CZ20031565A3 - Způsob izolace a čistění epothilonů - Google Patents

Description

Způsob izolace a čistění epothilonů

Oblast techniky

Vynález se týká nového způsobu desorpce epothilonů, zejména epothilonů A nebo/a epothilonů B, z pryskyřic a nových způsobů přípravy, zpracování a čistění epothilonů a způsobu přípravy epothilonů zahrnujícího uvedený desorpčni proces, jakož i použití určitých rozpouštědel pro desorpci epothilonů z pryskyřic.

Dosavadní stav techniky

Epothilony A a B představují novou skupinu cytotoxických účinných látek stabilizujících mikrotubuly (o tom viz Gerth K. a kol., J.Antibiot. 49, 560-3 (1966) obecného vzorce

ve kterém R znamená atom vodíku (epothilon A) nebo methylovou skupinu (epothilon B).

Po prvním uvedení těchto epothilonů v odborné literatuře (viz WO 93/10121) bylo popsáno několik způsobů syntézy a výroby jak samotných epothilonů, tak i jejich četných derivátů (všechny tyto látky budou dále společně uváděny jako • » • · · · · · · · · · • β ··» ·· »♦ · * epothilony), například těch, které jsou popsány v následujících patentových dokumentech:

WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/47584, WO 00/00485, WO 00/23452, WO 99/03848, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461, WO 99/65913, WO 98/38192, WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/31247, WO 99/42602, WO 99/28324, WO 00/50423, WO 00/39276, WO 99/27890, WO 99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514, WO 99/59985, WO 00/37473, WO 98/08849, US 6,043,372, US 5,969,145, WO 99/40047, WO 99/01124 a WO 99/43653.

Kromě epothilonu A a epothilonu B také zejména epothilony D a E popsané v patentovém dokumentu WO 97/19061 a epothilony E a F popsané v patentovém dokumentu WO 98/22461, jakož i epothilony popsané v patentovém dokumentu WO 99/02514 mají zajímavé vlastnosti.

Jako příklad terapeutického využití epothilonů popisuje mezinárodní patentová přihláška WO 99/43320 četná podání epothilonů jako činidel proti proliferačním onemocněním, zejména proti nádorovým onemocněním, přičemž epothilony působí vzhledem k jejich obdobnému mechanizmu účinku srovnatelně jako Taxol, který je dobře známým, na trhu dostupným protirakovinovým činidlem. Mezinárodní patentová přihláška WO 99/39694 popisuje některé specifické formulace epothilonů, zejména epothiolonu A a epothilonu B.

Epothilony a zejména epothilon A a nejvýhodně epothilon B nabízejí četné výhody ve srovnání s již zavedenými postupy léčení, zejména v případech, kdy se nádory staly odolnými vůči Taxolové terapii. Proto je žádoucí nalezení syntézy epothilonů umožňující připravit epothilony ve větších produkčních objemech, které by uspokojily rostoucí poptávku po epothilonech.

·· φφφφ φφ ·· ·· φφφφ ··· · φ · · · · φ φ φφφ φ φ φφφ φφφ φ φ φ · φ φ · φ φ φ φ φ φ φφφ φφ φφ φ« φφ

Nejúčinnější produkční způsoby až dosud obsahují alespoň některé biosyntetické stupně a izolaci epothilonů z kultivačního prostředí nebo z obdobné reakční směsi.

Z počátku byla v literatuže popsána extrakce přírodních látek pomocí myxobakterií, zejména extrakce epothilonů z buněčného kmene Sorangium Cellulosum Soce90 (uložen pod depozičním číslem 6773 ve sbírce mikroorganizmů German Collectíon of Microorganisms, viz WO/10121). Aby se dosáhlo uspokojivé koncentrace přírodních látek, zejméně epothilonů, byla dříve ke kultivačnímu prostředí přidávána absorpční pryskyřice na bázi polystyrenu, například Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, Spolková republika Německo).

Nicméně nevýhodou tohoto způsobu je, že při jeho provádění ve velkém měřítku dochází k četným problémům. Funkce ventilů je zhoršena přítomností kuliček pryskyřice, dochází k ucpání potrubí a celé zařízení je vystaveno výraznému opotřebení v důsledku mechanického tření, ke kterému dochází při styku kuliček pryskyřice s vnitřními stěnami zařízení. Kuličky pryskyřice jsou porézní a proto mají velkou vnitřní povrchovou 2 plochu (asi 825 m ) . Sterilizace takové pryskyřice představuje problém vzhledem k tomu, že vzduch přítomný v pryskyřici bráni kontaktu vnitřích stěn se sterilizačním prostředí. Vzhledem k tomu je nemožné provádět uvedený proces v praxi ve velkém měřítku s využitím přídavku pryskyřice v průběhu kultivace mikroorganismu, který produkuje epothilony.

Z těchto důvodů byl v rámci mezinárodní patentové přihlášky WO 99/42602 nalezen a popsán zlepšený způsob produkce epothilonů, zejména epothilonů A a B. Tento způsob zahrnuje převedení do komplexu epothilonů z kultivačního prostředí mikroorganizmu produkujícího epothilony, přičemž uvedené • · • ·· ♦ • · « · * · ··· · · A · · » • · A · · A A A · A · · · · «»···«»·· · • · 9 ···· · · · A ·· » A A ·· «· * · ·· prostředí takto obsahuje cyklodextriny nebo jiná komplexotvorná činidla, smíšení buněk-prostého kultivačního prostředí (například filtrátu nebo centrifugátu uvedeného kultivačního prostředí) se syntetickou pryskyřicí, například s pryskyřicí na bázi matricových styren/divinylbenzenových kopolymerů, jakými jsou například Amberlite XAD-16 (Rohm & Haas Germany GMBH, Frakfurt, Spolková republika Německo) nebo Diaion HP-20 (Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milán, Itálie), za účelem absorpce epothilonů a desorpci epothilonů z pryskyřice, zejména za použití alkoholu, nejvýhodněji isopropanolu. Potom následuje přidání vody k alkoholové fázi, odstranění rozpouštědlové fáze (výhodně odpařením), fázová separace rezultujícího zbytku v přítomnosti esteru, zejména ethylacetátu nebo isopropylacetátu, obvykle molekulární filtrací (gelová chromatografie) vysušené esterové fáze, separace rezultující epothilonové směsi vyosokovýkonnou kapalinovou chromatografií s reverzní fází (výhodně za použití eluční soustavy tvořené směsí nitrílu a vody, například směsí acetonitrilu a vody) a případně další čistění fázovou separací v přítomnosti směsi vody a etheru, výhodně následná adsorpční chromatografie na silikagelu k dosažení dalšího oddělení nečistot, a krystalizace/rekrystalizace.

I když je výše popsaný způsob oproti minulým způsobům pokrokový a vhodný pro výrobu epothiolonů v průmyslovém měřítku, má tento způsob ještě některé nedostatky.

Tak například, k dosažení dostatečné čistoty se doporučuje provést buď stupeň molekulární filtrace nebo/a stupeň adsorpční chromatografie na silikagelu. Četné obtíže pramení z realizace fázové separace v přítomnosti esteru, jakým je například ethylacetát, která je (zejména v důsledku dlohé doby potřebné pro fázovou separaci fáze voda/ester ve velkém průmyslovém měřítku) velmi časově náročná, a z realizace následného • · ·· ···· • · · « · » * · • · · · · · ·· · • · · · · · · · · · · · · • · · · · 9 · · 9 · · ·· ··* ·· · » «· 9-9 odpaření, které je velmi obtížně proveditelné vzhledem k pěnění a prskání odpařované směsi.

To jsou tedy problémy, které mají být řešeny vynálezem, s cílem odstranit pokud možno co nejvíce výše uvedených nedostatků a najít nové a výhodné způsoby izolace epothilonů, zejména epothilonů A a B, potom co došlo k jejich adsorpci na pryskyřici.

Podstata vynálezu

S překvapením bylo nyní zjištěno, že pouhé nahrazení alkoholů, použitých jako desorpční rozpouštědla, určitými jinými rozpouštědly (označenými jako slabě polární nebo nepolární rozpouštědla, jak bude specifikováno níže) poskytuje řešení výše uvedených problémů a dosažení dalších výhod, jakými jsou například zlepšená desorpce a vyšší finální výtěžek. Dalšími dodatečnými výhodami jsou i) vyšší selektivita desorpce, ii) vyšší ukazuje na úplnější reextrakci esterem množství desorbovaných epothionů, což desorpci, iii) není zapotřebí provést (například ethylacetátem) s vysoce problematickou fázovou separací voda/ester, ani následné odpaření etheru; iv) není zapotřebí provést molekulární filtraci a obvykle ani adsorpční chromatografií, v) doba potřebná k desorpci je výrazně zkrácena, vi) provádí se menší počet stupňů, vii) zmenšené riziko kontaminace (což je důležité u vysoce toxických epothilonů) a viii) lepší a bezpečnější pracovní podmínky (což je odvislé od rozpouštědla použitého pro desorpci = extrakci), jakož i ix) po chromatografií s reverzní fází je zapotřebí odstranit neočekávaně menší množství vedlejších produktů nebo nečistot majících stejnou polaritu jako epothilony, zejména jako epothilon B, což je rovněž • ·· · • 4 4 « 4 · · ·

4 ·

· · · » odvislé od použitého rozpouštědla. Tyto a další výhody vyplynou z detailů uvedených v následujícím detailním popisu vynálezu.

Jeden předmět vynálezu se týká způsobu desorpce epothilonů, zejména epothilonů A nebo/a epothiolonu B, zejména epothilonů B, z pryskyřice, zejména syntetické pryskyřice, slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem.

Další předmět vynálezu se týká způsobu zpracování (mebo čistění) epothilonů, zejména po jejich produkci ve standardním prostředí pro chenickou synthézu nebo výhodně v kultivačním prostředí, které obsahuje mikroorganizmy, zejména myxobakterie, zejména rod Sorangium, které jsou vhodné pro produkci epothilonů, zejména epothilonů A nebo/a epothilonů B, a komplexotvornou složku, přičemž uvedený způsob zahrnuje použití slabě polárního nebo nepolárního rozpouštědla při desorpci uvedených epothilonů z pryskyřice.

Třetí předmět vynálezu se týká použití slabě polárního nebo nepolárního rozpouštědla pro desorpci epothiolonů, zejména epothiolonu A nebo/a epothilonů B, obzvláště epothilonů B, z pryskyřice, zejména ze syntetické pryskyřice.

Výše a dále uvedené obecné výrazy mají výhodně následující významy:

Výraz epothilony se výhodně vztahuje k libovolnému epothilonů nebo epothilonovému derivátu uvedenému v následujících patentových dokumentech:

• · · · · · • · · · · · • * · » «·· ♦ · · · · · ···· · * · · · · · ·

9 ·'« · · · · · · · · ·« · ·· · · · · * *

WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/47584,

WO 00/00485, WO 00/23452, WO 99/03848, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461,

WO 99/65913, WO 98/38192, WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086,

WO 98/25929, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/31247, WO 99/42602, WO 99/28324,

WO 00/50423, WO 00/39276, WO 99/27890, WO 99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514,

WO 99/59985, WO 00/37473, WO 98/08849, US 6,043,372, US 5,969,145, WO 99/40047,

WO 99/01124 a WO 99/43653, výhodněji k epothilonu A a zejména k epothilonu B, avšak v širším chápání vynálezu také k epothilonům D a E, popsaným v patentových dokumentech WO 97/19086 a WO 98/22461, k epothilonům E a F, popsaným v patentovém dokumentu WO 98/22461, nebo k epothilonům popsaným v patentovém dokumentu WO 99/02514.

Slabě polární nebo nepolární rozpouštědlo má výhodně následující charakteristiky:

Výhodné je rozpouštědlo, které v eluotropní řadě určené podle: Snyder a kol., J. Chromatogr. Sci. 16, 223 (1978) vykazuje následující charakteristiky, přičemž x_g znamená protonový akceptorový parametr (ukazatel tendence k tvorbě vodíkových vazeb (můstků) ve funkci akceptoru vodíku), X_d znamená protonový donorový parametr (ukazatel tendence k tvorbě vodíkových vazeb ve funkci donoru vodíku) a x_n znamená dipólový parametr (ukazatel dipolového charakteru) s výhradou, že x_e + x_d + x_n = 1, a výhodné jsou rovněž směsi takových rozpouštědel:

x_e = 0,20-0,40;

x_d = 0,15-0,36; a x_n = 0,38-0,60, výhodně x_e = 0,22-0,32;

x_d = 0,17-0,34; a x_n = 0,39-0,54.

•4 44«· •4 4444

4 4 4 • 44 444 44 4

444» 4 4444 4 4 4 · 444·····

44444 44 »4 44 44

Velmi výhodnými slabě polárními nebo nepolárními rozpouštědly jsou (nižší alkyl)-(nížší alkyl)ketony nebo cyklické ketony, jako například aceton, methylethylketon, 2-pentanon, methyl-isobutylketon nebo cyklohexanon, výhodněji ethery, zejména cyklické ethery, obzvláště tetrahydrofuran nebo dioxan; ještě výhodněji alifatické halogenové sloučeniny, zejména nižší alkylhalogenidy, obzvláště methylendichlorid (=methylenchlorid) nebo ethylendichlorid; nejvýhodněji aromatická rozpouštědla, zejména naftalen nebo (výhodně) benzen nebo naftalen nebo (výhodně) benzen substituovaný jedním nebo více, výhodně jedním až třemi, substituenty zvolenými z množiny zahrnující nižší alkylovou skupinu, zejména methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo isopropylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, zejména methoxyskupinu nebo ethoxyskupinu, atom halogenu, zejména atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu, nitroskupinu a (nižší alkoxy)-(nižší alkyl)ovou skupinu, zejména ethoxymethylovou skupinu; obzvláště toluen, ethylbenzen, xylen, zejména o-, m- nebo p-xylen, mesitylen, pseudokumen, hemelliten, kumen, isopropyltoluen, fenylhalogenidy, zejména fluorbenzen, chlorbenzen, brombenzen nebo jodbenzen, nižší alkoxybenzeny, zejména ethoxybenzen nebo methoxybenzen nebo (nižší alkoxy)-(nižší alkyl)benzeny, zejména ethoxymethylbenzel (benzylether) ; nebo libovolné směsi dvou nebo více, například 2 až 4, z uvedených rozpouštědel; nejvýhodnější jsou (nižší alkyl)benzeny, zejména ethylbenzen, xylen, zejména o-, m- nebo p-xylen, mesitylen, pseudokumen, hemelliten, kumen, isopropyltoluen a nejvýhodněji toluen.

Pojem slabě polární nebo nepolární rozpouštědlo rovněž zahrnuje směsi dvou nebo více výše a dále popsaných rozpouštědel, například 2 až 4 takových rozpouštědel.

Adjektivum nižší vždy znamená, že dále uvedená skupina výhodně obsahuje nejvýše až 7 uhlíkových atomů, zejména až 4 · 4 44 4

4 <

4 4· 4 skupina je rozvětvená nebo skupina může být například vícekrát rozvětvená a touto nerozvětvená skupinou je uhlíkové atomy, přičemž tato nerozvětvená. Nižší alkylová nebo jednou nebo například methylová skupina, ethylová skupina, propylová skupina, jako isopropylová skupina nebo n-propylová skupina, butylová skupina, jako isobutylová skupina, sek-butylová skupina, terc-butylová skupina nebo n-butylová skupina, nebo také pentylová skupina, jako amylová skupina nebo n-pentylová skupina.

Atomem halogenu je výhodně atom jodu, atom bromu, atom chloru nebo atom fluoru.

Uhlovodíkem je výhodně organická sloučenina obsahující výhodně 4 až 20 uhlíkových atomů, výhodněji 6 až 16 uhlíkových atomů, přičemž uhlovodík může být alifatickým, například lineárním, rozvětveným nebo cyklickým nasyceným alkanem, například cyklohexanem, lineární, rozvětvenou nebo cyklickou (nearomatickou) organickou skoučeninou s jednou nebo více dvojnými nebo/a trojnými vazbami nebo aromatickým uhlovodíkem, přičemž tento aromatický uhlovodík jen nesubstituovaným aromatickým uhlovodíkem nebo aromatickým uhlovodíkem jednou nebo vícekrát, například až třikrát, substituovaným substituenty zvolenými z množiny zahrnující nižší alkylovou skupinu, zejména methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo isopropylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, zejména methoxyskupinu nebo ethoxyskupinu, atom halogenu, zejména atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu, nitroskupinu a (nižší alkoxy)-(nižší alkyl)ovou skupinu, zejména ethoxymethylovou skupinu, výhodně substituovaným jednou až třemi nižšími alkylovými skupinami.

44 4

499· 4 · 4« • 44 49« 44 4 • 4*49 9 4444 4 4

4 « 4 94 · » 49 9

4 9-4 · 49 4 4 4 4 4 4

Alkoholem je výhodně hydroxy-(nižší alkan), zejména methanol, ethanol nebo n- nebo isopropanol.

Pryskyřicí je zejména syntetická pryskyřice, výhodně pryskyřice na bázi kopolymerů styrenu a divinylbenzenu, výhodněji Amberlite XAD-4 nebo výhodně Amberlite XAD-16 [ Rohm &

Haas Germany GmbH, Frankfurt] nebo Diaion HP-20 [ Resindion

S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milán] . Je samozřejmé, že pryskyřice, ze které mají být epothilon nebo epothilony desorbovány podle vynálezu, obsahuje nekovalentně vázané epothilony (například reverzibilně vázané nebo adsorbované). Jinými slovy, všude tam, kde je použit výraz pryskyřice, se rozumí tímto výrazem pryskyřice jsoucí ve styku s jedním nebo více epothilony, přičemž tyto epothilony jsou zejména buď reverzibilně vázané nebo adsorbované.

V následující části popisu budou popsány výhodné formy provedení vynálezu.

V rámci výhodné formy provedení se vynález týká způsobu zahrnujícího desorpci z pryskyřice výše nebo níže popsaným slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem, zahrnující libovolný další čistící stupně, které jsou žádoucí nebo nezbytné k získání příslušných epothilonů, zejména epothilonu A a nejlépe epothilonu B, v čistém formě, zejména čistící stupně popsané v rámci vynálezu jako výhodné čistící stupně.

Zpracování epothilonů předchází reakce nebo způsob vedoucí k reakčnímu produktu obsahujícímu epothilony a určenému ke zpracování, přičemž epothilony jsou izolované buď i) z chemických reakčních směsí po rozpuštění v příslušném polárním vodném prostředí nebo ii) výhodněji ze supernatantu (například «* ·♦»· ·» 9» ♦· »9·· ··* »9« ·« 9 • 9 · · 9 9 9 · » ♦ 9 9 · • 9 9 · 9 99 999 9 *

9 « 9999 99·« • 9 »« · «9 9 9 9 9 t · cyklodextrin-obsahující supernatant, popsaný v patentovém dokumentu WO 99/42602) kultivačního prostředí s mikroorganizmy produkujícími epothilony, získaného rozdělením kultivačního prostředí na kapalnou fázi (například centrifugát nebo filtrát) a pevnou fázi (buňky), zejména použitím filtrace nebo odstředění (trubková odstředivka nebo separátor).

Po tomto předběžném zpracování výhodně následuje přímé smíšení roztoku i) nebo kapalné fáze ii) s pryskyřicí, zejména se synthetickou pryskyřicí, obzvláště s pryskyřicí na bázi kopolymerů styrenu a divinylbenzenu ve funkci matrice (dále zjednodušeně uváděná jako polystyrénová pryskyřice), jakou je například Amberlit XAD-16 nebo Diaion HP-20 (výhodně v objemovém poměru centrifugát:pryskyřice rovném asi 10:1 až 100:1, výhodně rovném asi 50:1). Po proběhnutí kontaktní periody výhodně rovné 0,25 až 50 hodinám, zejména 0,8 až 22 hodinám, se pryskyřice oddělí, například filtrací, sedimentací nebo odstředěním. Je-li to žádoucí, pryskyřice se po adsorpci promyje silně polárním rozpouštědlem, výhodně vodou.

Potom začíná realizace výhodného způsobu zpracování podle vynálezu. Desorpce epothilonů (které jako takové představují obzvláště výhodné provedení podle vynálezu) se provádí slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem, zejména (nižší alkyl)halogenidy, obzvláště methylendichloridem nebo ethylendichloridem, nebo výhodněji aromatickými rozpouštědly, zejména naftalenem nebo (výhodně) benzenem, nebo naftalenem nebo (výhodně) benzenem substituovaným jedním nebo více, výhodně jedním až třemi, substituenty, zvolenými z množiny zahrnující nižší alkylovou skupinu, zejména methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo isopropylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, zejména methoxyskupinu nebo ethoxyskupinu, atom halogenu, zejména atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu, nitroskupinu a (nižší alkoxy)-(nižší alkyl)ovou »· ··· ·

4· « · » · ♦ « · · · • · · «· ·· >· «· < f skupinu, zejména ethoxymethylovou skupinu, nejvýhodněji toluenem. Tento extrakčni stupeň může být opakován jednou nebo vícekrát, výhodně 0 až 3 krát, zejména jednou, za účelem dosažení úplné desorpce v případě, že je to nezbytné nebo žádoucí.

Zpracování takto získaných roztoků (v případě opakovaných extrakcí se jedná o sloučené roztoky) desorbovaných epothilonů výhodně pokračuje tím, že se provede odstranění rozpouštědla použitého pro desorpci z uvedených roztoků odpařením (destilací), výhodně zahuštěním v reaktoru a následně v rotační vakuové odparce.

Potom se provede další zpracování za použiti následujících stupňů, z nichž pouze čistící stupeň chromatografií s reverzní fází za použití elučního činidla tvořeného nitrilem je obligatorní, zatímco ostatní stupně jsou fakultativními stupni:

krystalizace epothilonů nebo epothilonů po desorpci; specificky v případě krystalizace epothilonů B se přidá směs alkoholu a uhlovodíku, zejména nižšího alkanolu a cyklického alifatického uhlovodíku s 3 až 10 kruhovými atomy, obzvláště methanolu a cyklohexanu (výhodně) v objemovém poměru 1:10 až 10:1, zejména v objemovém poměru 1:3 až 3:1. Přidání vody vede k rychlé fázové separaci, přičemž se alkoholová fáze odpaří k suchu, například ve vakuové rotační odparce. Získaný extrakt, který obsahuje epothilon B se potom ponechá vykrystalizovat z příslušné rozpouštědlové směsi, zejména ze směsi alkoholu a cyklického alifatického uhlovodíku, výhodněji ze směsí isopropanolu a cyklohexanu, výhodně v objemovém poměru 1:10 až 10:1, výhodněji v objemovém poměru 1:6 až 6:1 a nejvýhodněji v objemovém poměru 1:6 až 1:4;

4« ·*♦· • 4 • 4 4 4 • · · 4 » 4 4 » 4 444 ► 4 4 * » 9 4 i *4 4·

44 4

4 4 1

4· 44 (obligatorní) separace epothilonů reverzně fázovou chromatografií po vyjmutí vhodným rozpouštědlem, zejména směsí nitrilu a vody, výhodně směsí acetonitrilu a vody, výhodně v objemovém poměru 1:10 až 10:1, zejména v objemovém poměru 1:3 až 1:1, a eluci směsí nitrilu a vody, přičemž se chromatografie výhodně provádí na sloupci reverzně fázového materiálu, který obsahuje uhlovodíkové řetězce, jako například uhlovodíkové uhlíkových atomů, zejména na sloupci eluce se provádí elučním činidlem řetězce obsahující 18 materiálu RP-18, a obsahujícím nitril, zejména (nižší alkyl)nitril, obzvláště acetonitril, výhodně eluční soustavou tvořenou směsí nitrilu a vody, zejména směsí acetonitrilu a vody, výhodně v poměru nitril:voda rovném asi 1:99 až 99:1, především v poměru 1:9 až 9:1, například v poměru 2:8 až 7:3, výhodně v poměru 3:7 nebo 4:6; následně se odstraní nitril z frakcí obsahujících epothilon (zejména epothilon A nebo nejvýhodněji epothilon B) odpařením (destilací); je-li to žádoucí, voda doprovázející epothilon se potom extrahuje esterem, zejména (nižší alkyl)-(nižší alkanoát)em, výhodně isopropylacetátem, a esterová fáze obsahující epothilon se potom odpaří k suchu (výhodně nejdříve v prvním reaktoru a potom ve vakuové rotační odparce); (je-li to žádoucí, může být výchozí roztok epothilonů rozdělen na několik částí a tyto dílčí roztoky potom mohou být podrobeny separaci ve více než jednom reverzně fázovém separačním kroku);

pouze případná (například jako alternativa ke krystalizaci po desorpci) adsorpční chromatografie, zejména provedená zavedením na sloupec silikagelu a elucí příslušným rozpouštědlem nebo příslušnou směsí rozpouštědel, zejména směsí esteru a uhlovodíku, například směsí alkylalkanoátu a alkanu obsahujícího 4 až 10 uhlíkových atomů, obzvláště směsí ethylnebo isopropylacetátu a n-hexanu, ve kterém je poměr esteru k uhlovodíku výhodně v rozmezí 99:1 až 1:99, výhodně v rozmezí 10:1 až 1:10, například výhodně roven 4:1;

»* ·*·· ·· ♦ « ·· ···· • · · 9 9 9 · 9 <

• · · ·· 9 9 99· 9 9 9 • 9 · ··«♦ »·»· • · ♦« · « * · · *· 9 9 a nakonec rekrystalizace, například z příslušných rozpouštědel nebo směsí rozpouštědel, zahrnujících estery, směsi esterů a uhlovodíků nebo alkoholy, zejména směs ethylnebo isopropylacetátu a toluenu v poměru 1:10 až 10:1, výhodně v poměru 2:3 (epothilon A) nebo methanol nebo ethylacetát (epothilon B) ;

přičemž při uvedeném způsobu se v případě, že je to nezbytné nebo/a žádoucí, mezi jednotlivými stupni zahustí rezultující roztoky nebo suspenze nebo/a se kapalné a pevné složky oddělí jedna od druhé, zejména sedimentací, filtrací nebo odstředěním roztoků nebo suspenzí. Výše a níže uvedené přesnější definice mohou být výhodně použity ve výše uvedených jednotlivých stupních.

V rámci výhodné formy provedení se vynález rovněž týká způsobu izolace epothilonů adsorbovaných na syntetické pryskyřici, zejména epothilonů A nebo výhodněji epothilonů B, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje

i) desorpci epothilonů z uvedené syntetické pryskyřice slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědle, zejména (nižší alkyl)halogenidy, zejména methylendichloridem nebo ethylendichloridem, nebo výhodněji aromatickými rozpouštědly, zejména naftalenem nebo (výhodně) benzenem nebo naftalenem nebo (výhodně) benzenem substituovaným jedním nebom více, výhodně jedním až třemi, substituenty zvolenými z množiny zahrnující nižší alkylovou skupinu, zejména methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo isopropylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, zejména methoxyskupinu nebo ethoxyskupinu, atom halogenu, zejména atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu, nitroskupinu a (nižší alkoxy)-(nižší alkyl)ovou skupinu, zejména ethoxymethylo• 4 4 444 9 4

4«

4

4 4 · • 4 4« vou skupinu, nejvýhodněji toluenem, nebo směsí dvou nebo více takových rozpouštědel, ii) separaci epothilonů reverzní fázovou chromatografií po jejich vyjmutí ve vhodném rozpouštědle, zejména ve směsi nitrilu a vody, výhodně ve směsi acetonitrilu a vody, výhodně v objemovém poměru 1:10 až 10:1, zejména v objemovém poměru 1:3 až 1:1, a eluci směsí nitrilu a vody, přičemž chromatografie se výhodně provádí na sloupci revezně fázového materiálu, zejména na sloupci materiálu RP-18, obsahujícího uhlovodíkovém řetezce, například uhlovodíkové řetězce obsahující 18 uhlíkových atomů, a použije se eluční činidlo obsahující nitril, zejména (nižší alkyl)nitril, obzvláště acetonitril, přičemž se zejména použije směs nitrilu a vody, zejména směs acetonitrilu a vody, výhodně poměru nitril/voda rovném asi 1:99 až 99:1, výhodněji v poměru 1:9 až 9:1, například v poměru mezi 2:8 a 7:3, například při poměru 3:7 nebo 4:6.

V rámci další výhodné formy provedení vynálezu výše uvedený způsob začínající stupněm I) a obsahující stupeň ii) dále zahrnuje libovolný čistící stupeň, který je nezbytný nebo žádoucí k získání příslušných epothilonů, zejména epothilonů A a nej výhodněji epothilonů B, v čisté formě, výhodně ty čistící stupně, které byly v rámci vynálezu popsány jako výhodné.

Zpracování se výhodně provádí následujícím způsobem: adsorpce epothilonů, zejména z chemických reakčních směsí nebo výhodně ze supernatantů kultivačních prostředí migroorganizmů, může být provedena způsobem popsaným v patentovém dokumentu WO 99/42602 nebo způsobem, který je analogický s tímto způsobem; stručně specifikováno: epothilony jsou obsaženy v centrifugátu, který se potom přímo smísí se syntetickou pryskyřicí, zejména s ·« ··«» ·· 4« 44 4444 •44 »4 4 44 4

444» 4 4 4 4· 4 · 4

444 44 4»4 4 4 • 4 « «44» 4444

44» 44 4« 44 »4 pryskyřicí na bázi styrendivinylbenzenového kopolymeru, jako například s pryskyřicí AmberliteXAD-16 nebo Diaion HP-20 (výhodně v objemovém poměru centrifugát/pryskřice rovném asi 10:1 až 100:1, výhodněji v poměru asi 50:1), a získaná směs se míchá v míchacím zařízení. Po uplynutí doby, která je dostatečná pro adsorpci, například po uplynutí doby styku s pryskyřicí rovné 0,2 až 10 h, se pryskyřice oddělí odstředěním nebo filtrací. Adsorpce rpothilonů na pryskyřici může být rovněž provedena v chromatografické koloně na sloupci pryskyřice a to uspořádáním pryskyřice v koloně a vedením uvedeného centrifugátu skrze tuto kolonu. Po adsorpci se pryskyřice promyje vodou.

Potom započne výhodné zpracování podle vynálezu, které probíhá následujícím způsobem.

Desorpce epothilonů z pryskyřice se výhodně provádí slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem podle vynálezu, zejména výše nebo níže popsaným výhodným rozpouštědlem, zejména methylenchloridem nebo nejvýhodněji toluenem. Rozpouštědlo se potom odstraní, pokud je to nutné, výhodně k získání suchého zbytku. Je-li to vhodné, zbytek se vyjme ve směsi alkoholu a uhlovodíku, zejména ve směsi methanolu a cyklohexanu, výhodně ve výše popsaných poměrech, přičemž se použije poměrně malý objem uvedené směsi. Alkoholová fáze se potom odpaří, výhodně k suchu, a alkoholový extrakt se potom krystalizuje ze směsi alkoholu, výhodně isopropanolu, a uhlovodíku, zejména cyklohexanu, ve výše popsaných poměrech. Získaný pevný krystalický materiál se potom rozpustí ve směsi nitrilu a vody, výhodně popsané výše, zejména ve směsi acetonitrilu a vody v objemovém poměru 2:3, a získaný roztok se v případě, že je to žádoucí, po rozdělení do několika frakci nalije na preparativní reverzně fázový chromatotografický sloupec. Potom se provede eluce směsí nitrilu a vody, výhodně právě výše popsanou směsí.

·· »·»· ·« ·'**-<► ·# • · · · · ♦ · » * • · ··« · · ··« « « « • ♦ 9 » ♦ · » * « * * • · · · · · * · · «· >« (Aceto-)nitril přítomný v získaných frakcích obsahujících epothilon, zejména epothilon A a nejvýhodněji epothilon B, se odstraní odpařením (destilací) a získaná vodná fáze se extrahuje esterem, zejména isopropylacetátem. Získaný esterový extrakt se potom odpaří, výhodně k suchu, a získaný materiál se následně rekrystalizuje, přičemž například frakce epothilonu A se přímo krystalizuje ze směsi esteru a uhlovodíku, například ze směsi ethylacetátu a toluenu v objemovém poměru 2:3, zatímco frakce epothilonu B se krystalizuje z esteru, zejména z ethylacetátu nebo výhodně z alkoholu, zejména z methanolu.

Jako vysoce účinný selektivní eluční činidlo (desorpční činidlo) byl zjištěn toluen, který poskytuje přibližně 100% výtěžek dosažený za polovinu desorpční doby, kterou k tomu potřebuje isopropanol použitý v rámci postupu popsaného v patentovém dokumentu WO 99/42602« Množství desorbovaných epothilonů se překvapivě zvýší, například na 130 %, po desorpci toluenem ve srovnání s isopropanolovým desorpčním činidlem (ačkoliv se to na první pohled zdá nemožné z teoretického hlediska, tato skutečnost velmi dobře ilustruje hlavní výhodu poskytovanou vynálezem: výsledek se vztahuje ke stanovení naadsorbované pryskyřice; protože při tomto stanovení byl pro desorpci použit isopropanol, byl za základ vzat neúplný desorpční proces vedoucí původně k nižším hodnotám stanovení, které se nyní ukázaly být klamné) . Epothilonová směs může být (bez předcházející krystalizace nebo po předcházející krystalizaci) zavedena přímo na sloupec reverzeně fázové pryskyřice. Proces je značně robustní, pokud jde o množství rozpouštědel, míru míchání a teploty. Zatímto v případě alkoholů (například v případě ethanolu a isopropanolu) za míchání dochází ke dvoufázové desorpci, kdy se první množství epothílon-obsahujícího materiálu desorbuje v první časové periodě (což je snad vysvětlitelné distribucí velikostí pórů nalezenou u polystyrenu XAD-16, která má dvě distribuční maxima) a druhé množství uvedeného materiálu se desorbuje ve ·»·« ·· «« ·4 9*49 •44 44« 4 • 4 444 4 4 444 »44

4 4444 4 4- 4 4

4 4 · 4 44 44 4 4 44 druhé časové periodě až po uplynutí první časové periody, nebylo toto nežádoucí chování pozorováno u toluenu nebo rovněž u dichlormethanu, kde se všechen materiál obsahující epothilon desorbuje již v první časové periodě. Za srovnatelných podmínek činil v jednom příkladu zbytek po odpaření v případě isopropanolu a epothilonů A a B 40 g, zatímco v případě methylenchloridu 3,3 g a v případě toluenu pouze 0,9 g, ale například 17 až 18 g v případě epothilonů B po desorpci z pryskyřice na bázi kopolymeru styrenu a divinylbenzenu a za použití supernatantu kultivačních prostředí obsahujících cyklodextrin, jak je to popsáno v patentovém dokumentu WO 99/42602, což ukazuje na mnohem vyšší čistotu. Zatímco při použití toluenu se dosahuje nejvýznamnějších výhod, spočívá výhoda dichlormethanu v jeho snadném odstranění v důsledku je nízké teploty varu.

Separace epothilonů A a B může být rovněž dosažena provedením chromatografie ve formě simulovaného pohyblivého lože (SMB, Simulated Moving Bed). Chromatografie SMB je široce používanou separační metodou používanou pro separaci binárních směsí, jako je například separace racemátů na chirálních stacionárních fázích, například procesy Sorbex v petrochemickém průmyslu, jako procesy Parex nebo Molex, nebo proces Sarex používaný v cukrovarnickém průmyslu. Ve srovnání s šaržovou chromatografií, poskytuje chromatografie SMB výhodu provozu kontinuální protiproudé jednotky, která vede ke zvýšené produktivitě a snížené spotřebě mobilní fáze. Odborníkům v daném oboru je známo několik systematických postupů pro metodický rozvoj chromatografií SMB. Takové postupy jsou například popsané v: R.M.Nicoud, M.Baily, J.Kinkel, R.M.Devant, s t

T.R.E.Hampe a E.Kusters, Proceedings of the 1 European Meeting on Simulated Moving Bed Chromatography (1993), ISBN 2-905-267-21-6, str. 65-88; E.kusters, G.Gerber a F.D.Antia, Chromatographia, 40 (1995) 387; T. Prol a E Kůsters, J.

Chromatogr. A,800 (1998) 135; nebo C.Heuer, E.Kusters, T.

	·· •'•O	9 9 9 9	9 9	9999
	• ··	• * *	9 9	9.
	• » ···	• · · · *	9 9	9
	9 9 ·	9 9 9 9	9 9	9 9
	·· »♦·	99 9 9	99	9 9
19

Plattner a A.	Seidel-Morgenstern, J. Chromatogr.A,	827	(1998)
175.
Základní	parametry pro	separaci epothilonů	A	a B
chromatografií	SMB nohou být	přímo odvozeny od	konvenční

separace kapalinovou chromatografi. Výhodně se jako stacionární fáze použije reverzně fázový silikagel (RP 18) a jako mobilní fáze se použijí směsi vody a acetonitrilu. Finální soubor průtokových rychlostí (pro individuální zóny SMB a přepínací časy) může být odvozen buď z jednoduchého proudového schématu vyvinutého E.Kusters-em a kol., který je k dispozici v: Chromatographia, 40 (1995) 387, nebo pečlivým vyhodnocením adsorpčních isoterm, uvedených v: J. Chromatogr. A, 800 (1998) 135 a v: J.Chromatogr. A, 827 (1998) 175. Zpracování extraktu a rafinátových proudů může být rovněž provedeno způsobem popsaným pro separaci konvenční kapalinovou chromatografií.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen definicí patentových nároků a obsahem popisné části.

Příklady provedení vynálezu

V úvodu je třeba uvést, že při zacházení s epothilony je třeba dodržovat příslušná bezpečnostní ochranná opatření vzhledem k jejich vysoké toxicitě.

·« «φφφ ·« ·· *» «·φφ • * φ φφφ « φ · * Φ Φ φ · φ Φφφ* # · φ * φ φφφ φφ φφφ φ φ • Φ φ φφφφ φφφφ ·· ·♦· φφ *φ φφ φφ

Příklad 1

Zpracovatelský postup pro epothilon B

Desorpce 591,7 kg naadsorbované pryskyřice (styren/divinylbenzen-kopolymerová pryskyřice XAD-16 s naadsorbovaným epothilonem A a B z kultivačního prostředí) se provede mícháním uvedené pryskyřice rozdělené na dvě části vždy se 720 litry toluenu ve čtyřech podílech po dobu přibližně 8 hodin. Oddělení toluenové fáze od pryskyřice je zajištěno použitím filtru provozovaného pod sáním. Sloučené toluenové fáze se promyjí dvěma podíly tvořenými vždy 250 litry vody. Po rozdělení fází se toluenový extrakt zahustí v 1000 1 reaktoru na objem přibližně rovný 20 až 40 litrů a potom se provede zahuštění k suchu ve vakuové rotační odparce. Získá se 4,095 kg toluenového extraktu obsahujícího 209 g epothilonů B. Tento toluenový extrakt se rozpustí v 16,5 litru methanolu a 24,5 litru cyklohexanu. Po přidání 0,8 litru vody dojde bezprostředně k rozdělení fází. Methanolová frakce se odpaří k suchu ve vakuové rotační odparce, přičemž se získá 1,025 kg zbytku po odpaření obsahujícího 194 g epothilonů. Methanolový extrakt se potom krystalizuje z rozpouštědlové směsi obsahující 2,05 litrů isopropanolu a 10,25 litrů cyklohexanu, přičemž se získá 0,4 krystalického materiálu obsahujícího 184 g epothilonů B. Získané krystaly se rozpustí v 3,2 litru směsi acetonitrilu a vody v objemovém poměru 2:3 a rezultující vsázkový roztok se zavede ve třech oddělených bězích na preparativní sloupec reverzně fázové pryskyřice (25 kg sférického silikagelu RP-18, YMC-Gel ODS-A 120; 5 až 15 mikrometrů; Waters Corp.,Milford, Massachusetts, USA) . Eluce se provede směsí acetonitrilu a vody v objemovém poměru 2:3 ve funkci mobilní fáze při průtoku 2,3 1/rain; retenční doba epothilonů A = 77 až 96 minut, retenční doba epothilonů B = 96 až 119 min. Frakce se monitorují ultrafialovým detektorem při vlnové délce 250 nm. Acetonitril

4 4-4-4-4 4 4 4 4 4 4 4 44 4 ••4 444 44 «

4444 4 4*44 4 4 4

4 444 44 444 4 4 • 4 4 4444 4444

444 44 44 44 44 44 ze sloučených frakcí epothilonů B (ze tří běhů) se oddestiluje a zbylá vodní fáze se extrahuje 504 litry isopropylacetátu. Isopropylacetátový extrakt se zahustí v 630 1 reaktoru na přibližně 20 až 40 litrů a poslése se zahustí k suchu ve vakuové rotační odparce. Hmotnost zbytku po odpaření epothilonových frakcí činí 170 g a tento zbytek obsahuje (podle stanovení vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií za použití vnějšího standardu) 98,4 % epothilonů B. Takto získaný materiál se nakonec krystalizuje z 2,89 litru methanolu o teplotě 0 až 5 °C, přičemž se získá 150 g epothilonů B ve formě čistého krystalizátu.

Teplota tání získaného produktu: 124 až 125 °C;

¹H-nukleární magnetickorezonanční spektrum pro epothilon B (500 MHz-NMR, rozpouštědlo: DMSO-d6; chemické posuny δ v ppm vzhledem k TMS; s = singlet, d = dublet, m = multiplet):

• * · ♦♦♦ 4« ·· 4 · ·«·· ··* « ♦ » «· · • > ·*< · t ·»» · « · • · · * · · · · · « 4 ·· ··* ·· *· ·<

δ (multiplicita)

Integrál (počet H)

7.34 (s)

6.50 (S)

5.28 (d)

5.08 (d)

4.46 (d)

4.08 (m)

3.47 (m)

3.11 (m)

2.83 (dd)

2.64 (s)

2.36 (m)

2.09 (s)

2.04 (m)

1.83 (m)

1.61 (m)

1.47-1.24 (m)

1.18 (s)

1.13 (m)

1.06 (d)

0.89 (d + s, přesah)

6 2 3 6 • 4 »·<· 44 ·4 44 4444 • · * 444 44 4

44444 44444 <4 4

4· 444 44 444 4 4 ·· · 4444 4444 • 4 444 44 44 44 44

Příklad 2

Srovnání různých desorpčních postupů při přípravě epothilonu B suspenze XAD-16 s myxobakterií

Vždy 360 ml vodné styren/divinylbenzen-kopolymerové pryskyřice naadsorbovaným epothilonem A a B z kultivace provedené způsobem popsaným v patentovém dokumentu WO 99/čě602 (což odpovídá 194 g mokrého produktu Amberlite XAD-16) se extrahuje rozpouštědly uvedenými společně s pracovními podmínkami v následující tabulce v míchaném (obvyklé laboratorní kotvové míchadlo) skleněném reaktoru, opatřeném u dna slinutou fritou (interně vyrobený šaržový reaktor, vnitřní průměr: 10 cm. délka 20 cm, dále označován jako

Stirrer/Frit).

Tabulka 1

Srovnání desorpčních postupů při výrobě epothilonu B

Startovací pryskyřice (pryskyřice s naadsorbovaným epothilonem):

#1001: teoretický obsah 70 mg na 360 ml pryskyřicové suspenze (což odpovídá 70 mg na 104 g mokré XAD-16), #1003: teoretický obsah 114 mg na 360 ml pryskyřicové suspenze (což odpovídá 114 mg na 194 g mokré XAD-16).

·» ···* »9 · · ’ « 9 ► · «·· • « ·· ··»· • * «· ···

co

áoG IP T +3 CM >& s

#1003

o co

isopropanol

250

1 x 1.8

CM

CM

0.54

T·

iO

T·

1.70

3.3

56 (98)

2

I

o-

CO O

o

x: o

o

2.2

CM

I

v

T—

o> CO^

w

Q

O

<o

c

m

T“

CM

co

4J

r· 4fc

co

thyle

CM

X t—

I

co

r* O τ

Φ

I

>0) o a 'í

I

N x-

O

CM

u.

CM

o

co

x:

II

σ

P

•C <r

o

o

o

o

CO

oo

|x

co

LL 4-

o

OJ

c

lO

CM

T—

<o

CO

'SmX*

£ § 1

T—

CJ

Φ >.

CM

0.7

CM

<J) CJJ

fc: já r s 'T! π

Φ Σ

X

ωΗ

co

(O

o

co

03

c

II

, —,

μ—» ·Η ’C jJ

o

Φ Q.

o

lO

Φ

in

CM

m T“

CM

r-

σ>

o

Stirrer/F Teplota místnosi

#10

36

O i. Q. O w

ΙΟ CM

5 x 0.72

V* v—

CM

co CO

CM

’) 96

O

<9

‘C

V

o

.'tť -H

o

o

-C o

O

II

CO

iq

o

lO

3

CM

o

co

c

m

co

CO

h*·

έ 1 S

4fc

o

3 thyle

CM

co ó X

o

co

T-·

59

2

co

co

«—»

O

•

»

T

u· *·*>. LL -rj Φ $ ín ~ H fi w ÍT tn

#1001

360

sopropan

250

T“ II CM Ó X

00

Φ 04

0.7

ΤΓ-

u OJ

CM

5.84'

1.26

74 (105)

-P 'd

00

B

w

1

'rl

q

-

&

N

Ή

z—s

z—»

0

I

»

•

β

X3

d

W

,ζ—,

rl

a

•3

*—*

rH .

Ql

tf|0

rM

*—*

N

fll

z—».

z—*.

> ·

Ή

rQ

Uj

fr

d

o

δ

Λ

r—4

Λ

e

Λ

Q

y Λ

s

M

«

n j

Σ5

fli

tTl

k

P

««—»

y

0

rH

o

Z—»,

6

Pí

0

0

rH

n

>φ

\|

Qa—'

<Λ°

• 1

P

'H

C

·*—·

«w*

to

ri

rH

3)

H

(7

c

P

Ή

fc>

N

VpU

Q)

Φ

Q

o

UJ

2

q

5$

tí

CÍ|

ri

E

Ό

)L·

5

>y

QÍ

rj

>N

d

Q

to >53

OD

H

sfu

Φ

fri

1

d Ě

(D

.|J)H

P

o

£

p.i

Q

fj

•m

Φ

Πι

Ό

Η Ψ

(rt

Q.

řn

Λ

ra

Q

to

to

0

•S

J3

rH

•A

Q

X5

rfy

Ž? S

Q

>

«

£

En

fi

fe

o

2

I o

O

A

N>ň

«· «·«« • · • ··· ·· • · · • * ··· • · · · * « «4 4 *· ·· ·· ···· • 4 4 • · 4 • · · φ • *4 · ·· ··

12

Stir./Frit (43°C)

#1003

360

Toluen

250

4x0.36 = 1.44

X IO Ó

T“ Ó

T

0.95

15.8

150 (132)

l·-

II

£E

04

▼“·

c u.

1003

360

c Φ □

640

0.36 1.44

CO O

0.1

T

co co o

17.1

CO ««X O

—>

1-

X

CO

r*

CO

H

4

tr

o

*-< ’k_ LU

003

09

uen

50

II CD

X in

V*

T

.75

co |<

(116

Φ

=í

co

Toli

04

0.3

ó

o

o

32

X

T·

co

v

o

o

co

2-45°

c

T“

o

O)

003

80

opa

OS

II 00

co

co

.54

T-

LO

t—

.32

.69

γ. r-

v

T

k. cx

04

T-

c

>

OJ

04

iq

X

os

X

CM co

Φ

cc

04

co

Frit (RT)

#1003

360

Toluen

640

0.72 = 2.

co

0.5’

Ó

T-

CO co ó

17.4

53 (134)

X

r-

£

co

U_

co

«

IO

co

03

JZ o

ó

Ó)

o

c Φ

II

CO

co

O) to

cd

o

o

σ·

IO

co

co

E

T“

£ Φ

ó X

't

O

22

km LU

T”

0

t

Id

'Π3

•H

>u

«*«*»

0

&

•

3

Λ

fO

Ct-t

Έ -

&

íí

r—I

\pj

S,

ΰΡ

ro

« -tí

k

n ·

'«M»'

Φ

Λ

3

2

0«

Ci'-' Ή <D

'd

£

H

esor

SH

φ_ dl H

r-i $ 33

S-

<JP

• 1

Έ

Ή

> N

Ή

O''

'c -

c

*>**

'

N

8 >0 UJ

í

•o

T3

>

id.

$6.

3

g

s

1

Φ >N

:>

I *

£

‘á

3

«3

3

M N

o

'3

&

případě 2 extrakcí činí ztráta výtěžku asi 5 %

II cd ·· ···· ·· ·Λ • r · · · · • · ··· · · ··· • · * » · · · · • · · · · · · ·· ···· * · · • · · • · φ • « · · ·· ·· b = trojnásobná extrakce, kdy voda nevyjímá žádnou polární složku;

c = první z tří fázových separací;

d = materiál při přirovnání ke zbytku po odpaření ethylacetátu může být mnohem lépe chromatografován na silikagelu;

e = odpovídá zbytku po odpaření asi 25 až 30 g;

f - sušení v sušárně (za hlubokého vakua) přes víkend;

g = snad výsledek hojné první fázové separace týkající se použité doby;

h = izolace: první extrakce = 700 ml; druhá extrakce =

680 ml; třetí extrakce = 680 ml;

i = izolace: první extrakce = 670 ml; druhá extrakce = 710 ml; třetí extrakce = 720 ml;

j = potřeba přidání vody nebyla ještě potvrzena;

k = zjednodušuje odstranění původně přítomné vody (XAD-16 je kryt použitou vodou);

= vzhledem k výsledkům varianty 8, 11 a 12 a k elučním křivkám pro všechny experimenty s toluenem nemůže být vyloučeno použití menšího množství pryskyřice;

Erl./mag.St = magnetické mícháni v Erlenmayerové baňce;

methylenchlorid (methylenchl.) = dichlormethan; Stir./Frit = Stirrer/Frit;

RT = teplota místnosti.

Z výše uvedených experimentů a dalších údajů může být odvozeno, že ve srovnání s isopropanolem poskytuje methylenchloridová extrakce lepší selektivitu, kratší dobu extrakce (přibližně dvakrát kratší), rychlejší destilaci rozpouštědla (teplota varu methylenchloridu je 40 °C, zatímco teplota varu isopropanolu je 81 až 83 °C), skutečnost, že již není zapotřebí časově náročná a problematická fázová separace směsi ethylacetátu a vody, skutečnost, že již není zapotřebí destilace druhého rozpouštědla, a tedy menší počet stupňů, což má za následem snížené riziko kontaminace a lepší a bezpečnější

I* • · · · operační manipulaci; je možné zpracování polovičního objemu (například zpracování v 1000 1 reaktorech namísto ve 2000 1 reaktorech); produkovaný epothilon B má lepši čistotní profil (méně vedlejších produktů s polaritou, která je srovnatelná s polaritou epothilonů B); a zbytek po odpaření nepění a neprská, jako je tomu v případě extrakce ethylacetátem. Při desorpci toluenem se dosáhne vyššího výtěžku ve srovnání s isopropanolovou extrakcí (asi 100 % namísto 80 %), přičemž lze pozorovat lepší selektivitu (za použití isopropanolu se desorbuje asi desetinásobné množství vedlejších produktů); doba extrakce se výrazně zkrátí (asi třikrát), zjednodušší se obtížná filtrace po desorpci isopropanolem (isopropanolová extrakce je obtížně proveditelná ve velkém měřítku), již není zapotřebí destilace druhého rozpouštědla, je možné pracovat v menších reaktorech (opět je například možné použít 1000 1 reaktor namísto 2000 1 reaktoru), je možné vynechat chromatografií na silikagelu (zbytek po odpaření po desorpci obsahuje vždy asi 40 % směsi epothilonů A/B) a zbytek po odpaření po desorpci nepění a neprská jako zbytek z extrakce ethylacetátem.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob desorpce epothilonů z pryskyřice, vyznačený tím, že se desorpce provádí slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že epothilony určené k desorpci jsou epothilon A nebo epothilon B.
3. 3. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 2, vyznačený tím, že pryskyřicí je syntetická pryskyřice.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že pryskyřicí je syntetická pryskyřice na bázi styren/divinylbenzenových kopolymerů.
5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačený tím, že slabě polární nebo nepolární rozpouštědlo je zvoleno z množiny, zahrnující (nižší alkyl)halogenidy a aromatická rozpouštědla a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičem výraz nižší alkyl znamená alkylovou skupinu obsahující nejvýše 7 uhlíkových atomů.
6. 6.

   použité

   Způsob podle nároku 5, vyznačený rozpouštědlo je zvoleno aromatické zahrnující naftalen, substituovaný jedním množiny, zahrnující t

   z nebo m, ze množiny, benzen benzen a naftalen nebo více substituenty zvolenými z nižší alkylovou skupinu, nižší

   4 · 44 44 4944

   494 994 49 4 • 4 4 4 4 4 4449 9 4 4 alkoxyskupinu, atom halogenu, nitroskupinu a (nižší alkoxy)-(nižší alkyl)ovou skupinu, přičemž výraz nižší znamená, že nižší alkylová skupina nebo (nižší alkoxy)skupina obsahuje nejvýše 7 uhlíkových atomů.
7. 7. Způsob izolace epothilonů adsorbovaných na syntetické pryskyřici, vyznačený tím, že zahrnuje iii) desorpci epothilonů z uvedené syntetické pryskyřice slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem a ív) separaci epothilonů reverzně fázovou chromatografií potom, co byly epothilony vyjmuty vhodným rozpouštědlem, a eluci směsí nitrilu a vody.
8. 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačený tím, že dále zahrnuje libovolné čistící stupně, které jsou žádoucí nebo nezbytné k získání příslušných epothilonů v čisté formě.
9. 9. Způsob získání epothilonů z reakční směsi, vyznačený t í m, že zahrnuje desorpci epothilonů slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem, přičemž tento desorpční stupeň může být opakován k dosažení úplnější desorpce;

   odstranění rozpouštědla použitého pro desorpci ze získaných roztoků odpařením;

   případnou krystalizaci epothilonů nebo epothilonů po desorpci, zejména krystalizaci epothilonů B přidáním směsi alkoholu a uhlovodíku a odpařením alkoholové fáze k suchu a krystalizaci epothilonů B z příslušné směsi rozpouštědel; (případný stupeň) oddělení epothilonů reverzně fázovou chromatografií vyjmutím zbytku z předcházejícího stupně ve vhodném rozpouštědle a elucí směsí nitrilu a vody a odstraněním nitrilu ze sloučených frakcí obsahujících • · · ♦ · · · ···· • · · · · « » · · »t · · epothílony, přičemž voda zbylá v epothilonech se potom případně extrahuje esterem a esterá fáze obsahující epothílony se následně odpaří k suchu;

   případné další čistění adsorpční chromatografií; a finální krystalizaci přečištěného epothilonů z příslušného rozpouštědla nebo z příslušné směsi rozpouštědel;

   přičemž v případě, že je to žádoucí nebo/a nezbytné, mohou být roztoky nebo suspenze získané mezi jednotlivými stupni zahuštěny nebo/a kapalné a pevné složky mohou být od sebe odděleny, a výraz nižší zde znamená, že skupina obsahuje nejvýše 7 uhlíkových atomů.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačený tím, že se desorpce epothilonů z pryskyřice provede slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem, zejména rozpouštědlem, které je v nároku 5 nebo 6 uvedeno jako výhodné rozpouštědlo; rozpouštědlo se potom odstraní, pokud je to nutné, výhodně až k získání suchého zbytku, zbytek se případně vyjme poměrně malým objemem směsi alkoholu a uhlovodíku; alkoholová fáze se odpaří, výhodně k suchu a alkoholový extrakt se potom krystalizuje ze směsi alkoholu a uhlovodíku k získání pevného krystalického materiálu, který se potom rozpustí ve směsi nitrilu a vody popsané v nároku 8, zejména ve směsi acetonitrilu a vody v objemovém poměru 2:3, a získaný roztok se nalije, případně po požadovaném rozdělení do více než jednoho běhu, na preparativní reverzně fázový chromatografický sloupec, který se potom eluuje směsí nitrilu a vody, a ze získaných frakcí obsahujících epothilon se odstraní nitril odpařením, načež se získaná vodná fáze extrahuje esterm a získaný esterový extrakt se potom odpaří a získaný materiál se následně rekrystalizuje, přičemž výraz nižší zde znamená, že skupina obsahuje 7 uhlíkových atomů.

    ·· ···· ·· ·· ·· ·«·· • · · · · « ·· « • · · · · · ···· 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

    9· 99 9 9 9 9 9 99 99
11. 11. Způsob podle některého z nároků 7,9 nebo 10, vyznačený t í m, že separace epothilonů A a B se provádí chromatografií se simulovaným pohyblivým ložem (SMB).
12. 12. Způsob podle některého z nároků 1,7,9 nebo 10, vyznačený t í m, že slabě polární rozpouštědlo nebo nepolární rozpouštědlo nebo směs takových rozpouštědel má následující charakteristiky v eluotropní řadě určené podle Snyder-a a kol.:

    χθ = 0,20 až 0,40, x_d = 0,15 až 0,36, a ^xn = 0,38 až 0,60, pncemz donorový x +x ,+x e d n ^xe je protonový akceptorový parametr, parametr a x_n je dipolový parametr, = 1.

    x_d je protonový s výhradou, že
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačený tím, že slabě polární rozpouštědlo nebo nepolární rozpouštědlo nebo směs takových rozpouštědel má následující charakteristiky v eluotropní řadě určené podle Snyder-a a kol.:

    x_e = 0,22 až 0,32, x_d = 0,17 až 0,34, a x_n = 0,39 až 0,54, přičemž χθ je protonový akceptorový parametr, x_d je protonový donorový parametr a x_n je dipolový parametr, s výhradou, že ^Xe^+Xd^+Xn ⁼ !·
14. 14. Použití slabě polárního nebo nepolárního rozpouštědla pro desorpci epothilonů z pryskyřice.

    • · ···· ·· ·· • · · · « « · « » • «··· · ···· « · « ·»······»··* • * · · · · · · · · · • · · · · ·· ·· 9« ··
15. 15. Použití podle nároku 14, při kterém je slabě polární nebo nepolární rozpouštědlo zvoleno z množiny, zahrnující (nižší alkyl)halogenidy a aromatická rozpouštědla, zejména naftalen, benzen a naftalen nebo benzen substituovaný jedním nebo více substituenty zvolenými z množiny, zahrnující nižší alkylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, atom halogenu, nitroskupinu a (nižší alkoxy)-(nižší alkyl)ovou skupinu, a směs dvou nebo více takových rozpouštědel, a pryskyřice je syntetickou pryskyřicí.
16. 16. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 3 až 13 nebo použití podle nároku 14 nebo 15, kde epothilony jsou zvolené ze skupiny, zahrnující epothilony A,B,D,E a F.