ES2239687T3 - Procedimiento para el aislamiento y la purificacion de epotilonas. - Google Patents
Procedimiento para el aislamiento y la purificacion de epotilonas.Info
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Abstract
Un procedimiento para desorber epotilonas A, B, D, E y/o F de una resina, haciendo uso dicho procedimiento de un disolvente débilmente polar a apolar seleccionado del grupo que consiste en halogenuros de alquilo inferior y disolventes aromáticos o una mezcla de dos o más de tales disolventes, en donde el prefijo ¿inferior¿ significa que el radical contiene hasta 7 átomos de carbono.
Description
Procedimiento para el aislamiento y la
purificación de epotilonas.
Esta invención se refiere a un nuevo
procedimiento de desorción para epotilonas, especialmente epotilona
A y/o epotilona B, desde resinas, y a nuevos procedimientos de
producción, tratamiento o purificación o métodos de fabricación para
epotilonas que comprenden dichos procedimientos de desorción, así
como el uso de ciertos disolventes para la desorción de epotilonas
desde resinas.
Las epotilonas A y B representan una nueva clase
de ingredientes activos citotóxicos estabilizantes de microtúbulos
(véase Gerth, K. y otros, J. Antibiot. 49,
560-3 (1966)) de la fórmula:
donde R significa hidrógeno
(epotilona A) o metilo (epotilona
B).
Desde la descripción de estas epotilonas (véase
WO 93/10121), se han descrito varios métodos para la síntesis y la
fabricación tanto de las epotilonas como principalmente de
numerosos derivados de epotilona (denominados colectivamente
"epotilonas" más adelante aquí), por ejemplo los descritos en
WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/47584, WO 00/00485, WO
00/23452, WO 99/03848, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461, WO
99/65913, WO 98/38192, WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO
97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/31247, WO
99/42602, WO 99/28324, WO 00/50423, WO 00/39276, WO 99/27890, WO
99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514, WO 99/59985, WO 00/37473, WO
98/08849, US 6.043.372, US 5.969.145, WO 99/40047, WO 99/01124 y WO
99/43653) Además de la epotilona A y la epotilona B, especialmente
las epotilonas D y E, descritas en WO 97/19086 y WO 98/22461, y las
epotilonas E y F, descritas en WO 98/22461, así como las epotilonas
descritas en WO 99/02514 muestran propiedades interesantes.
Como un ejemplo para el uso terapéutico, la
Solicitud Internacional WO 99/43320 describe un número de modos de
administración de epotilonas como agentes contra enfermedades
proliferativas, especialmente enfermedades tumorales, que, debido a
su mecanismo similar, actúan de un modo comparable al del Taxol®, un
agente anticanceroso bien conocido y comercializado. WO 99/39694
describe algunas formulaciones específicas de las epotilonas,
especialmente A y B.
Las epotilonas, especialmente la epotilona A y lo
más preferiblemente la epotilona B, ofrecen un número de ventajas
en comparación con los tratamientos establecidos, especialmente
también en casos en los que los tumores se han hecho refractarios
al tratamiento con Taxol. Por lo tanto, se requieren urgentemente
métodos para su síntesis en grandes cantidades para cumplir demandas
anticipadas.
Los procedimientos de producción más eficaces
hasta ahora comprenden al menos algunas etapas biosintéticas y el
aislamiento de epotilonas de medios de cultivo o similares.
Originalmente, la extracción de substancias
naturales por medio de mixobacterias, especialmente las epotilonas
a partir de la cepa celular Sorangium Cellulosum Soce90
(depositada bajo el número 6773 en the German Collection of
Microorganisms, véase WO 93/10121) fue descrita en la literatura.
Para obtener una concentración satisfactoria de las substancias
naturales, especialmente las epotilonas, previamente, una resina de
adsorbato basada en poliestireno se añadía siempre al medio de
cultivo para la absorción al medio, por ejemplo Amberlite
XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, Alemania).
Sin embargo, la desventaja de este procedimiento
es que, a gran escala, conduce a abundancia de problemas. Las
válvulas son deterioradas por los glóbulos de resina, los tubos
pueden bloquearse y los aparatos pueden someterse a un mayor
desgaste debido a la fricción mecánica. Los glóbulos de resina son
porosos y por lo tanto tienen una gran superficie específica
interna (aproximadamente 825 m^{2}/gramo de resina). La
esterilización se convierte en un problema, ya que el aire
encerrado en la resina no se puede tratarse en autoclave. Así, el
procedimiento no puede llevarse a cabo en la práctica a gran escala
usando adición de resina durante el cultivo de los microorganismos
que producen epotilonas.
Por lo tanto, un procedimiento avanzado para la
producción de epotilonas, especialmente de epotilonas A y B, se
encontró y se describió en WO 99/42602. Ese método comprende la
complejación de epotilonas procedentes de medios de cultivo de
microorganismos que producen epotilonas, comprendiendo dichos medios
ciclodextrinas u otros agentes que forman complejos, la mezcla del
medio de cultivo libre de células (por ejemplo, un filtrado o
centrifugado de dicho medio de cultivo) con una resina sintética,
por ejemplo una resina basada en copolímeros de
estireno/divinilbenceno como matriz, tal como Amberlite
XAD-16 (Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt) o
Diaion HP-20 (Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical
Co., Milán, Italia), para absorber las epotilonas, y la desorción,
especialmente con un alcohol, lo más preferiblemente isopropanol.
Esto es seguido por la adición de agua a la fase alcohólica, la
retirada de la fase de disolvente (preferiblemente mediante
evaporación), la separación de fases del residuo resultante en
presencia de un éster, especialmente acetato de etilo o acetato de
isopropilo, habitualmente la filtración molecular (cromatografía en
gel) de la fase de éster secada, la separación de la mezcla de
epotilonas resultante mediante HPLC en fase inversa
(preferiblemente, mediante elución con una mezcla de nitrilo/agua,
por ejemplo acetonitrilo/agua) y opcionalmente la purificación
adicional mediante separación de fases en presencia de una mezcla
de agua/éter, preferiblemente la cromatografía de adsorción
subsiguiente sobre gel de sílice para alcanzar una retirada
adicional de impurezas, y la cristalización/recristalización.
Aunque es un progreso útil y es apropiado para la
producción a escala industrial, este método todavía tiene ciertas
desventajas.
Por ejemplo, para obtener suficiente pureza, es
conveniente hacer uso de la etapa de filtración molecular o la
etapa de cromatografía de adsorción en gel de sílice o ambas. Más
dificultades vienen de la separación de fases en presencia de un
éster, tal como acetato de etilo, que (especialmente debido al
tiempo largo para la separación de fases de la fase de agua/éster a
gran escala industrial) consume mucho tiempo, así como la
evaporación subsiguiente, que además es difícil de manejar en vista
de la espumación y la formación de salpicaduras.
Así, este es un problema que ha de ser
solucionado por la presente invención para evitar tantas de las
dificultades previas como sea posible y encontrar modos nuevos y
ventajosos para el aislamiento de epotilonas, especialmente
epotilonas A y B, después de su adsorción a una resina.
Muy sorprendentemente, se ha encontrado ahora que
mediante la simple substitución de los alcoholes usados como
disolvente de desorción por ciertos otros disolventes (llamados
disolventes débilmente polares o apolares según se especifica más
adelante) se proporciona un progreso real que puede alcanzarse para
obtener una solución a los problemas mencionados previamente,
conduciendo a ventajas adicionales tales como una desorción mejorada
y un rendimiento final superior. Entre las ventajas adicionales
están (i) selectividad de desorción superior; (ii) cantidad
superior de epotilonas desorbidas, indicando una desorción más
completa; (iii) falta de re-extracción con éster
(por ejemplo, acetato de etilo) con la separación de fases de
agua/éster altamente problemática y sin requerirse evaporación de
éter subsiguiente; (iv) no se requiere filtración molecular y
habitualmente tampoco cromatografía de adsorción; (v) el tiempo
requerido para la desorción se disminuye considerablemente; (vi)
menos etapas de procesamiento; (vii) riesgo de contaminación
disminuido (importante con las epotilonas altamente tóxicas); y/o
(viii) manejo mejor y más seguro (dependiendo del disolvente usado
para la desorción = extracción); y (ix) dependiendo también del
disolvente, inesperadamente, cantidades incluso inferiores de
subproductos o impurezas con polaridad similar a las epotilonas,
especialmente a la epotilona B, que necesitan ser retiradas después
de la cromatografía en fase inversa. Estas y otras ventajas pueden
deducirse de los detalles dados en la Descripción Detallada de la
Invención subsiguiente:
Un aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para desorber epotilonas, especialmente epotilona A
y/o B, en particular epotilona B, desde una resina, especialmente
una resina sintética, con un disolvente débilmente polar o
apolar.
Un aspecto adicional se refiere a un
procedimiento para tratar (o purificar) epotilonas, especialmente
después de su producción en un medio estándar para síntesis química
o preferiblemente un medio de cultivo que comprende
microorganismos, especialmente mixobacterias, en particular del
género Sorangium, que son adecuadas para producir
epotilonas, especialmente epotilona A y/o B, y un componente
formador de complejos, comprendiendo dicho procedimiento el uso de
un disolvente débilmente polar o apolar para la desorción de dichas
epotilonas desde una resina.
Un tercer aspecto de la invención se refiere al
uso de un disolvente débilmente polar o apolar para la desorción de
epotilonas, especialmente epotilona A y/o B, en particular
epotilona B, de una resina, especialmente una resina sintética.
Los términos generales usados previamente aquí y
más adelante aquí tienen preferiblemente los significados dados más
adelante aquí
El término "epotilonas" se refiere
preferiblemente a epotilona A y especialmente epotilona B, pero en
un aspecto más amplio de la invención también a las epotilona D y
E, descritas en WO 97/19086 y WO 98/22461, las epotilonas E y F,
descritas en WO 98/22461, o las epotilonas descritas en WO
99/02514. Todos estos documentos, especialmente con respecto a los
derivados de epotilona y los derivados de epotilona preferidos
mencionados allí, se incluyen aquí mediante referencia.
Un disolvente débilmente polar o apolar significa
halogenuros de alquilo inferior y disolventes aromáticos o una
mezcla de tales disolventes y preferiblemente tiene las siguientes
características:
Se prefiere un disolvente que, en la serie
eluotrópica determinada de acuerdo con Snyder y otros, J.
Chromatogr. Sci. 16, 223 (1978), muestre las siguientes
características, donde x_{e} es el parámetro aceptor de protones
(indicador de la tendencia para formar enlaces de hidrógeno como
aceptor de hidrógeno), x_{d} es el parámetro donante de protones
(indicador de la tendencia a formar enlaces de hidrógeno como
donante de hidrógeno) y x_{n} es el parámetro dipolar (que indica
el carácter dipolar), con la condición de que x_{e} + x_{d} +
x_{n} = 1, o una mezcla de tales disolventes:
x_{e} =
0,22-0,32; \ x_{d} = 0,17-0,34 \ y \
x_{n} =
0,39-0,54.
Muy preferidos entre los disolventes débilmente
polares o apolares son dicloruro de metileno (= cloruro de
metileno) o dicloruro de etileno; o lo más especialmente
disolventes aromáticos, especialmente naftaleno o (preferiblemente)
benceno o naftaleno o (preferiblemente) benceno substituidos por
uno o más, preferiblemente de uno a tres, restos seleccionados del
grupo que consiste en alquilo inferior, especialmente metilo, etilo
o isopropilo, alcoxi inferior, especialmente metoxi o etoxi,
halógeno, especialmente flúor, cloro, bromo o yodo, nitro y
alcoxi(inferior)-alquilo(inferior)
(especialmente etoximetilo); especialmente tolueno, etilbenceno,
xileno, especialmente o-, m- o p-xileno, mesitileno,
pseudo-cumeno, hemeliteno, cumeno,
isopropiltolueno, halogenuros de fenilo, especialmente
fluorobenceno, clorobenceno, bromobenceno o yodobenceno,
alcoxi(inferior)-bencenos, especialmente
etoxibenceno o metoxibenceno o
alcoxi(inferior)-alquil(inferior)-bencenos,
especialmente etoximetilbenceno (éter bencílico); o cualquier
mezcla de dos o más, por ejemplo de dos a cuatro de estos
disolventes; los más preferidos son
alquil(inferior)-bencenos, especialmente
etilbenceno, xileno, especialmente o-, m- o
p-xileno, mesitileno, pseudo-cumeno,
hemeliteno, cumeno, isopropiltolueno y lo más especialmente
tolueno.
El término "disolvente débilmente polar o
apolar" también incluye mezclas de dos o más de los disolventes
descritos previamente aquí y más adelante aquí, por ejemplo de dos
a cuatro de tales disolventes.
El prefijo "inferior" indica siempre que el
radical nombrado correspondientemente contiene preferiblemente
hasta un máximo de 7 átomos de carbono, en particular hasta 4
átomos de carbono, y está ramificado o no ramificado. El alquilo
inferior puede estar, por ejemplo, no ramificado o ramificado una
vez o más, y es, por ejemplo, metilo, etilo, propilo tal como
isopropilo o n-propilo, butilo tal como isobutilo,
sec-butilo, terc-butilo o
n-butilo, o también pentilo tal como amilo o
n-pentilo.
El halógeno es preferiblemente yodo, bromo, cloro
o fluoro.
Un hidrocarburo es preferiblemente un compuesto
orgánico que tiene de 4 a 32, más preferiblemente de 4 a 20, aún
más preferiblemente de 6 a 16, átomos de carbono y puede ser
alifático, por ejemplo un alcano saturado lineal, ramificado o
cíclico, por ejemplo ciclohexano, un compuesto orgánico lineal,
ramificado o cíclico (no aromático) con uno o más dobles y/o triples
enlaces, o un hidrocarburo aromático, no estando el último
substituido o estando substituido por uno o más, por ejemplo hasta
tres, substituyentes seleccionados del grupo que consiste en
alquilo inferior, especialmente metilo, etilo o isopropilo, alcoxi
inferior, especialmente metoxi o etoxi, halógeno, especialmente
fluoro, cloro, bromo o yodo, nitro y
alcoxi(inferior)-alquilo(inferior),
especialmente etoximetilo, preferiblemente por de uno a tres restos
alquilo inferior.
Un alcohol es preferiblemente un
hidroxi-alcano(inferior), especialmente
metanol, etanol o n- o iso-propanol.
Una resina es especialmente una resina sintética,
preferiblemente una resina basada en copolímeros de estireno y
divinilbenceno, más preferiblemente Amberlite XAD-4
o preferiblemente Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas
Germany GmbH, Frankfurt] o Diaion HP-20 (Resindion
S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milán]. Ni que decir tiene que una
resina de la que han de desorberse una epotilona o epotilonas de
acuerdo con la invención tiene las epotilonas en contacto no
covalentemente con ella (por ejemplo, unidas reversiblemente a ella
o adsorbidas a ella). En otros términos, cuando se usa el término
"resina", se entiende que significa "resina que tiene una o
más epotilonas en contacto con ella, especialmente unidas
reversiblemente o adsorbidas a ella".
En un aspecto preferido de la invención, la
invención se refiere a un procedimiento que comprende una desorción
de una resina con un disolvente débilmente polar o apolar según se
describe previamente o más adelante, que comprende cualesquiera
etapas de purificación adicionales deseables o requeridas para
llegar a las epotilonas respectivas, especialmente epotilona A y lo
más especialmente epotilona B, en forma pura, preferiblemente las
descritas como preferibles en la presente invención.
El tratamiento de las epotilonas está precedido
por la reacción o el procedimiento que conduce a un producto de
reacción que comprende epotilonas que han de tratarse que se aíslan
(i) de mezclas de reacción química después de la disolución en un
medio acuoso polar apropiado, o (ii) más preferiblemente, el
sobrenadante (por ejemplo, uno que contiene ciclodextrina según se
describe en WO 99/42602) de un medio de cultivo con microorganismos
que producen las epotilonas separando un cultivo en la fase líquida
(por ejemplo, centrifugado filtrado) y la fase sólida (células),
especialmente por medio de filtración o centrifugación (centrífuga
o separador tubular).
Este pretratamiento se continúa entonces
preferiblemente mezclando directamente la solución ((ii)) o la fase
líquida ((ii))) con una resina, especialmente una resina sintética,
especialmente una resina basada en copolímeros de estireno y
divinilbenceno como matriz (en lo sucesivo también denominada
simplemente resina de poliestireno), tal como Amberlite
XAD-16 o Diaion HP-20
(preferiblemente, en una relación de volumen de centrifugado:resina
de alrededor de 10:1 a 100:1, preferiblemente aproximadamente
50:1). Después de un período de contacto preferiblemente de 0,25 a
50 horas, especialmente de 0,8 a 22 horas, la resina se separa, por
ejemplo mediante filtración, sedimentación o centrifugación. Si se
requiere, después de la adsorción, la resina se lava con un
disolvente fuertemente polar, preferiblemente con agua.
A continuación, comienza el procedimiento
preferido de tratamiento de acuerdo con la presente invención: la
desorción de las epotilonas (formando como tal un aspecto muy
preferido de la invención) se efectúa con un disolvente débilmente
polar o apolar, en particular con halogenuros de alquilo inferior,
especialmente dicloruro de metileno o dicloruro de etileno, más
preferiblemente disolventes aromáticos, especialmente naftaleno (o
preferiblemente) benceno, o naftaleno o (preferiblemente) benceno
substituidos por uno o más, preferiblemente de uno a tres, restos
seleccionados del grupo que consiste en alquilo inferior,
especialmente metilo, etilo o isopropilo, alcoxi inferior,
especialmente metoxi o etoxi, halógeno, especialmente fluoro,
cloro, bromo o yodo, nitro y
alcoxi(inferior)-alquilo(inferior),
especialmente etoximetilo; lo más preferiblemente tolueno. La etapa
de extracción puede repetirse una o más veces, preferiblemente de
cero a tres veces, especialmente una vez, para obtener la desorción
más completa cuando sea necesario o se desee.
El tratamiento de las soluciones (en el caso de
extracción repetida combinada) de epotilonas desorbidas así
obtenibles preferiblemente continúa con la retirada del disolvente
usado para la desorción de las soluciones resultantes mediante
evaporación (destilación), preferiblemente por medio de
concentración en un reactor y subsiguientemente en un evaporador
giratorio bajo vacío.
Subsiguientemente, tiene lugar un procesamiento
adicional usando las siguientes etapas, donde la etapa de
purificación por medio de cromatografía en fase inversa con elución
con un nitrilo es preceptiva, mientras que las otras etapas son
opcionales:
- cristalización de la epotilona o las epotilonas
después de la desorción; especialmente, para la cristalización de
epotilona B, se añade una mezcla de un alcohol y un hidrocarburo,
especialmente de un alcanol inferior y un hidrocarburo alifático
cíclico con de 3 a 10 átomos de anillo, lo más especialmente de
metanol y ciclohexano (preferiblemente en una relación v/v de 1:10
a 10:1, especialmente de 1:3 a 3:1). La adición de agua conduce a
la separación de fases rápida y la fase alcohólica se evapora hasta
sequedad, por ejemplo por medio de un evaporador giratorio bajo
vacío. El extracto resultante que comprende la epotilona B se
cristaliza más adelante en una mezcla de disolventes apropiada,
especialmente en una mezcla de alcohol/hidrocarburo alifático
cíclico, lo más preferiblemente isopropanol/ciclohexano,
preferiblemente en una relación v/v de 1:10 a 10:1, más
preferiblemente de 1:6 a 6:1, lo más preferiblemente de 1:6 a
1:4;
- separación (obligatoria) de las epotilonas
mediante cromatografía en fase inversa después de recogerse en un
disolvente adecuado, especialmente una mezcla de un nitrilo y agua,
preferiblemente acetonitrilo/agua, en una relación v/v preferida de
1:10 a 10:1, especialmente de 1:3 a 1:1, y elución con una mezcla
de nitrilo y agua, caracterizada preferiblemente porque la
cromatografía se lleva a cabo en una columna de un material en fase
inversa, que está cargado con cadenas de hidrocarburo, tales como
cadenas de hidrocarburo que contienen 18 átomos de carbono,
especialmente un material RP-18, y se usa un
eluyente que comprende un nitrilo, especialmente un
alquil(inferior)-nitrilo, en particular
acetonitrilo, en particular se usa una mezcla de nitrilo/agua,
especialmente una mezcla de acetonitrilo/agua, preferiblemente en
una relación de nitrilo a agua de aproximadamente 1:99 a 99:1,
principalmente entre 1:9 y 9:1, por ejemplo entre 2:8 y 7:3, por
ejemplo 3:7 ó 4:6; y la retirada del nitrilo de la epotilona
recogida (especialmente epotilona A o lo más preferiblemente
epotilona B) que comprende fracciones mediante evaporación
(destilación); si se desea, el agua restante con la epotilona se
extrae a continuación con un éster, especialmente un alcanoato
inferior de alquilo inferior, preferiblemente acetato de
isopropilo, con evaporación subsiguiente (preferiblemente en primer
lugar en un reactor, a continuación en un evaporador giratorio bajo
vacío) de la fase de éster que contiene epotilona hasta sequedad;
(si se desea, la solución de epotilona de partida puede dividirse y
separarse en más de un recorrido separado en fase inversa);
- solo si se requiere (por ejemplo, como una
alternativa a la cristalización después de la desorción),
cromatografía de adsorción, en particular añadiendo a una columna
de gel de sílice y eluyendo con un disolvente o una mezcla de
disolventes apropiados, especialmente una mezcla de
éster/hidrocarburo, por ejemplo alcanoato de alquilo inferior/alcano
de 4 a 10 átomos de carbono, especialmente acetato de etilo o
isopropilo/n-hexano, en la que la relación entre el
éster y el hidrocarburo está preferiblemente en el intervalo de 99:1
a 1:99, preferiblemente de 10:1 a 1:10, por ejemplo 4:1;
- y finalmente recristalización, por ejemplo en
disolventes o mezclas de disolventes apropiados, por ejemplo que
consisten en ésteres, mezclas de ésteres/hidrocarburos, o
alcoholes, especialmente acetato de etilo o ispopropilo:tolueno de
1:10 a 10:1, preferiblemente 2:3 (epotilona A), o metanol o acetato
de etilo (epotilona B);
proceso en el cual, si es necesario y/o se desea,
entre cada etapa que se emplea, las soluciones o suspensiones
resultantes se concentran y/o los componentes líquidos y sólidos se
separan entre sí, en particular mediante sedimentación, filtración o
centrifugación de soluciones/suspensiones. Las definiciones más
precisas mencionadas previamente y más adelante pueden usarse
preferiblemente en las etapas individuales previas.
Un aspecto preferido de la invención se refiere
además a un procedimiento para el aislamiento de epotilonas
adsorbidas en una resina sintética, especialmente epotilona A y lo
más especialmente epotilona B, procedimiento que comprende
- (i)
- la desorción de las epotilonas desde dicha resina sintética con un disolvente débilmente polar o apolar, en particular con halogenuros de alquilo inferior, especialmente dicloruro de metileno o dicloruro de etileno, o más preferiblemente disolventes aromáticos, especialmente naftaleno o (preferiblemente) benceno, o naftaleno o (preferiblemente) benceno substituidos por uno o más, preferiblemente de uno a tres, restos seleccionados del grupo que consiste en alquilo inferior, especialmente metilo, etilo o isopropilo, alcoxi inferior, especialmente metoxi o etoxi, halógeno, especialmente fluoro, cloro, bromo o yodo, nitro y alcoxi(inferior)-alquilo(inferior), especialmente etoximetilo; lo más preferiblemente tolueno; o en un aspecto más amplio de la invención una mezcla de dos o más de tales disolventes; y
- (ii)
- la separación de las epotilonas mediante cromatografía en fase inversa después de recogerse en un disolvente adecuado, especialmente una mezcla de un nitrilo y agua, preferiblemente acetonitrilo/agua, en una relación v/v preferida de 1:10 a 10:1, especialmente de 1:3 a 1:1, y la elución con una mezcla de nitrilo y agua, caracterizada preferiblemente porque la cromatografía se lleva a cabo en una columna de un material de fase inversa, especialmente un material RP-18, que está cargado con cadenas de hidrocarburo, tales como cadenas de hidrocarburo que contienen 18 átomos de carbono, y se usa un eluyente que comprende un nitrilo, especialmente un alquil(inferior)-nitrilo, en particular acetonitrilo, en particular se usa una mezcla de nitrilo/agua, especialmente una mezcla de acetonitrilo/agua, preferiblemente en una relación de nitrilo a agua de aproximadamente 1:99 a 99:1, principalmente entre 1:9 y 9:1, por ejemplo entre 2:8 y 7:3, por ejemplo de 3:7 ó 4:6.
En un aspecto preferido adicional de la
invención, el procedimiento del último párrafo que empieza con la
etapa (i) y que comprende la etapa (ii) implica además cualesquiera
etapas de purificación adicionales deseables o requeridas para
llegar a las epotilonas respectivas, especialmente epotilona A y lo
más especialmente epotilona B, en forma pura, preferiblemente las
descritas como preferibles en la presente invención.
La preparación para el tratamiento se lleva a
cabo preferiblemente como sigue: la adsorción de las epotilonas,
especialmente de mezclas de reacción químicas o más preferiblemente
del sobrenadante de cultivos de microorganismos, puede alcanzarse
como se describe en WO 99/42602 o análogamente a la misma;
brevemente, las epotilonas se encuentran en el centrifugado, que a
continuación se mezcla directamente con una resina sintética,
especialmente una resina de copolímero de estireno/divinilbenceno,
tal como Amberlite XAD-16 o Diaion
HP-20 (preferiblemente en una relación de volumen de
centrifugado:resina de alrededor de 10:1 a 100:1, preferiblemente
aproximadamente 50:1) y se remueve en un agitador. En esta etapa,
las epotilonas se transfieren a la resina. Después de un período
suficiente para la adsorción, por ejemplo un período de contacto de
alrededor de 0,2 a 10 h, la resina se separa mediante centrifugación
o filtración. La adsorción de las epotilonas sobre la resina
también puede efectuarse en una columna cromatográfica, poniendo la
resina en la columna y haciendo que el centrifugado recorra la
resina. Después de la adsorción, la resina se lava con agua.
Los procedimientos preferidos de acuerdo con la
invención comienzan entonces y avanzan como sigue: la desorción de
las epotilonas de la resina se efectúa preferiblemente con un
disolvente débilmente polar o apolar de acuerdo con la invención,
especialmente uno descrito como preferido previamente o más
adelante, especialmente cloruro de metileno o lo más especialmente
tolueno. El disolvente se retira a continuación tanto como sea
necesario, preferiblemente hasta que se obtiene un residuo seco.
Cuando es apropiado, el residuo se recoge en una mezcla de
alcohol/hidrocarburo, especialmente en metanol/ciclohexano,
preferiblemente en las relaciones descritas previamente, en un
volumen relativamente bajo. La fase alcohólica se evapora,
preferiblemente hasta sequedad, y el extracto alcohólico se
cristaliza a continuación en una mezcla de un alcohol, especialmente
isopropanol, y un hidrocarburo, especialmente ciclohexano,
preferiblemente en las relaciones descritas previamente. El
material cristalizado sólido resultante se disuelve a continuación
en una mezcla de nitrilo/agua, preferiblemente como se describe
previamente, especialmente una mezcla de acetonitrilo/agua 2:3
(v/v), y la solución de alimentación resultante se vierte, si se
requiere, después de separar en más de un recorrido, en una columna
preparativa en fase inversa. Sigue la elución con nitrilo/agua,
especialmente como se acaba de mencionar. El
(aceto)-nitrilo de las fracciones resultantes que
contienen epotilona, especialmente epotilona A y lo más
especialmente epotilona B, se retira mediante evaporación
(destilación) y la fase acuosa resultante se extrae con un éster,
especialmente acetato de isopropilo. El extracto de éster se evapora
a continuación, preferiblemente hasta sequedad, y subsiguientemente
el material resultante se recristaliza, por ejemplo una fracción de
epotilona A se cristaliza directamente en una mezcla de
éster/hidrocarburo, por ejemplo acetato de etilo:tolueno = 2:3, y
la fracción de epotilona B de un éster, especialmente acetato de
etilo, o preferiblemente de un alcohol, especialmente metanol.
Especialmente con tolueno, se ha descubierto un
eluyente (desorbente) altamente selectivo que permite alcanzar un
rendimiento de aproximadamente 100% en la mitad del tiempo de
desorción necesario con el isopropanol usando en WO 99/42602.
Sorprendentemente, la cantidad de epotilonas desorbidas se
incrementa, por ejemplo hasta 130%, después de la desorción con
tolueno cuando se compara con desorción con isopropanol. (Aunque
esto parece a primera vista imposible desde un punto de vista
teórico, ilustra claramente una ventaja principal de la presente
invención: el resultado se relaciona con el ensayo de la resina
cargada. Como ese ensayo hace uso de isopropanol para la desorción,
tiene que tomarse un procedimiento de desorción incompleto como
base que conduce originalmente a valores de ensayo inferiores que
ahora se vuelven engañosos). La mezcla de epotilonas (sin o con la
cristalización precedente) puede aplicarse directamente a la
columna de fase inversa. El procedimiento se hace altamente sólido
con respecto a las cantidades de disolventes, las velocidades de
agitación y las temperaturas. Aunque para alcoholes (por ejemplo,
etanol o isopropanol) bajo agitación puede observarse una desorción
bifásica en la que una primera cantidad de material que comprende
epotilona se desorbe en un primer período de tiempo (explicable
posiblemente por la distribución de tamaños de poros encontrada en
poliestireno XAD-16 que tiene dos máximos de
distribución), y una segunda cantidad después de un período de
tiempo adicional, este comportamiento no deseable no se encuentra
con el tolueno o también el diclorometano donde todo el material se
desorbe ya en el primer período de tiempo. Bajo condiciones
comparables, se ha encontrado que el residuo de evaporación en el
caso del isopropanol/las epotilonas A y B en un ejemplo es 40 g,
con cloruro de metileno 3,3 g, en el caso de tolueno sólo 0,9 g,
con, por ejemplo, 17-18 g % de epotilona B después
de la desorción de resinas de copolímero de estireno/divinilbenceno
obtenidas a partir de sobrenadantes de cultivo que comprenden
ciclodextrina según se describe en WO 99/42602, indicando una
pureza muy superior. Aunque el tolueno tiene las ventajas más
significativas, el diclorometano tiene como una ventaja la
facilidad de retirada, debido al bajo punto de ebullición.
La separación de la epotilona A y B también puede
alcanzarse realizando la cromatografía descrita aquí en su sistema
de lecho móvil simulado (SMB). Las cromatografías de SMB se usan
ampliamente para la separación de mezclas binarias, por ejemplo la
separación de racematos en fases estacionarias quirales, por
ejemplo los procedimientos SORBEX en las industrias petroquímicas,
como Parex o Molex, o el procedimiento SAREX en la industria
azucarera. En comparación con la cromatografía discontinua, la
cromatografía SMB proporciona la ventaja de una operación unitaria
en contracorriente continua, que conduce a una productividad
incrementada y un consumo de fase móvil reducido. Varios
procedimientos sistemáticos para el desarrollo del método de
cromatografía de SMB son conocidos por los expertos en la técnica.
Tales procedimientos son descritos, por ejemplo, por R.M. Nicoud,
M. Bailly, J. Kinkel, R.M. Devant, T.R.E. Hampe y E. Küsters en
Proceedings of the 1^{st} European Meeting on Simulated Moving
Bed Chromatography, (1993), ISBN
2-905-267-21-6,
p. 65-88; E. Küsters, G. Gerber y F.D. Antia,
Chromatograhia, 40 (1995) 387; T. Pröll y E. Küsters, J.
Chromatogr. A, 827 (1998) 175. Los parámetros básicos para la
separación de epotilona A y B con cromatografía de SMB pueden
tomarse directamente de la separación por LC convencional.
Preferiblemente, gel de sílice en fase inversa (RP 18) se toma como
fase estacionaria y mezclas de agua/acetonitrilo como fases móviles.
El grupo final de caudales (para las zonas de SMB individuales y el
tiempo de cambio, respectivamente) puede tomarse a partir de un
esquema de flujo simple como el desarrollado por E. Küsters y
otros, en Chromatograhia, 40 (1995) 387 o después de una
estimación cuidadosa de las isotermas de adsorción según se
establece en J. Chromatogr. A, 800 (1998) 135 y J.
Chromatogr. A, 827 (1998) 175. El tratamiento de las corrientes
de extracto y refinado puede realizarse de nuevo según se describe
para la separación por LC convencional.
La invención se refiere lo más preferiblemente a
los procedimientos y métodos descritos en los ejemplos
subsiguientes.
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la
invención sin limitar su alcance.
Precaución: Cuando se manejan epotilonas,
deben tomarse medidas protectoras apropiadas, cuando sea necesario,
en vista de su alta toxicidad.
La desorción de 591,7 g de resina cargada (resina
de copolímero de estireno/divinilbenceno XAD-16
cargada con epotilonas A y B procedentes de un medio de cultivo) se
efectúa agitando la resina en dos porciones cada una con 720 litros
de tolueno en cuatro porciones durante aproximadamente 8 horas. La
separación de la fase de tolueno de la resina tiene lugar usando un
filtro de succión. Las fases de tolueno combinadas se lavan en dos
porciones con 250 l de agua cada una. Después de la separación de
fases, el extracto de tolueno se concentra en un reactor de 1000
litros hasta aproximadamente 20-40 litros y a
continuación se concentra hasta sequedad en un evaporador giratorio
bajo vacío. El resultado es un extracto de tolueno de 4,095 kg que
contiene 209 g de epotilona B. El extracto de tolueno se disuelve
en 16,5 litros de metanol y 24,5 litros de ciclohexano. Después de
la adición de 0,8 litros de agua, la separación de fases se produce
inmediatamente. La fracción de metanol se evapora hasta sequedad en
un evaporador giratorio bajo vacío dando 1,025 kg de residuo de
evaporación que contiene 194 g de epotilona B. El extracto de
metanol se cristaliza a continuación en una mezcla de disolventes
que consiste en 2,05 litros de isopropanol y 10,25 litros de
ciclohexano, dando 0,4 kg de material cristalizado que contiene 184
g de epotilona B. Los cristales se disuelven en 3,2 litros de
acetonitrilo/agua = 2/3 (v/v) y la solución de alimentación
resultante se transfiere en tres recorridos separados a una columna
preparativa en fase inversa (25 kg de gel de sílice esférico
RP-18, YMC-Gel
ODS-A 120; 5-15 \mum; Waters
Corp., Milford, Massachusetts, EE.UU. de A.). La elución se efectúa
con acetonitrilo/agua = 2/3 (v/v) como fase móvil con un caudal de
2,3 litros/min; tiempo de retención de epotilona = 76,96 min,
tiempo de retención de epotilona B 96-119 min. La
fraccionación se verifica con un detector UV a 250 nm. El
acetonitrilo de las fracciones de epotilona B combinadas (de los
tres recorridos) se separa por destilación y la fase acuosa
restante se extrae con 504 litros de acetato de isopropilo. El
extracto de acetato de isopropilo se concentra en un reactor de 630
litros hasta aproximadamente 20-40 litros y a
continuación se concentra hasta sequedad en un evaporador giratorio
bajo vacío. El peso del residuo de evaporación de las fracciones de
epotilona B es 170 g y tiene un contenido de 98,4% de acuerdo con
HPLC (patrón externo). El material resultante se cristaliza
finalmente en 2,89 litros de metanol a 0-5ºC dando
150 g de cristalizado puro de epotilona B.
Punto de fusión: 124-125ºC;
datos de ^{1}H-NMR para la
epotilona B (500 MHz-NMR, disolvente:
DMSO-d_{6}. Desplazamiento químico \delta en
ppm relativas a TMS. S = singlete, d = doblete, m =
multiplete):
| \delta (Multiplicidad) | Integral (número de H) | |
| 7,34 (s) | 1 | |
| 6,50 (s) | 1 | |
| 5,28 (d) | 1 | |
| 5,08 (d) | 1 | |
| 4,46 (d) | 1 | |
| 4,08 (m) | 1 | |
| 3,47 (m) | 1 | |
| 3,11 (m) | 1 | |
| 2,83 (dd) | 1 | |
| 2,64 (s) | 3 | |
| 2,36 (m) | 2 | |
| 2,09 (s) | 3 | |
| 2,04 (m) | 1 | |
| 1,83 (m) | 1 | |
| 1,61 (m) | 1 | |
| 1,47-1,24 (m) | 4 | |
| 1,18 (s) | 6 | |
| 1,13 (m) | 2 | |
| 1,06 (d) | 3 | |
| 0,89 (d +s, solapamiento) | 6 | |
| \Sigma = 41 |
360 ml de cada una de una suspensión de la resina
de copolímero de estireno/divinilbenceno XAD-16
cargada con epotilona A y B procedente de un cultivo de
mixobacterias mediante el método descrito en WO 99/42602
(correspondientes a 194 g de Amberlite® XAD-16
húmeda) se extraen con los disolventes y bajo las condiciones
mencionadas en la tabla subsiguiente en un reactor de vidrio
agitado (agitador de anclaje de laboratorio común) con una frita
sinterizada en el fondo (reactor discontinuo de fase sólida
doméstico, diámetro interno 10 cm x 20 cm de longitud,
"Agitador/Frita" en lo sucesivo aquí).
Resina de partida (resina con epotilona
adsorbida):
- -
- Nº 1001 carga teórica 70 mg por 360 ml de suspensión de resina (corresponde a 70 mg por 194 g de XAD-16 húmeda)
- -
- Nº 1003 carga teórica 114 mg por 360 ml de suspensión de resina (corresponde a 114 mg por 194 g de XAD-16 húmeda)
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
\newpage
A partir de estos experimentos y datos
adicionales, puede deducirse que en comparación con el isopropanol,
la extracción con cloruro de metileno ofrece mejor selectividad, un
tiempo de extracción más corto (aproximadamente en un factor de 2),
una destilación de disolvente más rápida (el punto de ebullición del
cloruro de metileno es aproximadamente 40ºC, el del isopropanol
81-83ºC), ya no se requiere la separación de fases
de acetato de etilo/agua que consume mucho tiempo y muy
problemática; no se requiere más la segunda destilación de
disolvente, de modo que puede usarse un número inferior de etapas de
procesamiento, dando como resultado un riesgo de contaminación
inferior, y un manejo mejor y más seguro; es posible el tratamiento
en la mitad del volumen (por ejemplo, en reactores de 1000 l en
lugar de reactores de 2000 l); el producto epotilona B tiene un
perfil de pureza mejor (menos subproductos con polaridad comparable
a la epotilona B) y el residuo de evaporación no forma salpicaduras
y no forma espuma en el caso de la extracción con acetato de etilo.
Para la desorción con tolueno, se obtiene un rendimiento superior en
comparación con la extracción con isopropanol (aproximadamente 100
en lugar de aproximadamente 80%), puede observarse mejor
selectividad (con isopropanol, aproximadamente la cantidad de diez
veces de subproductos se desorbe), el tiempo de extracción se
acorta considerablemente (en un factor de aproximadamente 3), la
difícil filtración después de la desorción con isopropanol se
simplifica (la extracción con isopropanol era difícil de establecer
a gran escala), la segunda destilación de disolvente ya no se
requiere, el tratamiento es posible en reactores menores (de nuevo,
por ejemplo, es posible usar un reactor de 1000 l en lugar de uno de
2000 l), es posible abandonar la cromatografía en gel de sílice (el
residuo de evaporación después de la desorción contiene ya
aproximadamente 40% de una mezcla de epotilona A/B) y el residuo de
evaporación después de la desorción no muestra la espumación y la
formación de salpicaduras observadas para el residuo de la
extracción con acetato de etilo.
Claims (13)
1. Un procedimiento para desorber epotilonas A,
B, D, E y/o F de una resina, haciendo uso dicho procedimiento de un
disolvente débilmente polar a apolar seleccionado del grupo que
consiste en halogenuros de alquilo inferior y disolventes
aromáticos o una mezcla de dos o más de tales disolventes, en donde
el prefijo "inferior" significa que el radical contiene hasta 7
átomos de carbono.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que las epotilonas que han de desorberse
son epotilona A o epotilona B.
3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la resina es una resina
sintética.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la resina es una resina sintética
basada en copolímeros de estireno/divinilbenceno.
5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se usa un disolvente
aromático seleccionado del grupo que consiste en naftaleno, benceno
o naftaleno o benceno substituidos por uno o más restos
seleccionados del grupo que consiste en alquilo inferior, alcoxi
inferior, halógeno, nitro y
alcoxi(inferior)-alquilo(inferior); en
donde el prefijo "inferior" significa que el radical contiene
hasta 7 átomos de carbono.
6. Un procedimiento para el aislamiento de
epotilonas A, B, D y E y/o F adsorbidas a una resina sintética,
procedimiento que comprende
- (iii)
- la desorción de las epotilonas de dicha resina sintética con un disolvente débilmente polar o apolar seleccionado del grupo que consiste en halogenuros de alquilo inferior y disolventes aromáticos o una mezcla de dos o más de tales disolventes; en donde el prefijo "inferior" significa que el radical contiene hasta 7 átomos de carbono; y
- (iv)
- la separación de las epotilonas mediante cromatografía en fase inversa después de recogerse en un disolvente adecuado y la elución con una mezcla de nitrilo y agua.
7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6, que incluye además cualesquiera
etapas de purificación adicionales deseables o requeridas para
llegar a las epotilonas respectivas en forma pura.
8. Un procedimiento para tratar epotilonas A, B,
D, E y/o F a partir de una mezcla de reacción, comprendiendo dicho
procedimiento
- -
- desorber las epotilonas con un disolvente débilmente polar o apolar seleccionado del grupo que consiste en halogenuros de alquilo inferior y disolventes aromáticos o una mezcla de dos o más de tales disolventes, donde la etapa de desorción puede repetirse para alcanzar una desorción más completa;
- -
- retirar el disolvente usado para la desorción de las soluciones resultantes mediante evaporación;
- -
- opcionalmente recristalizar la epotilona o las epotilonas después de la desorción; especialmente, para la cristalización de epotilona B, añadir una mezcla de un alcohol y un hidrocarburo y evaporar la fase alcohólica hasta sequedad, y cristalizar la epotilona B en una mezcla de disolventes apropiada;
- -
- (etapa obligatoria) separar las epotilonas mediante cromatografía en fase inversa recogiendo el residuo de la etapa precedente en un disolvente adecuado y eluyendo con una mezcla de nitrilo y agua y retirando el nitrilo de las fracciones que comprenden epotilona recogidas, mediante evaporación; si se desea, el agua restante con la epotilona se extrae a continuación con un éster con evaporación subsiguiente de la fase de éster que contiene epotilona hasta sequedad;
- -
- opcionalmente, purificar adicionalmente mediante cromatografía de adsorción;
- -
- y finalmente recristalizar una epotilona purificada en disolventes o mezclas de disolventes apropiados;
procedimiento en el cual, si es
necesario y/o se desea, entre cada etapa que se emplea, las
soluciones o suspensiones resultantes se concentran y/o los
componentes líquidos y sólidos se separan entre sí; en donde el
prefijo "inferior" significa que el radical contiene hasta 7
átomos de
carbono.
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la desorción de las epotilonas de la
resina se efectúa con un disolvente débilmente polar o apolar
seleccionado del grupo que consiste en halogenuros de alquilo
inferior y disolventes aromáticos o una mezcla de dos o más de
tales disolventes, el disolvente se retira a continuación tanto como
sea necesario, preferiblemente hasta que se obtiene un residuo
seco, cuando es apropiado, el residuo se recoge en una mezcla de
alcohol/hidrocarburo en un volumen relativamente bajo; la fase
alcohólica se evapora, preferiblemente hasta sequedad, y el extracto
alcohólico se cristaliza a continuación en una mezcla de un alcohol
y un hidrocarburo, el material cristalizado sólido resultante se
disuelve a continuación en una mezcla de nitrilo/agua según se
describe en la reivindicación 8, especialmente una mezcla de
acetonitrilo/agua 2:3 (v/v), y la solución de alimentación
resultante se vierte, si se desea, después de separarla en más de
un recorrido, en la columna preparativa en fase inversa; seguido
por elución con nitrilo/agua; a continuación sigue la retirada del
nitrilo de las fracciones resultantes que contienen epotilona
mediante evaporación y la fase acuosa resultante se extrae con un
éster; dicho extracto de éster se evapora a continuación y
subsiguientemente el material resultante se recristaliza; en donde
el prefijo "inferior" significa que el radical contiene hasta 7
átomos de carbono.
10. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 6, 8 ó 9, en el que la
separación de epotilona A y B se alcanza mediante cromatografía en
lecho móvil simulado (SMB).
11. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 8 ó 9, en el que el
disolvente débilmente polar o apolar seleccionado del grupo que
consiste en halogenuros de alquilo inferior y disolventes aromáticos
o una mezcla de dos o más de tales disolventes; en donde el prefijo
"inferior" significa que el radical contiene hasta 7 átomos de
carbono; o una mezcla de tales disolventes muestra las siguientes
características en la serie eluotrópica determinada de acuerdo con
Snyder y otros:
x_{e} =
0,22-0,32; \ x_{d} = 0,17-0,34 \ y \
x_{n} =
0,39-0,54,
donde x_{e} es el parámetro
aceptor de protones; x_{d} es el parámetro donante de protones y
x_{n} es el parámetro dipolar, con la condición de que x_{e} +
x_{d} + x_{n} =
1.
12. El uso de un disolvente débilmente polar o
apolar seleccionado del grupo que consiste en halogenuros de
alquilo inferior y disolventes aromáticos o una mezcla de dos o más
de tales disolventes para la desorción de las epotilonas A, B, D, E
y/o F de una resina; en donde el prefijo "inferior" significa
que el radical contiene hasta 7 átomos de carbono.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12,
en el que el disolvente débilmente polar o apolar se selecciona del
grupo que consiste en naftaleno, benceno o naftaleno o benceno
substituidos por uno o más restos seleccionados del grupo que
consiste en alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, nitro y
alcoxi(inferior)-alquilo(inferior); o
una mezcla de dos o más de tales disolventes; la resina es una
resina sintética; en donde el prefijo "inferior" significa que
el radical contiene hasta 7 átomos de carbono.
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