SK6892003A3

SK6892003A3 - Process for the isolation and purification of epothilones

Info

Publication number: SK6892003A3
Application number: SK689-2003A
Authority: SK
Inventors: Ernst Kusters; Heinz Unternahrer
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2004-01-08
Also published as: US20050288514A1; US7569698B2; US20040054188A1; DE60109814T2; RU2285007C2; CZ301664B6; ES2239687T3; PT1345944E; DE60109814D1; BR0115991A; HK1059618A1; NO20032591L; CA2433414A1; AR031902A1; TWI286137B; PL209406B1; JP4287650B2; ATE292132T1; SK287356B6; IL156088A0

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nového spôsobu desorpcie epothilónov, najmä epothilónu A alebo/a epothilónu B, zo živíc a nových spôsobov prípravy, spracovania a čistenia epothilónov a spôsobu prípravy epothilónov, ktorý zahŕňa uvedený desorpčný proces, ako aj použitie určitých rozpúšťadiel pre desorpciu epothilónov zo živíc.

Doterajší stav techniky

Epothilóny A a

B predstavujú novú skupinu cytotoxických účinných látok, ktoré stabilizujú mikrotubuly (pozri Gerth K. a

J.Antibiot.

560-3 (1966) všeobecného vzorca

49,

v ktorom R znamená atóm vodíka (epothilón A) alebo metylovú skupinu (epothilón B).

Po prvom uvedení týchto epothilónov v odbornej literatúre (pozri WO 93/10121) sa opisuje niekoľko spôsobov syntézy a výroby ako samotných epothilónov, tak aj ich mnohých derivátov (všetky tieto látky sa ďalej spoločne uvádzajú ako epothilóny), napríklad tých, ktoré sú opísané v nasledujúcich patentových dokumentoch:

WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/47584, WO 00/00485, WO 00/23452, WO 99/03848, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461,

WO 99/65913, WO 98/38192, WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/31247, WO 99/42602, WO 99/ 28324, WO 00/50423, WO 00/39276, WO 99/27890, WO 99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514, WO/99Ú59985, WO 00/37473, WO 98/08849, US 6,043,372, US 5,969,145, WO 99/40047, WO 99/01124 a WO 99/43653.

Okrem epothilónu A a epothilónu B tiež najmä epothilóny D a E opísané v patentovom dokumente WO 97/19061 a epothilóny E a F opísané v patentovom dokumente WO 98/22461, ako aj epothilóny opísané v patentovom dokumente WO 99/02514 majú zaujímavé vlastnosti .

Ako príklad terapeutického využitia epothilónov opisuje medzinárodná patentová prihláška WO 99/43320 mnohé podávania epothilónov ako činidiel proti proliferačným ochoreniam, najmä proti nádorovým ochoreniam, pričom epothilóny pôsobia vzhľadom na ich obdobný mechanizmus účinku porovnateľne ako Taxol, ktorý je dobre známym, na trhu dostupným protirakovinovým činidlom. Medzinárodná patentová prihláška WO 99/39694 opisuje niektoré špecifické formulácie epothilónov, najmä epothilónu A a epothilónu B.

Epothilóny a najmä epothilón A a najvýhodnejšie epothilón B ponúkajú početné výhody v porovnaní s už zavedenými postupmi liečenia, najmä v prípadoch, kedy sa nádory stali odolnými voči Taxolovej terapii. Preto sa požaduje aby sa vynašla syntéza epothilónov, ktorá umožňuje pripraviť epothilóny vo väčších produkčných množstvách, ktoré by uspokojili narastajúci dopyt po epothilónoch.

Najúčinnejšie produkčné spôsoby až doteraz obsahujú aspoň niektoré biosyntetické stupne a izoláciu epothilónov z kultivačného prostredia alebo z obdobnej reakčnej zmesi.

Zo začiatku sa v literatúre opisuje extrakcia prírodných látok pomocou myxobaktérií, najmä extrakcia epothilónov z bunkového kmeňa Sorangium Cellulosum Soce90 (uložený pod depozitným číslom 6773 v zbierke mikroorganizmov Germán Collection of

Microorganisms, pozri WO/10121). Aby sa dosiahla uspokojivá koncentrácia prírodných látok, najmä epothilónov, najprv sa ku kultivačnému prostrediu pridávala absorpčná živica na báze polystyrénu, napríklad Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas,

Frankfurt, Spolková republika Nemecko).

Avšak nevýhodou tohto spôsobu je, že pri jeho uskutočnení vo veľkej miere dochádza k mnohým problémom. Funkcia ventilov je zhoršená prítomnosťou guľôčok živice, dochádza k upchávaniu potrubia a celé zariadenie sa vystavuje výraznému opotrebeniu v dôsledku mechanického trenia, ku ktorému dochádza pri styku guľôčok živice s vnútornými stenami zariadenia. Guľôčky živice sú porézne a preto majú veľkú vnútornú povrchovú plochu (asi 825 m²). Sterilizácia takejto živice predstavuje problém vzhľadom na to, že vzduch prítomný v živici bráni kontaktu vnútorných stien so sterilizačným prostredím. Vzhľadom na to je nemožné uskutočňovať uvedený proces v praxi vo veľkej miere s využitím prídavku živice v priebehu kultivácie mikroorganizmu, ktorý produkuje epothilóny.

patentovej zlepšený spôsob B. Tento spôsob z kultivačného

Z týchto dôvodov prihlášky WO 99/42602 produkcie epothilónov, zahŕňa prevedenie do prostredia mikroorganizmu, uvedené prostredie takto komplexotvorné činidlá, kultivačného prostredia kultivačného uvedeného napríklad benzénových (Rohm & Nemecko) Chemical so živicou kopolymérov,

Haas alebo

Co. ,

Germany

Diaion bol v rámci medzinárodnej vynájdený a opísaný najmä epothilónu A a komplexu epothilónov ktorý produkuje epothilóny, pričom obsahuje cyklodextríny alebo iné zmiešanie buniek - jednoduchého (napríklad filtrátu alebo centrifugátu prostredia) so syntetickou živicou, na báze matricových styrén/divinylsú napríklad Amberlite XAD-16 Frankfurt, Spolková republika (Resindion S.R.L., Mitsubishi

Taliansko), za účelom absorpcie epozo živice, pričom sa použije izopropanol. Potom nasleduje akými

GMBH,

HP-20

Miláno, a desorpcie epothilónov najmä alkohol, najvýhodnejšie thilónov pridanie vody k alkoholovej fáze, odstránenie rozpúšťadlovej fázy (výhodne odparením), fázová separácia výsledného zvyšku v prítomnosti esteru, najmä etylacetátu alebo izopropylacetátu, obvykle molekulárnou filtráciou (gélová chromatografia) vysušenej esterovej fázy, separácia výslednej epothilónovej zmesi vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou s reverznou fázou (pričom sa výhodne použije elučná sústava, ktorú tvorí zmes nitrilu a vody, napríklad zmes acetonitrilu a vody) a prípadne ďalšie čistenie fázovou separáciou v prítomnosti zmesi vody a éteru, výhodne následná adsorpčná chromatografia cez silikagél, pričom sa dosiahne ďalšie oddelenie nečistôt, a kryštalizácia/rekryštalizácia.

Aj keď je opísaný spôsob oproti minulým spôsobom pokrokový a vhodný na výrobu epothilónov v priemyselnom meradle, má tento spôsob ešte niektoré nedostatky.

Tak napríklad, na dosiahnutie dostatočnej čistoty sa odporúča uskutočniť buď stupeň molekulárnej filtrácie alebo/a stupeň adsorpčnej chromatografie cez silikagél. Mnohé problémy pramenia z realizácie fázovej separácie v prítomnosti esteru, akým je napríklad etylacetát, ktorá je (najmä v dôsledku dlhej doby, ktorá je potrebná na fázovú separáciu fázy voda/ester vo veľkom priemyselnom meradle) veľmi časovo náročná, a z realizácie následného odparenia, ktoré je veľmi namáhavé uskutočniteľné vzhľadom na to, že odparovaná zmes pení a prská.

To sú teda problémy, ktoré sa majú vyriešiť vynálezom, pričom sa odstráni pokiaľ možno čo najväčší počet uvedených nedostatkov a nájdu sa nové a výhodné spôsoby izolácie epothilónov, najmä epothilónov A a B, potom čo došlo k ich adsorpcii na živicu .

Podstata vynálezu

S prekvapením sa zistilo, že aj nahradenie alkoholov, ktoré sú použité ako desorpčné rozpúšťadlá, určitými inými (označenými ako bude rozpúšťadlami rozpúšťadlá, uvedených napríklad zlepšená desorpcia a vyšší finálny výťažok, dodatočnými výhodami sú i) vyššia selektivita desorpcie, ii) vyššie množstvo desorbovaných epothilónov, čo ukazuje na úplnejšiu desorpciu, iii) nie je potrebné uskutočniť reextrakciu esterom (napríklad etylacetátom) s vysoko problematickou fázovou separáciou potrebné adsorpčnú výrazne zmenšené ako slabo polárne alebo špecifikované) poskytuje problémov a dosiahnutie ďalších výhod, zlepšená voda/ester, ani následné uskutočniť molekulárnu chromatografiu, v) čas skráti, riziko , ako odstrániť nepoláme riešenie akými sú

Ďalšími odparenie filtráciu éteru; iv) nie je obvykle ani desorpciu sa stupňov, vii) na vi) uskutočňuje sa kontaminácie (čo je viii), od rozpúšťadla, aj ix) po chromatografii s neočakávane menšie potrebný menší počet dôležité u vysoko toxických lepšie a bezpečnejšie pracovné podmienky ktoré sa použije na desorpciu = reverznou fázou je množstvo vedľajších alebo nečistôt, ktoré majú rovnakú polaritu ako najmä ako epothilón B, čo je rovnako závislé od

Tieto a ďalšie výhody vyplynú z detailov, epothilónov) a (čo je závislé extrakciu) potrebné produktov epothilóny, použitého rozpúšťadla, ktoré sú uvedené v nasledujúcom detailnom opise vynálezu.

Jeden predmet vynálezu sa týka spôsobu desorpcie epothilónov, najmä epothilónu A alebo/a epothilónu B, najmä epothilónu B, zo živice, najmä syntetickej živice, slabo polárnym alebo nepolárnym rozpúšťadlom.

Ďalší predmet vynálezu sa týka spôsobu spracovania (alebo čistenia) epothilónov, najmä po ich produkcii v štandardnom prostredí na chemickú syntézu alebo výhodne v kultivačnom prostredí, ktoré obsahuje mikroorganizmy, najmä myxobaktérie, najmä rod Sorangium, ktoré sú vhodné na produkciu epothilónov, najmä epothilónu A alebo/a epothilónu B, a komplexotvornú zložku, pričom uvedený spôsob zahŕňa použitie slabo polárneho alebo nepolárneho rozpúšťadla pri desorpcii uvedených epothilónov zo živice.

Tretí predmet vynálezu sa týka použitia slabo polárneho alebo nepolárneho rozpúšťadla na desorpciu epothilónov, najmä epothilónu A alebo/a epothilónu B, obzvlášť epothilónu B, zo živice, najmä zo syntetickej živice.

Uvedené všeobecné výrazy majú výhodne nasledujúce významy:

Výraz epothilóny sa výhodne vzťahuje na ľubovoľný epothilón alebo epothilónový derivát uvedený v nasledujúcich patentových dokumentoch:

WO	99/03848,	WO	00/49020,	WO	00/49021,	WO	00/47584,	WO	00/00485,
WO	00/23452,	WO	99/03848,	WO	00/49019,	WO	99/07692,	WO	98/22461,
WO	99/65913,	WO	98/38192,	WO	00/50423,	WO	00/22139,	WO	99/58534,
WO	97/19086,	WO	98/25929,	WO	99/67252,	WO	99/67253,	WO	00/31247,
WO	99/42602,	WO	99/28324,	WO	00/50423,	WO	00/39276,	WO	99/27890,
WO	99/54319,	WO	99/54318,	WO	99/02514,	WO	99/59985,	WO	00/37473,
WO	98/08849,	US 6,043,372,	US 5,969,:	145, WO	99/40C47, WO

99/01124 a WO 99/43653, výhodnejšie na epothilón A a najmä na epothilón B, avšak v širšom chápaní vynálezu tiež na epothilóny D a E, opísané v patentových dokumentoch WO 97/19086 a WO 98/22461, na epothilóny E a F, opísané v patentovom dokumente WO 98/22461, alebo na epothilóny opísané v patentovom dokumente WO 99/02514.

Slabo polárne alebo nepolárne rozpúšťadlo má výhodne nasledujúce charakteristiky:

Výhodné je rozpúšťadlo, ktoré v eluotropnom poradí určenom podľa: Snyder a kol., J. Chromatogr. Sci.

vykazuje nasledujúce charakteristiky, pričom x_eakceptorový parameter (ukazovateľ tendencie väzieb (mostíkov) vo funkcii akceptora donorový parameter (ukazovateľ väzieb vo funkcii donora vodíka) (ukazovateľ dipólového charakteru) s výhradou, že x_d + x_n = 1, a výhodné sú rovnako zmesi takých rozpúšťadiel:

protónový vodíkových parameter

J.

na

223 (1978)

16, znamená protónový tvorbu vodíka), tendencie vodíkových x_d znamená na tvorbu a x_n znamená dipólový x_e +

X_e =	-- 0,20-0,40;
Xd =	- 0,15-0,36; a
Xn =	= 0,38-0,60,

výhodne

Xe =	= 0,22-0,32;
Xd =	= 0,17-0,34; a

x_n = 0,39-0,54.

Veľmi výhodnými slabo polárnymi alebo nepolárnymi rozpúšťadlami sú (nižší alkyl)-(nižší alkyl)ketóny alebo cyklické ketóny, ako napríklad acetón, metyletylketón, 2-pentanón, metylizobutylketón alebo cyklohexanón, výhodnejšie étery, najmä cyklické étery, obzvlášť tetrahydrofurán alebo dioxán; ešte výhodnejšie alifatické halogénové zlúčeniny, najmä nižšie alkylhalogenidy, obzvlášť metyléndichlorid (= metylénchlorid) alebo etyléndichlorid; najvýhodnejšie aromatické rozpúšťadlá, najmä naftalén alebo (výhodne) benzén alebo naftalén alebo (výhodne) benzén substituovaný jedným alebo viacerými, jedným až troma, substituentami, ktoré sú zvolené zo ktorá zahŕňa nižšiu nitroskupinu etoxymetylovú o-, m- alebo výhodne skupiny, skupinu, nižšiu alkylovú skupinu, najmä metylovú alebo izopropylovú skupinu, metoxyskupinu alebo etoxyskupinu, atóm atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm a (nižšiu alkoxy)-(nižšiu alkyl)ovú skupinu, skupinu; obzvlášť toluén, etylbenzén, xylén, p-xylén, mezitylén, pseudokumén, hemelliten, izopropyltoluén, fenylhalogenidy, najmä fluórbenzén, jódbenzén, nižšie alkoxybenzény, metoxybenzén alebo (nižšie najmä etoxymetylbenzel (benzylnapriklad 2 sú (nižšie etylovú skupinu alkoxyskupinu, najmä halogénu, najmä atóm-fluóru, jódu, najmä najmä kumén, chlórbenzén, brómbenzén alebo najmä etoxybenzén alebo alkoxy)-(nižšie alkyl)benzény, éter); alebo ľubovoľné zmesi dvoch alebo viacerých, až 4, z uvedených rozpúšťadiel; najvýhodnejšie alkyl) benzény, najmä etylbenzén, xylén, najmä o-, m- alebo* pxylén, mezitylén, pseudokumén, hemelliten, kumén, izopropyltoluén a najvýhodnejšie toluén.

Pojem slabo polárne alebo nepoláme rozpúšťadlo rovnako zahŕňa zmesi dvoch alebo viacerých opísaných rozpúšťadiel, napríklad 2 až 4 takéto rozpúšťadlá.

Adjektívum nižšia vždy znamená, že ďalej uvedená skupina výhodne obsahuje najviac až 7 uhlíkových atómov, najmä až 4 uhlíkové atómy, pričom táto skupina je rozvetvená alebo nerozvetvená. Nižšia alkylová skupina môže byť napríklad nerozvetvená alebo raz alebo viackrát rozvetvená a touto skupinou je napríklad metylová skupina, etylová skupina, propylová skupina, ako izopropylová skupina alebo n-propylová skupina, butylová skupina, ako izobutylová skupina, sek-butylová skupina, tercbutylová skupina alebo n-butylová skupina, alebo tiež pentylová skupina, ako amylová skupina alebo n-pentylová skupina.

Atómom halogénu je výhodne atóm jódu, atóm brómu, atóm chlóru alebo atóm fluóru.

Uhľovodíkom je výhodne organická zlúčenina, ktorá obsahuje výhodne 4 až 20 uhlíkových atómov, výhodnejšie 6 až 16 uhlíkových atómov, pričom uhľovodík môže byť alifatickým, napríklad lineárnym, rozvetveným alebo cyklickým nasýteným alkánom, napríklad cyklohexánom, lineárnou, rozvetvenou alebo cyklickou (nearomatickou) organickou zlúčeninou s jednou alebo viacerými dvojnými alebo/a trojitými väzbami alebo aromatickým uhľovodíkom, pričom tento aromatický uhľovodík je nesubstituovaným aromatickým uhľovodíkom alebo uhľovodíkom raz alebo viackrát, substituentami, ktoré alkylovú skupinu, alebo izopropylovú metoxyskupinu alebo substituovaným ktorá zahŕňa nižšiu napríklad sú zvolené až etylovú skupinu alkoxyskupinu, najmä aromatickým trikrát, skupiny, skupinu, nižšiu zo najmä metylovú skupinu, etoxyskupinu, atóm halogénu, najmä atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu, nitroskupinu a (nižšiu alkoxy)-(nižšiu alkyl)ovú skupinu, najmä etoxymetylovú skupinu, výhodne substituovaná jednou' až troma nižšími alkylovými skupinami.

Alkoholom je výhodne hydroxy-(nižší alkán), najmä metanol, etanol alebo n- alebo izopropanol.

Živicou je najmä syntetická živica, výhodne živica na báze kopolymérov styrénu a divinylbenzénu, výhodnejšie Amberlite XAD4 alebo výhodne Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] alebo Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co. , Miláno]. Je samozrejmé, že živica, z ktorej majú byť epothilón alebo epothilóny desorbované podľa vynálezu, obsahuje nekovalentne viazané epothilóny (napríklad reverzibilne viazané alebo absorbované). Inými slovami, všade tam, kde sa použije výraz živica, sa rozumie týmto výrazom živica ktorá je v styku s jedným alebo viacerými epothilónmi, pričom tieto epothilóny sú najmä buď reverzibilne viazané alebo adsorbované.

V nasledujúcej časti opisu budú opísané výhodné formy uskutočnenia vynálezu.

V rámci výhodnej formy uskutočnenia sa vynález týka spôsobu, ktorý zahŕňa desorpciu zo živice už .opísaným slabo polárnym alebo nepolárnym rozpúšťadlom, ktoré zahŕňa ľubovoľné ďalšie stupne čistenia, ktoré sú požadované alebo nevyhnutné na získanie príslušných epothilónov, najmä epothilónu A a najlepšie epothilónu B, v čistej forme, najmä stupne čistenia opísané v rámci vynálezu ako výhodné stupne čistenia.

Spracovanie epothilónov predchádza reakcia alebo spôsob, ktorý vedie k reakčnému produktu, ktorý obsahuje epothilóny a je určený na spracovanie, pričom epothilóny sú izolované buď i) z chemických reakčných zmesí po rozpustení v príslušnom polárnom vodnom prostredí alebo ii) výhodnejšie zo supernatantu (napríklad cyklodextrin-obsahujúci supernatant, opísaný v patentovom dokumente WO 99/42602) kultivačného prostredia s mikroorganizmami, ktoré produkujú epothilóny, získaného rozdelením kultivačného prostredia na kvapalnú fázu (napríklad centrifugát alebo filtrát) a pevnú fázu (bunky), pričom· sa použije najmä filtrácia alebo odstredenie (trubková odstredivka alebo separátor).

Po tomto predbežnom spracovaní výhodne nasleduje priame zmiešanie roztoku i) alebo kvapalnej fázy ii) so živicou, najmä so syntetickou živicou, obzvlášť so živicou na báze kopolymérov styrénu a divinylbenzénu vo funkcii matrice (ďalej zjednodušene uvádzaná ako polystyrénová živica), akou je napríklad Amberlit XAD-16 alebo Diaion HP-20 (výhodne v objemovom pomere centrifugát : živica rovnom asi 10:1 až 100:1, výhodne rovnom asi 50:1). Po prebehnutí kontaktnej periódy, ktorá sa výhodne rovná 0,25 až 50 hodinám, najmä 0,8 až 22 hodinám, sa živica oddelí, napríklad filtráciou, sedimentáciou alebo odstredením. Ak to je potrebné, živica so po adsorpcii premyje silne polárnym rozpúšťadlom, výhodne vodou.

Potom začína realizácia výhodného spôsobu spracovania podlá vynálezu. Desorpcia epothilónov (ktoré ako také predstavujú obzvlášť výhodné uskutočnenie podlá vynálezu) sa uskutočňuje slabo polárnym alebo nepolárnym rozpúšťadlom, najmä (nižšie alkyl)halogenidy, obzvlášť metyléndichloridom alebo etyléndichloridom, alebo výhodnejšie aromatickými rozpúšťadlami, najmä naftalénom alebo (výhodne) benzénom, alebo naftalénom alebo (výhodne) benzénom substituovaným jedným alebo viacerými, výhodne jedným až troma, substituentami, ktoré sú zvolené zo skupiny, ktorá zahŕňa nižšiu alkylovú skupinu, najmä metyiovú skupinu, etylovú skupinu alebo izopropylovú skupinu, nižšiu alkoxyskupinu, najmä metoxyskupinu alebo etoxyskupinu, atóm halogénu, najmä atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu, nitroskupinu a (nižšiu alkoxy)-(nižšiu alkyl)ovú skupinu, najmä etoxymetylovú skupinu, najvýhodnejšie toluénom. Tento extrakčný stupeň sa môže opakovať raz alebo viackrát, výhodne 0 až 3 krát, najmä raz, pričom sa dosiahne úplná desorpcia v prípade, že je to nevyhnutné alebo požadované.

Spracovanie takto získaných roztokov (v prípade opakovaných extrakcii sa jedná o zlúčené roztoky) desorbovaných epothilónov výhodne pokračuje tým, že sa uskutoční odstránenie rozpúšťadla, ktoré sa použilo na desorpciu z uvedených roztokov odparením (destiláciou), výhodne zahustením v reaktore a následne v rotačnej vákuovej odparke.

Potom sa uskutoční ďalšie spracovanie, pričom sa použijú nasledujúce stupne, z ktorých iba stupeň čistenia chromatografiou s reverznou fázou, pri ktorej sa použije elučné činidlo tvorené nitrilom je obligatórne, zatiaľ čo ostatné stupne sú fakultatívne stupne:

kryštalizácia epothilónu alebo epothilónov špecificky v prípade kryštalizácie epothilónu B najmä nižšieho alkanolu s 3 až prípade kryštalizácie alkoholu a uhľovodíka, alifatického uhľovodíka metanolu a cyklohexánu 10:1, najmä v objemovom rýchlej fázovej separácii, sucha, napríklad vo vákuovej ktorý obsahuje epothilón B

PO so desorpcii; pridá zmes cyklického kruhovými atómami, obzvlášť (výhodne) pomere 1:3 pričom rotačnej až sa objemovom pomere 1:10 až 3:1. Pridanie vody vedie k alkoholová fáza odoarí do príslušnej rozpúšťadlovej zmesi, najmä zo zmesi alkoholu a cyklického alifatického uhľovodíka, výhodnejšie zo zmesi izopropanolu a cyklohexánu, výhodne v objemovom pomere 1:10 až 10:1, výhodnejšie v objemovom pomere 1:6 až 6:1 a najvýhodnejšie v objemovom pomere 1:6 až 1:4;

(obligatórna) separácia epothilónov reverzne fázovou chromatografiou po vybratí vhodným rozpúšťadlom, najmä zmesou nitrilu a vody, výhodné zmesou acetonitrilu a vody, výhodne v objemovom pomere 1:10 až 10:1, najmä v objemovom pomere 1:3 až 1:1, a elúcia zmesou nitrilu a vody, pričom sa chromatografia výhodne uskutočňuje na stĺpci reverzne fázového materiálu, ktorý obsahuje uhľovodíkové reťazce, ako napríklad uhľovodíkové' reťazce, ktoré obsahujú 18 uhlíkových atómov, najmä na stĺpci materiálu RP-18, a elúcia sa uskutoční elučným činidlom, ktoré obsahuje nitril, acetonitril, výhodne a vody, najmä zmes nitril:voda rovnom najmä (nižší elučnou sústavou, alkyl)nitril, ktorú tvorí zmes nitrilu obzvlášť až 9:1, napríklad následne alebo 4:6;

epothilón odparením sprevádza vody, výhodne predovšetkým v v pomere 2:8 až 7:3, výhodne v sa odstráni nitril z frakcii, ktoré obsahujú epothilón B) voda ktorá asi 1:99 až 99:1,

2:8 až v pomere pomere 1:9 pomere 3: 7 (najmä epothilón A alebo najvýhodnejšie (destiláciou); ak je to požadované, epothilón sa potom extrahuje esterom, alkyl)-(nižší alkanoát)om, výhodne izopropylacetátom, a esterová fáza, ktorá obsahuje epothilón sa potom odparí do sucha (výhodne najprv v prvom reaktore a potom vo vákuovej rotačnej odparke); (ak sa to požaduje, môže sa východiskový roztok epochilónu rozdeliť na niekoľko časti a tieto čiastkové roztoky sa potom môžu podrobiť separácii vo viac než jednom reverzne fázovom separačnom kroku);

iba prípadná (napríklad ako alternatíva ku kryštalizácii po desorpcii) adsorpčná chromatografia, uskutočnená najmä zavedením na stĺpec silikagélu a elúciou príslušným rozpúšťadlom alebo príslušnou zmesou rozpúšťadiel, najmä zmesou esceru a uhľovodíka, napríklad zmesou alkylalkanoátu a alkánu, ktorý obsahuje 4 až 10 uhlíkových atómov, obzvlášť zmesou etyl- alebo izopropylacetátu a n-hexánu, v ktorom je pomer esceru k uhľovodíku výhodne v rozsahu 99:1 až 1:99, výhodne v rozsahu 10:1 až 1:10, napríklad výhodne rovný 4:1;

a nakoniec rekŕyštalizácia, púšťadiel alebo zmesí rozpúšťadiel, alkoholy, najmä pomere 1:10 až alebo metanol esterov a uhľovodíkov alebo napríklad z príslušných ktoré zahŕňajú estery, zmes etylvýnodne v ecvlacetát rozzmesi alebo izopropylacetátu a toluénu pomere 2:3 (epothilón A) (epothilón B);

10:1, alebo pričom pri uvedenom spôsobe alebo/a požadované, medzi výsledné roztoky alebo suspenzie sa v prípade, j ednotlivými alebo/a nevyhnutné zahustia je to stupňami sa kvapalné a tuhé že zložky oddelia jedna od druhej, najmä sedimentáciou, filtráciou alebo odstredenim roztokov alebo suspenzií. Uvedené presnejšie definície sa môžu výhodne použiť v uvedených jednotlivých stupňoch.

V rámci výhodnej formy uskutočnenia sa vynález rovnako týka spôsobu izolácie epothilónov adsorbovaných na syntetickej živici, najmä epothilónu A alebo výhodnejšie epothilónu B, ktorého podstata spočíva v tom, že zahŕňa

i) desorpciu epothilónov z uvedenej syntetickej živice slabo polárnym alebo nepolárnym rozpúšťadlom, najmä (nižšie alkyl)halogenidy, najmä metyléndichloridom alebo etyléndichloridom, alebo výhodnejšie aromatickými rozpúšťadlami, najmä naftalénom alebo (výhodne) benzénom alebo naftalénom alebo (výhodne) benzénom substituovaným jedným alebo viacerými, výhodne jedným až troma, substituentami, ktoré sa zvolia zo skupiny, ktorá zahŕňa nižšiu alkylovú skupinu, najmä metylovú skupinu, etylovú skupinu alebo izopropylovú skupinu, nižšiu alkoxyskupinu, najmä metoxyskupinu alebo etoxyskupinu, atóm halogénu, najmä atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu, nitroskupinu a (nižšiu alkoxy)-(nižšiu alkyl)ovú skupinu, najmä etoxymetylovú skupinu, najvýhodnejšie toluénom, alebo zmesou dvoch alebo viacerých takýchto rozpúšťadiel, a ii) separáciu epothilónov reverznou fázovou chromatografiou po ich vybratí vhodným rozpúšťadlom, najmä zmesou nitrilu a vody, výhodne zmesou acetonitrilu a vody, výhodne v objemovom pomere 1:10 až 10:1, najmä v objemovom pomere 1:3 až 1:1, a elúciu zmesou nitrilu a vody, pričom chromatografia sa výhodne uskutočňuje nä stĺpci reverzne fázového materiálu, najmä na stĺpci materiálu RP-18, ktorá obsahuje uhľovodíkové reťazce, napríklad uhľovodíkové reťazce, ktoré obsahujú 18 uhlíkových atómov, a použije sa elučné činidlo, ktoré obsahuje nitril, najmä (nižší alkyl)nitril, obzvlášť acetonitril, pričom sa najmä použije zmes nitrilu a vody, najmä zmes acetonitrilu a vody, výhodne pomeru nitril/voda rovnom asi 1:99 až 99:1, výhodnejšie v pomere 1:9 až 9:1, napríklad v pomeru medzi 2:8 a 7:3, napríklad pri pomere 3:7 alebo 4:6.

V rámci ďalšej výhodnej formy uskutočnenia vynálezu uvedený spôsob, ktorý začína stupňom I) a obsahuje stupeň ii) ďalej zahŕňa lubovolný stupeň čistenia, ktorý je nevyhnutný alebo požadovaný na získanie príslušných epothilónov, najmä epothilónu A a najvýhodnejšie epothilónu B, v čistej forme, výhodne tie stupne čistenia, ktoré boli v rámci vynálezu opísané ako výhodné.

Spracovanie sa výhodne uskutočňuje nasledujúcim spôsobom: adsorpcia epothilónov, najmä z chemických reakčných zmesí alebo výhodne zo supernatantov kultivačných prostredí mikroorganizmov, sa môže uskutočniť spôsobom, ktorý je opísaný v patentovom dokumente WO 99/42602 alebo spôsobom, ktorý je analogický s týmto spôsobom; stručne špecifikované: epothilóny sú obsiahnuté v centrifugáte, ktorý sa potom priamo zmiesi so syntetickou živicou, najmä so živicou na báze styréndivinylbenzénového kopolyméru, ako napríklad so živicou Amberlite XAD-16 alebo Diaicn HP-20 (výhodne v objemovom pomere centrifugát/živica rovnom asi 10:1 až 100:1, výhodnejšie v pomere asi 50:1), a získaná zmes sa mieša v miešacom zariadení. Po uplynutí času, ktorý je dostatočný na adsorpciu, napríklad po uplynutí času styku so živicou rovného 0,2 až 10 h, sa živica oddelí odstredením alebo filtráciou. Adsorpcia epothilónov na živicu sa môže rovnako uskutočniť v chromatografickej kolóne na stĺpci živice a to usporiadaním živice v kolóne a vedením uvedeného centrifugátu cez túto kolónu. Po adsorpcii sa živica premyje vodou.

Potom začne výhodné spracovanie podlá vynálezu, ktoré prebieha nasledujúcim spôsobom.

Desorpcia epothilónov zo živice sa výhodne uskutočňuje slabo polárnym alebo nepolárnym rozpúšťadlom podlá vynálezu, najmä opísaným výhodným rozpúšťadlom, najmä metylénchloridom alebo najvýhodnejšie toluénom. Rozpúšťadlo sa potom odstráni, pokial je to nutné, výhodne pre získanie suchého zvyšku. Ak to je vhodné, zvyšok sa vyextrahuje v zmesi alkoholu a uhlovodika, najmä v zmesi metanolu a cyklohexánu, výhodne v opísaných pomeroch, pričom sa použije pomerne malý objem uvedenej zmesi. Alkoholová fáza sa potom odparí, výhodne do sucha, a alkoholový extrakt sa potom kryštalizuje zo zmesi alkoholu, výhodne izopropanolu, a uhľovodíka, najmä cyklohexénu, v opísaných pomeroch. Získaný tuhý kryštalický materiál sa potom rozpustí v zmesi nitrilu a vody, výhodne opísanej, najmä v zmesi acetonitrilu a vody v objemovom pomere 2:3, a získaný roztok sa v prípade, že je to požadované, po rozdelení do niekoľkých frakcií naleje na preparatívny reverzne fázový chromatografický stĺpec. Potom sa uskutoční elúcia zmesou nitrilu a vody, výhodne práve opísanou zmesou. (Aceto-)nitril prítomný v získaných frakciách, ktoré obsahujú epothilón, najmä epothilón A a najvýhodnejšie epothilón B, sa odstráni odparením (destiláciou) a získaná vodná fáza sa extrahuje esterom, najmä izopropylacetátom. Získaný esterový extrakt sa potom odparí, výhodne do sucha, a získaný materiál sa následne rekryštalizuj e, pričom napríklad frakcia epothilónu A sa priamo kryštalizuje zo zmesi esteru a uhľovodíka, napríklad zo zmesi etylacetátu a toluénu v objemovom pomere 2:3, zatiaľ kým frakcia epothilónu B sa kryštalizuje z esteru, najmä z etylacetátu alebo výhodne z alkoholu, najmä z metanolu.

Ako vysoko účinné selektívne elučné činidlo (desorpčné činidlo) bol zistený toluén, ktorý poskytuje približne 100 % výťažok dosiahnutý za polovicu desorpčnej doby, ktorú na to potrebuje izopropanol použitý v rámci postupu opísaného v patentovom dokumente WO 99/42602. Množstvo desorbovaných epothilónov sa prekvapivo zvýši, napríklad na 130 %, po desorpcii toluénom v porovnaní s izopropanolovým desorpčným činidlom (aj keď sa to na prvý pohlad zdá nemožné z teoretického hľadiska, táto skutočnosť veľmi dobre ilustruje hlavnú výhodu poskytovanú vynálezom: výsledok sa vzťahuje na stanovenie naadsorbovanej živice; pretože pri tomto stanovení sa na desorpciu použil izopropanol, za základ sa vzal neúplný desorpčný proces, ktorý viedol pôvodne k nižším hodnotám stanovenia, ktoré sa teraz ukázali byť klamné). Epothilónová zmes sa môže predchádzaj úcej fázovej živice, rozpúšťadiel, (bez predchádzajúcej kryštalizácie alebo po kryštalizácii) zaviesť priamo na stĺpec reverzne Proces je značne robustný, pokiaľ ide o množstvo mieru miešania a teploty. Zatiaľ kým v prípade al koholov (napríklad v prípade etanolu a izopropanolu) za miešania dochádza k dvojfázovej desorpcii, kedy sa prvé množstvo materiálu, ktorý obsahuje epothilón desorbuje v prvej časovej perióde (čo je snáď vysvetliteľné distribúciou veľkosuí pórov nájdenou u polystyrénu XAD-16, ktorá má dve distribučné maximá) a druhé množstvo uvedeného materiálu sa desorbuje v druhej časovej perióde až po uplynutí prvej časovej periódy, nepozorovalo sa toto neželané chovanie pri toluéne alebo rovnako pri dichlórmetáne, kde sa všetok materiál, ktorý obsahuje epothilón desorbuje už v prvej časovej perióde. Za porovnateľných podmienok predstavoval v jednom príklade zvyšok po odparení v prípade izopropanolu a epothilónov A a B 40 g, zatiaľ čo v prípade metylénchloridu 3,3 g a v prípade toluénu iba 0,9 g, ale napríklad 17 až 18 g v prípade epothilónu B po desorpcii zo živice na báze kopolyméru styrénu a divinyľbenzénu, pričom sa použije supernatant kultivačných prostredí, ktoré obsahujú cyklodextrín, ako je to opísané v patentovom dokumente WO 99/42602, čo ukazuje na oveľa vyššiu čistotu. Zatiaľ čo pri použití toluénu sa dosahujú najvýznamnejšie výhody, spočíva výhoda dichlórmetánu v jeho ľahkom odstránení v dôsledku jeho nízkej teploty varu.

Separácia epothilónu A a B sa môže rovnako dosiahnuť uskutočnením chromatografie vo forme simulovaného pohyblivého lôžka (SMB, Simulated Moving Bed) . Chromatografia SMB je široko používanou separačnou metódou používanou na separáciu binárnych zmesí, ako je napríklad separácia racemátov na chirálnych stacionárnych fázach, napríklad procesy Sorbex v petrochemickom priemysle, ako procesy Parex alebo Molex, alebo proces Sarex používaný v cukrovarníckom priemysle. V porovnaní so šaržovou chromatografiou, poskytuje chromatografia SMB výhodu prevádzky kontinuálnej protiprúdovej jednotky, ktorá vedie k zvýšenej produktivite a zníženej spotrebe mobilnej fázy. Odborníkom v danom obore je známych niekoľko systematických postupov pre metodický rozvoj chromatografie SMB. Takéto postupy sú napríklad opísané v: R. M. Nicoud, M. Baily, J. Kinkel, R. M. Devant, T. R. E. Hampe a E. Kústers, Proceedings of the l^st European Meeting on Simulated Moving Bed Chromatography (1993), ISBN 2905-267-21-6, str. 65-88; E. kústers, G. Gerber a F. D. Antia, Chromatographia, 40 (1995) 387; T. Pról a E. Kústers, J. Chromatogr. A,800 (1998) 135; alebo C. Heuer, E. Kústers, T. Plattner a A. Seidel-Morgenstern, J. Chromatogr. A, 827 (1998) 175.

Základné parametre na separáciu epothilónu A a B chromatografiou SMB sa môžu priamo odvodiť od konvenčnej separácie kvapalinovou chromatografiou. Výhodne sa ako stacionárna fáza použije reverzne fázový silikagél (RP 18) a ako mobilná fáza sa použijú zmesi vody a acetonitrilu. Finálny súbor prietokových rýchlostí (pre individuálne zóny SMB a prepínacie časy) sa môže odvodiť buď z jednoduchej prúdovej schémy vyvinutej E. Kústers-om a kol., ktorý je k dispozícii v: Chromatographia, 40 (1995) 387, alebo starostlivým vyhodnotením adsorpčných izoteriem, uvedených v: J. Chromatogr. A, 800 (1998) 135 a v-: J. Chromatogr. A, 827 (1998) 175. Spracovanie extraktu a rafinátových prúdov sa môže rovnako uskutočniť spôsobom, ktorý je opísaný na separáciu konvenčnou kvapalinovou chromatografiou.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych “príkladov jeho uskutočnení, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený definíciou patentových nárokov a obsahom opisnej časti.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Na úvod je nutné uviesť, že pri zachádzaní s epothilónmi je potrebné dodržiavať príslušné bezpečnostné ochranné opatrenia vzhľadom na ich vysokú toxicitu.

Príklad 1

Spracovateľský postup pre epothilón B

Desorpcia 591,7 kg naadsorbovanej živice (styrén/divinylbenzén-kopolymérová živica XAD-16 s naadsorbovaným epothilónom A a B z kultivačného prostredia) sa uskutoční miešaním uvedenej živice rozdelenej na dve časti vždy so 720 litrami toluénu v štyroch podieloch v priebehu približne 8 hodín. Oddelenie toluénovej fázy od živice sa zaistí použitím filtra, ktorý sa prevádzkuje pod satím. Zlúčené toluénové fázy sa premyjú dvoma podielmi, ktoré tvorí vždy 250 litrov vody. Po rozdelení fáz sa toluénový extrakt zahustí v 1000 1 reaktore na objem približne rovný 20 až 40 litrov a potom sa uskutoční zahustenie do sucha vo vákuovej rotačnej odparke. Získa sa 4,095 kg toluénového extraktu, ktorý obsahuje 209 g epothilónu B. Tento toluénový extrakt sa rozpustí v 16,5 litroch metanolu a 24,5 litroch cyklohexánu. Po pridaní 0,8 litrov vody dôjde bezprostredne k rozdeleniu fáz. Metanolová frakcia sa odparí do sucha vo vákuovej rotačnej odparke, pričom sa získa 1,025 kg zvyšku, ktorý po odparení obsahuje 194 g epothilónu. Metanolový extrakt sa potom kryštalizuje z rozpúšťadlovej zmesi, ktorá obsahuje 2,05 litrov izopropanolu a 10,25 litrov cyklohexánu, pričom sa získa 0,4 kryštalického materiálu, ktorý obsahuje 184 g epothilónu B. Získané kryštály sa rozpustia v 3,2 litroch zmesi acetonitrilu a vody v objemovom pomere 2:3 a výsledný vsádzkový roztok sa zavedie v troch oddelených pásoch na preparatívny stĺpec reverzne fázovej živice (25 kg sférického silikagélu RP18, YMC-Gel . ODS-A 120; 5 až 15 mikrometrov; Waters Corp. , Milford, Massachus.etts, USA). Elúcia sa uskutočni zmesou acetonitrilu a vody v objemovom pomere 2:3 vo funkcii mobilnej fázy pri prietoku 2,3 1/min; retenčný čas epothilónu A = 77 až 96 minút, retenčný čas epothilónu B = 96 až 119 min. Frakcie sa monitorujú ultrafialovým detektorom pri vlnovej dĺžke 250 nm. Acetonitril zo spojených frakcií epothilónu B (z troch pásov) sa oddestiluje a zvyšná vodná fáza sa extrahuje 504 litrami izopro pylacetátu. Izopropylacetátový extrakt sa zahusti v 630 1 reaktora na približne 20 až 40 litrov a potom sa zahusti do sucha vo vákuovej rotačnej odparke. Hmotnosť zvyšku po odparení epothilónových frakcií predstavuje 170 g a tento zvyšok obsahuje (podía stanovenia vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou, pričom sa použije vnútorný štandard) 98,4 % epothilónu B. Takto získaný materiál sa nakoniec kryštalizuje z 2,89 litrov metanolu s teplotou 0 až 5 °C, pričom sa získa 150 g epothilónu B vo forme čistého kryštalizátu.

Teplota topenia získaného produktu: 124 až 125 °C;

¹H-nukleárne magnetickorezonančné spektrum pre epothilón B (500 MHz-NMR, rozpúšťadlo: DMSO-d6; chemické posuny Ô v ppm vzhladom na TMS; s = singlet, d = dublet, m = multiplet):

δ (multiplicita)

7,34(s)

6, 50(s)

5,28(d)

5,08 (d)

4.46 (d)

4,08 (m)

3.47 (m)

3,11 (m)

2,83(dd)

2, 64(s)

2,36(m)

2,09(s)

2,04(m)

1, 83(m)

Integrál (počet H l,61(m)1 l,47-l,24(m)4 l,18(s)6 l,13(m)2 l,06(d)3

0,89(d+s, presah)6

Σ = 41

Príklad 2

Porovnanie rôznych desorpčných postupov pri príprave epothilónu B

Vždy 360 ml vodnej suspenzie styrén/divinylbenzénkopolymérovej živice XAD-16 s naadsorbovaným epothilónom A a B z kultivácie myxobaktérií uskutočnenej spôsobom opísaným v patentovom dokumente WO 99/če602 (čo zodpovedá 194 g mokrého produktu Amberlite XAD-16) sa extrahuje rozpúšťadlami, ktoré sú uvedené spoločne s pracovnými podmienkami v nasledujúcej tabuľke v miešanom (zvyčajne laboratórne kotvové miešadlo) sklenenom reaktore, opatrenom na dne spečenou fritou (interne vyrobený šaržový reaktor, vnútorný priemer: 10 cm, dĺžka 20 cm, ďalej označovaný ako Stirrer/Frit).

Tabuľka 1

Porovnanie desorpčných postupov pri výrobe epothilónu B

Štartovacia živica (živica s naadsorbovaným epothilónom) :

#1001: teoretický obsah 70 mg na 360 ml živicovej suspenzie (čo zodpovedá 70 mg na 104 g mokrej XAD-16),

- #1003: teoretický obsah 114 mg na 360 ml živicovej 'Suspenzie (čo zodpovedá 114 mg na 194 g mokrej XAD-16).

		~ i
o +->	o o	co		: C Π3	1	CO			ST m
	lO 1 CNJ ^r	o	o	Ch	i °	i—1			r—1
	o	CO	O	I m		CN]	CN]
4-> :<0 Ch	t—1 ^t=	r—1	' M 04 O N h-1	1 CN	x !----1			o	r—1
CO


o
4->	O	co
	o	o	o
m c¹		o	CD
C_ I I	O	,^-1	CO
4—¹•ra Ch co		=#=

ci
o
r—I		CNJ
£
O i	O	CNJ
C Ό :	LO		CN
Ό	CN	X
r—\|
>1		r—l

d) S

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

	i Ό •H	CN
_			hl	i	CN
•H			O	i		1 1 1
-M ω O	CO o	o	r-¹1 jC	o	II x:	1 1 1 1 1 1
c	o	CD		‘ lO	CN	CO
4-J cn	t-1 =#=	CO	G 'Φ	(N	r-	1 1 1
Φ H			r—1		o	1 I I 1 1 1
£			4->		X
			o
			s		CO

4-J • rJ		r—i o	CO
M	Φ	•<—1			s
ω	4-J	-U cn	CO		ra		II
s	O r-H θ-	o c	o o	o CD	Ch o	o LO	•-H CN r*»	m
M	α)	4-J	t^-1	CO	i n	: cn]
M •H	H	cn Φ •H	=#=		Ch I o		O
4-J ω		e			N L—1	!	X

U0 <υ 'T

CN

O m CN

II <o co o

co

LÍO o

I I I

I I

I I I

I I

I x

CO

	i-H
•H			0		t—4
4-J			s
cn	t-i		Π3		II
0	o	O	α	O
c	o	CO	0	m	CN
4-»	r—1	CO	5-1	i <nj
cn	44s		α		O
Φ			o
•r]			! N	f	x
£			h-4

CM ro

•ΓΊ Φ > O

r—1

á N

Φ

•-H

»-H

Jj

'<o

U

g

O

•H

x

E

c

>

•H

5-1

c

u

*—·

O

cO

o

>

H

Ch

4-J

•H

-X

•H

Φ

'Φ

E

Ul

φ

Ό

Π5

'03

cn

>N

•r4

C

Φ

r—4

O

•H

O

•H

4-J

(D

M

•H

•

N

>υ

•H

cn

C

>

O

Φ

>

0

Ό

Φ

4-J

C ;

Ch

; C

-X

Φ

-X

o

4J

O

cn

Φ _:

^4

E

TJ

5-4

•

co

Φ

£

•H

>N

Ch ;

o

>cn

'<0

Φ

(0

Ό

M

i—!

Φ

O

>

o

cn

Φ

4-J

•ΓΊ

cn —

Ch

•H

4-J

>

Φ

->

•H

c

□

Φ

¹ -H

0

D

(0 X

Tí

M

X

4J

CC

>

>N

Σ

cn

Q

S

O

<J —

O

CU

ω

Φ

LíO	í—i	O r-	CO	CO CH
r1		t—i	CO	<£>
				lD

ι ι I

I I

I

4-1 'ťT

CN

CO

lO

CN

!------1 00	cn	^r CO
CO	CM	<0
		o>

I I

I I I

I I I l I I I I I í I

Ό ΓΓΟ

CO uo rt“i oo σι m o

cxj

^r lD

CN cr uT)

O r-

<XJ	1	ovo
·<—1			cx		-—
C		ä	Ό
Q		—	0		σ
r-Ί					s
Φ		ω	O	.—.
T>		•H	CL, —	oP	··
Ό		C	Cn
O	-C	Φ	Xí ~-		0
		M	o	x:	>N
<0		(TJ	>W -H	(0	ra
XI	N	a	>1 C	w	:p
o	OJ	Ό	> Φ	x>	'>
Q	U-i	o	N Cl	O	>

12

Stirrer/Frit

ω 0 CO

#1003

360

Toluén

250

4 x 0,36 =

1,44

*3*

1 1 1 1 1 1 1 1

lD O

1 1 1 1 1 1 1 1

u

•H

II

ti

1

6-i

CO o o rH

c

CD

1

11

x ti (D tl

(RT)

360

olué

o ŠT CD

0, 3

rH

1 1 1 1

lO O

1 1 1 1

ti

E-)

x

1

•H

1

4->

^r

σ>

4-)

•H

II

tl

1

tu

co o o i—1

C

CO

1

10

X ti (D tl

P CG

360

olué

250

0,3

’sT r—1

1 1 1 1

ϋ lO O

1 1 1 1

ti

Eh

x

1

•H

1

4-1

ω

co

ΟΊ

x σ rH

P O LT) 1 CN ST

003

80

opano

50

t—1 II co

CO

54

rH

<D CG

rH =#=

rH

zopr

CM

rH x

o

rH

hH

i—1

Cxl

4->

•H

CM

tl

|

CO

tu \ tl Φ tl

P CG

#1003

360

oluén

O šT MO

II XI r-

CO

1 1 1 1 1

<—< lO O

1 1 1 1 1

tl

Eh

o

1

•H

1

4-1

X

ω

co

«

id

m

4-4

- M

**

ω

o

1

σ'

co o

o

lénchl

II

1 1

1 1 I

1 f

C-

<0

O

o

σ·

LT)

m

e x

rH =H=

t—1

O

1 |

1 I

•

X

I

l

t

rH

4-4

tl

<D

ω

s

rH

•ΓΊ

Φ

>

Λ

á

-

0

r—1

N

Φ

r—<

p

'05

u

ε

O

•H

A

c

>

•H

—’'

H

c

U

—

O

í0

0

>

•<H

Ch

>

P

•H

Φ

'Φ

e

H

Φ

Ό

03

'05

P

V)

>N

•H

c

φ

rH

O

Ή

P

rg

P

•H

•

N

>o

•H

cn

c

>

O

Φ

>

o

T3

OJ

P

C

Ch

C

φ

Φ

υ

-P

a

U

cn

Φ

M

05

>o

ε

Ό

P

fO

05

Λί

x:

•H

>N

Ch

O

></)

'<XJ

φ

05

Ό

P

«-Η

05

u

>

o

cn

Φ

P

•m

cn —x

Ch

•H

P

Φ

'>1

•H

c

□

Φ

-H

o

n

<T3 JZ

T3

P

x

P

CC

>

>N

s

(0

Q

Σ

o

•o —

o

Ol

ω

Φ

0,1	γΗ	0, 95	15,8	150 (132)

				<NI
		00		00
r—1		00		rH

ο		*» ο	r· rH	o
				□o
				t^-H
				r-H

				CD
		ι_Γ)	CO	i-H
f-1 ο	ι—i	0,7	rr—i	t—1
				CN
				00
				j—4

				o
				rH
		CN	cn	τ-Η
LT)		οο	kD
t—H		*»	S.
		CN	CN	□0
				*»
				CN
				CO


		C0		13


ο		•η ο	C· t—1	00
				LT)
				rH

1
1				cn
1 \|		00 ΓΩ	ID	co
	r—1
1 1			o	CN
1				CN
		1
φ		φ		ovs
•Η		α
C		Ό
φ	'-τ'	0		Cn
<—1				β
Φ	φ	Ο
τ>	•Η	£Χ —.	0*>	··
Ό —	C	σ'	—	x.
0 £	φ			0
—		ο	x:	>N
φ	φ	>ω ή	φ	Φ
Ο Ν	CL	> c	cn	X)
Ο -Φ	TJ	> φ	£	'>
Q Ψ<	Ο	CO Ll	O	>

a - neoptimalizované, v prípade 2 extrakcii predstavuje strata výťažku asi 5 % b - trojnásobná extrakcia, kedy voda neextrahuje žiadnu polárnu zložku;

c - prvá z troch fázových separácií;

d - materiál pri prirovnaní k zvyšku po odparení etylacetátu sa môže oveľa lepšie chromatografovať cez silikagél;

e - zodpovedá zvyšku po odparení asi 25 až 30 g;

f - sušenie v sušiarni (za hlbokého vákua) cez víkend;

g	- snáď výsledok hojnej prvej ka použitého času;	fázovej	separácie,	ktorý sa tý-
h	izolácia: prvá extrakcia	= 700	ml;	druhá	extrakcia =
	680 ml; tretia extrakcia = 680 ml;
i	izolácia: prvá extrakcia	= 670	ml;	druhá	extrakcia =
	710 ml; tretia extrakcia = 720 ml;
j	- potreba pridať vodu nebola	ešte potvrdená;

k - zjednodušuje odstránenie pôvodne prítomnej vody (XAD-16 je krytý použitou vodou);

- vzhladom na výsledky varianty 8, 11 a 12 a na elučné krivky pre všetky experimenty s toluénom sa nemôže vylúčiť použitie menšieho množstva živice;

Erl./mag.St = magnetické miešanie v Erlenmayerovej banke;

metylénchlorid (metylénchl.) = dichlórmetán;

Stir./Frit = Stirrer/Frit; RT = teplota miestnosti.

Z uvedených experimentov a ďalších údajov je možné odvodiť, že v porovnaní s izopropanolom poskytuje metylénchloridová extrakcia lepšiu selektivitu, kratší čas extrakcie (približne dvakrát kratší), rýchlejšiu destiláciu rozpúšťadla (teplota varu metylénchloridu je 40 ’C, zatiaľ kým teplota varu izopropanolu je 81 až 83 ’C), skutočnosť, že už nie je potrebná časovo náročná a problematická fázová separácia zmesi etylacetátu a vody, skutočnosť, že už nie je potrebná destilácia druhého rozpúšťadla, a teda menší počet stupňov, čo má za následok znížené riziko kontaminácie a lepšiu a bezpečnejšiu operačnú manipuláciu; je možné spracovanie polovičného objemu (napríklad spracovanie v 1000 1 reaktoroch namiesto v 2000 1 reaktoroch); produkovaný epothilón B má lepší čistotný profil (menej vedľajších produktov s polaritou, ktorá je porovnateľná s polaritou epothilónu B); a zvyšok po odparení nepení a neprská, ako je to v prípade extrakcie etylacetátom. Pri desorpcii toluénom sa dosiahne vyšší výťažok v porovnaní s izopropanolovou extrakciou (asi 100 % namiesto 80 %), pričom je možné pozorovať lepšiu selektivitu (keď sa použije izopropanol desorbuje sa asi desaťnásobné množstvo vedľajších produktov); doba extrakcie sa výrazne skráti (asi trikrát), zjednoduší sa namáhavá filtrácia po desorpcii izopropanolom (izopropanolová extrakcia sa namáhavo uskutočňuje vo veľkom množstve), nie je potrebná destilácia druhého rozpúšťadla, je možné pracovať v menších reaktoroch (opäť je napríklad možné použiť 1000 1 reaktor namiesto 2000 1 reaktora), je možné vynechať chromatografiu na silikagéli (zvyšok po odparení po desorpcii obsahuje vždy asi 40 % zmesi epothilónu A/B) a zvyšok po odparení po desorpcii nepení a neprská ako zvyšok z extrakcie etylacetátom.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob desorpcie epothilónov zo živice, vyznačuj ú - ci sa tým, že sa desorpcia uskutočňuje slabo polárnym alebo nepolárnym rozpúšťadlom.
2. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že epothilóny určené na desorpciu sú epothilón A alebo epothilón B.
3. Spôsob podlá niektorého z nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že živicou je syntetická živica.
4. Spôsob podlá nároku 3, vyznačujúci sa tým, že živicou je syntetická živica na báze styrén/divinylbenzénových kopolymérov.
5. Spôsob podlá niektorého z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že slabo polárne alebo nepoláme rozpúšťadlo sa zvoli zo skupiny, ktorá zahŕňa (nižšie alkyl)halogenidy a aromatické rozpúšťadlá a zmesi dvoch alebo viacerých takýchto rozpúšťadiel, pričom výraz nižší alkyl znamená alkylovú skupinu, ktorá obsahuje najviac 7 uhlíkových atómov.
6. Spôsob podlá nároku 5, vyznačujúci sa tým, že použité aromatické rozpúšťadlo sa zvolí zo skupiny, ktorá zahŕňa naftalén, benzén a naftalén alebo benzén substituovaný jedným alebo viacerými substituentami, ktoré sú zvolené zo skupiny, ktorá zahŕňa nižšiu alkylovú skupinu, nižšiu alkoxyskupinu, atóm halogénu, nitroskupinu a (nižšiu alkoxy)(nižšiu alkyl)ovú skupinu, pričom výraz nižší znamená, že nižšia alkylová skupina alebo (nižšia alkoxy)skupina obsahuje najviac 7 uhlíkových atómov.
7. Spôsob izolácie epothilónov adsorbovaných na syntetickej živici, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa iii) desorpciu epothilónov z uvedenej syntetickej živice slabo polárnym alebo nepolárnym rozpúšťadlom a iv) separáciu epothilónov reverzne fázovou chromatografiou potom, čo sa epothilóny vybrali vhodným rozpúšťadlom, a elúciu zmesou nitrilu a vody.
8. Spôsob podlá niektorého z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa ľubovoľné stupne čistenia, ktoré sú požadované alebo nevyhnutné na získanie príslušných epothilónov v čistej forme.
9. Spôsob získania epothilónov z reakčnej zmesi, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa desorpciu epothilónov slabo polárnym alebo nepolárnym rozpúšťadlom, pričom sa tento desorpčný stupeň môže opakovať kým sa nedosiahne úplnejšia desorpcia;

odstránenie rozpúšťadla použitého na desorpciu zo získaných roztokov odparením;

pripadnú kryštalizáciu epothilónu alebo epothilónov po desorpcii, najmä kryštalizácii epothilónu B pridaním, zmesi alkoholu a uhľovodíka a odparením alkoholovej fázy do sucha a kryštalizáciu epothilónu B z príslušnej zmesi rozpúšťadiel;

(prípadný stupeň) oddelenie epothilónov reverzne fázovou chromatografiou vybratím zvyšku z predchádzajúceho stupňa vhodným rozpúšťadlom a elúciu zmesou nitrilu a vody a odstránenie nitrilu zo zlúčených frakcií, ktoré obsahujú epothilóny, pričom voda, ktorá ostala v epothilónoch sa potom prípadne extrahuje esterom a esterová fáza, ktorá obsahuje epothilóny sa následne odparí do sucha;

prípadné ďalšie čistenie adsorpčnou chromatografiou; a finálnu kryštalizáciu prečisteného epothilónu z príslušného rozpúšťadla alebo z príslušnej zmesi rozpúšťadiel;

pričom v prípade, že je to požadované alebo/a nevyhnutné, môžu sa roztoky alebo suspenzie získané medzi jednotlivými stupňami zahustiť alebo/a kvapalné a tuhé zložky sa môžu od seba oddeliť, a výraz nižší tu znamená, že skupina obsahuje najviac 7 uhlíkových atómov.
10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa desorpcia epothilónov zo živice uskutoční slabo polárnym alebo nepolárnym rozpúšťadlom, najmä rozpúšťadlom, ktoré je v nároku 5 alebo 6 uvedené ako výhodné rozpúšťadlo; rozpúšťadlo sa potom odstráni, pokiaľ je to nutné, výhodne až kým sa získa suchý zvyšok, zvyšok sa prípadne vyextrahuje pomerne malým objemom zmesi alkoholu a uhľovodíka; alkoholová fáza sa odparí, výhodne do sucha a alkoholový extrakt sa potom kryštalizuje zo zmesi alkoholu a uhľovodíka na získanie tuhého kryštalického materiálu, ktorý sa potom rozpustí v zmesi nitrilu a vody, ktorá je opísaná v nároku 8, najmä v zmesi acetonitrilu a vody v objemovom pomere 2:3, a získaný roztok sa naleje, pripadne po požadovanom rozdelení do viacerých než jedného prúdu, na preparatívny reverzne fázový chromatografický stĺpec, ktorý sa potom eluuje zmesou nitrilu a vody, a zo získaných frakcií, ktoré obsahujú epothilón sa odstráni nitril odparením, potom sa získaná vodná fáza extrahuje esterom a získaný esterový extrakt sa potom odparí a získaný materiál sa následne rekryštalizuje, pričom výraz nižší znamená, že skupina obsahuje 7 uhlíkových atómov.
11. Spôsob podľa niektorého z nárokov 7, 9 alebo 10, vyz- načujúci sa tým, že separácia epothilónu A a B sa uskutočňuje chromatografiou so simulovaným pohyblivým lôžkom (SMB).
12. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1, 7, 9 alebo 10 vyznačujúci sa tým, že slabo polárne rozpúšťadlo alebo nepoláme rozpúšťadlo alebo zmes takýchto rozpúšťadiel má nasledujúce charakteristiky v eluotropnom rade, ktorý sa urči podlá Snydera a kol·.:

x_e = 0,20 až0,40, x_d = 0,15 až 0,36,a x_n = 0,38 až0,60, pričom x_e je protónový akceptorový parameter, x_d je protónový donorový parameter a x_n je dipólový parameter, s výhradou, že x_e+ x_d + x_n = 1.
13. Spôsob podlá nároku 12, vyznačujúci sa tým, že slabo polárne rozpúšťadlo alebo nepolárne rozpúšťadlo alebo zmes takýchto rozpúšťadiel má nasledujúce charakteristiky v eluotropnom rade určené podľa Snydera a kol.:

x_e = 0,22 až 0,32, x_d = 0,17 až 0,34, a x_n= 0,39 až 0,54, pričom x_e je protónový akceptorový parameter, x_d je protónový donorový parameter a x_n je dipólový parameter, s výhradou, že X_e + X_d + Xn = I-
14. Použitie slabo polárneho alebo nepolárneho rozpúšťadla na desorpciu epothilónov_zo živice.
15. Použitie podľa nároku 14, pri ktorom sa slabo polárne alebo nepolárne rozpúšťadlo zvoli zo skupiny, ktorá zahŕňa (nižšie alkyl) halogenidy a aromatické rozpúšťadlá, najmä naftalén, benzén a naftalén alebo benzén substituovaný jedným alebo viacerými substituentami, ktoré sú zvolené zo skupiny, ktorá zahŕňa nižšiu alkylovú skupinu, nižšiu alkoxyskupinu, atóm halogénu, nitroskupinu a (nižšiu alkoxy)-(nižšiu alkyl)ovú skupinu, a zmes dvoch alebo viacerých takých rozpúšťadiel, a živica je syntetická živica.
16. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 použitie podľa nároku 14 alebo 15, kde sú skupiny, ktorá zahŕňa epothilóny A, B, D, E alebo 3 až 13 alebo epothilóny zvolené zo a F.

TP 6f<7'2íx>2>

Anotácia

Názov vynálezu: Spôsob izolácie a čistenia epothilónov

spôsob desorpcie epothilónov, najmä epothilónu A alebo/a spracovateľské t a epothilónov^ ktoré použitie určitých epothilónu B, zo živíc a výrobné i, čistiac procesy alebo spôsoby produkcie zahŕňajú uvedený spôsob desorpcie, ako aj rozpúšťadiel na desorpciu epothilónov zo živíc.