CZ301664B6

CZ301664B6 - Zpusob desorpce a získání epothilonu A, B, D, E a/nebo F a použití slabe polárního nebo nepolárního rozpouštedla pro desorpci epothilonu A, B, D, E a/nebo F z pryskyrice

Info

Publication number: CZ301664B6
Application number: CZ20031565A
Authority: CZ
Inventors: Küsters@Ernst; Unternährer@Heinz
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2010-05-19
Also published as: EP1345944B1; CN1263761C; GB0029895D0; PE20020568A1; PL361884A1; DE60109814D1; MXPA03005097A; DK1345944T3; ZA200304296B; PL209406B1; SK287356B6; NO329164B1; HUP0302579A3; US20050288514A1; HK1059618A1; CZ20031565A3; AU2002224936B2; AU2493602A; HUP0302579A2; NZ526197A

Abstract

Rešení se týká zpusobu desorpce epothilonu A, B, D, E a/nebo F z pryskyrice, pri kterém se desorpce provádí slabe polárním nebo nepolárním rozpouštedlem zvoleným ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidu a aromatických rozpouštedel a smesi dvou nebo více takových rozpouštedel, pricemž prívlastek "nižší" znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomu, jakož i použití uvedeného slabe polárního nebo nepolárního rozpouštedla pro desorpci epothilonu A, B, D, E a/nebo F z pryskyrice.

Description

Způsob desorpce a získání epothilonů A, B, D, £ a/nebo F a použiti slabí polárního nebo nepolárního rozpouštědla pro desorpci epothilonů A, B, D, E a/nebo F z pryskyřice

Oblast techniky

Výnález se týká způsobu desorpce a získání epothilonů A, B, D, E a/nebo F a použití slabě polárního nebo nepolárního rozpouštědla pro desorpci epothilonů A, B, D, E a/nebo F z pryskyřice.

Dosavadní stav techniky

Epothilony A a B představují novou skupinu cytotoxických účinných látek stabilizujících mikrotubuly (o tom víz Gerth K. a kol., J. Antibiot. 49, 560—3 (1966)) obecného vzorce

ve kterém R znamená atom vodíku (epothilon A) nebo methylovou skupinu (epothilon B).

Po prvním uvedení těchto epothilonů v odborné literatuře (viz WO 93/10121) bylo popsáno několik způsobů syntézy a výroby, jak samotných epothilonů, tak i jejich četných derivátů (všechny tyto látky budou dále společně uváděny jako “epothilony“), například těch, které jsou popsány v následujících patentových dokumentech:

WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/47584, WO 00/00485, WO 00/23452,

WO 99/03848, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461, WO 99/65913, WO 98/38192,

WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252,

WO 99/67253, WO 00/31247, WO 99/42602, WO 99/28324, WO 00/50423, WO 00/39276,

WO 99/27890, WO 99/54319, WO 99/54318, WO 99/02514, WO 99/59985, WO 00/37473,

WO 98/08849, US 6 043 372, US 5 969 145, WO 99/40047, WO 99/01124 a WO 99/43653.

Kromě epothilonů A a epothilonů B také zejména epothilony D a E popsané v patentovém dokumentu WO 97/19061 a epothilony E a F popsané v patentovém dokumentu WO 98/22461, jakož i epothilony popsané v patentovém dokumentu WO 99/02514 mají zajímavé vlastnosti.

Jako příklad terapeutického využití epothilonů popisuje mezinárodní patentová přihláška WO 99/43320 četná podání epothilonů jako činidel proti proliferačním onemocněním, zejména proti nádorovým onemocněním, přičemž epothilony působí vzhledem k jejich obdobnému mechanizmu účinku srovnatelně jako Taxol, který je dobře známým, na trhu dostupným proti40 rakovinovým činidlem. Mezinárodní patentová přihláška WO 99/39694 popisuje některé specifické formulace epothilonů, zejména epothilonů A a epothilonů B.

Epothilony a zejména epothilon A a nejvýhodněji epothilon B nabízejí četné výhody ve srovnání s již zavedenými postupy léčení, zejména v případech, kdy se nádory staly odolnými vůči Taxo-1 CZ 301664 B6 lové terapii. Proto je žádoucí nalezení syntézy epothilonů umožňující připravit epothilony ve větších produkčních objemech, které by uspokojily rostoucí poptávku po epothilonech.

Nej účinnější produkční způsoby až dosud obsahují alespoň některé biosyntetické stupně a izolaci epothilonů z kultivačního prostředí nebo z obdobné reakční směsi.

Z počátku byla v literatuře popsána extrakce přírodních látek pomocí myxobakterií, zejména extrakce epothilonů z buněčného kmene Sorangium Cellulosum Soce90 (uložen pod depozičním číslem 6773 ve sbírce mikroorganizmů German Collection of Microorganisms, viz WO/10121). io Aby se dosáhlo uspokojivé koncentrace přírodních látek, zejména epothilonů, byla dříve ke kultivačnímu prostředí přidávána absorpční pryskyřice na bázi polystyrenu, například Amberlite

XAD-l 180 (Rohm & Haas, Frankfurt, Spolková republika Německo).

Nicméně nevýhodou tohoto způsobu je, že při jeho provádění ve velkém měřítku dochází k čet15 ným problémům, Funkce ventilů je zhoršena přítomností kuliček pryskyřice, dochází k ucpání potrubí a celé zařízení je vystaveno výraznému opotřebení v důsledku mechanického tření, ke kterému dochází při styku kuliček pryskyřice s vnitřními stěnami zařízení. Kuličky pryskyřice jsou porézní, a proto mají velkou vnitřní povrchovou plochu (asi 825 m³). Sterilizace takové pryskyřice představuje problém vzhledem k tomu, že vzduch přítomný v pryskyřici brání kon20 taktu vnitřních stěn se steriíizaČním prostředím. Vzhledem k tomu je nemožné provádět uvedený proces v praxi ve velkém měřítku s využitím přídavku pryskyřice v průběhu kultivace mikroorganismu, který produkuje epothilony.

Z těchto důvodů byl v rámci mezinárodní patentové přihlášky WO 99/42602 nalezen a popsán zlepšený způsob produkce epothilonů, zejména epothilonu A a B. Tento způsob zahrnuje převedení do komplexu epothilonů z kultivačního prostředí mikroorganizmu produkujícího epothilony, přičemž uvedené prostředí takto obsahuje cyklodextriny nebo jiná komplexotvomá činidla, smíšení buněk-prostého kultivačního prostředí (například filtrátu nebo centrifúgátu uvedeného kultivačního prostředí) se syntetickou pryskyřicí, například s pryskyřicí na bázi matricových sty30 ren/divinylbenzenových kopolymerů, jakými jsou například Amberlite XAD-l 6 (Rohm & Haas Germany GMBH, Frakfurt, Spolková republika Německo) nebo Diaion HP-20 (Resindion

S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milán, Itálie), za účelem absorpce epothilonů a desorpci epothilonů z pryskyřice, zejména za použití alkoholu, nej výhodněji isopropanolu. Potom následuje přidání vody k alkoholové fázi, odstranění rozpouštědlové fáze (výhodně odpařením), fázová separace řezultujícího zbytku v přítomnosti esteru, zejména ethylacetátu nebo isopropylacetátu, obvykle molekulární filtrací (gelová chromatografie) vysušené esterové fáze, separace rezultující epothilonové směsi vysokovýkonnou kapalinovou chromatografii s reverzní fází (výhodně za použití eluční soustavy tvořené směsí nitrilu a vody, například směsí acetonitrilu a vody) a případně další čistění fázovou separací v přítomnosti směsi vody a etheru, výhodně následná adsorpční chromatografie na silikagelu k dosažení dalšího oddělení nečistot, a krystalizace/rekrystalizace.

I když je výše popsaný způsob oproti minulým způsobům pokrokový a vhodný pro výrobu epothilonů v průmyslovém měřítku, má tento způsob ještě některé nedostatky.

Tak například, k dosažení dostatečné čistoty se doporučuje provést buď stupeň molekulární filtrace, nebo/a stupeň adsorpční chromatografie na silikagelu. Četné obtíže pramení z realizace fázové separace v přítomnosti esteru, jakým je například ethylacetát, která je (zejména v důsledku dlouhé doby potřebné pro fázovou separaci fáze voda/ester ve velkém průmyslovém měřít50 ku) velmi časově náročná, a z realizace následného odpaření, které je velmi obtížně proveditelné vzhledem k pěnění a prskání odpařované směsi.

To jsou tedy problémy, které mají být řešeny vynálezem, s cílem odstranit pokud možno co nejvíce výše uvedených nedostatků a najít nové a výhodné způsoby izolace epothilonů, zejména epothilonu A a B, potom co došlo k jejich adsorpci na pryskyřici.

-2CL JU1004 BO

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob desorpce epothilonů A, B, D, E a/nebo F z pryskyřice, jehož pod5 stata spočívá v tom, že se desorpce provádí slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem zvoleným ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů, io Výhodně jsou epothilony určenými k desorpci epothilon A nebo epothilon B. Výhodně je pryskyřici syntetická pryskyřice. Výhodně je pryskyřici syntetická pryskyřice na bázi styren/divinylbenzenových kopolymerů. Výhodně se použije aromatické rozpouštědlo zvolené ze souboru sestávajícího z naftalenu, benzenu nebo naftalenu nebo benzenu substituovaného jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z nižší alkylové skupiny, nižší alkoxy15 skupiny, halogenu, nitroskupiny a nižší alkoxy-nižší alkylové skupiny, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů.

Výhodně je předmětem vynálezu způsob izolace epothilonů A, B, D, E a/nebo F adsorbovaných na syntetické pryskyřici, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje (iii) desorpci epothilonů z uvedené syntetické pryskyřice slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem zvoleným ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů; a (iv) separaci epothilonů reverzně fázovou chromatografií potom, co byly epothilony vyjmuty vhodným rozpouštědlem, a eluci směsi nitrilu a vody.

Výhodně způsob podle vynálezu dále zahrnuje čisticí stupně, které jsou žádoucí nebo nezbytné k získání příslušných epothilonů v čisté formě.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob získání epothilonů A, B, D, E a/nebo F z reakční směsi, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje desorpci epothilonů z pryskyřice slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem zvoleným ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů a desorpční stupeň může být opakován k dosažení úplnější desorpce;

odstranění rozpouštědla použitého pro desorpci z rezultuj ících roztoků odpařením;

- případnou krystalizaci epothilonů po desorpci, zejména krystalizaci epothilonů B přidáním směsi nižšího alkanolu obsahujícího až 7 uhlíkových atomů a cyklického alifatického uhlovodíku obsahujícího 3 až 10 kruhových uhlíkových atomů a odpařením alkoholické fáze k suchu a krys40 talizací epothilonů B z vhodné směsi rozpouštědel;

- obligatomí oddělení epothilonů reverzně fázovou chromatografií vyjmutím zbytku z předcházejícího stupně ve vhodném rozpouštědle a eluci směsí nižšího alkylnitrilu, ve kterém nižší alkylový zbytek obsahuje až 7 uhlíkových atomů, a vody a odstraněním nitrilů ze sloučených frakcí obsahujících epothilon odpařením, přičemž se zbylá vodná frakce s epothilonem potom případně extrahuje esterem a esterová fáze obsahující epothilon se následně odpaří k suchu;

případné další čištění adsorpční chromatografií;

a nakonec rekrystalizací vyčištěného epothilonů z vhodných rozpouštědel nebo směsí rozpouštědel;

přičemž v případě, že je to nezbytné a/nebo žádoucí, se mezi použitými stupni rezultuj ící roztoky nebo suspenze zahustí a/nebo se kapalné a pevné složky vzájemně oddělí.

-3CZ 3U1664 B6

Výhodně se desorpce epothilonů z pryskyřice provádí slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem zvoleným ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů, rozpouštědlo se potom případně odstraní, výhodně až k získání suchého zbytku, zbytek se vyjme nezbytným malým objemem směsi alkohol/uhlovodík, alkoholová fáze se odpaří, výhodně k suchu a alkoholový extrakt se potom krystalizuje ze směsi alkoholu a uhlovodíku, rezultující pevný vykrystalizovaný podíl se potom rozpustí ve směsi nitril/voda definované výše, zejména ve směsi acetonitrilu a vody v objemovém poměru 2:3, a rezultující roztok se nalije po případném rozdělení do více než jedné frakce na preparativní io reverzně fázovou kolonu, načež následuje eluce uvedenou směsí nitril/voda, načež se nitril odstraní z rezultujících frakcí obsahujících epothilon odpařením a rezultující vodná fáze se extrahuje esterem, přičemž se uvedený ester potom odpaří a zbylý podíl se následně rekrystalizuje.

Výhodně se separace epothilonů A a B provádí chromatografii se simulovaným pohyblivým is ložem SMB.

Výhodně má slabě polární nebo nepolární rozpouštědlo, zvolené ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů, nebo směs dvou nebo více takových rozpouštědel následující charakteristiky v eluotropní řadě stanovené Snyderem aj.:

Xe = 0,22 až 0,32; Xa = 0,17 až 0,34; a x_n = 0,39 až 0,54, přičemž x_c znamená protonový akceptorový parametr; Xa znamená protonový donorový parametr a x_n znamená dipólový parametr s výhradou, že x<. + X4 + x_rt = 1.

Předmětem vynálezu je rovněž použití slabě polárního nebo nepolárního rozpouštědla zvoleného ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů, pro desorpci epothilonů A, B, D, E a/nebo F z pryskyřice.

Výhodně se slabě polární nebo nepolární rozpouštědlo zvolí ze souboru sestávajícího z naftalenu, benzenu nebo naftalenu nebo benzenu substituovaného jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z nižší alkylové skupiny, nižší alkoxyskupiny, halogenu, nitroskupiny a nižší alkoxy-nižší alkylové skupiny, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až

7 uhlíkových atomů.

S překvapením bylo nyní zjištěno, že pouhé nahrazení alkoholů, použitých jako desorpční rozpouštědla, určitými jinými rozpouštědly (označenými jako slabě polární nebo nepolární rozpouštědla, jak bude specifikováno níže) poskytuje řešení výše uvedených problémů a dosažení dalších výhod, jakými jsou například zlepšená desorpce a vyšší finální výtěžek. Dalšími dodatečnými výhodami jsou i) vyšší selektivita desorpce, i i) vyšší množství desorbovaných epothilonů, což ukazuje na úplnější desorpci, iii) není zapotřebí provést reextrakci esterem (například ethylacetátem) s vysoce problematickou fázovou separací voda/ester, ani následné odpaření etheru; i v) není zapotřebí provést molekulární filtraci a obvykle ani adsorpění chromatografii, v) doba potřebná k desorpci je výrazně zkrácena, vi) provádí se menší počet stupňů, vii) zmenšené riziko kontaminace (což je důležité u vysoce toxických epothilonů) a viii) lepší a bezpečnější pracovní podmínky (což je odvislé od rozpouštědla použitého pro desorpci = extrakci), jakož i ix) po chromatografii s reverzní fázi je zapotřebí odstranit neočekávaně menší množství vedlejších produktů nebo nečistot majících stejnou polaritu jako epothilony, zejména jako epothilon B, což je rovněž odvislé od použitého rozpouštědla. Tyto a další výhody vyplynou z detailů uvedených v nesledujícím detailním popisu vynálezu.

Výraz „epothilony“ se výhodně vztahuje k libovolnému epothilonů nebo epothilonovému derivátu uvedenému v následujících patentových dokumentech:

-4LZ. JUlUQtt DO

WO 99/03848, WO 00/49020, WO 00/49021, WO 00/47584, WO 00/00485, WO 00/23452,

WO 99/03848, WO 00/49019, WO 99/07692, WO 98/22461, WO 99/65913, WO 98/38192,

WO 00/50423, WO 00/22139, WO 99/58534, WO 97/19086, WO 98/25929, WO 99/67252,

WO 99/67253, WO 00/31247, WO 99/42602, WO 99/28324, WO 00/50423, WO 00/39276,

WO99/27890, WO99/54319, WO99/54318, WO99/02514, WO99/59985, WOOO/37473,

WO 98/08849, US 6 043 372, US 5 969 145, WO 99/40047, WO 99/01124 a WO 99/43653, výhodněji k epothilonu A a zejména k epothilonu B, avšak v širším chápání vynálezu také k epothilonům D a E, popsaným v patentových dokumentech WO 97/19086 a WO 98/22461, k io epothilonům E a F, popsaným v patentovém dokumentu WO 98/22461, nebo k epothilonům popsaným v patentovém dokumentu WO 99/02514.

Slabě polární nebo nepolární rozpouštědlo má výhodně následující charakteristiky:

Výhodné je rozpouštědlo, které v eluotropní řadě určené podle: Snyder a kol., J. Chromatogr. Sci. 16, 223 (1978) vykazuje následující charakteristiky, přičemž x_e znamená protonový akceptorový parametr (ukazatel tendence k tvorbě vodíkových vazeb (můstků) ve funkci akceptoru vodíku), Xd znamená protonový donorový parametr (ukazatel tendence k tvorbě vodíkových vazeb ve funkci donoru vodíku) a Xn znamená dipólový parametr (ukazatel dipolového charakteru) s výhra20 dou, žeXe + Xd + Xn=l,a výhodné jsou rovněž směsi takových rozpouštědel:

x_e = 0,20 až 0,40;

Xd = 0,15 až 0,36; a x_n = 0,38 až 0,60, výhodně x, = 0,22 až 0,32;

Xd-0,17 až 0,34; a

Xn = 0,39 až 0,54.

Velmi výhodnými slabě polárními nebo nepolárními rozpouštědly jsou (nižší alkyl) - (nižší alkyl)ketony nebo cyklické ketony, jako například aceton, methylethylketon, 2-pentanon, methylisobutylketon nebo cyklohexanon, výhodněji ethery, zejména cyklické ethery, obzvláště tetrahydrofuran nebo dioxan; ještě výhodněji alifatické halogenové sloučeniny, zejména nižší alkylhalogenidy, obzvláště methy lendichlorid (^methylenchlorid) nebo ethylendichlorid; nejvýhodněji aromatická rozpouštědla, zejména naftalen nebo (výhodně) benzen nebo naftalen nebo (výhodně) benzen substituovaný jedním nebo více, výhodně jedním až třemi, substituenty zvolenými z množiny zahrnující nižší alkylovou skupinu, zejména methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo isopropylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, zejména methoxy skupí nu nebo ethoxyskupinu, atom halogenu, zejména atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu, nitroskupinu a (nižší alkoxy) - (nižší alkyl)ovou skupinu, zejména ethoxymethylovou skupinu; obzvláště toluen, ethylbenzen, xylen, zejména o~, m~ nebo p-xylen, mesitylen, pseudokumen, hemelliten, kumen, isopropyltoluen, fenylhalogenidy, zejména fluorbenzen, chlorbenzen, brom45 benzen nebo jodbenzen, nižší alkoxybenzeny, zejména ethoxybenzen nebo methoxybenzen nebo (nižší alkoxy) - (nižší alkyl)benzeny, zejména ethoxymethylbenzen (benzylether); nebo libovolné směsi dvou nebo více, například 2 až 4, z uvedených rozpouštědel; nej výhodnější jsou (nižší alkyl)benzeny, zejména ethylbenzen, xylen, zejména o-, m- nebo p-xylen, mesitylen, pseudokumen, hemelliten, kumen, isopropyltoluen a nejvýhodněji toluen.

Pojem „slabě polární nebo nepolární rozpouštědlo“ rovněž zahrnuje směsí dvou nebo více výše a dále popsaných rozpouštědel, například 2 až 4 takových rozpouštědel.

Adjektivum „nižší“ vždy znamená, že dále uvedená skupina výhodně obsahuje nejvýše až 7 uhlí55 kových atomů, zejména až 4 uhlíkové atomy, přičemž tato skupina je rozvětvená nebo nerozvět-5CZ 301664 B6 vená. Nižší alkylová skupina může být například nerozvětvená nebo jednou nebo vícekrát rozvětvená a touto skupinou je například methylová skupina, ethylová skupina, propylová skupina, jako isopropylová skupina nebo n-propylová skupina, butylová skupina, jako isobutylová skupina, seA-butylová skupina, terc-b uty lová skupina nebo n-butylová skupina, nebo také pentylová skupina, jako amylová skupina nebo w-pentylová skupina.

Atomem halogenu je výhodně atom jodu, atom bromu, atom chloru nebo atom fluoru.

Uhlovodíkem je výhodně organická sloučenina obsahující výhodně 4 až 20 uhlíkových atomů, io výhodněji 6 až 16 uhlíkových atomů, přičemž uhlovodík může být alifatickým, například lineárním, rozvětveným nebo cyklickým nasyceným alkanem, například cyklohexanem, lineární, rozvětvenou nebo cyklickou (nearomatickou) organickou sloučeninou s jednou nebo více dvojnými nebo/a trojnými vazbami nebo aromatickým uhlovodíkem, přičemž tento aromatický uhlovodík je nesubstituovaným aromatickým uhlovodíkem nebo aromatickým uhlovodíkem jednou nebo vícekrát, například až třikrát, substituovaným substituenty zvolenými z množiny zahrnující nižší alkylovou skupinu, zejména methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo isopropylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, zejména methoxyskupinu nebo ethoxyskupinu, atom halogenu, zejména atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu, nitroskupinu a (nižší alkoxy) - (nižší alkyl)ovou skupinu, zejména ethoxymethylovou skupinu, výhodně substituovaným jednou až třemi nižšími alkylovými skupinami.

Alkoholem je výhodně hydroxy 1 - (nižší alkan), zejména methanol, ethanol nebo n- nebo isopropanol.

Pryskyřicí je zejména syntetická pryskyřice, výhodně pryskyřice na bázi kopolymerů styrenu a divinylbenzenu, výhodněji Amberlite XAD-4 nebo výhodně Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] nebo Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milán]. Je samozřejmé, že pryskyřice, ze které mají být epothilon nebo epothilony desorbovány podle vynálezu, obsahuje nekovalentně vázané epothilony (například reverzibilně vázané nebo adsorbované). Jinými slovy, všude tam, kde je použit výraz „pryskyřice“, se rozumí tímto výrazem „pryskyřice jsoucí ve styku s jedním nebo více epothilony, přičemž tyto epothilony jsou zejména buď reverzibilně vázané, nebo adsorbované.

V následující části popisu budou popsány výhodné formy provedení vynálezu.

V rámci výhodné formy provedení se vynález týká způsobu zahrnujícího desorpci z pryskyřice výše nebo níže popsaným slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem, zahrnující libovolné další čisticí stupně, které jsou žádoucí nebo nezbytné k získání příslušných epothilonů, zejména epothilonu A a nejlépe epothilonů B, v čisté formě, zejména čisticí stupně popsané v rámci vynálezu jako výhodné čisticí stupně.

Zpracování epothilonů předchází reakce nebo způsob vedoucí k reakČnímu produktu obsahujícímu epothilony a určenému ke zpracování, přičemž epothilony jsou izolované buď i) z chemických reakčních smést po rozpuštění v příslušném polárním vodném prostředí nebo i i) výhodněji ze supematantu (například cyklodextrin-obsahující supernatant, popsaný v patentovém dokumentu WO 99/42602) kultivačního prostředí s mikroorganizmy produkujícími epothilony, získaného rozdělením kultivačního prostředí na kapalnou fázi (například centrifugát nebo filtrát) a pevnou fázi (buňky), zejména použitím filtrace nebo odstředění (trubková odstředivka nebo separátor),

Po tomto předběžném zpracování výhodně následuje přímé smíšení roztoku i) nebo kapalné fáze ii) s pryskyřicí, zejména se syntetickou pryskyřicí, obzvláště s pryskyřicí na bázi kopolymerů styrenu a divinylbenzenu ve funkci matrice (dále zjednodušeně uváděná jako polystyrénová pryskyřice), jakou je například Amberlit XAD-16 nebo Diaion HP-20 (výhodně v objemovém poměru centrifugáfcpryskyřice rovném asi 10:1 až 100:1, výhodně rovném asi 50:1). Po proběh-6CZ 3U1W>4 Bb nutí kontaktní periody výhodně rovné 0,25 až 50 hodinám, zejména 0,8 až 22 hodinám, se pryskyřice oddělí, například filtrací, sedimentací nebo odstředěním. Je—H to žádoucí, pryskyřice se po adsorpci promyje silně polárním rozpouštědlem, výhodně vodou.

Potom začíná realizace výhodného způsobu zpracování podle vynálezu. Desorpce epothilonů (které jako takové představují obzvláště výhodné provedení podle vynálezu) se provádí slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem, zejména (nižší alkyl)halogenidy, obzvláště methylendichloridem nebo ethylendichloridem, nebo výhodněji aromatickými rozpouštědly, zejména naftalenem nebo (výhodně) benzenem, nebo naftalenem nebo (výhodně) benzenem substituovaným io jedním nebo více, výhodně jedním až třemi, substituenty, zvolenými z množiny zahrnující nižší alkylovou skupinu, zejména methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo isopropylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, zejména methoxyskupinu nebo ethoxyskupinu, atom halogenu, zejména atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu, nitroskupinu a (nižší alkoxy) - (nižší alkyl)ovou skupinu, zejména ethoxymethylovou skupinu, nej výhodněji toluenem. Tento extrakč15 ní stupeň může být opakován jednou nebo vícekrát, výhodně 0 až 3 krát, zejména jednou, za účelem dosažení úplné desorpce v případě, že je to nezbytné nebo žádoucí.

Zpracování takto získaných roztoků (v případě opakovaných extrakcí se jedná o sloučené roztoky) desorbovaných epothilonů výhodně pokračuje tím, že se provede odstranění rozpouštědla použitého pro desorpci z uvedených roztoků odpařením (destilací), výhodně zahuštěním v reaktoru a následně v rotační vakuové odparce.

Potom se provede další zpracování za použití následujících stupňů, z nichž pouze čisticí stupeň chromatografií s reverzní fází za použití elučního Činidla tvořeného nitrilem je obligatomí, zatím25 co ostatní stupně jsou fakultativními stupni:

krystalizace epothilonů nebo epothilonů po desorpci; specificky v případě krystalizace epothilon u B se přidá směs alkoholu a uhlovodíku, zejména nižšího atkanolu a cyklického alifatického uhlovodíku s 3 až 10 kruhovými atomy, obzvláště methanolu a cyklohexanu (výhodně) v objemovém poměru 1:10 až 10:1, zejména v objemovém poměru 1:3 až 3: ΐ. Přidání vody vede k rychlé fázové separaci, přičemž se alkoholová fáze odpaří k suchu, například ve vakuové rotační odparce. Získaný extrakt, který obsahuje epothilon B, se potom ponechá vykrystalizovat z příslušné rozpouštědlové směsi, zejména ze směsi alkoholu a cyklického alifatického uhlovodíku, výhodněji ze směsi isopropanolu a cyklohexanu, výhodně v objemovém poměru 1:10 až 10:1, výhodněji v objemovém poměru 1:6 až 6:1 a nejvýhodněji v objemovém poměru 1:6 až 1:4;

- (obligatomí) separace epothilonů reverzně fázovou chromatografií po vyjmutí vhodným rozpouštědlem, zejména směsí nitrilu a vody, výhodně směsí acetonitrilu a vody, výhodně v objemovém poměru 1:10 až 10:1, zejména v objemovém poměru 1:3 až 1:1, a eluci směsí nitrilu a vody, přičemž se chromatografie výhodně provádí na sloupci reverzně fázového materiálu, který obsahuje uhlovodíkové řetězce, jako například uhlovodíkové řetězce obsahující 18 uhlíko40 vých atomů, zejména na sloupci materiálu RP-18, a eluce se provádí elučním činidlem obsahujícím nitril, zejména (nižší alkyl)nitril, obzvláště acetonitril, výhodně eluční soustavou tvořenou směsi nitrilu a vody, zejména směsí acetonitrilu a vody, výhodně v poměru nitrihvoda rovném asi 1:99 až 99:1, především v poměru 1:9 až 9:1, například v poměru 2:8 až 7:3, výhodně v poměru 3:7 nebo 4:6; následně se odstraní nitril z frakcí obsahujících epothilon (zejména epothilon A nebo nejvýhodněji epothilon B) odpařením (destilací); je-li to žádoucí, voda doprovázející epothilon se potom extrahuje esterem, zejména (nižší alkyl) - (nižší alkanoát)em, výhodně isopropylacetátem, a esterová fáze obsahující epothilon se potom odpaří k suchu (výhodně nejdříve v prvním reaktoru a potom ve vakuové rotační odparce); (je-li to žádoucí, může být výchozí roztok epothilonů rozdělen na několik částí a tyto dílčí roztoky potom mohou být podrobeny separaci ve více než jednom reverzně fázovém separačním kroku);

pouze případná (například jako alternativa ke krystalizaci po desorpci) adsorpční chromatografie, zejména provedená zavedením na sloupec silikagelu a eluci příslušným rozpouštědlem nebo příslušnou směsí rozpouštědel, zejména směsí esteru a uhlovodíku, například směsi

-7CZ JU1664 Bb alkylalkanoátu a alkanu obsahujícího 4 až 10 uhlíkových atomů, obzvláště směsí ethyl-nebo isopropylacetátu a π-hexanu, ve kterém je poměr esteru k uhlovodíku výhodně v rozmezí 99:1 až l :99, výhodně v rozmezí 10:1 až 1:10, například výhodně roven 4:1;

a nakonec rekrystalizace, například z příslušných rozpouštědel nebo směsí rozpouštědel, zahrnujících estery, směsi esterů a uhlovodíků nebo alkoholy, zejména směs ethyl-nebo isopropylacetátu a toluenu v poměru 1:10 až 10:1, výhodně v poměru 2:3 (epothilon A) nebo methanol nebo ethylacetát (epothilon B);

přičemž při uvedeném způsobu se v případě, že je to nezbytné nebo/a žádoucí, mezi jednotlivými stupni zahustí rezultující roztoky nebo suspenze nebo/a se kapalné a pevné složky oddělí jedna od io druhé, zejména sedimentací, filtrací nebo odstředěním roztoků nebo suspenzí. Výše a níže uvedené přesnější definice mohou být výhodně použity ve výše uvedených jednotlivých stupních.

V rámci výhodné formy provedení se vynález rovněž týká způsobu izolace epothilonů adsorbovaných na syntetické pryskyřici, zejména epothilonů A nebo výhodněji epothilonů B, jehož pod15 stata spočívá v tom, že zahrnuje

i) desorpci epothilonů z uvedené syntetické pryskyřice slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem, zejména (nižší aikyl)halogenidy, zejména methylendichloridem nebo ethylendichloridem, nebo výhodněji aromatickými rozpouštědly, zejména naftalenem nebo (výhodně) benzenem nebo naftalenem nebo (výhodně) benzenem substituovaným jedním nebo více, výhodně jedním až třemi, substituenty zvolenými z množiny zahrnující nižší alkylovou skupinu, zejména methylovou skupinu, ethylovou skupinu nebo isopropylovou skupinu, nižší alkoxy skup inu, zejména methoxyskupinu nebo ethoxyskupinu, atom halogenu, zejména atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu, nitroskupinu a (nižší alkoxy) - (nižší alkyl)ovou skupinu, zejména ethoxymethylovou skupinu, nejvýhodněji toluenem, nebo směsí dvou nebo více takových rozpouštědel, a

i i) separaci epothilonů reverzní fázovou chromatografií po jejich vyjmutí ve vhodném rozpouštědle, zejména ve směsi nitrilu a vody, výhodně ve směsi acetonitrilu a vody, výhodně v objemovém poměru 1:10 až 10:1, zejména v objemovém poměru 1:3 až 1:1, a eluci směsí nitrilu a vody, přičemž chromatografíe se výhodně provádí na sloupci reverzně fázového materiálu, zejména na sloupci materiálu RP-18, obsahujícího uhlovodíkové řetězce, například uhlovodíkové řetězce obsahující 18 uhlíkových atomů, a použije se eluční činidlo obsahující nitril, zejména (nižší alkyl)-nitril, obzvláště acetonitril, přičemž se zejména použije směs nitrilu a vody, zejména směs acetonitrilu a vody, výhodně poměru nitril/voda rovném asi 1:99 až 99:1, výhodněji v poměru 1:9 až 9:1, například v poměru mezi 2:8 a 7:3, například při poměru 3:7 nebo 4:6.

V rámci další výhodné formy provedení vynálezu výše uvedený způsob začínající stupněm I) a obsahující stupeň ii) dále zahrnuje libovolný čisticí stupeň, který je nezbytný nebo žádoucí k získání příslušných epothilonů, zejména epothilonů A a nejvýhodněji epothílonu B, v čisté formě, výhodně ty čisticí stupně, které byly v rámci vynálezu popsány jako výhodné.

Zpracování se výhodně provádí následujícím způsobem: adsorpce epothilonů, zejména z chemických reakčních směsí nebo výhodně ze supematantů kultivačních prostředí migroorganizmů, může být provedena způsobem popsaným v patentovém dokumentu WO 99/42602 nebo způsobem, který je analogický s tímto způsobem; stručně specifikováno: epothilony jsou obsaženy v centrifugátu, který se potom přímo smísí se syntetickou pryskyřicí, zejména s pryskyřicí na bázi styrendivinylbenzenového kopolymerů, jako například s pryskyřicí AmberliteXAD-16 nebo Diaion HP-20 (výhodně v objemovém poměru centrifugát/pryskyřice rovném asi 10:1 až 100:1, so výhodněji v poměru asi 50:1), a získaná směs se míchá v míchacím zařízení. Po uplynutí doby, která je dostatečná pro adsorpci, například po uplynutí doby styku s pryskyřicí rovné 0,2 až 10 h, se pryskyřice oddělí odstředěním nebo filtrací. Adsorpce epothilonů na pryskyřici může být rov-8VZj UVXW*t DD něž provedena v chromatografické koloně na sloupci pryskyřice a to uspořádáním pryskyřice v koloně a vedením uvedeného centrifugátu skrze tuto kolonu. Po adsorpci se pryskyřice promyje vodou.

Potom započne výhodné zpracování podle vynálezu, které probíhá následujícím způsobem.

Desorpce epothilonů z pryskyřice se výhodně provádí slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem podle vynálezu, zejména výše nebo níže popsaným výhodným rozpouštědlem, zejména methylenchloridem nebo nejvýhodněji toluenem. Rozpouštědlo se potom odstraní, pokud je to io nutné, výhodně k získání suchého zbytku. Je-li to vhodné, zbytek se vyjme ve směsi alkoholu a uhlovodíku, zejména ve směsi methanolu a cyklohexanu, výhodně ve výše popsaných poměrech, přičemž se použije poměrně malý objem uvedené směsi. Alkoholová fáze se potom odpaří, výhodně k suchu, a alkoholový extrakt se potom krystalizuje ze směsi alkoholu, výhodně isopropanolu, a uhlovodíku, zejména cyklohexanu, ve výše popsaných poměrech. Získaný pevný krystalický materiál se potom rozpustí ve směsi nitrilu a vody, výhodně popsané výše, zejména ve směsi acetonitrilu a vody v objemovém poměru 2:3, a získaný roztok se v případě, zeje to žádoucí, po rozdělení do několika frakcí nalije na preparativní reverzně fázový chromatografický sloupec. Potom se provede eluce směsí nitrilu a vody, výhodně právě výše popsanou směsí. (Aceto-)nitril přítomný v získaných frakcích obsahujících epothilon, zejména epothilon A a nej20 výhodněji epothilon B, se odstraní odpařením (destilací) a získaná vodná fáze se extrahuje esterem, zejména isopropylacetátem. Získaný esterový extrakt se potom odpaří, výhodně k suchu, a získaný materiál se následně rekrystalizuje, přičemž například frakce epothilonů A se přímo krystalizuje ze směsi esteru a uhlovodíku, například ze směsi ethylacetátu a toluenu v objemovém poměru 2:3, zatímco frakce epothilonů B se krystalizuje z esteru, zejména z ethylacetátu nebo výhodně z alkoholu, zejména z methanolu.

Jako vysoce účinné selektivní eluční činidlo (desorpční činidlo) byl zjištěn toluen, který poskytuje přibližně 100% výtěžek dosažený za polovinu desorpční doby, kterou k tomu potřebuje isopropanol použitý v rámci postupu popsaného v patentovém dokumentu WO 99/42602. Množství desorbovaných epothilonů se překvapivě zvýší, například na 130 %, po desorpci toluenem ve srovnání s isopropanolovým desorpčním činidlem (ačkoliv se to na první pohled zdá nemožné z teoretického hlediska, tato skutečnost velmi dobře ilustruje hlavní výhodu poskytovanou vynálezem: výsledek se vztahuje ke stanovení naadsorbované pryskyřice; protože pri tomto stanovení byl pro desorpci použit isopropanol, byl za základ vzat neúplný desorpční proces vedoucí původ35 ně k nižším hodnotám stanovení, které se nyní ukázaly být klamné). Epothilonová směs může být (bez předcházející krystalizaee nebo po předcházející krystalizaci) zavedena přímo na sloupec reverzně fázové pryskyřice. Proces je značně robustní, pokud jde o množství rozpouštědel, míru míchání a teploty. Zatímco v případě alkoholů (například v případě ethanolu a isopropanolu) za míchání dochází ke dvoufázové desorpci, kdy se první množství epothilon-obsahujícího mate40 riálu desorbuje v první časové periodě (což je snad vysvětlitelné distribucí velikostí pórů nalezenou u polystyrenu XAD-16, která má dvě distribuční maxima) a druhé množství uvedeného materiálu se desorbuje ve druhé časové periodě až po uplynutí první časové periody, nebylo toto nežádoucí chování pozorováno u toluenu nebo rovněž u dichlormethanu, kde se všechen materiál obsahující epothilon desorbuje již v první časové periodě. Za srovnatelných podmínek činil v jednom příkladu zbytek po odpaření v případě isopropanolu a epothilonů A a B 40 g, zatímco v případě methylenchloridu 3,3 g a v případě toluenu pouze 0,9 g, ale například 17 až 18 g v případě epothilonů B po desorpci z pryskyřice na bázi kopolymeru styrenu a divinylbenzenu a za použití supematantu kultivačních prostředí obsahujících cyklodextrin, jakje to popsáno v patentovém dokumentu WO 99/42602, což ukazuje na mnohem vyšší Čistotu, Zatímco pri použití tolu50 enu se dosahuje nej významnějších výhod, spočívá výhoda dichlormethanu v jeho snadném odstranění v důsledku jeho nízké teploty varu.

Separace epothilonů A a B může být rovněž dosažena provedením chromatografie ve formě simulovaného pohyblivého lože (SMB, Simulated Moving Bed), Chromatografie SMB je široce používanou separační metodou používanou pro separaci binárních směsí, jako je například sepa-9CZ 301664 B6 race racemátů na chirálních stacionárních fázích, například procesy Sorbex v petrochemickém průmyslu, jako procesy Parex nebo Molex, nebo proces Sarex používaný v cukrovamickém průmyslu. Ve srovnání s šaržovou chromatografií, poskytuje chromatografie SMB výhodu provozu kontinuální protiproudé jednotky, která vede ke zvýšené produktivitě a snížené spotřebě mobilní fáze. Odborníkům v daném oboru je známo několik systematických postupů pro metodický rozvoj chromatografií SMB. Takové postupy jsou například popsané v: R. M. Nicoud, M. Baily, J, Kinkel, R. M. Devant, T. R. E. Hampe a E. Kiisters, Proeeedings of the 1* European Meeting on Simulated Moving Bed Chromatography (1993), ISBN 2-905-267-21-6, str. 65-88; E. Kiisters, G. Gerber a F. D. Antia, Chromatographia, 40 (1995) 387; T. Pról a E. Kiisters, J. Chromatogr. io A, 800 (1998) 135; nebo C. Heuer, E. Kiisters, T. Plattner a A. Seidel-Morgenstem, J. Chromatogr, A, 827(1998) 175.

Základní parametry pro separaci epothilonů A a B chromatografií SMB mohou být přímo odvozeny od konvenční separace kapalinovou chromatografií. Výhodně se jako stacionární fáze pou15 žije reverzně fázový silikagel (RP 18) a jako mobilní fáze se použijí směsí vody a acetonitrílu. Finální soubor průtokových rychlostí (pro individuální zóny SMB a přepínací Časy) může být odvozen buď z jednoduchého proudového schématu vyvinutého E. Kiistersem a kot, který je k dispozici v: Chromatographia, 40 (1995) 387, nebo pečlivým vyhodnocením adsorpčních isoterm, uvedených v: J. Chromatogr. A, 800 (1998) 135 a v; J. Chromatogr. A, 827 (1998) 175.

Zpracování extraktu a rafinátových proudů může být rovněž provedeno způsobem popsaným pro separaci konvenční kapalinovou chromatografií.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen definicí patentových nároků a obsahem popisné části.

Příklady provedení vynálezu

V úvodu je třeba uvést, že při zacházení s epothilony je třeba dodržovat příslušná bezpečnostní ochranná opatření vzhledem k jejich vysoké toxicitě.

Příklad 1

Zpracovatelský postup pro epothilon B

Desorpce 591,7 kg naadsorbované pryskyřice (styren/divinylbenzen-kopolymerová pryskyřice XAD-16 s naadsorbovaným epothilonem A a B z kultivačního prostředí) se provede mícháním uvedené pryskyřice rozdělené na dvě Části vždy se 720 litry toluenu ve Čtyřech podílech po dobu přibližně 8 hodin. Oddělení toluenové fáze od pryskyřice je zajištěno použitím filtru provozovaného pod sáním. Sloučené toluenové fáze se promyjí dvěma podíly tvořenými vždy 250 litry vody. Po rozdělení fází se toluenový extrakt zahustí v 1000 1 reaktoru na objem přibližně rovný 20 až 40 litrům a potom se provede zahuštění k suchu ve vakuové rotační odparce. Získá se

4,095 kg toluenového extraktu obsahujícího 209 g epothilonů B. Tento toluenový extrakt se rozpustí v 16,5 litru methanolu a 24,5 litru cyklohexanu. Po přidání 0,8 litru vody dojde bezprostředně k rozdělení fází. Methanolová frakce se odpaří k suchu ve vakuové rotační odparce, přičemž se získá 1,025 kg zbytku po odpaření obsahujícího 194 g epothilonů. Methanolový extrakt se potom krystalizuje z rozpouštědlové směsi obsahující 2,05 litrů isopropanolu a 10,25 litrů so cyklohexanu, přičemž se by získá 0,4 kg krystalického materiálu obsahujícího 184 g epothilonů B. Získané krystaly se rozpustí v 3,2 litru směsi acetonitrílu a vody v objemovém poměru 2:3 a rezultující vsázkový roztok se zavede ve třech oddělených bězích na preparativní sloupec reverzně fázové pryskyřice (25 kg sférického silíkagelu RP-18, YMC-Gel ODS-A 120; 5 až 15 mikrometrů; Waters Corp., Milford, Massachusetts, USA). Eluce se provede směsí acetonitrílu a vody v objemovém poměru 2:3 ve funkci mobilní fáze při průtoku 2,3 1/min; retenční doba epo-10tó JUlUUt DU thilonu A ~ 77 až 96 minut, retenční doba epothilonu B = 96 až 119 min. Frakce se monitorují ultrafialovým detektorem při vlnové délce 250 nm. Acetonitril ze sloučených frakcí epothilonu B (ze tří běhů) se oddestiluje a zbylá vodní fáze se extrahuje 504 litry isopropylacetátu. Isopropylacetátový extrakt se zahustí v 630 1 reaktoru na přibližně 20 až 40 litrů a posléze se zahusti k suchu ve vakuové rotační odparce. Hmotnost zbytku po odpaření epothilonových frakcí činí 170 g a tento zbytek obsahuje (podle stanovení vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií za použití vnějšího standardu) 98,4 % epothilonu B. Takto získaný materiál se nakonec krystalizuje z 2,89 litru methanolu o teplotě 0 až 5 °C, přičemž se získá 150 g epothilonu B ve formě čistého krystalizátu.

Teplota tání získaného produktu: 124 až 125 °C;

'H-nukleámí magnetickorezonanční spektrum pro epothilon B (500 MHz-NMR, rozpouštědlo: DMSO-d6; chemické posuny δ v ppm vzhledem k TMS; DMSO znamená dimethylsulfoxid,

TMS znamená tetramethylsilan, s = singlet, d = dublet, m = multiplet):

δ (multiplicita) Integrál (počet H)

7.34 (s) 1

6.50 (s) 1

5.28 (d) 1

5.08 (d) 1

4.46 (d) 1

4.08 (m) l

3.47 (m) 1

3.11 (m) 1

2.83 (dd) 1

2.64 (s) 3

2.36 (m) 2

2.09 (s) 3

2.04 (m) 1

1,83 (m) l

1.61 (m) 1

1.47-1.24 (m) 4

1.18(s) 6

1.13 (m) 2

1.06 (d) 3

0.89 (d +s, přesah) 6

Σ = 41

Příklad 2

Srovnání různých desorpčních postupů při přípravě epothilonu B

Vždy 360 ml vodné suspenze styren/divinylbenzen-kopolymerové pryskyřice XAD-16 s naadsorbovaným epothilonem A a B z kultivace myxobakterií provedené způsobem popsaným v patentovém dokumentu WO 99/42602 (což odpovídá 194 g mokrého produktu Amberlite XAD16) se extrahuje rozpouštědly uvedenými společně s pracovními podmínkami v následující tabulce v míchaném (obvyklé laboratorní kotvové míchadlo) skleněném reaktoru, opatřeném u dna slinutou fritou (interně vyrobený šaržový reaktor, vnitřní průměr: 10 cm. délka 20 cm, dále označován jako „Stirrer/Frit“).

Tabulka 1

Srovnání desorpčních postupů při výrobě epothilonu B

-11 CZ 3U1664 B6

Startovací pryskyřice (pryskyřice s naadsorbovaným epothilonem):

#1001: teoretický obsah 70 mg na 360 ml pryskyřicové suspenze (což odpovídá 70 mg na

194 g mokré XAD-16), #1003: teoretický obsah 114 mg na 360 ml pryskyřicové suspenze (což odpovídá 114 mg na

194 g mokré XAD-16).

o

3 R Cl α ~

#1003

3 T^-

Isopropanol

250

« r- X T*

Cl

s d

to Τ’

-

1,70

3,3 1

8 8

0

co

OJ

IO

1 -

8

s

§

8

Cl

T“

Cl

co

* (J

rt

0

Cl

X T-

co

rt

Τ- Ο

Λ

Τ’

a

UV 2

Ό

Cl

|

•c

cí

j

TT

£ I

i

s

s c

Q

II e Cl

rt

Τ’

α s

r*_

g

® 1

5<

rt

i

cl

s 0

CÍ“

co

s

£

X

w

rt

ÍPg

(O

(9

o

23 S = ft w

rt 8 *

0 to rt

s 8 «

0 8

II Cl r\ d X

10

•

10

1

Cl cí

tn T*

Ct

rt rt

O) cí

3 (O OJ

10

tJ

•C

T-

£

ΐ g| f

8

O to n

Φ £ 0

0 8

II 8 0 X

rt

10 d

0

O s rt

£

3 Φ U)

2

rt

3

to

t-

c U- rj L· (β 4-1 ? o g

8 s

§

w 2 §

§

T- II Cl o*

co

•

r* d

I

Γ

1» Cl

Cl

5. lf>

8 T

Ol 8

ω SK

X co

ř*

5'g

8

i

Ή '3

I

J

o,

.5

Ξ

u-j

a

/·>

tři

H

Λ

fll

--¼

>1

Ή

fc

TJ

£

M

8

a

£

g

x:

8

e

g

α

i

s_;

H

5

'd

>

8

íá

&-

dP

Ή

'5

s

>h

5

jfi

g

8

JÍ

g

•jí

Varia

ti

s

i

s

*

ϊ

$

!

jj

s

>|

1

I

i

g

fl

í

á

S

ΐ

s

£

f

&s

s

£

- 12«ινιιηι** ου

w K·

u o •Έ u. (0

#1003 |

360

i Toluen |

<

$ T“ II <D CO d X

*r

M IO d

Ύ- o

v—

8 O

15,8

3 c O LO IH

P

||

í?

T-

a. c

g

c β

o

rt

m

Τ-

T-

3

b·”

O c

T-

H;

*

rt

1

X rt

c

1

Ο

d

T-

o IO Τ»

to

P

3

x

ÍO

O r·

** ’C u. £

T“ *

§

c

o a

II 8 O

rt

u io o*

r* o

-

10 rv d

co b·

T- T- Kj< 3

X

to

rt

υ

V)

o

oO

rf

£

T“

o

Φ

13 CM

CO §

8

II co

to

3

T*

IO

T-

CM to

CJ) O

T- T •w

rt 3

Τ' *

T-

Q. 8

OJ

v- X

c

)

CM

cm

10 Cli to

Φ

X

CM

P

CM 11

s

to

X ¥ u_

g T* tt

§

O 3 |2

§

bí o

to

IO d

ί- ο

T-

CO co d

V ht

r- 8

X

T-

co

ω

« co

Š

IO cí

b.

«?

i— *

s

c 5» i

c*·

II IO Ο- Χ

IO

-

CĎ tO rt

LO O

s 3

δ

s

T”

.§

>fe

c

ij

'flj

a

3

£

o

IH

L

S¹

*w

fr

«p

flí

fH

iH

s*

tf

A

f

o

pí

c

rQ

ře

4J

Qj

£

Φ

£

o

2P

Λ

ř

Qt'**’

0 «ν'

5

ti

* Λ

>2

ε

4J

P

w

'SS

3

rH

m

3

fll

M

tf

»»

C

0

M

»0

M

*—*

-8

i

>

S

tf

•d

j3

s

ví S

a

s

Ό

)

2

>2

s

L

ΐ

)N Lh

8

£

A

id

hS

a

- —

fl

H

*s

s

O

a

'£

8

2

!'í

8

as

8

£

* ιΛ

Μ (X

ΓΜ

II b = trojnásobná extrakce, kdy voda nevyjímá žádnou polární složku; c = první z tří fázových separací;

d = materiál při přirovnání ke zbytku po odpaření ethylacetátu může být mnohem lépe chromatografován na silikagelu;

e = odpovídá zbytku po odpaření asi 25 až 30 g;

-13CZ 301664 B6 f - sušení v sušárně (za hlubokého vakua) přes víkend;

g = snad výsledek hojné první fázové separace týkající se použité doby;

h = izolace: první extrakce = 700 ml; druhá extrakce = 680 ml; třetí extrakce = 680 ml;

i = izolace: první extrakce - 670 ml; druhá extrakce = 710 ml; třetí extrakce = 720 ml;

j = potřeba přidání vody nebyla ještě potvrzena;

k = zjednodušuje odstranění původně přítomné vody (XAD-l6 je kryt použitou vodou);

= vzhledem k výsledkům varianty 8, 11 a 12 a k elučním křivkám pro všechny experimenty s toluenem nemůže být vyloučeno použití menšího množství pryskyřice;

„Erl./mag.Sť‘ = magnetické míchání v Erlenmayerové baňce; io „methylenchlorid (methylenchl.)“ = dichlormethan;

„Stir./Frit“ = Stirrer/Frit;

„RT“ = teplota místnosti.

Z výše uvedených experimentů a dalších údajů může být odvozeno, že ve srovnání s isopropa15 nolem poskytuje methy lenchloridová extrakce lepší selektivitu, kratší dobu extrakce (přibližně dvakrát kratší), rychlejší destilaci rozpouštědla (teplota varu methylenchloridu je 40 °C, zatímco teplota varu isopropanolu je 81 až 83 °C), skutečnost, že již není zapotřebí časově náročná a problematická fázová separace směsi ethylacetátu a vody, skutečnost, že již není zapotřebí destilace druhého rozpouštědla, a tedy menší počet stupňů, což má za následek snížené riziko kontaminace a lepší a bezpečnější operační manipulaci; je možné zpracování polovičního objemu (například zpracování v 1000 I reaktorech namísto ve 2000 1 reaktorech); produkovaný epothilon B má lepší čistotní profil (méně vedlejších produktů s polaritou, kteráje srovnatelná s polaritou epothilonu B); a zbytek po odpaření nepění a neprská, jako je tomu v případě extrakce ethylacetátem. Při desorpci toluenem se dosáhne vyššího výtěžku ve srovnání s isopropanolovou extrakcí (asi 100 namísto 80 %), přičemž lze pozorovat lepší selektivitu (za použití isopropanolu se desorbuje asi desetinásobné množství vedlejších produktů); doba extrakce se výrazně zkrátí (asi třikrát), zjednodušší se obtížná filtrace po desorpci isopropanolem (isopropanolová extrakce je obtížně proveditelná ve velkém měřítku), již není zapotřebí destilace druhého rozpouštědla, je možné pracovat v menších reaktorech (opět je například možné použít 1000 1 reaktor namísto 20001 reaktoru), je možné vynechat chromatografii na silikagelu (zbytek po odpaření po desorpci obsahuje vždy asi 40 % směsi epothilonu A/B) a zbytek po odpaření po desorpci nepění a neprská jako zbytek z extrakce ethylacetátem.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

40 1. Způsob desorpce epothilonů A, B, D, E a/nebo F z pryskyřice, vyznačený tím, že se desorpce provádí slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem zvoleným ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů.

45
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že epothilony určenými k desorpci jsou epothilon A nebo epothilon B.
3. Způsob podle některého z předcházejících nároků 1 nebo 2, vyznačený tím, že pryskyřicí je syntetická pryskyřice.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že pryskyřicí je syntetická pryskyřice na bázi styren/divinylbenzenových kopolymerů.

- 14C£ JU1004 BO
5. Způsob podle některého z nároků laž4, vyznačený tím, že se použije aromatické rozpouštědlo zvolené ze souboru sestávajícího z naftalenu, benzenu nebo naftalenu nebo benzenu substituovaného jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z nižší alky5 love skupiny, nižší alkoxyskupiny, halogenu, nitroskupiny a nižší alkoxy-nižší alkylové skupiny, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů.
6. Způsob izolace epothilonů A, B, D, E a/nebo F adsorbovaných na syntetické pryskyřici, vyznačený tím, že zahrnuje io (iii) desorpci epothilonů z uvedené syntetické pryskyřice slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem zvoleným ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů; a (iv) separaci epothilonů reverzně fázovou chromatografii potom, co byly epothilony vyjmuty

15 vhodným rozpouštědlem, a elucí směsí n itri lu a vody.
7. Způsob podle některého z nároků laž6, vyznačený tím, že dále zahrnuje čisticí stupně, které jsou žádoucí nebo nezbytné k získání příslušných epothilonů v čisté formě.

20
8. Způsob získání epothilonů A, B, D, E a/nebo F z reakční směsi, vyznačený tím, že zahrnuje desorpci epothilonů z pryskyřice slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem zvoleným ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7

25 uhlíkových atomů a desorpční stupeň může být opakován k dosažení úplnější desorpce;

odstranění rozpouštědla použitého pro desorpci z rezultuj ících roztoků odpařením;

případnou krystalizaci epothilonů po desorpci, zejména krystalizaci epothilonů B přidáním směsi nižšího alkanolu obsahujícího až 7 uhlíkových atomů a cyklického alifatického uhlovodíku obsahujícího 3 až 10 kruhových uhlíkových atomů a odpařením alkoholické fáze k suchu a krys30 talizací epothilonů B z vhodné směsi rozpouštědel;

- obligatomí oddělení epothilonů reverzně fázovou chromatografii vyjmutím zbytku z předcházejícího stupně ve vhodném rozpouštědle a elucí směsí nižšího alky ln itri lu, ve kterém nižší alkylový zbytek obsahuje až 7 uhlíkových atomů, a vody a odstraněním nitrilů ze sloučených frakcí obsahujících epothilon odpařením, přičemž se zbylá vodná frakce s epothilonem potom

35 případně extrahuje esterem a esterová fáze obsahující epothilon se následně odpaří k suchu;

- případné další čištění adsorpční chromatografii;

a nakonec rekrystalizaci vyčištěného epothilonů z vhodných rozpouštědel nebo směsí rozpouštědel;

přičemž v případě, že je to nezbytné a/nebo žádoucí, se mezi použitými stupni rezultující roztoky 40 nebo suspenze zahustí a/nebo se kapalné a pevné složky vzájemně oddělí.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že se desorpce epothilonů z pryskyřice provádí slabě polárním nebo nepolárním rozpouštědlem zvoleným ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouš45 tědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů, rozpouštědlo se potom případně odstraní, výhodně až k získání suchého zbytku, zbytek se vyjme nezbytným malým objemem směsí alkohol/uhlovodík, alkoholová fáze se odpaří, výhodně k suchu a alkoholový extrakt se potom krystalizuje ze směsi alkoholu a uhlovodíku, rezultující pevný vykrystalizovaný podíl se potom rozpustí ve směsi nitril/voda definované v nároku 8, zejména ve

50 směsi acetonitrilu a vody v objemovém poměru 2:3, a rezultující roztok se nalije po případném rozdělení do více než jedné frakce na preparativní reverzně fázovou kolonu, načež následuje eluce uvedenou směsí nitril/voda, načež se nitril odstraní z rezultuj ících frakcí obsahujících epo- 15CZ 301664 Bó thilon odpařením a rezultující vodná fáze se extrahuje esterem, přičemž se uvedený ester potom odpaří a zbylý podíl se následně rekrystalizuje.
10. Způsob podle některého z nároků 6, 8 nebo 9, vyznačený tím, že separace epothilo5 nu A a B se provádí chromatografií se simulovaným pohyblivým ložem SMB.
11. Způsob podle některého z nároků 1, 6, 8 nebo 9, vyznačený tím, že slabě polární nebo nepolární rozpouštědlo, zvolené ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek

10 „nižší” znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů, nebo směs dvou nebo více takových rozpouštědel má následující charakteristiky v eluotropní řadě stanovené Snyderem aj.:

Xe = 0,22 až 0,32; Xd = 0,17 až 0,34; ax_n = 0,39 až 0,54, přičemž x* znamená protonový akceptorový parametr; znamená protonový donorový parametr a x_n znamená dipólový parametr s výhradou, že Xe + x^ + χ_π = 1.
12. Použití slabě polárního nebo nepolárního rozpouštědla zvoleného ze souboru sestávajícího z nižších alkylhalogenidů a aromatických rozpouštědel a směsi dvou nebo více takových rozpouštědel, přičemž přívlastek „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů, pro desorpcí epothilonů A, B, D, E a/nebo F z pryskyřice.
13. Použití podle nároku 12, při kterém se slabě polární nebo nepolární rozpouštědlo zvolí ze souboru sestávajícího z naftalenu, benzenu nebo naftalenu nebo benzenu substituovaného jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru sestávajícího z nižší alkylové skupiny, nižší alkoxyskupiny, halogenu, nitroskupiny a nižší alkoxy-nižší alkylové skupiny, přičemž přívlastek

25 „nižší“ znamená, že skupina obsahuje až 7 uhlíkových atomů.