TW200811225A

TW200811225A - Polymer conjugate of podophyllotoxin

Info

Publication number: TW200811225A
Application number: TW096117516A
Authority: TW
Inventors: Masayuki Kitagawa; Keizou Ishikawa; Keiichirou Yamamoto; Kazutoshi Takashio; Masao Shibata
Original assignee: Nippon Kayaku Kk
Priority date: 2006-05-18
Filing date: 2007-05-17
Publication date: 2008-03-01
Also published as: EP2019122A1; JP5181347B2; RU2447095C2; EP2019122A4; AU2007252678A1; US20090162313A1; WO2007135910A1; KR20090009241A; CN101448875A; RU2008149932A; JPWO2007135910A1; CA2652656A1; US8940332B2

Description

200811225 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種由具有聚乙二醇結構部分及2個以上丁一酸單醯胺結構部分之聚合物的羧基與鬼臼毒素類的羥基進行酯鍵結而成之鬼臼毒素類之高分子結合體、其製造方法及其用途。【先前技術】

鬼臼t素係多年生草鬼白屬之Podophyllum 的根或！的水萃取物中所含有之生理活性物質，已知鬼臼毒素或其衍生物具有抗癌活性。但是，該等化合物中有許多係難心於水者，又，為了進一步提高有效性，業者一直在進行鬼臼t素類之水溶性高分子化衍生物等的研究。例如，於專利文獻！中，對於結合有聚乙二醇之鬼白毒素高分子衍生物有域。然，，該鬼臼毒素之高分子衍生 :’結構上於一分子聚乙二醇上僅可結合卜2個鬼臼毒素分子’其結果是，為了投與有效量的藥劑必須投與大量的聚合物。 :專利文獻2中，，己載有—將藥劑與形成微胞 Λ4- J^L· ^ ...... W丹笟风微腮且顯开 :生的聚乙二酵與聚天門冬胺酸的嵌段共聚物相結合之古=專利文獻3中，記載有—成為高分子藥物輸送體 ::载體’其中將疏水性物質與聚乙二醇類和聚酸性 ^ Π Γ段共聚物的側㈣酸結合。於專利文獻4中，吾樹驗類高分子衍生物，兑中 ”中聚乙二酵類和聚麵 /、聚物的側鏈幾基與喜樹驗類的酸性經基結合 120255.doc 200811225 然而，於專利文獻2〜4中並盔關於龟Λ主主 …關於尾臼f素類結合體之記載。 [專利文獻1 ]曰本專利特表平1 〇_5〗3】87號公報 [專利文獻2]日本專利第2694923號公報 [專利文獻3]日本專利第3268913號公報 [專利文獻4]國際公開第2〇〇4/39869號案【發明内容】 [發明所欲解決之問題] 專利文獻1中記載之聚乙二醇類部分與藥劑之結合可被生物體的水解酶切斷，藉此控制藥劑之輸送及释放。然而，一般認為，當然生物體之水解酶的種差即使於同—種中個體差異亦較大，與藥劑的結合之切斷依賴於水解酶，因此擔心被釋放藥劑之效果會產生個體差異。於專利文獻2中記載之阿德力黴素（adriamycin)結合體，其中嵌段共聚物與阿德力黴素（adriamycin)係以醢胺鍵結合，但醯胺鍵係化學上穩定之鍵結樣式，因此由於水解: 造成的藥劑釋放較慢，其藥效方面存在疑問。依託泊甙（etoposide)或替尼泊甙（teniposide)等鬼臼毒素類係有用之抗癌劑，業者正在謀求具有水溶性且抗癌活性 k異之其新穎衍生物。 [解決問題之技術手段] 本發明者們為解決上述問題而進行努力研究，結果發現’若具有羥基的化合物與具有丁二酸單醯胺結構的 1運仃酯鍵結，則產生伴隨丁二酸單醯胺變為環化結構 120255.doc 200811225 (丁二酸醯亞胺）而具有羥基的化合物易於游離之現象，因此於製造由具有聚乙二醇結構部分及丁二酸單醯胺結構部分之聚合物與鬼臼毒素類的羥基進行酯鍵結而成之鬼臼毒素類之高分子結合體時，該高分子結合體並不依賴於水解酶而釋放出鬼臼毒素類；且完成本發明。即，本發明係關於以下（1)〜(10)。 ' (1)一種鬼臼毒素類之高分子結合體，其係由具有聚乙 0 二醇結構部分及2個以上丁二酸單醯胺結構部分之聚合物的羧基與鬼臼毒素類的羥基進行酯鍵結而成者。 (2) 如上述（1)之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中具有聚乙二醇結構部分及2個以上的丁二酸單醯胺結構部分之聚合物係後段共聚物。 (3) 如上述（2)之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中2個以上的丁二酸單醯胺結構部分係聚天門冬胺酸。 (4) 如上述（3)之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中高分 _ 子結合體係以通式（I) [化1] COzR4

. I R1-0-{CH2CH2〇)|-R2-I{NHCOCH)d-(NHCOCH2CH)^NHCOCH)f- CH2C02R4 CH2C〇R5

CORS C02H

• I -{NHC.〇CH2CH)g-CNHCOCH)h.iNHCQCH2CH)i-tNC〇CH)jJ-NHR3 i；H2C02H C0.CH2 (i) 120255.doc 200811225 [式中，R1表示氫原子或（Cl〜C6)烷基，R2表示連接基， R3表示氫原子或（C1〜G6)醯基，R4表示鬼臼毒素類之羥基殘基，R5表示選自由（C1〜C30)烷氧基、（C7〜C30)芳烷氧基、(C1〜C30)烷基胺基、二（C1〜C30)烷基胺基、羧基經保護的胺基酸及-N(R6)CONH(R7)所組成之群之基，R6、R7 可相同亦可不同，表示（C3〜C6)環狀烷基或可經第三胺基取代之（(：1〜05)烷基，{表示5〜11500之整數，（1、6、；^8、 h、i及j分別獨立表示0〜200之整數，其中d+e表示1〜200之整數，且d+e+f+g+h+i+j表示3〜200之整數，聚天門冬胺酸之各構成單位之連接順序為任意]所表示之化合物。 (5) 如上述（4)之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中R1為 (C1〜C6)烷基，R2為（C2〜G6)伸烷基，R3為（C1〜C6)醯基、t 為8〜23 00之整數，d、e、f、g、h、i及j分別獨立為0〜100 之整數，其中d+e為1〜100之整數，且d+e+f+g+h+i+j為 6〜1 0 0之整數。 (6) 如上述（5)之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中R1為 (C1〜C3)烷基，R2為（C2〜C4)伸烷基，R3為（C1〜C3)醯基，t 為100〜300之整數，d、e、f、g、h、i及j分別獨立為0〜90 之整數，其中d+e為1〜90之整數，且d+e+f+g+h+i+j為 15〜90之整數。 (7) 如上述（1)至（6)中任一項之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中鬼臼毒素類為鬼臼毒素、依託泊戒（etopo side)或替尼泊戒(teniposide)。 (8) —種鬼臼毒素類之高分子結合體，其係藉由於有機 120255.doc 200811225 >谷劑中’使用脫水縮合杳】將且太· ^將具有聚乙二醇結構部分及2個以上丁二酸單醯胺結構部公夕取人稱^刀之聚合物的缓基與鬼臼毒素類的羥基進行酯鍵結而獲得。 (9)如上述（1)至⑺中任—項之鬼臼毒素類之高分子結體 . 《製1^方法’、中於有機溶劑中，使用脫水縮合劑將具有 ‘ ％乙二醇結構部分及2個以上丁二酸單醯胺結構部分之聚合物的羧基與鬼臼毒素類的羥基進行酯鍵結。 • (1〇) 一種抗癌劑，其係將上述⑴至⑻中任一項之鬼白毒素類之高分子結合體作為有效成分。 [發明之效果] 本發明之鬼白毒素類之高分子結合體，可不依賴於生物體的水解酶而釋放藥劑，因而難以受個體差異的影響，可期待其具有有效之治療效果。【實施方式】本發明之鬼臼毒素類之高分子結合體，其特徵在於：由壽具有聚乙二醇結構部分及2個以上的丁二酸單醯胺結構部分之聚合物的羧基與鬼臼毒素類的羥基進行酯鍵結而成。於本發明中，所謂丁二酸單醯胺結構部分，意指 Η N C Ο - C - C - C Ο 2 Η結構，例如可列舉：丁二酸單醯胺 ’ （eHNC〇eCH2-CH2-C02H)或、天門冬胺酸的2個羧酸中的1 個被酿胺化之結構（-11]^(：0-(：11(-：^11 + (：112-(：0211、或者 -HNC0-CH2-CHGNH-)-C02H)等。該等丁二酸單醯胺結構部分，例如，可如聚天門冬胺酸般構成聚合物的主鏈，或者可為與由類糊精等聚醇、聚離胺酸等聚胺、除聚天門冬 120255.doc 200811225 胺酸以外的聚羧酸（例如，聚乳酸等）所構成之主鏈聚合物的官能基相結合者。至於具有聚乙二醇結構部分及2個以上的丁二酸單醯胺結構部分之聚合物，可列舉：自主鏈聚合物起聚乙二醇結構部分與丁二酸單酿胺結構部分以梳狀排列之接枝型聚合物、或具有聚乙二醇結構部分及丁二酸單醯胺結構部分之聚合物以直列方式結合之嵌段型聚合物（嵌段共聚物）等。

於2個以上丁二酸單醯胺結構部分為聚天門冬胺酸之情 $時接枝型聚合物中亦包含聚天門冬胺酸的主鏈與聚乙一知結構部分進行部分結合之聚合物等，嵌段型聚合物中亦包含聚天門冬胺酸的末端與聚乙二醇結構部分的末端結合之聚合物等。至於本發明之鬼臼毒素類之高分子結合體之聚合物中之聚乙二醇結構部分，可列舉將兩末H單個末端加以修飾之來乙一私，於將兩末端加以修飾之情形時，其修飾基可相同亦可不同。至於該修飾基，可列舉可具有取代基之 (Cl C6)烧基。至於可具有取代基之⑹〜叫烧基之烧基，可列舉下述烧基，較好的是（C1〜C4)烧基，例如甲基、乙土正丙基、正丁基等。至於可具有取代基之（C1〜C6)烷基之取代基’例如可列舉：胺基、甲胺基、二甲胺基、乙胺基、二乙胺基等。至於聚乙二醇結構部分車父好的是5 0 0〜1 〇〇〇〇〇左右本發明之具有聚乙二醇之分子量，為300〜500000左右， ’更好的是1000〜50000左右。結構部分及2個以上丁二酸單醯 120255.doc 200811225 月女結構部分之聚合物之分子量，為500〜600000左右，較好的是600〜110000左右，更好的是8〇〇〜8〇〇〇〇左右。再者本务明之所渭分子量，係指以GPC法測定之重量平均分子量。於本喬月之鬼臼毋素類之南分子結合體中，與具有聚乙 - ％結構部分及2個以上丁二酸單醯胺結構部分之聚合物相結合之鬼臼毒素類之結合量’相對於總幾基數為 1〜1〇〇/。，較好的是1〜90%，更好的是2〜60%。 :發明之鬼臼毒素類’若係具有羥基且具有抗腫瘤活性毒素類則無特別限定。至於該鬼臼毒素，例如可列舉之Γ述式（11)所表^鬼臼毒素、以下述式⑽所表 = 戒或以下述式（IV)所表示之替尼泊武等。鬼臼 ^舉mm之醇性經基、下 $下述式(IV)的糖部分之醇性羥基或苯㈣’但其取代位置並無限定。、本發明之鬼臼毒素類之高入 6主主』子、、、口 &體，可列舉：Μ ώ命臼毋素類的醇性羥基或者务糟由鬼者進行結合…體2毋素類的紛性經基中之任-炙、。口體、或者其等之混合物；素類經由醇性經基與—分子高分子结人體逸者’意臼毒由紛性經基進行結合者可相互混合。卩結合者與經 120255.doc -12- 200811225 [化2]

OH

[化3]

• [化 4]

120255.doc -13- 200811225 於本發明中，作為2個以上丁二酸單醯胺結構部分，較好的是聚天門冬胺酸。至於本發明之鬼臼毒素類之高分子結合體，較好的是以上述通式（1)[式中，R1表示氫原子或（C1〜C6)烷基，R2表示連接基，R3表示氫原子或（C1〜C6)醯基，R4表示鬼臼毒素類之羥基殘基，r5表示選自由（C1〜C30)烷氧基、 (C7〜C30)芳烷氧基、（C1〜C30)烷基胺基、二（C1〜C30)烷基胺基、羧基經保護之胺基酸及-N(R6)CONH(R7)所組成之群之基，R6、R7可相同亦可不同，表示（C3〜C6)環狀烷基或者可經第三胺基取代之（C1〜C5)烷基，t表示5〜11 500之整數，d、e、f、g、h、i及j分別獨立表示〇〜200之整數，其中d+e表示1〜200之整數，且d+e+f+g+h+i+j表示3〜200之整數’聚天門冬胺酸之各構成單位之連接順序為任意]所表示之化合物。至於通式⑴之R1中之（C1〜C6)烷基，為直鏈或分枝鏈 (C1〜C6)烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、正己基等，較好的是直鏈或分枝鏈（C1〜C4)烷基，特別好的是直鏈或分枝鏈（C1〜C3)烷基，例如特別好的是甲基、乙基、正丙基、異丙基，尤其好的是甲基。至於以通式（I)之R2所表示之連接基，並無特別限定，可列舉（C2〜C6)伸烷基，較好的是（C2〜C4)伸烷基，例如可列舉：伸乙基、伸丙基、伸丁基等，特別好的是伸丙基。至於一般式（I)之R3中之（ci〜C6)醯基，並無特別限定， 120255.doc -14- 200811225 例如可列舉：甲醯基、乙醯基、丙醢基等，較好的是⑼〜C3)醯基，特別好的是乙醯基/乙㈣生=式:1)的R4即鬼臼毒素類的羧基殘基中，至於鬼白可列舉上述鬼白毒素類；若係具有聚合物的羧酸縮合劑形成_的經基、且具有抗腫瘤鬼白毋素類’則無特別限定。至於該“毒素類，

:=可列舉：以上述式(„)所表示之鬼白毒素、以上述式 (^)所表示之依託泊㈣以上述式（IV)所表示之替尼寺。从通，⑴之R5，表示選自由（Cl〜C3〇)烧氧基、（ο〜⑶) 芳烧氧基、（C1〜C30)统基胺基、三（cl〜C3〇)燒基胺基、將羧基保護之胺基酸及-N(R6)c〇NH(R7)所組成之群之基， R6、R7為可被相同或不同的（C3〜G6)環狀烷基或第三胺基取代之（C1〜C5)烷基。作為通式⑴之R5，於一分子中可相 Π亦了不同，又，於鬼臼毒素類之高分子結合體中所使用之聚合物中，可為單一聚合物亦可為混合物。至於該（C1〜C30)烷氧基，可列舉直鏈或分枝鏈之 (C1〜C30)燒氧基，較好的是直鏈或分枝鏈之（Ci〜ci〇)燒氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第三丁氧基等，·至於（C7〜C30)芳烷氧基，可列舉··直鏈或分枝鏈之（C7〜C30)芳烷氧基，較好的是直鍵或分枝鏈之（C7〜C12)芳烷氧基，例如可列舉4_苯基丁氧基等。至於該（C1〜C30)烷基胺基或二（C1〜C30)烷基胺基，可列 120255.doc -15- 200811225 舉直鏈或分枝鏈之（Cl〜C3 0)烷基胺基或二（cl〜C3〇)烷基胺基’·較好的是直鏈或分枝鏈之（C1〜C20)烷基胺基或二 (C1〜C20)烷基胺基，例如可列舉··甲胺基、乙胺基、正丙胺基、異丙胺基、正丁胺基、第三丁胺基、二甲胺基、二乙基胺基、二（正丁基)胺基等。至於保護該羧基之胺基酸，可列舉於通常肽合成中所使用之保護羧基之胺基酸，例如可列舉苯丙胺酸苄酯等。

至於通式（I)之R5中之-N(R6)c〇nh(R7)[R6、R7為可相同亦可不同，表示（C3〜C6)環狀烷基或可經第三胺基取代 (1 C 5)烧基]’並無特別限定，例如可列舉··環已胺基羰基環己胺基、異丙胺基羰基異丙胺基等。本發明之以上述通式⑴所表示之鬼白毒素類之高分子結 =體中之2個以上的丁二酸單醯胺結構部分即聚天門冬胺酸中，有…胺基酸型、P-胺基酸型、環化者等構成單元，該等構成單元之連接順序並無限定，可為嵌段型亦可為無規型。 =上述-般式⑴所表示之鬼臼毒素類之高分子結合體中 =聚天門冬胺酸之總天門冬胺酸數’係以d+e+f+g+h+i+j 來表示，例如可自製造嵌段共聚物時所㈣之天門冬胺酸衍生物的量而求得。該天門冬胺酸數（d+e+f+g+h+i切為 3 200個左右，較好的是6〜1〇〇個左右，特別好的是15〜㈧鬼白毒素類所結合的天門冬胺酸數（d+e)相對於總天冬月女酸數（d+e+f+g+h+i+j)之比例為卜刚。/。，較好的 120255.doc -16· 200811225 3〜90%，更好的 !〜_左右，=:二r冬胺™為左右。疋1 1〇0個左右，特別好的是1〜90個述素類所結合之天門冬胺酸數(d+e)，例如，如下键士〇心’於進行於有機溶财使鬼μ素類進行醋鍵、、、口之脫水縮合及虛你 …灸，可由反應液中殘存的未反應之鬼臼毒素類之量而求出。 —土酉文型（d+f+h)相對於總天門冬胺酸數 +e+f+g+h+i+j)之比例為10〜100%，較好的是20〜100〇/〇 ; β’基酸型（e+g+i)之比例為㈣％，較好的是請％。該比例’例如可藉由選擇聚天門冬胺酸之保護基之脫保護條件等而適當改變。上述通式（I)之t為5〜115〇〇左右之整數，較好的是8~23〇〇左右之整數，更好的是1〇〇〜3〇〇左右之整數。本發明之鬼白毒素類之高分子結合體，可於水中形成將聚乙二醇結構部分作為外殼之微胞。本發明之鬼臼毒素類之高分子結合體，係藉由於有機溶劑中，使用脫水縮合劑使具有聚乙二醇結構部分及2個以上丁二酸單醯胺結構部分之聚合物的羧基與鬼白毒素類的羥基進行酯鍵結，而獲得；該製造方法亦包含於本發明中。即，例如以下之製造方法··於溶解兩者的有機溶劑中，較好的是N，N-二甲基曱醯胺（DmF)、1,3-二甲基·2_咪峻琳酮（DMI)、Ν-曱基吡咯啶酮（ΝΜΡ)等非質子性極性溶劑中，於0〜180°C、較好的是5〜50°C下，使用二環己基碳 120255.doc -17- 200811225 化一醯亞胺（DCC)、二異丙基碳化二醯亞胺（DIpc)、丨_乙基-3-(3-一甲胺基丙基）碳化二醯亞胺鹽酸鹽（臀§<^)、1_乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉酮（EEDQ)等脫水縮合劑，將以專利文獻2中記載的方法所製備之聚乙二醇結構部分_ 聚天門冬fe酸之肷段共聚物與根據需要將除進行反應的基以外的官能加以保護之鬼臼毒素類進行反應。又，於進行該縮合反應之時，亦可使用N，N-二甲胺基吡啶（DMAp)等反應助劑。縮合反應後，根據需要進行脫保護，再藉由通常的分離精製等操作製造鬼臼毒素類之高分子結合體。又’ R5為-N(R6)CONH(R7)基（R6、R7可相同亦可不同，表不（C3〜C6)環狀烷基或者可經第三胺基取代之（C1〜C5)烷基）之鬼臼毒素類之高分子結合體，亦可藉由使用上述碳化二醯亞胺類作為縮合劑之反應而獲得。至於將（C1〜C30)烷氧基、（C7〜C3〇)芳烷氧基、（cl〜C3〇) 烷基胺基、二（Cl〜C30)烷基胺基或保護羧基的胺基酸導入通式（I)之化合物中的R5之方法，可以採用以下方法：使聚合物的羧基活化後與欲結合量所對應的醇、對應的胺或保護羧基的胺基酸等於鹼性條件下進行反應之方法，使對應的醇、對應的胺或保護羧基的胺基酸等活化後與聚合物進行反應之方法等。於精製聚合物後可以同樣之反應使聚合物中未反應的羧基再活化，此處可使鬼臼毒素類的羥基縮合，或者重複使不同的醇、胺等反應而合成具有以的各種取代基之聚合物，繼而，亦可使鬼臼毒素類縮合。又，於使鬼臼毒素類縮合後，亦可使（C1〜C3〇)烷氧基、(C7〜C3〇) 120255.doc -18- 200811225 蒡烧氧基、（C1〜C3G)院基胺基、二（C1〜⑶）燒基胺保護羧基之胺基酸等縮合。 /者其中，本發明之鬼臼毒素類之高分子結合不只限定於上述方法。 i&法 =二亦包含將本發明…毒素類之高分子結合劑、錠劑、散劑等通常使用之劑型為/射化時通常使用的藥學上容許之載體，例：::::了製劑劑、崩散劑、溶劑、賦形劑、可溶化劑、分::劑、潤滑劑、懸濁化劑、防腐劑、止痛劑、色素、化較好的是作為注射劑使用，通常，例、中’ -甲基㈣B各相 Cremophor等或其等之混合液）或者水與該祕一醉、之混合液等。 ” 冷丨生有機容劑本發明之鬼G毒素類之高分子結合體之旦根據患者的性別、年齢、生理狀態、病態二I:然可㈣經口投與時，通常成人每i曰投== 〇十）〇.01〜500 mg/m2、較好的是0.1〜250 mg/m2成刀之投與，係於靜脈内、_ k用注射 [實施例] 腫瘤部)等處進行。以下，根據實施例更具體地說明本發限定於該等實施例。仁本發明並不實施例1 120255.doc -19- 200811225 化合物1(由分子篁12000的甲氧基聚乙二醇部分及聚合數為35的聚天門冬胺酸部分所構成之嵌段共聚物與依託泊甙之結合體；通式（I)之Rl = Me(甲基）、R2=伸丙基、R3 = Ac(乙醯基）、R4=依託泊甙殘基、R5=異丙胺基羰基異丙胺基，d+e+f+g+h+i+j=35，t= 273)之合成將依專利文獻3中記載的方法所製備的甲氧基聚乙二醇· 聚天門冬fe酸肷段共聚物（天門冬胺酸的聚合數為3 5，1.8 〇 g)及市售之依託泊甙（700 mg)溶解於DMF (70 ml)中，添加 DMAP (72 mg)、DIPC (1.25 ml)，於 25°C 下攪拌 20小時。於反應液中添加乙醇（105 ml)、乙酸乙酯（105 ml)及二丙醚 (840 ml)，於室溫下攪拌12〇分鐘，然後濾取沈析物，以乙醇/二異丙醚（1/4 (v/v)，100 ml)清洗之。將所得沈析物溶解於乙腈/水（1/1 (v/v)，210 ml)中，然後於離子交換樹脂 (The Dow Chemical Company製 DOWEX 50 (H+)，15 ml)中進行通塔’以乙腈/水（1/1 (v/v)，ml)進行溶出。於所得浴出部分中添加水（14〇 mi)再於減壓下將乙腈蒸餾除去，其後進行冷凍乾燥，藉此獲得化合物1 (2 〇6 g)。根據使用HPLC(高速液相層析）進行反應液中未反應依託泊戒夏之計量，化合物i中之依託泊甙含量為16.5% (w/w)，d+e相對於d+e+f+g+h+i+j之比例為15%。化合物1 中並未檢出游離之依託泊甙。可藉由本方法可附加異丙胺基羰基異丙胺基作為，其存在比係由將化合物丨溶解於重氫氧化鈉/重水/重乙腈者的 H NMR(氫核磁共振光譜）而求出，化合物}中異丙胺基羰 120255.doc -20- 200811225 基異丙胺基於聚天門冬胺酸中所占比例，即f+g相對於 d+e+f+g+h+i+j之比例為19·6%。其他天門冬胺酸係游離羧酸（h+i)或者環狀結構（j)。實施例2 化合物2(由與分子量12〇〇〇的甲氧基聚乙二醇部分及聚 - 合數為35之聚天門冬胺酸部分所構成之嵌段共聚物與鬼臼毒素之結合體：通式（I)之R1 = Me(甲基）、R2 =伸丙基、 φ R3 = Ac(乙醯基）、R4 =鬼臼毒素殘基、R5 =異丙胺基羰基異丙胺基，d+e+f+g+h+i+j = 35，t= 273)之人成將依專利文獻3中記載的方法所製備之甲氧基聚乙二醇_ 聚天門冬胺酸嵌段共聚物（天門冬胺酸之聚合數為35， mg)及市售之鬼臼毒素（106 mg)溶解sDMF (5 ml)中，添加 DMAP (12 mg)、DIPC (〇·16 ml)，於 25Λ：下攪拌 2〇小時。於反應液中添加乙醇（15 ml)及二異丙醚（6〇 m][)，於室溫下攪拌120分鐘，然後濾取沈析物，以乙醇/二丙醚('1/4 • (V/V)，10 ml)清洗之。將所得沈析物溶解於乙腈/水（1/1 (Wv)、10 ml)中，然後於離子交換樹脂（The D〇w

Company製DOWEX 5 0 (H+)，2·5 ml)中進行通塔，以乙腈/ ‘ 水（1/1 (V/V)，5 ml)進行溶出。於所得溶出部分中添加水，（1〇 m1)，於減壓下將乙腈蒸餾除去，其後進行冷凍乾燥，藉此獲得化合物2 (220 mg)。根據使用HPLC(高速液相層析）進行反應液中毒素量之計量，化合物2中…毒素含量為二 (w/w)，d+e相對於d+e+f+g+h+i+j之比例為131%。化合物 120255.doc • 21編 200811225 2中並未檢出游離之鬼臼毒素。可藉由本方法附加異丙胺基羰基異丙胺基作為，其存在比係由將化合物2溶解於重氫氧化鈉/重水/重乙腈中者的 ^-NMR而求出，化合物2中異丙胺基羰基異丙胺基於聚天門冬胺酸中所占比例，即f+g相對於d+e+f+g+h+i+j之比例為15.2%。其他天門冬胺酸係游離羧酸（h+i)或者環狀結構 ⑴。 " 實施例3 化合物3(由分子量12000的甲氧基聚乙二醇部分及聚合數為33的聚天門冬胺酸部分所構成之嵌段共聚物與鬼臼毒素之結合體：通式（I)之R1 = Me(甲基）、R2 =伸丙基、R3 =Ac(乙醯基）、R4 =鬼臼毒素殘基、R5 =異丙胺基羰基異丙胺基或者0-苄基苯基丙胺醯基、d+e+f+g+h+i+j = 33，t =273)之合成將依專利文獻3中記載的方法所製備的甲氧基聚乙二醇_ 聚天門冬胺酸嵌段共聚物（天門冬胺酸之聚合數為33， 464.4 mg)及市售之鬼臼毒素（1〇〇 mg)溶解於dmf (6 ml) 中，添加 DMAP (12 mg)、DIPC (0·09 ml)，於 15°C 下授拌 20小時。繼而，添加苯丙胺酸苄酯鹽酸鹽（36·8 mg)、三乙胺（〇·〇2 ml)及 DIPC (0.23 ml)，於 15°C 下進一步授拌 20小時，其後於25 °C下進一步攪拌4小時。於反應液中添加乙酸乙酯（10 ml)、乙醇（10 ml)及二異丙醚（8〇 ml)，於室溫下攪拌30分鐘，然後濾取沈析物，以乙醇/二異丙醚（1/4 (v/v)，20 ml)清洗之。將所得沈析物溶解於乙腈/水（1/1 120255.doc -22 - 200811225 (Wv)，20 ml)中，然後於離子交換樹脂（The D〇w Chemieal Company製DOWEX 50 (H+)，3 ml)中進行通塔，以乙腈/水 (1/1 (v/v)，20 ml)進行溶出。於所得溶出部分中添加水（25 ml)，於減壓下將乙腈蒸餾除去，其後進行冷凍乾燥，藉此獲得化合物3 (580 mg)。根據使用HPLC(高速液相析）進行反應液中未反應鬼臼毒素量之計量，化合物3中之鬼臼毒素含量為13.7〇/〇 (w/w) ’ d+e相對於d+e+f+g+h+i+j之比例為19%。化合物3 中並未檢出游離之鬼臼毒素。作為R5之一而導入之〇-苄基苯基丙胺醯基，係將化合物 3於乙腈-氫氧化鈉水溶液於4〇。〇下水解6小時，將溶出的节醇進行定量而求出，〇-苄基苯基丙胺醯基於聚天門冬胺酉文中所占比例，即f+g相對於d+e+f+g+h+i+j之比例，對於〇-苄基苯基丙胺醯基結合者而言為13%。又，亦將異丙胺基羰基異丙胺基導入作為R5，其存在比係由將化合物3溶解於重氫氧化鈉/重水/重乙腈中者之ιΗ_ NMR(氫核磁共振光譜）而求出。異丙基胺基幾基異丙胺基於5^天門冬胺酸中所占比例，即f+g相對於d+e+f+g+h+i+j 之比例，對於異丙基胺基羰基異丙胺基結合者而言為 1 5%。該結果為，R5之總量於聚天門冬胺酸中所占比例，即f+g相對於d+e+f+g+h+i+j之比例為28%。其他天門冬胺酸係游離羧酸（h+i)或者環狀結構（j)。比較例1 比較化合物1(由分子量12000的甲氧基聚乙二醇部分及 120255.doc -23- 200811225 聚合數為23的㈣胺酸部分所構成之鼓段共聚物與依託泊甙之結合體）之合成將依特開平5-955號公報中記㈣方法所製備的甲氧基聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物（21 mg)及市售的依託泊武 (9.6 mg)溶解於 DMF (1 ml)中，添加 DMAp (〇 6 爪幻、Dipc

(〇·〇 1 mi) ’於25t；下授拌20小時。於反應液中添加乙醇 (1.5 ml)、乙酸乙酯（1.5 ml)及二異丙醚（12如），於室溫下攪拌30分鐘，然後濾取沈析物，以乙醇/二異丙醚 (v/v)，2 ml)清洗。將所得沈析物溶解於乙腈/水（Μ (Wv)，3 ml)中，然後於離子交換樹脂（The D〇w chemieal

Company製D0WEX 50 (H+)、〇·2 ml)中進行通塔，以乙猜/ 水（1/1 (v/v) ’ 1 ml)進行溶出。於所得溶出部分中添加水〇 ml) ’於減壓下將乙腈蒸餾除去，其後進行冷來乾燥，藉此獲得比較化合物1 (28.0 mg)。藉由HPLC測量反應液中未反應依託泊甙的量，比較化合物1中之依託泊甙含量為23.8% (w/w)。比較化合物J中並未檢出游離之依託泊甙。比較例2 比較化合物2(由分子量12000的甲氧基聚乙二醇部分及聚合數為2 3的聚麩胺酸部分所構成之嵌段共聚物與鬼臼毒素之結合體）之合成將依特開平5-955號公報中記載的方法所製備的甲氧基聚乙二醇-聚麩胺酸嵌段共聚物（52 mg)及市售的鬼臼毒素

(10 mg)溶解於 DMF (1 ml)中，添加 DMAP (2 mg)、DTPC 120255.doc -24· 200811225 (0·03 ml)，於25°C下攪拌20小時。於反應液中添加乙醇（3 ml)及二異丙醚（12 ml)，於室溫下攪拌30分鐘後濾取沈析物，以乙醇/二異丙醚（1/4 (v/v)，2 ml)清洗之，將所得沈析物溶解於乙腈/水（1/1 〇/v)，3 ml)中，然後於離子交換樹脂（The Dow Chemical Company製 DOWEX 50 (H+)，〇·2

ml)中進行通塔，以乙腈/水（1/1 (v/v)，1 ml)進行溶出。於所得溶出部分中添加水（1 ml)，於減壓下將乙腈蒸顧除去，其後進行冷凍乾燥，藉此獲得比較化合物2 (64.3 mg) 〇根據使用HPLC進行反應液中的未反應鬼臼毒素量之計量’比較化合物2中之鬼臼毒素含量為丨6 〇% (w/w)。比較化合物2中並未檢出游離之鬼臼毒素。試驗例1 化合物1於非酶存在下之藥劑釋放將化合物1或比較化合物i以聚合物濃度i mg/ml溶解於 PBS(碟酸緩衝生理食鹽水；pH 71)中，且保溫於37。〇。以 HPLC將自該高分子結合體中釋放的依託泊錢行分離，利用標準曲線進行定量。由定量值與由高分子結合體的藥劑含有量所求出的總藥劑量之比示於圖ΐσ 如圖1所表明，本發明之高分子結合體（化合物1)，即使 =解酶I可於24小時内釋放85%以上的依託泊#，相對 :不具有丁二酸單醯胺結構部分之比較化合物1，即 ;A j夺亦成乎不釋放依託泊甙。該結果顯示，本發明 *类頁阿分子結合體於非酶存在下具有m藥劑 120255.doc -25- 200811225 釋放性能。試驗例2 化合物2、3於非酶存在下之藥劑釋放將化合物2、3或比較化合物2以聚合物濃度為j mg/ml溶解於PBS(磷酸緩衝生理食鹽水；pH 7.1)中，且保溫於 37°C。以HPLC將自該高分子結合體中釋放的鬼臼毒素進行分離，利用標準曲線進行定量。定量值與由高分子結合體的藥劑含有量求出的總藥劑量之比示於圖2。如圖2所表明，本發明之高分子結合體（化合物2及3)即使無水解酶於24小時内亦釋放丨〇〜6〇%以上之鬼臼毒素，相對於此，不具有丁二酸單醯胺結構部分的比較化合物 2，即使於24小時亦幾乎不釋放鬼臼毒素。該結果顯示，本發明之鬼臼毒素類之高分子結合體於非酶存在下具有優異之藥劑釋放性能。又，亦顯示可自由地控制藥劑釋放性能。試驗例3 化合物1之抗腫瘤作用將於小白鼠皮下繼代培養的小白鼠大腸癌c〇l〇n 26切成約2 mm的正方形塊，使用套管針將其移植入雌性cDF1小白鼠的月側皮下。於腫瘤移植後第7日，於小白鼠尾靜脈内單次投與本發明之高分子結合體（化合物1}或對照藥（依託泊甙，ETP)。對照群係不投與藥物之群。化合物1係以 5%葡萄糖注射液將其溶解後使用。Ετρ係將Lastet注射劑 (日本化藥公司製）以5%葡萄糖注射液加以稀釋後使用。投 120255.doc -26· 200811225 與後’使用游標卡尺測量腫瘤之長徑（L mm)及短徑（w mm)，藉由（LxW2)/2計算腫瘤體積，作為相對於投與曰的腫瘤體積之相對腫瘤體積而示於表i。又，將此時之體重變化作為相對於投與日體重之相對體重而示於表1。 [表1] 0 投與後天數 _ 4 0.86 8 1.69 化合物1 450 mg/kg 相對腫瘤體積 1.00 相對體重 1.00 0.87 0.97 ETP 90 mg/kg 相對腫瘤體積 1.00 U7 3.79 相對體重 1.00 0.87 0.97 對照群相對腫瘤體積 1.00 5.02 11.59 相對體重 1.00 0.98 0.82 由表1顯示，本發明之高分子結合體，於引起與ETP (90 mg/kg)相同程度體重減少之投與量（45〇 mg/kg)中，具有較 ETP優異之抗癌活性，且成為抗癌劑。試驗例4化合物2及3之抗腫瘤作用將於小白鼠皮下繼代培養的小白鼠大腸癌c〇1〇n 26切成約2 mm的正方形塊，使用套管針將其移植入雌性CDF1小白鼠的背側皮下。於腫瘤移植後第7天（表2中，投與開始 )將本务月之南分子結合體（化合物2及化合物3 )或對照藥（鬼臼骨素，POD)投與小白鼠尾靜脈内。化合物2及化合物3，係將 >谷解於5%葡萄糖注射液中者一次投與。對照群係不投與藥物之群。P〇D係購自Sigma公司，自投與開'始日起’ H甲基亞颯及5%葡萄糖注射液稀釋者連續$曰 I20255.doc -27- 200811225 投與。投與後，使用游標卡尺測量腫瘤之長徑（L mm)及短徑（W mm)，藉由（LxW2)/2計算腫瘤體積，作為相對於投與開始日腫瘤體積之相對腫瘤體積而示於表2。又，將此時的體重變化作為相對於投與開始日的體重之相對體重而示於表2。 [表2] 才j 0 1與開始E 3 3後之天凄 5 8 化合物2 一次投與75 mg/kg 相對腫瘤體積 1.00 0.82 0.80 2.24 相對體重 1.00 0.96 0.99 1.00 化合物3 一次投與75 mg/kg 相對腫瘤體積 1.00 1.79 2.05 3.26 相對體重 1.00 0.95 0.98 0.94 POD 連續5日投與15 mg/kg (合計75 mg/kg) 相對腫瘤體積 1.00 1.58 1.79 6.08 相對體重 1.00 1.01 0.96 0.98 對照群相對腫瘤體積 1.00 3.01 4.38 6.52 相對體重 1.00 0.99 0.97 0.86

由表2顯示，本發明之高分子結合體，於引起與POD (15 mg/kg/日，連續5日投與）相同程度體重減少之投與量（75 mg/kg)中，雖然進行單次投與但具有較POD優異之抗癌活性，且成為抗癌劑。【圖式簡單說明】圖1係表示本發明之化合物1(依託泊甙與嵌段共聚物的聚天門冬胺酸結合之高分子衍生物）及比較化合物1 (依託泊甙與嵌段共聚物的聚麩胺酸結合之高分子衍生物）之PBS溶液（pH 7.1，37°C)中依託泊甙釋放量相對於依託泊甙總結合量之比例。圖1中，-春·表示本發明之化合物1、-〇-表示比 120255.doc -28- 200811225 較化合物1釋放量之比例。圖2係表示本發明之化合物2及化合物3(鬼臼毒素與嵌段共聚物的聚天門冬胺酸結合之高分子衍生物）及比較化合物2(鬼臼毒素與嵌段共聚物的聚麩胺酸結合之高分子衍生物）之PBS溶液（pH 7.1，37°c)中鬼臼毒素釋放量相對於鬼臼毒素總結合量之比例。 ‘ 圖2中，-♦-表示本發明之化合物2，-▲-表示本發明之 • 化合物3，-◊-表示比合物2之釋放量之比例。

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Claims

200811225 十、申請專利範圍： 1 · 一種鬼臼毒素類之高分子結合體，其係由具有聚乙二醇結構部分及2個以上丁二酸單醯胺結構部分之聚合物的羧基與鬼臼毒素類的羥基進行酯鍵結而成者。 2. 如請求項1之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中具有聚乙二醇結構部分及2個以上丁二酸單醯胺結構部分之聚合物為嵌段共聚物。 3. 如請求項2之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中2個以上丁二酸單醯胺結構部分為聚天門冬胺酸。 4. 如請求項3之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中高分子結合體為以通式（I) [化5] C02R4 R1-O-(CH2CH2〇)rR2-[(NHC0CH)d.(NHCOCH2CH)^NHC〇CH)f- CHaC02R4 CH2COR5

COR5 co2h ch2co2h coch2 ⑴ [式中，R1表示氫原子或（Cl〜C6)烷基，R2表示連接基， R3表示氫原子或（C1〜C6)醯基，R4表示鬼臼毒素類之羥基殘基，R5表示選自由（C1〜C30)烷氧基、（C7〜C30)芳烷氧基、（C1〜C30)烷基胺基、二（C1〜C30)烷基胺基、羧基經保護之胺基酸及-N(R6)CONH(R7)所組成之群之基， I20255.doc 200811225 R6、R7可相同亦可不同，表示（C3〜C6)環狀烷基或者可經第二胺基取代之（C1〜C5)烧基，t表示5〜11500之整數， d、e、f、g、h、i及j分別獨立表示〇〜2〇〇之整數，其中 d+e表示1〜200之整數，且d+e+f+g+h+i+j表示3〜200之整數，聚天門冬胺酸之各構成單位之連接順序為任意]所表不之化合物。

5·如請求項4之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中旧為 (C1〜C6)烷基，R2為（C2〜C6)伸烷基，R3為（C1〜C6)醯基，t為8〜2300之整數，d、e、f、g、h、i及j分別獨立表示0〜100之整數，其中d + e為1〜1〇〇之整數，且 d+e + f+g+h+i+j為6〜100之整婁文。 6.如請求項5之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中以為 (C1〜C3)烷基，R2為（C2〜C4)伸烷基，R3為（C1〜C3)醯基’ t為1〇〇〜300之整數’ d、e、f、g、卜⑷分別獨立為〇〜90之整數，其中d+e為丨〜⑽之整數，且 d+e+f+g+h+i+j為 15〜90之整數。如明求項1至6中任一項之鬼臼毒素類之高分子結合體，其中鬼臼毒素類為鬼臼毒素、依託泊武（etGpc)side)或者替尼泊甙（teniposide)。 8. 一種鬼臼毒素類之高分子結合體，其係藉由於有機溶劑中’使用脫水縮合劑使具有聚乙二醇結構部分及2個以上丁一酸單醯胺結構部分之平人# 1: i t 口物的羧基與鬼臼毒素類的經基進行酯鍵結而獲得。 9 · 一種如請求項1至7中任一項之舍主、之鬼臼毋素類之高分子結合 120255.doc 200811225 體之製、it太、、且有卷去’其中於有機溶劑中，i用脫水縮合劑使八Λ乙一知結構部分及2個以上丁二酸單醯胺結構部 7刀之聚合物的m基與鬼臼毒素類的經基進行醋鍵結。 10. 一種抗癌劑，其係以如請求項丨至8中任一項之鬼臼毒素類之高分子結合體為有效成分。

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