TW201304801A - 腦功能改善用胜肽之酵素性製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種腦功能改善用胜肽之酵素性製造方法。具體而言，本發明提供一種腦功能改善用胜肽之製造方法、及含有該水解產物之飲食品或醫藥組合物，該腦功能改善用胜肽之製造方法之特徵在於：包括利用含有蛋白酶之酵素觸媒水解乳酪蛋白，而生成含有(i)包含序列編號1所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，(ii)包含序列編號2所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，或(iii)上述(i)及(ii)之胜肽之混合物的水解產物，其中，該胜肽之各自生成產率為2%以上，或該混合物之合計生成產率為10%以上。

Description

腦功能改善用胜肽之酵素性製造方法
本發明係關於一種腦功能改善用胜肽，尤其是關於一種健忘改善或預防用胜肽之酵素性製造方法。具體而言，係關於一種利用含有蛋白酶之酵素觸媒水解乳酪蛋白，而製造富含具有上述作用之胜肽之水解產物的方法。
本發明亦關於一種含有上述水解產物之飲食品或醫藥組合物。
由腦功能降低引起之症狀及疾病有抑鬱症、精神分裂症、譫妄症、癡呆症(腦血管性癡呆症、阿茲海默氏病等)等。隨著現代社會之高齡化，尤其是癡呆症患者增加逐漸成為嚴重之社會問題。癡呆症之症狀因人而異，但作為可見之共同症狀，可列舉：記憶障礙、定向力障礙、判斷力-思考力降低等。於癡呆症中，多數患者為腦血管性癡呆症與阿茲海默氏病。例如，腦血管性癡呆由於大腦皮質或海馬區神經細胞因腦血流障礙而受到損傷，故而表現出癡呆、記憶障礙。因此，除了治療有可能產生腦血管障礙之高血壓、糖尿病、高膽固醇血症等基礎疾病以外，亦應用改善腦血流之藥物或保護腦神經細胞之藥物。另一方面，阿茲海默氏病雖然原因尚未明確闡明，但由於可見其患者之作為腦內之神經傳遞物質之乙醯膽鹼之水準降低，故而認為原因之一為膽鹼功能性神經之功能降低(例如非專利文獻1)。因此，於阿茲海默氏病中，以提高乙醯膽鹼 之濃度而防止膽鹼功能性神經之功能降低為目的之治療方法逐漸成為主流。
目前，作為阿茲海默氏病之治療藥物，例如市售有鹽酸多奈哌齊等乙醯膽鹼酯酶抑制劑。但是，鹽酸多奈哌齊等乙醯膽鹼酯酶抑制劑存在因具有肝臟毒性或較強之副作用，故而無法長期服用，又，價格昂貴之問題。
又，作為關於胜肽表現出健忘改善效果之報告，例如報告有藉由側腦室內投予或經口投予XPLPR(X為L、I、M、F、W)300 mg/kg而顯示出對莨菪胺誘發健忘之改善效果，作為其機制之一，提示有利用腦內C3a受體而釋放乙醯膽鹼(專利文獻1)。認為莨菪胺作為毒蕈鹼受體拮抗劑而引起膽鹼功能性神經之功能降低，作為腦功能障礙誘發劑而發揮作用，故而對於改善作用，阿茲海默氏病治療藥物開發時之模型動物例如可藉由Y字迷宮試驗、八方向迷宮試驗、被動迴避試驗等行為試驗，而證實腦功能之改善及/或強化之效果。但是，任一胜肽為了顯示出作用均需要進行大量之經口投予、或腹腔內投予、腦室內投予等投予，並未作為可經口攝取之物質而顯示出充分之效果。又，並無對本發明中之胜肽及其相關物之評價報告，與腦功能改善有關之作用不明。
因此，隨著高齡化社會之發展，越來越強烈期待開發出一種如預防由腦功能降低引起之症狀或疾病、進而顯示出改善效果之對醫藥品、進而食品之應用優異的更安全之化合物。
且說，對於利用酵素水解酪蛋白而獲得之水解物，雖然報告有具有降血壓作用、平滑肌收縮作用、貧血改善作用等藥理作用，及使用於營養劑或母乳代替物中等(專利文獻2~8)，但未找到針對腦功能改善作用之報告。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第3898389號公報
[專利文獻2]日本專利特公表10-507641號公報
[專利文獻3]日本專利特開平06-128287號公報
[專利文獻4]日本專利1893866號公報
[專利文獻5]日本專利1572761號公報
[專利文獻6]日本專利4633876號公報
[專利文獻7]日本專利特公平07-032676號公報
[專利文獻8]日本專利1907911號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1] R. T. Bartus et al., Science, 217, 408-414(1982)
本發明之目的在於提供一種新穎之腦功能改善用胜肽之酵素性製造方法。
本發明之另一目的在於提供一種藉由該方法所製造之反應產物、及含有其之飲食品及醫藥組合物。
概括而言，本發明具有下述特徵。
(1)一種腦功能改善用胜肽之製造方法，其特徵在於：包括利用含有蛋白酶之酵素觸媒水解乳酪蛋白，而生成含有(i)包含序列編號1所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，(ii)包含序列編號2所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，或(iii)上述(i)及(ii)之胜肽之混合物的水解產物，其中，該胜肽之各自生成產率為2%以上，或該混合物之合計生成產率為10%以上。
(2)如上述(1)之方法，其中蛋白酶為中性蛋白酶或鹼性蛋白酶。
(3)如上述(1)或(2)之方法，其中蛋白酶源自微生物。
(4)如上述(3)之方法，其中微生物為屬於芽孢桿菌(Bacillus)屬或麴菌(Aspergillus)屬之微生物、或乳酸菌。
(5)如上述(4)之方法，其中微生物選自由地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)、麴菌屬(Aspergillus sp.)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、蜂蜜麴黴(Aspergillus melleus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)及嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)所組成之群中。
(6)如上述(1)至(5)中任一項之方法，其中乳酪蛋白為牛乳酪蛋白。
(7)如上述(1)至(6)中任一項之方法，其中包含序列編 號1所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽的生成產率為5~10%或其以上。
(8)如上述(1)至(7)中任一項之方法，其中包含序列編號2所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽的生成產率為10~50%或其以上。
(9)如上述(1)至(8)中任一項之方法，其中包含序列編號1所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽、與包含序列編號2所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽之合計生成產率為15~60%或其以上。
(10)如上述(1)至(9)中任一項之方法，其中水解產物進而含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽。
(11)如上述(1)至(10)中任一項之方法，其中酵素觸媒進而含有具有肽酶活性之酵素。
(12)如上述(1)至(11)中任一項之方法，其中酵素觸媒係固定於載體上。
(13)如上述(1)至(12)中任一項之方法，其中乳酪蛋白之水解係使用乳汁而進行。
(14)如上述(1)至(13)中任一項之方法，其中酵素/乳酪 蛋白之重量比為1/100~1/1,000。
(15)如上述(1)至(14)中任一項之方法，其中於45~55℃下之水解反應之反應時間為2~10小時。
(16)如上述(1)至(15)中任一項之方法，其進而包括使酵素觸媒失活。
(17)如上述(1)至(16)中任一項之方法，其進而包括：對包含序列編號1所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，包含序列編號2所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，包含序列編號3所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，或者含有該等胜肽之至少2種以上之混合物進行單離及/或濃縮。
(18)一種水解產物，其特徵在於：其係藉由如上述(1)至(17)中任一項之方法所生成，並且以相對於水解產物之乾燥固體每1 g約為0.5 mg以上之量含有包含序列編號1~3所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽中之任一種以上。
(19)如上述(18)之水解產物，其係經乾燥者。
(20)一種飲食品，其含有如上述(18)或(19)之水解產物。
(21)一種補充品，其含有如上述(18)或(19)之水解產 物。
(22)如上述(20)之飲食品或如上述(21)之補充品，其為乳酸菌醱酵飲食品。
(23)如上述(20)之飲食品或如上述(21)之補充品，其為功能性食品。
(24)一種醫藥組合物，其含有如上述(18)或(19)之水解產物及製藥上可容許之載體。
(25)如上述(24)之醫藥組合物，其為腦功能改善用。
(26)如上述(25)之醫藥組合物，其中腦功能改善為健忘之改善或預防。
本發明之方法可酵素性效率良好地製造具有健忘改善、預防等腦功能改善作用之胜肽。
對本發明進一步詳細地進行說明。
1.具有腦功能改善作用之胜肽
藉由本發明之方法而由乳酪蛋白或含有乳酪蛋白之原料酵素性製造之胜肽類具有下述胺基酸序列。
．Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu(或NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)之胺基酸序列(序列編號1，以下有時亦稱為「N-E胜肽」)或此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列
．Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met(或NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM) 之胺基酸序列(序列編號2，以下有時亦稱為「N-EVM胜肽」)或此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列
．Ser Trp Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gln Ser Val Leu(或SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL)之胺基酸序列(序列編號3，以下有時亦稱為「S-SVL胜肽」)或此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸之之胺基酸序列
N-E胜肽係自N-EVM胜肽之C末端切除ValMet序列之胜肽。S-SVL胜肽雖然於序列上與該等2個胜肽不同，但均為自乳酪蛋白切出之胜肽，且均具有腦功能改善作用、尤其是健忘改善或預防作用之共同特性。關於健忘改善或預防作用，於下述實施例4~7中進行證明。
於本說明書中使用之所謂「腦功能改善作用」係指改善與記憶及癡呆有關之腦功能降低所伴隨之障礙的效果。
又，於本說明書中使用之所謂「健忘」係指記憶力減退，為記憶障礙之一種。因此，於本說明書中使用之所謂「健忘改善或預防」係指改善或預防記憶力之減退。
關於胜肽之胺基酸序列，於本說明書中所使用之「包含缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽」為包含序列編號1、2或3所示之胺基酸序列之胜肽之變異體(有時亦稱為「變異體胜肽」)，且具有與包含該序列編號1、2或3所示之胺基酸序列之胜肽的腦功能改善作用相同或與其類似之水準(例如為50%以上，較佳為80%以 上，更佳為100%以上)的腦功能改善作用。此種變異體胜肽另外亦可為包含序列編號1、2或3所示之胺基酸序列與具有89%以上、較佳為90%以上、進而較佳為94%以上之序列同源性之胺基酸序列的胜肽。於本說明書中所使用之「序列同源性」係指於對2個胺基酸序列以導入間隙或不導入間隙而成為最大一致率之方式進行比對時，同源胺基酸殘基數相對於包括間隙數在內之總胺基酸數之百分率(%)。序列同源性之%例如可藉由利用美國NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國立生物技術信息中心)所公開之BLAST、FASTA等公知之演算法而確定。
上述變異體胜肽之較佳例為包含序列編號1、2或3所示之胺基酸序列中含有1或2個胺基酸殘基之保存性胺基酸置換之胺基酸序列的胜肽。
於本說明書中使用之所謂「保存性胺基酸置換」係指如疏水性胺基酸、極性胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、具有分枝狀側鏈之胺基酸、芳香族胺基酸等般極性、電氣性質、構造性質等性質類似之胺基酸彼此之置換。疏水性(非極性)胺基酸之例為：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸等；極性胺基酸之例為：絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺、麩醯胺等；酸性胺基酸之例為：天冬醯胺酸與麩醯胺酸；鹼性胺基酸之例為：離胺酸、精胺酸及組胺酸；具有分枝狀側鏈之胺基酸之例為：纈胺酸、異白胺酸及白胺酸；芳香族胺基酸之 例為：苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及組胺酸。
上述變異體胜肽設為除了基於作為原料受質之酪蛋白之供給源差異的天然變異體以外，亦包含對序列編號1、2或3之胜肽之胺基酸進行人工改型之變異體者。此種變異體可藉由公知之胜肽合成技術而合成，又，可藉由下述實施例中所記載之功能試驗法而確認腦功能改善效果、尤其是健忘改善效果。
本發明之上述胜肽設為不僅包含游離形態而且包含鹽之形態者。其原因在於：於製造胜肽時，存在胜肽與原料之酪蛋白中所含有之鈣(Ca)離子、或源自用以溶解酪蛋白所使用之鹼性液的例如鈉(Na)離子、源自視需要使用之緩衝液的金屬離子等形成鹽之情況。又，預測藉由將胜肽設為鹽形態，胜肽會變得易溶於水。
2.胜肽之酵素性製法 2.1酵素性製法之一般程序
本發明之腦功能改善用胜肽可藉由利用含有蛋白酶之酵素觸媒水解乳酪蛋白而製造。
具體而言，本發明提供一種腦功能改善用胜肽之製造方法，其特徵在於：其包括利用含有蛋白酶之酵素觸媒水解乳酪蛋白，而生成含有上述N-E胜肽(序列編號1)或其變異體胜肽、上述N-EVM胜肽(序列編號2)或其變異體胜肽、或該等之混合物的水解產物，其中，該胜肽之各自生成產率為2%以上，較佳為5~10%或其以上，或者該混合物之合計生成產率為10%以上，較佳為15~60%或其以上。
乳酪蛋白為牛乳、羊乳、馬乳等獸乳之酪蛋白，較佳為牛乳酪蛋白。
於酵素反應中使用乳酪蛋白時，視需要一面將酪蛋白加熱至50℃以下一面逐步少量添加至苛性鈉水溶液等鹼性水溶液中並於攪拌下進行溶解後，利用鹽酸等酸將pH值調整至中性附近。
或者乳酪蛋白亦可為乳汁等含有酪蛋白之原料。於該情形時，無需如上述般之鹼性處理。
如先前技術所記載般，眾所周知將乳蛋白質酵素性水解所獲得之水解物使用於醫藥或食品等，但針對N-E胜肽及/或N-EVM胜肽之產生至今尚無報告而未為人所知。本發明之方法係提高該等新穎胜肽之生成產率之方法，且為具有新穎性及進步性者。
根據本發明之方法，於減少相對於酪蛋白量之酵素量時，同樣具有腦功能改善作用之上述S-SVL胜肽(序列編號3)或其變異體胜肽亦會與上述N-E胜肽或其變異體胜肽、及上述N-EVM胜肽或其變異體胜肽一同生成。
以下，進而說明酵素觸媒及反應條件。
2.2酵素觸媒
於本發明之方法中，用以水解乳酪蛋白之酵素觸媒係含有蛋白酶之酵素觸媒。此處，所謂「含有」之表述意指除蛋白酶以外，視需要亦可含有具有肽酶活性之酵素等水解酵素。
只要可自乳酪蛋白生成N-E胜肽或其變異體胜肽、及/或 N-EVM胜肽或其變異體胜肽，則不限定蛋白酶之來源或種類，即蛋白酶為水解蛋白質或多肽之酵素，於本發明中，亦包含細菌、酵母、菌類等微生物；藻類、植物、動物等中之任一者之蛋白酶。
於此種蛋白酶中，較佳者為中性蛋白酶或鹼性蛋白酶。中性蛋白酶為最佳pH值在中性區域之蛋白酶，鹼性蛋白酶為最佳pH值在鹼性區域之蛋白酶。由於本發明方法之反應pH值為pH值6.5~8.5，較佳為pH值7.0~8.0，故而更佳為於此種pH值範圍內具有水解活性之酵素。
於上述蛋白酶中，較佳例為絲胺酸蛋白酶。該酵素係通常於其活性中心具有絲胺酸、組胺酸及天冬醯胺酸之三組觸媒殘基的蛋白酶。
較佳之蛋白酶係可以上述產率自乳酪蛋白生成N-E胜肽或其變異體胜肽、及/或N-EVM胜肽或其變異體胜肽的源自微生物之蛋白酶。例如可使用源自屬於芽孢桿菌(Bacillus)屬或麴菌(Aspergillus)屬之微生物的蛋白酶、源自乳酸菌之蛋白酶等作為本發明方法之酵素。具體而言，較佳之蛋白酶為源自選自由地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)、麴菌屬(Aspergillus sp.)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、蜂蜜麴黴(Aspergillus melleus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)及嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)所組成群中之微生物的蛋白酶。酵素亦可為精製酵素、半精製酵素、粗製酵素、破碎菌體(較佳為冷 凍乾燥品)等中之任一形態，只要具有自乳酪蛋白切出上述胜肽之活性即可。
由於酵素具有受質特異性，故而如下述實施例所述，例如胰蛋白酶、胰酶等動物酵素，源自解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)等之蛋白酶等不適合本發明之方法。
適合本發明方法之蛋白酶例如可藉由下述實施例1所記載之方式選拔：將牛乳酪蛋白鈉約10 mg溶解於磷酸緩衝液(pH值7.0~7.3)中，以酵素/酪蛋白之重量比成為約1/200之方式添加試驗蛋白酶，於約35~約50℃之溫度下處理約1~4小時後，利用三氯乙酸停止反應，目標胜肽之生成例如使用高速液相層析三段四極棒質譜儀(LC/MS/MS，Waters TQD)，並藉由使用逆相之ODS(OctaDecyl Silane，十八烷基矽烷)管柱作為分離管柱、使用0.1%甲酸水溶液及含有0.1%甲酸之乙腈作為溶析液之梯度分析而分離各成分後，利用質譜儀檢測各胜肽，以合成胜肽作為標準物質製作校準曲線，並使用該校準曲線算出含量。
可於本發明之方法中使用之蛋白酶之例為源自地衣芽胞桿菌之鹼性蛋白酶「Protin SD-AY10」(商品名，Amano Enzyme公司製造)、源自麴菌屬之鹼性蛋白酶「Sumizyme MP」(商品名，新日本化學工業公司製造)等，但並不限定於該等。
於本發明之方法中使用之酵素觸媒亦可進而含有具有肽酶活性之酵素。此種具有肽酶活性之酵素具有用以自酪蛋 白生成上述N-E胜肽或其變異體胜肽、及/或上述N-EVM胜肽或其變異體胜肽之活性、或者用以自N-EVM胜肽生成N-E胜肽之活性。實際上，於下述實施例中所記載之表1及表4中，由胜肽生成之隨時間經過之變化得知，由於首先產生N-EVM胜肽，繼而產生N-E胜肽，故而認為藉由實際所使用之市售之酵素製劑中所含有之具有肽酶活性之酵素而自前驅物N-EVM胜肽生成N-E胜肽。
以下，例示可與上述蛋白酶組合使用之具有肽酶活性之酵素。
自胜肽之C末端游離出1個胺基酸之羧基肽酶(EC3.4.16.-、EC3.4.17.-、EC3.4.18.-)，例如羧基肽酶A(EC3.4.17.1)、羧基肽酶B(EC3.4.17.2)、羧基肽酶C(EC3.4.16.5)、羧基肽酶Y(EC3.4.16.5)等。或者自胜肽之C末端游離出2個胺基酸之肽基二肽酶(EC3.4.15.-)，例如肽基二肽酶A(EC3.4.15.1)、肽基二肽酶B(EC3.4.15.4)、肽基二肽酶Dcp(EC3.4.15.5)等。
羧基肽酶A(EC3.4.17.1)(http：//www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/17/1.html)雖會釋出C末端胺基酸，但由於對末端之-Asp、-Glu、-Arg、-Lys或-Pro幾乎或完全不發揮作用，故而認為難以分解N-E胜肽(NIPPLTQTPVVVPPFLQ-PE)之C末端-PE(-Pro-Glu)，另一方面，對於N-EVM胜肽(NIPPLTQTPVVVPPFLQ-PE-VM)，可水解C末端-VM(-Val-Met)而產生N-E胜肽。
羧基肽酶B(EC3.4.17.2)(http：//www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/ enzyme/EC3/4/17/2.html)為催化鹼性胺基酸水解之代表性羧基肽酶酵素，雖然認為不會直接對自N-EVM胜肽向N-E胜肽之轉化發揮作用，但可有助於該等胜肽之產生。
由於羧基肽酶Y(EC3.4.16.5)(http：//www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/16/5.html)具有較廣之受質特異性，故而可有助於產生N-E胜肽等胜肽。
由於肽基二肽酶A(EC3.4.15.1)(http：//www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/15/1.html)會釋出寡肽+Xaa-Yaa(其中，Xaa並非Pro，Yaa非Asp亦非Glu)之C末端二胜肽Xaa-Yaa，故而認為不會自N-E胜肽(NIPPLTQTPVVVPPFLQ-PE)之C末端-PE(-Pro-Glu)分解，另一方面，對於N-EVM胜肽(NIPPLTQTPVVVPPFLQ-PE-VM)，可水解C末端-VM(-Val-Met)而產生胜肽N-E。
由於肽基二肽酶B(EC3.4.15.4)(http：//www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/15/4.html)具有較廣之受質特異性，故而可有助於產生N-E胜肽等胜肽。
由於肽基二肽酶Dcp(EC3.4.15.5)(http：//www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/15/5.html)具有較廣之受質特異性，故而可有助於產生N-E胜肽等胜肽。
於具有肽酶活性之酵素中，除上述所例示之酵素類以外，例如可列舉蛋白內切酶Glu-C(EC3.4.21.19)或具有相同活性之酵素。該酵素為選擇性水解蛋白質或胜肽中之麩醯胺酸(Glu)之C末端側的酵素(http：//www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/21/19.html)。
於本發明之方法中使用之具有肽酶活性之酵素只要為上述具有酵素活性者，則亦可為精製酵素、半精製酵素、粗製酵素、破碎菌體(較佳為冷凍乾燥品)等中之任一形態。
於本發明方法中之酵素觸媒較佳為將至少1種上述蛋白酶與至少1種上述具有肽酶活性之酵素組合而成之觸媒。於該情形時，該等酵素之添加方法並無特別限制，例如可使用下述方法：於水解反應時，可同時存在於反應體系中，或者亦可先添加蛋白酶進行反應，然後再於N-EVM胜肽或其變異體胜肽之產生大致成為最大之時刻向反應體系中添加具有肽酶活性之酵素等。
酵素觸媒另外亦可固定於載體上。載體只要為通常可用於酵素之固定化者則無特別限制。將酵素結合於載體上之方式，可為共價鍵或亦可為非共價鍵。於為共價鍵之情形時，可將溴化氰、N-羥基順丁烯二醯亞胺、鄰苯二甲醛、二異氰酸酯、醯亞胺酯等之反應性基與載體結合，並將此種基與酵素結合。於為非共價鍵之情形時，可利用物理吸附或凡得瓦力、離子鍵結、交聯、包埋、微膠囊等方式與載體結合。載體非限定性地為礦物、金屬、聚合物、多糖類等。礦物例如包括浮石、多孔性玻璃等。金屬例如包括磁性體、陶瓷等。聚合物例如包括聚丙烯醯胺凝膠、離子交換樹脂、光交聯性樹脂預聚物、胺基甲酸酯預聚物等。多糖類例如包括κ-角叉菜膠、海藻酸鹽等。
蛋白酶及具有肽酶活性之酵素可一併或分別固定於載體上。
2.3反應條件
酵素性水解反應亦可以連續式或批次式之任一方式進行。連續式一般使用固定化酵素觸媒，另一方面，批次式係使用非固定化酵素觸媒。
於使用固定化酵素觸媒時，將觸媒填充於可控制溫度之管柱中，並向其中連續地以固定流速流入酪蛋白溶液。隨時間經過對反應液取樣，監測目標胜肽之產生，於成為最高生成含量之時刻回收反應液。
於為非固定化酵素觸媒之情形時，於附帶攪拌且可控制溫度之反應槽中添加酪蛋白溶液與酵素觸媒，以批次式進行反應，同樣地監測目標胜肽之產生，於成為最高生成含量之時刻回收反應液。
受質原料之乳酪蛋白為上述獸乳酪蛋白，較佳為牛乳酪蛋白，且較佳為易溶於水之乳酪蛋白鹽、例如乳酪蛋白鈉之形態。通常，乳酪蛋白鈉例如可藉由於水中懸浮酪蛋白，並於攪拌下添加少量苛性鈉水溶液而製備，或者亦可於苛性鈉水溶液中添加少量酪蛋白，並視需要於酪蛋白之添加後進行pH值之調整。或者亦可直接使用或濃縮使用含有酪蛋白之乳汁來代替乳酪蛋白鹽。
由於酵素具有最佳pH值，故而較佳為以反應中無pH值變動之方式含有緩衝液，只要可控制pH值則未必需要緩衝劑。作為緩衝液，使用可維持自中性區域至弱鹼性區域之範圍之pH值、例如pH值6.5~8.5、較佳為pH值7.0~8.0之緩衝液。此種緩衝液例如包括：磷酸緩衝液、三羥甲基胺基 甲烷鹽酸緩衝液、氯化銨緩衝液等。緩衝液係以可見緩衝作用之量添加至受質原料溶液中。
各酵素/乳酪蛋白之重量比為1/50~1/2,000，較佳為1/100~1/1,000，進而較佳為1/150~1/250，例如為1/200。或者相對於乳酪蛋白每1 g以蛋白酶計為1~100,000單位(U)，較佳為10~50,000單位(U)，進而較佳為50~10,000單位(U)(此處，1U係指1分鐘內分解1 μmol受質之酵素活性)，但亦可根據酵素之種類或性質進行調節。
反應溫度只要為酵素不失活之溫度即可，通常為30~60℃，較佳為45~55℃。若為耐熱性酵素，則亦可於超過該範圍之溫度下使用，較佳為設為不會使受質之酪蛋白凝固之溫度。
反應時間根據酵素之種類或溫度等而變化，通常為1~12小時，較佳為2~10小時，進而較佳為3~7小時。
對反應進行監測，進行反應直至目標胜肽之生成含量達到特定值。
根據本發明之方法，上述N-E胜肽(序列編號1)或其變異體胜肽的生成產率為2~10%或其以上，及/或上述N-EVM胜肽(序列編號2)或其變異體胜肽的生成產率為10~50%或其以上，以及上述N-E胜肽或其變異體胜肽與上述N-EVM胜肽或其變異體胜肽之合計生成產率為15~60%或其以上。尤其於藉由上述具有肽酶活性之酵素之作用而實現自N-EVM胜肽向N-E胜肽之轉換之情形時，預測N-E胜肽之生成產率進一步提高。於本發明之方法中，通常生成上述 胜肽之混合物，但較佳為獲得富含N-E胜肽之混合物。
本說明書中使用之所謂「生成產率」係各生成胜肽之莫耳濃度相對於由β-酪蛋白之平均分子量算出之莫耳濃度的百分率(%)。具體而言，例如將含有N-E胜肽(序列編號1)與N-EVM胜肽(序列編號2)及S-SVL胜肽(序列編號3)序列之牛乳酪蛋白中之β-酪蛋白之平均分子量設為25100，又，對於N-E胜肽(序列編號1)將胜肽之分子量設為2086.4，對於N-EVM胜肽(序列編號2)將胜肽之分子量設為2316.8，對於S-SVL胜肽(序列編號3)將胜肽之分子量設為2550.0，進而將牛乳酪蛋白中之β-酪蛋白之含有比率設為約30%而確定生成產率。
於本發明之方法中，藉由改變酵素之種類或酵素量，可以約為3~70%之生成產率生成S-SVL胜肽(序列編號3)或其變異體胜肽(參照圖1~圖4)。例如於以酵素/酪蛋白為1/1,000(重量比)使用酵素製劑「Protin SD-AY10」(商品名，90,000 PU/g以上，Amano Enzyme公司製造)進行水解反應時，於約4小時內以約65%之產率生成該胜肽(參照表5)。另一方面，於以酵素/酪蛋白為1/200(重量比)使用相同酵素並同樣地進行水解反應時，於4小時內且11%之產率生成(參照表4)。又，於使用「Sumizyme MP」(商品名，新日本化學工業公司製造)作為酵素製劑時，S-SVL胜肽之產率隨反應時間之經過而自約10%降至0%(參照表6、表7)。
於反應結束後，通常使酵素觸媒失活。失活例如可藉由加熱至約60℃~約75℃而進行。
3.水解產物
本發明進而提供一種水解產物，其特徵在於：其係藉由上述方法所製造之水解產物，並且以相對於水解產物之乾燥固體每1 g約為0.5 mg以上之量含有1種以上之包含序列編號1~3所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽中之任一者。
此處，所謂「水解產物」通常指藉由利用上述方法之乳酪蛋白之水解反應所獲得之反應液(較佳為酵素失活後之反應液)或其濃縮物。
該水解產物之特徵在於：以相對於水解產物之乾燥固體每1 g約為0.5 mg以上、較佳為約1.0 mg以上、進而較佳為約10~15 mg或其以上之量含有N-E胜肽或其變異體胜肽。
水解產物可進而含有相對於水解產物之乾燥固體每1 g為約1.0~20 mg或其以上之N-EVM胜肽或其變異體胜肽、及/或相對於水解產物之乾燥固體每1 g為約1.0~20 mg或其以上之S-SVL胜肽或其變異體胜肽。
較佳為於水解產物中之N-E胜肽或其變異體胜肽與N-EVM胜肽或其變異體胜肽之合計含量相對於水解產物之乾燥固體每1 g約為1.5~4.0 mg或其以上，較佳為約10~30 mg或其以上。
本發明之水解產物可直接使用，或亦可藉由超過濾等進行濃縮，或者亦可進行乾燥。乾燥較佳為冷凍乾燥，亦可於濃縮後進行冷凍乾燥。
視需要可自水解產物分別單離上述N-E胜肽或其變異體胜肽、上述N-EVM胜肽或其變異體胜肽、及上述S-SVL胜肽或其變異體胜肽，或亦可將N-E胜肽或其變異體胜肽及N-EVM胜肽或其變異體胜肽與S-SVL胜肽或其變異體胜肽分離。於為後者之情形時，可以混合物之形式分離N-E胜肽或其變異體胜肽及N-EVM胜肽或其變異體胜肽，並以富含該等成分、較佳為富含N-E胜肽或其變異體胜肽之方式進行濃縮。
胜肽之單離及濃縮亦可藉由適宜組合通常之技術，例如凝膠過濾、離子交換層析法、親和層析法、矽膠層析法、HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析法)等層析法、結晶化、鹽析、有機溶劑沈澱、超過濾等技術方法而進行。又，亦可藉由該操作去除緩衝劑成分等。
4.於醫藥及食品中之應用
本發明之水解產物或上述胜肽類有如下功效：具有改善腦功能之作用，例如改善或預防健忘，增強記憶力。如上所述，健忘係指記憶力減退，為一種記憶障礙。此種效果可利用下述實施例證明。因此，為了治療或預防由腦功能降低引起之症狀及疾病、例如抑鬱症、精神分裂症、譫妄症、癡呆症(腦血管性癡呆症、阿茲海默氏病等)等疾病或症狀，可使用本發明之水解產物或上述胜肽類，或亦可於雖未達此種疾病之程度但確認為健忘症狀之情形時使用。
4.1於醫藥中之應用
本發明進而提供一種含有上述水解產物及製藥上可容許之載體之醫藥組合物。
水解產物含有上述胜肽中之至少N-E胜肽。又，水解產物亦可以液體或固體中之任一形態含有於載體中。
根據本發明之實施形態，醫藥組合物為腦功能改善用。更具體而言，該醫藥組合物為健忘之改善或預防用。
作為可適用之疾病，為如上所述之由腦功能降低引起之症狀及疾病，例如抑鬱症、精神分裂症、譫妄症、癡呆症(腦血管性癡呆症、阿茲海默氏病等)等疾病或症狀。
於本發明之醫藥組合物中之作為有效成分的水解產物之用量並無特別限制，換算為各胜肽之重量，一般而言較佳為0.1 μg/kg體重~1 mg/kg體重，但不限定於該範圍內。投予用量可根據年齡、性別、症狀之程度等而決定。
投予路徑例如為經口投予、靜脈內投予、經黏膜投予、鼻腔內投予、直腸內投予等，較佳為經口投予。投予可對被試驗者進行1日1次，或分複數次進行。
本說明書中所稱之被試驗者通常為人，但亦包括人類以外之哺乳動物、例如狗等寵物動物。
作為投予形態(或製劑)，可為固體製劑及液體製劑中之任一形態，例如可列舉：錠劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、溶液劑、注射劑、粉末劑、噴霧製劑等。
製藥上可容許之載體包括賦形劑或稀釋劑，例如可列舉：葡聚糖類、蔗糖、乳糖、麥芽糖、木糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、明膠、羧甲基纖維素、羧乙基纖維 素、羥丙基甲基纖維素、阿拉伯膠、古亞膠、黃蓍膠、丙烯酸系共聚物、乙醇、生理食鹽水、林格氏溶液等。
除上述載體以外，視需要亦可添加防腐劑、穩定劑、黏合劑、pH值調節劑、緩衝劑、增黏劑、凝膠化劑、抗氧化劑等添加劑。該等添加劑較佳為製藥時使用者。
本發明之醫藥組合物亦可與具有腦功能改善效果之其他醫藥品組合使用。於此種醫藥品中，例如可列舉下述者，較佳為市售之醫藥品。
癡呆症治療藥物例如為乙醯膽鹼酯酶抑制劑(多奈哌齊、加蘭他敏(Galantamine)、利伐斯的明(Rivastigmine)、他克林(tacrine)等)、NMDA(N-Methyl-D-Aspartic acid，N-甲基-D-天冬醯胺酸)受體拮抗劑(美金剛胺(memantine)等)等。
抗焦慮藥例如為苯二氮呯系抗焦慮藥等。
抗抑鬱藥例如為：選擇性血清素再吸收抑制劑(Selective Serotonin Reuptake Inhibitor，SSRI)、血清素-去甲腎上腺素(noradrenaline(去甲腎上腺素))再吸收抑制劑(Serotonin-Norepinephrine Reuptake Inhibitors，SNRI)、三環系抗抑鬱藥(Tricyclic Antidepressant，TCA)、四環系抗抑鬱藥、三唑并吡啶系抗抑鬱藥(Serotonin-2 Antagonist and Reuptake Inhibitors，SARI)、單胺氧化酶抑制劑(MAO(Monoamine Oxidase)抑制劑)、去甲腎上腺素功能性-特異性血清素功能性抗抑鬱藥(Noradrenergic and Specific Serotonergic Antidepressants，NaSSA)、去甲腎上腺素-多 巴胺再吸收抑制劑(Norepinephrine-Dopamine Reuptake Inhibitor，NDRI)等。
抗精神病藥。
安眠藥。
該等醫藥品可於投予本發明之醫藥組合物之同時、或投予前、或者投予後之任一時刻投予。於採用市售醫藥品之情形時，其用量較佳為醫藥製造商所指示之用量。
4.2於食品或飼料中之應用
本發明進而提供一種含有上述水解產物之飲食品或補充品。
由於水解產物具有腦功能改善作用、尤其是健忘之改善或預防作用，故而此種飲食品或補充品為功能性飲食品或健康食品。例如包括向乳酸菌醱酵液中添加該水解產物所獲得之飲食品或補充品。此處，所謂補充品為1種包含膳食增補劑(dietary supplement)之食品劃分，於本說明書中係指可提供腦功能改善作用之功能輔助物質。
亦可使用水解產物作為非人類動物之飼料之原材料。例如為狗之情形時，可於製造狗飼料時調配水解產物。
作為飲食品，並不限定於下述者，例如可列舉：各種飲料、酸乳酪、乳酪、奶油、乳酸菌醱酵品等各種乳製品、流質食物、果凍、糖果、蒸煮食品、模壓點心、曲奇、蛋糕、麵包、餅乾、巧克力等。
於為功能性飲食品、或健康食品或者補充品之情形時，可製成固形物、凝膠狀物、液狀物中之任一形態，例如可 製成各種加工飲食品、粉末、錠劑、丸劑、膠囊、果凍、顆粒等形態。
於飲食品中可適宜調配食品用之碳水化合物、蛋白質、脂質、維生素類、礦物質類、糖類(葡萄糖等)、天然或人工甜味劑、檸檬酸、碳酸水、果汁、穩定劑、保存劑、黏合劑、增黏劑、乳化劑等。
水解產物之調配量並無特別限定，可換算為各胜肽之重量而設為0.1 μg/kg體重~1 mg/kg體重。或者，該調配量相對於飲食品每100 g為10 μg~500 mg，進而較佳為100 μg~100 mg，但並不限定於此。根據每1日之攝取次數，可較上述量進一步減少食品、例如功能性食品之每1次之攝取量。適當之攝取量可考慮到各種主要因素而進一步調整。
於本發明之飲食品或補充品中可進一步組合調配其他被認為具有腦功能改善作用之下述原材料或化合物。
食品成分，例如為銀杏葉萃取物、花生四烯酸(Arachidonic Acid，ARA)、γ-胺基丁酸(γ-aminobenzoic acid，GABA)、茶胺酸、腦醯胺、咖啡因、肉鹼、α-甘油磷醯膽鹼(α-GPC(GlyceroPhosphoryl Choline))、假馬齒莧(Bacopa monniera)、DHA(Docosahexaenoic acid，二十二碳六烯酸)結合磷脂質、磷脂醯絲胺酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂醯膽鹼、聖約翰草、蝦紅素、菸鹼酸、吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)、輔酶Q10(Coenzyme Q10)等。
不飽和脂肪酸，例如為二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EicosaPentaenoic acid，EPA)等。多酚類例如為白藜蘆醇等。
漂木酸等。
兒茶酸類等。
該等原材料或化合物之調配量為可確認效能之公知範圍內。
[實施例]
以下，列舉實施例更具體地說明本發明，但本發明之範圍不受該等實施例之限制。
(實施例1)
利用使用源自微生物之酵素之酪蛋白水解的Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)及Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)之胜肽之酵素性製法
於1 ml之pH值7.0~7.3之磷酸緩衝液中分散溶解源自牛乳之酪蛋白鈉10 mg，將溫度調整為50℃而製備受質溶液。於所獲得之受質溶液中以酵素/酪蛋白之重量比成為1/100~1/400之方式添加表1所示之市售之各種酵素，於 50℃下反應4小時，繼而以最終濃度成為1%之方式於反應液中添加10%三氯乙酸水溶液而停止反應。繼而，所獲得之溶液中所含有之各胜肽之定量係於使用高速液相層析三段四極棒質譜儀(LC/MS/MS，Waters TQD)，並藉由使用逆相之ODS管柱作為分離管柱、使用0.1%甲酸水溶液及含有0.1%甲酸之乙腈作為溶析液的梯度分析而分離各成分後，利用質譜儀檢測各胜肽，並使用以合成胜肽作為標準物質所製作之校準曲線而算出含量。
序列編號1、序列編號2、序列編號3之各胜肽之產率係將用於研究之酪蛋白鈉溶液10 mg/ml中之β-酪蛋白濃度設為3 mg/ml、β-酪蛋白之分子量設為25100、序列編號1之分子量設為2086.4、序列編號2之分子量設為2316.8、序列編號3之分子量設為2550.0而求出估算值。
由表1所示之結果顯示：藉由使用源自芽孢桿菌(Bacillus)屬及麴菌(Aspergillus)屬之中性蛋白酶或具有鹼性蛋白酶活性之酵素之酪蛋白的水解，可以高產率獲得Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)及Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)。
(1)Amano Enzyme公司製造、(2)新日本化學工業公司製造、(3)Sigma-Aldrich公司製造
(比較例1)
利用使用酸性蛋白酶之酪蛋白水解的Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)及Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)之胜肽之酵素性製法
將源自牛乳之酪蛋白鈉10 mg分散溶解於1 ml之pH值4.0之乙酸緩衝液中，將溫度調整為40℃而製備受質溶液。於 所獲得之受質溶液中以酵素/酪蛋白之重量比成為1/200之方式添加表2所示之市售之各種酵素，於40℃下反應3小時，繼而以最終濃度成為1%之方式於反應液中添加10%三氯乙酸水溶液而停止反應。繼而，所獲得之溶液中所含有之各胜肽之定量係於使用高速液相層析三段四極棒質譜儀(LC/MS/MS，Waters TQD)，並藉由使用逆相之ODS管柱作為分離管柱、使用0.1%甲酸水溶液及含有0.1%甲酸之乙腈作為溶析液之梯度分析而分離各成分後，利用質譜儀檢測各胜肽，並使用以合成胜肽作為標準物質所製作之校準曲線而算出含量。又，各胜肽之產率係以與實施例1相同之方式求出估算值。
由表2所示之結果顯示：於使用具有酸性蛋白酶活性之酵素之酪蛋白之水解中，幾乎不生成Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)及Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)。
(1)Sigma-Aldrich公司製造
(比較例2)
利用使用源自哺乳類之胰酶及胰蛋白酶之酪蛋白水解的Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)及Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)之胜肽之酵素性製法
將源自牛乳之酪蛋白鈉10 mg分散溶解於1 ml之pH值7.3之磷酸緩衝液中，將溫度調整為50℃而製備受質溶液。於所獲得之受質溶液中以酵素/酪蛋白之重量比成為1/200之方式添加表3所示之市售酵素胰酶及胰蛋白酶，於50℃下反應4小時，繼而以最終濃度成為1%之方式於反應液中添加10%三氯乙酸水溶液而停止反應。繼而，於所獲得之溶液中所含有之各胜肽之定量係於使用高速液相層析三段四極棒質譜儀(LC/MS/MS，Waters TQD)，並藉由使用逆相之ODS管柱作為分離管柱、使用0.1%甲酸水溶液及含有0.1%甲酸之乙腈作為溶析液之梯度分析而分離各成分後，利用質譜儀檢測各胜肽，並使用以合成胜肽作為標準物質所製作之校準曲線而算出含量。又，各胜肽之產率係以與實施例1相同之方式求出估算值。
由表3所示之結果顯示：於使用源自哺乳類酵素之胰酶及胰蛋白酶之酪蛋白之水解中，幾乎不生成Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)及Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)。
(1)Sigma-Aldrich公司製造、(2)和光純藥工業公司製造
(實施例2)
生成Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)及Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)之最佳反應時間之研究
將源自牛乳之酪蛋白鈉10 mg分散溶解於1 ml之pH值7.3 之磷酸緩衝液中，將溫度調整為50℃而製備受質溶液。於所獲得之受質溶液中以酵素/酪蛋白之重量比成為1/200及1/1000之方式添加地源自衣芽胞桿菌之酵素Protin SD-AY10(Amano Enzyme公司製造)，於50℃下反應7小時，隨時間經過每1小時回收反應液。於回收時，以最終濃度成為1%之方式於反應液中添加10%三氯乙酸水溶液而停止反應。繼而，所獲得之溶液中所含有之各胜肽之定量係於使用高速液相層析三段四極棒質譜儀(LC/MS/MS，Waters TQD)，並藉由使用逆相之ODS管柱作為分離管柱、使用0.1%甲酸水溶液及含有0.1%甲酸之乙腈作為溶析液之梯度分析而分離各成分後，利用質譜儀檢測各胜肽，並使用以合成胜肽作為標準物質所製作之校準曲線而算出含量。又，各胜肽之產率係以與實施例1相同之方式求出估算值。
根據表4、圖1及表5、圖2所示之結果，Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)及Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)之產率之合計係於以酵素/酪蛋白之重量比為1/200進行添加時，於開始反應後4小時顯示出最大值(圖1)。又，同樣地Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)之產率於以 酵素/酪蛋白之重量比為1/1000進行添加時，於開始反應後4小時顯示出最大值(圖2)。由以上明確：藉由以短時間停止反應，可以高產率獲得該等胜肽。
(實施例3)
生成Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(序列編號1)及Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(序列編號3)之最佳反應時間之研究
將源自牛乳之酪蛋白鈉10 mg分散溶解於1 ml之pH值7.0 或8.0之磷酸緩衝液中，將溫度調整為50℃而製備受質溶液。於所獲得之受質溶液中以酵素/酪蛋白之重量比成為1/200之方式添加源自麴菌屬之酵素Sumizyme MP(新日本化學工業公司製造)，於50℃下反應7小時，隨時間經過每1小時回收反應液。於回收時，以最終濃度成為1%之方式於反應液中添加10%三氯乙酸水溶液而停止反應。繼而，所獲得之溶液中所含有之各胜肽之定量係於使用高速液相層析三段四極棒質譜儀(LC/MS/MS，Waters TQD)，並藉由使用逆相之ODS管柱作為分離管柱、使用0.1%甲酸水溶液及含有0.1%甲酸之乙腈作為溶析液之梯度分析而分離各成分後，利用質譜儀檢測各胜肽，並使用以合成胜肽作為標準物質所製作之校準曲線而算出含量。又，各胜肽之產率係以與實施例1相同之方式求出估算值。
根據表6、圖3及表7、圖4所示之結果，Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(序列編號1)及Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(序列編號2)之產率之合計於pH值7.0、pH值8.0並且開始反應後2~3小時顯示出最大值。又，同樣地Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(序列編號3)之產率於開始反應後1小時顯示出最大值，但隨著時間之經過而降低。由以上明確，藉由以短時間停止反應，可以高產率獲得該等胜肽。
(實施例4)
Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)之健忘預防作用
使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=15-75)使之自由攝取食餌及水。使用Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu 0.05 nmol/kg體重(0.1 μg/kg體重)、0.5 nmol/kg體重(1 μg/kg體重)、1.5 nmol/kg體重(3 μg/kg體重)、5 nmol/kg體重(10 μg/kg體重)、50 nmol/kg體重(100 μg/kg體重)、500 nmol/kg體重 (1000 μg/kg體重)作為被試驗物質。於實施評價自發性交替行動之Y字迷宮試驗60分鐘前對小鼠單次經口投予被試驗物質。又，於實施Y字迷宮試驗30分鐘前，為了對小鼠誘發腦功能障礙(記憶障礙及/或癡呆障礙)，以成為1 mg/kg體重之方式於背部皮下投予莨菪胺。於Y字迷宮試驗中，使用一根臂之長度為40 cm、壁高度為12 cm、地板寬度為3 cm、上部寬度為10 cm且以120度之角度分別連接3根臂之Y字迷宮作為實驗裝置。將小鼠置於Y字迷宮之任一臂之前端，於8分鐘內使之自由探索迷宮內，並依序記錄小鼠所移動之臂。對小鼠於測定時間內移動至各臂之次數進行計數，將其設為總進入數，並研究其中連續選擇不同之三個臂之組合(例如，於將3根臂分別設為A、B、C時，於所進入之臂之順序為ABCBACACB之情形時，包括重複在內而計數為4)，將該數設為自發性交替行動數。將用自發性交替行動數除以總進入數減2之數並乘以100所求出之值設為自發性交替行動變化率，並將其設為自發性交替行動之指標。本指標之值越高，表示越可保持短期記憶。測定值係以每個群組之平均值±標準誤差表示。對照群與莨菪胺對照群之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。又，莨菪胺對照群與NIPPLTQTPVVVPPFLQPE投予群之顯著差異檢驗係於單向配置分散分析後利用Dunnett(Dunnett)型多重比較檢驗而進行。將結果示於圖5。顯示出NIPPLTQTPVVVPPFLQPE於0.05 nmol/kg體重~500 nmol/kg體重(0.1 μg/kg體重~1000 μg/kg體重)之範圍 內具有健忘預防作用。
(實施例5)
Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)相關胜肽之健忘預防作用
使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=15-45)使之自由攝取食餌及水。使用Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu 50 nmol/kg體重(100 μg/kg體重)、或Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM)50 nmol/kg體重(120 μg/kg體重)作為被試驗物質。於實施評價自發性交替行動之Y字迷宮試驗60分鐘前對小鼠單次經口投予被試驗物質。又，於實施Y字迷宮試驗30分鐘前，為了對小鼠誘發腦功能障礙(記憶障礙及/或癡呆障礙)，以成為1 mg/kg體重之方式於背部皮下投予莨菪胺。於Y字迷宮試驗中，使用一根臂之長度為40 cm、壁高度為12 cm、地板寬度為3 cm、上部寬度為10 cm且以120度之角度分別連接3根臂之Y字迷宮作為實驗裝置。將小鼠置於Y字迷宮之任一臂之前端，於8分鐘內使之自由探索迷宮內，並依序記錄小鼠所移動之臂。對小鼠於測定時間內移動至各臂之次數進行計數，將其設為總進入數，並研究其中連續選擇不同之三個臂之組合(例如於將3根臂分別設為A、B、C時，於所進入之臂之順序為ABCBACACB之情形時，包括重複在內而計數為4)， 將該數設為自發性交替行動數。將用自發性交替行動數除以總進入數減2之數並乘以100所求出之值設為自發性交替行動變化率，並將其設為自發性交替行動之指標。本指標之值越高，表示越可保持短期記憶。測定值係以每個群組之平均值±標準誤差表示。對照群與莨菪胺對照群之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。又，莨菪胺對照群與各胜肽投予群之顯著差異檢驗係於單向配置分散分析後利用Dunnett(Dunnett)型多重比較檢驗而進行。將結果示於圖6。顯示出NIPPLTQTPVVVPPFLQPE於50 nmol/kg體重(100 μg/kg體重)，NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM於50 nmol/kg體重(120 μg/kg體重)時具有健忘預防作用。
(實施例6)
Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)之記憶力增強作用
使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=14-15)使之自由攝取食餌及水。使用Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu 500 nmol/kg體重(1000 μg/kg體重)作為被試驗物質。被試驗物質係於實施評價記憶保持之新奇物體識別試驗60分前對小鼠單次經口投予。於新奇物體識別試驗中，使用30×30×30 cm之箱作為實驗裝置。馴化操作係於鋪設墊料之實驗裝置內放入小鼠5分鐘使之自由探索裝置內。於馴化操作之次日實施訓練試驗。訓練試驗中，於3種物體中選擇2個設置於實驗裝 置內(物體沿地板之中心線分別位於自兩側之壁起8 cm之位置，將其位置設為X1及X2)。再者，針對所設置之物體之選擇，以動物及群組間無偏差之方式預先無規地選擇。於經口投予被試驗物質或水60分鐘後，將小鼠放入實驗裝置中5分鐘，測定小鼠對各物體接近、探索1 cm以內之時間(秒)。於訓練試驗之48小時後實施保持試驗。保持試驗中，以與訓練試驗相同之方式於實驗裝置內設置2個物體，但將其中1個更換為與訓練試驗所使用者不同之物體(新奇物體)，將其位置設為Y(作為例，於訓練試驗中將物體A設置於X1、將物體B設置於X2之情形時，於保持試驗中設置物體C代替物體A作為新奇物體，將其位置設為Y)。針對訓練試驗及保持試驗，測定小鼠對各物體接近、探索1 cm以內之時間(秒)(其中，去除在物體上之狀態)。針對訓練試驗及保持試驗，分別求出對2個物體進行探索之時間之比率。對各物體之探索時間之比率(%)，各群均以平均值±標準誤差表示。顯著差異檢驗係針對在保持試驗中對新奇物體(設置於Y上之物體)之探索時間之比率、與訓練試驗中對設置於放置有新奇物體之位置之物體(設置於X1或X2處之物體)之探索時間之比率，於對照群與胜肽群之間利用學生(Student)t檢驗進行。將結果示於圖7。顯示出NIPPLTQTPVVVPPFLQPE於500 nmol/kg體重(1000 μg/kg體重)時具有記憶力增強作用。
(實施例7)
Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val- Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL)之健忘預防作用
使用ddY系雄性小鼠(約7週齡)(n=15-30)使之自由攝取食餌及水。使用Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu 150 nmol/kg體重(380 μg/kg體重)、500 nmol/kg體重(1280 μg/kg體重)作為被試驗物質。被試驗物質係於實施評價自發性交替行動之Y字迷宮試驗60分鐘前對小鼠單次經口投予。又，於實施Y字迷宮試驗30分鐘前，為了對小鼠誘發腦功能障礙(記憶障礙及/或癡呆障礙)，以成為1 mg/kg體重之方式於背部皮下投予莨菪胺。於Y字迷宮試驗中，使用一根臂之長度為40 cm、壁高度為12 cm、地板寬度為3 cm、上部寬度為10 cm且以120度之角度分別連接3根臂之Y字迷宮作為實驗裝置。將小鼠置於Y字迷宮之任一臂之前端，於8分鐘內使之自由探索迷宮內，並依序記錄小鼠所移動之臂。對小鼠於測定時間內移動至各臂之次數進行計數，將其設為總進入數，並研究其中連續選擇不同之三個臂之組合(例如，於將3根臂分別設為A、B、C時，於所進入之臂之順序為ABCBACACB之情形時，包括重複在內而計數為4)，將該數設為自發性交替行動數。將用自發性交替行動數除以總進入數減2之數並乘以100所求出之值設為自發性交替行動變化率，並將其設為自發性交替行動之指標。本指標之值越高，表示越可保持短期記憶。測定值係以每個群組之平均值±標準誤差表示。對照群與莨菪胺對照群 之間之顯著差異檢驗係利用學生(Student)t檢驗而進行。又，莨菪胺對照群與SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL投予群之顯著差異檢驗係利用學生t檢驗而進行。將結果示於圖8。顯示出SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL於150 nmol/kg體重~500 nmol/kg體重(380 μg/kg體重~1280 μg/kg)之範圍內具有健忘預防作用。
[產業上之可利用性]
根據本發明，可提供一種以作為食品係安全之乳酪蛋白為原料進行酵素性水解而獲得之新穎之腦功能改善用胜肽。由於該胜肽尤其具有健忘之改善或預防效果，故而對於記憶減退之症狀之減輕或改善有用。
[序列表自由內容]
序列編號1~3：牛酪蛋白衍生胜肽
圖1係表示於含有乳牛酪蛋白鈉之磷酸緩衝液(pH值7.0-7.3)中以酵素/酪蛋白之重量比成為1/200之方式添加地源自衣芽胞桿菌之酵素Protin SD-AY10(Amano Enzyme公司製造)進行水解反應時之Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)、Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu (SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)之生成產率之隨時間經過之變化。
圖2係表示於含有乳牛酪蛋白鈉之磷酸緩衝液(pH值7.0-7.3)中以酵素/酪蛋白之重量比成為1/1,000之方式添加地源自衣芽胞桿菌之酵素Protin SD-AY10(Amano Enzyme公司製造)進行水解反應時之Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)、Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)之生成產率之隨時間經過之變化。
圖3係表示於含有乳牛酪蛋白鈉之磷酸緩衝液(pH值7.0)中以酵素/酪蛋白之重量比成為1/200之方式添加源自麴菌屬之酵素Sumizyme MP(新日本化學工業公司製造)進行水解反應時之Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)、Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu (SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)之生成產率之隨時間經過之變化。
圖4係表示於含有乳牛酪蛋白鈉之磷酸緩衝液(pH值8.0)中以酵素/酪蛋白之重量比成為1/200之方式添加源自麴菌屬之酵素Sumizyme MP(新日本化學工業公司製造)進行水解反應時之Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE：序列編號1)、Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM：序列編號2)及Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu(SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL：序列編號3)之生成產率之隨時間經過之變化。
圖5係表示胜肽Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)之莨菪胺誘發健忘預防效果。將水(對照)、或單獨將莨菪胺、或者將NIPPLTQTPVVVPPFLQPE 0.05 nmol/kg體重或0.5 nmol/kg體重或1.5 nmol/kg體重或5 nmol/kg體重或50 nmol/kg體重或500 nmol/kg體重與莨菪胺一併投予小鼠，藉由實施例4所記載之方法分別評價健忘預防效果。圖4之縱軸表示自發性交替行動變化率。圖表自左起依序表示對照群、莨菪胺對照群、NIPPLTQTPVVVPPFLQPE 0.05 nmol/kg體重、0.5 nmol/kg體重、1.5 nmol/kg體重、5 nmol/kg體重、50 nmol/kg體重、500 nmol/kg體重投予群之自發性交替行動變化率。為了確認是否誘發健忘，藉由學生t檢驗進行水投予對照群與單獨投予莨菪胺之莨菪胺對照群之間之顯著差異檢驗。＊＊表示相對於水投予對照群為P<0.01。NIPPLTQTPVVVPPFLQPE投予群與莨菪胺對照群之顯著差異檢驗係藉由Dunnett型多重比較檢驗而進行。#表示相對於莨菪胺對照群P<0.05。##表示相對於莨菪胺對照群P<0.01。
圖6係表示胜肽Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu(NIPPLTQTPVVVPPFLQPE)、Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met(NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM)之莨菪胺誘發健忘預防效果。將水(對照)、或單獨將莨菪胺、或者將NIPPLTQTPVVVPPFLQPE 50 nmol/kg體重或NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM 50 nmol/kg體重與莨菪胺一併投予小鼠，藉由實施例5所記載之方法分別評價健忘預防效果。圖5之縱軸表示自發性交替行動變化率。為了確認是否誘發健忘，藉由學生t檢驗進行水投予對照群與單獨投予莨菪胺之莨菪胺對照群之間之顯著差異檢驗。＊＊表示相對於水投予對照群P<0.01。各胜肽投予群與莨菪胺對照群之顯著差異檢驗係藉由Dunnett型多重比較檢驗進行。##表示相對於莨菪胺對照群P<0.01。
圖7係表示胜肽Asn-Ile-Pro-Pro-Leu-Thr-Gln-Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu之記憶力增強效 果。將水(對照)或NIPPLTQTPVVVPPFLQPE 500 nmol/kg投予小鼠，藉由實施例6所記載之方法分別評價記憶力增強效果。圖7之縱軸表示探索時間之比例。針對探索時間之比例，藉由學生t檢驗進行對照群與胜肽群之間之顯著差異檢驗。＊表示相對於水投予對照P<0.05。
圖8係表示胜肽Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Thr-Val-Met-Phe-Pro-Pro-Gln-Ser-Val-Leu之莨菪胺誘發健忘預防效果。將水(對照)、或單獨將莨菪胺、或者將SWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL 150 nmol/kg體重或500 nmol/kg體重與莨菪胺一併投予小鼠，藉由實施例7所記載之方法分別評價健忘預防效果。為了確認是否誘發健忘，藉由學生t檢驗進行水投予對照群與單獨投予莨菪胺之莨菪胺對照群之間之顯著差異檢驗。＊＊表示相對於水投予對照群P<0.01。各胜肽投予群與莨菪胺對照群之顯著差異檢驗係藉由學生t檢驗而進行。##表示相對於莨菪胺對照群P<0.01，表示P<0.1。
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Claims (26)

  1. 一種腦功能改善用胜肽之製造方法，其特徵在於：其包括利用含有蛋白酶之酵素觸媒水解乳酪蛋白，而生成含有(i)包含序列編號1所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，(ii)包含序列編號2所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，或(iii)上述(i)及(ii)之胜肽之混合物的水解產物，其中，該胜肽之各自生成產率為2%以上，或該混合物之合計生成產率為10%以上。
  2. 如請求項1之方法，其中蛋白酶為中性蛋白酶或鹼性蛋白酶。
  3. 如請求項1或2之方法，其中蛋白酶源自微生物。
  4. 如請求項3之方法，其中微生物為屬於芽孢桿菌(Bacillus)屬或麴菌(Aspergillus)屬之微生物、或乳酸菌。
  5. 如請求項4之方法，其中微生物選自由地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)、麴菌屬(Aspergillus sp.)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、蜂蜜麴黴(Aspergillus melleus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)及嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)所組成之群中。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中乳酪蛋白為牛乳酪蛋白。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中包含序列編號1所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽的生成產率為5~10%或其以上。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中包含序列編號2所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽的生成產率為10~50%或其以上。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中包含序列編號1所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，與包含序列編號2所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽之合計生成產率為15~60%或其以上。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中水解產物進而含有包含序列編號3所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中酵素觸媒進而含有具有肽酶活性之酵素。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中酵素觸媒係固定於載體上。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中乳酪蛋白之水解係使用乳汁而進行。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中酵素/乳酪蛋白之重量比為1/100~1/1,000。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中於45~55℃下之水解反應之反應時間為2~10小時。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其進而包括使酵素觸媒失活。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其進而包括：對包含序列編號1所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，包含序列編號2所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，包含序列編號3所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽，或者含有該等胜肽之至少2種以上之混合物進行單離及/或濃縮。
  18. 一種水解產物，其特徵在於：其係藉由如請求項1至17中任一項之方法所生成之水解產物，並且以相對於水解產物之乾燥固體每1 g約為0.5 mg以上之量含有包含序列編號1~3所示之胺基酸序列之胜肽或包含此胺基酸序列中缺失、置換或附加1或2個胺基酸殘基之胺基酸序列之胜肽中之任一種以上。
  19. 如請求項18之水解產物，其係經乾燥者。
  20. 一種飲食品，其含有如請求項18或19之水解產物。
  21. 一種補充品，其含有如請求項18或19之水解產物。
  22. 如請求項20之飲食品或請求項21之補充品，其為乳酸菌醱酵飲食品。
  23. 如請求項20之飲食品或請求項21之補充品，其為功能性食品。
  24. 一種醫藥組合物，其含有如請求項18或19之水解產物及製藥上可容許之載體。
  25. 如請求項24之醫藥組合物，其為腦功能改善用。
  26. 如請求項25之醫藥組合物，其中腦功能改善為健忘之改善或預防。
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