NO329164B1 - Fremgangsmate for a desorbere, isolere og opparbeide epotiloner og anvendelse av svakt polare eller apolare losemidler for desorpsjon av epotiloner - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår en desorpsjonsprosess for epotiloner, særlig epotilon A og/eller epotilon B, fra harpikser og nye produksjons-, opparbeidings- eller rensingsprosesser eller fremstillingsfremgangsmåter for epotiloner som innbefatter nevnte desorpsjonsprosess, så vel som anvendelse av visse løsemidler for desorpsjon av epotiloner fra harpikser.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en ny desorpsjonsprosess for epotiloner, særlig epotilon A og/eller epotilon B, fra harpikser og nye isolerings- og opparbeidingsprosesser så vel som anvendelsen av visse løsemidler og desorpsjon av epotiloner fra harpikser.

Epotiloner A og B representerer en ny klasse mikrotubuli-stabiliserte cytotoksiske aktive ingredienser (se Gerth, K. et al., J. Antibiot. 49,560-3 (1966) med formelen:

hvori R betegner hydrogen (epotilon A) eller metyl (epotilon B).

Siden beskrivelsen av disse epotilonene (se WO 93/10121), har flere fremgangsmåter blitt beskrevet for syntese og fremstilling både av epotilonene og først og fremst et antall epotilonderivater (samlet betegnet "epotiloner" heretter), for eksempel de som er beskrevet i WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/47584, WO 00/00485, WO 00/23452, WO 99/03849, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461, WO 99/65913, WO 98/38192, WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/31247, WO 99/42602, WO 99/28324, WO 00/50423, WO 00/39276, WO 99/27890, WO 99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514, WO 99/59985, WO 00/37473, WO 98/08849, US 6.043.372, US 5.969.145, WO 99/40047, WO 99/01124 og WO 99/43653.1 tillegg til epotilon A og epotilon B viser særlig epotilonene D og E, beskrevet i WO 97/19086 og WO 98/22461, og epotilonene E og F, beskrevet i WO 98/22461, så vel som epotilonene beskrevet i WO 99/02515 interessante egenskaper.

Som et eksempel på den terapeutiske anvendelsen, beskriver internasjonal søknad WO 99/43320 et antall administrasjonsmåter for epotiloner som midler ovenfor proliferative sykdommer, særlig tumorsykdommer, som på grunn av deres tilsvarende mekanisme virker på en måte sammenlignbar med den til Taxol®, et godt kjent og markedsført anti-krefbniddel. WO 99/39694 beskriver noen spesifikke formuleringer av epotiloner, særlig A og B.

Epotilonene, særlig epotilon A og mest foretrukket epotilon B, gir et antall fordeler sammenlignet med etablerte behandlinger, særlig også i tilfellet hvor tumorer har blitt motstandsdyktige mot behandling med Taxol. Derfor er fremgangsmåter for deres syntese i større mengder svært påkrevet for å bemøte forventede behov.

Den mest effektive fremstillingsprosessen så langt innbefatter i det minste noen biosyntetiske trinn og isolering av epotiloner fra dyrkningsmedium og lignende.

Opprinnelig ble ekstraksjon av naturlige substanser ved hjelp avmyksobakterier, særlig epotiloner fra cellestammen Sorgangjum Cellulosum Soce90 (deponert under nr. 6773 i "the German Collection of Microorganisms", se WO 93/10121) beskrevet i litteraturen. For å oppnå en tilfredsstillende konsentrasjon av de naturlige substansene, særlig epotilonene, ble først en adsorbatharpiks basert på polystyren alltid tilsatt til dyrkningsmediet for absorpsjon av mediet, for eksempel Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, Tyskland).

Imidlertid er ulempen ved denne prosessen i stor skala at den fører til et antall problemer. Ventilene svekkes av perler av harpiks, rør kan blokkere og apparaturen kan utsettes for slitasje på grunn av mekanisk friksjon. Harpiksperlene er porøse og har derfor et stort indre overflateareal (ca, 825 nrVgram harpiks). Sterilisering er et problem, idet luften i harpiksen ikke autoklaveres. Således kan fremgangsmåten ikke bli utført på en måte som kan utføres i stor skala ved anvendelse av harpikstilsetning i løpet av dyrkingen av mikroorganismene som produserer epotilonene.

Derfor ble en forbedret prosess for fremstilling av epotilonene, særlig epotiloner A og B, funnet og beskrevet i WO 99/42602. Denne fremgangsmåten innbefatter kompleksering av epotiloner fra dyrkningsmedium av epotilonproduserende organismer, nevnte medium innbefatter cyklodekstriner eller andre kompieksdannende midler, sammenblanding av det cellefrie dyrkningsmediet (for eksempel filtrat eller sentrifugat av nevnte dyrkningsmedium) med en syntetisk harpiks, for eksempel en harpiks basert på styren/divinylbenzenkopolymerer som matriks, slik som Amberlite XAD-16 (Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt, Tyskland) eller Diaion HP-20 (Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milano, Italia) for å absorbere epotilonene og desorpsjon, særlig med en alkohol, mest foretrukket isopropanol. Dette følges av tilsetning av vann til alkoholfasen, fjerning av løsemiddelfasen (foretrukket ved fordamping), faseseparasjon av det resulterende residuet under nærvær av en ester, særlig etylacetat eller isopropylacetat, vanligvis molekylær filtrering (gelkromatografi) av den tørkede esterfasen, separasjon av den resulterende epotilonblandingen ved omvendt fase HPLC (foretrukket ved eluering med en blanding av nitril/vann, for eksempel acetonitirl/vann), og eventuelt ytterligere rensing ved faseseparasjon under nærvær av en vann/eterblanding, foretrukket etterfølgende adsorpsjonskromatografi på silikagel for å oppnå ytterligere fjerning av urenheter, og

krystallisering/rekrystallisering.

Selv om den utgjør et viktig fremskritt og er hensiktsmessig for industriskalaproduksjon, har denne fremgangsmåten fremdeles ulemper.

For å oppnå tilstrekkelig renhet, er det for eksempel anbefalt å anvende enten moletylfilrferingstrinn eller silikagelabsorpsjomkromatografitrinn eller begge. Flere problemer oppstår ved faseseparasjon under nærvær av en ester, slik som etylacetat, som (særlig på grunn av lang tid for faseseparasjon av vann/esterfasen i storindustriskala) er svært tidkrevende, så vel som etterfølgende fordamping, som i tillegg er vanskelig å håndtere i lys av skumming og spruting.

Det er således et problem som søkes løst ved foreliggende oppfinnelse å unngå så mange av de ovenfor nevnte problemene som mulig og finne nye og fordelaktige måter for å isolere epotiloner, særlig epotiloner A og B, etter deres adsorpsjon til en harpiks.

Svært overraskende har det blitt funnet at ved enkel erstatning av alkoholene som anvendes som desorpsjonsløsemiddel med visse andre løsemidler (nemlig svakt polare og apolare løsemidler som spesifisert nedenfor), tilveiebringer dette et virkelig gjennombrudd som kan oppnås for å oppnå en løsning på problemene nevnt ovenfor, som fører til ytterligere fordeler slik som forbedret desorpsjon og høyere sluttutbytte. Blant de ytterligere fordelene er (i) høyere desorpsjonsselektivitet; (ii) høyere mengde desorbert epotiloner, hvilket indikerer mer fullstendig desorpsjon; (iii) ingen re-ekstraksjon med ester (for eksempel etylacetat) med svært problematisk vann/esterfaseseparasjon og ingen etterfølgende eterfordamping kreves; (iv) ingen molekylifltrering og vanligvis ingen adsorpsjonskromatografi er påkrevet; (v) tiden som kreves for desorpsjon reduseres betydelig; (vi) færre prosesstrinn, (vii) redusert forurensningsfare (viktig med svært toksiske epotiloner), og/eller (vii) bedre og sikrere håndtering (avhengig av løsemidlet som anvendes for desorpsjon - ekstraksjon); og (ix) også avhengig av løsemidlet uventet enda lavere mengder biprodukter eller urenheter med tilsvarende polaritet som epotilonene, særlig som epotilon B, som må fjernes fjernet etter omvendt fasekromatografi. Disse og ytterligere fordeler kan avledes fra detaljene gitt i den etterfølgende detaljerte beskrivelsen av oppfinnelsen.

Et aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for å desorbere epotiloner A, B, D, E og/eller F fra en harpiks, kjennetegnet ved at fremgangsmåten innbefatter anvendelsen av et svakt polart eller apolart løsemiddel valgt fra gruppen bestående av laverealkylhalogenider og aromatiske løsemidler eller en blanding av to eller flere slike, hvor forstavelsen "lavere" betyr at resten inneholder opp til 7 karbonatomer.

Et ytterligere aspekt angår en fremgangsmåte for opparbeiding (eller rensing) av epotiloner, særlig etter deres fremstilling i et standard medium for kjemisk syntese eller foretrukket et dyrkningsmedium som innbefatter mikroorganismer, særlig myksobakterier, særlig av arten Sorangium, som er egnet for fremstilling av epotiloner, særlig epotilon A og/eller B, og en kompleksdannende komponent.

Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å isolere epotiloner A, B, D, E og/eller F absorbert til en syntetisk harpiks, kjennetegnet ved at fremgangsmåten innbefatter

(iii) desorpsjon av epotilonene fra nevnte syntetiske harpiks med et svakt polart eller apolart løsemiddel valgt fra gruppen bestående av laverealkylhalogenider og aromatiske løsemidler eller en blanding av to eller flere slike løsemidler, hvor forstavelsen "lavere" betyr at resten inneholder opp til 7 karbonatomer. og (iv) separasjon av epotilonene med omvendtfase kromatografi etter at de er tatt opp i et egnet løsemiddel og eluert med en blanding av nitril og vann. Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for opparbeiding av epotiloner A, B, D, E og/eller F fra en reaksjonsblanding, kjennetegnet ved at nevnte prosess innbefatter - desorpsjon av epotilonene med et svakt polart eller apolart løsemiddel valgt fra gruppen bestående av laverealkylhalogenider og aromatiske løsemidler eller en blanding av to eller flere slike løsemidler, hvor desorpsjonstrinnet kan gjentas for å oppnå mer fullstendig desorpsjon; - fjerne løsemidlet som anvendes for desorpsjon fra de resulterende løsningene ved fordamping; - eventuelt krystallisering av epotilonene etter desorpsjon; særlig for<i >krystallisasjon av epotilon B, tilsette en blanding av en alkohol og et hydrokarbon, og fordampe alkoholfasen til tørrhet, og krystallisere epotilon B fra en passende løsemiddelblanding,

- (obligatorisk trinn) separere epotilonene med omvendtfase kromatografl ved å

ta opp residuet fra foregående trinn i et passende løsemiddel, og eluere med en blanding av nitril og vann, og fjerne nitrilet fra det oppsamlede epotilonet som innbefatter fraksjoner ved fordamping og hvis ønskelig, blir deretter det gjenværende vannet med epotilonene ekstrahert med en ester med etterfølgende fordamping av epotilonene som inneholder esterfasen til tørrhet;

- eventuelt ytterligere rensing ved adsorpsjonskromatografi,

- og til slutt rekrystallisere og rense epotilonet fra passende løsemidler eller løsemiddelblandinger;

i hvilken prosess, hvis nødvendig og/eller ønskelig, blir mellom hvert trinn som anvendes, de resulterende løsningene eller suspensjonene konsentrert, og/eller væske- eller faststoffkomponentene blir separert fra hverandre, hvori prefikset "lavere" betyr at radikalet inneholder opp til 7 karbonatomer.

Et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen angår anvendelsen av et svakt polart eller apolart løsemiddel for desorpsjon av epotiloner, særlig epotilon A og/eller B, særlig epotilon B, fra en harpiks, særlig en syntetisk harpiks.

De generelle begrepene anvendt ovenfor og i det følgende har foretrukket betydningen gitt nedenfor: Begrepet "epotiloner" angår foretrukket et hvilket som helst epotilon eller epotilonderivat nevnt i patentsøknadene: WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/47584, WO 00/00485, WO 00/23452, WO 99/03849, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461, WO 99/65913, WO 98/38192, WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252, WO 99/67253, WO 00/31247, WO 99/42602, WO 99/28324, WO 00/50423, WO 00/39276, WO 99/27890, WO 99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514, WO 99/59985, WO 00/37473, WO 98/08849, US 6.043.372, US 5.969.145, WO 99/40047, WO 99/01124 og WO 99/43653, mer foretrukket epotilon A og særlig epotilon B, men i et bredere aspekt ifølge oppfinnelsen også epotilonene D og E, beskrevet i WO 97/19086 og WO 98/22461, epotilonene E og F, beskrevet i WO 98/22461 eller epotilonene beskrevet i WO 99/02514.

Et svakt polart eller apolart løsemiddel har foretrukket følgende karakteristikker: Foretrukket er et løsemiddel som, i den elutrofiske raden bestemt ifølge Snyder et al., J. Chromatogr. Sei. 16,223 (1978), viser følgende karakteirstikker, hvor xe er protonakseptorparameterent (indikator for tendens til dannelse av hydrogenbindinger som hydrogenakseptor), xj er protondonorparameteren (indikator for tendens til å danne hydrogenbindinger som hydrogendonor) og x„ er den dipolare parameteren (som indikerer dipolar karakter), med betingelsen at xe+x„ = 1, eller en blanding av slike løsemidler:

Svært fordelaktig blant de svakt polare og apolare løsemidlene er lavere alkyl-lavere alkylketoner eller cykliske ketoner, slik som aceton, metyletylketon, 2-pentanon, metyl-isobutylketon eller cykloheksanon, mer foretrukket etere, særlig cykliske etere, mer foretrukket tetrahydrofuran eller dioksan; enda mer foretrukket alifatiske halogenforbindelser, særlig lavere alkylhalogenider, særlig metylendiklorid (= metylenklorid) eller etylendiklorid; eller mer spesielt aromatiske løsemidler, særlig naftalen eller (foretrukket) benzen eller naftalin eller (foretrukket) benzensubstituert med en eller flere, foretrukket en til tre deler utvalgt fra gruppen som består av lavere alkyl, særlig metyl, etyl eller isopropyl, lavere alkoksy, særlig metoksy eller etoksy, halogen, særlig fluor, klor, brom eller jod, nitro og lavere alkoksy-laverealkyl, særlig etoksymetyl; særlig toluen, etyl-benzen, xylen, særlig o-, m- eller p-xylen, mesitylen, pseudo-kumen, hemelliten, kumen, isopropyl-toluen, fenylhalogenider, særlig fluorbenzen, klorbenzen, brombenzen eller jodbenzen, lavere alkoksybenzener, særlig etoksybenzen eller metoksybenzen, eller lavere alkoksy-lavere alkylbenzener, særlig etoksymetylbenzen (benzyleter); eller en hvilken som helst blanding av to eller flere, for eksempel 2 til 4 av disse løsemidlene; mest foretrukket er lavere alkyl-benzener, særlig etyl-benzen, xylen, særlig o-, m- eller p-xylen, mesitylen, pseudo-kumen, hemelliten, kumen, isopropyl-toluen, og mest spesielt toluen.

Begrepet "svakt polart eller apolart løsemiddel" inkluderer også blandinger av to eller flere av løsemidlene beskrevet tidligere og senere, for eksempel av 2 til 4 slike løsemidler.

Prefikset "lavere" indikerer alltid at det korresponderende navngitte radikalet inneholder foretrukket opp ril maksimum 7 karbonatomer, særlig 4 karbonatomer, og er forgrenet eller uforgrenet. Lavere alkyl kan for eksempel være uforgrenet eller forgrenet en eller flere ganger, og er for eksempel metyl, etyl, propyl slik som isopropyl eller n-propyl, butyl slik som isobutyl, sec-butyl, tert-butyl eller n-butyl, eller også pentyl slik som amyl eller n-pentyl.

Halogen er foretrukket jod, brom, klor eller fluor.

Et hydrokarbon er foretrukket en organisk forbindelse som har 4 til 32, mer foretrukket 4 til 20, enda mer foretrukket 6 til 16 karbonatomer og kan være alifatisk, for eksempel et lineært, forgrenet eller cyklisk mettet alkan, for eksempel cykloheksan, en lineær, forgrenet eller cyklisk (ikke-aromatisk) organisk forbindelse med en eller flere dobbel-og/eller trippelbindinger, eller et aromatisk hydrokarbon, hvor sistnevnte er usubstituert eller substituert med en eller flere, for eksempel opp til tre, substituenter utvalgt fra gruppen som består av lavere alkyl, særlig metyl, etyl eller isopropyl, lavere alkoksy, særlig metoksy eller etoksy, halogen, særlig fluor, klor, brom eller jod, nitro og lavere alkoksy-laverealkyl, særlig etoksymetyl; foretrukket av en til tre lavere alkyldeler.

En alkohol er foretrukket et hydroksy-lavere alkan, særlig metanol, etanol eller n- eller isopropanol.

En harpiks er særlig en syntetisk harpiks, foretrukket en harpiks basert på styren og divenylbenzenkopolymerer, mer foretrukket Amberlite XAD-4 eller foretrukket Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] eller Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milano]. Naturligvis gjelder at en harpiks fra hvilken et epotilon eller epotiloner skal desorberes ifølge oppfinnelsen, har epotiloner ikke-kovalent i kontakt med den (for eksempel reversibelt bundet til den eller absorbert til den). Med andre ord, der begrepet "harpiks" anvendes, er det ment å bety "harpiks som har en eller flere epotiloner i kontakt med den, særlig reversibelt bundet eller adsorbert til den ".

I et foretrukket aspekt av oppfinnelsen angår oppfinnelsen en fremgangsmåte som innbefatter en desorpsjon fra en harpiks med et svakt polart eller apolart løsemiddel som beskrevet ovenfor eller nedenfor, som innbefatter et hvilket som helst ytterligere rensingstrinn som er ønsket eller påkrevet for å komme til de respektive epotilonene, særlig epotilon A og mest spesielt epotilon B, i ren form, foretrukket de som er beskrevet som foretrukne ifølge oppfinnelsen.

Opparbeiding av epotilonene foregår ved reaksjonen eller fremgangsmåten som fører til et reaksjonsprodukt som innbefatter epotiloner som skal opparbeides som er isolert (i) enten fra kjemiske reaksjonsblandinger etter løsning i et passende polart vandig medium, eller (ii) mer foretrukket fra supernatanten (for eksempel et cyklodekstrin som inneholder en som beskrevet i WO 99/42602) av et dyrkningsmedium med mikroorganismer som gir epotiloner ved å separere en kultur i den flytende fasen (for eksempel sentrifugat eller filtrat) og fast fase (celler), særlig ved hjelp av filtrering eller sentrifugering (rørsentrifuge eller separator).

Denne forhåndsbehandlingen blir deretter foretrukket fortsatt ved direkte sammenblanding av løsningen ((i)) eller væskefasen ((ii)) med en harpiks, særlig en syntetisk harpiks, særlig en harpiks basert på styren og divinylbenzenkopolymerer som matriks (heretter referert til også kort som polystyrenharpiks), slik som Amberlite XAD-16 eller Diaion HP-20 (foretrukket i et forhold sentrifugat:harpiksvolum på ca.l0:l til 100:1, foretrukket ca. 50:1). Etter en kontaktperiode på foretrukket 0,25 til 50 timer, særlig 0,8 til 22 timer, blir harpiksen separert, for eksempel ved filtrering, sedimentering eller sentrifugering. Hvis påkrevet, blir harpiksen vasket etter adsorpsjon med et sterkt polart løsemiddel, foretrukket med vann.

Deretter starter den foretrukne fremgangsmåten for opparbeiding ifølge oppfinnelsen: Desorpsjon av epotilonene (som følgelig utgjør et svært foretrukket aspekt av foreliggende oppfinnelse) blir utført med laverealkylhalogenider, særlig metylendiklorid eller etylendiklorid, eller mer foretrukket aromatiske løsemidler, særlig naftalen eller (foretrukket) benzen, eller naftalin eller (foretrukket) benzen substituert med en eller flere, foretrukket en til tre deler utvalgt fra gruppen som består av lavere alkyl, særlig metyl, etyl eller isopropyl, lavere alkoksy, særlig metoksy eller etoksy, halogen, særlig fluor, klor, brom eller jod, nitro og lavere alkoksy-lavere alkyl, særlig etoksymetyl; mest foretrukket toluen. Ekstraksjonstrinnet kan gjentas en eller flere ganger, foretrukket 0 til 3 ganger, særlig en gang, for å oppnå mer fullstendig desorpsjon hvis nødvendig eller ønsket.

\

I

Opparbeidingen av (i tilfelle gjentagende ekstraksjon kombineres) løsningene av desorberte epotiloner således oppnådd fortsetter foretrukket med fjerning av løsemidlet anvendt for desorpsjonen fra de resulterende løsningene ved fordamping (destillasjon), foretrukket ved hjelp av konsentrering i en reaktor og deretter rotasjonsfordamping under vakuum.

Deretter finner ytterligere behandling sted ved anvendelse av de følgende trinn, hvor rensetrinnet som skjer ved hjelp av omvendtfase kromatografi med eluering med et nitril er obligatorisk, mens de andre trinnene er valgfrie: - krystallisering av epotilonene etter desorpsjon; særlig for krystallisering av epotilon B, en blanding av en alkohol og et hydrokarbon, særlig en lavere alkohol og et cyklisk alifatisk hydrokarbon med 3 til 10 ringatomer, mest spesielt metanol og cykloheksan (foretrukket i et v/v forhold på 1:10 til 10:1, særlig på 1:3 til 3:1), tilsettes. Tilsetning av vann fører til fastfaseseparasjon, og alkoholfasen fordampes til tørrhet, for eksempel ved hjelp av en rotasjonsfordamper under vakuum. Det resulterende ekstraktet som innbefatter epotilon B blir deretter krystallisert fra en passende løsemiddelblanding, særlig fra en alkohol/cyklisk alifatisk hydrokarbonblanding, mest foretrukket isopropanol/cykloheksan, foretrukket i et v/v forhold på 1:10 til 10:1, mer foretrukket 1:6 til 6:1, mest foretrukket 1:6 til 1:4; - (obligatorisk) separasjon av epotiloner ved omvendtfase kromatografi etter opptak i et passende løsemiddel, særlig en blanding av et nitril og vann, foretrukket acetonitirl/vann, i et foretrukket v/v forhold på 1:10 til 10:1, særlig 1:3 til 1:1, og eluering med en blanding av nitril og vann, foretrukket ved at kromatografien utføres på kolonne med omvendtfase materiale, som tilsettes hydrokarbonkjeder, slik som hydrokarbonkjeder som inneholder 18 karbonatomer, særlig et RP-18 materiale, og en eluent innbefatter et nitril, særlig et lavere alkylnitril, spesielt acetonitril, anvendes, spesielt en blanding av nitril/vann anvendes, særlig en blanding av acetonitirl/vann, foretrukket i et forhold mellom nitril og vann på ca. 1:99 til 99:1, foretrukket mellom 1:9 og 9:1, for eksempel mellom 2:8 og 7:3, for eksempel 3:7 eller 4:6; og fjerning av nitrilet fra det oppsamlede epotilonet (særlig epotilon A eller mest spesielt epotilon B) som innbefatter fraksjoner ved fordamping (destillasjon); hvis ønskelig, blir det gjenværende vannet med epotilonet deretter ekstrahert med en

<\>

ester, særlig et lavere alkyl-lavere alkanoat, foretrukket isopropylacetat, med etterfølgende fordamping (foretrukket først i en reaktor, deretter i en rotasjonsfordamper under vakuum) av epotilonet som inneholder esterfase til tørrhet; (hvis ønskelig, kan utgangsepotilonløsningen splittes og separeres i mer enn en omvendtfase separat kjøring;)

- kun hvis påkrevet (for eksempel som et alternativ til krystallisering etter desorpsjon) adsorpsjonskromatografi, særlig ved tilsetning til en kolonne av silikagel og eluering med et passende løsemiddel eller løsemiddelblanding, særlig en blanding av ester/hydrokarbon, for eksempel lavere alkylalkanoat / C4-Cio-alkan, særlig etyl eller isopropylacetat / n-heksan, hvori forholdet mellom esteren og hydrokarbonet foretrukket er i området 99:1 til 1:99, foretrukket 10:1 til 1:10, for eksempel 4:1: - og til slutt rekrystallisasjon, for eksempel fra passende løsemidler eller løsemiddelblandinger, som for eksempel består av estere, ester/hydrokarbonblandinger eller alkoholer, særlig etyl eller isopropylacetattoluen 1:10 til 10:1, foretrukket 2:3 (epotilon A) eller metanol eller etylacetat (epotilon B); - i hvilken prosess, hvis nødvendig eller ønskelig, mellom hvert trinn anvendes, de resulterende løsningene eller suspensjonene konsentreres, og/eller væske og faste komponenter separeres fra hverandre, særlig ved sedimentering, filtrering eller sentrifugering av løsningene/suspensjonene. De mer presise definisjonene nevnt ovenfor og nedenfor kan foretrukket anvendes i de enkelte trinnene

ovenfor.

Et foretrukket aspekt ved foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for isolering av epotiloner adsorbert på en syntetisk harpiks, særlig epotilon eller mest særlig epotilon B, hvilken fremgangsmåte innbefatter

(i) desorpsjon av epotilonene fra nevnte syntetiske harpiks med et svakt polart eller apolart løsemiddel, spesielt med lavere alkylhalogenider, særlig metylendiklorid eller etylendiklorid, eller mer foretrukket aromatiske løsemidler, særlig naftalen eller (foretrukket) benzen, eller naftalin eller (foretrukket) benzen substituert med en eller flere, foretrukket en til tre deler utvalgt fra gruppen som består av lavere alkyl, særlig metyl, etyl eller isopropyl, lavere alkoksy, særlig metoksy eller etoksy, halogen, særlig fluor, klor, brom eller jod, nitro og lavere alkoksy-lavere alkyl, særlig etoksymetyl;

mest foretrukket toluen; eller i et bredere aspekt av oppfinnelsen en blanding av to eller flere slike løsemidler; og (ii) separasjon av epotiloner ved omvendtfase kromatografi etter at de er tatt opp i et passende løsemiddel, særlig en blanding av et nitril og vann, foretrukket acetonitril/vann, i et foretrukket v/v forhold på 1:10 til 10:1, særlig 1:3 til 1:1, og eluering med en blanding av nitril og vann, foretrukket kjennetegnet ved at kromatografien utføres på kolonne med omvendtfase materiale, særlig et RP-18 materiale, som fylles med hydrokarbonkjeder, slik som hydrokarbonkjeder som inneholder 18 karboner, og en eluent omfattende et nitril, særlig et lavere alkylnitril, spesielt acetonitril, anvendes, spesielt en blanding av nitril/vann anvendes, særlig en blanding av acetonitril/vann, foretrukket i et forhold mellom nitril og vann på ca. 1:99 til 99:1, foretrukket mellom 1:9 og 9:1, for eksempel mellom 2:8 og 7:3, for eksempel 3:7 eller 4:6.

I et ytterligere aspekt medfører fremgangsmåten i siste avsnitt som starter med trinn (i) og som innbefatter trinn (ii) ytterligere et hvilket som helst ytterligere rensetrinn ønskelig eller påkrevet for å komme til de respektive epotilonene, særlig epotilon A og mest særlig epotilon B, i ren form, foretrukket de som er beskrevet som

foretrukket ifølge oppfinnelsen.

Preparering for opparbeiding blir foretrukket utført som følger: Adsorpsjon av epotilonene, særlig fra kjemiske reaksjonsblandinger eller mer foretrukket fra supernatanten av mikroorganismekulturene, kan oppnås som beskrevet i WO 99/42602 eller i analogi dertil; kort fortalt blir epotilonene funnet i sentrifugatet, som deretter blandes direkte med syntetisk harpiks, særlig en styren/divinylbenzen kopolymerharpiks, slik som Amberlite XAD-16 eller Diaion HP-20 (foretrukket i et forhold sentrifugat:harpiksvolum på ca. 10:1 til 100:1, foretrukket ca. 50:1) og røres i et blandeapparat. I dette trinnet blir epotilonene overført til harpiks. Etter en tilstrekkelig adsorpsjonsperiode, for eksempel kontaktperiode på ca. 0,2 til 10 timer, blir harpiksen separert ved sentrifugering eller filtrering. Adsorpsjon av epotilonene på harpiksen kan også utføres i en kromatografisk kolonne, ved å plassere harpiksen i kolonnen og kjøre sentrifugatet over harpiksen. Etter adsorpsjon blir harpiksen vasket med vann.

De foretrukne prosessene i forbindelse med oppfinnelsen starter og fortsetter deretter som følger: Desorpsjon av epotilonene fra harpiksen blir foretrukket utført med et svakt polart eller apolart løsemiddel anvendt ifølge oppfinnelsen, særlig et som beskrevet som foretrukket ovenfor eller nedenfor, særlig metylenklorid eller mest foretrukket toluen. Løsemidlet blir deretter fjernet så langt som mulig, foretrukket til et tørt residu er oppnådd. Hvis hensiktsmessig, blir residuet tatt opp i en alkohol/hydrokarbonblanding, særlig i metanol/cykloheksan, foretrukket i forhold som beskrevet ovenfor, i et relativt lavt volum. Alkoholfasen fordampes, foretrukket til tørrhet, og alkoholekstraktet blir deretter krystallisert fra en blanding av en alkohol, særlig iso-propanol, og et hydrokarbon, særlig cykloheksan, foretrukket i et forhold som beskrevet ovenfor. Det resulterende faste krystalliserte materialet blir deretter løst i en nitril/vannblanding, foretrukket som beskrevet ovenfor, særlig en 2:3 (v/v) acetonitril/vannblanding, og den resulterende innmatingsløsningen helles, hvis påkrevet, etter oppsplitting i mer enn en kjøring, på en preparativ omvendt fasekolonne. Eluering med nitril/vann, særlig som akkurat nevnt, følger. (Aceto-)nitrilet til de resulterende fraksjonene som inneholder epotilon, særlig epotilon A og mest foretrukket epotilon B, fjernes ved fordamping (destillasjon), og den resulterende vannfasen ekstraheres med en ester, særlig isopropylacetat. Esterekstraktet blir deretter fordampet, foretrukket til tørrhet, og deretter blir det resulterende materialet rekrystallisert, for eksempel en epotilon A fraksjon krystalliseres direkte fra en ester/hydrokarbonblanding, for eksempel etylacetat:toluen = 2:3, og epotilon B fraksjonen fra en ester, særlig etylacetat eller foretrukket fra en alkohol, særlig metanol.

Spesielt med toluen har det blitt observert en svært selektiv eluent (desorbant) som muliggjør å oppnå et omtrent 100% utbytte i halve desorpsjonstiden som er nødvendig med isoproanol anvendt i WO 99/42602. Overraskende økes mengden desorberte epotiloner, for eksempel til 130%, etter desorpsjon med toluen sammenlignet med isopropanoldesorpsjon. (Selv om dette ved første øyekast synes umulig fra et teoretisk synspunkt, illustrerer det på en god måte en hovedfordel ved foreliggende oppfinnelse: Resultatet er relatert til analysen av tilsatt harpiks. Idet analysen anvender isopropanol for desorpsjon, må en ufullstendig desorpsjonsprosedyre tas som basis som opprinnelig fører til lavere analyseverdier som nå viser seg å være villedende.) Epotilonblandingen kan (uten eller med etterfølgende krystallisering) anvendes direkte på omvendtfase kolonne. Prosessen blir svært robust med hensyn til løsemiddelmengdene, rørehastighetene og temperaturene. Mens for alkoholer (for eksempel etanol eller isopropanol) under røring kan en to-fase desorpsjon vise seg hvor en første mengde epotilonholdig materiale desorberes i en første tidsperiode (forklart ved porestørrelsesfordelingen som finnes i polystyren XAD-16 som har to fordelingsmaksima), en andre mengde etter en ytterligere tidsperiode, og denne uønskede oppførselen finnes ikke med toluen eller også diklormetan hvor alt materiale desorberes allerede i første tidsperiode. Under sammenlignbare betingelser er fordampingsresiduet i tilfellet for isopropanol for epotilonene A og B i et eksempel funnet å være 40 g, med metylenklorid 3,3 g, i tilfellet toluen kun 0,9 g, med for eksempel 17-18 g-% epotilon B etter desorpsjon fra styren/divinylbenzen kopolymerharpikser oppnådd fra cyklodekstrin-innbefattende dyrkningssupernatanter som beskrevet i WO 99/42602, hvilket indikerer langt høyere renhet. Mens toluen har de mest signifikante fordelene, har diklormetan som en fordel enklere fjerning på grunn v lavere kokepunkt.

Separasjonen av epotilon A og B kan også oppnås ved å utføre kromatografien beskrevet heri i dens simulerte bevegelige sjikt (SMB) tilnærming. SMB-kromatografier har bred anvendelse ved separasjon av binære blandinger, for eksempel separasjonen av racemater på kirale stasjonære faser, for eksempel SORBEX-prosessene innen petrokjemisk industri, som Parex eller Molex, eller SAREX-prosessen i sukkerindustrien. Sammenlignet med batch-kromatografi gir SMB-kromatografien fordelen med en kontinuerlig motstrømsenhetsoperasjon som fører til økt produktivitet og redusert mobilfasekonsumpsjon. Flere systematiske prosedyrer for fremgangsmåten utviklet for SMB-kromatografier er kjente for fagmannen. Slike prosedyrer er beskrevet for eksempel av R.-M. Nicourd, M. Bailly, J. Kinkel, R.M. Devant, T.R.E. Hampe og E. Kåusters i "Proceedings of the Ist European Meeting on Simulated Moving Bed Chromatography", (1993), ISBN 2-905-267-21-6, s. 65-88; E. Kusters, G. Gerber og F.D. Antia, "Chromatographia", 40 (1995) 387; T. Proll og E. Kusters, "J. Chromatogr. A", 800 (1998) 135; eller C. Heuer, E. Kusters, T. Plattner og A. Seidel-Morgenstem, "J. Chromatogr. A" 827 (1998) 175.

Basisparametrene for separasjonen av epotilon A og B med SMB-kromatografi kan tas direkte fra vanlig LC-separasjon. Foretrukket blir omvendtfase silikagel (RP 18) brukt som stasjonærfase og vann/acetonitirlblandinger som mobilfaser. Sluttsettet av strømningshastigheter (for individuelle SMB-soner og omkoblingstid, respektivt) kan tas enten fra et enkelt strømningsskjema som utviklet av E. Kusters, et al. i "Chromatographia", 40 (1995) 398 eller etter nøyaktig estimering av adsorpsjonsisotermen som fremsatt i "J. Chromatogr. A", 800 (1998) 135 og "J. Chromatogr. A", 827 (1998) 175. Opparbeidingen av ekstraktet og raffinatstrømmene kan igjen utføres som beskrevet for vanlig LC-separasjon.

Oppfinnelsen angår mest foretrukket prosesser og fremgangsmåter beskrevet i de etterfølgende eksempler.

EKSEMPLER

Følgende eksempler tjener til å illustrere oppfinnelsen.

Forsiktighet:

Ved håndtering av epotiloner, må hensiktsmessig beskyttende tiltak gjøres, hvis nødvendig, i lys av deres høye toksisitet.

Eksempel 1: Opparbeidingsprosedyre for epotilon B

Desorpsjon av 591,7 kg tilsatt harpiks (styren/divinylbenzenkopolymerharpiks XAD-16 tilsatt epotiloner A og B fra et dyrkningsmedium) utføres ved røring av harpiksen i to porsjoner hver med 720 liter toluen i fire porsjoner i ca. 8 timer. Separasjon av toluenfasen fra harpiksen finner sted ved anvendelse av et sugefilter. De kombinerte toluenfasene vaskes i to porsjoner med hver 2501 vann. Etter faseseparasjon blir toluenekstraktet konsentrert i en 1000 liter reaktor til ca. 20-40 liter og deretter konsentrert til tørrhet i en rotasjonsfordamper under vakuum. Resultatet er et toluenekstrakt på 4,095 kg som inneholder 209 g epotilon B. Toluenekstraktet løses i 16,5 liter metanol og 24,5 liter cykloheksan. Etter tilsetning av 0,8 liter vann finner faseseparasjon sted umiddelbart. Metanolrfaksjonen fordampes til tørrhet i en rotasjonsfordamper under vakuum, hvilket gir 1,025 kg fordampet residu som inneholder 194 g epotilon B. Metanolekstraktet blir deretter krystallisert i en løsemiddelblanding som består av 2,05 liter isopropanol og 10,25 liter cykloheksan, hvilket gir 0,4 kg krystalliset materiale som inneholder 184 g epotilon B. Krystallene løses i 3,2 liter acetonitril/vann = 2/3 (v/v) og den resulterende fødeløsningen overføres i tre separate kjøringer til en preparativ omvendtfase kolonne (25 kg RP-18 sfærisk silikagel, YMC-Gel ODS-A 120; 5-15 um; Waters Corp., Milford, Massachusetts, USA). Elueringen utføres med acetonitril/vann = 2/3 (v/v) som mobil fase med en strømningshastighet på 2,2 liter/min.; retensjonstid epotilon A = 77-96 min., retensjonstid for epotilon B 96-119 min. Fraksjoneringen overvåkes med en UV-detektor ved 250 nm. Acetonitrilet av kombinerte epotilon B-fraksjoner (av de tre kjøringene) blir destillert fra og gjenværende vannfase ekstraheres med 504 liter isopropylacetat. Isopropylacetatekstraktet konsentreres i en 630 liter reaktor til ca. 20-40 liter og blir deretter konsentrert til tørrhet i en rotasjonsfordamper under vakuum. Vekten av det fordampede residuet av epotilon B fraksjoner er 170 g og har et innhold på 98,4% ifølge HPLCV (ekstern standard). Det resulterende materialet blir til slutt krystallisert i 2,89 liter metanol ved 0-5°C hvilket gir 150 g epotilon B rent krystallisat.

Smeltepunkt: 124-125°C;

'H-NMR data for epotilon B (500 MHz-NMR, løsemiddel: DMS-d6. Kjemisk forskyvning 5 i ppm relativt til TMS.S = singlere, d = dublett, m = multiplett):

Eksempel 2: Sammenligning av forskjellige desorpsjonsprosesser for epotilon B fremstilling: 360 ml hver av en vandig suspensjon av styren/divinylbenzenkopolymerharpiksen XAD-16 tilsettes epotilon A og B fra en kultur av myksobakterier ved fremgangsmåten beskrevet i WO 99/42602 (som korresponderer til 194 g våt Amberlite® XAD-16) ekstraheres med løsemidlene og under betingelsene nevnt i den etterfølgende tabell i en rørt (felles labankerrører) glassreaktor med en sintrert fritte i bunnen (hjemmelaget fastfase batchreaktor, indre diameter 10 cm x 20 cm lengder, "Rører/Frit" heretter).

Tabell 1: Sammenligning av desorpsjonsfremgangsmåter for fremstilling av epotilon B

Startharpiks (harpiks med absorbert epotilon):

- #1001 teoretisk tilsetning 70 mg pr. 360 ml harpikssuspensjon (som korresponderer til 70 mg pr. 194 g våt XAD-16) - #1003 teoretisk itlsetning 114 mg pr. 360 ml harpikssuspensjon (som korresponderer til 114 mg pr. 194 g våt XAD-16)

f Tørkeovn (høyvakuum) over weekenden

g Muligens et resultat av, angående tiden som anvendes, generøs første

faseseparasjon

h Utvinning: 1. ekstraksjon = 700 ml; 2. ekstraksjon = 660 ml; 3. ekstraksjon =

680 ml

i Utvinning: 1. ekstraksjon = 670 ml; 2. ekstraksjon = 710 ml; 3. ekstraksjon =

720 ml

j Nødvendighet av vanntilsetning har ikke blitt bekreftet k Forenkler fjerning av vann opprinnelig tilstede (XAD-16 dekkes med vann idet

det anvendes)

1 I lys av resultatene av variant 8,11 og 12 og elueringskurvene for alle eksperimentene med toluen, kan anvendelsen av mindre mengder harpiks ikke ekskluderes.

"Erl./mag. St." står for magnetisk røring i en Erlenmeyer-kolbe "metylenklorid" ("Metylenkl.") er diklormetan

"Stir./Frit" står for Rører/Frit

"RT" står for romtemperatur

Fra disse eksperimentene og ytterligere data kan det avledes at, sammenlignet med isopropanol, gir metylenkloridekstraksjon bedre selektivitet, en kortere ekstraksjonstid (ca. med en faktor 2), raskere løsemiddeldestillasjon (kokepunkt til metylenklorid er ca. 40°C, og for isopropanol 81-83°C), den tidsintensive og svært problematiske etylacetat/vannfaseseparasjonen er ikke lenger påkrevet, den andre løsemiddeldestillasjonen er ikke lenger påkrevet, slik at et lavere antall prosesstrinn, som resulterer i lavere kontaminasjonsrisiko, bedre og sikrere håndtering, kan anvendes; opparbeiding i halve volumet (for eksempel i 10001 reaktorer i stedet for 20001 reaktorer) er mulig; produktet epotilon B har en bedre renhetsprofil (færre biprodukter med sammenlignbar polaritet som epotilon B), og fordampingsresiduet verken spruter eller skummer som i tilfellet etylacetatekstraksjon. For desorpsjon med toluen blir et høyere utbytte oppnådd sammenlignet med isopropanolekstraksjon (ca. 100 i stedet for ca. 80%), bedre selektivitet kan observeres (med isopropanol, ca. ti ganger mengden biprodukter blir desorbert), ekstraksjonstiden forkortes betydelig (med en faktor på ca. 3), den vanskelige filtreringen etter desorpsjon med isopropanol forenkles (isopropanolekstraksjonen var vanskelig å implementere i større skala), den andre løsemiddeldestillasjonen er ikke lenger påkrevet, opparbeiding er mulig i mindre reaktorer (igjen, for eksempel, er det mulig å anvende en 10001 i stedet for en 20001 reaktor), det er mulig å utelukke silikagelkromatografi (fordampingsresiduet etter desorpsjon inneholder allerede ca. 40% av en epotilon A/B-blanding), og fordampingsresiduet etter desorpsjon viser ikke lenger skumming og spruting som observeres for residuet fra etylacetatekstraksjon.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for å desorbere epotiloner A, B, D, E og/eller F fra en harpiks, karakterisert ved at fremgangsmåten innbefatter anvendelsen av et svakt polart eller apolart løsemiddel valgt fra gruppen bestående av laverealkylhalogenider og aromatiske løsemidler eller en blanding av to eller flere slike, hvor forstavelsen "lavere" betyr at resten inneholder opp til 7 karbonatomer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at epotilonene som absorberes er epotilon A eller epotilon B.

3. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at harpiksen er en syntetisk harpiks.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at harpiksen er en syntetisk harpiks basert på styren/vinylbenzenkopolymerer.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at et aromatisk løsemiddel som anvendes er utvalgt fra gruppen som består av naftalen, benzen, eller naftalen eller benzen substituert med en eller flere deler utvalgt fra gruppen som består av lavere alkyl, lavere alkoksy, halogen, nitro og lavere alkoksy-lavere alkyl, hvori prefikset "lavere" betyr at radikalet inneholder opp til 7 karbonatomer.

6. Fremgangsmåte for å isolere epotiloner A, B, D, E og/eller F absorbert til en syntetisk harpiks, karakterisert ved at fremgangsmåten innbefatter (v) desorpsjon av epotilonene fra nevnte syntetiske harpiks med et svakt polart eller apolart løsemiddel valgt fra gruppen bestående av laverealkylhalogenider og aromatiske løsemidler eller en blanding av to eller flere slike løsemidler, hvor forstavelsen 'lavere" betyr at resten inneholder opp til 7 karbonatomer. og (vi) separasjon av epotilonene med omvendtfase kromatografi etter at de er tatt opp i et egnet løsemiddel og eluert med en blanding av nitril og vann.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at den ytterligere innbefatter et eventuelt ytterligere rensetrinn ønsket eller påkrevet for å oppnå de respektive epotilonene i ren form.

8. Fremgangsmåte for opparbeiding av epotiloner A, B, D, E og/eller F fra en reaksjonsblanding, karakterisert ved at nevnte prosess innbefatter - desorpsjon av epotilonene med et svakt polart eller apolart løsemiddel valgt fra gruppen bestående av laverealkylhalogenider og aromatiske løsemidler eller en blanding av to eller flere slike løsemidler, hvor desorpsjonstrinnet kan gjentas for å oppnå mer fullstendig desorpsjon; - fjerne løsemidlet som anvendes for desorpsjon fra de resulterende løsningene ved fordamping; - eventuelt krystallisering av epotilonene etter desorpsjon; særlig for krystallisasjon av epotilon B, tilsette en blanding av en alkohol og et hydrokarbon, og fordampe alkoholfasen til tørrhet, og krystallisere epotilon B fra en passende løsemiddelblanding, - (obligatorisk trinn) separere epotilonene med omvendtfase kromatografi ved å ta opp residuet fra foregående trinn i et passende løsemiddel, og eluere med en blanding av nitril og vann, og fjerne nitrilet fra det oppsamlede epotilonet som innbefatter fraksjoner ved fordamping og hvis ønskelig, blir deretter det gjenværende vannet med epotilonene ekstrahert med en ester med etterfølgende fordamping av epotilonene som inneholder esterfasen til tørrhet; - eventuelt ytterligere rensing ved adsorpsjonskromatografi, - og til slutt rekrystallisere og rense epotilonet fra passende løsemidler eller løsemiddelblandinger; i hvilken prosess, hvis nødvendig og/eller ønskelig, blir mellom hvert trinn som anvendes, de resulterende løsningene eller suspensjonene konsentrert, og/eller væske- eller faststoffkomponentene blir separert fra hverandre, hvori prefikset "lavere" betyr at radikalet inneholder opp til 7 karbonatomer.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at desorpsjon av epotilonene fra harpiksen utføres med et svakt polart eller apolart løsemiddel valgt fra gruppen bestående av laverealkylhalogenider og aromatiske løsemidler eller en blanding av to eller flere løsemidler, løsemidlet fjernes deretter så langt som nødvendig, foretrukket til et tørt residu oppnås, hvis hensiktsmessig, blir residuet tatt opp i en alkohol/hydrokarbonblanding i et relativt lavt volum; alkoholfasen fordampes, foretrukket til tørrhet, og alkoholekstraktet blir deretter krystallisert fra en blanding av en alkohol og et hydrokarbon, hvor det resulterende faste krystalliserte materialet deretter løses i en nitril/vannblanding som beskrevet i krav 8, særlig en 2:3 (v/v) acetonitril/vannblanding, og den resulterende innmatingsløsningen blir helt, hvis påkrevet, etter splitting i flere enn en kjøring, på den preparative omvendtfase kolonnen; fulgt av eluering med nitril/vann; deretter fjerning av nitrilet av de resulterende fraksjonene som inneholder epotilon ved fordamping og den resulterende vannfasen ekstraheres med en ester; nevnte esterekstrakt blir deretter fordampet og deretter blir det resulterende materialet rekrystallisert; hvori prefikset "lavere" betyr at radikalet inneholder opp til 7 karbonatomer.

10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 6, 8 eller 9, karakterisert ved at separasjonen av epotilon A og B oppnås ved simulert bevegelig sjikt (SMB) kromatografi.

11. Anvendelse av et svakt polart eller apolart løsemiddel valgt fra gruppen bestående av laverealkylhalogenider og aromatiske løsemidler eller en blanding av to eller flere slike løsemidler for desorpsjon av epotiloner A, B, D, E og/eller F fra en harpiks, hvori forstavelsen "lavere" betyr at resten inneholder opp til 7 karbonatomer.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor det svakt polare eller apolare løsemidlet valgt fra gruppen bestående av naftalen, benzen eller naftalen eller benzen substituert med en eller flere enheter er valgt fra gruppen bestående av lavere alkyl, lavere alkoksy, halogen, nitro og lavere alkoksy-lavere alkyl; eller en blanding av to eller flere slike \ løsemidler; harpiksen er en syntetisk harpiks; hvori forstavelsen 'lavere" betyr at resten inneholder opp til 7 karbonatomer.