抗體對AE、投與相關反應及MedDRA SMQ過敏性反應事件的影響
●      為探索參與者對SC納武單抗之體驗及偏好 ●      偏好SC之參與者百分比及偏好經由PEPQ進行IV治療之參與者百分比(僅組A，SC納武單抗)
●      為探索IV及SC組之疾病相關症狀的變化及對健康相關生活品質的影響 ●      基線平均NSCLC-SAQ評分及基線後評分變化
●      為探索IV及SC組之健康狀況及健康相關生活品質的變化 ●      平均EQ-5D-5L效用及視覺類比量表評分及基線後評分變化
縮寫：AE=不良事件；BICR=盲法獨立中央審查；CminD28=28天內之最低血清濃度；Cavgd28=第28天之平均血清濃度；Cmax1=第一劑量後的最大血清濃度；Cminss=穩態谷值濃度；Cavgss=穩態平均血清濃度；DCR=疾病控制率；DoR=反應持續時間；IV=靜脈內；MedDRA=監管活動醫學詞典；ORR=客觀反應率；OS=總存活期；PFS=無進展存活期；PK=藥物動力學；Q2W=每2週；Q4W=每4週；rHuPH20=重組人類玻尿酸酶PH20；SAE=嚴重不良事件；SC=皮下；SMQ=標準化MedDRA查詢；Tmax=達到Cmax1之時間；TTR=反應時間。
總體設計
本研究為一項多中心、隨機、開放標記、3期研究，將評估SC納武單抗與IV納武單抗之PK及功效非劣效性以及SC納武單抗在晚期、復發性或轉移性NSCLC參與者中之安全性及耐受性。 ●  組A (n=257)：1200 mg納武單抗與20,000單位rHuPH20之SC納武單抗共調配物，Q4W±7天；及 ●  組B (n=257)：IV納武單抗3 mg/kg Q2W±3天(圖6)。
大約總共514名參與者將以1:1方式隨機分至以下治療組中：隨機分至治療組中將按照組織學(鱗狀相對於非鱗狀)、PD-L1評分(≥ 1%相對於＜ 1%相對於不確定)、體重(＜65 kg相對於65-90 kg相對於＞90 kg)及東部腫瘤協作組機能狀態ECOG-PS (0相對於1)進行分層(圖6)。ECOG PS必須在隨機分組之前14天內評定。此研究中之給藥將持續至根據實體腫瘤反應評估標準(RECIST) v.1.1之疾病進展、不可接受之毒性、撤回同意書、完成104週的治療、死亡或發起人終止研究，以先發生者為準。
在研究中，腫瘤評估應包括胸部對比增強CT、腹部、骨盆及所有其他已知及/或疑似疾病部位之CT/MRI，應自隨機分組開始每8週(±7天)進行一次，持續2年(104週)，接著每12週(±7天)進行一次，直至疾病進展及治療中止(包括超出進展之治療)，以較晚發生者為準。部分反應(PR)及完全反應(CR)必須在初始評估後至少4週進行評估及確認。腫瘤反應將使用RECIST 1.1評估。
將在組A之第1週期期間及組B之第1週期及第2週期期間收集系列血液樣品，接著在組A及組B之整個治療期內收集給藥前PK樣品，以表徵納武單抗之PK及免疫原性。
安全性監測將由在整個給藥時間間隔之選定時間進行的體格檢查、生命徵象量測及臨床實驗室評估組成。將在整個研究中密切監測參與者之AE。根據美國國家癌症研究所不良事件通用術語標準(NCI CTCAE) v.5標準收集AE及嚴重程度亦將包括SC投與後的局部注射部位反應及IV輸注相關反應。
劑量調整依據
來自參與該研究之參與者的PK資料，其中納武單抗(720 mg、960 mg及1200 mg) 在具有或不具有rHuPH20之情況下皮下投與，且使用若干腫瘤類型之歷史IV資料(來自大約3000名患者之資料)表徵皮下給藥時納武單抗之吸收概況。群體PK (PPK)分析估計第-1天之平均(90% CI)生物可用性為70% (66-74%)且一級吸收率為0.250 (90% CI：0.225-0.274)。所有其他PK參數及共變數對此等參數之影響與先前使用IV PPK模型估計的一致。模型估計之SC納武單抗1200 mg Q4W及IV納武單抗3 mg/kg Q2W暴露呈現於表59中。基於此等結果，與IV納武單抗3 mg/kg Q2W相比，預期1200 mg Q4W納武單抗之SC納武單抗劑量在所有體重範圍內提供類似或更高的暴露量。此外，以SC 1200 mg Q4W投與之納武單抗之幾何平均暴露量低於最高耐受IV劑量10 mg/kg Q2W之暴露量，且被視為安全的(圖7)。
表 59 ：SC納武單抗(具有rHUPH20)及IV納武單抗之模型估計暴露量
幾何平均值(% CV)
劑量 Cavgd28 (μg/mL) Cmind28 (μg/mL) Cmax1 (μg/mL)
1200 mg Q4W SC 65.50 (35.10) 40.40 (41.50 %) 93.00 (38.10 %)
3 mg/kg Q2W IV 40.20 (29.40%) 27.40 (35.20%) 57.80 (37.70%)
縮寫：Cavgd28=第28天之平均血清濃度；Cmax1=第一劑量後的最大血清濃度；Cmind28=第28天之最低血清濃度；CV=變異係數；IV=靜脈內；Q4W=每4週；Q2W=每2週；SC=皮下。
納入標準
參與者必須具有經組織學證實的NSCLC (鱗狀或非鱗狀)且存在IIIB/IIIC/IV期疾病(根據國際肺癌研究協會胸腫瘤分期手冊第8版)或在多模式治療(局部晚期疾病之放療、手術切除或根治性放化療)後出現疾病復發或進展(根據RECIST 1.1標準)。參與者必須在第一治療劑量之前28天內根據RECIST 1.1標準藉由CT或MRI具有可量測疾病。參與者必須在隨機分組後的14天內評估ECOG機能狀態為0或1。參與者必須在1次針對晚期或轉移性疾病之先前全身性療法期間或之後經歷疾病復發或進展。
基於鉑之雙重化學療法之後的維持療法不被視為單獨的治療方案。接受培美曲唑、貝伐單抗或埃羅替尼作為維持療法(基於鉑之雙重化學療法之非進展者)且進展之參與者符合條件。接受過輔助或新輔助鉑雙重化學療法(手術及/或放療後)且在完成治療後6個月內出現復發或轉移性疾病之參與者符合條件。在輔助或新輔助基於鉑之化學療法後＞ 6個月疾病復發，隨後在用於治療復發之鉑雙重方案期間或之後亦出現進展之參與者符合條件。
所有具有非鱗狀組織學之參與者均必須接受過EGFR突變狀態測試(包括但不限於外顯子19的缺失及外顯子21 [L858R]取代)；強烈鼓勵使用監管部門批准的測試。對敏感EGFR突變呈陽性之參與者在接受一種先前批准的EGFR抑制劑後應患有進行性疾病。具有已知ALK易位之非鱗狀組織學參與者在接受一種先前批准的ALK抑制劑後應患有進行性疾病。此研究不需要ALK突變測試。
強烈鼓勵在基線處具有症狀性腫瘤病變且可能需要在研究治療之第一劑量之4週內進行姑息性放療的參與者在入組前接受姑息性放療。姑息性放療應在第一劑量之前2週完成。若在該部位有記錄的(放射線照相)疾病進展(遵循RECIST 1.1標準)，則目標病變可位於先前照射過的區域中。
在進入研究時受到控制的患有慢性阻塞性肺病(COPD)之參與者符合條件。
福馬林固定之石蠟包埋(FFPE)腫瘤組織塊或至少20張未染色之腫瘤組織載玻片，該等腫瘤組織獲自芯針活檢、穿孔活檢、切除活檢或入組前的手術標本(入組後12週內)，在IRT中之採集時間與治療隨機分組之間無介入全身性抗癌療法。若儘管努力，仍無法獲得至少20張載玻片，則在與醫學監測者或指定人員討論後，在一些情況下提交較少載玻片可為可接受的。若在入組後12週內無法獲得腫瘤組織，則可提交存檔組織塊(入組後大約12個月內)，在IRT中之採集時間和治療隨機分組之間無介入全身性抗癌療法。不接受細針抽出物及其他細胞學樣品。IHC對腫瘤細胞PD-L1表現之評估必須由分析實驗室使用預處理組織樣品來進行。分析實驗室必須在隨機分組之前向IRT提供PD-L1結果。
排除標準
患有活動性自體免疫疾病或任何其他需要在隨機分組後14天內用皮質類固醇(＞ 10 mg每日普賴松等效物)治療或在隨機分組後30天內用其他免疫抑制藥物治療之病狀的參與者。在無活動性自體免疫疾病存在下，允許吸入或局部類固醇，及＞10 mg每日普賴松等效物的腎上腺替代類固醇劑量。已知人類免疫缺乏病毒(HIV)或已知後天免疫缺乏症候群(AIDS)測試呈陽性的病史。
患有I型糖尿病、僅需要激素替代之甲狀腺功能低下、不需要全身治療之皮膚病症(諸如白斑病、牛皮癬或禿頭症)或在無外部觸發存在下預期不會復發之病狀的參與者將允許入組。
患有未經治療之症狀性CNS轉移的參與者。若CNS轉移無症狀且不需要立即治療，或已接受治療且患者之神經功能已恢復至基線(與CNS治療相關之殘留病徵或症狀除外)，則參與者符合條件。此外，參與者必須在入組前至少2週停止使用皮質類固醇，或每日服用≤ 10 mg普賴松(或等效物)之穩定或遞減劑量。
患有需要治療之併發惡性腫瘤的參與者。若治療在隨機分組前至少2年完成且患者無疾病跡象，則患有先前經治療之惡性腫瘤的參與者符合條件。患有臨床穩定且不需要腫瘤定向治療之併發惡性腫瘤的患者亦符合條件。
患有有症狀或可能干擾疑似藥物相關肺毒性之偵測或管理之間質性肺病的參與者。
在隨機分組/治療前2週內接受過植物製劑(例如草藥補充劑或傳統中藥)治療以治療所研究疾病的參與者。在首次治療後30天內接種過活/減毒疫苗的參與者。先前接受過抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA 4抗體或任何其他特異性靶向T細胞共刺激或檢查點途徑之抗體或藥物治療的參與者。
基於基線實驗室評估之器官功能不足包括(i)白血球(WBC)＜2000/μL；(ii)嗜中性球＜ 1500/μL；(iii)血小板＜ 100×103/μL；(iv)血紅蛋白＜ 9.0 g/dL；(v)血清肌酐＞ 1.5×正常上限(ULN)，除非肌酐清除率≥ 40 mL/min (使用Cockroft-Gault公式量測或計算)；(vi)天冬胺酸轉胺酶(AST)/丙胺酸轉胺酶(ALT)：＞ 3.0×ULN；(vii)總膽紅素＞ 1.5×ULN(吉爾伯特症候群(Gilbert Syndrome)參與者除外，該等參與者之總膽紅素含量必須＜ 3.0×ULN)；(viii)任何表明存在病毒之HBV或HCV病毒陽性測試結果，例如B型肝炎表面抗原(HBsAg，澳大利亞抗原)陽性，或C型肝炎抗體(抗HCV)陽性(HCV-RNA陰性除外)。
皮下投與納武單抗與 rHuPH20 ( 組 A )
SC納武單抗應在各治療週期之第1天投與，每4週±7天一次，直至進展、不可接受之毒性、撤回同意書、完成104週(2年)的治療、死亡或研究結束，以先發生者為準。參與者應在隨機分組後3個日曆日內開始研究治療。
所允許之納武單抗將不存在劑量升級或降低。對於Q4W週期，參與者可在前一劑量後不少於25天給藥。不推薦對第一劑納武單抗進行前驅用藥。
根據參與者對治療之耐受程度，可中斷、延遲或終止納武單抗之劑量。未跳過給藥問診，僅將其延遲。
SC納武單抗將經由手動注射在第一週期內在腹部之一個象限中投與。對於後續週期，可選擇腹部四個象限之一及任一大腿，且注射部位應交替。SC投與應在大約3-5分鐘之時段內儘可能穩定地進行(亦即，無起始或停止，且以穩定速率)。在第1週期第1天及第2週期第1天SC手動注射SC納武單抗後，將對參與者進行大約360分鐘的監測。接受後續SC注射之參與者可在注射後進行大約30分鐘監測，如臨床需要且由研究者酌情決定。此外，將在各SC注射後大約24小時聯繫所有參與者，以報告任何注射部位反應。注射部位亦將在下次研究問診時進行評估。SC注射部位、持續時間及針頭類型必須記錄在電子病例報告表(eCRF)中。SC納武單抗劑量之製備說明提供於藥房手冊(Pharmacy Manual)中。 實例4 - 具有或不具有rHuPH20之皮下納武單抗
在一項正在進行的1/2期研究中，向年齡≥ 18歲、ECOG PS 0-1、患有轉移性/不可切除性實體腫瘤及可量測疾病的未接受過檢查點抑制劑治療之患者(pts)投與不同劑量的具有或不具有rHuPH20之納武單抗。主要目標為描述皮下納武單抗藥物動力學(PK)；且次要目標為安全性及免疫原性。其他分析比較了歷史IV納武單抗的接受情況。在第1週期中，部分A中之患者接受皮下納武單抗720 mg + rHuPH20，且部分B中之患者接受皮下納武單抗720 mg、皮下納武單抗960 mg + rHuPH20或皮下納武單抗960 mg。對於第2+週期，部分A及B中之患者每4週(Q4W)接受IV納武單抗480 mg。仍在進行研究之患者切換至部分C，皮下納武單抗1200 mg + rHuPH20，直至治療結束。在部分D中，患者接受從頭皮下納武單抗1200 mg + rHuPH20 Q4W。皮下注射為單次注射至腹部或大腿。
患者特徵因年齡、體重、腫瘤類型及先前治療而異。部分C及D之基線人口統計資料及疾病特徵展示於表60中。部分A中之腫瘤類型包括非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)、黑色素瘤(Mel)、肝細胞癌(HCC)及微衛星不穩定性高/錯配修復缺陷型大腸直腸癌(MSI-H/ dMMR CRC)。 表 60 ：部分C及D之基線人口統計資料/疾病特徵
   部分C患者，藉由初始治療分配過渡至SC (1200 mg + rHuPH20 部分D (1200 mg + rHuPH20) N = 36
   第1組 n = 9 第2組 n = 6 第3組 n = 5 第4組 n = 8 總N = 28
年齡，歲                  
平均值 70.7 65.3 65.2 69.3 68.1 64.6
中值(範圍) 71.0 (52-90) 64.0 (53-80) 66.0 (60-70) 69.0 (58-80) 67.5 (52-90) 69.0 (24-93)
年齡層，n (%)                  
＜ 65 2 (22.2) 3 (50.0) 2 (40.0) 2 (25.0) 9 (32.1) 14 (38.9)
≥ 65至＜ 75 4 (44.4) 1 (16.7) 3 (60.0) 4 (50.0) 12 (42.9) 17 (47.2)
≥ 75 3 (33.3) 2 (33.3) 0 2 (25.0) 7 (25.0) 5 (13.9)
性別，n (%)                  
男性 3 (33.3) 5 (83.3) 2 (40.0) 6 (75.0) 16 (57.1) 26 (72.2)
女性 6 (66.7) 1 (16.7) 3 (60.0) 2 (25.0) 12 (42.9) 10 (27.8)
ECOG PS，n (%)                  
0 6 (66.7) 5 (83.3) 2 (40.0) 2 (25.0) 15 (53.6) 12 (33.3)
1 3 (33.3) 1 (16.7) 3 (60.0) 6 (75.0) 13 (46.4) 24 (66.7)
體重，Kg a                  
平均值 77.1 70.2 60.6 75.9 72.3 80.4
中值(範圍) 72.7 (66-97) 69.5 (63-78) 60.0 (50-71) 73.3 (66-94) 71.6 (50-97) 80.7 (48-133)
腫瘤類型，n (%)                  
NSCLC 3 (33.3) 0 2 (40.0) 2 (25.0) 7 (25.0) 11 (30.6)
RCC 2 (22.2) 0 2 (40.0) 1 (12.5) 5 (17.9) 9 (25.0)
MSI-H/dMMR CRC 2 (22.2) 3 (50.0) 1 (20.0) 2 (25.0) 8 (28.6) 7 (19.4)
HCC 1 (11.1) 3 (50.0) 0 3 (37.5) 7 (25.0) 6 (16.7)
黑色素瘤 1 (11.1) 0 0 0 1 (3.6) 3 (8.3)
區域，n (%)                  
EU 1 (11.1) 5 (83.3) 3 (60.0) 6 (75.0) 15 (53.6) 14 (38.9)
紐西蘭 5 (55.6) 1 (16.7) 2 (40.0) 1 (12.5) 9 (32.1) 15 (41.7)
南美洲 0 0 0 1 (12.5) 1 (3.6) 7 (19.4)
美國 3 (33.3) 0 0 0 3 (10.7) 0
先前療法方案，n (%)                  
0 2 (22.2) 0 1 (20.0) 1 (12.5) 4 (14.3) 8 (22.2)
1 5 (55.6) 3 (50.0) 2 (40.0) 5 (62.5) 15 (53.6) 26 (72.2)
2 2 (22.2) 2 (33.3) 0 2 (25.0) 6 (21.4) 1 (2.8)
≥ 3 0 1 (16.7) 2 (40.0) 0 3 (10.7) 1 (2.8)
納武單抗暴露量隨著皮下劑量增加而增加(表61；圖8A-8C)。對於960 mg及1200 mg納武單抗+ rHuPH20，C avg及C tau高於IV納武單抗3 mg/kg每2週(Q2W)之幾何平均暴露量，且C max低於IV納武單抗10 mg/kg Q2W。在部分C (n = 28)中，13名(46.4%)患者經歷任何級別之TRAE，無新的/惡化的3+級TRAE或導致停藥/死亡的TRAE；7人(25.0%)報告了1級局部部位反應。在部分D(n = 36)中，27名(75.0%)患者經歷了任何級別之TRAE，4人(11.1%)經歷了3/4級TRAE，2人(5.6%)經歷了嚴重的3/4級TRAE，其中1人導致停藥，且無治療相關死亡；10人(27.8%)報告了1級局部部位反應。針對皮下納武單抗觀測到抗納武單抗抗體(Ab)，但與改變的PK/安全性或中和抗體無關。來自部分A之一名(4.5%)患者被視為持久性抗藥物抗體(ADA)陽性(表62)。在部分D中，僅1名(3.8%)患者具有8個滴度單位的陽性ADA滴度。未偵測到中和ADA，且無證據表明隨著ADA的發展而改變PK概況。抗納武單抗抗體的開發與所選AE(亦即支氣管痙攣、過敏反應、輸注相關反應)亦無關聯。探索性生物標記資料發現，治療後活檢中CD8+腫瘤浸潤淋巴球及PD-L1腫瘤表現增加，類似於IV納武單抗。 61 ：與rHuPH20一起給藥之納武單抗暴露量
幾何平均納武單抗濃度，µg /mL ( 範圍 ) C tau C avg C max T max
納武單抗720 mg 皮下(n = 20 a) 22.2 (4.76-59.6) 36.6 (16.5-76.3) 54.8 (19.9-114) 144 (47.0-357)
納武單抗960 mg 皮下(n = 9) 39.5 (8.06-67.6) 62.2 (26.8-93.3) 84.8 (42.7-128) 104 (47.2-168)
納武單抗1200 mg 皮下(n = 25 b) 51.3 (18.4-96.5) 77.5 (39.1-141) 105 (40.0-245) 118 (48.1-192)
a對於C max，n = 22； b對於C max，n = 26；Ctau =給藥間隔結束時之濃度 表 62 ：NIVO ADA評估：部分A、B及D
患者ADA狀態，n (%) 部分A 720 mg + rHuPH20 n = 22 部分B   
720 mg， 無rHuPH20 n = 18 960 mg + rHuPH20 n = 10 960 mg， 無rHuPH20 n = 17 部分D 1200 mg + rHuPH20 n = 26
基線ADA陽性 a 2 (9.1) 0 2 (20.0) 0 1 (3.8)
ADA陽性 7 (31.8) 5 (27.8) 3 (30.0) 0 1 (3.8)
持續陽性 1 (4.5) 0 0 0 0
非持續陽性-最後一個樣品陽性 0 3 (16.7) 0 0 0
其他陽性 6 (27.3) 2 (11.1) 3 (30.0) 0 1 (3.8)
中和陽性 0 0 0 0 0
ADA陰性 15 (68.2) 13 (72.2) 7 (70.0) 17 (100.0) 25 (96.2)
在本研究中研究的與皮下納武單抗+rHuPH20劑量相關的暴露具有良好耐受性，其安全概況與IV納武單抗一致。資料支持在3期研究中評估皮下納武單抗+ rHuPH20。
皮下納武單抗注射之平均持續時間跨治療組小於5分鐘。部分C及D中之所有患者均經由單次注射接受全皮下劑量之納武單抗1200 mg + rHuPH20 (22,000 U)。
藉由免疫組織化學(IHC)評估治療前及治療中(C1D15)配對活檢的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)上之CD8 (n = 23)表現(圖9A)及腫瘤PD-L1 (n = 25)表現(圖9B)。皮下遞送之納武單抗之免疫組織化學結果顯示，CD8 TIL表現之平均變化為5.0%，且PD-L1腫瘤表現之平均變化為2.8%，表明與靜脈內遞送之歷史納武單抗相比，在腫瘤微環境中之藥效學效應類似。 實例5 - 氧化應力分析
在此報告中，吾人評估有助於提高納武單抗及rHuPH20 (在一種調配物中之穩定及活性狀態水準極不同的兩種極不同蛋白質)之穩定性的因素。進行三項研究以充分理解調配物組成的影響。
研究1-研究除了加速穩定性以外，關於金屬、過氧化物及光之不同組合的多種氧化應力條件。研究2-研究觀測到調配物保護之濃度範圍。研究3-研究與預填充注射器及可穿戴裝置相關的其他初級包裝組件。此研究亦仔細檢查無rHuPH20之調配物影響。
為了評估納武單抗之穩定性，主要使用尺寸排阻層析法(SEC)，且為了評估rHuPH20之穩定性，量測了酶活性。將在所選時間點量測PS80含量及微粒。在此報告中顯示，添加DTPA及Met可最大限度地降低rHuPH20氧化的風險，且最大限度地提高納武單抗之穩定性。
研究設計
研究1：應力條件
建立研究1以確定不同氧化應力相互組合的影響。研究之三種氧化應力為：光[L](室溫下1000勒克斯)、金屬應力[M](總計1.5 ppm，鐵、鉻及銅各0.5 ppm)及過氧化物[P](1 mM過氧化物)。對三種應力分別評估及相互組合評估。初步資料顯示，酶活性隨著RT/RL儲存而降低，因此在室溫下，在1000勒克斯下，將光暴露與其他應力[LP、LM、MPL]之組合保持3天(3D)。注意：此研究之光暴露組[L]為在整個時間點持續時間內在室溫下暴露於1000勒克斯的唯一條件。Nivo在25℃暴露下顯示出最小的HMW增加，因此標準儲存條件溫度增加至30℃。由於光組合應力條件在室溫(RT)下暴露於光3天，因此所有條件均開始於RT/黑暗下3天或在室溫下在1000勒克斯下3天。研究中之8種應力條件為光/RT (1000勒克司) [L]；金屬應力(1.5 ppm鐵、鉻及銅)於RT/黑暗3D+30℃/黑暗下[M]；1 mM過氧化物於RT/黑暗3D+30℃/黑暗下[P]；光/RT 3D+過氧化物+30℃/黑暗[PL]；光/RT 3D+金屬+30℃/黑暗[ML]；過氧化物+金屬於RT/黑暗3D+30℃/黑暗下[MP]；光/RT 3D+金屬+過氧化物+30℃/黑暗[MPL]；RT/黑暗3D+30℃/黑暗[對照]。
中心點調配物組合物為：120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸(pH 6.0)、250 mM蔗糖、0.05% w/v 聚山梨醇酯80與2000 U/mL rHuPH20。在此研究中，如表63中所示地研究頂隙、螯合劑(DTPA/EDTA)及犧牲氧化劑(Met)之影響。表64展示此研究之儲存條件及計劃時間點。 表 63 ： 研究 1 - BMS - 986298 之 氧化研究之實驗條件
調配物 頂隙 DTPA (µM) EDTA (µM) Met (mM)
1 空氣 50 0 5.0
2 空氣 0 0 0.0
3 空氣 0 0 5.0
4 空氣 50 0 0
5 空氣 0 100 5.0
6 氮氣 50 0 5.0
7 氮氣 0 0 0
(所有調配物中同等地存在含120 mg/mL BMS-986298之20 mM組胺酸(pH 6.0)、250 mM蔗糖、0.05% (w/v)聚山梨醇酯80及2,000 U/mL rHuPH20)
表 64 ： 研究 1 - 氧化研究時間點
溫度 T0 3天 14天 1個月 3個月
光[L] (1000勒克司於RT下)    abcd X ab ac ac
金屬[M] (3D RT/黑暗+ 30℃/黑暗) X ab a a
過氧化物[P] (3D RT/黑暗+ 30℃/黑暗) X ab a a
光+過氧化物[PL] (3D RT/RL + 30℃/黑暗) X ab a a
光+金屬[ML] (3D RT/RL + 30℃/黑暗) X ab a a
金屬+過氧化物[MP] (3D RT/黑暗+ 30℃/黑暗) X ab a a
金屬+過氧化物+光[MPL] (3D RT/RL + 30℃/黑暗) X abc acd ac
對照[RT30] (3D RT/黑暗+ 30℃) X ab ac ac
拉動X但未測試。表65中定義之樣品分析
在此報告中，吾人藉由尺寸排阻層析法(SEC)關注不同參數如何影響納武單抗(Nivo)之穩定性。由於該方法之通量低，因此rHuPH20之穩定性評估僅在所選時間點進行。此外，亦選擇所選樣品來評估PS80之穩定性，PS80為經添加以提供藥品穩定性之關鍵賦形劑。此等結果用於預測所選條件如何影響Nivo及rHuPH20在不同氧化應力條件下之穩定性。 表 65 ： 研究 1 - 分析體積
代碼 量測 體積(mL)
a 外觀 0.6
   SEC 0.1
b MFI* 1.1
c 酶活性* 0.2
d PS80* 0.1
* 對所選樣品進行
研究2：調配物組成變化
建立研究2以確定觀測到調配物組成之益處的範圍。研究1定義了自氧化應力角度包括MPL及RT/RL之條件。針對氧化應力研究了此兩種應力條件以及對照。在氧化及熱應力(5、25及35℃)條件下研究了預期具有氧化益處之調配物條件。使用熱應力條件研究所有調配物以評估穩定性。
氧化應力條件： ●  MPL：所有三種應力之組合：在室溫/室內光照下3天[L] (1000勒克斯)、摻加金屬[M] (總計1.5 ppm，鐵、鉻及銅各0.5 ppm)及摻加過氧化物[P] (1 mM過氧化物)。金屬及過氧化物在T0 (初始時間點)摻加。在室溫/室內光照下3天之後，將樣品移動且在30℃下/避光保存該時間點之剩餘部分。 ●  RT30：MPL應力條件之對照。室溫/黑暗3天，接著在該時間點之剩餘部分維持30℃/避光 ●  RT/RL：在研究之全部持續時間內的室溫/室內光照(1000勒克司)。
熱應力條件包括(i) 5℃/避光；(ii) 25℃/避光(亦用作RT/RL條件之對照)；及(iii) 35℃/避光。
選擇調配物以展示調配物在以下調配物組成中係穩定的：(i) pH：5.2-6.8 His；(ii)組胺酸：10-100 mM (替代物：丁二酸鹽)；(iii) DTPA 10-200 µM (替代物：100 µM EDTA)；(iv) Met：1-20 mM (替代物：10 mM Trp)；(v) rHuPH20：0-5,000 U/mL；(vi) PS80：0.01-0.1% w/v (替代物：PS20 0.05% w/v及泊洛沙姆0.2 mg/mL)；(vii)糖：10-400 mM蔗糖(替代物：10%山梨糖醇及海藻糖)；及(viii)蛋白質：100-175 mg/mL。對於所有此等條件，中心點調配物組成為：120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸(pH 6.0)、250 mM蔗糖、50 μM DTPA、5 mM Met、0.05%聚山梨醇酯80與2,000 U/mL rHuPH20，且在小瓶中測試。
針對熱及氧化應力條件研究之條件展示於表66中。應注意，對於中心點條件及具有50 µM DTPA且無Met之條件，設計中存在重複的獨立調配物製備。篩選包括一個小的賦形劑表徵DOE，研究在pH、DTPA與Met濃度之間是否存在任何組合效應。在此等條件下研究DTPA、Met及酶含量的變化，外加具有氮氣頂隙，其中氧化更可能受此等調配物變化的影響。添加替代賦形劑以理解其相對於建議賦形劑的行為。作為Met之替代方案，添加Trp，且作為DTPA之替代方案，研究EDTA。研究了此等替代賦形劑之更高含量，以確保替代賦形劑相對於建議賦形劑之效能係毫無疑問的。研究中包括所選調配物之獨立重複(調配物21及29僅含DTPA，且調配物15及28-中心點)。
已針對熱應力單獨研究之調配物條件列於表67中。不太可能影響氧化之因素在此處有所不同。此等因素為：蛋白質濃度、替代緩衝液之使用及緩衝液強度、替代糖及糖濃度及替代界面活性劑及不同的界面活性劑含量。此處亦研究緩衝液pH之極值。對於所有此等條件，調配物包括50 µM DTPA、5 mM Met與2,000 U/mL rHuPH20。
對應於氧化應力條件之應力及時間點列於表68中。對應於熱應力條件之時間點列於表69中。 表 66 ： 研究 2 - BMS - 986298 之 氧化及熱應力之實驗條件
調配物 pH DTPA (uM) Met (mM) rHuPH20 (U/mL) 頂隙
1 5.5 10 1 2000 空氣
2 5.5 10 10 2000 空氣
3 5.5 100 1 2000 空氣
4 5.5 100 10 2000 空氣
5 6.5 10 1 2000 空氣
6 6.5 10 10 2000 空氣
7 6.5 100 1 2000 空氣
8 6.5 100 10 2000 空氣
9 5.5 50 5 2000 空氣
10 6.5 50 5 2000 空氣
11 6 10 5 2000 空氣
12 6 100 5 2000 空氣
13 6 50 1 2000 空氣
14 6 50 10 2000 空氣
15 * 6 50 5 2000 空氣
16 6 0 0 2000 空氣
17 6 200 5 2000 空氣
18 6 100 - EDTA 0 2000 空氣
19 6 100 - EDTA 5 2000 空氣
20 6 0 5 2000 空氣
21 * 6 50 0 2000 空氣
22 6 50 5 2000 氮氣
23 6 0 0 2000 氮氣
24 6 50 5 0 空氣
25 6 50 5 500 空氣
26 6 50 5 5000 空氣
27 6 50 Trp (10 mM) 2000 空氣
28 * 6 50 5 2000 空氣
29 * 6 50 0 2000 空氣
30 6 50 20 2000 空氣
*重複的獨立調配物製備。 (所有調配物中同等地存在含120 mg/mL BMS-986298之20 mM組胺酸、250 mM蔗糖及0.05% (w/v)聚山梨醇酯80) 表 67 ： 研究 2 - BMS - 986298 之 僅熱應力之實驗條件
調配物 蛋白質濃度(mg/mL) pH 緩衝液 緩衝液(mM) 糖 糖(mM) PS80 (wt%)
31 100 6.0 his 20 蔗糖 250 0.05
32 175 6.0 his 20 蔗糖 250 0.05
33 120 5.2 his 20 蔗糖 250 0.05
34 120 6.8 his 20 蔗糖 250 0.05
35 120 6.0 his 10 蔗糖 250 0.05
36 120 6.0 his 50 蔗糖 250 0.05
37 120 6.0 his 100 蔗糖 250 0.05
38† 120 6.0 his 20 無糖 0 0.05
39† 120 6.0 his 20 蔗糖 10 0.05
40† 120 6.0 his 20 蔗糖 400 0.05
41 120 6.0 his 20 蔗糖 250 0.05 - PS20
42 120 6.0 his 20 蔗糖 250 泊洛沙姆- 0.2 mg/mL
43†† 120 6.0 his 20 山梨糖醇 10% 0.05
44†† 120 6.0 his 20 海藻糖 10% 0.05
45 120 6.0 丁二酸鹽 20 蔗糖 250 0.05
46 120 6 his 20 蔗糖 250 0
47 120 6 his 20 蔗糖 250 0.01
48 120 6 his 20 蔗糖 250 0.1
49† * 120 6 his 20 蔗糖 250 0.05
*上表66中之調配物15及28之重複的獨立調配物製備(亦測試熱應力)。此調配物亦證實兩種DS來源之類似效能。 †使用不含糖之不同DS來源調配。 ‡ 對於此調配物，隨後發現不添加糖。在此處省略此等結果，但在研究3中涵蓋此兩種糖。 (所有調配物中同等地存在50 µM DTPA、5 mM Met與2,000 U/mL rHuPH20) 表 68 ： 研究 2 - 氧化研究時間點
溫度 光照25℃/RT下之1000勒克斯[25RT] 光(3D) 25℃+金屬+過氧化物+30℃/黑暗[MPL] 25℃/黑暗(3D)+30℃/黑暗[RT30]
T0 abcde - -
2 W a * a * a *
1 M a a a
3 M - acde a
樣品分析定義於表70中。附註.計劃為MFI提供1M及3M樣品，但由於COVID期間人員限制而無法運行。*視情況選用之測試 表 69 ： 研究 2 - 熱研究時間點
溫度 5℃ 25℃ 35℃
T0 abcde -              -
2 W - a * a *
1 M - a a
3 M a a acde
6 M a a a
樣品分析定義於表70中。附註.計劃為MFI提供6M樣品，但由於COVID期間人員限制而無法運行。*視情況選用之測試
在此研究中，吾人主要藉由尺寸排阻層析法(SEC)關注不同參數如何影響BMS-986298或Nivolumab之穩定性。由於酶活性方法之通量低，因此rHuPH20之穩定性評估僅在所選時間點進行。此外，亦選擇所選樣品來評估PS80之穩定性，PS80為經添加以提供藥品穩定性之關鍵賦形劑。CE-SDS及iCE在所選樣品上進行了測試，以瞭解低分子量物種及電荷變異體形成。此等結果用於預測所選條件如何影響Nivo及rHuPH20在不同氧化應力條件下之穩定性。 表 70 ： 研究 2 - 分析體積
代碼 量度 體積(mL)
a 外觀 0.5
   SEC 0.1
b MFI* 1.1
c 酶活性* 0.2
d PS80* 0.1
e CE-SDS* iCIEF* 0.1*
*對於所選樣品運行
研究3：PFS及可穿戴裝置之調配物組成變化
研究3之設置類似於研究2，但條件集中於使用預填充注射器及可穿戴裝置。與研究2類似，研究1 (MPL)之最壞情況條件包括於氧化應力條件中。由於在現實生活中不太可能遇到室溫/室內光照條件，且其對蛋白質及酶兩者賦予高應力，因此將室溫/室內光照條件去掉。與研究2類似，研究了標準熱應力條件外加氧化應力。針對氧化及熱應力條件兩者研究了可能影響氧化之調配物條件。所有調配物均在標準熱穩定性條件下進行測試。
氧化應力條件包括： ●  MPL：所有三種應力之組合：在室溫/室內光照下3天[L] (1000勒克斯)、摻加金屬[M] (總計1.5 ppm，鐵、鉻及銅各0.5 ppm)及摻加過氧化物[P] (1 mM過氧化物)。金屬及過氧化物在T0 (初始時間點)摻加。在室溫/室內光照下3天之後，將樣品移動且在30℃下/避光保存該時間點之剩餘部分。 ●  RT30：MPL應力條件之對照。室溫/黑暗3天，接著在該時間點之剩餘部分維持30℃/避光。
熱應力條件包括(i)5℃/避光；(ii)25℃/避光；及(iii)35℃/避光。
使用來自研究2之資料，希望研究之調配物濃度範圍被縮小以試圖找到對於穩定最佳的範圍。選擇調配物以展示調配物在此等調配物組成中係穩定的：(i) pH：5.2-6.5 His；(ii)組胺酸：15-100 mM；(iii) DTPA 10-200 µM (替代物：100 µM EDTA)；(iv) Met：1-20 mM (替代物：10 mM Trp)；(v) rHuPH20：0-10,000 U/mL；(vi) PS80：0.01-0.1% w/v (替代物: PS20及泊洛沙姆0.2 mg/mL)；(vii)糖：10-400 mM蔗糖(替代物：10%山梨糖醇及海藻糖)；(viii)蛋白質：100-200 mg/mL；及(ix)小瓶及PFS及貼片泵。
對於所有此等條件，中心點調配物組成為：20 mM組胺酸(pH 6.0)、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、5 mM Met、0.05% w/v聚山梨醇酯80與2,000 U/mL rHuPH20。小瓶中樣品之蛋白質濃度為120 mg/mL。PFS中之樣品具有150 mg/mL之納武單抗蛋白質濃度。此研究包括研究2中所研究之多種條件，但無酶。預計酶造成的影響最小，因此進行了驗證性研究，且在中心點測試了一次性條件。
針對熱及氧化應力兩者研究之條件及氧化應力條件展示於表71中。此處包括為涵蓋PFS添加之條件以及與使用PFS有關的條件(聚矽氧油及鎢摻加)。此處亦研究DTPA、Met及酶含量，其中氧化更可能受此等調配物組成差異的影響。
已針對熱應力單獨研究之調配物條件列於表72中。不太可能影響氧化之因素在此處有所不同。此等因素為：蛋白質濃度、緩衝液強度及酶含量。對於所有此等條件，調配物包括50 µM DTPA及5 mM Met。
對應於氧化應力條件之應力及時間點列於表73中。對應於熱應力條件之時間點列於表74中。 表 71 ： 研究 3 - BMS - 986298 之 氧化及熱應力之實驗條件
調配物 BMS-986298 (mg/mL) DTPA (uM) Met (mM) rHPH20 (U/mL) 附註
1 150 50 5 2000 聚矽氧油- 2X PFS
2 120 50 5 2000 PFS
3 150 50 5 2000 PFS
4 165 50 5 2000 PFS
5 120 50 5 2000 與研究2之中心點連接性
6 150 50 5 2000 摻加鎢1.0 ppm
7 120 50 5 10,000   
10 120 50 5 0 N=1
11 120 50 5 0 N=2
12 120 50 0 0 N=1
13 120 50 0 0 N=2
14 120 0 0 0   
15 120 0 5 0   
16 120 10 5 0   
17 120 200 5 0   
18 120 50 1 0   
19 120 50 20 0   
20 120 EDTA (100) 5 0   
21 120 50 Trp (10) 0 Trp (10)
22 150 50 5 0 摻加鎢1.0 ppm
38 150 50 5 0 聚矽氧油-2X
39 120 50 5 0 PFS
40 150 50 5 0 PFS
41 165 50 5 0 PFS
42 200 50 5 0 PFS
43 200 50 5 2000 PFS
44 120 50 5 2000 貼片泵
45 120 50 5 0 貼片泵
46 120 50 5 2000 貼片泵對照
所有調配物中同等地存在20 mM組胺酸pH 6.0、250 mM蔗糖及0.05% (w/v)聚山梨醇酯80。 表 72 ： 研究 3 - BMS - 986298 之 僅熱應力之實驗條件
調配物 蛋白質濃度(mg/mL) pH 緩衝液 緩衝液 (mM) 糖(mM) PS80 (wt%) rHuPH20 (U/mL)
8 200 6 組胺酸 20 250 0.05 2000
9 120 6 組胺酸 15 250 0.05 2000
23 120 5.2 組胺酸 20 250 0.05 0
24 120 6.5 組胺酸 20 250 0.05 0
25 120 6.0 丁二酸鹽 20 250 0.05 0
26 120 6 組胺酸 20 山梨糖醇(10%) 0.05 0
27 120 6 組胺酸 20 10 0.05 0
28 120 6 組胺酸 20 400 0.05 0
29 120 6 組胺酸 20 海藻糖(10%) 0.05 0
30 120 6 組胺酸 20 250 0.01 0
31 120 6 組胺酸 20 250 0.1 0
32 120 6 組胺酸 20 250 0.05 (PS-20) 0
33 120 6 組胺酸 20 250 泊洛沙姆 (0.2 mg/mL) 0
34 120 6 組胺酸 15 250 0.05 0
35 120 6 組胺酸 100 250 0.05 0
36 100 6 組胺酸 20 250 0.05 0
37 200 6 組胺酸 20 250 0.05 0
(所有調配物中同等地存在50 μM DTPA及5 mM Met。全部填充至小瓶中) 表 73 ： 研究 3 - 氧化研究時間點
溫度 光(3D) 25℃+金屬+過氧化物+30℃/黑暗 [MPL] 25℃/黑暗(3D)+30℃/黑暗[RT30]
T0 - -
2 W a * a *
1 M a a
3 M abcde ab
樣品分析定義於表75中。*視情況選用之測試。 表 74 ： 研究 3 - 熱研究時間點
溫度 5℃ 25℃ 35℃
T0 ab -              -
2 W - a * a *
1 M - a a
3 M a a a
6 M ab ab a
樣品分析定義於表75中。*視情況選用之測試。
在此研究中，吾人主要藉由尺寸排阻層析法(SEC)關注不同參數如何影響BMS-986298或Nivo之穩定性。僅對於5及25℃ 6M樣品運行驗證性MFI樣品。 表 75 ： 研究 3 - 分析體積
代碼 量測 體積(mL)
a 外觀 0.5
   SEC 0.1
b MFI* 1.1
* 對於所選樣品運行
材料及方法
材料
研究中所用之材料的細節提供於表76中。 表 76 ：材料資訊
   材料編號 研究1 批號 研究2 批號 研究3 批號
Nivo DS (170 mg/mL) 1274255 A1A8A-036 ABP4182-01
Nivo DS -無糖 (10 mg/mL) N/A VF Pool CRU，2018年8月20日 VF Pool CRU，2018年8月20日
rHuPH20 (10 mg/mL) 1405640 104-003-16-290016S 2HUN1803CA 2HUN1803CA
Neopack 2.25 mL注射器 RFS 27G1/25BSTW RNSBD260HS - 6299337   
2X Si注射器 Pilot 0T002 Fleming SCF - 18B331YL…0204
小瓶 1325008 AAK2742 AAR0679
塞子 1292715 AAL9676 AAL9676
捲邊 1221911 AAC2886 3K78805
貼片泵-智慧型劑量10mL West:  26018026 - SC00013392
貼片泵塞子 D 21-7HW SD2 10mL活塞FR2RUV - 905004
貼片泵West筒 26017493 - SC00004318
組胺酸 1274255 AAM9761 ABJ4908
His HCl H2O 1275346 AAM9523 ABJ5012
蔗糖 1244359 AAS9949 AAX0304
PS80 1353220 ABE4589 NOF 707361Z2
DTPA 05GD11.HQ00003 LG16.360 ABT3852
EDTA 1372205 (Hovione) AAL6226 AAN9782
甲硫胺酸 M9625-1KG (Sigma-Aldrich) SLBZ1683 SLBZ1683
過氧化物 BDH7690-1 (VWR) 18C065005 18C065005
六水合氯化鉻(III) 27096-1000G-F (Sigma-Aldrich) BCBC0518V BCBC0518V
三水合硝酸銅(II) 61194 (Fluka) 1272598 42807279 -
氯化銅(II)，無水，98% #12457 (Alfa Aesar)    - A28Q06   
硫酸鐵(II)銨 13448 (Alfa Aesar) J23N13 J23N13
樣品製備
解凍
冷凍儲存藥物物質(DS) BMS-986298及rHuPH20。此等DS瓶在室溫下避光解凍。解凍後，平緩地混合DS瓶子以確保均勻性。在5℃下儲存DS直至使用且在使用之後將任何剩餘部分再冷凍。調配物研究中所用之DS均不含DTPA及PS80。
對於研究1調配物，DP樣品係使用散裝DS材料BMS-986298 (170 mg/mL)藉由添加以下儲備溶液製備：(i) 10 mg/mL rHuPH20 DS (112 kU/mg rHuPh20)；(ii) 5%聚山梨醇酯80 (100×)；(iii) 2.5 mM DTPA (50×)；(iv) 5 mM EDTA (50×)；(v) 250 mM甲硫胺酸(50×)；(vi) 20 mM組胺酸250 mM蔗糖pH 6.0；(vii) 50 mM過氧化氫(50×)；(viii) 50 ppm六水合氯化鉻(III)、50 ppm三水合硝酸銅(II)及50 ppm硫酸鐵(II)銨(100×)。DS起始組合物包含20 mM組胺酸，及250 mM蔗糖，pH 6.0。
對於各調配物，製備未摻加、僅摻加過氧化物、僅金屬以及金屬及過氧化物之樣品。在即將摻加之前製備金屬混合液。在平緩混合後，所有調配物均使用帶有0.2 µm Supor膜之Acrodisc針筒過濾器進行過濾。實驗記錄於記錄簿A0F7F-090中。
對於研究2調配物，藉由4種方法製備DP樣品。首先，藉由使用散裝DS材料BMS-986298 (170 mg/mL)進行直接添加，無需進一步製備-無緩衝液交換。藉由添加0.2µm經過濾儲備溶液調配至目標濃度。儲備溶液包括：2 M蔗糖；495 mM組胺酸pH 6.0；500 mM組胺酸pH 5.2；500 mM組胺酸pH 5.5；211 mM組胺酸pH 6.5；262.5 mM組胺酸pH 6.8；5% PS80；5mM EDTA；2.5 mM DTPA；250 mM Met；5% PS80；20 mg/mL泊洛沙姆；1400 mM丁二酸鹽；80%山梨糖醇；40%海藻糖；54 mM色胺酸；及水。
此方法用於DS pH為6.0且蔗糖含量為250 mM之調配物組成。DS起始組合物為：20 mM組胺酸、250 mM蔗糖，pH 6.0。
CM3：使用自動化設備交換緩衝液，其中使用10kDa過濾器，加壓濃縮且將目標緩衝液添加至目標緩衝液交換組合物中。使用兩種輸入DS物料流：(i) 170 mg/mL Nivo儲備液之DS (直接按原樣使用；DS起始組成為：20 mM組胺酸、250 mM蔗糖，pH 6.0)；及(ii) 10 mg/mL Nivo儲備液之DS (此材料係在添加糖之前的病毒過濾步驟期間收集；此DS儲備液使用糖組成變化之樣品；將適於目標組成之糖添加至DS中，接著使用centricon過濾器濃縮；使用30kDa過濾器進行濃縮)。
需要此類型之緩衝液交換的調配物具有小樣品需求(僅用於需要具有獨特pH或糖含量的1種調配物)。在緩衝液交換之後，相同儲備液如上所述地用於調配。切向流過濾(TFF)使用30 kDa過濾器與8透濾體積之緩衝液交換。運行兩個TFF，一個為pH 5.5，且一個為pH 6.5。由於此兩個pH值下之調配物的數目，此係必需的。在緩衝液交換之後，相同儲備液如同以上步驟1地用於調配。透析用於製備調配物38-一種無糖調配物。該溶液最初為無糖調配物，且接著緩衝液交換為目標緩衝液pH/組成。隨後藉由經由10kDa膜離心來調節濃度。在緩衝液交換之後，相同儲備液如同以上步驟1地用於調配。
對於MPL條件，藉由產生50 ppm六水合氯化鉻(III)、50 ppm三水合硝酸銅(II)及50 ppm硫酸鐵(II)銨之儲備溶液來摻加金屬。類似地，使50 mM過氧化氫溶液摻加過氧化物。
在平緩混合後，所有調配物均使用帶有0.2 µm Supor膜之Acrodisc針筒過濾器進行過濾。
對TFF緩衝液進行賦形劑分析以確認賦形劑含量。分析發現與山梨糖醇交換之CM3緩衝液未添加山梨糖醇，且亦無意中遺漏海藻糖。因此，分析中省略了此兩個樣品(調配物43及44)之結果。此等條件包括於研究3中，但不含酶。
對於研究3調配物，DP樣品係藉由直接添加、藉由CM3進行緩衝液交換或與TFF緩衝液交換來製備。製備方法與研究2相似。研究2與研究3之間的主要差異在於DS儲備液為不同批次之材料，且研究3中用於摻加之金屬之一為氯化銅(II)，而研究2中為三水合硝酸銅(II)。
使用針頭填充貼片泵筒且將其與小瓶及注射器一起穩定放置。在適當的提取時間提取樣品且冷凍，直至Smart Dose貼片泵到達。貼片泵用於自筒中遞送溶液。使用針頭移除對照樣品之液體。
填充
將經調配及過濾之DP填充至去熱原之3 cc 小瓶(Schott 1型玻璃)或BD Neopack 2.25mL注射器中，且用高壓滅菌之13 mm Daikyo塞子(D-21-7S，塗有Fluorotec之血清)或BD1-3mL柱塞塞住。將小瓶旋緊且以豎直位置直立地穩定放置。例外情況為當小瓶水平放置時暴露於光照下。注射器以水平位置儲存。
分析
取出樣品，且接著立即冷凍直至分析時間，微粒分析(MFI)除外；其保持於5℃下直至分析。
SEC
DP樣品藉由SEC-HPLC (MTD-10789)進行分析，用於定量分析HMW及LMW物種。使用TSK gel Super SW 3000管柱(TOSOH 1875)分析樣品，流動速率為0.5 mL/min，且運行時間為35 min。移動相為100 mM磷酸鹽及100 mM硫酸鈉pH 6.8。各運行均注入50 µg負載量之Nivo樣品。藉由280 nm處之UV-吸光度來偵測峰，且量測各峰之面積及滯留時間。計算且報告單體、HMW及LMW物種之面積百分比。
酶活性
rHuPH20活性使用盤式濁度分析，方法CTL-10028在DCA中量測。玻尿酸酶效力分析係基於當玻尿酸(HA)與酸化血清結合時形成不溶性沈澱物。沈澱物產生可在640 nm處量測之混濁溶液。通過將酶與HA受質一起培育30分鐘，用酸化血清沈澱出未消化之HA，且將濁度與參考標準曲線進行比較來直接量測玻尿酸酶之效力(或活性)。
PS80分析
使用Waters Oasis Max管柱，以1毫升/分鐘之流動速率，用0.1%甲酸與5 mM甲酸銨/0.1%甲酸之乙腈溶液在30℃下用質譜儀量測PS80含量。
微粒
使用微流成像(MFI)測試微粒含量。將1.1 mL各樣品填充至單獨的玻璃瓶中進行MFI分析。藉由在分析之間運行之水樣來測試樣品。樣品用0.15 mL吹掃及0.43 mL分析體積進行測試。
根據成像毛細管等電聚焦(iCIEF)之電荷變異體
藉由iCIEF使用稱為iCE3 (MTD-10788)之成像等電聚焦系統來分析電荷變體。藉由自動進樣器將與適當pI標記、兩性電解質及其他添加劑混合之樣品注入碳氟化合物(FC)塗佈之毛細管筒中。在高壓預聚焦及聚焦後，藉由UV偵測器捕獲樣品遷移，且藉由CCD相機拍攝UV光吸收影像。計算且報告主峰、酸性變異體及鹼性變異體之面積百分比。
CE-SDS
Nivo之相對百分比純度係藉由CE-SDS使用LabChip GX II Caliper系統在非還原條件下測定。樣品係在十二烷基硫酸鈉(SDS)存在下變性及製備，SDS係一種清潔劑，其塗佈蛋白質，提供負電荷，有效掩蔽蛋白質之天然電荷。將各樣品抽吸至晶片上，與染料混合且進行電泳分離。接著在晶片上進行單獨的脫色步驟。儀器內之光學器件偵測各樣品之螢光信號。基於大小及電泳遷移率分離蛋白質物種。計算各峰之相對百分比面積且報告相對百分比純度(%主峰)。
結果 - 研究 1
尺寸排阻層析法
尺寸排阻層析法為用於監測納武單抗在所研究之各種應力條件下之穩定性的主要工具。
為了研究氮氣頂隙的影響，研究了兩種具有氮氣頂隙之調配物。含有50 µm DTPA及5 mM Met之調配物(調配物1-空氣，調配物6-氮氣)及不含DTPA或Met之調配物(調配物2-空氣，調配物7-氮氣)。HMW變化繪製於圖10中。對於具有DTPA及Met兩者之調配物，頂隙影響對於除RT/光照條件與連續光暴露之外的所有條件均為最小的(圖10)。在無DTPA且無met之調配物中，具有氮氣頂隙係有益的(圖10)。在添加DTPA及Met之情況下，氧化得到良好控制，且因此不需要氮氣頂隙。
各種調配物對在暴露於各種應力條件之後Nivo之HMW物種形成的影響展示於圖11中。應力條件包括(自左至右)：1.)對照-在室溫/黑暗下暴露3天(對於L條件，對照進行光暴露3天)+30℃熱應力(對於除RT/光以外的所有條件之熱應力)；2.) 金屬-鐵、鉻及銅各0.5 ppm (M條件)+光(在1000勒克斯下在室溫下3天- L條件)+30℃熱應力；3.) M + 1mM過氧化物(P條件)+ L + 30℃熱應力；4.) M + L + 30℃熱應力；5.) M + 30℃ 熱應力；6.) P + L + 30℃熱應力；7.) P + 30℃熱應力；8.)室溫/室內光照(無額外熱應力)。
在所有應力條件下，調配物2：無DTPA且無Met具有最高HMW形成速率，接著為調配物3：無DTPA且具有5 mM Met。調配物5：具有100 mM EDTA及5 mM Met，接著為調配物4：具有50 µM DTPA且無Met。最佳調配物為具有50 µm DTPA及5 mM Met之調配物1。在所有應力條件下均可觀測到此行為，但最好藉由查看MPL (與30℃熱應力之組合應力條件)來觀測該等差異。此MPL應力條件相對於所有調配物條件之圖展示於圖12中。
對圖12中之MPL應力條件的仔細檢查展示具有50 μM DTPA及5 mM Met兩者的好處(調配物1-空氣及6-氮氣)。調配物中具有兩種抗氧化劑可使Nivo穩定，因此用氮氣交換頂隙不會顯示改善的穩定性(調配物1與6完全重疊)。單獨具有DTPA (調配物4：50 µM DTPA與0 mM Met)優於更高量的EDTA與Met (調配物5：100 µM EDTA與5 mM Met)。在空氣頂隙下，在無DTPA且無Met之情況下觀測到最高HMW形成(調配物2：0 µM DTPA與0 mM Met)，接著為相同調配物，但在氮氣頂隙下(調配物7)及單獨具有Met (調配物3：0 µM DTPA與5 mM Met)。
檢查此等資料之另一種方式為藉由查看調配物組成以及其如何藉由應力條件執行，如圖13中所示。可觀測到具有DTPA及Met兩者之益處。檢查資料之此方式表明，RT/光照條件係最壞情況，且自個別應力角度來看，3天光照及/或金屬導致最高% HMW形成，且過氧化物的影響減弱。對於RT/光照條件，氮氣頂隙之益處非常明顯。對於無DTPA、無Met樣品，氮氣頂隙在所有應力條件下均使% HMW降低大約0.5%。對於具有DTPA及Met兩者之調配物，未觀測到由於氮氣頂隙之顯著改善。100 µM EDTA與5 mM Met之%HMW大於50 µM DTPA與5 mM Met，但影響的大小可能取決於精確的應力源。
為提供統計評估，探索各種線性模型。缺乏對純誤差、設計不平衡及複雜調配物-應力動力學的估計使得無法嘗試併入所有因素之單一組合模型。氮氣及EDTA樣品自分析中排除。剩餘的螯合劑-甲硫胺酸觀測結果展示於圖14中且為下文所述之分析提供圖形動機。RT/室內光照條件雖然包含在統計模型中，但已自下圖中刪除，因為此極端應力條件與預期使用情況不太相關。
對於此減少的資料集，螯合劑-應力相互作用之潛力係顯而易見的。但是，在僅DTPA之樣品中，應力效應似乎是累加的。此表明主效應統計模型係可估計的，且可用於比較具有/不具有甲硫胺酸之DTPA。基於存在或不存在DTPA，可能有殘差變異數差異。
基於所呈現之分析，仔細檢查了具有或不具有5 mM甲硫胺酸之DTPA與空氣頂隙的比較。在空氣下使用僅DTPA之樣品，併入甲硫胺酸及應力之主效應線性模型估計，在4週時添加甲硫胺酸對%HMW具有略顯著平均益處(差異0.0375%，p約0.0796)，且在12週時在所有應力條件下對%HMW具有統計顯著平均改善(差異0.125%，p約0.0016) (資料未示出)。
聚山梨醇酯 80
測試樣品子組以瞭解聚山梨醇酯之穩定性，聚山梨醇酯係一種對保護Nivo不形成微粒至關重要的界面活性劑。所測試樣品之PS80含量展示於表77中。PS80確實會被金屬、過氧化物及光氧化。藉由添加螯合劑(DTPA或EDTA)減輕降解。在無螯合劑之條件下，PS80含量在儲存時顯著下降。甚至在5℃下儲存2個月之後亦可觀測到此下降。在30℃下在金屬及過氧化物應力下儲存1個月後，其中3天在室溫/室內光照下，不含螯合劑之樣品降至小於0.1 mg/mL (自起始0.5 mg/mL目標)。氮氣頂隙略微保護PS80 (氮氣下0.08 mg/mL相對於空氣下0.02 mg/mL)。 表 77 ： 研究 1 - 自 0 . 5 mg / mL 初始 PS80 開始， 在 5 ℃下 2 個月 之後及在光 + 金屬 + 過氧化物 + 30 ℃ / 黑暗 [ MPL ] 下 3 天之後 1 個月的 PS80 含量。
調配物編號(頂隙) DTPA (uM) EDTA (uM) Met (mM) PS80 MP 5C 2M (mg/mL) PS80 MPL 30C 1M (mg/mL)
1 50 0 5 0.49 0.49
2 0 0 0 0.45 0.02
3 0 0 5 0.34 0.03
4 50 0 0 0.49 0.51
5 0 100 5 0.49 0.48
6 (N2) 50 0 5 0.51 0.49
7 (N2) 0 0 0 0.46 0.08
rHuPH20 酶活性
為了評估rHuPH20之穩定性，量測了一組有限樣品之酶活性。來自酶活性分析之結果展示於圖15中。儲存於30℃/黑暗與MPL應力(金屬及過氧化物應力，其中前3天在室溫/室內光照下)下之樣品的酶含量列於圖15中(中間)。含有DTPA及Met之調配物(調配物1)優於單獨含有DTPA之調配物，後者優於單獨含有Met之調配物。不含任一者(DTPA或甲硫胺酸)之調配物的酶活性下降最大。
暴露於3天RT/黑暗，繼之以30℃/黑暗之樣品，圖15 (左)展示類似行為，其中具有DTPA及Met之調配物以及僅具有DTPA之調配物優於僅具有Met之調配物及不具有DPTA或Met之調配物。
暴露於RT/RL之樣品展示不同的rHuH20酶活性行為，圖15(右)。對於此等條件，所有調配物對於所有3 M樣品均具有不可報告(低)水準之rHuPH20活性，除了具有DTPA及Met、保持於氮氣頂隙下之樣品。在空氣頂隙下連續暴露於室內光照後，未觀測到調配物差異。此等結果表明，頂隙氮氣與DTPA及Met之組合有助於在持續暴露於室溫/室內光照之情況下保護酶。
微粒形成
對於所有應力條件及調配物，在兩週時間點評估微粒形成。對於所有樣品，≥25 µm粒子之大微粒含量均較低(小於32個粒子/毫升)。對於所有樣品，≥10 µm粒子之微粒均低於164個粒子/毫升。具有最高微粒計數之樣品係在室溫/室內光照條件下，但粒子數目遠低於USP ＜788＞規範。在此研究期間未觀測到微粒問題。
調配物之穩定性藉由三個關鍵組成部分監測：根據SEC之Nivo穩定性、藉由監測酶活性之rHuPH20穩定性及藉由量測PS80含量之PS80穩定性。對於此等品質屬性中之每一者，調配物效能及最佳調配物至最差(自上至下)調配物之排序列於表78中。
根據SEC之Nivo穩定性展示HMW響應於氧化應力而增加。在應力(金屬、過氧化物及光)之各種組合中，HMW之增加受抗氧化劑的存在保護。Met及DTPA之組合展現比單獨的DTPA更好的穩定性，單獨的DTPA勝過Met，Met勝過不具有DTPA或Met之調配物。
rHuPH20酶活性響應於氧化應力而降低。特定言之，歸因於光應力之下降係顯著的。對於金屬、過氧化物及光應力(3天)條件之組合，可觀測到調配物組成益處。在存在Met及DTPA兩者之情況下，酶活性得到最佳保存。相對於單獨的DTPA具有可量測酶活性下降，單獨的DTPA相對於單獨的Met具有可量測酶活性下降，單獨的Met相對於無Met或DTPA具有可量測酶活性下降。
對於具有螯合劑(DTPA)之條件觀測到PS80保護。Met不保護PS80免於降解。 表 78 ： 研究 1 - 能夠區分調配物且對此等調配物進行排序之所研究品質屬性
品質屬性 Nivo SEC- HMW rHuPH20酶活性 PS80穩定性
(最佳) Met + DTPA Met + DTPA Met + DTPA = DTPA
排序 DTPA DTPA Met = 無
   Met Met   
(最差) 無 無   
對各種調配物之過氧化物、金屬與光照之各種組合外加30℃下之熱應力進行研究的關鍵結果表明，在具有50 μM DTPA及5 mM Met之調配物中存在益處。僅具有此等抗氧化劑中之一者的穩定性不如具有螯合劑及犧牲性抗氧化劑兩者。
結果 – 研究 2
分析表68及表69中所列之調配物。在此研究中，目標為瞭解可觀測到此調配物之益處的因素及範圍。研究之因素及範圍為：pH：5.2-6.8 His；組胺酸：10-100 mM (替代物：丁二酸鹽)；DTPA 10-200 µM (替代物：100 µM EDTA)；Met：1-20 mM (替代物：10 mM Trp)；rHuPH20：0-5,000 U/mL；PS80：0.01-0.1% w/v (替代物：PS20及泊洛沙姆0.2 mg/mL)；糖：10-400 mM蔗糖；及蛋白質：100-175 mg/mL。此產生49種在此處研究之不同調配物。pH、DTPA及Met水準共變化。賦形劑範圍之最大值及最小值處之調配物一次變化一個變量，所有其他因素均在目標組成處。目標組成為：含120 mg/mL Nivo之20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% w/v PS80，pH 6.0，具有空氣頂隙。應注意，對於中心點條件及具有50 µM DTPA且無Met之條件，設計中存在重複的獨立調配物製備。所研究調配物之分佈展示於圖16A-16F中。
與在目標組成處研究之調配物範圍類似，亦在目標組成處與其他賦形劑一起研究替代賦形劑：丁二酸鹽、100 µM EDTA、10 mM Trp、0.05% w/v PS20、泊洛沙姆0.2 mg/mL、10%山梨糖醇及海藻糖。
尺寸排阻層析法
尺寸排阻層析法為用於監測納武單抗之穩定性的主要工具。
再現性
對於中心點條件及具有50 µM DTPA且無Met之條件，設計中包括重複及獨立的調配物製備。此等調配物根據SEC按應力及時間點之最終HMW列於表79中。 表 79 ： 研究 2 - 在針對重複樣品研究之各應力條件下之最後時間點的 SEC 高分子量物種 - 中心及 0 Met 調配物。中心調配物組成 ： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 ， pH 6 . 0 。 0 Met 組成 ： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 0 . 05 % w / v PS80 ， pH 6 . 0 。
描述符 根據SEC之HMW%
調 配物 DS 來源 5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT/30 3M RT/RL 1M MPL 3M
15 中心 Nivo DS 0.9 1.4 1.7 1.2 1.9 1.5
28 中心 Nivo DS 0.9 1.4 1.8 1.3 1.8 1.6
49 中心 無糖DS 0.8 1.3 1.6 - - -
21 0 Met Nivo DS 0.9 1.5 1.8 1.3 1.9 1.8
29 0 Met Nivo DS 0.9 1.5 1.8 1.3 1.9 1.8
酶含量
在此研究中，研究0至5,000 U/mL之間的一系列酶含量。不同酶含量之根據SEC之最終HMW關於該應力條件下之最終時間點列於表80中。調配物組成具有不同酶含量與120 mg/mL Nivo，20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、5 mM Met、0.05% w/v PS80，pH 6.0。酶含量在所研究之所有應力條件下均對HMW物種形成無影響。 表 80 ： 研究 2 - 在針對不同酶含量研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。 調配 物 組成 ： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % PS80 ， pH 6 . 0 。
酶 (U/mL) 根據SEC之HMW%  
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT/30 3M RT/RL 1M MPL 3M
0 0.9 1.4 1.8 1.2 1.9 1.6
500 1.0 1.4 1.8 1.2 1.9 1.6
2000 0.9 1.4 1.7 1.2 1.9 1.5
2000 0.9 1.4 1.8 1.3 1.8 1.6
5000 0.9 1.4 1.8 1.2 1.9 1.6
替代賦形劑
在此研究中，研究了具有所有其他賦形劑之中心點組成的替代賦形劑。作為0.05% w/v PS80之替代界面活性劑，研究了0.05% w/v PS20及0.2 mg/mL泊洛沙姆。作為20 mM組胺酸之替代緩衝劑，研究了20 mM丁二酸鹽。界面活性劑及緩衝劑替代物不太可能對氧化保護產生大的影響，因此在熱應力條件下研究了此等替代物之效能。使用此等替代賦形劑之根據SEC之最終HMW針對緊鄰中心點條件(目標調配物組成為120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% w/v PS80，pH 6.0)之該應力條件下之最終時間點列於表81中。作為替代賦形劑，PS80可用PS20或泊洛沙姆替代，對穩定性之影響最小。以組胺酸為緩衝劑之調配物對Nivo穩定性至關重要，且無法用丁二酸鹽替代。在研究之所有熱應力條件(5℃、25℃及35℃)下，存在HMW物種隨丁二酸鹽緩衝劑之實質性增加。 表 81 ： 研究 2 - 在針對替代賦形劑研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。中心點組成 ： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 、 2000 U / mL rHuPH20 ， pH 6 . 0 。
替代賦形劑 根據SEC之HMW%
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M
中心 0.9 1.4 1.7
中心 0.9 1.4 1.8
PS20 0.9 1.3 1.7
泊洛沙姆 0.9 1.3 1.7
丁二酸鹽 1.3 3.2 6.8
作為50 µM DTPA之替代螯合劑，研究了100 µM EDTA。DTPA係一種更好的螯合劑，因此在此處研究更高水準之EDTA。類似地，作為5 mM甲硫胺酸之替代犧牲劑，研究了10 mM色胺酸。由於添加螯合劑及犧牲氧化劑會影響抗氧化保護，因此在熱及氧化應力條件兩者下對此等進行研究。使用此等替代賦形劑之根據SEC之最終HMW針對緊鄰中心點條件及對應對照(中心點調配物組成為120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% PS80，pH 6.0)之該應力條件下之最終時間點列於表82中。 表 82 ： 研究 2 ， 在針對 DTPA 及 Met 之 替代賦形劑研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。組成包括 ： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 0 . 05 % w / v PS80 、 2000 U / mL rHuPH20 ， pH 6 . 0 。
調 配物 根據SEC之HMW%
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT/30 3M RT/RL 1M MPL 3M
5 mM Met 50µm DTPA 0.9 1.4 1.7 1.2 1.9 1.5
5 mM Met 50µm DTPA 0.9 1.4 1.8 1.3 1.8 1.6
10 mM Trp 50µm DTPA 0.9 1.4 1.8 1.2 2.4 1.9
5 mM Met 100 µM EDTA 0.9 1.5 1.8 1.3 1.8 2.1
0 mM Met 100 µM EDTA 1 1.7 2.1 1.3 1.9 3.7
0 mM Met 50 µM DTPA 0.9 1.5 1.8 1.3 1.9 1.8
0 mM Met 50 µM DTPA 0.9 1.5 1.8 1.3 1.9 1.8
在MPL應力下3個月後列表之% HMW值明確展示具有DTPA之獨特益處，且與EDTA相比，DTPA為優良螯合劑。在MPL應力下3個月後，觀測到的%HMW為1.6%相對於2.1% HMW。對單獨螯合劑(不含Met)之評估進一步說明DTPA比EDTA更有益(在3M MPL應力後，DTPA之1.8% HMW相對於EDTA之3.7% HMW)。類似地，資料展示Met優於Trp。在RT/RL下之1M之後觀測到的HMW為Met之1.9%相對於Trp之2.4%，且3M MPL之後為Met之1.5%相對於Trp之1.9% HMW。當用5 mM Met及50 µM DTPA調配時，% HMW增加得到最佳控制。此等結果與研究1一致。
DTPA水準
研究了0-200 μM之DTPA水準範圍，中心點調配物組成為120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% w/v PS80，pH 6.0。不同Met水準下根據SEC之最終HMW關於該應力條件之最終時間點列於表83中。在加速熱條件(25℃及35℃)及MPL氧化條件下，具有0 µM DTPA會有影響；然而，在10-200 µM之濃度之間，未觀測到濃度依賴性DTPA效應之令人信服的證據。此行為隨時間推移在應力條件下一致，如圖17中所示。 表 83 ： 研究 2 ， 在針對不同 DTPA 水準 研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。組成包括 ： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 、 2000 U / mL rHuPH20 ， pH 6 . 0 。
DTPA (µM) 根據SEC之HMW%  
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT/30 3M RT/RL 1M MPL 3M
0 1.0 1.8 2.2 1.4 2.0 2.4
10 0.9 1.4 1.7 1.2 1.8 1.5
50 0.9 1.4 1.7 1.2 1.9 1.5
50 0.9 1.4 1.8 1.3 1.8 1.6
100 0.9 1.4 1.7 1.2 1.8 1.6
200 0.9 1.4 1.7 1.2 2.0 1.5
甲硫胺酸含量
研究了0-20 mM Met之甲硫胺酸(Met)含量範圍，中心點調配物組成為120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% w/v PS80，pH 6.0。不同Met水準下根據SEC之最終HMW關於該應力條件之最終時間點列於表84中。對於熱條件(5℃、25℃、35℃及RT/30℃對照)，Met水準變化不會產生重大影響。在RT/RL超過1個月及MPL超過3個月之氧化應力條件下，觀測到較高含量之Met與DTPA組合的益處。由於在所有此等調配物中添加DTPA對HMW形成之影響較大，因此益處極小。 表 84 ： 研究 2 ， 在針對不同 Met 水準 研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。組成包括 ： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 0 . 05 % w / v PS80 、 2000 U / mL rHuPH20 ， pH 6 . 0 。
Met 水準 (mM) 根據SEC之HMW%
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT/30 3M RT/RL 1M MPL 3M
0 0.9 1.5 1.8 1.3 1.9 1.8
0 0.9 1.5 1.8 1.3 1.9 1.8
1 0.9 1.5 1.7 1.3 1.9 1.7
5 0.9 1.4 1.7 1.2 1.9 1.5
5 0.9 1.4 1.8 1.3 1.8 1.6
10 0.9 1.4 1.6 1.2 1.8 1.5
20 0.9 1.4 1.7 1.2 1.6 1.4
在各條件下%HMW之時程變化展示於圖18中。在所有應力條件下，0 μM DTPA與0 mM Met具有最高HMW含量。在0 μM DTPA水準下0與5 mM甲硫胺酸調配物之間的區別很明顯—添加Met有利於Nivo之穩定性。在目標50 μM DTPA濃度下，Met水準在2週及1個月時間點處之不同應力下的影響更難區分。然而，在3個月及6個月時間點需要仔細評估。
MPL之仔細評估(金屬+過氧化物+3D光照，接著為30℃/黑暗應力條件)展示於圖19中。注意：對於具有0 mM Met與50 μM DTPA之調配物及具有5 mM Met與50 μM DTPA之調配物，存在由兩個及三個*標記標示之重複獨立調配物。0 μM DTPA下之0及5 mM Met調配物在所有三個時間點均有差異。在50 μM DTPA濃度下，%HMW形成似乎為在此等MPL條件下在1個月及3個月時間點兩者處之甲硫胺酸濃度的函數。特定言之，對於3個月時間點處之MPL應力條件，可明顯觀測到較高含量之Met的益處。具有5 mM Met濃度之100及200 μM DTPA之HWM形成類似於具有5 mM Met水準之50 μM DTPA。此係由於具有DTPA之二元效應，但無令人信服的證據表明如上文所論述之濃度依賴性DTPA效應。
pH
研究了5.2至6.8之pH水準範圍，中心點調配物組成為120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50µM DTPA、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% w/v PS80。不同pH水準下根據SEC之最終HMW關於該應力條件之最終時間點列於表85中。在所有熱條件(5℃、25℃及35℃)及氧化條件(RT/RL、MPL及RT/30℃對照)下，具有較高pH均存在影響。在5.2至6.5之pH範圍之間，調配物具有良好穩定性。 表 85 ： 研究 2 ， 在針對不同 pH 水準 研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。組成包括 ： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 及 2000 U / mL rHuPH20 。
pH 根據SEC之HMW%
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT/30 3M RT/RL 1M MPL 3M
5.2 1.0 1.4 1.9 - - -
5.5 0.9 1.5 1.8 1.2 1.8 1.5
6.0 0.9 1.4 1.7 1.2 1.9 1.5
6.0 0.9 1.4 1.8 1.3 1.8 1.6
6.5 1.1 1.8 2.0 1.5 2.7 2.1
6.8 1.2 2.6 4.1 - - -
pH、Met及DTPA水準之DOE評估
在pH、Met及DTPA水準之組合上運行了小賦形劑表徵DOE。DOE中之調配物列於表86中，所有調配物均含有120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、2,000 U/mL rHuPH20及0.05% PS80。不同Met水準下根據SEC之最終HMW關於該應力條件之最終時間點進行列表。對結果的檢查表明，在所有應力條件下均有明顯的pH效應。此部分研究之結果與上述單變研究結果一致。對於MPL條件，主要影響為pH，較高pH會導致較高HMW值。較高水準之Met具有保護作用，且此處研究之DTPA水準(10-100 µM)不會影響HMW。 表 86 ： 研究 2 ， 在針對研究 pH 、 Met 及 DTPA 水準之影響 的 DOE 研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。組成包括 ： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 0 . 05 % w / v PS80 及 2000 U / mL rHuPH20 。
pH DTPA (uM) Met (mM) 5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT/30 3M RT/RL 1M MPL 3M
5.2 50 5 1 1.4 1.9 - - -
5.5 10 1 0.9 1.5 1.9 1.3 1.7 1.5
5.5 10 10 0.9 1.4 1.8 1.2 1.6 1.4
5.5 100 1 0.9 1.5 1.9 1.3 1.8 1.6
5.5 100 10 0.9 1.4 1.8 1.2 1.6 1.4
5.5 50 5 0.9 1.5 1.8 1.2 1.8 1.5
6 10 5 0.9 1.4 1.7 1.2 1.8 1.5
6 100 5 0.9 1.4 1.7 1.2 1.8 1.6
6 50 1 0.9 1.5 1.7 1.3 1.9 1.7
6 50 10 0.9 1.4 1.6 1.2 1.8 1.5
6 50 5 0.9 1.4 1.7 1.2 1.9 1.5
6 50 5 0.9 1.4 1.8 1.3 1.8 1.6
6 50 5 0.8 1.3 1.6 - - -
6.5 10 1 1.1 1.8 2.1 1.6 2.8 2.2
6.5 10 10 1.1 1.8 1.9 1.5 2.7 1.9
6.5 100 1 1.1 1.8 2 1.6 2.8 2.4
6.5 100 10 1.1 1.7 1.9 1.5 2.6 1.9
6.5 50 5 1.1 1.8 2 1.5 2.7 2.1
6.8 50 5 1.2 2.6 4.1 - - -
組胺酸水準之影響
研究了10至100 mM之組胺酸水準範圍，中心點調配物組成為120 mg/mL Nivo、250 mM蔗糖、50µM DTPA、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% w/v PS80，pH 6.0。不同組胺酸水準下根據SEC之最終HMW關於該應力條件之最終時間點列於表87中。資料表明，組胺酸不僅為調配物中之緩衝劑，且亦具有保護特性，較高組胺酸水準可增加蛋白質之穩定性。在低組胺酸濃度下，保護行為最小化，尤其是低於20 mM組胺酸。此處之資料表明低於20 mM組胺酸水準之落差。此落差之精確位置未知。預期15mM-100mM之組胺酸濃度範圍具有相當且良好的穩定性。 表 87 ： 研究 2 ， 在針對不同組胺酸水準研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。組成包括： 120 mg / mL Nivo ， 250 mM 蔗糖， 50µM DTPA ， 5 mM Met ， 0 . 05 % w / v PS80 及 2000 U / mL rHuPH20 ， pH 6 . 0
根據SEC之HMW%
His (mM) 5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M
10 mM 1.1 2.1 4.1
20 mM 0.9 1.4 1.7
20 mM 0.9 1.4 1.8
50 mM 0.9 1.1 1.5
100 mM 0.8 0.9 1.3
蛋白質濃度之影響
研究了100至175 mg/mL之蛋白質濃度範圍，中心點調配物組成為20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50µM DTPA、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% w/v PS80，pH 6.0。不同蛋白質濃度下根據SEC之最終HMW關於該應力條件之最終時間點列於表88中。較高蛋白質濃度已顯示較高HMW形成，且與較高蛋白質濃度下之其他研究一致。 表 88 ： 研究 2 ， 在針對不同蛋白質濃度研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。組成包括 ： 20 mM 組胺酸 、 250 mM 蔗糖、 50µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 及 2000 U / mL rHuPH20 ， pH 6 . 0
蛋白質濃度 (mg/mL) 根據SEC之HMW%
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M
100 0.9 1.3 1.6
120 0.9 1.4 1.7
120 0.9 1.4 1.8
175 1.2 3 6.3
蔗糖濃度之影響
研究了0至400 mM之蔗糖濃度範圍，中心點調配物組成為120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、50µM DTPA、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% w/v PS80，pH 6.0。不同蔗糖濃度下根據SEC之最終HMW關於該應力條件之最終時間點列於表89中。低蔗糖水準具有較低穩定性。在10-400 mM蔗糖範圍內，升高的HMW值無關緊要。 表 89 ： 研究 2 ， 在針對不同蔗糖濃度研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。組成包括： 120 mg / mL Nivo ， 20 mM 組胺酸， 50µM DTPA ， 5 mM Met ， 0 . 05 % w / v PS80 及 2000 U / mL rHuPH20 ， pH 6 . 0
蔗糖 (mM) 根據SEC之HMW%
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M
0 1 1.9 2.3
10 1 1.7 2.2
250 0.9 1.4 1.7
250 0.9 1.4 1.8
400 0.9 1.2 1.6
PS80濃度之影響
研究了0至0.10 w/v PS80之PS80濃度範圍，中心點調配物組成為120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50µM DTPA、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20，pH 6.0。不同PS80濃度下根據SEC之最終HMW關於該應力條件之最終時間點列於表90中。觀測到的HMW值在所研究之調配物組成範圍內係恆定的。 表 90 ： 研究 2 ， 在針對不同 PS80 濃度研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。組成包括 ： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 及 2000 U / mL rHuPH20 ， pH 6 . 0
根據SEC之HMW%
PS80 (%) 5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M
0 0.9 1.4 1.7
0.01 0.9 1.4 1.7
0.05 0.9 1.4 1.7
0.05 0.9 1.4 1.8
0.10 0.9 1.4 1.7
氮氣頂隙之影響
為瞭解調配物之益處-使用氮氣頂隙來確定其在氧化應力以及熱應力期間對HMW的影響。所研究之兩種調配物為以下目標中心點調配條件：120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20，0.05% w/v PS80，pH 6.0，及無DTPA或Met之條件：120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% w/v PS80，pH 6.0。具有氮氣及空氣頂隙之此兩種調配物之根據SEC之最終HMW關於該應力條件之最終時間點列於表91中。 表 91 ： 研究 2 ， 在針對具有及不具有氮氣頂隙之 2 種 調配物研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。 中心組成為 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 及 2000 U / mL rHuPH20 ， pH 6 . 0 。 0 DTPA 0 Met 係指自中心點調配物移除兩種抗氧化劑 ( DTPA 及 Met ) 。
調配物 – 頂隙 根據SEC之HMW%
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT/30 3M RT/RL 1M MPL 3M
中心-空氣 0.9 1.4 1.7 1.2 1.9 1.5
中心- N 2 1 1.4 1.7 1.2 1.5 1.5
0 DTPA 0 Met -空氣 1 2.6 3.3 1.6 2.3 3.3
0 DTPA 0 Met - N 2 1 1.7 2.4 1.4 1.7 3
資料展示相對於無DPTA或Met之組合物，具有DTPA及Met兩者之中心點調配物的明顯益處。在不添加抗氧化劑(犧牲劑及螯合劑)之情況下，具有氮氣頂隙係有益的。感興趣的行為係在RT/RL條件下中心點調配物之行為略有不同。此處，氮氣頂隙有助於減少HMW形成。然而，在MPL條件下，當螯合劑及犧牲劑均存在時，氮氣頂隙不會影響HMW形成。與不含犧牲劑或螯合劑相比，含有犧牲劑及螯合劑兩者之調配物能夠保護HMW形成免受來自微弱光(3天)、過氧化物及金屬之氧化應力的影響。
統計模型：pH 6 50μM DTPA濃度調配物之最終時間點
評估總% HMW之統計模型。由於在大多數應力條件下觀測到的影響很小/可忽略不計，因此僅針對應力條件的一個子組開發統計模型。亦探索各種混合模型(未示出)，假設%HMW相對於時間(天)之線性模型。由於設計限制，估計調配物間及調配物內變異性之自由度數目有限，且關鍵比較之大約0.15至0.25%平均信賴區間之%HMW均方根誤差(RMSE)在12週時之應力條件下基本重疊。來自第一研究之結果估計兩個關鍵調配物比較之平均%HMW差異為0.125% (上述)。所有分析均使用JMP 15.2.0進行。
對25℃、35℃及MPL條件之密切評估為此三種應力條件在pH 6下在至少最長時間點之非是(no-yes) DTPA有益效應提供了弱至明顯證據。此外，對於無DTPA pH 6調配物，觀測到0-5mM非是甲硫胺酸效應。為了簡化結果呈現，僅在最後量測之時間點為此三個應力條件中之每一者開發統計模型。即使限於僅pH 6之調配物時，在各種統計模型下亦觀測到大約0.15至0.25%之%HMW RMSE。為了進一步減少對可能不充分的經驗模型的需求，僅概述了50 μM DTPA之統計結果。模型複雜性及/或非線性(例如由於包括無DTPA樣品)可能會增加錯誤指定或未充分指定模型之殘差變異數。
圖20展示在具有平滑曲線趨勢估計之三個最後採樣之應力條件下，SEC %HMW相對於甲硫胺酸濃度之圖。
對於35℃ 3個月樣品，相對於剩餘信號，複製變化性較大。對於25℃-6個月量測，僅獲得三個不同的值。此兩種熱應力條件明顯幾乎無趨勢。對於3個月時之組合氧化應力-MPL條件，近似線性趨勢最明顯。
估計各條件之簡單線性回歸以評估觀測到的關係之強度(圖21A-21C)。
僅組合氧化應力條件(MPL)線性回歸為顯著的(p約0.0088)。此等資料表明在50 μM DTPA存在下增加甲硫胺酸濃度對此氧化應力條件有明顯好處。未偵測到模型失擬(曲線模型亦被估計為具有改進的擬合，未示出)，且所有三個回歸之平均%HMW RMSE大約為0.06至0.08%。50μM DTPA-0 mM甲硫胺酸調配物在3個月時之預測平均%HMW為1.73% (95%信賴區間1.62-1.83)；對應50 μM DTPA-5 mM甲硫胺酸估計值為1.63% (95%信賴區間1.55-1.71)。此等估計值之間的平均差異大約等於在第一研究(上述)中觀測到的相同兩種調配物在MPL氧化應力條件下3個月時的0.125%平均差異。
電荷變異體
使用iCIEF評估電荷變異體。詳細研究了一子組樣品，其聚焦於具有兩種抗氧化劑之益處，以評估電荷變異體對Nivo之影響。針對MPL氧化應力條件之3 M時間點及35℃熱應力之3 M時間點來測試樣品。結果圖示於圖22A-22B中。
對於無抗氧化劑(無)之條件，%酸性物種最高。單獨甲硫胺酸之保護作用低於僅具有DTPA或具有DTPA及甲硫胺酸兩者。當在35℃條件下儲存時，單獨具有DTPA之調配物與具有DTPA及Met兩者之調配物之間無差異。在MPL應力下3個月，可在3個月時間點處觀測到略微益處。
CE-SDS
CE-SDS用於量測Nivo之經削減物種。詳細研究了一子組樣品，其聚焦於具有兩種抗氧化劑之益處，以評估調配物對保護Nivo免受氧化之影響。針對MPL氧化應力條件之3 M時間點及35℃ 3 M時間點來測試樣品。主峰面積%之結果列於表92中。相對於初始(T0)樣品，在樣品中未偵測到主峰面積之重大差異。在所研究之調配物中未偵測到在所研究之研究條件下LMW物種形成的變化。 表 92 ：研究 2 ，在 MPL 條件及 35 ℃ 應力下隨時間推移之 CE - SDS 主峰面積 % 。對於具有 DTPA 及 Met 之 調配物以及僅具有 DTPA 之 樣品製備重複樣品。 調配物 具有 50 µM DTPA 及 5 mM Met 濃度。所有調配物亦含有 120 mg / mL Nivo 、 20mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 0 . 05 % w / v PS80 、 2 , 000 U / mL rHuPH20 ， pH 6 . 0
調配物 CE-SDS主峰(%)
T0 35CT3M MPL3M
DTPA及Met 97.0 97.2 98.5
DTPA及Met 97.0 97.6 97.6
DTPA 97.0 96.7 98.2
DTPA 96.9 98.2 97.9
Met 96.7 96.7 98.0
無 96.3 96.8 98.0
酶活性
量測酶活性以測定rHuPH20酶之穩定性。詳細研究了一子組樣品，其聚焦於具有兩種抗氧化劑之益處，以評估調配物對保護酶免受氧化(主要降解機制)之影響。針對MPL氧化應力條件之3 M時間點及35℃ 3 M時間點來測試樣品。結果圖示於圖23A-23B中。
對於無抗氧化劑(無)之條件，酶降解最高。單獨甲硫胺酸之保護作用低於僅具有DTPA。具有DTPA及甲硫胺酸兩者提供最佳保護。在MPL應力條件下來看，益處更加明顯，但在35℃與MPL條件之間觀測到一致趨勢。此等結果與以上研究1中觀測到的結果一致。
PS80穩定性
量測PS80穩定性以確定關鍵賦形劑PS80之穩定性。詳細研究了一子組樣品，其聚焦於具有兩種抗氧化劑之益處，以評估調配物對保護PS80免受氧化之影響。針對MPL氧化應力條件之3 M時間點及35℃ 3 M時間點來測試樣品。結果圖示於圖24A-24B中。
在MPL應力條件下，對於無DTPA之條件(資料未示出)，PS80降解較高且PS80水準降至零。在3 M 時間點處之35℃條件下，可觀測到無與單獨Met之間的區別。PS80降解動力學在無抗氧化劑(無)之條件下最快，接著為單獨甲硫胺酸條件。MPL及35℃應力條件均在僅具有DTPA之調配物與具有DTPA及甲硫胺酸兩者之調配物之間展示與PS80相當的保護。自PS80穩定性角度來看，關鍵特性為包括DTPA。此等結果與研究1中觀測到的結果一致。
調配物範圍及替代賦形劑
建立研究2以確定主要藉由SEC觀測到調配物組成之益處的影響及範圍。調配物在單獨熱應力(5、25、35℃)或熱及氧化應力(MPL、RT/RL)下受應力。
基於此研究，最佳維持穩定性之調配物組成範圍如下：pH：5.2-6.5 His；組胺酸：15-100 mM；DTPA 10-200 µM (替代物：100 µM EDTA)；Met：1-20 mM (替代物：10 mM Trp)；rHuPH20：0-5,000 U/mL；PS80：0.01-0.1% w/v (替代物：PS20 0.05% w/v及泊洛沙姆0.2 mg/mL)；糖：10-400 mM蔗糖；及蛋白質：100-175 mg/mL。
中心點調配物為：120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、5 mM Met、50 µM DTPA、0.05% w/v 聚山梨醇酯80 (pH 6.0)與2,000 U /mL rHuPH20。
組胺酸緩衝液對於調配物至關重要-使用丁二酸鹽作為緩衝液之相同pH下之調配物未展現足夠穩定性(表91)。組胺酸具有穩定作用，在較高濃度下展示增加的穩定性。在此研究中，研究了至多100 mM組胺酸(表87)，但預期更高組胺酸濃度亦將保持穩定。在低組胺酸濃度下，穩定性下降。特定言之，在小於10 mM之組胺酸濃度下，% HMW增加。15-100 mM之間的範圍對最小化HMW物種形成至關重要。
pH範圍亦至關重要-超過pH 6.5之較高pH展示HMW對穩定性的增加(表85)。
不存在蔗糖之Nivo使得HMW形成水準略高(表89)。10-400 mM之間的蔗糖展現良好穩定性。
此處研究之0-0.1%之間的PS80水準保護Nivo免受HMW形成影響(表90)。替代界面活性劑：PS20 (0.05% w/v)及泊洛沙姆(0.2 mg/mL) 對Nivo展現良好保護，使其免受HMW形成影響(表81)。
添加0至5,000 U/mL之間的範圍內之酶不影響Nivo穩定性(表80)。
此報導表明需要兩種抗氧化劑。需要一種犧牲劑(Met)外加一種螯合劑(DTPA)。特定言之，此兩種抗氧化劑比其替代賦形劑表現更好(表82)。為了確認所選賦形劑之優越性，已在更高濃度下測試了替代氧化劑之效能。在RT/RL條件以及MPL應力條件下，用10 mM Trp替代5 mM Met均引起更高HMW。用100 µM EDTA替代50 µM DTPA在RT/RL條件下表現類似，但在加速熱條件及MPL應力條件下展示更高的HMW物種形成。組合調配物具有氧化保護，不需要氮氣頂隙來保護免受MPL應力影響(表91)。
10-200 μM之間的DTPA水準已證明類似穩定性(表83)。具有10 µM之最低DTPA濃度至關重要，但更高水準之DTPA不會增加Nivo之穩定性。
Met增加已證明在1-20 mM水準範圍內之可接受穩定性(表84)。對於Met之情況，建立一個統計模型，且對於MPL應力條件，發現線性回歸係顯著的(上述)。此表明具有Met有明顯益處，且更高濃度之Met有利於對抗MPL應力。
等級次序
具有兩種抗氧化劑之益處藉由監測以下各者證明：藉由SEC及iCIEF監測之Nivo穩定性、藉由觀察酶活性監測之rHuPH20穩定性以及藉由觀察PS80水準監測之PS80穩定性。研究之此部分聚焦於一子組樣品，其聚焦於對兩種抗氧化劑之需求(兩者相對於僅一者相對於無一者)。對於此等品質屬性中之每一者，調配物效能及最佳調配物至最差(自上至下)調配物之排序列於表93中。 表 93 ：研究 2 - 能夠區分調配物且對此等調配物進行排序之所研究品質屬性
品質屬性 Nivo SEC % HMW Nivo iCE %酸性 rHuPH20酶活性 PS80穩定性
(最佳) Met + DTPA Met + DTPA Met + DTPA Met + DTPA = DTPA
排序 DTPA DTPA DTPA Met
   Met Met Met 無
(最差) 無 無 無   
根據SEC之Nivo穩定性展示HMW回應於氧化應力(MPL)而增加。抗氧化劑的存在使HMW增加最小化。Met及DTPA之組合展現比單獨的DTPA更好的穩定性，單獨的DTPA勝過Met，Met勝過不具有DTPA或Met之調配物。此等結果與研究1一致。
電荷變異體(上述)展示在無DTPA或Met之情況下，%酸性物種增加至最高。單獨具有Met展示熱(35℃)及氧化(MPL)應力條件下之增加速率略慢。在熱應力條件下，單獨具有DTPA與具有DTPA及Met兩者相當；但是，在MPL條件下，與單獨的DTPA相比，在兩者之情況下觀測到略微益處。
rHuPH20酶活性響應於熱及氧化應力兩者而降低。對於氧化應力(MPL)，可最佳觀察到調配物組成益處。在存在Met及DTPA兩者之情況下，酶活性得到最佳保存。相對於單獨的DTPA具有可量測酶活性下降，單獨的DTPA相對於單獨的Met具有可量測酶活性下降，單獨的Met相對於無Met或DTPA具有可量測酶活性下降。此行為在熱應力(35℃)條件下係一致的，但單獨的DTPA與兩者(DTPA及Met)之間的差異較小。
對於具有螯合劑(DTPA)之條件觀測到PS80保護。Met不保護PS80免於降解。
對各種調配物組合之氧化應力(MPL-過氧化物、金屬及3天光照之組合外加30℃下之熱應力)進行研究之關鍵結果表明，在具有50 μM DTPA及5 mM Met兩者之調配物中存在益處。僅具有此等抗氧化劑中之一者的穩定性不如具有螯合劑及犧牲性抗氧化劑兩者。此等結果與研究1結果一致。
結果-研究3
在此研究中，目標為理解分子在不同包裝組件(預填注射器及貼片泵)中之行為。此外，相對於原始調配物組成有一些變化，以確定可觀測到此調配物之益處的範圍。此等變化包括： i.15-100 mM之組胺酸範圍。研究2展示在10 mM之低組胺酸濃度下HMW增加。 ii.0-10,000 U/mL之更寬酶水準，相比之下，研究2僅涵蓋至多5,000 U/mL。 iii.100-200 mg/mL之更寬蛋白質濃度。研究2涵蓋至多150 mg/mL。
此研究亦在調配物中不存在酶之情況下使用此等確認調配物範圍：pH：5.2-6.5 His；組胺酸：15-100 mM；DTPA：10-200 µM (替代物：100 µM EDTA)；Met：1-20 mM (替代物：10 mM Tryp)；PS80：0.01-0.1% w/v (替代物：PS20及泊洛沙姆0.2 mg/mL)；糖：10-400 mM蔗糖(替代物：10%山梨糖醇及海藻糖)；蛋白質：100-200 mg/mL；及初級包裝：小瓶、PFS及貼片泵。
應注意，在此研究中，山梨糖醇及海藻糖已正確添加至TFF緩衝液中，其在研究2中被遺漏。由於酶對HMW形成無影響，此等結果亦將用於理解此等替代糖與酶之行為。
此產生46種調配物，其中與研究2類似，調配物一次研究一個變量，所有其他因素均在目標組成處。在此研究中，小瓶及貼片泵主要在120 mg/mL下研究，且PFS係在150 mg/mL Nivo目標濃度下。目標調配物組成為：20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、5 mM Met、2,000 U/mL rHuPH20、0.05% w/v PS80，pH 6.0，具有空氣頂隙。應注意，對於中心點條件及具有50 µM DTPA且無Met之條件，設計中存在重複的獨立調配物製備。
在此研究中，使用SEC研究了Nivo之穩定性，且由於缺乏來自研究3之微粒資料，因此對所選時間點(MPL 3M、RT30 3M、5C 6M及25C 6M)進行了微粒分析。
尺寸排阻層析法
尺寸排阻層析法為用於監測納武單抗之穩定性的主要工具。
再現性及酶影響
與研究2一樣，中心點條件及0 Met條件之設計中包括重複及獨立的調配物製備；但對於研究3，調配物不包括酶。在表94中列出了研究2及3之兩種調配物之應力及時間點的SEC最終HMW。此資料展示研究2及3以及研究中獨立準備的再現性。資料始終在彼此之0.1% HMW範圍內。 表 94 ： 研究 2 及 3 - 在針對重複樣品研究之各應力條件下之最後時間點的 SEC 高分子量物種 - 中心及 0 Met 調配物。中心調配物組成： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 ， pH 6 . 0 。 0 Met 組成： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 0 . 05 % w / v PS80 ， pH 6 . 0 。
描述符 酶(U/mL) 根據SEC之HMW%
研究 - 形式 5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT30 3M MPL 3M
研究3 - 12 0 Met 0 1.0 1.5 1.8 1.3 1.9
研究3 - 13 0 Met 0 1.0 1.5 1.8 1.3 1.8
研究2 - 21 0 Met 2000 0.9 1.5 1.8 1.3 1.8
研究2 - 29 0 Met 2000 0.9 1.5 1.8 1.3 1.8
研究3 - 10 中心 0 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
研究3 - 11 中心 0 1.0 1.4 1.7 1.2 1.5
研究3 - 5 中心 2000 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
研究2 - 15 中心 2000 0.9 1.4 1.7 1.2 1.5
研究2 - 28 中心 2000 0.9 1.4 1.8 1.3 1.6
此研究以及研究2 (表80)展示，在所研究之全部酶水準(0-10,000 U/mL)中，使用或不使用酶對Nivo穩定性無影響(表95)。在整個研究3中，存在用及不用酶測試之重複組合物。此等結果非常一致(表95、表96、表97、表98、表99、表100、圖25A及圖25B)，且允許吾等在使用及不使用酶之情況下自信地轉譯知識。 表 95 ： 研究 3 - 在針對不同酶含量研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。 調配 物 組成： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w/v PS80 ， pH 6 . 0 。
酶 (U/mL) 根據SEC之HMW%
T0 5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT30 3M MPL 3M
0 0.8 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
0 0.8 1.0 1.4 1.7 1.2 1.5
2000 0.8 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
10000 0.8 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
10000 0.8 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
初級包裝
此研究評估三種不同類型之初級包裝：小瓶、預填充注射器及貼片泵。針對中心點調配物組成：20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、5 mM Met、0.05% w/v PS80，pH 6.0中120 mg/mL之蛋白質濃度，各種初級包裝之資料展示於表96中。不存在由初級包裝差異所致之HMW形成差異。 表 96 ： 研究 3 - 在針對 120 mg / mL Nivo 下之不同 初級包裝研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。 調配 物 組成： 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 ， pH 6 . 0
初級包裝 酶(U/mL)    根據SEC之HMW%
T0    5℃  6M 25℃ 6M 35℃  3M RT30 3M MPL 3M
小瓶 0 0.8 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
小瓶 0 0.8 1.0 1.4 1.7 1.2 1.5
小瓶 2000 0.8 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
PFS 0 0.7 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
PFS 2000 0.8 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
貼片泵 0 0.8 0.9 1.4 N/A* 1.2 1.4
貼片泵 2000 0.8 0.9 1.4 N/A* 1.2 1.4
* 由於貼片泵數目有限，因此貼片泵之可用資料有限。
為瞭解PFS組件是否存在任何責任，測試了兩個額外條件：一個摻加1 ppm鎢(W)，且用兩倍於標準BD Neopack注射器中發現之聚矽氧油填充至BD Neopack注射器中。該應力條件之最後時間點處的高分子量值列於表97中，濃度為150 mg/mL，再次使用20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、5 mM Met、0.05% w/v PS80，pH 6.0。未偵測到由鎢或聚矽氧油所致之HMW增加。 表 97 ： 研究 3 - 在針對使用 150 mg / mL Nivo 下之 PFS 組件 研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。 調配 物 組成： 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 ， pH 6 . 0
描述符 酶(U/mL) 根據SEC之HMW%
T0 5℃  6M 25℃ 6M 35℃  3M RT30 3M MPL 3M
0 W摻加PFS 0.8 1.1 1.7 1.9 1.4 1.6
0 2× Si油PFS 0.8 1.1 1.7 1.9 1.4 1.7
0 PFS 0.8 1.1 1.7 2.0 1.4 1.7
2000 W摻加PFS 0.8 1.1 1.7 1.9 1.4 1.7
2000 2× Si油PFS 0.8 1.1 1.7 1.9 1.4 1.7
2000 PFS 0.8 1.1 1.7 1.9 1.4 1.7
蛋白質濃度
初級包裝及酶水準不影響如上文所論述之HMW形成。在100至200 mg/mL之蛋白質濃度範圍內，在中心點調配物組成處跨包裝及酶水準之HMW形成一起列於表98中。中心點調配組成包括20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50µM DTPA、5 mM Met、0.05% w/v PS80，pH 6.0。較高蛋白質濃度已展示較高HMW形成，且與在較高蛋白質濃度下之其他研究及來自研究2之資料一致(表88)。 表 98 ：研究 3 - 在針對不同蛋白質濃度研究之各應力條件下之最後時間點，根據 SEC 之 高分子量物種。 調配 物 組成： 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 ， pH 6 . 0
初級包裝 酶(U/mL) 蛋白質濃度(mg/mL)    根據SEC之HMW%
初級 T0 5℃ 6M 25℃   6M 35℃ 3M RT30 3M MPL 3M
小瓶 0 100 0.7 0.9 1.3 1.5      
小瓶 0 120 0.8 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
小瓶 0 120 0.8 1.0 1.4 1.7 1.2 1.5
小瓶 2000 120 0.8 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
PFS 0 120 0.7 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
PFS 2000 120 0.8 1.0 1.5 1.7 1.2 1.5
PFS 0 150 0.8 1.1 1.7 2.0 1.4 1.7
PFS 2000 150 0.8 1.1 1.7 1.9 1.4 1.7
PFS 0 165 0.8 1.1 1.8 2.1 1.5 1.8
PFS 2000 165 0.9 1.1 1.8 2.0 1.4 1.8
小瓶 0 200 1.0 1.3 2.1 2.5      
PFS 0 200 1.0 1.3 2.2 2.5      
PFS 2000 200 1.0 1.3 2.2 2.5      
小瓶 2000 200 1.0 1.3 2.1 2.5      
替代賦形劑
在研究3中，作為250 mM (8.6%)蔗糖之替代糖，研究兩種替代糖：10%山梨糖醇及10%海藻糖。研究了該等結果以及使用0.05% w/v、0.05% w/v PS20及0.2 mg/mL泊洛沙姆作為PS80之替代界面活性劑的結果且列於表99中。此等結果針對研究2與研究3製成表格，其中研究2具有2,000 U/mL rHuPH20，而研究3不具有rHuPH20。其他賦形劑在目標組成處：目標調配物組成為120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、5 mM Met、0.05% w/v PS80，pH 6.0。在研究2之樣品製備過程中，使用海藻糖及山梨糖醇作為替代賦形劑之調配物存在錯誤，因此未呈現酶資料。 表 99 ： 研究 2 及 3 - 在針對替代賦形劑研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。 研究 2 條件具有 2 , 000 U / mL rHuPH20 ， 研究 3 具有 0 U / mL rHuPH20 。中心點組成： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 50 µM DTPA 、 5 mM Met 、 0 . 05 % w / v PS80 ， pH 6 . 0 。
替代賦形劑 根據SEC之HMW%
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M
研究2 研究3 研究2 研究3 研究2 研究3
中心 0.9 1.0 1.4 1.5 1.7 1.7
中心 0.9 1.0 1.4 1.4 1.8 1.7
PS20 0.9 0.9 1.3 1.4 1.7 1.7
泊洛沙姆 0.9 1.0 1.3 1.5 1.7 1.7
山梨糖醇    1.3    1.9    2.1
海藻糖    1.6    2.2    2.5
丁二酸鹽 1.3 1.5 3.2 3.2 6.8 5.7
作為替代賦形劑，PS80可用PS20或泊洛沙姆替代，對穩定性之影響最小。此等結果在兩個研究中一致。
以組胺酸為緩衝劑對Nivo穩定性至關重要，且無法用丁二酸鹽替代。在研究之所有熱應力條件(5℃ 6M、25℃ 6M及35℃ 3M)中，使用丁二酸鹽緩衝液之HMW物種實質性增加，且此在兩個研究中再次保持一致。
糖資料表明，相對於山梨醇或海藻糖，蔗糖具有更好的穩定效應。
作為50 µM DTPA之替代螯合劑，如研究2中所進行地研究了100 µM EDTA。DTPA係一種更好的螯合劑，因此在此處研究更高水準之EDTA。類似地，作為5 mM甲硫胺酸之替代犧牲劑，研究了10 mM色胺酸。由於添加螯合劑及犧牲氧化劑會影響抗氧化保護，因此在熱及氧化應力條件兩者下對此等進行研究。對於研究2及3，使用此等替代賦形劑之SEC最終HMW關於該應力條件之最終時間點列於表100中，其中此處之差異為研究2具有2,000 U/mL rHuPH20，而研究3不具有rHuPH20。調配物組成包括120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80，pH 6.0。
兩個研究之結果彼此類似。例外為0 DTPA及0 Met之情況-其中此自催化HWM增加發生之速度存在更高的可變性。在MPL應力下3個月後列表之% HMW值明確展示在兩個研究中具有DTPA之獨特益處，且與EDTA相比，DTPA為優良螯合劑。類似地，資料展示Met優於Trp。當用5 mM Met及50 µM DTPA調配時，% HMW增加得到最佳控制。此等結果在三個研究中一致。
此等研究展示組胺酸及蔗糖與Met及DTPA之組合均對Nivo穩定性有獨特及有益作用。 表 100 ： 研究 2 及 3 - 在針對 DTPA 及 Met 之 替代賦形劑研究之各應力條件下之最後時間點 ， 根據 SEC 之 高分子量物種。組成包括： 120 mg / mL Nivo 、 20 mM 組胺酸、 250 mM 蔗糖、 0 . 05 % w / v PS80 ， pH 6 . 0 。研究 2 條件具有 2 , 000 U / mL rHuPH20 ， 研究 3 具有 0 U / mL rHuPH20 。
替代賦形劑 根據SEC之HMW%
5℃ 6M 25℃ 6M 35℃ 3M RT30 3M MPL 3M
研究2 研究3 研究2 研究3 研究2 研究3 研究2 研究3 研究2 研究3
5 mM Met 50µm DTPA 0.9 1.0? 1.4 1.5 1.7 1.7 1.2 1.2 1.5 1.5
5 mM Met 50µm DTPA 0.9 1.0? 1.4 1.4 1.8 1.7 1.3 1.2 1.6 1.5
10 mM Trp 50µm DTPA 0.9 0.9 1.4 1.4 1.8 1.7 1.2 1.2 1.9 1.9
5 mM Met 100 µM EDTA 0.9 1.0? 1.5 1.5 1.8 1.8 1.3 1.3 2.1 2
0 mM Met 0 µM DTPA 1.0? 1.0? 1.7 2.6 2.1 3.2 1.3 1.6 3.7 4
0 mM Met 50 µM DTPA 0.9 1.0? 1.5 1.5 1.8 1.8 1.3 1.3 1.8 1.8
0 mM Met 50 µM DTPA 0.9 1.0? 1.5 1.5 1.8 1.7 1.3 1.3 1.8 1.7
賦形劑範圍
與研究2類似，在研究3中研究不同賦形劑範圍。此等結果與研究2之結果一致且契合，正如研究2中之關鍵發現所證明，Met濃度之影響隨著濃度增加而具有有益效果。所有三個研究之結果展示於圖25中。研究1僅評估0及5 mM Met值，且研究2聚焦於含酶之條件，且研究3聚焦於不含酶之條件。在整個此實例中，已證明該酶不會影響Nivo穩定性，且此發現在此再次得到證明。
所有3個研究之回歸圖展示於圖26中。三個研究極好地彼此重疊。0至5 mM甲硫胺酸效應之線性近似在以下中心點組成處為0.19% HMW：120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、50 µM DTPA、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80，pH 6.0。
在研究2及3中，穩定性得到最佳維持之調配物組成範圍如下：pH：5.2-6.5 His；組胺酸：15-100 mM；DTPA：10-200 µM (替代物：100 µM EDTA)；Met：1-20 mM (替代物：10 mM Trp)；rHuPH20：0-5,000 U/mL；PS80：0.01-0.1% w/v (替代物：PS20 0.05% w/v及泊洛沙姆0.2 mg/mL)；糖：10-400 mM蔗糖；蛋白質：100-175 mg/mL；及初級包裝：小瓶、PFS、貼片泵。
中心點調配物為：120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、5 mM Met、50 µM DTPA、0.05% w/v 聚山梨醇酯80 (pH 6.0)與2,000 U /mL rHuPH20。
此調配物之pH範圍至關重要。超過6.5之pH，觀測到HMW增加，且此在研究2及3兩者中一致。基於資料建議調配更接近pH 6之調配物。
組胺酸作為緩衝劑在調配物中至關重要，且具有穩定作用。來自研究2及3之資料一致。作為緩衝劑之丁二酸鹽未展現足夠穩定性。較低組胺酸濃度導致較高HMW形成。接近15 mM組胺酸水準時，存在穩定性降低之落差。在此研究中，研究了至多100 mM組胺酸，但預期更高濃度將保持穩定。
已研究0至10,000 U/mL之間的酶範圍且該酶範圍不影響Nivo之穩定性。此在研究2及3中一致。
0-0.1% w/v之間的PS80含量保護Nivo免受HMW形成影響。替代界面活性劑PS20 (0.05% w/v)及泊洛沙姆(0.2 mg/mL) 對Nivo展現良好保護，使其免受HMW形成影響。
蔗糖含量在10-400 mM之間的Nivo展現良好穩定性。作為替代穩定劑，海藻糖及山梨糖醇在儲存時展示與蔗糖相比更高的HMW形成。
在測試之小瓶、PFS及貼片泵中未觀測到初級包裝對穩定性的影響。
濃度範圍在10-200 µM DTPA之間的DTPA展示相同穩定性。即使在10 µM低水準下存在亦足以保護Nivo。在研究2及3中均未觀測到濃度依賴性。
增加之Met水準證明了在1-20 mM範圍內之可接受穩定性。結果在所有研究中一致(圖26)。在Met之情況下，建立了一個統計模型。對於MPL應力條件，發現線性回歸對於研究2及3均為顯著的。此表明具有Met有明顯益處，且更高濃度之Met有利於對抗MPL應力。
微粒
研究2不包括微粒分析。在研究3中，對所選時間點(MPL 3M、RT30 3M、5℃ 6M及25℃ 6M)進行微粒分析。一個樣品之微粒計數升高：用丁二酸鹽-調配物25替代組胺酸作為緩衝劑之樣品。在25C下6個月之HMW展示≥ 10 µm 之粒子為6527個/毫升。其餘樣品中≥ 10 µm之粒子為少於130個/毫升，遠低於USP ＜788＞粒子規格限制。此等資料展示將緩衝劑轉換為丁二酸鹽的問題，即使存在所有其他調配物組分亦如此。
結論-研究3
在研究中，除了小瓶以外，亦研究3種不同的包裝組件(預填充注射器及貼片泵)，且證實其與調配物一起表現良好。
該研究亦旨在瞭解最佳保持穩定性之全範圍。發現之範圍(來自研究2及3之組合)如下：pH：5.2-6.5 His；組胺酸：15-100 mM；DTPA：10-200 µM (替代物：100 µM EDTA)；Met：1-20 mM (替代物：10 mM Trp)；rHuPH20：0-5,000 U/mL；PS80：0.01-0.1% w/v (替代物：PS20 0.05% w/v及泊洛沙姆0.2 mg/mL)；糖：10-400 mM蔗糖；蛋白質：100-175 mg/mL；及初級包裝：小瓶、PFS、貼片泵。對於無酶之樣品，此等範圍相同。
中心點調配物為：120 mg/mL Nivo用於小瓶及150 mg/mL Nivo用於PFS，兩者均含有20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、5 mM Met、50 μM DTPA、0.05% w/v聚山梨醇酯80 (pH 6.0)與2,000U/mL rHuPH20。
此調配物之pH範圍至關重要。超過6.5之pH，觀測到HMW增加。組胺酸作為緩衝劑在調配物中至關重要，且具有穩定作用。較低組胺酸濃度導致較高HMW形成。接近15 mM組胺酸水準時，存在穩定性降低之落差。在此研究中，研究了至多100 mM組胺酸，但預期更高濃度將保持穩定。DTPA的存在對於維持Nivo穩定性而言重要，但未觀測到濃度依賴性。Met增加表明對Nivo有更高的保護作用。具有Met有明顯益處，且更高濃度之Met有利於對抗MPL應力。
作為緩衝劑之丁二酸鹽未對Nivo表現出足夠穩定性，形成可溶性聚集體(根據SEC之HMW增加)及不溶性聚集體(根據MFI之粒子)。作為蔗糖之替代穩定劑，海藻糖及山梨糖醇在儲存時展示更高的HMW形成。EDTA不如DTPA優越，且Tryp不如Met優越，即使在較高濃度下亦如此。此等研究展示組胺酸及蔗糖與Met及DTPA之組合均對提高Nivo穩定性有獨特及有益作用。 實例6 - 使用核磁共振(NMR)光譜學及分子動力學(MD)探測納武單抗-賦形劑相互作用
已進行NMR實驗及計算建模以研究納武單抗-賦形劑相互作用。兩種方法均證實存在優先的蛋白質-糖相互作用，且展示對蔗糖比甘露糖醇、海藻糖、甘胺酸、山梨糖醇或丁二酸鹽更強的結合行為。結果可指示糖在蛋白質調配物中之作用的關鍵分子機制。
糖用於穩定蛋白質調配物及防止蛋白質聚集體的形成。此實例之目標為更好地理解穩定機制，確定為何一些糖比其他糖更有效，且幫助指導使用核磁共振(NMR)及分子動力學(MD)方法之組合的調配物選擇。採用STD (飽和轉移差異) NMR實驗來量測蛋白質-配位體相互作用及結合(參見Angulo J.等人, Chem. Eur. J., 16:7803-7812 (2010)，其以全文引用之方式併入本文中)。
STD NMR實驗在NEO 700 Bruker NMR光譜儀上使用脈衝序列 stddiff在283 K之ICONNMR中進行NMR資料採集。使用3-4.5秒之再循環延遲。對具有賦形劑甘胺酸、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇及丁二酸鹽之納武單抗樣品(21.3 mg/ml濃度)進行NMR實驗以獲取各糖與納武單抗之結合效率。實驗係在一系列賦形劑濃度下進行，且將差分光譜中積分峰之強度擬合至Michaelis-Menten方程式，以評估賦形劑與蛋白質之間的相互作用是否具有特異性。特定相互作用在差分光譜中產生信號之飽和效應。
分子動力學(MD)係一種電腦模擬方法，用於在原子水準上模擬分子之間的相互作用。此處，模擬設置為含有一個納武單抗Fab基團、組胺酸緩衝劑(15 mM當量)及賦形劑分子(大約190 mM當量)。在獨立模擬中研究各賦形劑分子。模擬細胞使用MOE 2019.0101軟體(Molecular Operating Environment 2019.0101; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Canada, 2017)設置且模擬使用NAMD 2.12 (Phillips, J. C.等人, J. Comp. Chem, 26:1781-1802 (2005))運行。
藉由首先計數有多少賦形劑分子在距Fab基團之任何原子的氫鍵距離(＜2A)內來分析MD結果。為了區分賦形劑之緊密結合相互作用位姿與更輕微結合相互作用位姿，進行了集群分析，以對各獨立賦形劑之類似結合位姿進行分組，且對彼等位姿在模擬中佔據之頻率進行排序。
STD NMR結果展示蔗糖具有最小Kd (解離常數)值，展示納武單抗mAb關於海藻糖、甘胺酸及甘露糖醇、山梨糖醇及丁二酸鹽之最強相互作用(圖26)。
圖27展示在MD模擬之最後8 ns期間在納武單抗Fab基團之2 Å內之糖分子的平均數目。不同賦形劑之間可見顯著差異，其中蔗糖分子相互作用最多，且甘胺酸相互作用最少。相互作用數目之總體趨勢為蔗糖＞甘露糖醇=海藻糖＞甘胺酸。蔗糖分子之相互作用頻率為甘胺酸之超過五倍，且比甘露糖醇高約50%，甘露糖醇之相互作用數目為次最高。定性地，此等結果與NMR結果一致，但由於STD-NMR實驗對結合強度敏感，而非僅僅相互作用數目，吾人使用集群分析進一步探索MD中之相互作用的強度。
圖28A-28C展示藉由集群分析為各賦形劑鑑定之獨特結合位點的位置。在視覺上，賦形劑之間的差異很明顯，甘露糖醇(圖28C)、海藻糖(圖28E)及蔗糖(圖28D)之結合位點數目遠多於山梨糖醇(圖28B)及甘胺酸(圖28A)，與圖27中之趨勢匹配。圖29A-29B展示為各賦形劑鑑定之獨特位點之數目，其中圖29A為弱-中結合，且圖29B為強結合位點。在模擬中僅蔗糖、海藻糖及山梨糖醇具有強結合位點，其中海藻糖及山梨糖醇有1個此類位點，且蔗糖有7個。對此等位點之進一步分析表明，在此等強結合位姿中，蛋白質與賦形劑分子之間形成3-4個氫鍵，證實此等位姿非常有利，且可為由STD-NMR結果鑑定之交換位點的良好候選者。應注意，強結合海藻糖及山梨糖醇位點位於Fab之恆定域中，且靠近鉸鏈區，在鉸鏈區可能存在額外的空間相互作用，該等空間相互作用將阻止與完整mAb的結合。
NMR結果表明，與甘胺酸、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇及丁二酸鹽相比，僅蔗糖與納武單抗強烈相互作用/結合。MD結果表明，研究之所有糖均在一定程度上相互作用，偏好為：蔗糖＞甘露糖醇≥海藻糖＞甘胺酸＞山梨糖醇。MD叢集分析展示，僅蔗糖及海藻糖具有強結合相互作用，該等相互作用藉由與Fab上暴露之殘基的非特異性及特異性相互作用來穩定。僅對蔗糖之強結合位點的觀測結果與NMR觀測結果及MD結果相關，因此蔗糖之差異行為(Kamerzell, T.J.等人, Advanced Drug Delivery Reviews, 63:1118-1159 (2011))使其成為穩定蛋白質之更好賦形劑。蔗糖結合位點之較大總數可解釋為何蔗糖對所測試分子展示最佳聚集抑制。 實例7 - 對額外玻尿酸酶與納武單抗之分析
納武單抗皮下調配物包括玻尿酸酶(rHuPH20)。在當前研究中，將評估納武單抗與rHuPH20之替代類似物的相容性。替代酶變異體將在以下當前調配物組成中置於穩定狀態(例如在5℃、25℃或35℃下)：含120 mg/mL納武單抗之20 mM組胺酸(pH 6.0)、250 mM蔗糖、0.05%聚山梨醇酯80、5 mM甲硫胺酸、50 µM噴替酸及2000 U/mL rHuPH20。
將評估rHuPH20之各種替代類似物與納武單抗皮下調配物之組合。將考慮之例示性替代類似物包括但不限於具有選自SEQ ID NO: 5-263中所示之胺基酸序列之胺基酸序列的酶。舉例而言，具有SEQ ID NO: 92中所示之胺基酸序列之rHuPH20的替代類似物將在以下當前調配物組成中置於穩定狀態：含120 mg/mL納武單抗之20 mM組胺酸(pH 6.0)、250 mM蔗糖、0.05%聚山梨醇酯80、5 mM甲硫胺酸、50 µM噴替酸及rHuPH20 (例如2000 U/mL)；其中rHuPH20具有SEQ ID NO: 92中所示之胺基酸序列。
將在各時間點量測以下各者：pH、蛋白質濃度及SEC。將測試所選樣品之微粒物質(使用HIAC)及酶活性。將保留足夠樣品用於PS-80分析及根據CD-SDS及iCiEF之分析，且將在必要時進行測試。對於各時間點，將準備6 mL用於分析。
總共22個小瓶將每個樣品3 mL填充，以覆蓋11個時間點。此將藉由用80 mL調配物製備樣品來進行，以考慮使用0.22 µM PES過濾器過濾期間的損失。經過濾之藥品將填充至去熱原之3 cc 小瓶(Schott 1型玻璃)中，且用高壓滅菌之13 mm Daikyo塞子(D-21-7S，塗有Fluorotec之血清)塞住。小瓶將被旋緊且以直立位置穩定放置。
圖1呈現與作為根據實例1之調配物中之蔗糖濃度之函數的納武單抗皮下(SC)注射調配物之重量莫耳滲透濃度及黏度相關之資料的圖形表示。X軸表示蔗糖濃度(以mM為單位)，且Y軸表示調配物重量莫耳滲透濃度(以mOsm/kg為單位)。實心圓及實線表示重量莫耳滲透濃度值，且實線X及虛線表示黏度值。
圖2呈現與75 mM添加之精胺酸對根據實例1之納武單抗皮下(SC)注射調配物黏度之影響相關之資料的圖形表示。X軸表示蛋白質濃度(以mg/mL為單位)，且Y軸表示在20℃下之黏度(以cP為單位)。實心方塊表示包含添加之精胺酸的樣品，且實心菱形表示未添加精胺酸之樣品。
圖3為關於評估各種劑量之單獨或與玻尿酸酶(例如，rHuPH20)組合皮下投與之抗PD-1抗體(例如，納武單抗)之安全性及功效之研究的示意圖。
圖4為用於投與納武單抗之組合SC/IV PPK模型之預測檢查的線圖說明。個別點表示所觀測資料。該等線分別表示所觀測資料之第5、第50及第95百分位數。陰影區域表示預測資料之第5 (最低趨勢線)、第50 (中間趨勢線)及第95 (最高趨勢線)百分位數的基於模擬之90% CI。Conc=濃度；Nivo=納武單抗；Pred-Corr=預測校正。
圖5A-5C為按腫瘤類型說明Cavgd28 (圖5A)、Cmind28 (圖5B)及Cmax1 (圖5C)暴露之預測幾何平均比(SC/IV)的盒狀圖。CRC=大腸直腸癌；HCC=肝細胞癌；Mel=黑色素瘤；NSCLC=非小細胞肺癌；且RCC=腎細胞癌。
圖6為有關評估與每2週一次IV投與之3 mg/kg納武單抗相比，每4週一次皮下投與之1200 mg納武單抗與玻尿酸酶(例如，rHuPH20)之組合之安全性及功效的研究示意圖。
圖7為說明在3 mg/kg納武單抗IV每2週一次、10 mg/kg納武單抗IV每2週一次及1200 mg納武單抗皮下每4週一次下，納武單抗Cmind28在劑量及體重上之分佈的盒形圖。
圖8A-8C為說明在與rHuPH20一起皮下遞送720 mg、960 mg或1200 mg納武單抗後觀測到的C avg(圖8A)、C tau(圖8B)及C max(圖8C)按重量分佈之盒狀圖。虛線展示納武單抗3 mg/kg IV Q2W (歷史)之幾何平均C avg(圖8A)及C tau(圖8B)以及納武單抗10 mg/kg IV Q2W (歷史)之幾何平均C max(圖8C)。
圖9A-9B展示在第一次皮下劑量之納武單抗及rHuPH20 (部分A、B及D)之後14天，罹患非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)、黑色素瘤(Mel)、肝細胞癌(HCC)及微衛星不穩定性高/錯配修復缺陷型大腸直腸癌(MSI-H/dMMR CRC)之個體的腫瘤浸潤性淋巴球CD8表現(圖9A)及PD-L1腫瘤表現(圖9B)。
圖10為在研究1中，在金屬、過氧化物及光應力與30℃熱應力組合後，根據SEC，頂隙氮氣及空氣對Nivo之%HMW物種之影響的圖形表示。RT/光為持續光應力，其他光應力條件持續3天。調配物1 (空氣)及6 (氮氣)具有：50µm DTPA 5 mM Met；調配物2 (空氣)及7 (氮氣)具有：0 µM DTPA，0 mM Met。所有調配物亦含有120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80，pH 6.0與2,000 U/mL rHuPH20。
圖11為在研究1中，在金屬、過氧化物及光應力與30℃熱應力組合後，根據SEC，各種應力條件對Nivo之%HMW物種之影響的圖形表示。RT/光為持續光應力，其他光應力條件持續3天。調配物1：50µm DTPA 5 mM Met；調配物2：0 µM DTPA，0 mM Met；調配物3：0 µM DTPA，5 mM Met；調配物4：50 µM DTPA，0 mM Met；及調配物5：100 µM EDTA，5 mM Met。所有調配物亦含有120 mg/mL Nivo、20mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80，pH 6.0與2,000 U/mL rHuPH20。
圖12為在研究1中，金屬-鐵、鉻及銅各0.5ppm +光(在室溫下在1000勒克斯下3天+1mM過氧化物+30℃熱應力)下之HMW形成的圖形表示。注意：調配物1 (空氣)及6 (氮氣)彼此完全重疊，且在相同調配物組成下具有最小HMW形成。調配物1 (空氣)及6 (氮氣)：50µm DTPA 5 mM Met；調配物2 (空氣)及7 (氮氣)：0 µM DTPA，0 mM Met；調配物3：0 µM DTPA，5 mM Met；調配物4：50 µM DTPA，0 mM Met；及調配物5：100 µM EDTA，5 mM Met。所有調配物亦含有120 mg/mL Nivo、20mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80，pH 6.0與2,000 U/mL rHuPH20。
圖13為在研究1中，在金屬(鐵、鉻及銅各0.5ppm)、光(在室溫下在1000勒克斯下3天)及過氧化物(1mM過氧化物)與30℃熱應力之各種組合下3個月後，含有/不含5 mM Met及50 µM DTPA及100µm EDTA之調配物組成之%HMW的圖形表示。所有調配物亦含有120 mg/mL Nivo、20mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80，pH 6.0與2,000 U/mL rHuPH20。
圖14為在研究1中，在主效應統計模型中包括之金屬(鐵、鉻及銅各0.5ppm)、光(在室溫下在1000勒克斯下3天)及過氧化物(1mM過氧化物)與30℃熱應力之各種組合下3個月後，%HMW之圖形表示。該圖除以含有/不含5 mM Met及50 µM DTPA之調配物組成。所有調配物亦含有120 mg/mL Nivo、20mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80，pH 6.0與2,000 U/mL rHuPH20。
圖15為在研究1中，在3天RT/黑暗繼之以30℃/黑暗[對照-左側]、RT/RL持續3天繼之以30℃/黑暗，摻加金屬且摻加過氧化物[MPL-中間]以及室溫/室內光照[RT/光照-右側]下儲存後，rHuPH20酶活性之圖形表示。調配物1 (空氣)及6 (氮氣)：50µm DTPA 5 mM Met；調配物2 (空氣)及7 (氮氣)：0 µM DTPA，0 mM Met；調配物3：0 µM DTPA，5 mM Met；調配物4：50 µM DTPA，0 mM Met。所有調配物亦含有120 mg/mL Nivo、20mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80，pH 6.0與2,000 U/mL rHuPH20。
圖16A-16E為研究2之調配物之分佈的圖形表示。調配物範圍為賦形劑之最大值及最小值，目標組成處之所有其他因素為120 mg/mL Nivo (圖16A)、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA (圖16D)5mM Met (圖16E)、2,000 U/mL rHPH20 (圖16F)、0.05% w/v PS80，pH 6.0 (圖16B)。
圖17為對於研究2，對於0-200µM DTPA，在25℃、35℃及MPL、及RT/RL應力條件下至多6個月之不同時間點，根據SEC之高分子量物種的圖形表示。組成包括：120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、5 mM Met、0.05% w/v PS80、2000 U/mL rHuPH20，pH 6.0。
圖18為對於研究2，在25℃、35℃及MPL、及RT/RL應力條件下至多6個月之不同時間點，由調配物DTPA及Met濃度分離之根據SEC之高分子量物種的圖形表示。組成包括：120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80、2000 U/mL rHuPH20，pH 6.0。
圖19為對於研究2，在至多6個月之不同時間點，由調配物DTPA及Met濃度分離之根據SEC之高分子量物種的圖形表示。組成包括：120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80、2000 U/mL rHuPH20，pH 6.0。
圖20為SEC %HMW相對於甲硫胺酸濃度在三個最後採樣之應力條件下的圖形表示，該等應力條件在120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 μM DTPA、0.05% w/v PS80、2000 U/mL rHuPH20，pH 6.0下具有平滑曲線趨勢估計。
圖21A-21C為在25℃下6個月(圖21A)、在35℃下3個月(圖21B)及在MPL應力下3個月(圖21C)之後的%總HMW作為Met水準之函數與含有120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、0.05% w/v PS80、2000 U/mL rHuPH20，pH 6.0之調配物之擬合效能之線性回歸模型的圖形表示。
圖22A-22B為在MPL條件(圖22A)及35℃應力(圖22B)下，隨時間推移之酸性物種的圖形表示。具有DTPA及Met以及僅具有DTPA之調配物的重複樣品。50 µM及5 mM Met濃度下之DTPA。調配物為120 mg/mL Nivo、20mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80、2,000U/mL rHuPH20，pH 6.0。
圖23A-23B為在MPL條件(圖23A)及35℃應力(圖23B)下，隨時間推移之酶活性的圖形表示。具有DTPA及Met以及僅具有DTPA之調配物的重複樣品。50 µM及5 mM Met濃度下之DTPA。調配物為120 mg/mL Nivo、20mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80、2,000U/mL rHuPH20，pH 6.0。
圖24A-24B為在MPL條件(圖24A)及35℃應力(圖24B)下，隨時間推移之PS80含量的圖形表示。具有DTPA及Met以及僅具有DTPA之調配物的重複樣品。50 µM及5 mM Met濃度下之DTPA。調配物為120 mg/mL Nivo、20mM組胺酸、250 mM蔗糖、0.05% w/v PS80、2,000U/mL rHuPH20，pH 6.0。
圖25A為說明根據SEC在MPL條件之3個月時間點處高分子量物種在研究1、研究2及研究3之間的比較之圖形表示，該等高分子量物種在不同Met水準下用及不用2,000U/mLrHuPH20酶分離。圖25B為在MPL條件之3個月時間點根據SEC對高分子量物種之研究1、研究2及研究3作為Met之函數的回歸圖。組成包括120 mg/mL Nivo、20 mM組胺酸、250 mM蔗糖、50 µM DTPA、0.05% w/v PS80、2000 U/mL rHuPH20，pH 6.0 (圖25A-25B)。
圖26為提供甘胺酸、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖及丁二酸鹽之log 10(kd)比較的條形圖，如所指示。
圖27為條形圖，展示在甘胺酸、山梨糖醇、海藻糖、甘露糖醇及蔗糖之MD模擬之最後8 ns期間與納武單抗Fab基團相互作用之賦形劑分子數目的平均計數，如所指示。
圖28A-28E為甘胺酸(圖28A)、山梨糖醇(圖28B)、甘露糖醇(圖28C)、蔗糖(圖28D)及海藻糖(圖28E)中之每一者在納武單抗Fab上發現之結合位姿的圖示。Fab基團顯示為帶狀，輕微結合位姿展示於球棒圖中，且緊密結合位姿展示於空間填充圖中。
圖29A-29B為條形圖，說明在中等強度相互作用(圖29A)及強結合相互作用(圖29B)之MD模擬中發現的各賦形劑(甘胺酸、山梨糖醇、海藻糖、甘露糖醇及蔗糖)之獨特結合位姿數目。
 

          <![CDATA[<110>  美商必治妥美雅史谷比公司(BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY)]]>
                 美商哈羅賽公司(HALOZYME, INC.)
          <![CDATA[<120>  治療腫瘤之方法]]>
          <![CDATA[<130>  3338.225PC03]]>
          <![CDATA[<140>  TW 110149224]]>
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          <![CDATA[<160>  264   ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
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          <![CDATA[<211>  509]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  rHuPH20]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 
                      20                  25                  30          
          Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 
                  35                  40                  45              
          Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 
                          85                  90                  95      
          Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 
                      100                 105                 110         
          Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 
                  115                 120                 125             
          Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 
              130                 135                 140                 
          Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 
                          165                 170                 175     
          Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 
                      180                 185                 190         
          Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 
                  195                 200                 205             
          Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 
              210                 215                 220                 
          Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 
                          245                 250                 255     
          Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 
                      260                 265                 270         
          Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 
                  275                 280                 285             
          Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 
              290                 295                 300                 
          Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 
                          325                 330                 335     
          Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 
                  355                 360                 365             
          Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 
              370                 375                 380                 
          Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 
                      420                 425                 430         
          Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 
                  435                 440                 445             
          Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 
              450                 455                 460                 
          Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 
                          485                 490                 495     
          Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 
                      500                 505                 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗PD-1抗體重鏈可變區]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser 
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗PD-1抗體輕鏈可變區]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
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          <![CDATA[<400>  4]]>
          Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 
                      20                  25                  30          
          Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 
                  35                  40                  45              
          Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 
                          85                  90                  95      
          Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 
                      100                 105                 110         
          Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 
                  115                 120                 125             
          Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 
              130                 135                 140                 
          Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 
                          165                 170                 175     
          Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 
                      180                 185                 190         
          Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 
                  195                 200                 205             
          Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 
              210                 215                 220                 
          Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 
                          245                 250                 255     
          Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 
                      260                 265                 270         
          Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 
                  275                 280                 285             
          Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 
              290                 295                 300                 
          Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 
                          325                 330                 335     
          Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 
                  355                 360                 365             
          Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 
              370                 375                 380                 
          Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 
                      420                 425                 430         
          Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 
                  435                 440                 445             
          Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 
              450                 455                 460                 
          Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 
                          485                 490                 495     
          Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 
                      500                 505                 
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  447]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr 
                  435                 440                 445         
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  446]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
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                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
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          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe 
                  435                 440                 445     
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          <![CDATA[<211>  445]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
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          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
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                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
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          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
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          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
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          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
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                          165                 170                 175     
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                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
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          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
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                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
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                      420                 425                 430         
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 
                  435                 440             
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  442]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu 
                  435                 440         
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  483]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 
                      20                  25                  30          
          Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 
                  35                  40                  45              
          Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 
                          85                  90                  95      
          Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 
                      100                 105                 110         
          Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 
                  115                 120                 125             
          Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 
              130                 135                 140                 
          Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 
                          165                 170                 175     
          Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 
                      180                 185                 190         
          Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 
                  195                 200                 205             
          Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 
              210                 215                 220                 
          Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 
                          245                 250                 255     
          Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 
                      260                 265                 270         
          Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 
                  275                 280                 285             
          Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 
              290                 295                 300                 
          Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 
                          325                 330                 335     
          Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 
                  355                 360                 365             
          Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 
              370                 375                 380                 
          Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 
                      420                 425                 430         
          Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 
                  435                 440                 445             
          Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 
              450                 455                 460                 
          Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Phe Tyr Asn 
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          <![CDATA[<400>  12]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
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                          85                  90                  95      
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                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
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                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
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          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser 
              450                 455                 460         
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  460]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile 
              450                 455                 460 
          <![CDATA[<210>  16]]>
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          <![CDATA[<400>  16]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
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          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met 
              450                 455             
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala 
              450                 455     
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  461]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  18]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
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                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
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          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
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          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
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          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe 
              450                 455                 
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  457]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<400>  20]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
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          <![CDATA[<400>  21]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
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          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
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          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
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          Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Asp Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Gln Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Ser Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser Ile Leu 
              450                 455                 460                 
          Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 
          465                 470                 
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          <![CDATA[<211>  477]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  23]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Ile Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asn Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Thr Leu Met Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ile 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Leu Thr Thr Gly Val Thr Val His Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Val Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ser Lys Gln Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Leu Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Pro Gln Ala Thr Asp Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Met Leu Glu Thr Ile Lys Leu Gly Arg Ser Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Arg Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asp Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Val Val Val Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Asn Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Ala Arg Leu Val 
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          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Arg Glu Glu Leu Val Ser 
                  275                 280                 285             
          Thr Leu Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Ser Leu Ser Ile Thr Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asp Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Asp Ile Arg Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val His Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Val Glu Asp Leu Glu Glu Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Ser Leu Lys Pro Pro Val Glu Thr Glu Gly Ser Pro Pro Ile Phe Tyr 
                  435                 440                 445             
          Asn Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser Thr Thr Met Phe Ile Trp Arg Leu 
              450                 455                 460                 
          Glu Val Trp Asp Gln Gly Ile Ser Arg Ile Gly Phe Phe 
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Ile Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asn Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Thr Leu Met Gly Ser Pro Arg Ile Asn Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Leu Thr Thr Gly Val Thr Val His Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Val Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ser Lys Gln Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Leu Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Pro Gln Ala Thr Asp Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Met Leu Glu Thr Ile Lys Leu Gly Arg Ser Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Arg Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asp Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Val Val Val Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Asn Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Ala Arg Leu Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Arg Glu Glu Leu Val Ser 
                  275                 280                 285             
          Thr Leu Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Ser Leu Ser Ile Thr Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asp Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Asp Ile Arg Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val His Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Val Glu Asp Leu Glu Glu Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Ser Leu Lys Pro Pro Val Glu Thr Glu Gly Ser Pro Pro Ile Phe Tyr 
                  435                 440                 445             
          Asn Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser Thr Thr Met Phe Ile Val Asn Ile 
              450                 455                 460                 
          Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 
          465                 470                 475 
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  510]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Ala Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Thr Glu Phe Cys Leu Gly Lys Ser Gly Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Leu Phe Gly Ser Pro Arg Lys Asn Lys 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Ile Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Pro His Thr Gly Ala Ile Val His Gly Arg Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Leu Gly Pro Leu Gln Gln His Leu Thr Lys Leu Arg Gln Glu Ile 
                          85                  90                  95      
          Leu Tyr Tyr Met Pro Lys Asp Asn Val Gly Leu Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Leu Pro Thr Trp Leu Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Ile 
                  115                 120                 125             
          Tyr Arg Ile Lys Ser Ile Glu Leu Val Lys Ser Gln His Pro Gln Tyr 
              130                 135                 140                 
          Asn His Ser Tyr Ala Thr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Gly Arg Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Asp Lys Pro Asn Leu Tyr Lys Gly Ser Cys Phe Asp Ile Glu 
                  195                 200                 205             
          Lys Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Lys Glu Ser Thr Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Phe Pro Ser Val Tyr Leu Thr Ser Arg Ala Arg Ser Ala Thr Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Ser Lys Leu Tyr Val Val Arg Asn Arg Val His Glu Ala Ile Arg 
                          245                 250                 255     
          Val Ser Lys Ile Pro Asp Asp Lys Ser Pro Leu Pro Asn Phe Val Tyr 
                      260                 265                 270         
          Thr Arg Leu Val Phe Thr Asp Gln Ile Phe Gln Phe Leu Ser His His 
                  275                 280                 285             
          Asp Leu Val Tyr Thr Ile Gly Glu Ile Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly 
              290                 295                 300                 
          Ile Val Val Trp Gly Ser Gln Ser Leu Ala Arg Ser Met Lys Ser Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Leu His Leu Asp Asn Tyr Met Lys Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Leu Ile 
                          325                 330                 335     
          Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Asn Gln Val Leu Cys Gln Glu 
                      340                 345                 350         
          Gln Gly Val Cys Thr Arg Lys Asn Trp Asn Pro Asn Asp Tyr Leu His 
                  355                 360                 365             
          Leu Asn Pro Gly Asn Phe Ala Ile Gln Leu Gly Ser Asn Gly Thr Tyr 
              370                 375                 380                 
          Lys Val Asp Gly Lys Pro Thr Leu Thr Asp Leu Glu Gln Phe Ser Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Phe Gln Cys Ser Cys Tyr Thr Asn Leu Asn Cys Lys Glu Arg Thr 
                          405                 410                 415     
          Asp Met Asn Asn Val Arg Thr Val Asn Val Cys Ala Val Glu Asn Val 
                      420                 425                 430         
          Cys Ile Asp Thr Asn Val Gly Pro Gln Ala Val Thr Tyr Ala Pro Lys 
                  435                 440                 445             
          Glu Lys Lys Asp Val Ala His Ile Leu Ser Asn Thr Thr Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Ser Ser Thr Thr Met Ser Leu Pro Phe Pro Arg Lys His Val Ser Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Cys Leu Leu Val Leu Cys Met Tyr Ser Gln Tyr Leu Asn Ile Cys Tyr 
                          485                 490                 495     
          Arg Leu Val Ala Ile Gly Ile Gln His Gly Tyr Tyr Leu Lys 
                      500                 505                 510 
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  430]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  26]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile 
                      420                 425                 430 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
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          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
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          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
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          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
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                          85                  90                  95      
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          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
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          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
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                          325                 330                 335     
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          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
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          Phe 
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          <![CDATA[<400>  29]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
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                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
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                          325                 330                 335     
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                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu 
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          <![CDATA[<400>  30]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
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          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
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          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
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                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
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          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys 
                  435 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
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          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
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                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
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                  435     
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
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                          85                  90                  95      
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          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
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          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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                          245                 250                 255     
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          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
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          Phe Leu Lys Pro Pro 
                  435         
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
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          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
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                  195                 200                 205             
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          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
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                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
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          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
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          <![CDATA[<211>  441]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  36]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
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                          85                  90                  95      
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          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
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                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
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          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
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          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu 
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          <![CDATA[<400>  37]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
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          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
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                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala 
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  450]]>
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          <![CDATA[<400>  38]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
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          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser 
              450 
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          <![CDATA[<400>  39]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
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          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
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          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser 
              450         
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  453]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  41]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr 
              450             
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
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          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
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          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
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          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
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          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
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          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
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          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
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                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser Ile Leu 
              450                 455                 460                 
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  465]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser Ile Leu 
              450                 455                 460                 
          Phe 
          465 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Ala Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
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          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
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          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
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                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser Ile Trp 
              450                 455                 460                 
          Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Ala Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
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          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
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          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
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                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
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                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Asp Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Ile Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asn Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Ala Val Ala Ala Met 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Gln Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Thr 
                          245                 250                 255     
          Pro Asn Ala Asn Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Ala Arg Leu Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Arg Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Leu Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Ser Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Tyr Met Glu Thr Val Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Thr Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asp Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Glu Thr Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Tyr Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Thr Ser Leu Ser Cys Lys Val Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Ser Leu Lys Pro Pro Lys Glu Thr Glu Glu Ser Ser Gln Ile Phe Tyr 
                  435                 440                 445             
          Asn Pro Ser Ser Ser Thr Pro Ser Ala Ala Ile Phe Ile Val Ala Ile 
              450                 455                 460                 
          Leu Phe Phe Ile Ser Cys Val Val Ser Leu 
          465                 470                 
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  476]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Ile Ile Pro Asn Met Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Leu Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Ala Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Leu Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Asn Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Met Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Ala Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Ser Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asp Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Ser Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Trp Arg Leu Glu 
              450                 455                 460                 
          Val Trp Asp Gln Gly Ile Ser Arg Met Gly Phe Phe 
          465                 470                 475     
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Thr Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Asp Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Ala Arg Asn Arg Val Gln Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Val Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Tyr Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Ser Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val Ser Ile Leu 
              450                 455                 460                 
          Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
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          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
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          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
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          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
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                          85                  90                  95      
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                          325                 330                 335     
          Gly Ala Leu Leu Cys Ser Gln Ala Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
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          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
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          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
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                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Gly Pro Phe Ile Leu Asn Val Thr Ser 
                          325                 330                 335     
          Gly Ala Leu Leu Cys Ser Gln Ala Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  455]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Val Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Gly Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
          <![CDATA[<210>  57]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
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          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
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          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
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          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
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                          85                  90                  95      
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
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          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
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          <![CDATA[<400>  61]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
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          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
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          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
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          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Thr Leu Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Phe Ile Leu Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Phe Ile Leu Asn Val Thr Ser 
                          325                 330                 335     
          Gly Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  453]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Leu Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn Ala Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Ser Thr Leu Ser 
              450             
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  430]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
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                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
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          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
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          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile 
                      420                 425                 430 
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          <![CDATA[<400>  66]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
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          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
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          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
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          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
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          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
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          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Thr Leu Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
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          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
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          Phe Arg Gly Pro Leu Leu Pro Asn Arg Pro Phe Leu Trp Ala Trp Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp Met 
                      20                  25                  30          
          Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile 
              50                  55                  60                  
          Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe Tyr 
                          85                  90                  95      
          Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu Trp 
                      100                 105                 110         
          Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys Asn 
                  115                 120                 125             
          Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn His 
                          165                 170                 175     
          Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr Lys 
                      180                 185                 190         
          Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg Asn 
                  195                 200                 205             
          Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro Ser 
              210                 215                 220                 
          Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp Ala 
                          245                 250                 255     
          Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr Asp 
                      260                 265                 270         
          Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe Gly 
                  275                 280                 285             
          Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr Leu 
              290                 295                 300                 
          Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr Met 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys 
                          325                 330                 335     
          Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg Lys 
                      340                 345                 350         
          Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe Ala 
                  355                 360                 365             
          Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro Thr 
              370                 375                 380                 
          Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp Ala 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu Lys 
                      420                 425                 430         
          Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn Ala Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          Ser Thr Leu Ser 
              450         
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Phe Arg Gly Pro Leu Leu Pro Asn Arg Pro Phe Thr Thr Val Trp Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp Met 
                      20                  25                  30          
          Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile 
              50                  55                  60                  
          Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe Tyr 
                          85                  90                  95      
          Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu Trp 
                      100                 105                 110         
          Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys Asn 
                  115                 120                 125             
          Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn His 
                          165                 170                 175     
          Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr Lys 
                      180                 185                 190         
          Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg Asn 
                  195                 200                 205             
          Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro Ser 
              210                 215                 220                 
          Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp Ala 
                          245                 250                 255     
          Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr Asp 
                      260                 265                 270         
          Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe Gly 
                  275                 280                 285             
          Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr Leu 
              290                 295                 300                 
          Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr Met 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys 
                          325                 330                 335     
          Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg Lys 
                      340                 345                 350         
          Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe Ala 
                  355                 360                 365             
          Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro Thr 
              370                 375                 380                 
          Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp Ala 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu Lys 
                      420                 425                 430         
          Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn Ala Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          Ser Thr Leu Ser 
              450         
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  433]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  431]]>
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
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          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser 
                      20                  25                  30          
          Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly 
                  35                  40                  45              
          Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg 
                      100                 105                 110         
          Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg 
                  115                 120                 125             
          Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn His Leu 
                          165                 170                 175     
          Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr Lys Lys 
                      180                 185                 190         
          Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp 
                  195                 200                 205             
          Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile 
              210                 215                 220                 
          Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys 
                          245                 250                 255     
          Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln 
                      260                 265                 270         
          Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu 
                  275                 280                 285             
          Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser 
              290                 295                 300                 
          Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr Met Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met 
                          325                 330                 335     
          Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn 
                      340                 345                 350         
          Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile 
                  355                 360                 365             
          Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu 
              370                 375                 380                 
          Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp Ala Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro 
                      420                 425                 430         
          Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser 
                  435                 440                 445             
          Thr Leu Ser 
              450     
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  449]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe 
                      20                  25                  30          
          Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr 
                  35                  40                  45              
          Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile 
              50                  55                  60                  
          Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val 
                          85                  90                  95      
          Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr 
                      100                 105                 110         
          Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr 
              130                 135                 140                 
          Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly 
                          165                 170                 175     
          Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly 
                      180                 185                 190         
          Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu 
                  195                 200                 205             
          Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu 
              210                 215                 220                 
          Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro 
                          245                 250                 255     
          Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu 
                      260                 265                 270         
          Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val 
                  275                 280                 285             
          Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Thr 
              290                 295                 300                 
          Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr Met Asp Thr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser 
                          325                 330                 335     
          Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn 
                      340                 345                 350         
          Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu 
                  355                 360                 365             
          Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp 
              370                 375                 380                 
          Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val 
                          405                 410                 415     
          Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met 
                      420                 425                 430         
          Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser 
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  432]]>
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          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
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          <![CDATA[<400>  76]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 
                      420                 425                 
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Thr Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp 
                      420                 425     
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
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          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Thr Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
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          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys 
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          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
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          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
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          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
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          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
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          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
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          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          <![CDATA[<400>  80]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
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                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
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          Lys 
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          <![CDATA[<400>  81]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
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          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
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          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
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          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
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          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Pro Pro 
                  435 
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          <![CDATA[<400>  82]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
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          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
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                          245                 250                 255     
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
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          Lys Pro Pro Met 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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                          165                 170                 175     
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          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
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                      420                 425                 430         
          Lys Pro Pro Met Glu 
                  435         
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
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          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Pro Pro Met Glu Thr 
                  435             
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  439]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  85]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu 
                  435                 
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  454]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  86]]>
          Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala 
          1               5                   10                  15      
          Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr 
                  35                  40                  45              
          Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro 
              50                  55                  60                  
          Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu 
                      100                 105                 110         
          Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr 
                  115                 120                 125             
          Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro 
                          165                 170                 175     
          Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His 
                      180                 185                 190         
          Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys 
                  195                 200                 205             
          Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr 
              210                 215                 220                 
          Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro 
                          245                 250                 255     
          Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe 
                      260                 265                 270         
          Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr 
                  275                 280                 285             
          Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly 
              290                 295                 300                 
          Thr Leu Ser Ile Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala 
                          325                 330                 335     
          Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile 
                      340                 345                 350         
          Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn 
                  355                 360                 365             
          Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys 
              370                 375                 380                 
          Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr 
                          405                 410                 415     
          Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430         
          Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn Ala 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp Met 
                      20                  25                  30          
          Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile 
              50                  55                  60                  
          Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe Tyr 
                          85                  90                  95      
          Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu Trp 
                      100                 105                 110         
          Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys Asn 
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                          165                 170                 175     
          Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr Lys 
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          Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg Asn 
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          Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr Asp 
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          Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe Gly 
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          Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr Leu 
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                          325                 330                 335     
          Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg Lys 
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          Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe Ala 
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          Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro Thr 
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          Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val 
                  35                  40                  45              
          Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser 
              50                  55                  60                  
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          65                  70                  75                  80  
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          Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro 
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          Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn 
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          Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr 
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          Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr Met Asp Thr 
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                          325                 330                 335     
          Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp 
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          Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln 
                  355                 360                 365             
          Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu 
              370                 375                 380                 
          Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr 
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          Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp 
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          Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro 
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          Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr 
                  435                 440                 445             
          Leu Ser 
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          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
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          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
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          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
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          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
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                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile 
                      420                 425             
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          <![CDATA[<211>  429]]>
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          <![CDATA[<400>  90]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
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                  195                 200                 205             
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
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                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<211>  441]]>
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          <![CDATA[<400>  93]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
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          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
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          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
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          Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
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                          165                 170                 175     
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                          325                 330                 335     
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                      340                 345                 350         
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                      420                 425                 430         
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          <![CDATA[<400>  95]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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                  275                 280                 285             
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn Ala Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro 
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<211>  451]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  98]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn Ala Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Ser Thr 
              450     
          <![CDATA[<210>  99]]>
          <![CDATA[<211>  455]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  99]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
          <![CDATA[<210>  100]]>
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          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  100]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Ala Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<211>  455]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  101]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Cys Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
          <![CDATA[<210>  102]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Asp Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
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          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
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          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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                          325                 330                 335     
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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                          85                  90                  95      
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                  275                 280                 285             
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
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                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ala 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
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                          245                 250                 255     
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                  275                 280                 285             
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Gly Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          165                 170                 175     
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                      180                 185                 190         
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                  195                 200                 205             
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                          245                 250                 255     
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                  275                 280                 285             
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
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                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Gly Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  109]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn Ala Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys 
              450                 455                 460                 
          Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Phe 
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  455]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Thr Thr Ser Thr Glu Thr Cys Gln Tyr Leu Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Tyr Leu Thr Arg Leu Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
          <![CDATA[<210>  111]]>
          <![CDATA[<211>  455]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  111]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Ser Ser Ser Glu Glu Glu Cys Trp His Leu His 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Tyr Leu Val Asp Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  112]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Thr Ala Ser Lys Ala Asn Cys Thr Lys Val Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Phe Val Ser Ser Asp Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 
                  435                 440                 445             
          Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser 
              450                 455 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
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                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
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          Trp Glu Asn Thr Met Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                          85                  90                  95      
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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                          325                 330                 335     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
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              210                 215                 220                 
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          225                 230                 235                 240 
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          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Gln Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Phe Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          <![CDATA[<400>  122]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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                          85                  90                  95      
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                  195                 200                 205             
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          Met Lys Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Met Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
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          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          <![CDATA[<400>  126]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          325                 330                 335     
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
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                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Glu Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<400>  130]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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                          245                 250                 255     
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
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          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ser Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<400>  132]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
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              210                 215                 220                 
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          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Val Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          <![CDATA[<400>  138]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
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                          85                  90                  95      
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          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
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          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Gln Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  275                 280                 285             
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                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gln Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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                          85                  90                  95      
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<400>  145]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          1               5                   10                  15      
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          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
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                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  275                 280                 285             
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ile Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
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                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
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          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          <![CDATA[<400>  153]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                      100                 105                 110         
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                          325                 330                 335     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
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          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Arg Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<400>  157]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          165                 170                 175     
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                  275                 280                 285             
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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                      340                 345                 350         
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
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                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Leu Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Val Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
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          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Trp Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          1               5                   10                  15      
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          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
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          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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                          325                 330                 335     
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
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          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
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          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg His Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          <![CDATA[<400>  168]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
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                  275                 280                 285             
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Tyr Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          <![CDATA[<400>  172]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          325                 330                 335     
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
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          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
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          Met Asp Thr Glu Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                          85                  90                  95      
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                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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                          325                 330                 335     
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                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Asp Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
          <![CDATA[<210>  179]]>
          <![CDATA[<211>  431]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  179]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr His Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
          <![CDATA[<210>  180]]>
          <![CDATA[<211>  430]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  180]]>
          Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp Met 
                      20                  25                  30          
          Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile 
              50                  55                  60                  
          Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe Tyr 
                          85                  90                  95      
          Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu Trp 
                      100                 105                 110         
          Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys Asn 
                  115                 120                 125             
          Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn His 
                          165                 170                 175     
          Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr Lys 
                      180                 185                 190         
          Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg Asn 
                  195                 200                 205             
          Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro Ser 
              210                 215                 220                 
          Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp Ala 
                          245                 250                 255     
          Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr Asp 
                      260                 265                 270         
          Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe Gly 
                  275                 280                 285             
          Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser Trp 
              290                 295                 300                 
          Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr Met 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys 
                          325                 330                 335     
          Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg Lys 
                      340                 345                 350         
          Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe Ala 
                  355                 360                 365             
          Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro Thr 
              370                 375                 380                 
          Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp Ala 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430 
          <![CDATA[<210>  181]]>
          <![CDATA[<211>  429]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  181]]>
          Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser 
                      20                  25                  30          
          Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly 
                  35                  40                  45              
          Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg 
                      100                 105                 110         
          Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg 
                  115                 120                 125             
          Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn His Leu 
                          165                 170                 175     
          Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr Lys Lys 
                      180                 185                 190         
          Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp 
                  195                 200                 205             
          Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile 
              210                 215                 220                 
          Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys 
                          245                 250                 255     
          Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln 
                      260                 265                 270         
          Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu 
                  275                 280                 285             
          Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser Trp Glu 
              290                 295                 300                 
          Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr Met Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys Met 
                          325                 330                 335     
          Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn 
                      340                 345                 350         
          Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile 
                  355                 360                 365             
          Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu 
              370                 375                 380                 
          Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp Ala Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  182]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp 
          <![CDATA[<210>  183]]>
          <![CDATA[<211>  430]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  183]]>
          Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp Met 
                      20                  25                  30          
          Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile 
              50                  55                  60                  
          Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe Tyr 
                          85                  90                  95      
          Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu Trp 
                      100                 105                 110         
          Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys Asn 
                  115                 120                 125             
          Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn His 
                          165                 170                 175     
          Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr Lys 
                      180                 185                 190         
          Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg Asn 
                  195                 200                 205             
          Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro Ser 
              210                 215                 220                 
          Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp Ala 
                          245                 250                 255     
          Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr Asp 
                      260                 265                 270         
          Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe Gly 
                  275                 280                 285             
          Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser Trp 
              290                 295                 300                 
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          Asp Arg Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala Lys 
                          325                 330                 335     
          Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg Lys 
                      340                 345                 350         
          Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe Ala 
                  355                 360                 365             
          Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro Thr 
              370                 375                 380                 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Ala Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Ala Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
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                          325                 330                 335     
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
          Asp Gln Ala Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
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                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Ala Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
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          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Ala Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<400>  198]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ala Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          165                 170                 175     
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                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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                          245                 250                 255     
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                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          <![CDATA[<400>  199]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Ala Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          325                 330                 335     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
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          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
          <![CDATA[<210>  203]]>
          <![CDATA[<211>  431]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  203]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
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              210                 215                 220                 
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          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
          <![CDATA[<210>  204]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  204]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Ala Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
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          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<400>  205]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Ala Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<400>  206]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Ala Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
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          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                      180                 185                 190         
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
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                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
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                      100                 105                 110         
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<211>  431]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  214]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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          Thr Glu Ala Thr Ala Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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                          165                 170                 175     
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                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  215]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
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                  195                 200                 205             
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          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<400>  216]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Ala Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
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          <![CDATA[<400>  218]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          325                 330                 335     
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                      340                 345                 350         
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                          165                 170                 175     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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                  355                 360                 365             
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          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Ala Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Ala Asp 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
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                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
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                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Ala Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  225]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
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                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                          165                 170                 175     
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          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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                          245                 250                 255     
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Ala Cys Ile Asp Ala Phe 
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                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<400>  230]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Gln Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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                          165                 170                 175     
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                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
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          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          1               5                   10                  15      
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                          85                  90                  95      
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
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          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
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          1               5                   10                  15      
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                          325                 330                 335     
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          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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                          85                  90                  95      
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                  195                 200                 205             
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  275                 280                 285             
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
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              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Tyr Cys Ile Asp Ala Phe 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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                          85                  90                  95      
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
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          65                  70                  75                  80  
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                      100                 105                 110         
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
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                      260                 265                 270         
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                  275                 280                 285             
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Phe Thr Arg Thr Gln Glu Ser Cys Gln Ala Ile Gln Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<400>  252]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Ser Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Ala 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Asp Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Asn Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Leu Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Ala Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Ser 
              290                 295                 300                 
          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Asp Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  253]]>
          Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala 
          1               5                   10                  15      
          Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr 
                  35                  40                  45              
          Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro 
              50                  55                  60                  
          Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu 
                      100                 105                 110         
          Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr 
                  115                 120                 125             
          Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro 
                          165                 170                 175     
          Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His 
                      180                 185                 190         
          Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys 
                  195                 200                 205             
          Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr 
              210                 215                 220                 
          Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro 
                          245                 250                 255     
          Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe 
                      260                 265                 270         
          Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr 
                  275                 280                 285             
          Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly 
              290                 295                 300                 
          Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala 
                          325                 330                 335     
          Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile 
                      340                 345                 350         
          Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn 
                  355                 360                 365             
          Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys 
              370                 375                 380                 
          Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr 
                          405                 410                 415     
          Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430         
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          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
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          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
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          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
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          Gly Ser Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys 
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          Glu Tyr Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
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          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  255]]>
          Phe Lys Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ala Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
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          Asp Gln Ala Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Asp Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體]]>
          <![CDATA[<400>  256]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Ala Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
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          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Ala Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
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          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Leu Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Ala Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
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          Trp Glu Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr 
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          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
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          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
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          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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                          85                  90                  95      
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                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
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                          85                  90                  95      
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          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Asp 
              290                 295                 300                 
          Leu Ser Ile Ser Arg Thr Met Glu Ser Cys Gln Ala Ile Asp Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Thr Asp 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
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              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
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          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Ser Phe 
                          85                  90                  95      
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                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Asp Asp 
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          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
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          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
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                      180                 185                 190         
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                          245                 250                 255     
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                  275                 280                 285             
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          Met Asp Thr Thr Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
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          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
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          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
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          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
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          <![CDATA[<400>  262]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Ala Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Ala 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Ala Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Ala Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Leu Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Ala Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Asp 
              290                 295                 300                 
          Leu Ser Ile Ser Ser Thr Met Glu Ser Cys Gln Ala Ile Asp Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Asp Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
          <![CDATA[<210>  263]]>
          <![CDATA[<211>  431]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  263]]>
          Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro Leu Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala Thr Gly 
                  35                  40                  45              
          Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro Gln Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile Ala Phe 
                          85                  90                  95      
          Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val Tyr Lys 
                  115                 120                 125             
          Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu Ser Ala 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Ala Thr Ala Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His His Tyr 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile Lys Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu Tyr Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Ala Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr Leu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Leu Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val Phe Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Gln Ala Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr Thr Phe 
                  275                 280                 285             
          Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp Gly Asp 
              290                 295                 300                 
          Leu Ser Ile Ser Arg Thr Met Glu Ser Cys Gln Ala Ile Asp Glu Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu Ala Ala 
                          325                 330                 335     
          Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys Ile Arg 
                      340                 345                 350         
          Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp Asn Phe 
                  355                 360                 365             
          Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly Lys Pro 
              370                 375                 380                 
          Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys Ser Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp Asp Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala Phe 
                      420                 425                 430     
          <![CDATA[<210>  264]]>
          <![CDATA[<211>  447]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  玻尿酸酶變異體- PH20v]]>
          <![CDATA[<400>  264]]>
          Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 
                      180                 185                 190         
          His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Pro Asn Val Glu Ile 
                  195                 200                 205             
          Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 
                      420                 425                 430         
          Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr 
                  435                 440                 445
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Claims (175)

  1. 一種治療有需要之個體的方法，其包含向該個體皮下投與一定劑量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含(i)特異性結合PD-1或PD-L1且抑制PD-1與PD-L1之相互作用的抗體(分別為「抗PD-1抗體」或「抗PD-L1抗體」)，及(ii)內切糖苷酶水解酵素；其中該劑量包含一或多個皮下單位劑量；且其中該劑量包含至少約300 mg至至少約2400 mg該抗PD-1抗體或該抗PD-L1抗體。
  2. 如請求項1之方法，其中該劑量包含兩個或更多個皮下單位劑量，且其中該兩個或更多個皮下單位劑量係同時或相繼投與。
  3. 如請求項2之方法，其中該兩個或更多個皮下單位劑量係相繼投與，其中該兩個或更多個皮下單位劑量中之每一者在該等皮下單位劑量之間約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約一小時、約兩小時、約三小時、約四小時、約五小時、約六小時、約九小時、約十二小時、約十八小時或約二十四小時的時間間隔內投與。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該劑量係約每一週、兩週、三週、四週、六週、八週投與一次。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該抗體包含抗PD-1抗體。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該抗體之該劑量為約每週投與之約250 mg至約600 mg。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該抗體之該劑量為約每週投與之約250 mg、約260 mg、約270 mg、約280 mg、約290 mg、約300 mg、約310 mg、約320 mg、約330 mg、約340 mg、約350 mg、約360 mg、約370 mg、約380 mg、約390 mg、約400 mg、約410 mg、約420 mg、約430 mg、約440 mg、約450 mg、約460 mg、約470 mg、約480 mg、約490 mg、約500 mg、約510 mg、約520 mg、約530 mg、約540 mg、約550 mg、約560 mg、約570 mg、約580 mg、約590 mg或約600 mg。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該抗體之該劑量為約每週投與之約300 mg。
  9. 如請求項8之方法，其中該抗體之該劑量包含約300 mg之單一皮下單位劑量。
  10. 如請求項8或9之方法，其中該抗體之該劑量包含以約2 mL總體積投與之約300 mg之單一皮下單位劑量。
  11. 如請求項10之方法，其中該抗體之該劑量包含(i)兩個皮下單位劑量，其中該兩個皮下單位劑量中之每一者包含約150 mg該抗體；或(ii)三個皮下單位劑量，其中該三個皮下單位劑量中之每一者包含約100 mg該抗體。
  12. 如請求項11之方法，其中(i)向該個體之相同身體位置投與該兩個皮下單位劑量或(ii)向該個體之相同身體位置投與該三個皮下單位劑量中之至少兩者。
  13. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該抗體之該劑量為約每兩週投與之約300 mg至約900 mg。
  14. 如請求項13之方法，其中該抗體之該劑量為約每兩週投與之約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg、約500 mg、約510 mg、約520 mg、約530 mg、約540 mg、約550 mg、約560 mg、約570 mg、約580 mg、約590 mg、約600 mg、約610 mg、約620 mg、約630 mg、約640 mg、約650 mg、約660 mg、約670 mg、約680 mg、約690 mg、約700 mg、約710 mg、約720 mg、約730 mg、約740 mg、約750 mg、約760 mg、約770 mg、約780 mg、約790 mg、約800 mg、約810 mg、約820 mg、約830 mg、約840 mg、約850 mg、約860 mg、約870 mg、約880 mg、約890 mg或約900 mg。
  15. 如請求項13或14之方法，其中該抗體之該劑量為約每兩週投與之約600 mg。
  16. 如請求項15之方法，其中該抗體之該劑量包含單一皮下單位劑量。
  17. 如請求項15之方法，其中該抗體之該劑量包含兩個、三個或至少四個皮下單位劑量。
  18. 如請求項15或17之方法，其中該抗體之該劑量包含兩個皮下單位劑量，其中該兩個皮下單位劑量各自包含約300 mg該抗體。
  19. 如請求項18之方法，其中該兩個皮下單位劑量中之至少一者包含總體積大於約2 mL之約300 mg該抗體。
  20. 如請求項17至19中任一項之方法，其中向該個體之相同身體位置投與該等皮下單位劑量中之至少兩者。
  21. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該抗體之該劑量為約每四週投與之約900 mg至約1500 mg。
  22. 如請求項21之方法，其中該抗體之該劑量為約每四週投與之約900、約950、約1000 mg、約1010 mg、約1020 mg、約1030 mg、約1040 mg、約1050 mg、約1060 mg、約1070 mg、約1080 mg、約1090 mg、約1100 mg、約1110 mg、約1120 mg、約1130 mg、約1140 mg、約1150 mg、約1160 mg、約1170 mg、約1180 mg、約1190 mg、約1200 mg、約1210 mg、約1220 mg、約1230 mg、約1240 mg、約1250 mg、約1260 mg、約1270 mg、約1280 mg、約1290 mg、約1300 mg、約1310 mg、約1320 mg、約1330 mg、約1340 mg、約1350 mg、約1360 mg、約1370 mg、約1380 mg、約1390 mg、約1400 mg、約1410 mg、約1420 mg、約1430 mg、約1440 mg、約1450 mg、約1460 mg、約1470 mg、約1480 mg、約1490 mg或約1500 mg。
  23. 如請求項21或22之方法，其中該抗體之該劑量為約每四週投與之約1200 mg。
  24. 如請求項21至23中任一項之方法，其中該抗體之該劑量包含單一皮下單位劑量。
  25. 如請求項21至23中任一項之方法，其中該抗體之該劑量包含兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。
  26. 如請求項21至23或25中任一項之方法，其中該抗體之該劑量包含四個皮下單位劑量，其中該四個皮下單位劑量各自包含約300 mg該抗體。
  27. 如請求項26之方法，其中該四個皮下單位劑量中之至少一者包含總體積為大於2 mL之約300 mg該抗體。
  28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中向該個體之相同身體位置投與該等皮下單位劑量中之至少兩者。
  29. 如請求項25至28中任一項之方法，其中該兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量係在同一天投與。
  30. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該抗體包含抗PD-L1抗體。
  31. 如請求項30之方法，其中該抗體之該劑量為約每兩週投與之約900 mg至約1800 mg該抗體。
  32. 如請求項30或31之方法，其中該抗體之該劑量為約每兩週投與之約900、約950、約1000 mg、約1010 mg、約1020 mg、約1030 mg、約1040 mg、約1050 mg、約1060 mg、約1070 mg、約1080 mg、約1090 mg、約1100 mg、約1110 mg、約1120 mg、約1130 mg、約1140 mg、約1150 mg、約1160 mg、約1170 mg、約1180 mg、約1190 mg、約1200 mg、約1210 mg、約1220 mg、約1230 mg、約1240 mg、約1250 mg、約1260 mg、約1270 mg、約1280 mg、約1290 mg、約1300 mg、約1310 mg、約1320 mg、約1330 mg、約1340 mg、約1350 mg、約1360 mg、約1370 mg、約1380 mg、約1390 mg、約1400 mg、約1410 mg、約1420 mg、約1430 mg、約1440 mg、約1450 mg、約1460 mg、約1470 mg、約1480 mg、約1490 mg或約1500 mg。
  33. 如請求項30至32中任一項之方法，其中該抗體之該劑量為約每兩週約1200 mg。
  34. 如請求項30至33中任一項之方法，其中該劑量包含以大於約5 mL總體積投與之約1200 mg之單一皮下單位劑量。
  35. 如請求項30至33中任一項之方法，其中該劑量包含兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量。
  36. 如請求項30至33及25中任一項之方法，其中該抗體之該劑量包含四個皮下單位劑量，其中該四個皮下單位劑量各自包含約300 mg該抗體。
  37. 如請求項36之方法，其中該四個皮下單位劑量中之至少一者包含總體積大於2 mL之約300 mg該抗體。
  38. 如請求項35至37中任一項之方法，其中向該個體之相同身體位置投與該等皮下單位劑量中之至少兩者。
  39. 如請求項35至38中任一項之方法，其中該兩個、三個、四個、六個或至少八個皮下單位劑量係在同一天投與。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與該內切糖苷酶水解酵素一起投與。
  41. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與該內切糖苷酶水解酵素同時投與。
  42. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體與該內切糖苷酶水解酵素依序投與。
  43. 如請求項1至42中任一項之方法，其中該醫藥組合物以至少約1,000單位至至少約30,000單位該內切糖苷酶水解酵素之劑量投與。
  44. 如請求項1至43中任一項之方法，其中該醫藥組合物以至少約1000單位、至少約1500單位、至少約2000單位、至少約2500單位、至少約3000單位、至少約3500單位、至少約4000單位、至少約4500單位、至少約5000單位、至少約6000單位、至少約7000單位、至少約8000單位、至少約9000單位、至少約10,000單位、至少約11,000單位、至少約12,000單位、至少約13,000單位、至少約14,000單位、至少約15,000單位、至少約16,000單位、至少約17,000單位、至少約18,000單位、至少約19,000單位、至少約20,000單位、至少約21,000單位、至少約22,000單位、至少約23,000單位、至少約24,000單位、至少約25,000單位、至少約26,000單位、至少約27,000單位、至少約28,000單位、至少約29,000單位或至少約30,000單位該內切糖苷酶水解酵素之劑量投與。
  45. 如請求項1至44中任一項之方法，其中該醫藥組合物以約4000單位該內切糖苷酶水解酵素之劑量投與。
  46. 如請求項1至12及40至45中任一項之方法，其中該醫藥組合物以(i)約300 mg該抗體及(ii)約4000單位該內切糖苷酶水解酵素之劑量投與，約每週一次。
  47. 如請求項1至20及40至45中任一項之方法，其中該醫藥組合物以(i)約600 mg該抗體及(ii)約8000單位該內切糖苷酶水解酵素之劑量投與，約每兩週一次。
  48. 如請求項1至29及40至45中任一項之方法，其中該醫藥組合物以(i)約1200 mg該抗體及(ii)約20,000單位該內切糖苷酶水解酵素之劑量投與，約每四週一次。
  49. 如請求項1及30至45中任一項之方法，其中該醫藥組合物以(i)約1200 mg該抗體及(ii)約8000單位該內切糖苷酶水解酵素之劑量投與，約每兩週一次。
  50. 如請求項1及30至45中任一項之方法，其中該醫藥組合物以(i)約1800 mg該抗體及(ii)約12,000單位該內切糖苷酶水解酵素之劑量投與，約每三週一次。
  51. 如請求項1至50中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素在己糖胺酶β (1-4)或(1-3)鍵處裂解玻尿酸。
  52. 如請求項1至51中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素包含玻尿酸酶PH-20 (HuPH20)、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4或HYALPS1之催化域。
  53. 如請求項1至52中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸36-490具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。
  54. 如請求項1至53中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素包含玻尿酸酶。
  55. 如請求項1至54中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素包含選自由以下組成之群的玻尿酸酶：HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、其任何變異體及任何同功異型物。
  56. 如請求項1至55中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素包含rHuPH20或其片段。
  57. 如請求項1至56中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶包含一或多個胺基酸取代。
  58. 如請求項1至57中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶在α-螺旋區中包含一或多個胺基酸取代。
  59. 如請求項1至58中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶在連接子區中包含一或多個胺基酸取代。
  60. 如請求項1至59中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，其中相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶，缺失一或多個N末端及/或C末端胺基酸。
  61. 如請求項1至60中任一項之方法，其中該內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之rHuPH20，其中該經修飾之rHuPH20： i.   相對於野生型rHuPH20，包含在α-螺旋區、連接子區或α-螺旋區及連接子區兩者中之一或多個胺基酸取代； ii.  相對於野生型rHuPH20，包含一或多個N末端胺基酸、一或多個C末端胺基酸或一或多個N末端胺基酸及一或多個C末端胺基酸之缺失；或 iii. 包含(i)及(ii)兩者。
  62. 如請求項1至29及40至61中任一項之方法，其中該抗PD-1抗體包含選自由以下組成之群的抗體：納武單抗(nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、PDR001、MEDI-0680、測米匹單抗(cemiplimab)、特瑞普利單抗(toripalimab)、替雷利珠單抗(tislelizumab)、INCSHR1210、TSR-042、GLS-010、AM-0001、STI-1110、AGEN2034、MGA012、BCD-100、IBI308及其任何組合。
  63. 如請求項62之方法，其中該抗PD-1抗體與納武單抗交叉競爭結合至人類PD-1。
  64. 如請求項62之方法，其中該抗PD-1抗體包含納武單抗。
  65. 如請求項62之方法，其中該抗PD-1抗體包含派立珠單抗。
  66. 如請求項1及30至61中任一項之方法，其中該抗PD-L1抗體包含選自由以下組成之群的抗體：BMS-936559、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、阿維魯單抗(avelumab)、STI-1014、CX-072、KN035、LY3300054、BGB-A333、CK-301及其任何組合。
  67. 如請求項1至66中任一項之方法，其中該個體罹患癌症。
  68. 如請求項67之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：鱗狀細胞癌、小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、鱗狀NSCLC、非鱗狀NSCLC、神經膠質瘤、胃腸癌、腎癌(renal cancer)、透明細胞癌、卵巢癌、肝臟癌(liver cancer)、大腸直腸癌、子宮內膜癌、腎臟癌(kidney cancer)、腎細胞癌(RCC)、前列腺癌、激素難治性前列腺腺癌、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、膠質母細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤、子宮頸癌、胃部癌(stomach cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、結腸癌、頭頸癌、胃癌(gastric cancer)、生殖細胞腫瘤、小兒肉瘤、鼻腔鼻竇自然殺手、黑素瘤、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門區癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、直腸癌、兒童實體腫瘤、尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦癌、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、包括石棉所誘發癌症的環境誘發之癌症、病毒相關癌症或病毒起源之癌症(例如人類乳頭狀瘤病毒(HPV相關或起源之腫瘤))及其任何組合。
  69. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該醫藥組合物係使用自動注射器投與。
  70. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該醫藥組合物係使用可穿戴泵投與。
  71. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該醫藥組合物係藉由皮下輸注向該個體投與少於約10分鐘。
  72. 如請求項1至71中任一項之方法，其中該醫藥組合物係藉由皮下輸注向該個體投與少於約5分鐘。
  73. 如請求項1至72中任一項之方法，其中該醫藥組合物進一步包含至少兩種抗氧化劑。
  74. 如請求項73之方法，其中該至少兩種抗氧化劑係選自甲硫胺酸、色胺酸、組胺酸、半胱胺酸、抗壞血酸、甘胺酸、DTPA及EDTA。
  75. 如請求項73或74之方法，其中該至少兩種抗氧化劑包含(i)甲硫胺酸及EDTA或(ii)甲硫胺酸及DTPA。
  76. 如請求項73至75中任一項之方法，其中該至少兩種抗氧化劑包含至少約1至約20 mM甲硫胺酸。
  77. 如請求項73至76中任一項之方法，其中該至少兩種抗氧化劑包含至少約1 mM、至少約1.5 mM、至少約2 mM、至少約2.5 mM、至少約3 mM、至少約3.5 mM、至少約4 mM、至少約4.5 mM、至少約5 mM、至少約5.5 mM、至少約6 mM、至少約6.5 mM、至少約7 mM、至少約7.5 mM、至少約8 mM、至少約8.5 mM、至少約9 mM、至少約9.5 mM、至少約10 mM、至少約11 mM、至少約12 mM、至少約13 mM、至少約14 mM、至少約15 mM、至少約16 mM、至少約17 mM、至少約18 mM、至少約19 mM或至少約20 mM甲硫胺酸。
  78. 如請求項73至77中任一項之方法，其中該至少兩種抗氧化劑包含約5 mM甲硫胺酸。
  79. 如請求項73至78中任一項之方法，其中該至少兩種抗氧化劑包含至少約10 µM至約200 µM DTPA。
  80. 如請求項73至79中任一項之方法，其中該至少兩種抗氧化劑包含至少約10 µM、至少約15 µM、至少約20 µM、至少約25 µM、至少約30 µM、至少約35 µM、至少約40 µM、至少約45 µM、至少約50 µM、至少約55 µM、至少約60 µM、至少約65 µM、至少約70 µM、至少約75 µM、至少約80 µM、至少約85 µM、至少約90 µM、至少約95 µM、至少約100 µM、至少約110 µM、至少約120 µM、至少約130 µM、至少約140 µM、至少約150 µM、至少約160 µM、至少約170 µM、至少約180 µM、至少約190 µM或至少約200 µM DTPA。
  81. 如請求項73至80中任一項之方法，其中該至少兩種抗氧化劑包含約50 µM DTPA。
  82. 如請求項1至81中任一項之方法，其中該醫藥組合物進一步包含張力調節劑及/或穩定劑。
  83. 如請求項66之方法，其中該張力調節劑及/或穩定劑包含糖、胺基酸、多元醇、鹽或其組合。
  84. 如請求項82或83之方法，其中該張力調節劑及/或穩定劑係選自由以下組成之群：蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、甘露糖醇、甘油、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、氯化鈉、脯胺酸、精胺酸、組胺酸及其任何組合。
  85. 如請求項82至84中任一項之方法，其中該張力調節劑包含蔗糖。
  86. 如請求項1至85中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含至少約10 mM至至少約500 mM蔗糖。
  87. 如請求項1至86中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含至少約10 mM、至少約20 mM、至少約30 mM、至少約40 mM、至少約50 mM、至少約60 mM、至少約70 mM、至少約80 mM、至少約90 mM、至少約100 mM、至少約110 mM、至少約120 mM、至少約130 mM、至少約140 mM、至少約150 mM、至少約160 mM、至少約170 mM、至少約180 mM、至少約190 mM、至少約200 mM、至少約210 mM、至少約220 mM、至少約230 mM、至少約240 mM、至少約250 mM、至少約260 mM、至少約270 mM、至少約280 mM、至少約290 mM、至少約300 mM、至少約310 mM、至少約320 mM、至少約330 mM、至少約340 mM、至少約350 mM、至少約360 mM、至少約370 mM、至少約380 mM、至少約390 mM、至少約400 mM、至少約410 mM、至少約420 mM、至少約430 mM、至少約440 mM、至少約450 mM、至少約460 mM、至少約470 mM、至少約480 mM、至少約490 mM或至少約500 mM蔗糖。
  88. 如請求項1至87中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含約250 mM蔗糖。
  89. 如請求項1至88中任一項之方法，其中該醫藥組合物進一步包含緩衝劑。
  90. 如請求項89之方法，其中該緩衝劑係選自組胺酸、丁二酸鹽、緩血酸胺、磷酸鈉、乙酸鈉及檸檬酸鈉。
  91. 如請求項89或90之方法，其中該緩衝劑包含組胺酸。
  92. 如請求項1至91中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含至少約5 mM至至少約100 mM組胺酸。
  93. 如請求項1至92中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含至少約5 mM、至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約60 mM、至少約70 mM、至少約80 mM、至少約90 mM或至少約100 mM組胺酸。
  94. 如請求項1至93中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含約20 mM組胺酸。
  95. 如請求項1至94中任一項之方法，其中該醫藥組合物進一步包含界面活性劑。
  96. 如請求項95之方法，其中該界面活性劑選自由以下組成之群：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及泊洛沙姆188(poloxamer 188)。
  97. 如請求項95或96之方法，其中該界面活性劑包含聚山梨醇酯80。
  98. 如請求項1至97中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含至少約0.01% w/v至至少約0.1% w/v聚山梨醇酯80。
  99. 如請求項1至98中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含至少約0.01% w/v、至少約0.02% w/v、至少約0.03% w/v、至少約0.04% w/v、至少約0.05% w/v、至少約0.06% w/v、至少約0.07% w/v、至少約0.08% w/v、至少約0.09% w/v或至少約0.1% w/v聚山梨醇酯80。
  100. 如請求項1至99中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含約0.05% w/v聚山梨醇酯80。
  101. 如請求項1至29及40至100中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含： (a)    約120 mg/mL該抗PD-1抗體； (b)    約20 mM L-組胺酸； (c)    約250 mM蔗糖； (d)    約0.05% w/v聚山梨醇酯80； (e)    約50 µM噴替酸(pentetic acid)； (f)    約5 mM甲硫胺酸；及 (g)    約0.0182 mg/mL rHuPH20。
  102. 如請求項1至29及40至100中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含： (a)    約120 mg/mL該抗PD-1抗體； (b)    約20 mM L-組胺酸； (c)    約250 mM蔗糖； (d)    約0.05% w/v聚山梨醇酯80； (e)    約50 µM噴替酸； (f)    約5 mM甲硫胺酸；及 (g)    約2000 U/mL rHuPH20。
  103. 如請求項1至29及40至100中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含： (a)    約150 mg/mL該抗PD-1抗體； (b)    約20 mM L-組胺酸； (c)    約250 mM蔗糖； (d)    約0.05% w/v聚山梨醇酯80； (e)    約50 µM噴替酸； (f)    約5 mM甲硫胺酸；及 (g)    約0.0182 mg/mL rHuPH20。
  104. 如請求項1至29及40至100中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含： (a)    約150 mg/mL該抗PD-1抗體； (b)    約20 mM L-組胺酸； (c)    約250 mM蔗糖； (d)    約0.05% w/v聚山梨醇酯80； (e)    約50 µM噴替酸； (f)    約5 mM甲硫胺酸；及 (g)    約2000 U/mL rHuPH20。
  105. 如請求項1至104中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含約5.2至約6.8之pH。
  106. 如請求項1至105中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7或約6.8之pH。
  107. 如請求項1至106中任一項之方法，其中該醫藥組合物包含約6.0之pH。
  108. 一種醫藥組合物，其供如請求項1至107中任一項之方法使用。
  109. 一種醫藥組合物，其包含(i)特異性結合PD-1之抗體(「抗PD-1抗體」)、(ii)內切糖苷酶水解酵素及(iii)至少兩種抗氧化劑。
  110. 如請求項109之醫藥組合物，其包含至少約50 U/mL至至少約5000 U/mL內切糖苷酶水解酵素。
  111. 如請求項109或110之醫藥組合物，其包含至少約50 U/mL、至少約100 U/mL、至少約150 U/mL、至少約200 U/mL、至少約250 U/mL、至少約300 U/mL、至少約350 U/mL、至少約400 U/mL、至少約450 U/mL、至少約500 U/mL、至少約750 U/mL、至少約1000 U/mL、至少約1500 U/mL、至少約2000 U/mL、至少約2500 U/mL、至少約3000 U/mL、至少約3500 U/mL、至少約4000 U/mL、至少約4500 U/mL、至少約5000 U/mL、至少約5500 U/mL、至少約6000 U/mL、至少約6500 U/mL、至少約7000 U/mL、至少約7500 U/mL、至少約8000 U/mL、至少約8500 U/mL、至少約9000 U/mL、至少約9500 U/mL、至少約10,000 U/mL該內切糖苷酶水解酵素。
  112. 如請求項109至111中任一項之醫藥組合物，其包含至少約500 U/mL該內切糖苷酶水解酵素。
  113. 如請求項109至111中任一項之醫藥組合物，其包含至少約1000 U/mL該內切糖苷酶水解酵素。
  114. 如請求項109至111中任一項之醫藥組合物，其包含至少約2000 U/mL該內切糖苷酶水解酵素。
  115. 如請求項109至114中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素在己糖胺酶β (1-4)或(1-3)鍵處裂解玻尿酸。
  116. 如請求項109至115中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素包含玻尿酸酶PH-20 (HuPH20)、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4或HYALPS1之催化域。
  117. 如請求項109至116中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸36-490具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。
  118. 如請求項109至117中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素包含玻尿酸酶。
  119. 如請求項109至118中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素包含選自由以下組成之群的玻尿酸酶：HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、其任何變異體及任何同功異型物。
  120. 如請求項109至119中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素包含rHuPH20或其片段。
  121. 如請求項109至120中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶包含一或多個胺基酸取代。
  122. 如請求項109至121中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶，在α-螺旋區中包含一或多個胺基酸取代。
  123. 如請求項109至122中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，該玻尿酸酶相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶，在連接子區中包含一或多個胺基酸取代。
  124. 如請求項109至123中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之玻尿酸酶，其中相對於選自由HuPH20、HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPS1或其片段組成之群的野生型玻尿酸酶，缺失一或多個N末端及/或C末端胺基酸。
  125. 如請求項109至124中任一項之醫藥組合物，其中該內切糖苷酶水解酵素包含經修飾之rHuPH20，其中該經修飾之rHuPH20： i.   相對於野生型rHuPH20，包含在α-螺旋區、連接子區或α-螺旋區及連接子區兩者中之一或多個胺基酸取代； ii.  相對於野生型rHuPH20，包含一或多個N末端胺基酸、一或多個C末端胺基酸或一或多個N末端胺基酸及一或多個C末端胺基酸之缺失；或 iii. 包含(i)及(ii)兩者。
  126. 如請求項109至125中任一項之醫藥組合物，其中該至少兩種抗氧化劑係選自甲硫胺酸、色胺酸、組胺酸、半胱胺酸、抗壞血酸、甘胺酸、DTPA及EDTA。
  127. 如請求項109或126之醫藥組合物，其中該至少兩種抗氧化劑包含(i)甲硫胺酸及EDTA或(ii)甲硫胺酸及DTPA。
  128. 如請求項109至127中任一項之醫藥組合物，其中該至少兩種抗氧化劑包含至少約1至約20 mM甲硫胺酸。
  129. 如請求項109至128中任一項之醫藥組合物，其中該至少兩種抗氧化劑包含至少約1 mM、至少約1.5 mM、至少約2 mM、至少約2.5 mM、至少約3 mM、至少約3.5 mM、至少約4 mM、至少約4.5 mM、至少約5 mM、至少約5.5 mM、至少約6 mM、至少約6.5 mM、至少約7 mM、至少約7.5 mM、至少約8 mM、至少約8.5 mM、至少約9 mM、至少約9.5 mM、至少約10 mM、至少約11 mM、至少約12 mM、至少約13 mM、至少約14 mM、至少約15 mM、至少約16 mM、至少約17 mM、至少約18 mM、至少約19 mM或至少約20 mM甲硫胺酸。
  130. 如請求項109至129中任一項之醫藥組合物，其中該至少兩種抗氧化劑包含約5 mM甲硫胺酸。
  131. 如請求項109至130中任一項之醫藥組合物，其中該至少兩種抗氧化劑包含至少約10 µM至約200 µM DTPA。
  132. 如請求項109至131中任一項之醫藥組合物，其中該至少兩種抗氧化劑包含至少約10 µM、至少約15 µM、至少約20 µM、至少約25 µM、至少約30 µM、至少約35 µM、至少約40 µM、至少約45 µM、至少約50 µM、至少約55 µM、至少約60 µM、至少約65 µM、至少約70 µM、至少約75 µM、至少約80 µM、至少約85 µM、至少約90 µM、至少約95 µM、至少約100 µM、至少約110 µM、至少約120 µM、至少約130 µM、至少約140 µM、至少約150 µM、至少約160 µM、至少約170 µM、至少約180 µM、至少約190 µM或至少約200 µM DTPA。
  133. 如請求項109至132中任一項之醫藥組合物，其中該至少兩種抗氧化劑包含約50 µM DTPA。
  134. 如請求項109至133中任一項之醫藥組合物，其包含至少約20 mg/mL至至少約200 mg/mL該抗PD-1抗體。
  135. 如請求項109至134中任一項之醫藥組合物，其包含至少約135 mg/mL至至少約180 mg/mL該抗PD-1抗體。
  136. 如請求項109至135中任一項之醫藥組合物，其包含至少約108 mg/mL至至少約132 mg/mL該抗PD-1抗體。
  137. 如請求項109至134中任一項之醫藥組合物，其包含至少約20 mg/mL、至少約30 mg/mL、至少約40 mg/mL、至少約50 mg/mL、至少約60 mg/mL、至少約70 mg/mL、至少約80 mg/mL、至少約90 mg/mL、至少約100 mg/mL、至少約110 mg/mL、至少約120 mg/mL、至少約130 mg/mL、至少約140 mg/mL、至少約150 mg/mL、至少約160 mg/mL、至少約170 mg/mL、至少約180 mg/mL、至少約190 mg/mL或至少約200 mg/mL該抗PD-1抗體。
  138. 如請求項109至137中任一項之醫藥組合物，其包含約120 mg/mL該抗PD-1抗體。
  139. 如請求項109至138中任一項之醫藥組合物，其包含約150 mg/mL該抗PD-1抗體。
  140. 如請求項109至139中任一項之醫藥組合物，其進一步包含張力調節劑及/或穩定劑。
  141. 如請求項140之醫藥組合物，其中該張力調節劑及/或穩定劑包含糖、胺基酸、多元醇、鹽或其組合。
  142. 如請求項140或141之醫藥組合物，其中該張力調節劑及/或穩定劑係選自由以下組成之群：蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、甘露糖醇、甘油、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、氯化鈉、脯胺酸、精胺酸、組胺酸及其任何組合。
  143. 如請求項140至142中任一項之醫藥組合物，其中該張力調節劑包含蔗糖。
  144. 如請求項109至143中任一項之醫藥組合物，其包含至少約10 mM至至少約500 mM蔗糖。
  145. 如請求項109至144中任一項之醫藥組合物，其包含至少約10 mM、至少約20 mM、至少約30 mM、至少約40 mM、至少約50 mM、至少約60 mM、至少約70 mM、至少約80 mM、至少約90 mM、至少約100 mM、至少約110 mM、至少約120 mM、至少約130 mM、至少約140 mM、至少約150 mM、至少約160 mM、至少約170 mM、至少約180 mM、至少約190 mM、至少約200 mM、至少約210 mM、至少約220 mM、至少約230 mM、至少約240 mM、至少約250 mM、至少約260 mM、至少約270 mM、至少約280 mM、至少約290 mM、至少約300 mM、至少約310 mM、至少約320 mM、至少約330 mM、至少約340 mM、至少約350 mM、至少約360 mM、至少約370 mM、至少約380 mM、至少約390 mM、至少約400 mM、至少約410 mM、至少約420 mM、至少約430 mM、至少約440 mM、至少約450 mM、至少約460 mM、至少約470 mM、至少約480 mM、至少約490 mM或至少約500 mM蔗糖。
  146. 如請求項109至145中任一項之醫藥組合物，其包含約250 mM蔗糖。
  147. 如請求項109至146中任一項之醫藥組合物，其進一步包含緩衝劑。
  148. 如請求項147之醫藥組合物，其中該緩衝劑係選自組胺酸、丁二酸鹽、緩血酸胺、磷酸鈉、乙酸鈉及檸檬酸鈉。
  149. 如請求項147或148之醫藥組合物，其中該緩衝劑包含組胺酸。
  150. 如請求項109至149中任一項之醫藥組合物，其包含至少約5 mM至至少約100 mM組胺酸。
  151. 如請求項109至150中任一項之醫藥組合物，其包含至少約5 mM、至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約60 mM、至少約70 mM、至少約80 mM、至少約90 mM或至少約100 mM組胺酸。
  152. 如請求項109至151中任一項之醫藥組合物，其包含約20 mM組胺酸。
  153. 如請求項109至152中任一項之醫藥組合物，其進一步包含界面活性劑。
  154. 如請求項153之醫藥組合物，其中該界面活性劑選自由以下組成之群：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及泊洛沙姆188。
  155. 如請求項153或154之醫藥組合物，其中該界面活性劑包含聚山梨醇酯80。
  156. 如請求項109至155中任一項之醫藥組合物，其包含至少約0.01% w/v至至少約0.1% w/v聚山梨醇酯80。
  157. 如請求項109至156中任一項之醫藥組合物，其包含至少約0.01% w/v、至少約0.02% w/v、至少約0.03% w/v、至少約0.04% w/v、至少約0.05% w/v、至少約0.06% w/v、至少約0.07% w/v、至少約0.08% w/v、至少約0.09% w/v或至少約0.1% w/v聚山梨醇酯80。
  158. 如請求項109至157中任一項之醫藥組合物，其包含約0.05% w/v聚山梨醇酯80。
  159. 如請求項109至158中任一項之醫藥組合物，其包含： (a)    約150 mg/mL該抗PD-1抗體； (b)    約20 mM組胺酸； (c)    約250 mM蔗糖； (d)    約0.05% w/v聚山梨醇酯80； (e)    約50 µM噴替酸； (f)    約5 mM甲硫胺酸；及 (g)    約2000 U/mL rHuPH20。
  160. 如請求項109至159中任一項之醫藥組合物，其包含： (a)    約120 mg/mL該抗PD-1抗體； (b)    約20 mM組胺酸； (c)    約250 mM蔗糖； (d)    約0.05% w/v聚山梨醇酯80； (e)    約50 µM噴替酸； (f)    約5 mM甲硫胺酸；及 (g)    約2000 U/mL rHuPH20。
  161. 如請求項109至160中任一項之醫藥組合物，其包含約5.2至約6.8之pH。
  162. 如請求項109至161中任一項之醫藥組合物，其包含約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7或約6.8之pH。
  163. 如請求項109至162中任一項之醫藥組合物，其包含約6.0之pH。
  164. 如請求項1至163中任一項之醫藥組合物，其進一步包含第二治療劑。
  165. 如請求項164之醫藥組合物，其中該第二治療劑為抗體。
  166. 如請求項165之醫藥組合物，其中該第二治療劑為檢查點抑制劑。
  167. 如請求項166之醫藥組合物，其中該檢查點抑制劑為抗CTLA-4抗體、抗LAG-3抗體、抗TIM3抗體、抗TIGIT抗體、抗TIM3抗體、抗NKG2a抗體、抗OX40抗體、抗ICOS抗體、抗MICA抗體、抗CD137抗體、抗KIR抗體、抗TGFβ抗體、抗IL-10抗體、抗IL-8抗體、抗-B7-H4抗體、抗Fas配位體抗體、抗CXCR4抗體、抗間皮素抗體、抗CD27抗體、抗GITR或其任何組合。
  168. 一種單位劑量，其包含如請求項107至167中任一項之醫藥組合物。
  169. 一種單位劑量，其包含： (a)    約120 mg/mL該抗PD-1抗體； (b)    約20 mM L-組胺酸； (c)    約250 mM蔗糖； (d)    約0.05% w/v聚山梨醇酯80； (e)    約50 µM噴替酸； (f)    約5 mM甲硫胺酸；及 (g)    約2000 U/mL rHuPH20。
  170. 一種單位劑量，其包含： (a)    約150 mg/mL該抗PD-1抗體； (b)    約20 mM L-組胺酸； (c)    約250 mM蔗糖； (d)    約0.05% w/v聚山梨醇酯80； (e)    約50 µM噴替酸； (f)    約5 mM甲硫胺酸；及 (g)    約2000 U/mL rHuPH20。
  171. 一種小瓶，其包含如請求項105至167中任一項之醫藥組合物或如請求項168至170中任一項之單位劑量。
  172. 如請求項171之小瓶，其為自動注射器。
  173. 一種自動注射器，其包含如請求項105至167中任一項之醫藥組合物或如請求項168至170中任一項之單位劑量。
  174. 如請求項171之小瓶，其為可穿戴泵。
  175. 一種可穿戴泵，其包含如請求項105至167中任一項之醫藥組合物或如請求項168至170中任一項之單位劑量。
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