PL209406B1

PL209406B1 - Sposób obróbki epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z mieszaniny reakcyjnej, sposób desorpcji i sposób wyodrębniania epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z żywicy syntetycznej oraz zastosowanie rozpuszczalnika do desorpcji tych epotylonów

Info

Publication number: PL209406B1
Application number: PL361884A
Authority: PL
Inventors: Ernst Küsters; Heinz Unternährer
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2011-08-31
Also published as: JP4287650B2; GB0029895D0; IL156088A0; ZA200304296B; KR100894990B1; ATE292132T1; US6946561B2; WO2002046196A1; SK287356B6; AU2493602A; MXPA03005097A; CZ20031565A3; AU2002224936B2; US7569698B2; HUP0302579A3; NO20032591D0; HUP0302579A2; NO20032591L; DE60109814D1; CZ301664B6

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowego sposobu obróbki epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z mieszaniny reakcyjnej, sposobu desorpcji i sposobu wyodrębniania epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z żywicy syntetycznej oraz zastosowania rozpuszczalnika do desorpcji tych epotylonów.

Epotylony A i B reprezentują nową klasę cytotoksycznych substancji aktywnych stabilizujących mikrotubule (por. Gerth K. i in., J. Antibiot. 49, 560-3 (1966)) o wzorze:

w którym R oznacza atom wodoru (epotylon A) lub metyl (epotylon B).

Od czasu opisania epotylonów (patrz WO 93/10121), ujawniono szereg metod syntezy i wytwarzania zarówno epotylonów, jak przede wszystkim ich licznych pochodnych (zbiorowo nazywanych dalej „epotylonami), na przykład opisanych w WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/47584, WO 00/00485, WO 00/23452, WO 99/03848, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461, WO 99/65913, WO 98/38192, WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/21247, WO99/42602, WO 99/28324, WO 00/50423, WO 00/39276, WO 99/27890, WO 99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514, WO 99/59985, WO 00/37473, WO 98/08849, US 6,043,372, US 5,969,145, WO 99/40047, WO 99/01124 i WO 99/43653. Oprócz epotylonów A i B, interesujące własności wykazują szczególnie epotylony D i E, opisane w WO 97/19086 i WO 98/22461, oraz epotylony E i F, opisane w WO 98/22461, jak również epotylony opisane w WO 99/02514.

Jako przykład zastosowania terapeutycznego, zgłoszenie międzynarodowe WO 99/43320 opisuje kilka sposobów podawania epotylonów jako środków przeciw chorobom proliferacyjnym, zwłaszcza chorobom nowotworowym, które, ze względu na zbliżony mechanizm, działają w sposób porównywalny do Taksolu®, dobrze znanego, znajdującego się w sprzedaży leku przeciwnowotworowego. WO 99/39694 ujawnia specjalne preparaty epotylonów, zwłaszcza A i B.

Epotylony, zwłaszcza epotylon A i najkorzystniej epotylon B, w porównaniu ze znanymi, ustalonymi sposobami leczenia oferują szereg korzyści, zwłaszcza w przypadkach oporności nowotworów na terapię Taxolem. Zatem nagląca stała się potrzeba znalezienia sposobów ich otrzymywania w większych ilościach, które zaspokoiłyby wzrastające zapotrzebowanie.

Najbardziej skuteczne dotychczas znane sposoby wytwarzania obejmują co najmniej kilka etapów biosyntetycznych i wyodrębnianie epotylonów z pożywki hodowlanej lub podobnej.

Pierwotnie, w literaturze opisana została ekstrakcja związków naturalnych przy pomocy bakterii śluzowych (myxobakteria), zwłaszcza epotylonów z komórek szczepu Sorangium Cellulosum Soce90 (zdeponowanego pod numerem 6773 w Niemieckim Zbiorze Mikroorganizmów, patrz WO 93/10121). Dotychczas, w celu uzyskania zadowalającego stężenia substancji naturalnych, zwłaszcza epotylonów, do pożywki hodowlanej w celu zaabsorbowania do pożywki zawsze dodawano żywicę absorpcyjną opartą na polistyrenie, na przykład Amberlite XAD-1180 (Rohm&Haas, Frankfurt, Niemcy).

Przy prowadzeniu tego procesu na większą skalę występuje szereg problemów. Zawory ulegają uszkodzeniu przez kulki żywicy, rury mogą ulegać zatkaniu, a aparatura może podlegać większym naprężeniom wskutek tarcia mechanicznego. Kulki żywicy są porowate, w związku z czym mają większe pole powierzchni wewnętrznej (około 825 m²/g żywicy). Problemem staje się wyjaławianie, gdyż powietrze zamknięte w żywicy nie ulega odessaniu. Zatem praktycznie proces ten nie może być prowadzony na dużą skalę sposobem obejmującym dodanie żywicy w trakcie hodowli mikroorganizmów wytwarzających epotylony.

W zwią zku z tym, znaleziono i opisano w WO 99/42602 ulepszony sposób wytwarzania epotylonów, zwłaszcza epotylonów A i B. Sposób ten obejmuje kompleksowanie epotylonów z pożywki hodowlanej mikroorganizmu wytwarzającego epotylony, przy czym pożywka zawiera cyklodekstryny

PL 209 406 B1 lub inne środki tworzące kompleksy, mieszanie pozbawionej komórek pożywki hodowlanej (np. odfiltrowanej lub odwirowanej od wspomnianej pożywki hodowlanej) z żywicą syntetyczną na przykład z ż ywicą opartą na kopolimerach styren/diwinylobenzen jako matrycy, taką jak Amberlite XAD-16 (Rohm&Haas Germany GmbH, Frankfurt, Niemcy) lub Diaion HP-20 (Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Mediolan, Włochy) w celu zaabsorbowania epotylonów, oraz desorpcję, korzystnie przy użyciu alkoholu, szczególnie korzystnie izopropanolu. Następnie do fazy alkoholowej dodaje się wodę, usuwa rozpuszczalnik (korzystnie przez odparowanie), a otrzymaną pozostałość rozdziela na fazy w obecnoś ci estru, zwł aszcza octanu etylu lub octanu izopropylu, zazwyczaj stosuj ą c filtrację czą steczkową (chromatografię żelową) wysuszonej fazy estrowej, rozdziela otrzymaną mieszaninę epotylonów przez HPLC w odwróconym układzie faz (korzystnie eluując mieszaniną nitryl/woda, np. acetonitryl/woda) i ewentualnie dalej oczyszcza przez rozdzielenie faz w obecności mieszaniny woda/eter, korzystnie następującą chromatografię adsorpcyjną na żelu krzemionkowym w celu dalszego usunięcia zanieczyszczeń i krystalizację/rekrystalizację.

Mimo znaczącego postępu i wydajności odpowiedniej dla produkcji na skalę przemysłową, metoda ta w dalszym ciągu posiada pewne niedogodności.

Na przykład, w celu uzyskania wystarczającej czystości, zalecane jest wykorzystanie albo filtracji cząsteczkowej albo chromatografii adsorpcyjnej na żelu krzemionkowym, albo obydwu. Większe trudności wynikają obecnie z rozdzielania faz w obecności estru, takiego jak octan etylu, co (zwłaszcza w wyniku długiego czasu rozdziału faz woda/ester w procesie na skalę przemysłową) jest bardzo czasochłonne, jak również z powodu następującego potem odparowania, które w dodatku jest trudne do przeprowadzenia z powodu pienienia się i rozpylania.

Problemy, których rozwiązanie stawia przed sobą obecny wynalazek, to uniknięcie możliwie wielu powyższych trudności i znalezienie nowych, korzystnych dróg wyodrębniania epotylonów, zwłaszcza epotylonów A i B, po ich adsorpcji na żywicy.

Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że zwykłe zastąpienie alkoholi stosowanych jako rozpuszczalniki desorbujące przez pewne inne rozpuszczalniki (nazywane rozpuszczalnikami słabo polarnymi lub niepolarnymi, zgodnie z dalszą specyfikacją) stanowi przełom, umożliwiający rozwiązanie problemów wymienionych powyżej, prowadząc do dodatkowych korzyści, takich jak lepsza desorpcja i wyż sza wydajność końcowa. Do dodatkowych korzyś ci należą: (i) zwię kszenie selektywnoś ci desorpcji;

(ii) większa ilość desorbowanych epotylonów, oznaczająca pełniejszą desorpcję;

(iii) uniknięcie ponownej ekstrakcji estrem (np. octanem etylu) z wysoce kłopotliwym rozdziałem faz woda/ester i brak konieczności następującego odparowania eteru;

(iv) uniknięcie konieczności filtracji cząsteczkowej i zazwyczaj chromatografii absorpcyjnej; (v) znaczne skrócenie czasu potrzebnego do desorpcji; (vi) zmniejszenie ilości etapów reakcji; (vii) zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia (ważne w przypadku silnie toksycznych epotylonów); (viii) wygodniejsze i bezpieczniejsze manipulowanie (w zależności od rozpuszczalnika stosowanego do desorpcji = ekstrakcji); i (ix) również zależne od rozpuszczalnika nieoczekiwanie niższe ilości produktów ubocznych lub zanieczyszczeń o polarności zbliżonej do epotylonów, zwłaszcza do epotylonu B, koniecznych do usunięcia po chromatografii w odwróconym układzie faz.

Wynalazek dotyczy sposobu obróbki epotylonów, zwłaszcza po ich otrzymaniu w typowym środowisku reakcji chemicznej lub korzystnie w pożywce hodowlanej zawierającej mikroorganizmy, zwłaszcza bakterie śluzowe (myxobakteria), w szczególności rodzaju Sorangium, które są odpowiednie do wytwarzania epotylonów, zwłaszcza epotylonu A i/lub B oraz składnika tworzącego kompleks, który to sposób obejmuje zastosowanie do desorpcji wymienionych epotylonów z żywicy rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego.

Sposób obróbki epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z mieszaniny reakcyjnej, według wynalazku polega na tym, że obejmuje

- desorpcję epotylonów za pomocą rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego wybranego z grupy składającej się z halogenków niższych alkili oraz rozpuszczalników aromatycznych, wybranych z grupy składającej się z benzenu, benzenu podstawionego przez jedną lub więcej reszt wybranych z grupy składającej się z niższego alkilu, niższego alkoksylu, fluorowca, grupy nitrowej i niż szego alkilu podstawionego przez niż szy alkoksyl, lub za pomocą mieszaniny tych rozpuszczalników, korzystnie od 2 do 4, gdzie przedrostek „niższy oznacza rodnik zawierający do 7 atomów węgla, przy czym etap desorpcji może być powtarzany w celu uzyskania desorpcji zbliżonej do całkowitej;

PL 209 406 B1

- usunięcie z otrzymanych roztworów rozpuszczalnika stosowanego do desorpcji przez odparowanie;

- ewentualnie krystalizację epotylonu(ów) po desorpcji; przy czym w szczególnoś ci przy krystalizacji epotylonu B dodawanie mieszaniny alkoholu i węglowodoru, korzystnie niższego alkanolu i cyklicznego węglowodoru alifatycznego zawierającego od 3 do 10 atomów w pierścieniu, oraz odparowanie fazy alkoholowej do sucha, oraz krystalizację epotylonu B z odpowiedniej mieszaniny rozpuszczalników;

- rozdzielenie epotylonów przez chromatografię w układzie odwróconych faz po rozprowadzeniu pozostałości z poprzedniego etapu w odpowiednim rozpuszczalniku, i eluowanie za pomocą mieszaniny nitrylu i wody, korzystnie acetonitrylu i wody, następnie usunięcie przez odparowanie nitrylu z zebranych frakcji zawierających epotylon; i ekstrakcję pozostałej wody z epotylonem przy użyciu estru, zwłaszcza niższego alkanianu niższego alkilu, korzystnie octanu izopropylu, a następnie odparowanie do sucha fazy estrowej zawierającej epotylon;

- ewentualnie dalsze oczyszczanie metodą chromatografii adsorpcyjnej;

- końcową rekrystalizacj ę oczyszczonych epotylonów z odpowiednich rozpuszczalników lub mieszanin rozpuszczalników;

w którym, w razie konieczności i/lub potrzeby, pomiędzy każ dym z realizowanych etapów, otrzymane roztwory lub zawiesiny zatęża się, i/lub składniki ciekłe i stałe oddziela się od siebie.

Korzystnie w sposobie według wynalazku po desorpcji epotylonów z żywicy za pomocą rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego, rozpuszczalnik usuwa się tak długo jak to konieczne, korzystnie aż do uzyskania suchej pozostałości, przy czym w razie potrzeby pozostałości rozprowadza się w stosunkowo małej objętości mieszaniny alkoholu i węglowodoru, korzystnie niższego alkanolu i cyklicznego wę glowodoru alifatycznego zawierają cego od 3 do 10 atomów wę gla w pierś cieniu; faz ę alkoholową odparowuje się, korzystnie do sucha, a ekstrakt alkoholowy krystalizuje się z mieszaniny alkoholu i węglowodoru, otrzymany stały krystaliczny produkt rozpuszcza się następnie w mieszaninie nitrylu i wody, korzystnie acetonitrylu i wody, w stosunku objętościowym 2 do 3, a otrzymany roztwór zasilający podaje się, w razie konieczności, po podzieleniu na więcej niż jeden przebieg, na kolumnę preparatywną z układem odwróconych faz; następnie eluuje się mieszaniną nitrylu i wody; potem usuwa się nitryl z otrzymanych frakcji zawierających epotylon przez odparowanie, a otrzymaną fazę wodną ekstrahuje się estrem, po czym ekstrakt estrowy odparowuje się i następnie otrzymany produkt poddaje rekrystalizacji.

Korzystnie sposób według wynalazku realizuje się poprzez rozdział epotylonów A i B metodą chromatografii w symulowanym złożu ruchomym (SMB).

Przedmiotem wynalazku jest również sposób desorpcji epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z żywicy syntetycznej opartej na kopolimerach styren/diwinylobenzen, który charakteryzuje sie tym, że stosuje się rozpuszczalnik słabo polarny lub niepolarny wybrany z grupy składającej się z halogenków niższych alkili oraz rozpuszczalników aromatycznych, wybranych z grupy składającej się z benzenu, benzenu podstawionego przez jedną lub więcej reszt wybranych z grupy składającej się z niższego alkilu, niższego alkoksylu, fluorowca, grupy nitrowej i niższego alkilu podstawionego przez niższy alkoksyl, lub mieszaninę tych rozpuszczalników, korzystnie od 2 do 4, gdzie przedrostek „niższy oznacza rodnik zawierający do 7 atomów węgla.

Korzystnie desorpcji z żywicy podlegają epotylon A i/lub epotylon B.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wyodrębniania epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z ż ywicy syntetycznej opartej na kopolimerach styren/diwinylobenzen, charakteryzuj ą cy się tym, ż e obejmuje:

(i) desorpcję epotylonów z żywicy syntetycznej opartej na kopolimerach styren/diwinylobenzen za pomocą rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego wybranego z grupy składającej się z halogenków niż szych alkili oraz rozpuszczalników aromatycznych, wybranych z grupy skł adającej się z benzenu, benzenu podstawionego przez jedną lub więcej reszt wybranych z grupy składającej się z niższego alkilu, niższego alkoksylu, fluorowca, grupy nitrowej i niższego alkilu podstawionego przez niższy alkoksyl; lub mieszaniny dwóch lub więcej tych rozpuszczalników, korzystnie od 2 do 4, gdzie przedrostek „niższy oznacza rodnik zawierający do 7 atomów węgla.

(ii) rozdzielenie epotylonów metodą chromatografii w układzie odwróconych faz po rozprowadzeniu w odpowiednim rozpuszczalniku i eluowaniu mieszaniną nitrylu i wody, korzystnie acetonitrylu i wody.

PL 209 406 B1

Korzystnie w powyższym sposobie rozdzielenia epotylonów A i B dokonuje się metodą chromatografii w symulowanym złożu ruchomym (SMB).

Wynalazkiem jest również zastosowanie do desorpcji epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z żywicy syntetycznej opartej na kopolimerach styren/diwinylobenzen, rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego wybranego z grupy składającej się z halogenków niższych alkili oraz rozpuszczalników aromatycznych, wybranych z grupy składającej się z benzenu, benzenu podstawionego przez jedną lub więcej reszt wybranych z grupy składającej się z niższego alkilu niższego alkoksylu, fluorowca, grupy nitrowej i niższego alkilu podstawionego przez niższy alkoksyl; lub mieszaniny tych rozpuszczalników, korzystnie od 2 do 4 tych rozpuszczalników, gdzie przedrostek „niższy oznacza rodnik zawierający do 7 atomów węgla.

Terminy ogólne stosowane powyżej i w dalszym opisie korzystnie mają następujące znaczenie:

Określenie „epotylony korzystnie odnosi się do dowolnego epotylonu lub pochodnej epotylonu wymienionej w zgłoszeniach patentowych WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/47584, WO 00/00485, WO 00/23452, WO 99/03848, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461, WO 99/65913, WO 98/38192, WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/21247, WO99/42602, WO 99/28324, WO 00/50423, WO 00/39276, WO 99/27890, WO 99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514, WO 99/59985, WO 00/37473, WO 98/08849, US 6,043,372, US 5,969,145, WO 99/40047, WO 99/01124 i WO 99/43653, bardziej korzystnie do epotylonu A, a zwłaszcza epotylonu B, ale w szerszym aspekcie wynalazku także do epotylonów D i E, opisanych w WO 97/19086 i WO 98/22461, epotylonów E i F, opisanych w WO 98/22461, jak również epotylonów opisanych w WO 99/02514. Wszystkie te dokumenty, zwłaszcza w odniesieniu do pochodnych epotylonu i korzystnych pochodnych epotylonów tutaj wymienionych, są niniejszym włączone jako odnośniki.

Rozpuszczalnik słabo polarny lub niepolarny korzystnie posiada następującą charakterystykę:

Korzystny rozpuszczalnik stanowi ten, który w rzędzie eluotropowym oznaczonym zgodnie z pracą Snyder i współ pracowników, J. Chromatogr.Sci. 16,223 (1978), wykazuje nastę pują c ą charakterystykę, gdzie xe oznacza parametr akceptora protonów (wskaźnik tendencji do tworzenia wiązania wodorowego w charakterze akceptora wodoru), Xd oznacza parametr donora protonów (wskaźnik tendencji do tworzenia wiązania wodorowego w charakterze donora wodoru), a xn oznacza parametr dipolowy (wskazujący na charakter dipolowy), przy założeniu, że xe + xd + xn =1, lub mieszanina takich rozpuszczalników:

xe =0,20-0,40; xd =0,15-0,36; i xn =0,38-0,60; korzystnie xe =0,22-0,32; xd =0,17-0,34; i xn =0,39-0,54.

Bardzo korzystne wśród rozpuszczalników słabo polarnych i niepolarnych są dichlorek metylenu (=chlorek metylenu) lub dichlorek etylenu; lub szczególnie korzystnie rozpuszczalniki aromatyczne, szczególnie benzen, benzen podstawiony przez jedną lub więcej, korzystnie jedną do trzech reszt wybranych z grupy składającej się z niższych alkili, zwłaszcza metylu, etylu lub izopropylu, niższych alkoksyli, zwłaszcza metoksylu lub etoksylu, fluorowców, zwłaszcza fluoru, chloru, bromu lub jodu, grupy nitrowej i niższych alkoksylo-niższych alkili, zwłaszcza etoksymetylu, szczególnie toluenu, etylobenzenu, ksylenu, zwłaszcza o-, m-, lub p-ksylenu, mezytylenu, pseudokumenu, hemellitenu, kumenu, izopropylotoluenu, halogenków fenylowych, zwłaszcza fluorobenzenu, chlorobenzenu, bromobenzenu lub jodobenzenu, niższych alkoksybenzenów, zwłaszcza etoksybenzenu lub metoksybenzenu, lub niższych alkoksylo-niższych alkilobenzenów, zwłaszcza etoksymetylobenzenu (eteru benzylowego); lub dowolnej mieszaniny dwu lub więcej z nich, na przykład 2 do 4 z tych rozpuszczalników; najbardziej korzystne są niższe alkilobenzeny, zwłaszcza etylobenzeny, ksylen, szczególnie o-, m- lub p-ksylen, mezytylen, pseudokumen, hemelliten, kumen, izopropylotoluen, a najkorzystniej toluen.

Określenie rozpuszczalnik słabo polarny lub niepolarny obejmuje także mieszaniny dwu lub więcej rozpuszczalników opisanych powyżej i poniżej, na przykład 2 do 4 takich rozpuszczalników.

Przedrostek „niższy alkil zawsze wskazuje, że odpowiednio nazwany rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla, szczególnie do 4 atomów węgla, i jest rozgałęziony lub prostołańcuchowy. Niższy alkil może być na przykład nierozgałęziony lub rozgałęziony jednokrotnie lub więcej, i stanowi np. metyl, etyl, propyl, taki jak izopropyl lub n-propyl, butyl, taki jak izobutyl, sec-butyl, tert-butyl lub n-butyl, lub także pentyl, taki jak amyl lub n-pentyl.

Fluorowiec korzystnie stanowi jod, brom, chlor lub fluor.

Węglowodór korzystnie stanowi związek organiczny posiadający 4 do 32, bardziej korzystnie 4 do 20, jeszcze bardziej korzystnie 6 do 16 atomów węgla i może stanowić alifatyczny, np. liniowy,

PL 209 406 B1 rozgałęziony lub cykliczny nasycony alkan, np. cykloheksan, liniowym rozgałęziony lub cykliczny (niearomatyczny) związek organiczny z jednym lub więcej wiązaniem podwójnym i/lub potrójnym, lub węglowodór aromatyczny, ten ostatni nie podstawiony lub podstawiony przez jeden lub więcej, np. do trzech, podstawników wybranych z grupy składającej się z niższego alkilu, zwłaszcza metylu, etylu lub izopropylu, niższego alkoksylu, zwłaszcza metoksylu lub etoksylu, fluorowca, zwłaszcza fluoru, chloru, bromu lub jodu, nitro i niższych alkoksylo-niższych alkili, zwłaszcza etoksymetylu, korzystnie przez jedną do trzech reszt niższego alkilu.

Alkohol korzystnie stanowi hydroksy-niższy alkan, zwłaszcza metanol, etanol lub n- lub izo-propanol.

Żywicę korzystnie stanowi żywica syntetyczna, zwłaszcza żywica oparta na kopolimerach styrenu i diwinylobenzenu, bardziej korzystnie Amberlite XAD-4 lub korzystnie Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] lub Diaion HP-20 [Resindlon S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Mediolan]. Nie wymaga komentarza, że żywica, z której ma być desorbowany epotylon lub epotylony zgodnie z wynalazkiem, ma epotylony związane z nią nie kowalencyjnie (np. związane odwracalnie lub zaadsorbowane). Innymi słowy, kiedy stosuje się określenie „żywica, ma ono oznaczać „żywicę posiadającą jeden lub więcej epotylonów pozostających z nią w kontakcie, zwłaszcza związanych odwracalnie lub zaadsorbowanych.

Po przeprowadzeniu desorpcji epotylonów z żywicy w rozpuszczalniku słabo polarnym lub niepolarnym jak opisano powyżej, można prowadzić dalsze dowolne etapy oczyszczania konieczne lub potrzebne do uzyskania odpowiednich epotylonów w czystej postaci.

Obróbkę epotylonów poprzedza reakcja lub proces prowadzący do produktu reakcji zawierającego epotylony poddawane obróbce, które wyodrębnia się (i) albo z mieszanin po reakcji chemicznej po rozpuszczeniu w odpowiednim uwodnionym rozpuszczalniku niepolarnym, lub (ii) bardziej korzystnie z nadsączu (na przykład zawierającego cyklodekstryny, jak opisano w WO 99/42602) lub z pożywki hodowlanej mikroorganizmów produkujących epotylony, przez rozdzielenie hodowli na fazę ciekłą (np. roztwór po odwirowaniu lub filtrat) i fazę stałą (komórki), szczególnie przy użyciu filtracji lub odwirowania (wirówka rurowa lub separator).

Te czynności wstępne kontynuuje się, mieszając bezpośrednio roztwór ((i)) lub fazę ciekłą ((ii)) z żywicą zwłaszcza z żywicą syntetyczną, szczególnie z żywicą opartą na kopolimerach styrenu i diwinylobenzenu jako matrycy (dalej określanej także po prostu jako żywica polistyrenowa), taką jak Amberlite XAD-16 lub Diaion HP-20 (korzystnie w stosunku objętościowym roztworu po odwirowaniu do żywicy ok. 10:1 do 100:1, korzystnie około 50:1). Po okresie kontaktu, korzystnie 0,25 do 50 godzin, zwłaszcza 0,8 do 22 godzin, żywicę oddziela się, na przykład przez filtrację, sedymentację lub odwirowanie. W razie potrzeby żywicę po adsorpcji przemywa się silnie polarnym rozpuszczalnikiem, korzystnie wodą

Wówczas rozpoczyna się korzystny sposób obróbki zgodnie z wynalazkiem: desorpcję epotylonów (tworzącą bardzo korzystny aspekt wynalazku per se) prowadzi się przy użyciu rozpuszczalników słabo polarnych lub niepolarnych, zwłaszcza niższych halogenków alkilowych, szczególnie dichlorku metylenu lub dichlorku etylenu, lub bardziej korzystnie rozpuszczalników aromatycznych, wybranych z grupy składającej się z benzenu, benzenu podstawionego przez jedną lub więcej, korzystnie jedną do trzech reszt wybranych spośród grup składających się z niższych alkili, zwłaszcza metylu, etylu lub izopropylu, niższych alkoksyli, zwłaszcza metoksylu lub etoksylu, fluorowców, zwłaszcza fluoru, chloru, bromu lub jodu, grupy nitrowej lub niższych alkoksylo-niższych alkili, zwłaszcza etoksymetylu, najbardziej korzystnie toluenu. Etap ekstrakcji w celu osiągnięcia, w razie potrzeby lub konieczności, bardziej całkowitej desorpcji, można powtarzać jeden lub więcej razy, korzystnie 0 do 3 razy, zwłaszcza raz.

Obróbkę (w przypadku połączenia powtórnych ekstrakcji) tak otrzymanych roztworów zdesorbowanych epotylonów kontynuuje się, usuwając rozpuszczalnik stosowany do desorpcji z otrzymanych roztworów przez odparowanie (destylację), korzystnie przez zatężenie w reaktorze i następnie w wyparce obrotowej pod próż nią .

Następnie ma miejsce dalsze postępowanie z realizowaniem następujących etapów, spośród których etap oczyszczania metodą chromatografii w odwróconym układzie faz z elucją za pomocą nitrylu jest obowiązkowy, podczas gdy inne etapy są fakultatywne:

- etap krystalizacji epotylonu(ów) po desorpcji; w szczególności przy krystalizacji epotylonu B dodaje się mieszaninę alkoholu i węglowodoru, zwłaszcza niższego alkanolu i cyklicznego węglowodoru alifatycznego zawierającego 3 do 10 atomów w pierścieniu, najbardziej korzystnie metanolu

PL 209 406 B1 i cykloheksanu (korzystnie w stosunku obję toś ciowym 1:10 do 10:1, zwł aszcza od 1:3 do 3:1). Dodanie wody powoduje szybkie rozdzielenie faz, fazę alkoholową odparowuje się do sucha, np. przy użyciu wyparki obrotowej pod próżnią. Otrzymany ekstrakt zawierający epotylon B krystalizuje się następnie z odpowiedniej mieszaniny rozpuszczalników, najbardziej korzystnie izopropanol/cykloheksan, korzystnie w stosunku objętościowym 1.10 do 10:1, korzystniej 1:6 do 6:1, jeszcze korzystniej 1:6 do 1:4;

- etap (obowią zkowy) rozdzielenia epotylonów przez chromatografię w odwróconym ukł adzie faz po rozprowadzeniu w odpowiednim rozpuszczalniku, zwłaszcza w mieszaninie nitrylu i wody, korzystnie acetonitryl/woda, w korzystnym stosunku objętościowym 1:10 do 10:1, zwłaszcza 1:3 do 1:1, i eluowanie mieszanin ą nitrylu i wody, korzystnie charakteryzują cy się tym, ż e chromatografię prowadzi się na kolumnie z wypełnieniem do faz odwróconych, ze związanymi łańcuchami węglowodorowymi, takimi jak łańcuchy węglowodorowe zawierające 18 łańcuchów węgla, szczególnie z wypełnieniem RP-18, i stosuje się eluent zawierający nitryl, zwłaszcza niższy alkilonitryl, szczególnie acetonitryl, w szczególności mieszaninę nitryl/woda, zwłaszcza mieszaninę acetonitryl/woda, korzystnie w stosunku obję toś ciowym nitrylu do wody około 1:99 do 99:1, przede wszystkim pomię dzy 1:9 do 9:1, np. pomiędzy 2:8 i 7:3, np. 3:7 lub 4:6; i usunięcie nitrylu z zebranych frakcji zawierających epotylon (zwłaszcza epotylon A lub w szczególności epotylon B) przez odparowanie (destylację); w razie konieczności pozostałą wodę z epotylonem ekstrahuje się następnie estrem, zwłaszcza niższym estrem niższego alkilu, korzystnie octanem izopropylu, z następnym odparowaniem do sucha fazy estrowej zawierającej epotylon (korzystnie najpierw w reaktorze, następnie w wyparce obrotowej pod próżnią); (w razie potrzeby, wyjściowy roztwór epotylonu może być podzielony i rozdzielany w więcej niż jednym cyklu rozdziału w odwróconym układzie faz);

- tylko w razie potrzeby (np. jako alternatywa dla krystalizacji po desorpcji), etap chromatografii adsorpcyjnej, zwłaszcza przez naniesienie na kolumnę z żelem krzemionkowym i eluowanie odpowiednim rozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalników, zwłaszcza mieszaniną ester/węglowodór, na przykład alkanian niższego alkilu/C4-C10-alkan, zwłaszcza octan etylu lub izopropylu n-heksan, w którym stosunek estru do węglowodoru korzystnie mieści się w zakresie 99:1 do 1:99, korzystnie 10:1 do 1:10, na przykład 4:1;

- i etap koń cowej rekrystalizacji, np. z odpowiednich rozpuszczalników lub mieszanin rozpuszczalników, na przykład składających się z estrów, mieszanin ester/węglowodór lub alkoholi, zwłaszcza octan etylu lub izopropylu/toluen, w którym stosunek estru do toluenu korzystnie mieści się w zakresie 1:10 do 10:1, korzystnie 2:3 (epotylon A) lub metanolu bądź octanu etylu (epotylon B);

w którym to sposobie, w razie koniecznoś ci lub potrzeby, pomię dzy każ dym ze stosowanych etapów otrzymane roztwory lub zawiesiny zatęża się, i/lub składniki ciekłe i stałe oddziela się od siebie, w szczególności przez sedymentację, filtrację lub odwirowanie roztworów/zawiesin. W powyższych poszczególnych operacjach mogą być korzystnie stosowane bardziej precyzyjne definicje przedstawione powyżej lub poniżej.

Korzystny aspekt wynalazku odnosi się także do sposobu wyodrębniania epotylonów, zwłaszcza epotylonu A lub w szczególności epotylonu B, zaadsorbowanych na żywicy syntetycznej, który to proces obejmuje (i) desorpcję epotylonów ze wspomnianej żywicy syntetycznej za pomocą rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego, zwłaszcza halogenków niższych alkili, w szczególności dichlorku metylenu lub dichlorku etylenu, lub bardziej korzystnie rozpuszczalników aromatycznych, wybranych z grupy składającej się z benzenu, benzenu podstawionego przez jedną lub więcej, korzystnie jedną do trzech reszt wybranych z grupy składającej się z niższego alkilu, zwłaszcza metylu, etylu lub izopropylu, niższego alkoksylu, zwłaszcza metoksylu lub etoksylu, fluorowca, zwłaszcza fluoru, chloru, bromu lub jodu, grupy nitrowej i niższego alkoksylo-niższego alkilu, zwłaszcza etoksymetylu; najbardziej korzystnie toluenu; lub w szerszym aspekcie wynalazku mieszaniny dwu lub więcej rozpuszczalników; oraz (ii) rozdzielenie epotylonów metodą chromatografii w odwróconym układzie faz po rozprowadzeniu w odpowiednim rozpuszczalniku, zwłaszcza w mieszaninie nitrylu i wody, korzystnie acetonitrylu/wody, w korzystnym stosunku objętościowym 1:10 do 10:1, zwłaszcza 1:3 do 1:1, i eluowanie mieszaniną nitrylu lub wody, korzystnie charakteryzujące się tym, że chromatografię prowadzi się na kolumnie do faz odwróconych, zwłaszcza z wypełnieniem RP-18, ze związanymi łańcuchami węglowodorowymi, takimi jak łańcuchy węglowodorowe zawierające 18 atomów węgla, i stosuje się eluent składający się z nitrylu, zwłaszcza z niższego alkilonitrylu, w szczególności acetonitrylu, w szczegól8

PL 209 406 B1 ności mieszaninę acetonitryl/woda, korzystnie w stosunku nitrylu do wody około 1:99 do 99:1, przede wszystkim pomiędzy 1:9 a 9:1, np. pomiędzy 2:8 a 7:3, np. 3:7 lub 4:6.

Po przeprowadzeniu procesu z ostatniego punktu zaczynającego się od etapu (i) i obejmującego etap (ii) można prowadzić dowolne kolejne etapy oczyszczania konieczne lub wymagane do otrzymania odpowiednich epotylonów w czystej postaci.

Przygotowanie do obróbki korzystnie prowadzi się w sposób następujący: adsorpcji epotylonów, zwłaszcza z mieszaniny po reakcji chemicznej lub bardziej korzystnie z nadsączu pożywki mikroorganizmów, można dokonać zgodnie z opisem w WO 99/42602 lub analogicznie do niego; po prostu epotylony znajdują się w płynie po odwirowaniu, który następnie miesza się bezpośrednio z żywicą syntetyczną, zwłaszcza żywicą kopolimeru styren/diwinylobenzen, taką jak Amberlite XAD-16 lub Diaion HP-20 (korzystnie w stosunku objętościowym płynu po odwirowaniu do żywicy około 10:1 do 100:1, korzystnie około 50:1) i miesza się w mieszalniku. W etapie tym epotylony ulegają adsorpcji na żywicy. Po czasie wystarczającym do adsorpcji, na przykład po około 0,2 do 10 godzin, żywicę oddziela się przez odwirowanie lub filtrację. Adsorpcji epotylonów na żywicy można także dokonać na kolumnie chromatograficznej, umieszczając żywicę w kolumnie i przepuszczając przez nią płyn po odwirowaniu. Po adsorpcji żywicę przemywa się wodą.

Następnie zaczyna się proces według wynalazku, który przebiega następująco: desorpcji epotylonów z żywicy dokonuje się przy pomocy rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego według wynalazku, zwłaszcza opisanego jako korzystny powyżej lub poniżej, szczególnie chlorku metylenu lub szczególnie korzystnie toluenu. Rozpuszczalnik usuwa się wówczas tak długo, jak to konieczne, korzystnie aż do uzyskania suchej pozostałości. W razie potrzeby, pozostałość rozprowadza się w mieszaninie alkohol/wę glowodór, zwł aszcza metanol/cykloheksan, korzystnie w stosunku obję tościowym opisanym powyżej, w stosunkowo małej objętości. Fazę alkoholową odparowuje się, korzystnie do sucha, a następnie ekstrakt alkoholowy krystalizuje z mieszaniny alkoholu, zwłaszcza izopropanolu z węglowodorem, zwłaszcza cykloheksanem, korzystnie w proporcjach opisanych powyżej. Otrzymany stały krystaliczny produkt rozpuszcza się wówczas w mieszaninie nitryl/woda, korzystnie jak opisano powyżej, szczególnie w mieszaninie acetonitryl/woda w stosunku objętościowym 2:3 i otrzymany roztwór zasilają cy podaje się , w razie potrzeby po rozdzieleniu w jednym lub więcej cyklach, na kolumnę preparatywną do odwróconego układu faz. Następuje eluowanie mieszaniną nitryl/woda, zwłaszcza tą wymienioną powyżej. Acetonitryl z uzyskanych frakcji zawierających epotylon, zwłaszcza epotylon A, a szczególnie epotylon B, usuwa się przez odparowanie (oddestylowanie), a otrzymaną fazę wodną ekstrahuje się estrem, zwłaszcza octanem etylu. Ekstrakt estrowy odparowuje się, korzystnie do sucha, a następnie otrzymany produkt rekrystalizuje, na przykład frakcje epotylonu A rekrystalizuje się bezpośrednio z mieszaniny ester/węglowodór, np. octan etylu : toluen = 2:3, a frakcje epotylonu B z estru, zwł aszcza z octanu etylu lub korzystnie z alkoholu, zwł aszcza metanolu.

Okazało się, że szczególnie selektywny eluent (desorbent) stanowi toluen, który umożliwia uzyskanie około 100%-owej wydajności przy połowie czasu desorpcji potrzebnego w przypadku izopropanolu, stosowanego w WO 99/42602. Ilość desorbowanych epotylonów nieoczekiwanie wzrasta po desorpcji toluenem na przykład do 130% w porównaniu z desorpcją izopropanolem. (Jakkolwiek wydaje się to na pierwszy rzut oka niemożliwe z teoretycznego punktu widzenia, dobrze ilustruje główną zaletę obecnego wynalazku: rezultat jest podany w odniesieniu do wyników oznaczenia dla obciążonej żywicy. Ponieważ w oznaczeniu tym do desorpcji wykorzystuje się izopropanol, jako podstawę obliczeń trzeba było przyjąć niepełny proces desorpcji, pierwotnie prowadzący do niższych wartości oznaczenia, co obecnie okazało się mylące). Mieszaninę epotylonów można (bez lub z dalszym poddaniem krystalizacji) podawać bezpośrednio na kolumnę do faz odwróconych. Proces okazuje się bardzo silny, biorąc pod uwagę ilości rozpuszczalników, szybkości mieszania i temperatury. Podczas gdy w przypadku alkoholi (np. etanolu lub izopropanolu) podczas mieszania obserwuje się desorpcję dwufazową, gdzie pierwsza część produktu zawierającego epotylon ulega desorpcji w pierwszym okresie (można to wytłumaczyć rozkładem wielkości porów występującym w polistyrenie XAD-16, który to rozkład ma dwa maksima), a druga część po dalszym okresie, tego niekorzystnego zjawiska nie obserwuje się w przypadku toluenu ani dichlorometanu, gdzie cały produkt ulega desorpcji od razu w pierwszym okresie. W porównywalnych warunkach, pozostałość po odparowaniu dla epotylonów A i B w jednym przykł adzie w przypadku izopropanolu wynosi 40 g, dla chlorku metylenu 3,3 g, w przypadku toluenu tylko 0,9 g, przy ok. 17-18% wag. epotylonu B po desorpcji z ż ywic kopolimerów styren/diwinylobenzen otrzymanych z nadsączu kultury zawierającej cyklodekstrynę, jak to opisano w WO 99/42602, co wskazuje na znacznie większą czystość. Podczas gdy najbardziej znaczące koPL 209 406 B1 rzyści wykazuje toluen, dichlorometan posiada jedną zaletę, polegającą na łatwości usuwania, ze względu na niską temperaturę wrzenia.

Epotylon A można oddzielić od epotylonu B także metodą chromatografii opisaną niniejszym w wariancie symulowanego złoża ruchomego (SMB). Chromatografia SMB jest szeroko stosowana do rozdzielania mieszanin dwuskładnikowych, np. mieszanin racemicznych na chiralnych fazach stacjonarnych, np. procesy SORBEX w przemyśle petrochemicznym, jak Parex lub Molex, lub SAREX w przemyśle cukrowniczym. W porównaniu z chromatografią periodyczną chromatografia SMB posiada zaletę wynikającą z przeciwprądowej ciągłej operacji jednostkowej, która prowadzi do zwiększenia wydajności i zmniejszenia zużycia fazy ruchomej. Znany jest szereg systematycznych procedur rozwinięcia metody chromatografii SMB. Procedury takie opisane są np. przez R.M. Nicoud, M. Bailly, J. Kinkel, R.M Devant, T.R.E. Hampe i E.Kiisters w Proceedings of the 1^st European Meeting on Simulated Moving Bed Chromatography, (1993), ISBN 2-905-267-21-6, str. 65-88; E.Kiisters, G.Gerber i F.D.Antia, Chromatographia, 40 (1995) 387; T.Proll i E.Kiisters, J. Chromatogr.A, 800 (1998) 135; lub C.Heuer, E.Kiisters, T.Plattner i A.Seidel-Morgenstern, J.Chromatogr.A, 827 (1998), 175. Podstawowe parametry rozdziału epotylonów A i B za pomocą chromatografii SMB można zaczerpnąć bezpośrednio z konwencjonalnego rozdziału metodą chromatografii cieczowej (LC). Korzystnie, jako fazę stacjonarną stosuje się żel krzemionkowy do faz odwróconych (RP 18), a jako fazę ruchomą mieszaniny woda/acetonitryl. Ostateczne ustalenie szybkości przepływu (dla poszczególnych stref przepływu opracowanym przez E.Kiisters i współpr. w J.Chromatogr.A (1995) 387 lub po ostrożnym obliczeniu izoterm absorbcji wyprowadzonych w J.Chromatogr.A, 800 (1998) 135 i J.Chromatogr.A, 827 (1998) 175. Strumienie ekstraktu i rafinatu można przerabiać zgodnie z opisem dla konwencjonalnej LC.

Wynalazek najbardziej korzystnie odnosi się do procesów i metod opisanych w następujących przykładach.

P r z y k ł a d y:

Następujące przykłady służą ilustracji wynalazku.

Ostrzeżenie: przy manipulowaniu epotylonami należy zachować wszelkie możliwe środki ostrożności ze względu na ich toksyczność.

P r z y k ł a d 1. Procedura obróbki dla epotylonu B

Desorpcji 591,7 kg obciążonej żywicy (żywica kopolimeru styren/diwinylobenzen XAD-16 obciążona epotylonami A i B z pożywki hodowlanej) dokonano mieszając żywicę w dwu porcjach z 720 l toluenu każda, w czterech częściach przez około 8 godzin. Fazę toluenową oddzielono od żywicy stosując filtr próżniowy. Połączone fazy toluenowe przemyto w dwu porcjach, po 250 ml wody każda. Po rozdzieleniu faz ekstrakt toluenowy zatężono w 1000-litrowym reaktorze do około 20-40 litrów, po czym zatężano do sucha w wyparce obrotowej pod próżnią. Otrzymano 4,095 kg ekstraktu toluenu zawierającego 209 g epotylonu B. Ekstrakt toluenowy rozpuszczono w 16,5 l metanolu i 24,5 l cykloheksanu. Po dodaniu 0,8 l wody natychmiast nastąpiło rozdzielenie faz. Frakcję metanolową odparowano do sucha w suszarce obrotowej pod próżnią uzyskując 1,025 kg pozostałości, zawierającej 194 g epotylonu B. Następnie ekstrakt metanolowy krystalizowano w mieszaninie rozpuszczalników składającej się z 2,05 l izopropanolu i 10,25 l cykloheksanu, otrzymując 0,4 kg krystalicznego produktu zawierającego 184 g epotylonu B. Kryształy rozpuszczono w 3,2 l mieszaniny acetonitryl/woda = 2:3 (obj/obj) i otrzymany roztwór zasilający przeniesiono w trzech odrębnych cyklach na kolumnę preparatywną do faz odwróconych (25 kg kulistego żelu krzemionkowego RP-18, YMC-Gel ODS-A 120; 5-15 μm.; Waters Corp., Milford, Massachusettes, USA). Eluowano stosując acetonitryl/wodę jako fazę ruchomą z szybkością przepływu 2,3 l/min; czas retencji epotylonu A=77-96 min, czas retencji epotylonu B = 96-119 min. Rozdział kontrolowano za pomocą detektora UV przy 250 nm. Acetonitryl z połączonych frakcji epotylonu B (z trzech przebiegów) oddestylowano a pozostałą fazę wodną ekstrahowano 504 l octanu izopropylu. Ekstrakt octanu izopropylu zatężono w reaktorze o pojemności 630 l do około 20-40 l, a następnie zatężono do sucha w wyparce próżniowej pod próżnią. Masa odparowanej pozostałości frakcji epotylonu B wynosiła 170 g, a zawartość 98,4% według HPLC (wzorzec zewnętrzny). Otrzymany produkt krystalizowano na koniec w 2,89 l metanolu w temp. 0-5°C, uzyskując 150 g czystego krystalicznego epotylonu B.

Temp. topn. 124-125°C.

PL 209 406 B1

Dane ¹H-NMR dla epotylonu B (500 MHz-NMR, rozpuszczalnik: DMSO-d6; przesunięcia chemiczne δ w ppm w odniesieniu do TMS. S= singlet, d=dublet, m.= multiplet):

δ (wielokrotność)

7,34 (s)

6,50 (s)

5,28 (d)

5,08 (d)

4,46 (d)

4,08 (m)

3,47 (m)

3,11 (m)

2,83 (dd)

2,64 (s)

2,36 (m)

2,09 (s)

2,04 (m)

1,83 (m)

1,61 (m)

1,47-1,24 (m)

1,18 (s)

1,13 (m)

1,06 (d)

0,89 (d+s, nakładające się) Σ liczba całkowita (ilość H) 1 1 1 1 1 1 1 1 3 2 3 1 1 1 4 6 2 3 6

P r z y k ł a d 2. Porównanie różnych sposobów desorpcji dla epotylonu B:

Próbki wodnej zawiesiny żywicy kopolimeru styren/diwinylobenzen XAD-16 po 360 ml każda, obciążonej epotylonem A i B z pożywki hodowlanej myksobakterii sposobem opisanym w WO 99/42602 (odpowiadającej 194 g mokrej Amberlite® XAD-16) ekstrahowano różnymi rozpuszczalnikami w warunkach wymienionych w nastę pującej dalej tabeli, w mieszanym (zwykłym laboratoryjnym mieszadłem kotwicowym) reaktorze szklanym ze szkłem spiekanym na dnie (reaktor periodyczny do fazy stałej produkcji własnej, średnica wewnętrzna 10 cm, długość 20 cm, dalej „miesz./spiek).

T a b e l a 1: Porównanie sposobów desorpcji dla epotylonu B Żywica wyjściowa (żywica z zaadsorbowanym epotylonem B)

- #1001 obciążenie teoretyczne 70 mg na 360 ml zawiesiny żywicy (odpowiednik 70 mg na 194 g mokrej XAD-16)

- #1003 obciążenie teoretyczne 114 mg na 360 ml zawiesiny żywicy (odpowiednik 114 mg na 194 g mokrej XAD-16)

Wariant	1	2	3	4	5	6
Reaktor	Miesz./spiek (RT)	Miesz./spiek (RT)	Miesz./spiek (RT)	Miesz./spiek (RT)	Reflux (40°C)	Reflux (42-45°C)
1	2	3	4	5	6	7
Żywica wyjściowa	#1001	#1001	#1003	#1003	#1003	#1003
Ilość zawiesiny żywicy	360	360	360	360	360	180
Rozpuszczalnik desorpcyjny	Izopropanol	Chlorek metylenu	Izopropanol	Chlorek metylenu	Chlorek metylenu	Izopropanol
Mieszanie (obr/min)	250	250	250	250	250	250
Objętość (l)	8x0,2=1,6	3x0,36=1,1^a	5x0,72=3,6	3x0,72^h=2,2	1x2,2	1x1,8
Czas desorpcji (h)	8	3	5	3	2	2
Odparowanie (h)	2^e	0,5	4^e	Brak	Brak	2
Dodatek wody (l)	0,7	Brak^b	1,15	Brak	Brak	0,54

PL 209 406 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7
Ekstrakcja octanem etylu (l)	1,1	Brak	2,2	Brak	Brak	1,1
Czas rozdziału faz (h)	24^c	Brak	15	Brak	Brak	15
Odparowanie (h)	2	Brak	2	1	1	1
Pozostałość po odparowaniu (g)	5,84^l	3,37^d	3,31	2,68^a	3,24^l	1,70
Zawartość (%)	1,26	1,75	2,9	3,7	3,1	3,3
Wydajność: mg (%)	74(105)^g	59(84)	96(84)	99(87)	101(89)	56(98)

Wariant	7	8	9	10	11	12
Reaktor	Erl/Miesz. magn.	Miesz./spiek (RT)	Reflux (42-45°C)	Miesz./spiek (RT)	Miesz./spiek (RT)	Miesz./spiek (43°C)
Żywica wyjściowa	#1003	#1003	#1003	#1003	#1003	#1003
Ilość zawiasy żywicy	100	360	180	360	360	360
Rozpuszczalnik desorpcyjny	Chlorek metylenu	Toluen	Izopropanol	Toluen	Toluen	Toluen
Mieszanie (obr/min)	?	640	250	250	640	250
Objętość (l)	1x0,5=0,5	3x0,72=2,2	1x1,8=1,8	4x0,36=1,44	4x0,36=1,44	4x0,36=1,44
Czas desorpcji (h)	5	3	6	4	4	4
Odparowanie (h)	Brak		15	Brak	Brak	Brak
Dodatek wody (l)	Brak	0,5¹	0,54	0,5^k	0,5^k	0,5^k
Ekstrakcja octanem etylu (l)	Brak	Brak	1,1	Brak	Brak	Brak
Czas rozdziału faz (h)	Brak	0,1	15	0,1	0,1	0,1
Odparowanie (h)	1	1	1	1	1	1
Pozostałość po odparowaniu (g)	4,38	0,88	2,32	0,75	0,88	0,95
Zawartość (%)	0,5	17,4	2,69	17,6	17,1	15,8
Wydajność: mg (5)	22(69)	153(134)	62,5(110)	132(116^	150(132)	150(132)

a - bez optymalizacji; w przypadku 2 ekstrakcji spadek wydajności ok. 5% b - trzykrotna ekstrakcja przeciwprądowa wodą nie powoduje usunięcia składników polarnych c - pierwszy z trzech rozdziałów faz przez noc d - produkt, który w porównaniu z pozostałością po odparowaniu octanu etylu, znacznie lepiej ulega chromatografowaniu na żelu krzemionkowym e - odpowiada pozostałości po odparowaniu około 25 do 30 g f - piec suszarniczy (wysoka próżnia) przez weekend g - prawdopodobnie wynik, w odniesieniu do zużytego czasu, generowania pierwszego rozdziału faz h - odzysk: 1-sza ekstrakcja = 700 ml; 2-ga ekstrakcja = 660 ml; 3-cia ekstrakcja = 680 ml i - odzysk: 1-sza ekstrakcja = 670 ml; 2-ga ekstrakcja = 710 ml; 3-cia ekstrakcja = 720 ml j - nie potwierdziła się konieczność dodatku wody k - ułatwia usunięcie wody oryginalnie występującej (XAD-16 zalewa się stosowaną wodą) l - w świetle rezultatów wariantu 8, 11 i 12 oraz krzywych elucji dla wszystkich prób z toluenem, nie można wykluczyć użycia mniejszych ilości żywicy

PL 209 406 B1 „Erl./miesz. magn.” oznacza mieszanie magnetyczne w kolbie Erlenmayera „chlorek metylenu” oznacza dichlorometan „miesz./spiek” oznacza mieszadło/spiek „RT” oznacza temperaturę pokojową

Z powyższych doświadczeń i dalszych danych można wyciągnąć wniosek, że w porównaniu z izopropanolem ekstrakcja chlorkiem metylenu zapewnia lepszą selektywność, krótszy czas ekstrakcji (około 2-krotnie), szybsze oddestylowanie rozpuszczalnika (temp. wrzenia chlorku metylenu wynosi ok. 40°C, izopropanolu (81-83°C), brak konieczności czasochłonnego i trudnego rozdzielania faz octan etylu/woda, uniknięcie drugiej destylacji rozpuszczalnika, w związku z czym możliwe jest zmniejszenie ilości etapów procesu powodujące mniejsze ryzyko zanieczyszczenia, lepsze i bezpieczniejsze manipulowanie; moż liwość obróbki przy połowie objętości (np. reaktory 1000-litrowe zamiast 2000-litrowych); otrzymanie produktu epotylon B o lepszym profilu czystości (mniej produktów ubocznych o polarności porównywalnej z epotylonem B), a ponadto pozostałość po odparowaniu nie zatyka aparatury i nie pieni się, jak w przypadku ekstrakcji octanem etylu. W przypadku desorpcji toluenem uzyskuje się wyższe niż w przypadku ekstrakcji izopropanolem wydajności (około 100% zamiast 80%), obserwuje się lepszą selektywność (przy izopropanolu desorpcji ulega około 10-krotnie większa ilość produktów ubocznych), skraca się znacząco czas ekstrakcji (około 3-krotnie), uproszczeniu ulega trudna filtracja po desorpcji izopropanolem (ekstrakcja izopropanolem okazała się trudna do wprowadzenia na skalę przemysłową), nie jest wymagana druga destylacja rozpuszczalnika, możliwa jest obróbka w mniejszych reaktorach (ponownie, dla przykładu, możliwe jest zastosowanie reaktora 1000 litrów zamiast 2000 litrów), możliwe jest zaniechanie chromatografii na żelu krzemionkowym (pozostałość po odparowaniu po desorpcji już zawiera około 40% mieszaniny epotylonów A/B), a pozostałość po odparowaniu po desorpcji nie pieni się, ani nie zatyka zaworów, jak obserwowano w przypadku ekstrakcji octanem etylu.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób obróbki epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z mieszaniny reakcyjnej, znamienny tym, że obejmuje

- desorpcję epotylonów za pomocą rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego wybranego z grupy składającej się z halogenków niższych alkili oraz rozpuszczalników aromatycznych, wybranych z grupy składającej się z benzenu, benzenu podstawionego przez jedną lub więcej reszt wybranych z grupy składającej się z niższego alkilu, niższego alkoksylu, fluorowca, grupy nitrowej i niższego alkilu podstawionego przez niższy alkoksyl, lub za pomocą mieszaniny tych rozpuszczalników, korzystnie od 2 do 4, gdzie przedrostek „niższy” oznacza rodnik zawierający do 7 atomów węgla, przy czym etap desorpcji może być powtarzany w celu uzyskania desorpcji zbliżonej do całkowitej;

- usunięcie z otrzymanych roztworów rozpuszczalnika stosowanego do desorpcji przez odparowanie;

- ewentualnie krystalizację epotylonu(ów) po desorpcji; przy czym w szczególnoś ci przy krystalizacji epotylonu B dodawanie mieszaniny alkoholu i węglowodoru, korzystnie niższego alkanolu i cyklicznego węglowodoru alifatycznego zawierającego od 3 do 10 atomów w pierścieniu, oraz odparowanie fazy alkoholowej do sucha, oraz krystalizację epotylonu B z odpowiedniej mieszaniny rozpuszczalników;

- rozdzielenie epotylonów przez chromatografię w układzie odwróconych faz po rozprowadzeniu pozostałości z poprzedniego etapu w odpowiednim rozpuszczalniku, i eluowanie za pomocą mieszaniny nitrylu i wody, korzystnie acetonitrylu i wody, następnie usunięcie przez odparowanie nitrylu z zebranych frakcji zawierają cych epotylon; i ekstrakcję pozostał ej wody z epotylonem przy uż yciu estru, zwłaszcza niższego alkanianu niższego alkilu, korzystnie octanu izopropylu, a następnie odparowanie do sucha fazy estrowej zawierającej epotylon;

- ewentualnie dalsze oczyszczanie metodą chromatografii adsorpcyjnej;

- końcową rekrystalizacj ę oczyszczonych epotylonów z odpowiednich rozpuszczalników lub mieszanin rozpuszczalników;

w którym, w razie konieczności i/lub potrzeby, pomiędzy każ dym z realizowanych etapów, otrzymane roztwory lub zawiesiny zatęża się, i/lub składniki ciekłe i stałe oddziela się od siebie.

PL 209 406 B1
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po desorpcji epotylonów z żywicy za pomocą rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego, rozpuszczalnik usuwa się tak długo jak to konieczne, korzystnie aż do uzyskania suchej pozostałości, przy czym w razie potrzeby pozostałości rozprowadza się w stosunkowo małej objętości mieszaniny alkoholu i węglowodoru, korzystnie niższego alkanolu i cyklicznego węglowodoru alifatycznego zawierającego od 3 do 10 atomów węgla w pierścieniu; fazę alkoholową odparowuje się korzystnie do sucha, a ekstrakt alkoholowy krystalizuje się z mieszaniny alkoholu i węglowodoru, otrzymany stały krystaliczny produkt rozpuszcza się następnie w mieszaninie nitrylu i wody, korzystnie acetonitrylu i wody, w stosunku objętościowym 2 do 3, a otrzymany roztwór zasilający podaje się, w razie konieczności, po podzieleniu na więcej niż jeden przebieg, na kolumnę preparatywną z układem odwróconych faz; następnie eluuje się mieszaniną nitrylu i wody; potem usuwa się nitryl z otrzymanych frakcji zawierających epotylon przez odparowanie, a otrzymaną fazę wodną ekstrahuje się estrem, po czym ekstrakt estrowy odparowuje się i następnie otrzymany produkt poddaje rekrystalizacji.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że rozdziału epotylonów A i B dokonuje się metodą chromatografii w symulowanym złożu ruchomym (SMB).
4. Sposób desorpcji epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z żywicy syntetycznej opartej na kopolimerach styren/diwinylobenzen, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalnik słabo polarny lub niepolarny wybrany z grupy składającej się z halogenków niższych alkili oraz rozpuszczalników aromatycznych, wybranych z grupy składającej się z benzenu, benzenu podstawionego przez jedną lub więcej reszt wybranych z grupy składającej się z niższego alkilu, niższego alkoksylu, fluorowca, grupy nitrowej i niższego alkilu podstawionego przez niższy alkoksyl, lub mieszaninę tych rozpuszczalników, korzystnie od 2 do 4, gdzie przedrostek „niższy oznacza rodnik zawierający do 7 atomów węgla.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że podlegającymi desorpcji epotylonami są epotylon A i/lub epotylon B.
6. Sposób wyodrębniania epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z żywicy syntetycznej opartej na kopolimerach styren/diwinylobenzen, znamienny tym, że obejmuje (i) desorpcję epotylonów z żywicy syntetycznej opartej na kopolimerach styren/diwinylobenzen za pomocą rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego wybranego z grupy składającej się z halogenków niż szych alkili oraz rozpuszczalników aromatycznych, wybranych z grupy składającej się z benzenu, benzenu podstawionego przez jedną lub więcej reszt wybranych z grupy składającej się z niższego alkilu, niższego alkoksylu, fluorowca, grupy nitrowej i niższego alkilu podstawionego przez niższy alkoksyl; lub mieszaniny dwóch lub więcej tych rozpuszczalników, korzystnie od 2 do 4, gdzie przedrostek „niższy oznacza rodnik zawierający do 7 atomów węgla.

(ii) rozdzielenie epotylonów metodą chromatografii w układzie odwróconych faz po rozprowadzeniu w odpowiednim rozpuszczalniku i eluowaniu mieszaniną nitrylu i wody, korzystnie acetonitrylu i wody.
7. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że rozdziału epotylonów A i B dokonuje się metodą chromatografii w symulowanym złożu ruchomym (SMB).
8. Zastosowanie rozpuszczalnika słabo polarnego lub niepolarnego wybranego z grupy składającej się z halogenków niższych alkili oraz rozpuszczalników aromatycznych, wybranych z grupy składającej się z benzenu, benzenu podstawionego przez jedną lub więcej reszt wybranych z grupy składającej się z niższego alkilu niższego alkoksylu, fluorowca, grupy nitrowej i niższego alkilu podstawionego przez niższy alkoksyl; lub mieszaniny tych rozpuszczalników, korzystnie od 2 do 4 tych rozpuszczalników, gdzie przedrostek „niższy oznacza rodnik zawierający do 7 atomów węgla do desorpcji epotylonów A i/lub B i/lub E i/lub F z żywicy syntetycznej opartej na kopolimerach styren/diwinylobenzen.