SK284823B6 - Použitie hydroxylamínového derivátu na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na zvýšenie produkcie molekulových chaperónov, hydroxylamínový derivát a farmaceutické alebo kozmetické prostriedky s jeho obsahom - Google Patents

Použitie hydroxylamínového derivátu na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na zvýšenie produkcie molekulových chaperónov, hydroxylamínový derivát a farmaceutické alebo kozmetické prostriedky s jeho obsahom Download PDF

Info

Publication number
SK284823B6
SK284823B6 SK881-97A SK88197A SK284823B6 SK 284823 B6 SK284823 B6 SK 284823B6 SK 88197 A SK88197 A SK 88197A SK 284823 B6 SK284823 B6 SK 284823B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
substituted
alkyl
unsubstituted
aralkyl
aryl
Prior art date
Application number
SK881-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK88197A3 (en
Inventor
L�Szl� V�Gh
Nagy P�Ter Liter�Ti
Jen Szilbereky
L�Szl� �R�Gdi
Andrea Jedn�Kovits
L�Szl� Jaszlits
Katalin B�R�
Ede M�Rv�Nyos
Mih�Ly Barab�S
Erzs�Bet Heged�S
L�Szl� Kor�Nyi
M�Ria K�Rthy
G�Bor Balogh
Ibolya Horv�Th
Zsolt T�r�k
�Va Udvardy
Gy�Rgy Dorm�N
D�Nes Medzihradszky
Bea M�Zes
Eszter Kov�Cs
Ern� Duda
Beatrix Farkas
Attila Glatz
Original Assignee
Biorex Kutat� �S Fejleszt� Rt.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27270113&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK284823(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biorex Kutat� �S Fejleszt� Rt. filed Critical Biorex Kutat� �S Fejleszt� Rt.
Publication of SK88197A3 publication Critical patent/SK88197A3/sk
Publication of SK284823B6 publication Critical patent/SK284823B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/02—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by halogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/12—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by nitrogen atoms, e.g. N-hydroxyamidines
    • C07C259/18—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by nitrogen atoms, e.g. N-hydroxyamidines having carbon atoms of hydroxamidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C275/00—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C275/64—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups singly-bound to oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/18—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/89—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C07D215/54—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/22—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/26—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/08—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms
    • C07D295/084—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
    • C07D295/088—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/38—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated

Abstract

Je opísané použitie chemickej zlúčeniny na prípravu farmaceutického prostriedku na zvýšenie expresie molekulových chaperónov exprimovaných bunkou alebo v eukariotickej bunke, ktorá je vystavená fyziologickému stresu, na zvýšenie expresie molekulového chaperónu v bunke nad množstvo vyvolané daným fyziologickým stresom, alebo na liečenie choroby spojenej s funkciou chaperónového systému alebo spojenej s poškodením bunkovej membrány alebo membrány bunkovej organely, alebo na jej prevenciu, pričom chemickou zlúčeninou je hydroxylamínový derivát, ktorého tautomérne formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II), alebo jeho soľ, a/alebo akýkoľvek jeho opticky aktívny stereoizomér. Tiež je opísaný uvedený hydroxylamínový derivát a farmaceutické a/alebo kozmetické prostriedky s jeho obsahom.

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka použitia hydroxylamínového derivátu na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na zvýšenie produkcie molekulových chaperónov a farmaceutických alebo kozmetických prostriedkov s obsahom tohto derivátu.
Molekulové chaperóny sú bielkoviny, ktoré sprostredkovávajú skladanie bielkovinovej štruktúry. Viažu sa nekovalentne k odkrytým povrchom bielkovín, ktoré sú novosyntetizované, alebo denaturované, alebo zle zložené, napomáhajú im zložiť sa do správnej konformácie. Molekulové chaperóny sú tiež zapojené do radu bunkových pochodov, ako je syntéza bielkovín, translokácia bielkovín a replikácia DNA.
Doterajší stav techniky
Molekulové chaperóny zahŕňajú bielkoviny tepelného šoku, čo sú bielkoviny, ktorých expresia sa významne zvyšuje v bunkách vystavených neobvykle vysokej teplote (tepelnému šoku) alebo vystavených širokej palete fyziologických stresov. Tento nárast expresie molekulových chaperónov potom poskytuje bunkám ochranu proti škodlivým účinkom hypertémie, ako dokazuje tolerancia buniek proti teplotám, ktoré sú pre ne inak smrteľne vysoké, ak sú tieto bunky predkondicionované krátkym vystavením vysokej teplote.
Fyziologické stresy, ktoré indukujú bielkoviny tepelného šoku, zahrnujú široký rad patologických stavov spojených s mnohými chorobami. Syntéza bielkovín tepelného šoku v bunkách vystavených takýmto stresom ukazuje tiež na ochranu daných buniek proti daným fyziologickým stresom, podobne ako v prípade reakcie na tepelný šok.
Jedným takýmto patologickým stavom spojeným s indukciou molekulových chaperónov je ischemické poškodenie. Ischemické poškodenie tkaniva je dôsledkom obmedzenia zásobovania krvou z akejkoľvek príčiny. Napríklad: pretrvávajúca koronárna oklúzia spôsobuje poškodenie myokardu, ktoré vedie k nekróze srdcového svalu a ohrozuje šance na zahojenie, aj keď sa prúdenie krvi navráti. Časté poškodenia spôsobené ischémiou môžu byť v mozgu a môžu viesť k odumretiu mozgového tkaniva.
Bolo pozorované, že množstvo bielkoviny tepelného šoku hsp70 sa zvyšovalo v myokarde počas ischémie vedúcej k nekróze dokonca vtedy, keď trvanie ischémie bolo krátke. V týchto prípadoch, podobne ako pri tepelnom šoku, ochraňoval zvýšený obsah bunkovej hsp70 bunky proti dôsledkom ďalšej ischémie, ktorá by inak spôsobovala nekrózu (DAS, D. K. et al., Cardiovascular Res: 578, 1993). Toto bolo pozorované tiež, keď boli ischémii podrobené potkanie bunky v bunkovej štruktúre (J. Clin. Invest. 93: 759 - 767 (1994)). Podľa tohto teda bielkoviny tepelného šoku syntetizované bunkami myokardu poskytujú ochranu proti ischemickému poškodeniu.
Situácia v mozgovom tkanive je podobná, pričom cerebrálna ischémia vedie k zvýšeniu expresie bielkovín tepelného šoku v mozgovom tkanive. Experimenty tiež potvrdili, že predchádzajúce pôsobenie subletálnej ischémie na zvieratá indukuje bielkovinu tepelného šoku (hsp70) a chráni mozog proti závažnejšiemu následnému ischemickému napadnutiu (Šimon et al., Neurosci. Lett. 163: 135 - 137 (1993)).
Ešte ďalší príklad fyziologického stresu tkanív a orgánov spojený s molekulovými chaperónmi poskytuje zápalové ochorenie. Zápal je nešpecifickou odpoveďou hosti teľských buniek na preniknutie cudzej látky, ako je to v prípadoch infekcie rôznymi bakteriálnymi a vírusovými patogénmi a zahrnuje zhlukovanie a aktiváciu leukocytov v mieste poranenia, čo vedie k tvorbe a uvoľneniu vysokých hladín reaktívnych foriem kyslíka a cytokínov. Tieto cytokíny a reaktívne kyslíkové radikály napádajú patogén, ale poškodzujú tiež hostiteľské tkanivo (Jacquier, Sarlin, Experientia 50: 1031 - 1038 (1994)). Uvažuje sa, že ako ochranu proti týmto toxickým mediátorom zápalu zvyšuje hostiteľské tkanivo produkciu molekulových chaperónov. Takto produkované molekulové chaperóny chránia hostiteľské bunky pred poškodením spôsobovaným reaktívnymi formami kyslíka a ochraňujú bunky pred cytotoxicitou TNF a iných cytokínov a reaktívnych kyslíkových radikálov. V štúdiách na zvieratách bolo dokázané, že predchádzajúce vystavenie zvieraťa tepelnému šoku, ktorý spôsoboval nárast expresie bielkoviny tepelného šoku (hsp70), viedlo ku značnému zníženiu pulmonámych zápalov. Podľa tohto teda majú molekulové chaperóny protizápalovú funkciu.
Príklady uvedené ilustrujú schopnosť molekulových chaperónov chrániť bunky pred rôznymi fyziologickými stresmi, ktoré narušujú bunkovú homeostatickú rovnováhu a spôsobujú poškodenie buniek. Pri molekulových chaperónoch sa tiež ukázalo, že sú výhodné pri liečení neoplaziem. Bolo napríklad uvedené, že ak sa nádorové bunky transfekujú génom kódujúcim molekulový chaperón (65 kd hsp), strácajú svoju tumorigenicitu alebo vykazujú jej pokles (PCT prihláška č. PCT/GB93/02339). Ďalej bolo tiež uvedené, že nádorové bunky v odpovedi na tepelný šok exprimujú molekulové chaperóny v zvýšenom množstve. Tie však nie sú prítomné v cytoplazme, ale na povrchu bunkových membrán (Ferrarini M. et al., Int. J. Cancer. 51:613619 (1992)). Zvýšená prítomnosť molekulových chaperónov na bunkových povrchoch koreluje so zvýšenou citlivosťou NK (prirodzených zabíjacích) buniek na nádorové bunky, umožňujúcou lepšie cielenie, infiltráciu a zabíjanie nádorových buniek NK bunkami (Kurosawa et al., Eur. J. Immunol. 23: 1029(1993)).
Vzhľadom na výhody spojené so zvýšenou expresiou molekulových chaperónov v bunkách by bola metóda na zvýšenie tejto expresie alebo zvýšenie aktivity molekulových chaperónov veľmi žiaduca.
Podstata vynálezu
Predložený vynález sa týka použitia chemickej zlúčeniny na prípravu farmaceutického prostriedku na zvýšenie expresie molekulových chaperónov exprimovaných bunkou, ktorá je vystavená fyziologickému stresu na zvýšenie expresie molekulového chaperónu v bunke nad množstvo vyvolané daným fyziologickým stresom, pričom chemickou zlúčeninou je hydroxylamínový derivát, ktorého tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II) alebo jeho soľ, a/alebo akýkoľvek jeho opticky aktívny stereoizomér,
kde
A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti, aryl, substituovaný aryl, heteroaryl alebo substituovaný hcteroaryl,
Z je kovalentná väzba, kyslík alebo =NR', kde R je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu a aralkylu substituovaného v arylovej a/alebo alkylovej časti,
R je alkyl alebo substituovaný alkyl,
X v tautomére všeobecného vzorca (I) je halogén alebo substituovaný hydroxyl alebo amín, monosubstituovaný amín alebo disubstituovaný amín, a
X v tautomére všeobecného vzorca (II) je kyslík, imín alebo substituovaný imín, a
R' je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl majúci substituovanú arylovú alebo alkylovú časť, a acyl alebo substituovaný acyl, a zlúčeniny všeobecného vzorca (I) prípadne obsahujú intramolekulové kruhové štruktúry vytvorené spojením X a reaktívneho substituenta.
V použití podľa vynálezu sa na bunku pôsobí pred fyziologickým stresom aj po fyziologickom strese.
Iným neobmedzujúcim uskutočnením vynálezu je použitie chemickej zlúčeniny na prípravu farmaceutického prostriedku na zvýšenie aktivity molekulového chaperónu v eukaryotickej bunke, ktorá je vystavená fyziologickému stresu na zvýšenie aktivity molekulového chaperónu v bunke nad množstvo vyvolané daným fyziologickým stresom, pričom chemickou zlúčeninou je hydroxylaminový derivát, ktorého tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II) alebo jeho soľ, a/alebo akýkoľvek jeho opticky aktívny stereoizomér, x x (I) (I) kde
A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti, aryl, substituovaný aryl, heteroaryl alebo substituovaný heteroaryl,
Zje kovalentná väzba, kyslík alebo =NR , kde R je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu a aralkylu substituovaného v arylovej a/alebo alkylovej časti,
R je alkyl alebo substituovaný alkyl,
X v tautomére všeobecného vzorca (I) je halogén alebo substituovaný hydroxyl alebo amín, monosubstituovaný amín alebo disubstituovaný amín, a
X v tautomére všeobecného vzorca (II) je kyslík, imín alebo substituovaný imín, a
R' je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl majúci substituovanú arylovú alebo alkylovú časť, a acyl alebo substituovaný acyl, a zlúčeniny všeobecného vzorca (I) prípadne obsahujú intramolekulové kruhové štruktúry vytvorené spojením X a reaktívneho substituenta.
Iným predmetom je použitie chemickej zlúčeniny na prípravu farmaceutického prostriedku alebo prípadne kozmetického prostriedku na liečenie choroby spojenej s funkciou chaperónového systému alebo spojenej s poškodením bunkovej membrány alebo membrány bunkovej organely, alebo na jej prevenciu, pričom chemickou zlúčeninou je hydroxylaminový derivát opísaný skôr.
Ešte ďalším uskutočnením vynálezu je použitie hydroxylaminového derivátu na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie kardiovaskulárnych, vaskulámych, mozgových, alergických, imunitných, autoimúnnych ochorení, chorôb vírusového alebo bakteriálneho pôvodu, nádorových ochorení, chorôb kože a/alebo sliznice, alebo chorôb epitelu obličkových kanálikov alebo stavov, ktoré môžu byť liečené kozmetickou intervenciou.
Vynález sa tiež týka nových hydroxylaminových derivátov, ktoré majú široký rozsah biologických účinkov a vhodných na zvýšenie hladiny molekulových chaperónov v organizmoch alebo aktivity týchto molekulových chaperónov a na prípravu farmaceutických alebo kozmetických prostriedkov vhodných na tento účel.
Ďalší predmet predloženého vynálezu predstavujú farmaceutické a kozmetické prostriedky, ktoré obsahujú nové hydroxylamínové deriváty spoločne s nosičmi a pomocnými látkami, ktoré sú všeobecne prijateľné v takýchto prostriedkoch.
Tento vynález je aspoň čiastočne založený na neočakávanom objave, že hydroxylamínové deriváty, ktoré majú opísané štruktúry, sú schopné pri použití na pôsobenie na bunky zvyšovať množstvo molekulových chaperónov produkovaných týmito bunkami alebo zvyšovať ich aktivitu. Tento účinok je obzvlášť veľký, keď sú dané bunky pod fyziologickým stresom, ktorý indukuje expresiu molekulových chaperónov. V týchto prípadoch chemické zlúčeniny zvyšujú expresiu molekulových chaperónov na množstvo vyvolané fyziologickým stresom samotným. Tento objav je významný z hľadiska úlohy, ktoré molekulové chaperóny zohrávajú v bunkách, ktorou sa samotné chránia pred patologickými účinkami rôznych chorôb. Teda, keď je nejaká zlúčenina schopná zvyšovať množstvo alebo aktivitu molekulových chaperónov exprimovaných bunkami, umožní to bunkám ochranu pred škodlivými účinkami chorôb alebo nápravu poškodenia nimi spôsobenú.
Hydroxylamínové deriváty, ktorých tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II) alebo jeho soľ, a/alebo akýkoľvek jeho opticky aktívny stereoizomér,
I ω (O kde
A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti, aryl, substituovaný aryl, heteroaryl alebo substituovaný heteroaryl,
Zje kovalentná väzba, kyslík alebo =NR', kde R' je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu a aralkylu substituovaného v arylovej a/alebo alkylovej časti, R je alkyl alebo substituovaný alkyl,
X v tautomére všeobecného vzorca (I) je halogén alebo substituovaný hydroxyl alebo amín, monosubstituovaný amin alebo disubstituovaný amín, a
X v tautomére všeobecného vzorca (II) je kyslík, imín alebo substituovaný imín, a
R' je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl majúci substituovanú arylovú alebo alkylovú časť, a acyl alebo substituovaný acyl, a zlúčeniny všeobecného vzorca (I) pripadne obsahujú intramolekulové kruhové štruktúry vytvorené spojením X a reaktívneho substituenta.
Tam, kde sa uvádza „alkyl“, rozumejú sa priame alebo rozvetvené alkylové skupiny zahŕňajúce krátke a dlhé reťazce. Typický počet uhlíkových atómov výhodných alkylových skupín s krátkym reťazcom sa pohybuje od 1 do 8 a skupinou môže byť metylová, etylová, izopropylová, butylová, sek-butylová, pentylová, íerc-pentylová, hexylová, heptylová a oktylová skupina, a podobne, výhodnejšie sa pohybuje od 1 do 6 a skupinou môže byť metylová, etylo vá, izopropylová, butylová, sec-butylová, pentylová, terc-pentylová a hexylová skupina.
Typický počet uhlíkových atómov výhodných alkylových skupín s dlhým reťazcom sa pohybuje od 9 do 21 a skupinou môže byť nonylová, decylová, undecylová, dodecylová, tridecylová, tetradecylová, pentadecylová, hexadecylová, heptadecylová, oktadecylová, nonadecylová, eicosylová a heneicosylová skupina, a podobne, výhodnejšie sa pohybuje od 9 do 17 a skupinou môže byť nonylová, decylová, undecylová, dodecylová, tridecylová, tetradecylová, pentadecylová, hexadecylová a heptadecylová skupina.
Výhodná cykloalkylová skupina znamená cykloalkylovú skupinu, ktorá má krátky cykloalkylový reťazec od 3 do 8, a skupinou môže byť cyklopropylová, cyklobutylová, cyklohexylová, cykloheptylová a cyklooktylová skupina, a podobne výhodnejšie od 3 do 7, a skupinou môže byť cyklopropylová, cyklobutylová, cyklohexylová a cykloheptylová skupina.
Prípadne substituovaný aryl alebo alkyl znamená arylovú alebo alkylovú skupinu, ktorá má jednu alebo viac substituovaných skupín, ako je kyano-, hydroxylová, krátka alkylová (napr. metylová, etylová, propylová, izopropylová, butylová, izobutylová, sec-butylová, pentylová, terc-pentylová, hexylová, heptylová, oktylová a podobne), krátka alkoxylová (napr. metoxylová, etoxylová, propoxylová, izopropoxylová, butoxylová, izobutoxylová, sec-butoxylová, terc-butoxylová, pentoxylová, terc-pentyloxylová, hexylová a podobne), arylová (napr. fenylová, naftylová a podobne), nitro-, amino-, aminomonosubstituovaná krátkym alkylom (napr. metyl, etyl, propyl, izopropyl, terc-butyl) amino- a podobne, amino- disubstituované krátkymi alkylmi (napr. dimetylamino-, dietylamino-, dipropylamino-, diizopropylamino-, dibutylamino-, dipentylamino-, dihexylamino-, a podobne), skupina mono-, di- alebo trihalogénového krátkeho alkylu (napr. chlórmetylová, 2,2-dichlóretylová, trifluórmetylová a podobne) alebo halogénový atóm (napr. atóm fluóru, brómu a jódu), ako i podobné.
Výhodná alkylová skupina znamená alkylovú skupinu s krátkym reťazcom, ako je opísané, substituovanú jednou alebo viacerými arylovými skupinami (prípadne substituovanú), a môže ňou byť skupina benzyl-, benzhydryl-, trityl-, 1-fenyletyl-, 2-fenyletyl-, 2-benzhydryletyl-, 3-fenylpropyl, 1 -metyl-2-fenyl-etyl-, 1-fenylbutyl-, 4-tritylbutyl-, 1,1-dimetyl-2-fenetyl-, 4-fenylbutyl-, 5-fenylpentyl-, 6-fenylhexyl- a podobne, výhodnejšie nižšie alkylové skupiny s 1 až 4 uhlíkovými atómami substituovanými fenylovou skupinou, a môže ňou byť skupina benzyl-, 2-fenyletyl, 1-metyl-2-fenyletyl-. Výhodnými arylovými skupinami môžu byť skupiny fenyl-, naftyl-, pentalenyl-, antracenyl- a podobne, výhodnejšími skupiny fenyl- a naftyl-.
Výhodná 3- až 8-členná, výhodnejšie 5- až 8-členná, nasýtená heterocyklická N-obsahujúca skupina znamená nasýtenú heterocyklickú skupinu obsahujúcu 1 - 4 dusíkové atómy, a môže ňou byť skupina aziridinyl-, azatidinyl-, oxaziranyl-, pyrolidinyl-, imidazolidinyl-, pyrazolidinyl-, perhydrotiazolyl-, perhydroizoxazolyl-, piperidinyl-, piperazinyl-, perhydropiperidinyl-, perhydropiperazinyl-, morfolinyl-, perhydro-lH-azepinyl- a podobne.
Výhodná heteroarylová skupina znamená nenasýtenú 3až 8-člennú, výhodnejšie 5- až 8-člennú, 1 až 4 dusíky obsahujúcu nenasýtenú heteromonocyklickú skupinu a môže ňou byť skupina pyrolyl-, pyrolinyl-, imidazolyl-, pyrazolyl-, pyridyl- a jej N-oxid, pyrimidyl-, pyrazinyl-, pyridazinyl-, triazolyl, tetrazolyl-, dihydrotriazinyl a podobne, alebo znamená nenasýtenú 1 - 5 dusíkov obsahujúcu kondenzovanú heterocyklickú skupinu a môže ňou byť skupina indolyl-, izoindolyl-, indolizinyl-, benzimidazolyl-, chino lyl-, izochinolyl-, indazolyl-, benzotriazolyl-, tetrazolopiridyl-, tetrazolopiridazinyl-, dihydrotriazolopyridazinyl- a podobne, alebo znamená 3- až 6-člennú, výhodnejšie 5- až 6-člennú, 1-2 kyslíky a 1 - 3 dusíky obsahujúcu nenasýtenú heteromonocyklickú skupinu a môže ňou byť skupina oxazolyl-, izoxazolyl-, oxadiazolyl-(l,2,4-oxadiazolyl- a iné) a podobne, alebo znamená nenasýtenú 1-2 kyslíky a 1 - 3 dusíky obsahujúcu kondenzovanú heterocyklickú skupinu a môže ňou byť skupina benzoxazolyl-, benzoxadiazolyl-, a podobne, alebo znamená 3-až 8- člennú, výhodnejšie 5- až 6-člennú, 1 - 2 síry a 1 -dusíky obsahujúcu nenasýtenú heteromonocyklickú skupinu a môže ňou byť skupina tienylu, alebo znamená 1 kyslík obsahujúcu nenasýtenú heteromonocyklickú skupinu a môže ňou byť skupina furylu, alebo znamená nenasýtenú 1-2 síry a 1 - 2 dusíky obsahujúcu kondenzovanú heterocyklickú skupinu a môže ňou byť skupina benzotiazolyl-, benzotiadiazolyl- a podobne.
Výhodná „acylová“ skupina samotná alebo ako vytvárajúca časť acylovanej skupiny, znamená výhodne acylovú skupinu, ktorou môže byť alkanoyl- s krátkym reťazcom (napr. formyl-, acetyl-, propionyl-, butyryl- a podobne), alkoxykarbonyl- s krátkym reťazcom (napr. metoxykarbonyl-, etoxykarbonyl-, propoxykarbonyl-, butoxykarbonyl-, tercbutoxykarbonyl- a podobne), alkylsulfonyl-, s krátkym reťazcom (napr. metylsulfonyl-, etylsulfonyl- a podobne), arylsulfonyl- (napr. fenylsulfonyl- a podobne), aroyl- (napr. benzoyl-, naftoyl-, a podobne), aryl-(alkanoyl s krátkym reťazcom)-, (napr. fenylacetyl-, fenylpropionyl a podobne), cyklo-(alkyl s krátkym reťazcom)-, (alkanoyl s krátkym reťazcom)-, (napr. cyklohexylacetyl a podobne), aryl-(alkoxy s krátkym reťazcomj-karbonyl- (napr. benzyloxykarbonyl a podobne), arylkarbamoyl- (napr. fenylkarbamoyl-, naftylkarbamoyl- a podobne), cykloalkylkarbamoyl- (napr. cyklohexylkarbamoyl- a podobne), skupina heteromonocyklického sulfonylu (napr. tienylsulfonylu, furylsulfonylu a podobne), a daná acylová skupina môže byť prípadne substituovaná 1-3 substituentmi, ako je napísané v odseku „prípadne substituovaná“.
Výhodná ω-aminoalkylová skupina znamená alkylovú skupinu s krátkym reťazcom obsahujúcu substituovaný N-atóm v polohe alkylového reťazca a v ktorej je alkylový reťazec prípadne substituovaný jedným alebo viac substituentmi, výhodne jedným alebo dvoma halogénmi (napr. chlórom, brómom, fluórom, jódom), hydroxylovou skupinou, alebo acetylénovou skupinou, kde acylová skupina je, ako bola definovaná, výhodnejšie jednou alebo dvoma alkylovými skupinami s krátkym reťazcom, pričom definícia „alkylu“ je rovnaká ako vyššie. N-Atóm v polohe alkylového reťazca môže byť substituovaný jednou alebo dvoma alkylovými skupinami s krátkym reťazcom, výhodne metylom, etylom, terc-butylom a podobne, cykloalkylkarbamoylom (napr. cyklohexylkarbamoylom a podobne), výhodnejšie môže byť N-atóm súčasťou nasýtenej heterocyklickej skupiny, ktorá obsahuje 1-4 dusíkové atómy a ktorou môže byť skupina aziridinyl-, azatidinyl-, oxaziranyl-, pyrolidinyl-, imidazolidinyl-, pyrazolidinyl-, perhydrotiazolyl-, perhydroizoxazolyl-, piperidinyl-, piperazinyl-, perhydropipcridinyl-, perhydropiperazinyl-, morfolinyl-, perhydro-1 H-azepinyl- a podobne, N-atóm v polohe môže byť substituovaný arylovou skupinou (napr. fenylovou a podobne) a môže byť kvartemarizovaný krátkym alkylovým substituentom alebo oxidovaný.
Ak je žiaduce, voľné bázy všeobecných vzorcov (I) a (II) môžu byť premenené na adičné soli kyselín reakciou s organickými kyselinami a môžu byť acetáty, maleináty a podobne, alebo reakciou s anorganickými kyselinami a môžu byť hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy, sulfáty, fosfáty a podobne, alebo reakciou s aminokyselinami a môžu byť arginínové soli, soli kyseliny glutámovej a podobne.
V jednom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínového derivátu štruktúry I je Z kovalentná väzba alebo halogén, výhodne chlór alebo bróm. Výhodné zlúčeniny patriace k tejto skupine majú ako A: a) aralkyl alebo aralkyl so substituovanou arylovou časťou, výhodne fenyl alkyl alebo fenyl alkyl, ktorý má jeden alebo dva substituenty, výhodne alkoxy, b) aryl alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo substituovaný fenyl, výhodne substituovaný fenyl obsahujúci jeden alebo viac alkylov, halogénov, haloalkylov, alkoxylov alebo nitroskupín, c) naftyl, d) N-obsahujúcu heteroarylovú skupinu vrátane tých, čo môžu byť kondenzované s benzénovým jadrom, výhodne pyridyl, e) S-obsahujúcu heteroarylovú skupinu, f) O-obsahujúcu heteroarylovú skupinu. Výhodné zlúčeniny patriace k tejto skupine majú ako R: a) ω-amino alkyl, b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acyloxy skupinou, výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti. Z ω-aminoalkyl skupín a) až d) sú zvlášť výhodné tie, ktoré majú 3-8 uhlíkových atómov v alkylovej časti.
Určité typy hydroxylamínových derivátov štruktúry I, ktoré majú kovalentnú väzbu ako Z a halogén ako X, sú zverejnené v US patentoch č. 5 147 879, 5 328 906 a 5 296 606. Tieto zlúčeniny môžu byť pripravené postupmi opísanými v citovaných US patentoch, výhodne diazotáciou zodpovedajúcich X=NH2 derivátov v prítomnosti príslušného hydrohalidu. Východiskové zlúčeniny možno získať známymi postupmi opísanými napr. v maďarskom patente č. 111 578 (1976), konkrétne spojením amidoximu štruktúry 1 (R1 = R2 = H) s napr. reaktívnym derivátom štruktúry 2 v prítomnosti bázy, a môžu byť diazotované obvykle bez izolácie a purifikácie. Koncové skupiny A a R daných zlúčenín môžu byť ďalej amidifikované a derivované podľa potreby.
V inom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínového derivátu štruktúry I je Z kovalentná väzba a X je hydroxy skupina OQ, kde Q je nesubstituovanú alebo substituovaná alkylová alebo aralkylová skupina. Vo výhodnom uskutočnení je Q priamy alebo rozvetvený alkyl. V týchto zlúčeninách je A aryl alebo heteroaryl, výhodne N-obsahujúca heteroarylovú skupina, a R je výhodne: a) ω-amino alkyl, b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť, c) -amino alkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, d) -amino alkyl, ktorý má mono alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acylovou skupinou výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti. Z ω-aminoalkyl skupín
a) až d) sú zvlášť výhodné tie, ktoré majú 3 - 8 uhlíkových atómov v alkylovej časti.
Zvláštna skupina hydroxyamínových derivátov štruktúry I, kde Z je kovalentná väzba a X je OQ má štruktúru ľ. Štruktúra ľ obsahuje cyklus uzavretý prostredníctvom hydroxylovej skupiny. Tieto zlúčeniny predstavujú cyklickú formu zlúčenín štruktúry I, pričom R je -CH2-CH(OH)-R. R je priamy alebo rozvetvený alkyl, alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne -amino alkyl, ktorý je prípadne substituovaný na svoje aminoskupine a výhodne obsahuje Cj.5 priamy alebo rozvetvený alkylový reťazec. Najvýhodnejšie R je -amino alkyl mono- alebo disubstituovaný na aminoskupine, kde aminosubstituenty nezávisle od sebe môžu byť jeden alebo dva priame alebo rozvetvené alkyly alebo cykloalkyly, alebo dva aminosubstituenty spolu s priľahlým N-atómom tvoria 3- až 7-, výhodne 5- až 7-členný heterocyklus, ktorý pripadne obsahuje ďalší heteroatóm. Z tohto majú výhodné zlúčeniny A, kto rým je fenyl, substituovaný fenyl, N-obsahujúci heteroaryl substituovaný N-obsahujúci heteroaryl, S-obsahujúci heteroaryl alebo substituovaný S-obsahujúci heteroaryl.
Hydroxylamínové deriváty štruktúry I, ktoré majú kovalentnú väzbu ako Z a OQ, ako X sú zverejnené v maďarskej patentovej prihláške č. 2385/1992. Tieto zlúčeniny možno pripraviť zo zodpovedajúcich halogénových derivátov uvedenej skupiny (hydroxylamínových derivátov štruktúry I, kde Z je kovalentná väzba a X je halogén) postupmi opísanými v maďarskej patentovej prihláške č. 2385/1992, napr. reakciou s alkoxidmi alebo alkalickým uzavretím cyklu pre cyklické zlúčeniny štruktúry ľ.
V jednom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínového derivátu štruktúry I je Z kovalentná väzba a X je NR‘R2, kde R1 a R2 nezávisle od seba sú H, priamy alebo rozvetvený alkyl, alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, cykloalkyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom k ním pripojeným tvorí nasýtený 3- až 7-, výhodne nasýtený 5- až 7-členný cyklus.
Zo zlúčenín opísaných v práve predchádzajúcom odseku sú zvlášť výhodné tie, v ktorých je R a) ω-amino alkyl,
b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť, c) ω-amino alkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, d) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acyloxy skupinou výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti. Z týchto zlúčenín sú výhodnejšie tie, ktorých A je a) aralkyl alebo aralkyl so substituovanou arylovou časťou, výhodne fenyl alkyl alebo fenyl alkyl, ktorý má jeden alebo dva substituenty, výhodne alkoxy, b) aryl alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo substituovaný fenyl, výhodne substituovaný fenyl obsahujúci jeden alebo viac alkylov, halogénov, haloalkylov, alkoxylov, nitroskupín alebo acylaminoskupín, c) naftyl, d) N-obsahujúcu heteroarylovú skupinu vrátane tých, čo môžu byť kondenzované s benzénovým jadrom, výhodne pyridyl,
e) S-obsahujúcu heteroarylovú skupinu, f) O-obsahujúcu heteroarylovú skupinu.
Hydroxylamínové deriváty štruktúry I, kde Z je kovalentná väzba a X je NR’R2 zahrnujú známe, a tiež nové deriváty. Zlúčeniny, kde X je NH2 sú zverejnené v maďarskom patente č. 177578 (1976) a možno ich syntetizovať alkyláciou amidoximových derivátov štruktúry 1 (štruktúra I, kde RI=R2=H) s reaktívnym derivátom štruktúry 2 v prítomnosti bázy.
Zvláštna skupina hydroxyamínových derivátov štruktúry I, kde Zje kovalentná väzba a X je NR‘R2 je poskytnutá štruktúrou I.
Štruktúra I predstavuje cyklickú formu štruktúry I, ktorá obsahuje cyklus uzavretý prostredníctvom skupiny NR*R2. Tieto zlúčeniny môžu byť odvodené zo zlúčenín štruktúry I, pričom R2 je H a R je -CH2-CH(OH)-R. R jc priamy alebo rozvetvený alkyl, alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl.
Zo zlúčenín štruktúry I sú výhodné tie, ktorých A je a) aryl alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo substituovaný fenyl, výhodne substituovaný fenyl obsahujúci jeden alebo viac alkylov, halogénov, haloalkylov, alkoxylov alebo nitroskupín, b) naftyl, c) N-obsahujúcu heteroarylovú skupinu vrátane tých, čo môžu byť kondenzované s benzénovým jadrom, výhodne pyridyl, d) S-obsahujúcu heteroarylovú skupinu, e) O-obsahujúcu heteroarylovú skupinu. Zvlášť výhodné sú tie zlúčeniny, ktoré obsahujú R, ktorým je: a) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť, b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť. Výhodne alkylová časť ω-aminoalkylu z a) a b) obsa
SK 284823 Β6 huje 1 - 5 uhlíkových atómov. Zvlášť výhodné sú -aminoalkylové skupiny, ktoré majú disubstituovanú amino časť, pričom dané substituenty spolu s priľahlým N-atómom tvoria 3- až 7-, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus. Tento heterocyklus môže obsahovať ďalší heteroatóm(y).
V týchto ω-aminoalkylových skupinách je aminosubstituentom výhodne priamy alebo rozvetvený alkyl alebo cykloalkyl. V zlúčeninách všeobecného vzorca ľ' je R1 vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, cykloalkyl, nesubstituovaný aralkyl alebo aralkyl substituovaný v arylovej alebo alkylovej časti.
Zlúčeniny štruktúry I možno pripravovať uzavretím cyklu medzi atómami N(4)-C(5). Potrebné deriváty s otvoreným reťazcom sú zlúčeniny štruktúry I, kde Z je kovalentná väzba, X je NR1 R2 a R1 je, ako je definované v súvislosti so zlúčeninami všeobecného vzorca (I), R2 je H a R je skupina vzorca -CH2-CHY5-R, kde Y5 predstavuje odchádzajúcu skupinu, napr. halogénový atóm. Takéto deriváty možno získať zo zodpovedajúcich Y5=OH zlúčenín s anorganickými halogenačnými činidlami, napr. tionylchloridom alebo chloridom fosforečným. Halogenáciu možno uskutočňovať s inertným rozpúšťadlom alebo bez inertného rozpúšťadla, napr. s benzénom, chloroformom, tetrahydrofuránom, atď., obvykle za varu. Po odstránení zvyšku činidla, napr. po odparení tionylchloridu, sa surový halogénderivát cyklizuje - buď po izolácii alebo purifikácii alebo bez nich - pôsobením silnej bázy, napr. butoxidu sodného v t-butanole za vzniku zlúčeniny ľ, ktorá sa nakoniec izoluje a puriftkuje štandardnými postupmi (extrakciou, rekryštalizáciou, atď.)
V jednom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínového derivátu štruktúry I je Z kovalentná väzba a X je OQ, kde Q je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl alebo aralkyl, ktorý má substituovanú arylovú časť alebo substituovanú alkylovú časť. Alkyl alebo substituovaný alkyl, ktorým je Q, má výhodne 1 - 4 uhlíkové atómy. Z týchto zlúčenín sú výhodné tie, ktorých A je alkyl alebo substituovaný alkyl, výhodne s 1 - 4 uhlíkovými atómami, alebo aralkyl alebo aralkyl, ktorý má susbstituovanú arylovú časť alebo substituovanú alkylovú časť. Z týchto zlúčenín sú výhodné tie, ktorých R je : a) ω-amino alkyl, b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť,
c) ω-amino alkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, d) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acyloxy skupinou výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti.
Tieto hydroxylamínové deriváty štruktúry I, kde Z je kovalentná väzba a X je OQ možno získať v reakcii O-substituovaných hydroxylaminov, ktoré majú štruktúru 6 (pozri napr. Ger. Off. 2 651 083 (1976)) a ortoesterov so štruktúrou 7. Kondenzácia sa obvykle uskutočňuje v samotnom činidle ako rozpúšťadle, výhodne za varu. Po odparení sa produkt izoluje kryštalizáciou, v niektorých prípadoch (keď je v bočnom reťazci R aminofunkcia) vo forme adičnej soli kyseliny.
V jednom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínového derivátu štruktúry I je Z kyslík a X je NR’R2, kde R1 a R2 nezávisle od seba sú H, priamy alebo rozvetvený alkyl, substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, cykloalkyl, aryl, substituovaný aryl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom k ním pripojeným tvorí nasýtený 3- až 7-, výhodne nasýtený 5- až 7-členný cyklus. Z týchto zlúčenín sú výhodné tie, ktorých R je : a) ω-amino alkyl, b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť, c) ω-amino alkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, d) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amí novú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acyloxy skupinou výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti. Z ω-aminoalkyl skupín a) až d) sú zvlášť výhodné tie, ktoré majú 3 - 8 uhlíkových atómov v alkylovej časti. Z týchto zlúčenín sú výhodnejšie tie, ktorých A je a) alkyl alebo substituovaný alkyl, b) aralkyl alebo aralkyl so substituovanou arylovou a/alebo substituovanou alkylovou časťou, c) aryl alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo substituovaný fenyl. Prípravu týchto zlúčenín možno uskutočňovať, ako je opísané, pričom metódy závisia od povahy X, konkrétne od toho, či X je nesubstituovaná amino- (NH2) alebo substituovaná amino- funkčná skupina.
a) Prípravu zlúčenín, kde X je NH2 možno uskutočňovať adíciou hydroxylamínu štruktúry 6 na organický kyanát štruktúry A-O-CN (pozri napr. Chem. Ber. 98., 144 (1965)). Reakcia sa uskutočňuje výhodne v inertnom organickom rozpúšťadle, obvykle pri izbovej teplote. Izolácia často vyžaduje chromatografické čistenie.
b) Zlúčeniny, ktorých X je monosubstituovaná aminoskupina (napr. NHR1) sa pripravujú zo známych haloformimidov štruktúry 9 (pozri napr. Houben-Weil „Methoden der Organoschen Chemie“, zv. E/4, str. 544 (1983)) a zlúčeniny štruktúry 6, v prítomnosti organickej bázy (napr. trietylamínu) alebo anorganickej bázy, ako je uhličitan sodný, v inertnom rozpúšťadle, ako je benzén, tetrahydrofurán, atď., s následnými štandardnými postupmi spracovania a čistenia.
c) Deriváty, kde X je disubstituovaná aminoskupina možno pripravovať reakciou sekundárneho amínu štruktúry 5 so zlúčeninou štruktúry 1, kde Z je kyslík a X je OQ (príprava týchto derivátov je opísaná). Tieto aminačné reakcie sa uskutočňujú v polárnych organických rozpúšťadlách, napr. etanole, ak je to potrebné, s refluxovaním.
V inom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínového derivátu štruktúry I je Z =NR3, kde R3 je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl, ktorý má substituovanú arylovú alebo substituovanú alkylovú časť, kde X je NR’R2, kde R1 a R2 nezávisle od seba sú H, priamy alebo rozvetvený alkyl, substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, aryl alebo substituovaný aryl, cykloalkyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom k ním pripojeným tvorí nasýtený 3- až 7-, výhodne nasýtený 5- až 7-členný cyklus. Z týchto zlúčenín sú výhodné tie, ktorých A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl alebo aralkyl so substituovanou arylovou alebo substituovanou alkylovou časťou, arylová alebo substituovaná arylová skupina. Výhodné R pre zlúčeniny patriace do tejto skupiny hydroxylamínových derivátov je a) ω-amino alkyl, b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť, c) ω-amino alkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, d) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acyloxy skupinou výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti. Je výhodné, keď alkylové časti ω-aminoalkyl skupín a) až d) obsahujú 3 - 8 uhlíkových atómov v alkylovej časti.
Dané hydroxylamínové deriváty štruktúry I, kde Zje =NR3 a X je NR*R2, možno pripravovať aminolýzou zodpovedajúcich izomočovinových derivátov, patriacich do skupiny zlúčenín opísaných skôr (táto skupina zodpovedá hydroxylamínovým derivátom štruktúry I, ktoré majú Z kyslík a X je NR’R2, s amóniom alebo primárnym alebo sekundárnym amínom. Táto reakcia sa uskutočňuje výhodne v polárnom rozpúšťadle, napr. vo vode alebo etanole, s použitím prebytku amínu. Alternatívne môžu byť haloformamidy štruktúry 10 (Houben-Weil „Methoden der Organischen Chemie“, zv. E/4, str. 544 (1983)) dané do reakcie so zlúčeninami štruktúry 6, v prítomnosti organickej alebo anorganickej bázy, tiež za vzniku zlúčenín tejto skupiny. Reakcia sa uskutočňuje v inertnom organickom rozpúšťadle, obvykle pri izbovej teplote. Zlúčeniny, kde R je skupina všeobecného vzorca b), kde R7 je acyl, sa pripravujú esterifikáciou zodpovedajúcich zlúčenín obsahujúcich vodík ako R7. Alkyl- alebo arylestery sa obvykle získavajú s použitím chloridu alebo anhydridu kyseliny v prítomnosti terciálneho amínu alebo anorganickej bázy, výhodne v inertnom rozpúšťadle.
Iná skupina hydroxylaminových derivátov užitočných v tomto vynáleze má štruktúru II, ktorá predstavuje tautomému formu zlúčenín štruktúry I. V jednom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínového derivátu štruktúry II je Z kovalentná väzba a X je kyslík. Výhodné zlúčeniny patriace do tejto skupiny majú A, ktorým je; alkyl, aralkyl alebo aralkyl so substituovanou arylovou alebo alkylovou časťou, b) aryl alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo substituovaný fenyl, výhodne substituovaný fenyl obsahujúci jeden alebo viac substituentov, pričom preferované skupiny substituentov zahrnujú skupiny alkylov, haloalkylov a alkoxylov, c) N-obsahujúca heteroarylová skupina, výhodne piridyl, d) S-obsahujúca heteroarylová skupina. Pre zlúčeniny patriace do tejto skupiny je výhodné R: a) ω-amino alkyl, b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť, c) ω-amino alkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, d) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acyloxy skupinou výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti. Výhodné zlúčeniny tejto skupiny majú R', ktorým je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl, ktorý má substituovanú arylovú alebo substituovanú alkylovú časť.
Zlúčeniny patriace do tejto skupiny sú zverejnené v maďarskej patentovej prihláške č. 2385/1992. Tu sú opísané cesty na ich prípravu: Najvýhodnejšie môžu byť získané acyláciou O-substituovaných hydroxylaminových derivátov, ktoré majú štruktúru 6 (pozri tiež Ger. Off. 2 651 083 (1976)) s chloridom kyseliny, ktorý má štruktúru 11. Táto cesta môže byť využitá tiež na prípravu tých zlúčenín, kde R' je iné ako vodík, s použitím štruktúry 12 - namiesto štruktúry 6 - ako východiskovej látky.
V inom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínového derivátu štruktúry II je Z chemická väzba a X je =NR4, kde R4 je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl, ktorý má substituovanú arylovú alebo substituovanú alkylovú časť, cykloalkyl, a R' je alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl, ktorý má substituovanú arylovú alebo substituovanú alkylovú časť. Z týchto zlúčenín sú výhodné tie, ktorých A je: aralkyl alebo aralkyl so substituovanou arylovou časťou, výhodne fenylalkyl alebo fenylalkyl obsahujúci jeden alebo viacej substituentov, výhodne alkoxy, b) aryl alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo substituovaný fenyl obsahujúci jednu alebo viac alkylových, haloalkylových alebo nitroskupín, c) naftyl, d) N-obsahujúca heteroarylová skupina, výhodne piridyl, e) S-obsahujúca heteroarylová skupina. Výhodné zlúčeniny patriace do tejto skupiny majú R: a) ω-amino alkyl, b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť, c) ω-amino alkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, d) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acyloxy skupinou výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti. Z ω-aminoalkyl skupín a) až d) sú zvlášť: výhodné tie, ktoré obsahujú 3 - 8 uhlíkových atómov v alkylovej časti.
Tieto zlúčeniny možno pripraviť buď O-alkyláciou niektorého Ν,Ν'-disubstituovaného amidoximu štruktúry 13 s chemickou zlúčeninou, ktorá má štruktúru II (k reakčným podmienkam pozri prípravu zlúčenín štruktúry I, kde Z je kovalentná väzba a X je NR’R2), alebo O-acyláciou N,O-disubstituovaného hydroxylamínu všeobecného vzorca (12) s indolylhalidom všeobecného vzorca (16), pričom reakcia sa uskutočňuje v inertnom rozpúšťadle, výhodne v prítomnosti organického alebo anorganického kyslého vychytávača. Zlúčeniny, kde R je skupina všeobecného vzorca b), kde R7 je acyl, sa pripravujú esterifikáciou zodpovedajúcich zlúčenín obsahujúcich vodík ako R7. Alkyl- alebo arylestery sa obvykle získavajú použitím chloridu alebo anhydridu kyseliny v prítomnosti terciálneho amínu alebo anorganickej bázy, výhodne v inertnom rozpúšťadle.
V inom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínového derivátu štruktúry II je Z kyslík a X je kyslík. Výhodné zlúčeniny patriace do tejto skupiny majú A, ktorým je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl alebo aralkyl so substituovanou arylovou alebo alkylovou časťou. R je výhodne:
a) ω-amino alkyl, b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť, c) ω-amino alkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, d) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acyloxy skupinou výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti. Z ω-amino alkyl skupín a) až d) sú zvlášť výhodné tie, ktoré majú 3 - 8 uhlíkových atómov v alkylovej časti. Výhodné zlúčeniny tejto skupiny majú R', ktorým je alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl, ktorý má substituovanú arylovú alebo substituovanú alkylovú časť.
Zlúčeniny patriace do tejto skupiny sú zverejnené v maďarskom patente č. 1756/75 (podanom 15. júna 1995). Môžu byť pripravené acyláciou hydroxylamínu, ktorý má štruktúru 6 alebo štruktúru 12 s chlórmravčanom, ktorý má štruktúru 14, podobným spôsobom ako s jednoduchým chloridom kyseliny, ako je opísané pre syntézu zlúčenín štruktúry II, kde Z je kovalentná väzba a X je kyslík. Reakcia vyžaduje prítomnosť bázy, anorganickej alebo organickej, a môže sa uskutočňovať v inertnom rozpúšťadle, napr. chloroforme. Vedľajší produkt, soľ, sa odstráni napr. extrakciou vodou a produkt sa izoluje z organického roztoku.
V ešte inom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínového derivátu štruktúry II je Z kyslík, X je =NR4, kde R4 je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, aryl, substituovaný aryl, heteroarylová alebo substituovaná heteroarylová skupina. V týchto zlúčeninách je A výhodne alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, najvýhodnejšie nesubstituovaný alebo substituovaný fenyl, aralkyl alebo aralkyl so substituovanou arylovou alebo alkylovou častou a R je výhodne: a) ω-amino alkyl, ktorý obsahuje hydroxy- alebo acyloskupinu v alkylovom reťazci, pričom alkylový reťazec uvedenej ω-aminoalkylovej skupiny výhodne obsahuje 3-8 uhlíkových atómov. V týchto zlúčeninách je R' výhodne alkyl, aryl alebo aralkyl, ktorých skupiny môžu byť nesubstituované alebo substituované.
Tieto zlúčeniny sú N-substituovanými analógmi hydroxylamínových derivátov štruktúry I, kde Z je kyslík a X je NR’R2 a môžu byť pripravené podobne z haloformimidov štruktúry 9 a chemickej zlúčeniny štruktúry 12, v prítomnosti organickej bázy (napr. trietylaminu) alebo anorganickej bázy, ako je uhličitan sodný, v inertnom rozpúšťadle, ako je benzén, tetrahydrofurán, atď. následnými štandardnými postupmi spracovania a čistenia.
V inom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylaminového derivátu štruktúry II je Z =NR3, kde R3 je vybraný zo skupiny skladajúcej sa z vodíka, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu alebo aralkylu, ktorý má substituovanú arylovú alebo alkylovú časť, a X je kyslík. Výhodné zlúčeniny tejto skupiny majú A, ktorým je: aralkyl alebo aralkyl so substituovanou arylovou časťou, výhodne fenylalkyl alebo fenylalkyl, ktorý obsahuje jeden alebo viac substituentov, výhodne alkoxy b) aryl alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo substituovaný fenyl, obsahujúci jednu alebo viac alkylových, haloalkylových alebo nitroskupín, c) naftyl, d) N-obsahujúca heteroarylová skupina, výhodne pyridyl, e) S-obsahujúca heteroarylová skupina. Výhodné zlúčeniny patriace do tejto skupiny majú ako R: a) ω-amino alkyl, b) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť, c) ω-amino alkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, d) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acyloxy skupinou výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti. Z ω-amino alkyl skupín a) až d) sú zvlášť výhodné tie, ktoré majú 3 - 8 uhlíkových atómov v alkylovej časti. V týchto zlúčeninách je R' výhodne vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl, ktorý má substituovanú arylovú alebo substituovanú alkylovú časť, acylová alebo substituovaná acylová skupina.
Tieto zlúčeniny sú zverejnené v súčasnej podanej maďarskej patentovej prihláške č. 1756/95 a môžu byť pripravené reakciou hydroxylamínovej zlúčeniny so štruktúrou 15, v inertnom organickom rozpúšťadle, obvykle jednoduchým miešaním pri izbovej teplote počas 2-24 hodín. Nakoniec sa produkty izolujú - po odparení rozpúšťadla - výhodne pomocou kryštalizácie.
V jednom neobmedzujúcom uskutočnení hydroxylamínových derivátov štruktúry II je Z =NR3, kde R3 je vybraný zo skupiny skladajúcej sa z vodíka, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu, aralkylu, ktorý má substituovanú arylovú alebo substituovanú alkylovú časť, cykloalkylu, a R'je alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl, ktorý má substituovanú arylovú alebo substituovanú alkylovú časť. Výhodné zlúčeniny patriace do tejto skupiny majú ako R3 vodík, alkyl alebo substituovaný alkyl, a R4 je vodík alebo arylová skupina, A je alkyl, substituovaný alkyl, aryl alebo aralkyl, ktorý môže mať substituovanú arylovú a/alebo alkylovú časť. Z týchto zlúčenín sú výhodné tie, ktoré majú ako R: a) ω-amino alkyl, b) ω-amino alkyl, ktorý má monoalebo disubstituovanú amínovú časť, c) ω-amino alkyl, ktorý má substituovanú alkylovú časť, d) ω-amino alkyl, ktorý má mono- alebo disubstituovanú amínovú časť a tiež substituovanú alkylovú časť hydroxy alebo acyloxy skupinou výhodnou ako substitučnou skupinou alkylovej časti. Z ω-aminoalkyl skupín a) až d) sú zvlášť výhodné tie, ktoré obsahujú 3-8 uhlíkových atómov v alkylovej časti.
Prípravu zlúčenín patriacich do tejto skupiny možno uskutočniť aminolýzou zodpovedajúcich izomočovinových derivátov (zlúčenín so štruktúrou II, kde Z je kyslík a X je NR4) s primárnym alebo sekundárnym amínom alebo amóniom. Táto reakcia sa uskutočňuje v polárnom rozpúšťadle, napr. vode alebo etanole, s použitím prebytku amínu. Alternatívne môžu byť haloformamidy štruktúry 10 ponechané reagovať so zlúčeninami štruktúry 12 v prítomnosti organickej alebo anorganickej bázy v inertných rozpúšťadlách, obvykle pri ich teplote varu.
Jedno neobmedzujúce uskutočnenie hydroxylamínových derivátov štruktúry I definuje novú skupinu zlúčenín, kde X je halogén, výhodne chlór alebo bróm, Zje chemická väzba a A je skupina všeobecného vzorca (a), kde Y1 je halo-, alkoxy- alebo nitroskupina, alebo haloalkylová skupina, výhodne haloalkyl obsahujúci 1 -4 uhlíkové atómy, a n je 1, 2 alebo 3; alebo O-obsahujúci heteroaryl, výhodne furyl, S-obsahujúci heteroaryl (výhodne tienyl), N-obsahujúci heteroaryl (výhodne pyridyl, chinolyl alebo izochinolyl), ktorý môže byť kondenzovaný s benzénovým jadrom a R je skupina so štruktúrou (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú
H, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne CMalkyl alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k ním pripojeným, tvoria nasýtený heterocyklus. Y6 je -OR7, kde R7 je H alebo acylová skupina, výhodne alkyl, karbonyl, substituovaný alkyl karbonyl, aryl karbonyl, substituovaný aryl karbonyl, aminoacyl alebo substituovaný aminoacyl, k je 1,2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3, výhradne, keď A je pyridyl alebo naftyl alebo skupina všeobecného vzorca (a), kde Y1 je halo alebo alkoxy, potom R7 je iný než H. Tieto zlúčeniny môžu prípadne ako A obsahovať N-obsahujúcu heteroaromatickú skupinu s N-kvartémym CM alkylom alebo oxid uvedenej N-obsahujúcej heteroaromatickej skupiny a/alebo R, kde cyklus tvorený koncovými skupinami R6 a R7 je N-kvartémy alebo N-oxidovaný nasýtený heterocyklus. Výhodné spomedzi týchto zlúčenín sú tie, ktorých A je skupina štruktúry (a) a kde Y1 je trifluórmetyl. Táto skupina hydroxylamínových derivátov všeobecného vzorca (I) taktiež zahrnuje stereoizoméry zlúčenín, kde X je halo, A je pyridyl, Z je chemická väzba a R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 sú nezávislé od seba H, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne CM alkyl alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným, tvoria nasýtený 3- až 7-, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus. Y6 je -OR7, kde R7 je aminoacyl, k je
I, 2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3.
Tieto nové zlúčeniny možno pripravovať použitím postupov analogických tým, ktoré sú opísané v US patente č. 5 147 879, 5 328 906 a 5 296 606. Napríklad:
a) Deriváty, kde ako R5, tak R6 sú iné než vodík, sa pripravujú diazotáciou zodpovedajúcich NH2 derivátov (hydroxylamínových derivátov štruktúry I, kde Z je kovalentná väzba a X je NH2) v prítomnosti príslušného halidu vodíka, podobne ako v postupoch opísaných vUS patentoch č. 5 147 879, 5 328 906 a 5 296 606. Východiskové zlúčeniny možno získať tiež známym postupom opísaným napr. v maďarskom patente č. 177578, konkrétne spojením amidoximu so štruktúrou 1, kde R1 a R2 štruktúry 1 sú vodíky, s napr. reaktívnym derivátom štruktúry 2 v prítomnosti bázy, a možno ich diazotovať obvykle bez izolácie a čistenia.
b) Keď v žiadanej štruktúre R7 je vodík, a m je 1, syntézu možno uskutočniť reakciou oxyranu so štruktúrou 3 a amínu so štruktúrou 4. Tento postup možno použiť tiež na syntézu R5=H derivátov.
c) Zlúčeniny, kde R je skupina štruktúry (b) a kde R7 tejto skupiny je acylová skupina, sa pripravujú esterifikáciou zodpovedajúcich R7=H derivátov. Alkyl- alebo arylestery sa obvykle získavajú s chloridom alebo anhydridom kyseliny v prítomnosti terciálneho amínu alebo anorganickej bázy, výhodne v inertnom rozpúšťadle, alebo v niektorých prípadoch Schotten-Baumanovým postupom s použitím vodnej anorganickej bázy v dvojfázovom systéme. Na prípravu aminoacylesterov sa ako činidlá použijú karboxyaktivované N-chránené aminokyselinové deriváty (napr. aktívne stery), v postupoch zásadne známych z peptidovej chémie. Táto kondenzácia taktiež vyžaduje prítomnosť bázy (napr. trietylamínu). Izolácia a čistenie daných produktov sa uskutočňuje s použitím štandardných preparatívnych techník. Konečný preparát má často formu soli s príslušnou
SK 284823 Β6 anorganickou alebo organickou kyselinou. Pri východiskových chirálnych aminokyselinách sú dané produkty často diastereoizoméry, ktoré majú druhé chirálne centrum v R skupine. V priebehu izolácie sa tieto diastereoizoméry časom rozdeľujú a produkt možno získať v stéricky čistej forme.
Zlúčeniny so štruktúrou I, kde Zje kovalentná väzba, X je halo-, výhodne chlór alebo bróm, A je skupina všeobecného vzorca (c) a R je skupina všeobecného vzorca (d), jeden alebo oba z Y2 a Y3, z ktorých aspoň jeden musí byť v molekule prítomný, sú kyslík, alebo alkyl alebo substituovaný alkyl s 1 - 4 uhlíkovými atómami a k je 1, 2 alebo 3 a m je 1, 2 alebo 3; Y2 a Y3 sú pripojené bodkovanou čiarou, čo znamená prípadnú prítomnosť týchto substituentov, sú taktiež nové hydroxylamínové deriváty.
Tieto hydroxylamínové deriváty sa pripravujú chemickými modifikáciami (t. j. N.-oxidáciou alebo kvartemizáciou) koncovej pyridínovej a/alebo piperidínovej skupiny v ich nesubstituovaných prekurzoroch. Na oxidáciu sa používajú výhodne perkyseliny, napr. substituované kyseliny perbenzoové, v inertných rozpúšťadlách (napr. chloroforme, dichlórmetáne). Ak sú v molekule prítomné obe oxidovateľné skupiny, môžu sa tvoriť mono- a dioxidy v závislosti od množstva použitého činidla. Na konci reakcie sa prebytok činidla rozloží a produkt sa izoluje odparením. Kvartemizáciu možno uskutočniť s alkylhalidmi (napr. metyljodidom), výhodne refluxovaním činidla vo vhodnom rozpúšťadle napr. acetóne. Produkt je často nerozpustný v prostredí a môže byť izolovaný jednoduchou filtráciou.
Ešte inou novou skupinou zlúčenín patriacich k hydroxylamínovým derivátom so štruktúrou I sú tie, ktorých Z je chemická väzba, a je aralkyl, substituovaný aralkyl, výhodne fenylakyl, ktorý môže mať jednu alebo viac alkoxy skupín, výhodne alkoxy majúce 1 až 4 uhlíkové atómy, fenyl, substituovaný fenyl majúci jeden alebo viac substituentov, pričom výhodné substituenty zahrnujú alkyl, výhodne alkyl alebo haloalkyl majúci 1 až 4 uhlíkové atómy, halo-, acylamino- alebo nitroskupina, alebo N-obsahujúca heteroarylová skupina, ktorá môže byť kondenzovaná s benzénovým jadrom, výhodne pyrolyl, pyridyl, izochinolyl alebo chinoly, alebo síru obsahujúca heteroaromatická skupina, výhodne tienyl, pričom dané heteroarylová skupiny môžu byť substituované jedným alebo viac alkylmi, výhodne alkylmi s 1 až 4 uhlíkovými atómami; X je -NR'R2, kde R1 a R2 nezávisle od seba sú vodíky, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne alkyl majúci 1 až 6 uhlíkových atómov, cykloalkyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom k ním pripojeným, môžu tvoriť nasýtený 3- až 7-, výhodne 5- až 7-členný heterocyklus; R je skupina štruktúry (e), kde R5 a R6 nazávisle od seba sú vodíky, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne alkyl majúci 1 až 4 uhlíkové atómy, cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným, môžu tvoriť nasýtený 3-až 7-, výhodne 5- až 7členný heterocyklus, ktorý môže obsahovať ďalšie heteroatómy a substituenty, pričom substituentom je výhodne alkyl majúci 1 až 4 uhlíkové atómy; Y4 je vodík alebo alkyl alebo substituovaný alkyl majúci 1 až 4 uhlíkové atómy, alebo OR7, kde R7 je vodík alebo acyl, k je 1,2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3, s výhradou, že ak A je fenyl, ktorý je nesubstituovaný alebo substituovaný halogénom alebo alkoxy, alebo fenylalkyl substituovaný alkoxy, alebo pyridylová skupina a R7 je vodík, potom aspoň jeden z R1 a R2 je iný než vodík, alebo ak A je fenyl, ktorý je nesubstituovaný alebo substituovaný halogénom alebo alkoxy, fenylalkyl substituovaný alkoxy, alebo pyridylová skupina, a R1 a R2 sú oba vodíky, potom R7 je iný než vodík.
Zlúčeniny, kde X je NH2 derivát sa pripravujú - podobne ako v uvedenom postupe - reakciou zodpovedajúcich intermediátov so štruktúrou 1, kde R1 a R2 štruktúry 1 sú vodíky, so zlúčeninou štruktúry 2. Alkylačné činidlo (štruktúry 2) môže obsahovať hydroxylové a/alebo amínové substituenty. Reakcia vyžaduje prítomnosť anorganickej alebo organickej bázy, a vo výhodnom spôsobe sa používa alkoholový roztok alkoholátu ako médium a báza. Produkt sa často izoluje vo forme soli s vhodnou organickou alebo anorganickou kyselinou.
Iná skupina uvedených nových zlúčenín je charakterizovaná tým, že pri týchto derivátoch sú R1 a R2 jeden alebo oba iné než vodík. Takéto štruktúry možno pripraviť dvoma spôsobmi.
a) Amidoxim so štruktúrou 1, ktorý už obsahuje žiadané substituenty R1 a/alebo R2, môže reagovať s reaktívnou zlúčeninou štruktúry 2, podobne ako v postupe opísanom v predošlom odseku. Substituované amidoximy so štruktúrou 1, používané ako východiskové látky, sú známe z literatúry [Chem. Rev. 62 155 - 183 (1962)].
b) Substitúcia halogénových atómov v zlúčeninách štruktúry I, kde Z je kovalentná väzba a X je halogén amínom so štruktúrou 5 môže viesť tiež k podobným zlúčeninám. V prípade derivátov, nesúcich OH substituent v R skupine (Y4=OH), sa musí táto hydroxylová skupina vopred chrániť a po substitučnej reakcii deprotekovať, inak je uprednostňovaný cyklický derivát so štruktúrou ľ. Na chránenie sa ukázali naj uspokoj ivejšie chrániace skupiny acetylového typu, napr. tetrahydropyranylová skupina. Chránenie sa uskutoční reakciou nechránenej zlúčeniny s dihydropyranom, s následným vytesnením halogénu/aminu, čo obvykle vyžaduje refluxovanie v rozpúšťadle, napr. alkohole. Deprotekcia produktu môže byť nakoniec uskutočnená kyslým pôsobením, napr. varením etanolového roztoku v prítomnosti napr. kyseliny p-toluénsulfónovej.
Ako sa už uviedlo, jedna skupina nových zlúčenín zahrnuje tiež tie, kde Y5 je alkoxylová skupina. Môžu byť pripravované acyláciou zodpovedajúcich Y5=OH derivátov, ktoré sú známe buď z literatúry (napr. maďarského patentu č. 177578) alebo sú opísané v tomto vynáleze. Reakcia môže byť uskutočnená rovnako ako tá, čo je opísaná pri haloderivátoch, kde R7 je acylová skupina (spôsob c)).
Nové hydroxylamínové deriváty štruktúry I zahrnujú taktiež tie, kde Z je kyslík alebo =NR3. Skupina, kde R3 je nesubstituovaná alebo substituovaná alkylová skupina, X je -NR'R2, R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, ktorý prípadne obsahuje jeden alebo viac ďalších heteratómov. V týchto zlúčeninách A je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo substituovaná fenylová skupina, alebo nesubstituovaná alebo substituovaná aralkylová skupina, a R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne Cb4 alkyl, alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, Y6 je -OR7, kde R7 je acyl, výhodne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo arylkarbonyl, k je 1,2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3.
Nové hydroxylamínové deriváty, kde Zje kyslík a X je OR, kde Q je nesubstituovaná alebo substituovaná alkylová skupina, alebo nesubstituovaná alebo substituovaná aral kýlová skupina, a je nesubstituovaná alebo substituovaná alkoxylová skupina alebo nesubstituovaná alebo substituovaná aralkylová skupina, a R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne Cj.4 alkyl, alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, Y6 je -OR7, kde R7 je acyl, výhodne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo arylkarbonyl, k je 1, 2 alebo 3 am je 1,2 alebo 3, patria taktiež do rozsahu zlúčenín všeobecného vzorca (I).
Iná skupina nových hydroxylamínových derivátov štruktúry I je predstavovaná tými, kde Aje nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl, alebo N-obsahujúca heteroaromatická skupina, výhodne pyridyl, alebo Sobsahujúca heteroaromatická skupina, Z je chemická väzba, X je -OQ, kde Q je Ck4 alkyl a R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne CM alkyl, alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7členný nasýtený heterocyklus, Y6 je H, k je 1,2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3.
Tieto zlúčeniny sa pripravujú reakciou zodpovedajúcich hydroxylamínových derivátov všeobecného vzorca (I), kde X je halo, a zodpovedajúcich alkoholátov, výhodne v alkohole zodpovedajúcom alkoholátu, výhodne pri refluxovaní. Reakčná zmes sa spracuje spôsobmi známymi v odbore, a produkt sa izoluje chromatografiou alebo vytváraním soli.
Nové hydroxylamínové deriváty všeobecného vzorca (II) taktiež zahrnujú skupinu zlúčenín, kde X je kyslík, Aje C1.2o priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo halofenyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, naftyl, alebo N-obsahujúca heteroaromatická skupina, výhodne pyridyl, Z je chemická väzba, R'je vodík, CM alkyl alebo aralkyl, výhodne fenylalkyl, R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne Ch4 alkyl, alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, Y6 je -OR7, kde R7 je acyl, výhodne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo arylkarbonyl, k je 1,2 alebo 3 a m je 1, 2 alebo 3 s výhradou, že ak A je iné než alkyl a R'je vodík, potom Y6 je vodík.
Nové zlúčeniny, kde Z je kovalentná väzba, kyslík alebo =NR3skupina, kde R3 je vodík, alebo nesubstituovaná alebo substituovaná alkylová skupina, X je =NR4, kde R4 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenylová skupina, alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, výhodne fenylalkyl, patria taktiež do rozsahu zlúčenín všeobecného vzorca (II). V týchto zlúčeninách je A nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo substituovaný fenyl, alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, výhodne fenylalkyl R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne C]_4 alkyl, alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus. Y6 je vodík alebo -OR7, R7 je acyl, výhodne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo arylkarbonyl, k je 1,2 alebo 3 a mje 1, 2 alebo 3.
Novými hydroxylamínovými derivátmi všeobecného vzorca (II) sú taktiež tie, kde X je kyslík, A je nesubstituo vaný alebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, výhodne fenylalkyl, Z je kyslík, R je alkyl alebo aralkyl, výhodne fenylalkyl, R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne C-,_4 alkyl, alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus. Y6 je vodík alebo -OR7, R7 je vodík alebo acyl, výhodne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo arylkarbonyl, k je 1,2 alebo 3 a mje 1,2 alebo 3.
Hydroxylamínové zlúčeniny všeobecného vzorca (II), kde X je kyslík a Z je =NH sú taktiež novými zlúčeninami.
Jedna skupina týchto zlúčenín je tvorená tými, kde A je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, cykloalkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, výhodne fenylalkyl, nesubstituovaný fenyl alebo fenyl substituovaný halo, alkyl, haloalkyl, alkoxy alebo nitro, R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne C].4 alkyl, alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7členný nasýtený heterocyklus. Y6 je vodík alebo -OR7, R7 je vodík alebo -OH, k je 1,2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3.
Iná skupina týchto zlúčenín je tvorená tými, kde a je skupina štruktúry (a) a kde Y1 je haloalkyl, výhodne trifluórmetyl, a n je 1,2 alebo 3, R' je vodík a R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne CM alkyl, alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5-až 7-člcnný nasýtený heterocyklus. Y6 je vodík alebo -OR7, R7 je vodík alebo -OH, k je 1,2 alebo 3 a m je 1, 2 alebo 3.
Nové hydroxylamínové deriváty podľa vynálezu taktiež zahrnujú cyklické zlúčeniny všeobecného vzorca (T), kde A je nesubstituovaný fenyl, fenyl substituovaný halo alebo nitro, alebo N-obsahujúci heteroaryl, R1 je vodík, a R je -aminoalkylová skupina mono- alebo disubstituovaná na aminoskupine, ktorej alkylový reťazec má 1-5 uhlíkových atómov, a dané amino substituenty, nezávisle od seba, môžu byť jedným alebo dvoma priamymi alebo rozvetvenými alkylmi alebo cykloalkylmi, alebo dané dva amino substituenty, spolu s dusíkom k nim priľahlým tvoria 3- až 7členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, alebo jeho Cb4 alkyl N-kvartémy derivát, s výhradou, žc ak A je 3-pyridyl, R je iný než 1-piperidinylmetyl.
Spôsob zvýšenia expresie molekulových chaperónov v bunkách
Tento vynález sa týka spôsobu zvyšovania expresie molekulových chaperónov v bunkách pomocou pôsobenia účinného množstva hydroxylamínového derivátu na bunky a tkanivá. Na tento spôsob sa dajú používať hydroxylamínové deriváty, ktorých tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II). Štruktúry všeobecných vzorcov (I) a (II) sú podrobne rozobrané v predchádzajúcej časti.
V jednom neobmedzujúcom uskutočnení vynálezu je poskytnutý spôsob zvýšenia expresie molekulových chaperónov v bunkách vystavených stresu. Pri tomto spôsobe sa na bunky vystavené fyziologickému stresu, ktorý vyvoláva expresiu molekulových chaperónov bunkami, pôsobí účinným množstvom hydroxylamínového derivátu, ktorých tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II). Hydroxylamínové deriváty zvyšujú expresiu molekulových chaperónov v týchto bunkách nad množstvo indukované daným fyziologickým stresom.
SK 284823 Β6
V inom neobmedzujúcom uskutočnení vynálezu sa na bunky pôsobí hydroxylamínovými derivátmi predtým, než sú vystavené fyziologickému stresu. Hydroxylamínové deriváty zvyšujú expresiu molekulových chaperónov nad množstvo indukované daným fyziologickým stresom.
Výraz „molekulový chaperón“, ako sa tu používa, odkazuje na bielkovinu, ktorá pomáha iným bielkovinám skladať sa do správnych alebo aktívnych štruktúr, obvykle nekovalentnou väzbou k týmto bielkovinám. Chaperóny pomáhajú nielen opraviť a napraviť bielkoviny, ktoré sú novosyntetizované, alebo denaturované, ale aj tých, ktoré sú denaturované alebo zle zložené.
Molekulové chaperóny zahrnujú okrem iného bielkoviny tepelného šoku (hsp), z ktorých hsp70 a hsp72 majú zvláštny význam v spojení s týmto vynálezom, ako i bielkovinu (BiP), viažucu ťažký reťazec IgG s glukózou regulovanej bielkoviny (grp). Príklady hsp a grp zahrnujú, ale bez obmedzenia, tie ktoré patria do nasledujúcich tried: hsp70, hspôO, hsp90, grp94, grp80 a hsp27.
Eukaryotické bunky, na ktoré sa pôsobí hydroxylamínovými derivátmi sú výhodne bunky cicavcov, výhodnejšie ľudské bunky. Výraz „eukaryotická bunka“ odkazuje tak na eukaryotické, ktoré sú in vitro (bunky, ktoré sú mimo živého organizmu, napr. pri kultivačných podmienkach), ako i in vivo (bunky, ktoré sú vnútri živého organizmu, napr. bunky tvoriace tkanivá a orgány).
Z eukaryotických buniek živého organizmu sa výhodne pôsobí v súlade s vynálezom na neuróny, svalové bunky, bunky cievnej steny, najmä endotelové bunky, epitelové bunky a bunky imunitného systému. Výhodne sa pôsobí v súlade so spôsobom podľa vynálezu taktiež na rastlinné bunky vrátane buniek živého rastlinného organizmu.
Pod výrazom „fyziologický stres“, ako sa tu používa, sa rozumejú stavy pôsobiace na bunku, vyvolávajúce reakciu bunky na stres“, napr. syntézu bielkovín chaprónov. Fyziologické stresy zahrnujú faktory, ktoré spôsobujú poškodenie buniek alebo narušujú homeostatickú rovnováhu buniek. Sú nimi napríklad metabolické, oxidačné, lokálnemechanické stresy, alebo stresy spôsobované hypoxiou, ischémiou, tepelným šokom alebo radiáciou alebo toxickými látkami. Dôležitá forma metabolického stresu je spôsobovaná diabetom mellitom.
Iná dôležitá vyskytujúca sa forma fyziologických stresov zahrnuje stresy vedúce k tvorbe voľných radikálov alebo zvýšeniu množstva cytokínov v bunkovom prostredí. Poškodené bunky, ktoré sú spojené s rôznymi patologickými stavmi, poskytujú príklady fyziologických stresov.
V jednom neobmedzujúcom uskutočnení vynálezu je fyziologický stres, ktorý indukuje reakciu na expresiu molekulových chaperónov, reakciou na fyziologický stres vedúci ku kardiovaskulárnym, vaskulámym, mozgovým, alergickým, imunitným, autoimúnnym chorobám, vírusovým a bakteriálnym infekciám, chorobám kože a sliznice, alebo chorobám ľadvinových kanálikov epitelového pôvodu alebo spôsobujúcim stavy, ktoré majú byť liečené kozmetickou intervenciou.
Takéto kardiovaskulárne choroby zahrnujú najvýhodnejšie aterosklerózu vyvolanú fyziologickým stresom, koronárne choroby, alebo kardiovaskulárne choroby spôsobené hypertóniou alebo pulmonámou hypertóniou.
Charakteristickými mozgovými chorobami sú okrem iných tie, ktoré sú spôsobené cerebrovaskulámou ischémiou, vyvolanou fyziologickým stresom, mŕtvica, traumatické poranenia hlavy, senilné neurodegeneratívne ochorenia, najmä senilná demencia, AIDS demencia, alkoholická demencia, Alzheimerova choroba alebo epilepsia.
Charakteristické choroby vyvolané ochorením kože alebo sliznice sú dermatologické choroby alebo ulcerálne choroby gastrointestinálneho systému.
Pri uvedených chorobách fyziologický stres indukuje expresiu molekulových chaperónov v bunkách, ale tento účinok nie je dostatočný na ochranu proti poškodzovaniu buniek chorobou. Liečba uvedenými hydroxylamínovými derivátmi, ktorá je spojená so zvýšením expresie chaperónov alebo zvýšením ich aktivity, umožňuje elimináciu štrukturálnych odchýlok spôsobovaných chorobou, a teda regeneráciu buniek.
V jednom neobmedzujúcom uskutočnení vynálezu je fyziologickým stresom tepelný šok alebo vystavenie buniek neobvykle vysokej teplote. V inom neobmedzujúcom uskutočnení vynálezu je fyziologickým stresom bunkové poškodenie spojené s ischémiou. Ischemická lézia buniek, najmä srdcového svalu a mozgových buniek, je spôsobovaná kardiovaskulárnymi poruchami, spôsobovanými cievnou oklúziou alebo ruptúrou, ako sú srdcová a mozgová trombóza, alebo vaskulámou oklúziou, mŕtvicou, embóliou, alebo chronickými vaskulámymi spazmami. Ischémia vyvoláva „reakciu buniek na stres“, ktorá vedie ku zvýšenému množstvu hsp, ktorý potom zase chráni dané bunky pred škodlivými účinkami ischémie (Mestril, R. et al., J. Mol. Celí. Cardiol. 27: 45 (1995)).
Pri pôsobení účinného množstva hydroxylamínových derivátov na tieto bunky môže byť molekulová expresia chaperónov v bunkách zvýšená nad množstvo indukované ischemickým stavom a taktiež môže byť zvýšená aktivita molekulových chaperónov.
V súvislosti s touto záležitosťou: Ak sa vyberie zo zvieraťa orgán na transplantáciu, takéto vyňatie je fyziologickým stresom spôsobujúcim poškodenie buniek tvoriacich tento orgán, čo indukuje expresiu chaperónov. V takomto prípade podávanie hydroxylamínových derivátov pred vyňatím orgánu alebo po ňom môže zvýšiť množstvo chaperónu produkovaného bunkami alebo jeho aktivitu, a teda poskytovať cytoprotektivny účinok.
Neuronálne poškodenia môžu byť indukované pri ischémii taktiež mnohými inými stresmi, čo indukuje produkciu molekulových chaperónov v neuronálnych bunkách. Navyše excitotoxické neuronálne poškodenia taktiež indukujú produkciu molekulových chaperónov neuronálnymi bunkami, a sú zahrnuté do pojmu „fyziologický stres“.
V ešte inom príklade tohto vynálezu je fyziologický stres poskytovaný toxickými mediátormi zápalov, ako sú oxidačné radikály a cytokíny, ako je TNF, ktoré sú produkované makrofágmi. Na bunkách vystavených zvýšenému množstvu týchto toxických mediátorov bolo dokázané, že exprimujú zvýšené množstvo hsp, ktoré potom zase chráni tieto bunky pred toxicitou (Kantengawa, S. et al., Semin. Immun. 3: 49 - 56 (1991)). Rôzne zápalové ochorenia vrátane pulmonámych zápalových stavov, ako je šokový syndróm dospelých, indikujú expresiu hsp bunkami, a ten potom vykazuje cytoprotektivny účinok (Jacquier-Salin, M. R. et al., Experientia 50: 1031 - 1038 (1994)). Keď je množstvo molekulových chaperónov v bunkách zvýšené nad množstvo indukované TNF a reaktívnymi formami kyslíka, bunky môžu byť lepšie chránené pred týmito faktormi a lepšie umožňovať nápravu poškodenia nimi spôsobovanú.
Faktory ovplyvňujúce fyziologický stav bunkových membrán vrátane membránovej fluidity, taktiež poskytujú príklady fyziologického stresu. Zvýšenie expresie molekulových chaperónov v týchto bunkách nad expresiu indukovanú narušením fyziologického stavu bunkových membrán môže poskytnúť lepšiu ochranu a taktiež dovolí bunkám nápravu bunkových membrán.
Spojenie „účinné množstvo hydroxylamínových derivátov“, ako sa tu používa v spojení so zvýšením expresie molekulových chaperónov v bunkách pod fyziologickým stresom, alebo v bunkách, ktoré môžu byť následne vystavené fyziologickému stresu, odkazuje na množstvo, ktoré zvýši expresiu molekulových chaperónov nad hladinu indukovanú fyziologickým stresom samým. Takéto množstvo môže byť stanovené tým, kto sa vyzná v odbore. Výhodne pre bunky in vitro je účinné množstvo medzi 10'6 - 10 4M. Výhodnejšie je účinné množstvo medzi 10-6 - 5 x 10'4M.
Pri podávaní zvieraťu sa účinné množstvo líši v závislosti od rôznych faktorov, ako je spôsob podávania, ale stanovenie rozsahu účinnosti patrí do znalostí znalých odboru a nebude vyžadovať zbytočné experimentovanie. Napríklad: Keď sa hydroxylamínové deriváty podávajú intravenózne, účinné množstvo je výhodne medzi 0,1 - 10 mg/kg telesnej hmotnosti, výhodnejšie 0,5 - 2,0 mg/kg telesnej hmotnosti, keď sa podávajú orálne je účinné množstvo výhodne medzi 10 - 500 mg/kg telesnej hmotnosti, výhodnejšie 50- 100 mg/kg telesnej hmotnosti.
Zvýšenie expresie molekulových chaperónov v bunkách možno detegovať s použitím dobre zavedených laboratórnych postupov, ako sú postupy „Nothem“ a „Westem“ analýzy.
Príklad techniky „Westem“ analýzy, ktorý možno použiť, je daný nasledovne: Bunky sa kultivujú in vitro pri 37 °C v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) doplnenom 10 % fetálneho teľacieho séra (GIBCO), v 5 % CO2. Hydroxylamínové deriváty, ktorých tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II), môžu byť pridávané do tkanivovej kultúry, napríklad 10 M zlúčenina je podávaná bunkám 16 hodín pred fyziologickým stresom, alebo po určitom časovom období následne po fyziologickom strese. Koncentrácie hydroxylamínového derivátu, ako aj čas podávania tejto zlúčeniny sa však môže meniť podľa žiaduceho experimentálneho usporiadania.
Šesť hodín po tepelnom šoku sa bunky dvakrát premyjú vo fosfátovom pufrovanom soľnom roztoku (PBS) a potom zoškrabú z povrchu kultivačných misiek v PBS. Potom sa bunky stočia po 5 minútach pri 1500 rpm a vezmú do 100 μΐ modifikovaného solubilizačného pufra (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) obsahujúceho 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Triton N-100, 1 mM PMSF, 2 mg/ml aprotinínu, 1 gg/ml chymostatínu a sonikujú 3 x po 20 sekúnd (2 min. intervaly, nastavenie 8).
Koncentrácia bielkovín sa potom stanoví z 5 μΐ vzorky stanovením Bradfordovej (M. M. Bratford, Anál. Biochem. 72: 248 - 254 (1976)) v troch paralelách. Vzorky sa nastavia na koncentráciu bielkoviny 100 μg/30 μΐ pomocou pufru uvedeného skôr a ďalšieho pufra tak, že konečná koncentrácia zložiek v tomto pufri bude: 110 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoetanol, 3 % glycerol a trochu brómfenolovej modrej; potom sa pretrepe pri izbovej teplote počas 30 minút. Vzorky takto získané možno použiť na gélovú elektroforézu.
Ak sa zosilňujúci účinok hydroxylamínových derivátov podľa vynálezu skúša na bunkách in vivo, aplikuje sa fyziologický stres na zviera, napr. ischčmia alebo STZ-indukovaný diabetes. V prípade ischémie možno myokardiálnu ischémiu vo zvierati indukovať tak, ako je opísané v príklade 8, a diabetický stav možno indukovať tak, ako je opísané v príklade 10. Hydroxylamínový derivát podľa vynálezu môže byť zvieraťu podávaný pred vystavením fyziolo gickému stresu, v priebehu stresu alebo potom. Ako sa uviedlo, načasovanie podávania možno meniť podľa experimentálneho usporiadania.
Nasledujúce kroky prípravy bielkovín z relevantných tkanív zvieraťa po takomto pôsobení sa uskutočňujú pri 0 až 4 °C. Tkanivá, ako je tkanivo pečene (okolo 15-20 g), sa homogenizuje v domácom mixéri 2 minúty v 80 ml lyzačného pufra obsahujúceho Tris-HCl, ph 8,0 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100 a 1 mM proteázové inhibítory (PMSF, benzamidín, kyselinu aminokaprónovú). Homogenát sa potom centrifuguje pri 20 000 x g po 30 min. v centrifúge Sorvall RC28S.
Koncentrácia bielkovín sa potom v príprave stanoví stanovením Bradfordovej a nastaví na 5 mg/ml. Vzorky obsahujúce 1,8 mg bielkoviny sa pred gélovou elektroforézou solubilizujú s 0,6 ml pufra obsahujúceho 110 mM TrisHCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoetanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a trochu brómfenolovej modrej a pretrepú sa pri izbovej teplote počas 30 minút.
Vzorky bielkovín získané z tkanivových kultúr alebo zvieracích tkanív, ako sa oba typy opisujú, sa použijú na elektroforézu a následnú imunoblotu (oba postupy sú v odbore dobre známe a sú podrobne opísané v Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membráne, 3. laboratórny manuál, Millipore, a U. K. Laemmli, Náture 227: 680 - 685 (1970).
Napríklad: Elektroforézu možno uskutočniť podľa Laemmliho (U. K. Laemmli, Náture 227: 680 - 685 (1970)) na 8 - 18 % polyakrylamidovom géli pri konštantnom napätí 50 V cez noc. Bielkoviny sa potom vyfarbia s Coomassie Brilliant Blue R-250 alebo prenesú na Immobilone PVDF (millipore) pri konštantnom prúde (300 mA) po 3 hodiny pri 4 °C v prenosovom pufri (10 mM CAPS, pH 11, 10 % metanol) (Proteín Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membráne, 3. laboratórny manuál, Millipore). Po prenose sa zablokujú nešpecifické miesta membrány 2 % bovinným sérovým albumínom (BSA) v TPBS (fosfátom pufrovaný soľný roztok obsahujúci 0,1 % Tween 20) pri 4 °C cez noc. Membrána s prenesenou látkou môže byť inkubovaná s protilátkou špecifickou k molekulovému chaperónu, napr. GRP94 monoklonálnou protilátkou (SPA-850, StressGen), zriedenou 1 : 3000, HSP60 monoklonálnou protilátkou (SPA-600 StressGen), zriedenou 1 : 2700, HSP72 monoklonálnou protilátkou (C9F34-5, StressGen), zriedenou 1 : 1250, alebo HSP90 monoklonálnou protilátkou (AC88, StressGen), zriedenou 1 : 2000, počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Potom sa membrána premyje s TPBS pufrom jednu hodinu a inkubuje ďalšiu 1 hodinu s antipotkaními (Sigma, 1 : 4000 zriedenie, pro grp94), resp. antimyšacími (Sigma, adsorbovaná s ľudskými a potkaními bielkovinami, 1 : 3000 zriedenie, pro IIspóO, HSP72 alebo HSP90) sekundárnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou. Po následnom premytí s TPBS sa membrána vyvíja s ECL (zosilneným chemiluminiscenčným) systémom (Amersham).
Zmeny v obsahu stresových bielkovín možno kvantifikovať použitím denzitometra Bio-Rad (model 1650) a integrátora Hewlett-Packard (HP 3394 A). Pripraví sa dilučná séria z bielkovinových roztokov obsahujúcich známe množstvo chaperónu, uvedený postup sa zopakuje s danými zriedeniami, a koncentrácia chaperónu v testovanej vzorke sa stanoví z kalibračnej krivky, získanej z dilučného testu.
„Nothem“ hybridizácia je iným experimentálnym postupom dostupným na stanovovanie hladiny zvyšovania molekulových chaperónov (pomocou merania hladiny mRNA) hydroxylamínovými derivátmi podľa vynálezu. Bunky alebo tkanivá možno získavať tak, ako je opísané v súvislosti s postupom „Westem“ analýzy. Celkovú RNA z týchto buniek alebo tkanív možno extrahovať použitím RNAgents (Promega) podľa inštrukcií výrobcu (Protocols and Applications, 2. vydanie, 1991, Promega Corporation). Zamrznuté vzorky tkanív (okolo 50 až 100 mg) sa homogenizujú v 1,0 denaturujúcom 4 M guanidín tiokyanáte, 42 mM citráte sodnom, 0,83 mM p-merkaptoetanole, 0,1 % Nonidete P-40 pri 4 °C (Brinkmanova homogenizácia). Potom sa pridá 1/10 objemu 3 M octanu sodného (pH 4,0) a homogenát sa extrahuje kyslým fenolom (fenol : chloroform : izoamyalkohol 25 : 24 : 1) vortexovanim počas 10 sekúnd. Vzorka sa inkubuje na ľade 15 minút, a potom sa centrifuguje 4 °C, 20 min. 10 000 x g). Vodná fáza sa potom prenesie do nových Eppendorfových skúmaviek, postup sa opakuje a vodná fáza sa zrazí pri -20 °C cez noc rovnakým objemom izopropanolu. Po centrifugácii (4 °C, 20 min. 10 000 x g) sa precipitát premyje dvakrát 95 % alkoholom a vysuší pri izbovej teplote. RNA sa rozpustí v 20 μΐ vody spracovanej s dietylpyrokarbonátom (DEPC) a koncentrácia sa zmeria spektrofotometricky pri 260 - 280 nm. Osem gg celkovej RNA sa podrobí kapilárnemu prenosu na formaldehydagarózovom géli, RNA z gélu sa prenesie na nylonovú membránu podľa inštrukcií výrobcu (ZetaProbe GT, BioRad).
V jednotlivých vzorkách sa obsah mRNA molekulového chaperónu porovnáva s hladinou mRNA glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázového (GAPDH) génu vo vzorke. cDNA sondy (napríklad ľudská hsp70 cDNA plnej dĺžky, keď sondovanou mRNA je hsp70 a Apa-Ncol fragment potkaní GAPDH cDNA) sú označené alfa-32P CTP s použitím súpravy Random Prime DNA Labeling Kit (USB). Rádioaktívne označené fragmenty sa purifikujú na kolóne Sephadexu G-50 (pharmacia), ako je opísané (Ausubel et al., vyd.: Current Protocols in Molecular Biology, John Willey&Sons, 1987).
Prehybridizácie sa uskutočňujú pri 65 °C v H-pufre (0,25 M Na2HPO4, pH 7,2, 7 % SDS) 15 minút. Hybridizácia sa uskutočňuje cez noc (65 °C, H-pufor) s izotopovo označenou cDNA sondou s aspoň 106 cpm/ml. Membrána sa potom premyje s 20 mM Na2HPO4, pH 7,2, 5 % SDS (65 °C, 2 x 15 min.) a hodnotí autorádiografiou. Tá istá sa použije na sondovanie hsp70 mRNA a meranie GAPDH mRNA používanej ako vnútorný štandard.
Tento vynález ďalej zahrnuje spôsob liečby alebo prevencie rôznych patologických stavov, napríklad chorôb spojených s fungovaním chaperónového systému a s poškodeniami v bunkových membránach a membránach bunkových organel, pomocou podávania účinného množstva hydroxylamínových derivátov, ktorých tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II), na kontrolu patologických stavov v organizme. V patologických stavoch je v bunkách indukovaná charakteristická expresia molekulových chaperónov. Zvýšená expresia molekulových chaperónov v týchto bunkách im môže napomáhať napraviť poškodenia, spôsobované patologickými stavmi a taktiež pri obnovovaní bunkovej homeostatickej rovnováhy.
Takéto patologické stavy zahrnujú ischémiu, nádorové ochorenia, infekcie spôsobované mikroorganizmami, autoimunitné ochorenia a dermatózy.
Ako sa tu používa, „liečba“ znamená zlepšovanie klinického stavu subjektu, a nutne neindikuje, že by sa dosahovalo úplné vyliečenie. Zlepšovanie odkazuje na skrátené trvanie choroby alebo zníženie závažnosti choroby, alebo subjektívne zlepšenie života pacienta, alebo predĺžené prežitie pacienta.
Účinné množstvo hydroxylamínu podľa vynálezu na liečbu odkazuje na množstvo dostatočné na zlepšenie klinického stavu, ako je opísané. Účinné množstvo závisí od faktorov, ako je spôsob podávania a môže byť ľahko stanovené tým, kto je znalý v odbore. Hydroxylamínové deriváty podľa vynálezu možno podávať parentálne alebo orálne, výhodne orálne a miestne, a účinné množstvo je 10 až 500 mg/kg telesnej hmotnosti, výhodnejšie je účinné množstvo 20- 100 mg/kg telesnej hmotnosti.
Pri použití spôsobu liečby podľa vynálezu môžu byť tkanivá myokardu, mozgu a ľadvín chránené pred poškodením tkaniva alebo nekrózou, spôsobovanou ischémiou, pričom daný spôsob zahrnuje podávanie účinného množstva hydroxylamínových derivátov podľa vynálezu subjektu na zníženie, prevenciu alebo rcvcrziu škodlivých účinkov prolongovanej ischémie.
Tento vynález zahrnuje použitie hydroxylamínových derivátov, ktorých tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II), na výrobu prostriedku na liečenie patologických stavov tu opísaných.
V spôsobe merania ochranného účinku hydroxylaminových derivátov sa používa test na zvieratách, ktorý nasleduje. Potkany sú anestetizované pentobarbitolom (Nembutal, 60 mg/kg telesnej hmotnosti, i. p.) a umelo ventilovane ovzduším miestnosti (2 ml/100 g, 54 cyklov za minútu) prostredníctvom tracheotómie. Pravá karotidová tepna sa katetrizuje a spojí sa s prevodníkom tlaku (BPR-01, Stoelting) na meranie systémového tepnového krvného tlaku (BP) pomocou predzosilňovača (Hg-02, Experimetria). Hydroxylamínové deriváty podľa vynálezu sa podávajú prostredníctvom kanyly k jugulámej žile (i. v.) alebo orálne (p. o.). Tep (HR) sa meria kardiotachometrom (HR-01, Experimetria) a sníma sa elektrokardiogram (ECG štandardné vedenie II) na záznamovom zariadení (MR-12, Medicor) pomocou podkožných nerezových ihlových elektród. Hrudník sa otvorí ľavou toraktómiou a potom sa srdce exteriorizuje jemným tlakom na pravú stranu hrudného koša. Aplikuje sa tlačka pod ľavú hlavnú koronárnu artériu, ako je opísané Seylom et al. (1960). Srdce sa opatrne umiestni späť do hrudníka a zviera je ponechané zotaviť sa. Monitoruje sa rektálna teplota a udržuje sa konštantná na 37 °C. Experimentálny protokol začína 5 minútovou stabilizačnou periódou. Keď sa počas tejto periódy pozoruje trvalé krvný tlak nižší ako 70 mm Hg alebo arytmia, zviera sa vyradí z ďalšieho experimentovania. Myokardiálna ischémia sa potom vyvolá koronárnou oklúziou 5 minút a reperfúzia sa ponechá 10 minút.
V priebehu celého pokusu sa nepretržite zaznamenávajú na viackanálovom zapisovači (R61-6CH), Medicor) krvný tlak (BP), tep (HR) a EKG. Hydroxylamínové deriváty sa podávajú v 5. a 60. minúte pred oklúziou i. v. alebo p. o. cestou. Dávky hydroxylamínových derivátov môžu byť 0,5, 0,75, 1,0 mg/kg i. v. a 100 mg/kg telesnej hmotnosti p. o., zatiaľ čo referenčná substancia Bepiridil sa podáva v dávke 1,0 mg/kg i. v. Stredné trvanie ventrikulámej tachykardie (VT) a/alebo ventrikulámej fibrilácie (VF) v priebehu prvých 3 minút reperfúzie sa meria a analyzuje.
Tento vynález zahrnuje taktiež spôsob udržovania fluidity bunkovej membrány, keď je fluidita bunkovej membrány ovplyvnená v dôsledku fyziologického stresu. Tento spôsob zahrnuje pôsobenie na bunkové membrány alebo membrány bunkových organel, ktoré majú zmenenú membránovú fluiditu účinným množstvom hydroxylamínových derivátov na nápravu fluidity uvedenej membrány. Experimentálny protokol uvádzaný v súvislosti s príkladom 9
SK 284823 Β6 (rovnovážna DPH fluorescenčnej anizotropie) možno použiť na stanovenie účinku hydroxylamínových derivátov podľa vynálezu na fluiditu bunkovej membrány.
Ako bolo uvedené, tento vynález zahrnuje spôsob liečby patologických stavov spojených s bunkovou membránou a membránou bunkových organel. Jedným príkladom takéhoto patologického stavu je diabetes mellitus, ako aj choroby spojené s poškodením mitochondriou, ako je ALS (amyotropická laterálna skleróza). Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba (HD), určité kardiomyopatie, ako tie, čo majú toxický pôvod, spôsobované alkoholom a ťažkými kovmi, zápalové a vírusové kardiomyopatie, alebo autoimúnne kardiomyopatie. V tomto spôsobe môžu byť použité hydroxylamínové deriváty, ktorých tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II).
Spôsob podľa vynálezu môže byť použitý na liečbu nádorových ochorení, pričom tento spôsob zahrnuje podávanie účinného množstva hydroxylamínovývh derivátov organizmu s nádorom na zabránenie tvorby alebo rastu nádoru. V tomto spôsobe môžu byť použité hydroxylamínové deriváty, ktorých tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II).
Farmaceutické a kozmetické prostriedky obsahujúce hydroxylamínové deriváty
Ako už bolo uvedené, tento vynález sa týka taktiež použitia hydroxylamínových derivátov všeobecných vzorcov (I) a (II) vrátane ich opticky aktívnych stereoizomérov, na výrobu farmaceutických prostriedkov (a prípadne kozmetických prostriedkov) užitočných na liečbu kardiovaskulárnych, vaskulámych, alergických, imunitných, autoimunitných chorôb, chorôb spôsobovaných vírusovými a bakteriálnymi infekciami, nádorových ochorení, chorôb kože a sliznice, alebo chorôb ľadvinových kanálikov, provokovaných fyziologickým stresom, alebo týchto stavov, spôsobovaných taktiež fyziologickým stresom, ktoré môžu byť liečené kozmetickou intervenciou, pričom všeobecné vzorce (I) a (II), alebo ich soli, zahrnujú ich opticky aktívne stereoizoméry.
A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl substituovaný v arylovej alebo alkylovej časti, aryl substituovaný aryl, heteroarylová alebo substituovaná heteroarylová skupina,
Z je kovalentná väzba, kyslík alebo =NR3, kde R3 je vybraný zo skupiny skladajúcej sa z vodíka, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu a aralkylu substituovaného v arylovej a/alebo alkylovej časti,
R je alkyl alebo substituovaný alkyl,
X v tautomére všeobecného vzorca (I) je halogénová alebo substituovaná hydroxylová alebo amínová, monosubstituovaná amínová alebo disubstituovaná amínová skupina a
R v tautomére všeobecného vzorca (II) je kyslíková, imínová alebo substituovaná iminová skupina a
X' je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl, ktorý má substituovanú arylovú alebo alkylovú časť, a acylová alebo substituovaná acylová skupina, a zlúčeniny všeobecného vzorca (I) prípadne obsahujú intramolekulové cyklické štruktúry tvorené spojením X a reaktívneho substituenta.
Použitím týchto zlúčenín možno pripravovať prostriedky tak na preventívne, ako aj na liečebné účely, ktoré môžu byť užitočné pri podávaní alebo aplikáciu na ľudský alebo zvierací organizmus pri prevencii alebo kontrole poškodenia buniek, spôsobovaného uvedenými chorobami, a teda pri zvoľňovaní alebo odstraňovaní patologického stavu daného organizmu.
Tieto prostriedky môžu byť pripravované spôsobmi známymi per se v príprave kozmetických a farmaceutických prostriedkov, zmiešaním aktívnej látky so zodpovedajúcimi nosičmi a/alebo prídavnými látkami. Dané prostriedky všeobecne obsahujú 0,5 až 99,5 hmotn. % aktívnej zlúčeniny. Množstvo aktívnej látky v prostriedku je určené povahou a vážnosťou ochorenia, vekom pacienta a spôsobom liečby. Hydroxylamínové deriváty všeobecných vzorcov (I) a (II) možno formulovať do prípravkov na orálne a parentálne, ako aj miestne použitie.
Denná dávka aktívnej zlúčeniny je okolo 10 až 500 mg/kg, výhodne 10 až 500 mg/kg, a je, obzvlášť v prípade orálnych prostriedkov, rozdelená na 2 - 3 podávania.
Na účely orálneho podávania sú prostriedky formulované do dražé, granulátu, a ak je to žiaduce, do roztoku alebo suspenzie. Parentálne prostriedky zahrnujú vodné suspenzie a sterilné injektovateľné roztoky, zatiaľ čo rektálne formy podávania sú okrem iného čapíky a miestne formy zahrnujú mazania, krémy, emulzie a gély.
Na prípravu tabliet sa mieša aktívna zložka s vhodným nosičom, ako je škrob, želatína, laktóza, stearát horečnatý, talk, arabská guma a silikagél, zmes sa granuluje a zlisuje do tabliet.
Na prípravu dražé sa z aktívnych zložiek a prídavných látok pripraví zmes podobná, ako je uvedené, táto zmes sa granuluje, granulát sa zlisuje do jadra, ktoré sa potom potiahne cukrom, napr. použitím cukor obsahujúceho polyvinylpyrolidínového roztoku.
Na prípravu formy kapsúl sa aktívne zložky zmiešajú s prídavnými látkami, ako je škrob, talk, kremelina, mikrokryštalická celulóza a zmes sa plní do tvrdých alebo mäkkých želatínových kapsúl.
Tieto orálne prostriedky môžu byť doplnené aditívami, ktoré podporujú alebo spomaľujú absorpciu.
Sirupy, elixíry alebo kvapky môžu byť pripravené, ak sa pri aktívnej zložke použijú sladidlá, metyl- alebo propylparaben, a ak je to žiaduce, ochucovacie prídavky a zmieša sa s nimi vodný roztok aktívnej zložky.
Na rektálne podávanie možno čapíky pripravovať s použitím vhodných prídavných látok, ako je kakaové maslo alebo polyetylénglykol.
Prostriedky, vhodné na parentálne použitie, môžu byť injekcie, pripravované rozpustením aktívnej zložky v sterilnom izotonickom soľnom roztoku, alebo vodnej suspenzii, ktoré môžu byť pripravované použitím vhodných dispergačných a zvlhčovacích činidiel, ako je propylénglykol a butylénglykol.
Krémy a mazania na miestne použitie možno pripraviť použitím primárnych alebo sekundárnych alkoholov, ako sú cetylalkohol, stearylalkohol, glycerol, prírodné tuky a oleje, ako sú olivový olej, olej z pšeničných klíčkov, lanolín, dlhších uhľovodíkov, ako je vazelína, ako aj celulózových derivátov. Tieto prostriedky môžu obsahovať konzervačné látky, ako je metyl-p-hydroxy benzoát.
Prostriedky na použitie ako kozmetické alebo lekársko-kozmetické prípravky možno pripraviť podobnou cestou. Výhodne sa zmiešajú lipofilné zložky a vo vode rozpustné zložky sa rozpustia vo vode, prípadne s miernym zahriatím. Ak je to žiaduce, upraví sa pH zmesi lipofilných zložiek na vhodnú hodnotu a získaná emulzia sa mieša pri chladení. Aktívna zložka sa pridá do zmesi takto získanej vo forme vodného roztoku.
Farmaceutické a kozmetické prostriedky, ktoré obsahujú nové hydroxylamínové deriváty, podrobne opísané v zvláštnej časti tohto opisu, možno taktiež pripravovať uve denými postupmi. Tieto prostriedky sú taktiež predmetom vynálezu.
Jedno uskutočnenie farmaceutických a kozmetických prostriedkov podľa vynálezu obsahuje hydroxylamínové deriváty všeobecného vzorca (I) v množstve 0,5 až 99,5 hmotn. % spolu s nosičmi a prídavnými látkami všeobecne používanými v takýchto prostriedkoch, kde
X je halogén výhodne chlór alebo bróm,
Z je chemická väzba a al) A je skupina všeobecného vzorca (a), kde Y1 je halo-, alkoxy-, haloalkylová alebo nitroskupina a n je 1,2 alebo 3; alebo O-obsahujúci heteroaryl, výhodne furyl, S-obsahujúci heteroaryl, výhodne tienyl, alebo N-obsahujúci heteroaromatická skupina prípadne kondenzovaná s benzénovým jadrom alebo jej N-Cm alkyl kvartémy derivát alebo N-oxid, výhodne pyridyl, chinolyl alebo izochinolyl.
R je skupina so štruktúrou (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne priamy alebo substituovaný alkyl, výhodne Cm alkyl alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus. Y6 je -OR7, R7 je vodík alebo acylová skupina, výhodne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl, arylkarbonyl, alebo aminoacyl, k je 1,2 alebo 3 a m je 1, 2 alebo 3 alebo ich N-C1.4alkyl kvartémy derivát alebo N-oxid, výhradne, že ak A je pyridyl alebo naftyl alebo skupina všeobecného vzorca (a), kde Y1 je halo alebo alkoxy, potom R7 je iné než vodík, alebo a2) A je skupina všeobecného vzorca (c),
R je skupina všeobecného vzorca (d), a prípadne substituenty Y2 a Y3, z ktorých aspoň jeden musí byť v molekule prítomný, sú kyslík, alebo Cj.4 alkyl a k je 1, 2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3; a ak je daná zlúčenina mono- alebo bivalentný katión, jej aniónmi sú jeden alebo dva halidy, výhodne jódové ióny,
b) X je -NR’R2, R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, ktorý môže obsahovať jeden alebo viac ďalších heteroatómov,
Aje nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl,
Zje kyslík alebo =NR3 skupina, kde R3 je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl,
R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne Ci_4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus. Y6 je -OR7, R7 je vodík alebo acyl, výhodne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo arylkarbonyl, k je 1,2 alebo 3 a m je 1, 2 alebo 3, alebo
c) X je -OQ, kde Q je nesubstituovaný alebo substituovaný aryl alebo aralkyl,
Z je kyslík a
R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne CH alkyl alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus. Y6 je -OR7, R7 je vodík alebo acyl, výhodne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl, arylkarbonyl alebo aminoacyl, k je 1,2 alebo 3 a m je 1, 2 alebo 3, alebo
d) A je nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl, alebo N-obsahujúca heteroaromatická skupina, výhodne pyridyl, alebo S-obsahujúca heteroaromatická skupina,
Zje chemická väzba,
X je -OQ, kde Q je Cj.4alkyl a
R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne C|_4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtenýheterocyklus, Y6 je vodík, kje 1, 2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3.
Iná skupina farmaceutických a kozmetických prostriedkov podľa vynálezu zahrnuje tie, ktoré spolu s nosičmi a prídavnými látkami obsahujú hydroxylamínové deriváty všeobecného vzorca (I) v množstve asi 0,5 až 99,5 hmotn. % alebo ich soli a/alebo ich opticky aktívne stereoizoméry, kde
X je -NR'R2, R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne Cb4alkyl alebo cykloalkyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus.
A je nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, výhodne fenylalkyl substituovaný jednou alebo viac alkoxy skupinami, výhodne Ct.4alkoxy, nesubstituovaný fenyl alebo fenyl substituovaný jednou alebo viac halo-, alkyl-, haloalkyl-, acylamino-, alebo nitroskupinami, alebo nesubstituovaná alebo substituovaná N-obsahujúca heteroaromatická skupina, ktorá jc prípadne kondenzovaná s benzénovým jadrom, výhodne pyrolyl, pyridyl, izochinolyl alebo chinolyl, alebo S-obsahujúca heteroarylová skupina, výhodne tienyl, pričom dané heteroarylové skupiny môžu mať jeden alebo viac substituentov, výhodne jeden alebo viac alkylov, výhodne C-|.4alkylov,
Zje chemická väzba,
R je skupina štruktúry (e), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne Cj.4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5až 7-členný nasýtený heterocyklus, ktorý môže obsahovať ďalšie heteroatómy a mať substituenta(ov), výhodne Cj.4alkyl; Y4 je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný Cj.4alkyl Ys je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný, alebo OR7, kde R7 je vodík alebo acyl, k je 1, 2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3 s výhradou, že ak A je nesubstituovaný fenyl alebo fenyl substituovaný halogénom alebo alkoxy, alebo fenylalkyl substituovaný alkoxy, alebo pyridylová skupina a R7 je vodík, potom aspoň jeden z R1 a R2 je iný než vodík, alebo ak A je nesubstituovaný fenyl alebo fenyl substituovaný halogénom alebo alkoxy, alebo fenylalkyl substituovaný alkoxy, alebo pyridylová skupina, a R1 a R2 sú oba vodíky, potom R7 je iný než vodík.
Iná skupina farmaceutických a kozmetických prostriedkov podľa vynálezu zahrnuje tie, ktoré spolu s nosičmi a prídavnými látkami obsahujú v množstve okolo 0,5 až 99,5 hmotn. % hydroxylamínové deriváty všeobecného vzorca (I) alebo ich soli a/alebo ich opticky aktívne stereoizoméry, kde
a) X je kyslík,
A je Cj.2o priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo haloalkylfenyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, naftyl, alebo N-obsahujúca heteroaromatická skupina, výhodne pyridyl,
Zje chemická väzba,
R1 je vodík, C1_4alkyl alebo aralkyl, výhodne fenylalkyl,
R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne Cj_4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, Y6 je vodík alebo -OR7, kde R7 je vodík, k je 1,2 alebo 3 a m je 1, 2 alebo 3 s výhradou, že ak A je iné než alkyl a R' je vodík, potom Y6 je vodík, alebo
b) X je =NR4, kde R4 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, výhodne fenyl, alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenylalkyl,
A je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl alebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, výhodne fenylalkyl, alebo cykloalkyl,
Z je chemická väzba, kyslík alebo =NR3 skupina, kde R3 je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl,
R' je nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, výhodne fenyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, výhodne fenylalkyl, a
R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne C1.4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo R3 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, Y6 je vodík alebo -OR7, kde R7 je vodik alebo acyl, k je 1,2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3, alebo
c) X je kyslík,
A je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, výhodne fenylalkyl,
Zje kyslík,
R’je alkyl alebo aralkyl, výhodne fenylalkyl,
R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R3 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne CM alkyl alebo cykloalkyl, alebo R5 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, Y6 je vodík alebo -OR7, kde R7 je vodik alebo acyl, výhodne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo arylkarbonyl, k je 1,2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3, alebo
d) A je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, cykloalkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, výhodne fenylalkyl, nesubstituovaný fenyl alebo fenyl substituovaný halo-, haloalkyl-, alkoxy- alebo nitroskupinou,
R'je alkyl alebo aralkyl, výhodne fenylalkyl,
R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R3 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne C|_4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo R3 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, Y6 je vodik alebo -OH, k je 1, 2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3, alebo d2) A je skupina všeobecného vzorca (a), kde Y1 je haloalkyl, výhodne trifluórmetyl a n je 1,2 alebo 3,
R'je vodík,
R je skupina všeobecného vzorca (b), kde R3 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, výhodne C].4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo R3 a R6 spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, Y6 je vodík alebo -OH, k je 1, 2 alebo 3 a m je 1,2 alebo 3.
Iná skupina farmaceutických a kozmetických prostriedkov podľa vynálezu zahrnuje tie, ktoré spolu s nosičmi a prídavnými látkami obsahujú v množstve okolo 0,5 až 99,5 hmotn. % hydroxylamínové deriváty všeobecného vzorca (I) alebo ich soli a/alebo ich opticky aktívne stereoizoméry, kde
A je nesubstituovaný fenyl alebo fenyl substituovaný halo-, alebo nitroskupinou, N-obsahujúca heteroarylová skupina, výhodne pyridyl,
R1 je vodík, a
R je -aminoalkylová skupina, ktorá môže byť monoalebo disubstituovaná, pričom alkylový reťazec má 1 - 5 uhlíkových atómov, a dané amino substituenty, nezávisle od seba, môžu byť jedným alebo dvoma priamymi alebo rozvetvenými alkylmi alebo cykloalkylmi, alebo dané dva amino substituenty, spolu s dusíkovým atómom k nim pripojeným tvorí 3- až 7-členný, výhodne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklus, alebo jeho N-C1.4alkylový kvartémy derivát, s výhradou že ak A je pyridyl, R je iný než 1-piperidinylmetyl.
Uskutočnenia vynálezu sú vysvetlené podrobnejšie v nasledujúcich príkladoch. Musí sa však chápať, že rozsah ochrany nie je obmedzený na špecifické uskutočnenia uvádzané v príkladoch.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 ukazuje zmeny v hladine hsp na myokarde H9c2 potkanov vystavených tepelnému šoku ako účinok pôsobenia chloridu N-[2-(l-pipcridinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoylmaleinátu. Táto zlúčenina je vyznačená ako B v obrázkoch a tiež sa na ňu ako na zlúčeninu B odkazuje v nasledujúcom.
Obrázok 2 ukazuje výsledky uvedeného experimentu, získané analýzou „Westem blot“, založené na denzitometrickom hodnotení.
Obrázok 3 ukazuje výsledky analýzy „Northem blot“ hsp70 mRNA získané pri zisťovaní účinku zlúčeniny B na expresiu hsp na transkripčnej úrovni.
Obrázok 4 ukazuje výsledky analýzy „Northem blot“ hsp26 mRNA, získané na bunkách Saccharomyces cerevisiae pri zisťovaní účinku zlúčeniny B na aktiváciu hsp.
Obrázok 5 ukazuje účinok benzylalkoholu na aktiváciu adenylátcyklátu a membránový stav plazmy.
Obrázok 6 ukazuje úroveň expresie hsp génu na HeLa bunkách s použitím luciferázového reportérového na tento test.
Obrázok 7 ilustruje účinok zlúčeniny B na expresiu povrchových buniek v bunkovom rade K562.
Obrázok 8 ukazuje interakciu zlúčeniny B a rôznych lipidových membrán, s ukázaním nárastu povrchového napätia.
Obrázok 9 ukazuje účinok zlúčeniny B v koncentráciách 10 mM a 100 mM na fázový prechod dvojvrstva (L.) -» T hexagonál (Hn) pri veľkých jednolamelámych pľuzgierikoch pripravených z dipalmitoylfosfatidyl etanolamínu.
Obrázok 10 je diagram účinku zlúčeniny B na hladinu sérového TNF zdravých a STZ diabetických potkanov.
Obrázok 11 ukazuje účinok zlúčeniny B proti inhibičnému účinku cyklohexidínu na rast keratinocytov.
Obrázok 12 ukazuje účinok zlúčeniny B proti škodlivému pôsobeniu cykloheximídu na bunky endotelu.
Obrázok 13 ukazuje účinok zlúčeniny B proti škodlivému pôsobeniu cykloheximídu na bunky radu HeLa.
Obrázok 14 ukazuje účinok zlúčeniny B proti inhibičnému pôsobeniu cykloheximídu na rast bunkovej línie H9c2 potkanieho myokardu.
Obrázok 15 ukazuje účinok zlúčeniny B na aktivitu Pl transkripčného faktora v AB 1380 kvasinkových bunkách.
Obrázok 16 ukazuje účinok zlúčeniny B na aktivitu AP1 transkripčného faktora v JF1 kvasinkových bunkách.
Obrázok 17 zlúčeniny B na aktivitu PI transkripčného faktora v AB 1380 kvasinkových bunkách.
Obrázok 18 ukazuje výsledky testu získané na modeli izolovaného fungujúceho ischemického potkanieho srdca, pričom sa na daný model pôsobilo zlúčeninou B, ak boli stanovené analýzou „Westem blot“ 2 hodiny po ischémii.
Obrázok 19 ukazuje výsledky testu získané na modeli izolovaného fungujúceho ischemického potkanieho srdca, pričom sa na daný model pôsobilo zlúčeninou B, ak boli stanovené analýzou „Westem blot“ 3 hodiny po ischémii.
Obrázok 20 ukazuje hojenie rán STZ diabetických potkanov po tepelnom zranení pri liečbe krémom obsahujúcom 1 - zlúčeniny B.
Obrázok 21 ukazuje hojenie rán STZ diabetických potkanov po tepelnom zranení pri liečbe krémom obsahujúcom 2 - zlúčeniny B.
Obrázok 22 ukazuje hojenie rán STZ diabetických potkanov po tepelnom zranení pri liečbe krémom obsahujúcom zlúčeniny B.
Obrázok 23 ukazuje hojenie rán STZ diabetických potkanov po tepelnom zranení pri liečbe krémom obsahujúcom 1 - zlúčeniny B, ale s vizuálnym hodnotením.
Obrázok 24 ukazuje hojenie rán STZ diabetických potkanov po tepelnom zranení pri liečbe krémom obsahujúcom 2 - zlúčeniny B, ale s vizuálnym hodnotením.
Obrázok 25 ukazuje hojenie rán STZ diabetických potkanov po tepelnom zranení pri liečbe krémom obsahujúcom 4 - zlúčeniny B, ale s vizuálnym hodnotením.
Obrázok 26 ukazuje porovnávacie fotografie (liečba a kontrola), zhotovené v testoch uvedených pomocou digitálnej mikroskopickej epiluminiscenčnej techniky.
Obrázok 27 ukazuje hladiny hsp72 stanovené pomocou analýzy „Westem blot“ vo vzorkách získaných v predchádzajúcich testoch pri liečbe krémami obsahujúcimi 1, 2 a 4 zlúčeniny B.
Obrázok 28 ukazuje hladiny hsp72 stanovené pomocou imunohistochemickej analýzy (liečba a kontrola) SCID myší vystavených UV-B žiareniu a liečených zlúčeninou B.
Obrázok 29 ukazuje hladiny hsp72 stanovené pomocou analýzy „Westem blot“ v odobratých vzorkách kože SCID myší vystavených UV-B žiareniu a liečených zlúčeninou B.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Chemické príklady a príklady prostriedkov
Príklad 1
N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-2-tiofénkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
5,0 g (15,6 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-tiofénkarboximidoyl chlorid monohydrochloridu (príklad 44) sa rozpustilo v 19 ml vody, potom sa pridalo 6,1 ml koncentrovanej kyseliny soľnej. Roztok bol ochladený na -5 °C, potom sa po kvapkách pridal chladný roztok 4,4 g (63,8 mmol) dusitanu sodného v 2,4 ml vody. Počas celej reakcie bola vnútorná teplota udržovaná na 0 °C. Keď bolo pridanie úplné, zmes sa miešala ďalšiu jednu hodinu. Bol pridaný chladný benzén (60 ml) a zmes bola zalkalizovaná pomalým pridaním chladného roztoku 3,2 g (80 mmol) hydroxidu sodného v 45 ml vody. Organická fáza bola oddelená a premývaná postupne 20 ml vody, pokiaľ pH < 9 (3 - 5 krát). Organický roztok bol vysušený nad bezvodým síranom sodným, spracovaný s uhlím, sfiltrovaný a odparený vo vákuu (t> 45 °C) za poskytnutia 2,6 g oleja. Tento zvy šok bol rozpustený v 5 ml izopropylalkoholu a okyslený (pH 2) izopropylalkoholom obsahujúcom suchý chlorovodík. Produkt bol kryštalizovaný z n-hexánu za poskytnutia vybielenej látky.
Výťažok: 2,0 g (38 %)
Teplota topenia: 115 -123 °C
Podľa postupu z predchádzajúceho príkladu boli pripravené nasledujúce zlúčeniny:
Príklad 2
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-l-izochinolín-karboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Východisková látka: príklad 46
Výťažok: 48 %
Teplota topenia: 168 - 172 °C
IČ (KBr): 3425, 3128, 2947, 2866, 2650, 2540, 1622, 1597, 1566, 1452, 1385, 1364, 1329, 1296, 1281, 1240, 1117, 1092, 1024, 1015,978, 953,903,881,795,743,718, 658, 559 cm'1
Príklad 3
N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy] -1 -chinolínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1:1)
V tomto prípade bol na konci postupu spracovania izolovaný konečný produkt rozpustením surovej bázy v acetóne a pridaním ekvivalentného množstva kyseliny maleínovej.
Východisková látka: príklad 42
Výťažok: 67 %
Teplota topenia: 159 - 162 °C
IČ (KBr): 3427, 3019, 2947, 2886, 2689, 1583, 1477, 1450, 1352, 1293,1221, 1194,1132, 1072, 1045, 939, 919, 872, 833, 754,650, 557 cm’1
Príklad 4
N- [2-Hydroxy-3 -(1 -piperidinyl)propoxy] -3 -nitrobenzénkaroboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Východisková látka: príklad 40
Výťažok: 58 %
Teplota topenia: 185 - 189 °C
Príklad 5
N- [2-Hydroxy-3 -(1 -piperidinyl)propoxy] -3 -nitrobenzén-karboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Východisková látka: príklad 43
Výťažok: 47 %
Teplota topenia: 180- 182 °C
IČ (KBr): 3331, 2953, 2853, 2735, 2654, 2577, 1605, 1568, 1516, 1456, 1348, 1261, 1165, 1119, 1072, 1059, 1007, 960, 862, 849, 754, 719,690, 627, 581, 550, 478 cm·1
Príklad 6
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-nitrobenzénkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Východisková látka: príklad 45
Výťažok: 50 %
Teplota topenia: 159 - 162 °C
IČ (KBr): 3298, 2983, 2932, 2746, 1593, 1574, 1535, 1445, 1391, 1354, 1317, 1288, 1242, 1198, 1092, 1069, 1020, 968, 947, 914, 852, 793, 756, 708, 627, 577 cm’1
Príklad 7
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-furánkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Postup: l-Chlór-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propm [J. Org.
Chem. 33 (2) str. 523 - 30 (1968)] (3,0 g, 116,9 mmol) bol rozpustený vo vode (1,8 ml). Pridal sa tuhý NaOH (1,19 g, 29,8 mmol) a zmes sa miešala pri izbovej teplote 1 hodinu. Pridal sa N-hydroxy-2-furánkarboximidamid (1,92 g, 15,2 mmol) a zmes sa ponechala miešať pri izbovej teplote cez noc. Pridala sa koncentrovaná HC1 (2,1 ml) na úpravu pH na pribi. 4 a roztok bol odparený vo vákuu do sucha.
Zvyšok (5,4 g) bol rozpustený v kone. HC1 (37 ml), ochladený na 0 - 5 °C a po kvapkách sa v priebehu 30 minút pridal vodný roztok NaNO2 (5,6 g, 80 mmol v 23 ml vody). Roztok sa potom zalkalizoval pridaním 2N roztoku NaOH (102 ml) na pH = 10, a zextrahoval etylacetátom (2 x 130 ml). Spojené organické fázy sa premyli vodou, vysušili nad bezvodým Na2SO4 a odparili. Zvyšok (2,0 g) bol rozpustený v malom objeme etylacetátu (20 ml) a produkt bol zrazený pridaním izopropanolového roztoku HC1 (3,2N, 3 ml). Získaná biela zrazenina bola sfiltrovaná, premytá a nakoniec rekryštalizovaná z izopropanolu.
Výťažok: 11 %
Teplota topenia: 139- 141 °C
IČ (KBr): 3427, 3267, 3094, 2955, 2922, 2964, 2745, 1637, 1584, 1479, 1452, 1391, 1319, 1281, 1259, 1157, 1074,1024,999,980,943,887, 854, 843,743, 710,596 cm’1
Podľa postupu z predchádzajúceho príkladu boli pripravené nasledujúce zlúčeniny:
Príklad 8
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-4-pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1 : 1)
V tomto prípade bol na konci postupu spracovania izolovaný konečný produkt rozpustením surovej bázy v acetóne a pridaním ekvivalentného množstva kyseliny maleínovej.
Výťažok: 25 %
Teplota topenia: 165,5 - 169 °C
Príklad 9
N-[3-[(l, 1 -Dimetyl]amino-2-hydroxypropoxy]-3-trifluórmetylbenzénkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Postup:
a) 50 g (0,245 mmol) m-trifluórmetylbenzamidoximu a
33,7 g (0,6 mol) hydroxidu draselného sa rozpustilo v zmesi dimetylsulfoxidu a 170 ml vody a zmes bola ochladená na 0 °C. Pridalo sa 48 ml (0,6 mol) epichlórhydrínu a reakčná zmes bola miešaná 5 hodín pri 0 °C a ponechaná v chladničke cez noc. Ďalší deň sa pridalo 250 ml vody a zmes sa extrahovala etylacetátom (4 x 250 ml). Spojené organické fázy sa premyli vodou, vysušili, spracovali s uhlím a odparili do sucha za poskytnutia m-trifluórmetyl-N-(2,3-epoxypropoxy)-benzamidínu ako bezfarebného oleja.
Výťažok: 61 g (96%)
b) K získanému oleju sa pridalo 400 ml 18 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej a 60 ml éteru a zmes bola ochladená na -5 °C pri miešaní. Počas 40 minút sa pomaly pridalo 17,4 g (0,25 mol) dusitanu amónneho rozpusteného v 60 ml vody a reakčná zmes bola miešaná ďalších 20 minút. Zmes sa potom extrahovala éterom (2 x 160 ml) a spojené organické fázy sa dvakrát premyli vodou. K éterovému roztoku sa pridalo 340 ml 20 % roztoku hydroxidu sodného a dvojfázový systém bol pri miešaní refluxovaný 1 hodinu. Fázy boli potom oddelené, organická vrstva bola premývaná soľným roztokom do neutrality, vysušená a odparená do sucha za poskytnutia m-trifluórmetyl-N-(2,3-epoxypropoxy)-benzimidoyl chloridu ako bezfarebného oleja. Výťažok: 30,5 g (45 %)
c) Zmes 1,19 g (4,2 mmol) m-trifluór-N-(2,3-epoxypropoxy)-benzénkarboximidoyl chloridu a 0,89 ml (8,5 mmol) terc-butylamínu v 12 ml izopropylalkoholu sa refluxovala hodiny. Rozpúšťadlo bolo odstránené za zníženého tlaku. Zvyšok bol rozpustený v etylacetáte, pridalo sa 0,98 ml metanolového roztoku chlorovodíka (4,3N) a zmes bola skoncentrovaná pod vákuom na malý objem, potom zriedená éterom. Zrazenina, ktorá sa vytvorila, sa premyla chladným éterom a vysušila.
Výťažok: 0,48 g (32 %)
Teplota topenia: 150 - 153 °C
IČ (KBr): 3423, 3233, 2978, 2880, 2784, 1620, 1570, 1479, 1441, 1400, 1383, 1340, 1238, 1167, 1128, 1101, 1072,982,930, 897, 804, 787, 714,694 cm1
Podľa postupu z predchádzajúceho príkladu boli pripravené nasledujúce zlúčeniny:
Príklad 10
N-[2-Hydroxy-3-[(l-metyletyl)amino]propoxy]-3-trifluórmetylbenzénkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výťažok: 35 %
Teplota topenia: 105 - 108 °C
IČ (KBr): 3358, 2984, 2883, 2804, 1595, 1441, 1383, 1335, 1238, 1184, 1171, 1121, 1099, 1074, 1011, 995, 947, 906, 891,798, 779, 696,681, 567 cm’1
Príklad 11
N-[3-(Cyklohexylamino)-2-hydroxypropoxy]-3trifluórmetylbenzénkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výťažok: 35 %
Teplota topenia: 147 - 149,5 °C
IČ (KBr): 3381, 2951, 2860, 2820, 1580, 1439, 1344, 1267, 1161, 1126, 1099, 1074, 1003, 986, 932, 903, 872, 802, 787,716,692, 681,648 cmPríklad 12
N-[3-(Dietylamino)-2-hydroxypropoxy]-3-trifluórmetylbenzénkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výťažok: 21 %
Teplota topenia: 121 - 128 °C
IČ (KBr): 3425,3289,2951,2667, 1818, 1443,1337, 1238, 1178, 1115, 1049, 997,910,804, 781, 696, 686 cm*1
Príklad 13 N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-trifluórmetylbenzénkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výťažok: 13 %
Teplota topenia: 119 -123 °C
IČ (KBr): 3366, 2937, 2854, 2737, 2673, 2538, 1616, 1570, 1439, 1404, 1337, 1290, 1236, 1199, 1165, 1101, 1074, 1030, 984, 972, 933, 901, 829, 804, 88, 717, 699, 685, 646 cm1
Príklad 14 N-[2-Hydroxy-3-(piperidín-l-oxid-l-yl)propoxy]-N'-oxy-3-pyridínkarboximidoyl chlorid
Postup:
K roztoku N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chloridu (5,0 g, 17,1 mmol) v chloroforme (50 ml) sa v malých dávkach pridala kyselina m-chlórperbenzoová (7,0 g, 40 mmol), a zmes sa miešala pri izbovej teplote 2 hodiny. Rozpúšťadlo bolo odstránené, zvyšok rozpustený v 80 ml etylacetátu, extrahovaný vodou, vysušený a odparený. Získaný olejovitý produkt bol nakoniec kryštalizovaný s acetónom za poskytnutia produktu ako bielej tuhej látky.
Výťažok: 2,21 g (6,7 mmol, 40 %)
Teplota topenia: 140 - 142 °C
IČ (KBr): 3437, 3071, 2943, 2880, 2590, 1801, 1578, 1475, 1454, 1433, 1375, 1294, 1259, 1194, 1165, 1121, 1088, 1043, 1011, 995, 924, 905, 888, 845, 808, 710, 671, 554, 513,413 cm’1
Príklad 15
N-[2-Hydroxy-3 -(piperidín-1 -oxid-1 -yl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid
Postup:
K roztoku N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chloridu (2,0 g, 6,8 mmol) v chloroforme (20 ml) sa pridala kyselina m-chlórperbenzoová (1,6 g, s 70 % čistotou, 6,5 mmol), a zmes sa miešala pri izbovej teplote 30 minút. Roztok sa zalkalizoval pridaním 10 % roztoku hydroxidu sodného, potom sa oddelil a organická vrstva bola premytá soľným roztokom, vysušená a odparená. Tuhý zvyšok bol rekryštalizovaný s etylacetátom, precipitát bol sfiltrovaný, premytý a vysušený so získaním produktu ako bielej tuhej látky.
Výťažok: 1,03 g (48%)
Teplota topenia: 127 - 130 °C
IČ (KBr): 3454, 2988, 2945, 2880, 2585, 1585, 1512, 1479, 1443, 1416, 1393, 1350, 1331, 1289, 1183, 1134, 1072,1051,1030,997,953,939,
Príklad 16
N'- [2-Hydroxy-3 -(1 -metyl-1 -piperidínium-1 -yl)propoxy]-N-metylpyridínium-3-karboximidoyl chlorid jodidu
N'-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chloridu (1,0 g, 3,4 mmol) a 1,2 ml (20 mmol) metyljodidu bola refluxovaná v acetóne (10 ml) pod dusíkom 2 hodiny. Výsledný tmavožltý precipitát bol sfiltrovaný a premytý acetónom za získania surového produktu (1,8 g), ktorý bol potom rekryštalizovaný z 20 ml etanolu.
Výťažok: 1,2 g (60 %)
Teplota topenia: 153 - 157 °C
IČ (KBr): 3462, 3406, 3317, 2941, 2878, 2831, 1729, 1636, 1589, 1504, 1461, 1378, 1350, 1290, 1209, 1171, 1121, 11011, 1069, 1047, 1030, 941, 897, 868, 818, 706, 673, 635, 589 cm1
Príklad 17
N-[2-Acetoxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1 :1)
Postup:
1,48 g (5,0 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chloridu bolo rozpustené v 5 ml acetanhydridu. Teplota zmesi bola zvýšená na 40 °C. Po 30 minútach bolo rozpúšťadlo pri izbovej teplote úplne odstránené vo vákuu, zvyšok bol rozpustený v 30 ml dietyléteru, spracovaný s uhlím, sfiltrovaný a rozpúšťadlo bolo odstránené pri zníženom tlaku s poskytnutím 1,74 g oranžovo sfarbeného oleja.
Zvyšok bol rozpustený v 10 ml acetónu a bol pridaný roztok 0,6 g (5,17 mmol) kyseliny maleínovej v 10 ml acetónu. Kryštalický produkt bol oddelený filtráciou a premytý acetónom s poskytnutím 1,43 g bielej látky. Rekryštalizácia, s odfarbením, z 9 ml izopropylalkoholu poskytla titulnú zlúčeninu.
Výťažok: 1,22 g (54 %)
Teplota topenia: 143 - 144 °C
Príklad 18 (S)-N-[2-[2-(R)-( 1,1 -Dimetyletyloxykarbonylamino)-3-fenylpropionyloxy]-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1:1)
Postup:
6.7 g (25,5 mmol) N-(terc-butoxykarbonyl)-D-fenyalanínu bolo rozpustené v 50 ml dichlórmetánu. Roztok bol ochladený na 0 °C a po kvapkách sa pridalo 4,0 ml trictylamínu a potom 2,5 ml (26 mmol) chlórmravčanu etylnatého. Zmes sa miešala 20 minút pri 0 °C a potom sa počas 30 minút pridal roztok N-[2-hydroxy-3-(l -piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chloridu. Reakčná zmes sa miešala pri izbovej teplote 1 hodinu. Roztok bol extrahovaný vopred 10 % kyselinou octovou (2 x 100 ml), potom vodou, vysušený bezvodým síranom sodným, a odparený do sucha. Zvyšok (10,7 g) bol rozpustený v 71 ml acetónu a bolo pridané 1,53 g (13 mmol) kyseliny maleínovej. Výsledná tuhá látka bola sfiltrovaná a premytá acetónom.
Výťažok: 4,0 g (6,0 mmol, 23 %)
Teplota topenia: 146,5 - 148 °C
IČ (KBr): 3393, 2978, 1744, 1697, 1582, 1518, 1468, 1454, 1420, 1381, 1358, 1313, 1290, 1256, 1169, 1126, 1099,1084,1045,1016,930,908, 870, 750,690,575 cm’1
Podľa postupu opísaného v predchádzajúcom príklade boli pripravené nasledujúce zlúčeniny:
Príklad 19 (R)-N-[2-[2-(S)-( 1,1 -Dimetyletyloxykarbonylamino)-3-fenylpropionyloxy]-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1 : 1)
Výťažok: 23 %
Táto zlúčenina má rovnaké fyzikálne údaje (t. t., IČ) ako je uvedené v príklade 18.
[a]D = -23,6° [c= l,MeOH]
Príklad 20
N-[2-Benzoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid (Z)-2-buténdionát (1:1)
Postup:
20,9 g (75,0 mmol) N-(2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidamidu [maďarský patent č. 177 578 (1976)] sa rozpustilo v 300 ml benzénu. K tomuto roztoku sa pridalo 150 ml IN roztoku hydroxidu sodného, s následným pridaním 19,5 ml (168 mmol) benzoylchloridu po kvapkách. Po intenzívnom miešaní zmesi 2 hodiny sa pridalo 7,1 g (67 mmol) uhličitanu sodného a ďalšia dávka benzoylchloridu (9,75 ml, 84 mmol). Potom boli fázy oddelené a organická vrstva bola extrahovaná IN roztokom hydroxidu sodného a vodou, vysušená a odparená do sucha. Zvyšok (41 g oleja) bol rozpustený v 150 ml acetónu a bolo pridané 8,7 g (75 mmol) kyseliny maleínovej. Získaný precipitát bol sfiltrovaný, premytý alkoholom a usušený.
Podľa postupu opísaného v predchádzajúcom príklade boli pripravené nasledujúce zlúčeniny:
Príklad 21
N-[2-Benzoyloxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1 : 1)
Východisková látka: US patent č. 5 147 879 (1992) Výťažok: 64 %
Teplota topenia: 134 - 136 °C
IČ (KBr): 2955, 2939, 2517, 1718, 1583, 1477, 1452, 1410, 1370, 1354, 1317, 1268, 1209, 1173, 1117, 1057, 1043, 998,968, 939, 870, 748, 723, 714, 652, 582 cnf‘
Príklad 22
N-[2-Palmitoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid
Postup:
14.7 g (52,8 mmol) N-(2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidamidu [maďarský patent č.
177.578 (1976)] sa rozpustilo v 160 ml chloroformu, pridalo sa 7,7 ml (55 mmol) trietylamínu, s následným pridaním palmitoylchloridu (14,7 g, 56,5 mmol) v 85 ml chloroformu, po kvapkách. Zmes sa miešala cez noc pri izbovej teplote. Ďalší deň sa pridalo ďalšie množstvo 3,8 ml trietylamínu a 7,4 g palmitoylchloridu, a v miešaní sa pokračovalo ešte jeden deň. Roztok bol potom extrahovaný postupne vodou, 5 % kyselinou octovou a vodou, vysušený bezvodým síranom sodným a odparený do sucha.
Zvyšok (28,2 g oleja) bol rozpustený v etylacetáte a produkt bol zrazený pridaním 30 ml IN HCl/etylacetátu. Hustý biely precipitát bol sfiltrovaný, premytý etylacetátom a usušený.
Výťažok: 10,9 g (37 %)
Teplota topenia: 110 - 113 °C
Podľa postupu opísaného v predchádzajúcom príklade boli pripravené nasledujúce zlúčeniny:
Príklad 23
N-[2-Palmitoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid dihydrochlorid
Východisková látka: US patent č. 5 147 879 (1992) Poznámka: reakcia sa uskutočňovala refluxovaním Výťažok: 72 %
Teplota topenia: 69 - 73,5 °C
IČ (KBr): 3425, 2922, 2853, 2648, 2544, 1742, 1632, 1468, 1416, 1377, 1287, 1183, 1113, 1087, 1032, 984, 708, 675 cm-1
Príklad 24
N-[2-Furyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl (Z)-2-buténdionát (1 : 1)
Poznámka: produkt bol izolovaný vo forme maleínovej soli
Výťažok: 52 %
Teplota topenia: 167 -171,5 °C
Príklad 25
N-[2-(o-Chlórbenzoyloxy)-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid
Poznámka: reakcia sa uskutočňovala refluxovaním Výťažok: 50 %
Teplota topenia: 91 - 94 °C
Príklad 26
N-[2-(p-Metoxybenzoyloxy)-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid
Poznámka: reakcia sa uskutočňovala refluxovaním Výťažok: 71 %
Teplota topenia: 152 - 155 °C
Príklad 27
N-[2-(m-Trifluórmetylbenzoyloxy)-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid Poznámka: reakcia sa uskutočňovala refluxovaním Výťažok: 45 %
Teplota topenia: 144- 147 °C
Príklad 28
N-[2-(2-Tenoyloxy)-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid(Z)-2-buténdionát(l : 1)
Poznámka: reakcia sa uskutočňovala refluxovaním a produkt bol izolovaný vo forme maleínovej soli
Výťažok: 58 %
Teplota topenia: 168 - 176 °C
Príklad 29
N-[2-Acetoxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid monochlorid
Postup:
2,5 g (9,0 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamidu bolo rozpustené v 27 ml chloroformu, pridalo sa 1,6 g (16 mmol) acetanhydridu a miešalo sa 1 hodinu pri izbovej teplote. Reakčná zmes bola odparená do sucha a rozpustená v izopropylalkohole obsahujúcom ekvimoláme množstvo (9 mmol) suchého chlorovodíka. Roztok bol ochladený a tuhá látka sfiltrovaná. Rekryštalizácia z izopropylalkoholu poskytla kryštalickú zlúčeninu.
Výťažok: 1,9 g (59 %)
Teplota topenia: 107 °C
Príklad 30
N-[2-(3-Pyridínkarbonyloxy)-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid (Z)-2-buténdionát (1 : 1)
Postup:
K roztoku N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamidu (1,68 g, 6,0 mmol) v suchom pyridíne sa pridal anhydrid kyseliny nikotínovej (1,68 g, 7,4 mmol) a zmes sa ponechala pri izbovej teplote cez noc. Zmes bola odparená, zvyšok rozpustený v 30 ml etylacetátu, sfiltrovaný, filtrát sa extrahoval 10 % roztokom NaHCO3, bol vysušený a odparený. Získaný olej bol rozpustený v 20 ml acetónu a pridalo sa 0,53 g kyseliny maleínovej, čo viedlo ku zrážaniu. Produkt bol odfiltrovaný a premytý acetónom.
Výťažok: 1,84 g (61 %)
Teplota topenia: 157 - 160 °C
Príklad 31
N-[3-(l-Piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid dihydrochlorid
Postup:
2,86 g (51,5 mmol) hydroxidu draselného bolo rozpustené v 20 ml abs. etanolu, potom sa pridalo 6,45 g (47,0 mmol) N-hydroxy-3-pyridínkarboximidamidu a 7,7 g (47,7 mmol) l-chlór-3-(l-piperidinyl)-propánu a zmes sa refluxovala 9 hodín. Tuhý podiel bol odstránený filtráciou a filtrát bol odparený. Surový produkt bol rozpustený v 100 ml chloroformu, premytý IN roztokom hydroxidu sodného a potom trikrát vodou. Organická vrstva bola vysušená nad síranom sodným a rozpúšťadlo bolo odparené v malom množstve abs. etanolu a bol pridaný izopropylalkohol obsahujúci suchý chlorovodík (pH 2) s poskytnutím bielych kryštálov.
Výťažok: 4,8 g (38 %)
Teplota topenia: 95 - 100 °C
IČ (KBr): 3422, 3294, 3107, 2984, 2937, 2870, 2818, 1649, 1616, 1593, 1479, 1462, 1441, 1381, 1309, 1194, 1123, 1094, 1059, 1042, 982, 858, 816, 712, 559 cm'1
Podľa postupu opísaného v predchádzajúcom príklade boli pripravené nasledujúce zlúčeniny:
Príklad 32
N- [3 -(1 -Piperidinyl)propoxy] -3-fl uórmety lbenzénkarboximidamid monohydrochlorid
Výťažok: 42 %
Teplota topenia: 116 - 119 °C
IČ (KBr): 3412, 3082, 2949, 2874, 2827, 1655, 1485, 1447, 1383, 1325, 1283, 1171, 1121, 1094, 1072, 986, 920, 905, 808, 700, 677, 627 cm’1
SK 284823 Β6
Príklad 33
N-[3-(l-Piperidinyl)propoxy]-(3,4-dimetoxyfenyl)metánkarboximidamid dihydrochlorid
Výťažok: 35 %
Teplota topenia: 207 - 209 °C Príklad 34
N-[2,2-Dimetyl-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid
Výťažok: 38 % (olej)
IČ (KBr): 3323, 2935,2888, 2785, 1637,1477, 1393,1360, 1157,1111,1057,995,943,960,814,789,708,627 cm1
Príklad 35
N-[3-(4-Metyl-1 -piperazinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid
Výťažok: 23 %
Teplota topenia: 127 - 130 °C
IČ (KBr): 3387, 2947, 2878, 2802, 1730, 1639, 1450, 1389, 1283, 1242, 1194, 1150, 1083, 1015, 964, 933, 814, 710 cm'1
Príklad 36
N-[3-(l-Piperidinyl)propoxy]-3-nitrobenzénkarboximidamid monohydrochlorid
Výťažok: 51 %
Teplota topenia: 158 - 162 °C
Príklad 37
N-[3-(l-Piperidinyl)propoxy]-benzénkarboximidamid dihydrochlorid
Výťažok: 64 %
Teplota topenia: 207 - 209 °C
Príklad 38
N-[2-hydroxy-3-(l-Piperidinyl)propoxy]-2,4,5-trimetylbenzénkarboximidamid
Výťažok: 44 %
Teplota topenia: 199 - 201 °C
IČ (KBr): 3410, 3103, 2943, 2912, 2814, 2791, 1634, 1582, 1441, 1383, 1350, 1321, 1304, 1254, 1204, 1146, 1111, 1099,1065,993, 878, 851, 785,754, 525 cm’1
Príklad 39
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-4-acetaminobenzénkarboximidamid monohydrochlorid
Výťažok: 25 %
Teplota topenia: 133 - 137 °C
Príklad 40
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-nitrobenzénkarboximidamid monohydrochlorid
Výťažok: 38 %
Teplota topenia: 190- 193 °C
Príklad 41
N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-2-( 1,5-dimetyljpyrolkarboximidamid monohydrochlorid
Výťažok: 20 %
Teplota topenia: 144- 147 °C
IČ (KBr, báza): 3458, 3369, 2930, 2849, 1622, 1587, 1502, 1468, 1437, 1396, 1354, 1323, 1279, 1254, 1200, 1157, 1115, 1078, 1042, 988, 962, 930, 870, 856, 758, 737, 694, 609 cm’1
Príklad 42
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-chinolínkarboximidamid dihydrochlorid
Výťažok: 36 %
Teplota topenia: 210 - 211 °C
Príklad 43
N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-4-nitrobenzén-karboximidamid dihydrochlorid
Výťažok: 77 %
Teplota topenia: 184- 189 °C
Príklad 44
N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-2-tiofénkarboximidamid dihydrochlorid
Výťažok: 73 %
Teplota topenia: 157 - 170 °C
IČ (KBr): 3280 (b), 2940, 1655, 1420, 1120, 1018, 1002, 857, 710 cm-1
Príklad 45
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-nitrabenzénkarboximidamid dihydrochlorid
Výťažok: 47 %
Teplota topenia: 200 - 208 °C
IČ (KBr): 3300 (b), 2960, 1670, 1535, 1347, 1155, 1020,1002, 860, 800, 735 cm1
Príklad 46
N - [2-Hydroxy-3 -(1 -piperidinyl)propoxy] -1 -izochinolínkarboximidamid dihydrochlorid
Výťažok: 56 %
Teplota topenia: 208 - 216 °C
Príklad 47
N-[3-[(1,1 -Dimetyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-3-trifluórmetylbenzénkarboximidamid dihydrochlorid
Postup:
Zmes 21,0 g (80,8 mmol) m-trifluórmetyl-N-(2,3-epoxypropoxy)-benzamidínu (príklad 9/a), 105 ml terc-butylamínu, 210 ml éteru a 84 ml 4N roztoku hydroxidu sodného sa reŕluxovala 5 hodín. Fázy boli oddelené, éterová vrstva bola premývaná soľným roztokom do neutrality, vysušená a odparená do sucha. Výsledný olej bol rozpustený v 250 ml acetónu, spracovaný s uhlím, potom sa pridalo 39 ml 4N HCl/etylacetátového roztoku pri miešaní, čo viedlo ku zrážaniu bielej tuhej látky, ktorá bola sfíltrovaná a premytá acetónom.
Výťažok: 22,8 g (70 %)
Teplota topenia: 186 - 192 °C
IČ (KBr): 3418, 2984, 2785, 2625, 2527, 2401, 1664, 1585, 1487, 1437, 1381, 1329, 1173, 1155, 1130, 1078, 905, 874, 820, 692, 642, 594cm-‘
Príklad 48
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-butyl-3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid
Postup:
a) Príprava N-[2-[(2-tetrahydropyranyl)oxy]-3-(l-piperidinylpropoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chloridu: 21,3 g (71,4 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chloridu bolo rozpustené v 500 ml chloroformu, okyslené éterovým roztokom kyseliny chlorovodíkovej na pH = 3 a potom sa pridalo 32,6 ml (0,357 mol) 3,4-dihydro-2H-pyránu. Zmes sa miešala pri izbovej teplote 20 hodín, premyla trikrát 200 ml dávkami 2N roztoku hydroxidu sodného a štyrikrát rovnakým množstvom vody. Organická fáza bola vysušená nad síranom sodným, sfiltrovaná a odparená pri zníženom tlaku. Olejovitý zvyšok bol rozpustený v 600 ml etylacetátu a premývaný 150 ml dáv kami pufŕového roztoku pH = 5. Organický roztok bol vysušený, sfiltrovaný a odparený.
Výťažok: 24,5 g (90 %)
b) Zmes 3,7 g (9,68 mmol) N-[2-[(2-tetrahydropyranyl)oxy]-3-( 1 -piperidinylpropoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chloridu a 40 ml (0,41 mmol) n-butylamínu bola refluxovaná 3 hodiny. Prebytok amínu bol odparený vo vákuu s poskytnutím tmavohnedého oleja, ktorý bol rozpustený v 40 ml etanolu obsahujúceho 3,0 g kyseliny 4-toluénsulfónovcj, a zmes bola zahrievaná na 60 °C jednu hodinu. Rozpúšťadlo bolo odstránené pri zníženom tlaku, zvyšok bol zalkalizovaný (pH 10) s 2N roztokom hydroxidu sodného a potom extrahovaný trikrát chloroformom. Organický roztok bol vysušený nad síranom sodným, sfiltrovaný a rozpúšťadlo bolo odparené vo vákuu. Tmavý olejovitý zvyšok bol chromatograficky čistený s poskytnutím čistej bázy, ktorá bola rozpustená v 20 ml etanolu a okyslená ekvivalentným množstvom suchej kyseliny chlorovodíkovej rozpustenej v izopropylalkohole, s poskytnutím titulnej zlúčeniny ako svetložltej kryštalickej tuhej látky.
Výťažok: 1,22 g (34 %)
Teplota topenia: 120-122 °C
IČ (KBr, báza): 3319, 3293, 3040, 2959, 2854, 2842, 2522, 1612, 1580, 1450, 1427, 1399, 1333, 1315, 1221, 1196, 1171, 1126, 1103, 1051, 1022, 988, 964, 928, 899, 858, 929,719, 692, 602 cm’1
Príklad 49
N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-N'-cyklohexyl-3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid
Výťažok: 0,89 g (24 %)
Teplota topenia: 130- 134 °C
IČ (KBr): 3280, 2935, 2853, 2640, 1720, 1619, 1551, 1514, 1452, 1404, 1313, 1236, 1155, 1124, 1111, 1090, 1040,978, 828, 735, 627 cm'1
Príklad 50
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-(l,l-dimetyl)-benzénkarboximidamid
Postup:
Do roztoku 0,92 g (5,2 mmol) l-chlór-2-hydroxy-3-(l-piperidinylj-propánu v 2 ml vody sa pridalo 0,42 g (10,4 mmol) hydroxidu sodného a zmes sa miešala jednu hodinu. K tejto zmesi sa pridalo 11,0 g (5,2 mmol) N-hydroxy-N'-(l,l-dimetylj-benzénkarboximidamidu rozpusteného v 20 ml etanolu a zmes sa refluxovala 4 hodiny. Rozpúšťadlo bolo odparené, pridalo sa 50 ml vody a zmes sa extrahovala trikrát 50 ml dávkami chloroformu. Organická fáza bola vysušená nad síranom sodným, sfiltrovaná a rozpúšťadlo bolo odparené vo vákuu. Žltý olejovitý zvyšok bol pomaly kryštalizovaný v chladničke. Kryštály boli triturované dietyléterom a odfiltrované.
Výťažok: 0,55 g (31 %)
Teplota topenia: 134 - 137 °C
IČ (KBr): 3427, 3254, 2929, 2853, 2814, 1739, 1603, 1510, 1445, 1391, 1367, 1302, 1281, 1190, 1140, 1117, 1094, 1067, 1036, 993, 963, 922, 841, 789, 716, 675 cm1
Príklad 51
N-[2-Hydroxy-3 -(1 -piperidinyl)propoxy] -Ν',Ν'-diéty 1 -3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid
Postup:
0,66 g (16,6 mmol) hydroxidu draselného bolo rozpustené v 25 ml abs. etanolu, potom sa pridalo 1,61 g (8,3 mmol) N-hydroxy-N',N'-dietyl-3-pyridínkarboximidamidu a 1,48 g (8,3 mmol) l-chlór-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propánu a zmes sa refluxovala 5 hodín. Rozpúšťadlo bolo odparené, pridalo sa 50 ml vody a zmes bola trikrát extrahovaná s 50 ml dávkami etylacetátu. Organická vrstva bola vysušená nad síranom sodným, sfiltrovaná a rozpúšťadlo bolo odparené vo vákuu. Žltý olejovitý zvyšok bol čistený chromatografiou s poskytnutím čistej bázy, ktorá bola rozpustená v 20 ml etylacetátu a okyslená ekvivalentným množstvom suchej kyseliny chlorovodíkovej rozpustenej v etylacetáte, s poskytnutím titulnej zlúčeniny ako bielej kryštalickej tuhej látky.
Výťažok: 1,3 g (42 %)
Teplota topenia: 113 -117 °C
Príklad 52
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-hexadekánoiamid monohydrochlorid
Postup:
1,74 g (10 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propánu bolo rozpustené v 20 ml chloroformu a ochladené na 0 °C. Po kvapkách bol v priebehu 10 minút pridaný roztok palmitoylchloridu (2,85g, 10 mmol) v 10 ml chloroformu. Po miešaní zmesi 15 minút bol získaný biely precipitát odfiltrovaný, premytý chloroformom a vysušený.
Výťažok: 3,2 g (71 %)
Teplota topenia: 147 - 150 °C
IČ (KBr): 3242, 3090, 2951, 2916, 2849, 1730, 1653, 1520, 1472, 1439, 1371, 1300, 1229, 1169, 1136, 1099, 1070,1009, 993, 962, 928, 858, 760, 719, 602, 471 cm’1
Podľa postupu opísaného v predchádzajúcom príklade boli pripravené nasledujúce zlúčeniny:
Príklad 53
N-[3-(l-Piperidinyl)propoxy]-3-trifluónnetyl-benzamid Východisková látka: EP 365 364 (1990)
Výťažok: 69 % (olej)
IČ (KBr): 3425, 2941, 2864, 2775, 1674, 1614, 1566, 1520, 1483, 1393, 1337,1277, 1187, 1129,1072, 922, 914, 750, 698, 650 cnT1
Príklad 54
N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]naftalén-1 karboxamid
Výťažok: 54 % (olej)
Teplota topenia: 104 - 107 °C
IČ (KBr): 3375, 2934, 1641, 1593, 1564, 1439, 1340, 1325, 1113, 1026, 941,810, 779 cm’1
Príklad 55
N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-N'-heptylmočovina
Postup:
K roztoku 1,23 g (7,1 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propánu rozpusteného v 20 ml chloroformu sa pridalo 1,0 g (7,1 mmol) heptylizokyanátu a reakčná zmes bola miešaná 20 hodín. Rozpúšťadlo bolo odparené vo vákuu a zvyšok bol čistený chromatografiou s poskytnutím čistého bezfarebného oleja. Biely kryštalický produkt bol získaný trituráciou petroléterom.
Výťažok: 81 % (olej)
Teplota topenia: 49-51 °C
Podľa postupu opísaného v predchádzajúcom príklade bola pripravená nasledujúca zlúčenina:
Príklad 56
N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-N'-propylmočovina
Výťažok: 50 % (olej)
IČ (KBr): 3319, 2934, 2878, 2802, 1666, 1551, 1456, 1393, 1308,1155,1092,1040,993, 889,793 cm'1
Príklad 57
N-Cyklohexyl-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-močovina
Výťažok: 67 %
Teplota topenia: 108 -110 °C
IČ (KBr): 3319, 3287, 3188, 2930, 2853, 2797, 1637, 1574,1452, 1354, 1331, 1300, 1101, 1098,991 cm'1
Príklad 58
N-Hexyl-N'-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-močovina
Výťažok: 27 %
Teplota topenia: 50 - 52 °C
IČ (KBr): 3310, 2932, 2858, 2804, 1666, 1551, 1454, 1377, 1306, 1092,1040, 995, 791, 725, 604 cnť1
Príklad 59 N-(3-Chlórfenyl)-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-močovina
Výťažok: 34 %
Teplota topenia: 117-118 °C
IČ (KBr): 3250, 2939, 2900, 1670, 1597, 1551, 1491, 1429, 1329, 1252, 1119, 972, 775, 718, 700 cm'1
Príklad 60
N-Cyklohexyl-N'-[2-hydroxy-3-[N-cyklohexylkarbamoyl-N-( 1,1 -dimetyletyl)-amino]propoxy] -močovina
Výťažok: 44 %
Teplota topenia: 151 -152 °C
IČ (KBr): 3312, 2932, 2854, 1668, 1616, 1555, 1450, 1393,1364,1354, 1252, 1220, 1130, 941,891 cm1
Príklad 61
N-Hexyl-N'-[3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-močovina
Výťažok: 85 % (olej)
IČ (KBr): 3354, 2932, 2856, 2810, 1666, 1543, 1486, 1377,1308, 1155, 1134, 1076 cm’1
Príklad 62
N-terc-Butyl-N'-[2-hydroxy-3-(l-pipcridinyl)propoxy]-močovina
Výťažok: 38 %
Teplota topenia: 71 - 73 °C
IČ (KBr): 3314, 2945, 2916, 1651, 1555, 1460, 1393, 1384, 1335, 1254, 1111, 988, 903, 839, 781 cm’1
Príklad 63
N-(3-Nitro-fenyl)-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxyjmočovina
Výťažok: 54 %
Teplota topenia: 137 - 139 °C
IČ (KBr): 3281, 2943, 2818, 1672, 1607, 1560, 1529, 1486,1437, 1354, 1383, 1115, 802, 739 cm'1
Príklad 64
5,6-Dihydro-5-(l-piperidinyl)metyl-3-(3-pyridyl)-4H-1,2,4,-oxadiazín
Postup:
a) 17,5 g (0,05 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid dihydrochloridu bolo rozpustené v 50 ml tionylchloridu, varené 1 hodinu a potom bola zmes odparená do sucha. Zvyšok bol rozpustený v 300 ml metanolu, spracovaný s uhlím a po filtrácii bolo rozpúšťadlo odparené pri zníženom tlaku. Zvyšok bol roz pustený v minimálnom množstve etanolu a daný do chladničky s poskytnutím kryštalického N-[3-chlór-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidamid dihydrochloridu ako intermediámej zlúčeniny.
Výťažok: 13,2 g (71 %)
Teplota topenia: 127 - 145 °C
Príklad 65
N-[3-[( 1,1 -Dimetyletyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-3-trifluórmetyl-benzamid
Postup:
I, 3 ml (15,2 mmol) epichlorhydrínu sa pridalo k roztoku 1,6 ml (15,2 mmol) terc-butylamínu v 8 ml etanolu počas 10 minút pri miešaní a za udržovania teploty pod 20 °C, a nechalo sa stáť 3 dni.
Zvlášť sa rozpustilo 0,8 g (14,3 mmol) hydroxidu draselného v zmesi 20 ml etanolu a 3 ml vody, a do tejto zmesi sa pridalo 3,42 g (15,2 mmol) draselnej soli N-hydroxy-3-(trifluórmetyl)-benzamidu a skôr pripravená zmes epichlórhydrínu a terc-butylamínu. Reakčná zmes sa miešala a varila 10 hodín, potom bolo rozpúšťadlo odparené. Zvyšok bol triturovaný s 20 ml dichlórmetánu a 10 ml vody, organická fáza bola oddelená, premytá 5 ml vody a 5 ml nasýteného roztoku chloridu sodného, vysušená nad síranom sodným, sfiltrovaná a odparená. Olejovitý zvyšok bol kryštalizovaný v zmesi acetón.hexán s poskytnutím bielej látky ako titulnej zlúčeniny.
Výťažok: 0,85 g (17,3 %)
Teplota topenia: 156 - 158 °C
IČ (KBr): 2976, 2858, 1121, 1556, 1379, 1352, 1313, 1273, 1165, 1130,1072, 694 cm’1
Príklad 66
Metyl-N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridín-karboximidát (Z)-2-buténdionát (1:1)
Postup:
II, 4 g (38,2 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chloridu sa rozpustilo v 60 ml abs. etanolu a potom sa po kvapkách počas 5 minút pridalo 25 ml (0,1 mol) 25 % metanolového roztoku metoxidu sodného. Reakčná zmes sa varila pol hodinu a potom bola odparená. Zvyšok bol miešaný s 210 ml dichlórmetánu pol hodinu, chlorid sodný bol odfiltrovaný a filtrát premytý 50 ml vody a 50 ml nasýteného roztoku chloridu sodného, vysušený nad síranom horečnatým a odparený pri zníženom tlaku. Surový produkt bol čistený chromatografiou s poskytnutím titulnej zlúčeniny ako svetložltého oleja.
Výťažok: 2,9 g (29 %)
Elementárna analýza pre C15H23N3O3
vypoč. nájdené
c% 61,4 61,2
H% 7,90 7,91
N% 14,3 14,5
Príklad 67
Dietyl-N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-iminokarbonát
Postup:
Zmes 0,87g (5 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinylj-propánu a 1,1 g (5,5 mmol) tetraetyl ortokarbonátu sa miešala pri 100 °C 3 hodiny v prítomnosti katalytického množstva kyseliny p-toluénsulfónovej. Po odparení bol zvyšok čistený kolónovou chromatografiou (Merck Kieselgel 60, eluent chloroform/metanol/konc. NH4OH 30 : 5 : 0,2) s poskytnutím titulnej zlúčeniny ako svetložltého výťažku.
Výťažok: 27,79 % (olej) l3C-NMR (d,CDCl3): 154,9 (s, C=N), 76,5 (t, n-OCH2), 66,6 (d, CHOH), 64,5 (t, CHjCHJ, 61,5 (t, CHCH2N), 54,8 (t, piperidín), 26,0 (t, piperidín), 24,2 (t, piperidín), 14,9 (q, CHj), 14,1 (q, CHJ.
Príklad 68
N- [3 -[(1,1 -Dimetyletyl)amino] -2-hydroxypropoxy]-O-etyl-N'-fenylizomočovina
Postup:
18,4g (0,1 mol) etyl N-fenylchlórformimidátu (F. Lengfeld a J. Stieglitz: Am. Chem. J. J_6, 70 (1984)) a 16,2 g (0,1 mol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-[(l,l-dimetyletyl)-amin o] propán u [Ger. Off. 2 651 083] sa rozpustilo v 200 ml tetrahydrofuránu, pridalo sa 13,9 ml (0,1 mol) trietylaminu a zmes sa miešala pri izbovej teplote 10 hodín. Trietylamín hydrochlorid, ktorý sa vytváral, bol odfiltrovaný a filtrát bol odparený vo vákuu, zvyšok bol rozpustený v 200 ml chloroformu a premytý 50 ml vody. Organická vrstva bola vysušená nad síranom sodným, sfiltrovaná a odparená pri zníženom tlaku. Surový olejovitý zvyšok bol čistený chromatografiou s poskytnutím titulnej zlúčeniny ako svetložltého oleja.
Výťažok: 18,5 g (59,8%)
Elementárna analýza pre C|6H27N3O3
vypoč. nájdené
c% 62,1 61,3
H% 8,8 8,5
N% 13,6 13,7
Príklad 69
N- [3 -(1 -Piperidinyl)propoxy]-O-fenyl izokarboxamid Postup:
3,16 g (20 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propánu sa rozpustilo v 50 ml benzénu, pridalo sa 2,4 g (20 mmol) fenylkyanátu a zmes sa miešala pri izbovej teplote 12 hodín. Pridalo sa ďalších 0,16 g (1,3 mmol) kyanátu a zmes sa miešala ďalších 12 hodín. Po odparení bol zvyšok rozpustený v metanole a tento roztok bol vyčerený aktivovaným uhlím a odparený. Produkt bol kryštalizovaný z etylacetátu/etylalkoholu s poskytnutím bielej látky.
Výťažok: 46,9 %
Teplota topenia: 63 - 70 °C 13C-NMR (d, D2O): 152,4; 129,9; 125,8; 119,9; 70,3; 57,4; 53,2; 23,0; 22,7; 21,0
Príklad 70
N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-pentametylén-O-etyl izomočovina
Postup:
2,7 g (0,01 mol) dietyl-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-iminokarbonátu (pozri príklad 67) a 0,99 ml (0,01 mol) piperidínu bolo rozpustené v 40 ml tetrahydfofuránu a miešané pri izbovej teplote 2 hodiny a potom odparené do sucha. Zvyšok bol čistený chromatografiou s poskytnutím titulnej zlúčeniny ako oleja.
Výťažok: 2,1 g (67,1 %)
Elementárna analýza pre C16H3]N3O3
vypoč. nájdené
C% 61,3 61,1
H% 10,0 9,8
N% 13,4 13,6
Príklad 71
N,N-Dimetyl-N'-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyljpropoxy]-N'-fenylguanidín hydrochlorid
Postup:
1150 mg (6,58 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinylj-propánu (Ger. Off. 2 651 083) sa rozpustilo v chloroforme, pridalo sa 750 mg Na2CO3, potom sa po kvapkách pridal roztok 1206 mg (6,58 mmol) N,N-dimetyl-N'-fenylchloroformamidínu (BR 888646 (1959), Bayer, aut.: Kuhle a Eue L.; CA 57,136961 (1962)) v 10 ml chloroformu. Po 5 hodinách bola tuhá fáza odfiltrovaná a filtrát bol odparený. Tento zvyšok (1800 mg oleja) bol rozpustený v 10 ml etylacetátu a produkt bol zrazený pridaním 10,46 ml 0,5N HCl/etylacetát. Žltý precipitát bol sfiltrovaný, premytý a nakoniec rekryštalizovaný z acetónu, po etylacetáte.
Výťažok: 28 %
Teplota topenia: 127 - 129 °C
IČ (KBr): 3220, 2093, 2840, 2690, 2620, 1608, 1580, 1475, 1433, 1375, 1250, 1070, 1050, 1000, 925, 900, 760, 705 cm-1
Príklad 72
N-[3-[(l,l-Dimetyletyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-N'-fenylguanidín
Postup:
3,1 g (0,01 mol) N-[3-[(l,l-dimetyletyl)amino]-hydroxypropoxy]-o-etyl-N'-fenylizomočoviny (pozri príklad 68) sa rozpustilo v 20 ml tetrahydrofuránu, pridalo sa 200 ml 25 % roztoku hydroxidu amónneho a 0,26 g (5 mmol) chloridu amónneho, a zmes bola ponechaná pri izbovej teplote 15 hodín. Zmes bola odparená do sucha a čistená chromatografiou s poskytnutím titulnej zlúčeniny ako oleja. Výťažok: 1,7 g (60,7%)
Elementárna analýza pre C^H^N^
vypoč. nájdené
C% 60,0 60,2
H% 8,6 8,9
N% 20,0 19,8
Príklad 73
N,N'-Dimetyl-N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyljpropoxy]-benzénkarboxamidín hydrochlorid
Postup:
3,55 g (20 mmol) 3-piperidíno-2-hydroxy-1 -propánu bolo rozpustené v 2,5 ml vody, pridalo sa 0,8 g (20 mmol) NaOH a zmes bola miešaná pri izbovej teplote 1 hodinu. Potom bol pridaný roztok 6,49 g (20 mmol) N,N'-difenyl-N-hydroxybenzénkarboxamidín hydrochloridu v 60 ml etylalkoholu, po kvapkách, a ďalších 0,8 g (20 mmol) NaOH. Získaná žltá suspenzia sa varila 2 hodiny. Vyzrážaný chlorid sodný bol odfiltrovaný a premytý etylacetátom. Rozpúšťadlo bolo odparené, pridalo sa 40 ml etylacetátu a dvakrát sa extrahovalo 40 ml dávkami destilovanej vody. Organická fáza bola vysušená nad síranom sodným, sfiltrovaná. Produkt bol zrazený pridaním 5,5 ml 3,67 N HCl/etylacetát. Precipitát bol sfiltrovaný, premytý a nakoniec rekryštalizovaný z metanoléteru.
Výťažok: 42 %
Teplota topenia: 151 -155 °C (metanol/éter) 13C-NMR (d, CDC1J: 159,6; 148,0; 140,9; 131,0; 129,7; 129,3; 128,9; 127,9; 127,5; 64,2; 60,2; 54,5; 22,7; 21,9
Príklad 74
N-[3-( 1 -Piperidinyl)propoxy]-N-metyl-N'-fenyl-O-etylizokarboxamid
Postup prípravy tejto zlúčeniny je rovnaký, ako sa píše v príklade 68, s použitím l-metylaminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propánu a etyl-N-fenylchlórformamidátu ako východiskových látok.
Výťažok: 56 %
Elementárna analýza pre C27H29N3O3
vypoč. nájdené
c% 66,4 66,2
H% 9,5 8,9
N% 13,7 13,9
Príklad 75
N-[3-(l-Piperidinyl)propoxy]-N-metyl-N'-fenyl-O-etylizokarboxamid
Postup prípravy tejto zlúčeniny je rovnaký, ako sa píše v príklade 72, s použitím N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-N-metyl-N'fenyl-O-etylizomočoviny (pozri príklad 74) ako východiskovej látky.
Výťažok: 43 % (olej)
Elementárna analýza pre C1SH26N4O2
vypoč. nájdené
C% 62,7 62,2
H% 8,5 8,8
N% 18,3 18,4
Príklad 76
N,N,N'-Trimetyl-N'-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-fenylguanidín
Postup:
344 mg (2,0 mmol) l-metylaminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinylj-propánu bolo rozpustené v chloroforme, pridalo sa 750 mg Ňa2CO3. Potom sa po kvapkách pridal roztok 438 mg (2,0 mmol) N,N-dimetyl-N'-fenylchlórformamid hydrochloridu v 3 ml chloroformu. Po 8 hodinách bola tuhá fáza odfiltrovaná a filtrát bol odparený. Tento zvyšok bol rozpustený v etylacetáte a produkt bol extrahovaný pridaním roztoku HC1 (ph = 1) do vody. Vodná fáza bola zalkalizovaná pridaním 2N roztoku NaOH na pH = 11 a extrahovaná etylacetátom. Organická fáza bola odparená a ďalšie čistenie sa uskutočnilo kolónovou chromatografiou s poskytnutím titulnej zlúčeniny ako žltého oleja.
Výťažok: 10 % (olej) 13C-NMR (d, CDClj): 156,6; 150,5; 128,4; 121,4; 120,5; 120,5; 70,0; 55,9; 54,4; 40,6; 39,4; 25,8; 25,6; 24,3
Príklad 77 /R/(+)-N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridin-karboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1 ; 1)
Postup:
2,16 g (3,26 mmol) (S)-N-[2-[2-(R)-(l,l-dimetyletyloxykarbonylamino)-3-fenyl-propionyloxy]-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionátu (1:1) (pozri príklad 18) bolo suspendované v 40 ml metanolu a varené 1 hodinu, potom odparené do sucha. Zvyšok bol triturovaný s 20 ml etylacetátu, precipitát bol odfiltrovaný a premytý etylacetátom. Tento surový produkt bol rekryštalizovaný v izopropylalkohole s poskytnutím titulnej zlúčeniny.
Výťažok: 1,16 g (85 %)
Teplota topenia: 136 - 137 °C [a]D =+5,6° [c = 1, MeOH, t= 27 °C]
Príklad 78
N-(3-Piperidmo-l-propoxy)-3-pyridínkarboximidoyl chlorid dihydrochlorid
Po ochladení zmesi 10 ml destilovanej vody a 4,36 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej na 0 °C sa pri miešaní pridali 2 g (7,62 mmol) N-(3-piperidíno-l-propoxy)-3-pyridínkarboxamidínu (pozri príklad 31). K tomuto žltému roztoku sa po kvapkách pridalo 2,7 g (3,81 mmol) dusitanu amónneho rozpusteného v 10 ml vody. Po miešaní tohto zelenkavého roztoku pri -5 °C 1,5 hodinu bolo pH roztoku nastavené na 10 pridaním IN vodného roztoku hydroxidu sodného pri chladení, potom bol roztok extrahovaný trikrát s 40 ml chloroformu. Organická fáza sa premyla 20 ml vody, vysušila nad síranom sodným a odparila. Zvyšok bol čistený kolónovou chromatografiou (Merck Kiesegel 60, eluent chloroform/metanol 1 : 1, s poskytnutím 1,7 g (79,2 %) bázy zodpovedajúcej titulnej zlúčenine.
Titulný hydrochlorid sa pripraví zo získanej bázy pridaním etanolového roztoku chlorovodíka, 1.1.: 165 - 167 °C.
1Č (KBr): 3015, 2945, 2617, 2515, 2088, 1982, 1600, 1570, 1437,1402,1200, 1060, 988, 912, 808 cm·'
Uvedenú východiskovú látku možno pripraviť nasledovne:
Po rozpustení 2,86 g (51,06 mmol) hydroxidu draselného v 20 ml abs. etanolu sa po častiach pri miešaní pridalo 6,45 g (47,0 mmol) 3-pyridínkarboxamid oximu. Po rozpustení sa po kvapkách pridalo 7,7 g (47,66 mmol) l-(3-chlórpropylj-piperidínu rozpusteného v 5 ml etanolu. Po 9-hodinovej reakcii bol vyzrážaný chlorid draselný odfiltrovaný, etanolový roztok bol vycerený aktívnym uhlím a odparený. Odparený zvyšok bol po odobratí do 100 ml chloroformu premytý trikrát 100 ml IN roztoku hydroxidu sodného, potom 50 ml vody. Po oddelení bola organická fáza vysušená nad síranom sodným, sfiltrovaná a odparená. Olejovitý zvyšok sa pri ochladení stáva kryštalickým. Kryštály sa triturujú s asi 20 ml éteru, filtrujú a sušia s poskytnutím béžového produktu vo výťažku 4,8 g (38,9 %).
IČ (KBr): 3422, 3107, 2937, 2870, 2819, 1640, 1479, 1391,1309, 1194, 1123, 1059, 1042, 982, 916 cm·'
Podľa postupu opísaného v predchádzajúcom príklade bola pripravená nasledujúca zlúčenina:
Príklad 79
O-(3 -Piperidíno-1 -propyl)-3-nitro-benzhydroximoyl chlorid hydrochlorid
Výťažok: 50 %
Teplota topenia: 173 - 175 °C
IČ (KBr): 3420, 2926, 2953, 2649, 2546, 1514, 1591, 1533, 1452, 1354, 1259, 1252, 1049, 994, 733 cm'1
Príklady prostriedkov
Príklad 1: Tableta
Tableta obsahujúca 50 mg aktívnej látky sa pripraví z nasledujúcich zložiek: N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-tiofénkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid 50,0mg kukuričný škrob 100,0 mg laktóza 95,0mg stearát horečnatý 4,5mg
Aktívna zložka sa jemne zomelie, zmieša s aditivami, zmes a zhomogenizuje a granuluje. Granulát sa zlisuje do tabliet.
Príklad 2: Tableta
Tableta obsahujúca 5 mg aktívnej látky sa pripraví z nasledujúcich zložiek: N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-nitrobenzimidoyl chlorid monohydrochlorid 5,0mg kukuričný škrob 75,0mg laktóza 7,5mg koloidná kyselina kremičitá 7,5mg stearát horečnatý 5,0mg
Prostriedok sa pripraví z uvedených zložiek v súlade s príkladom 1.
Príklad 3: Tableta
Tableta obsahujúca 5 mg aktívnej látky sa pripraví z nasledujúcich zložiek: N-[2-Benzoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-pyridínkarboximidamid (Z)-2-buténdionát (1 : 1) 5,0 mg kukuričný škrob 75,0 mg želatína 7,5 mg mikrokryštalická celulóza (Apical) 25,05 mg stearát horečnatý 2,5 mg
Prostriedok sa pripraví z uvedených zložiek v súlade s príkladom 1.
Príklad 4: Kapsula
Kapsula obsahujúca 10 mg aktívnej látky sa pripraví z nasledujúcich zložiek: N-[2-palmitoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid 10,0 mg laktóza 80,0mg kukuričný škrob 25,0mg talk 3,0mg koloidná kyselina kremičitá 3,0mg stearát horečnatý 2,0mg
Aktívna látka sa zmieša s aditívami, zmes sa zhomogenizuje a naplní do želatínových kapsúl.
Príklad 5: Kapsula
Kapsula obsahujúca 20 mg aktívnej látky sa pripraví z nasledujúcich zložiek: N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-tiofénkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid 20,0 mg mikrokryštalická celulóza (Apical) 99,0 mg amorfná kyselina kremičitá 1,0 mg
Aktívna látka sa zmieša s aditívami, zmes sa zhomogenizuje a naplní do želatínových kapsúl.
Príklad 6: Dražé
Dražé obsahujúce 25 mg aktívnej látky sa pripraví z nasledujúcich zložiek: N-[3-[(l,l-dimetyletyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-3trifluórmetyl-benzamidín hydrochlorid 25,0 mg karboxymetylcelulóza 295,0mg kyselina stearová 20,0mg acetát ftalát celulózy 40,0mg
Aktívna látka sa zmieša s karboxymetylcelulózou a kyselinou stearovou a zmes sa granuluje v roztoku acetátu ftalátu celulózy v 200 ml etanolu/etylacetátu. Z granulátu sa zlisuje jadro, ktoré sa potiahne vodným roztokom polyvinylpyrolidínu obsahujúceho 5 % cukru.
Príklad 7: Injekcia
Injekčný roztok sa pripraví z nasledujúcich zložiek: N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-nitrobenzimidoyl chlorid5,0 g sterilný fyziologický roztok soli 2,0 mg
Príklad 8: Mazanie
Mazanie sa pripraví z nasledujúcich zložiek: N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-tiofénkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid 7,5g kyselina stearová 18,0g cetyl stearyl alkohol 15,0g monostearát glycerolu 4,0g laurylsulfát sodný 1,5g metyl p-hydroxybenzoát 0,2g destilovaná voda 150 ml
Kyselina stearová, cetyl stearyl alkohol a monostearát glycerolu sa roztaví dohromady. Laurylsulfát sodný a metyl p-hydroxybenzoát sa rozpustí v 100 ml vody pri miernom zahrievaní a potom sa pridajú do lipofilných zložiek pri miešaní, pokiaľ teplota neklesne na izbovú teplotu. Následne sa pridá roztok aktívnej zložky v 50 ml vody a dôkladne premieša.
Príklad 9: Mazanie
Mazanie sa pripraví z nasledujúcich zložiek: N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-2-nitrobenzimidoyl chlorid monohydrochlorid 7,0g polysorbát 4,0g tekutý parafín 4,0g cetyl stearyl alkohol 12,0g biela vazelína 20,0g monostearát glycerolu 4,0g metyl p-hydroxybenzoát 0,2g etylalkohol 1,8g destilovaná voda 150 ml
Prostriedok sa pripraví, ako je opísané v príklade 8.
Príklad 9: Krém
Krém sa pripraví z nasledujúcich zložiek: N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-4-pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1:1) 10,0g biela vazelína 90,0g biely vosk 3,0g cetyl stearyl alkohol 3,0g tetraboritan sodný 4,0g monostearát glycerolu 4,0g metyl p-hydroxybenzoát 0,2g destilovaná voda90 ml
Roztok vo vode rozpustných zložiek sa pridá k teplej zmesi lipofilných zložiek ako v príklade 8, a do konečnej emulzie sa pridá vodný roztok aktívnej zlúčeniny.
Príklad 6
Účinok N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridín-karboximidoyl chlorid maleátu na bunkovú expresiu hsp (skúmané na translačnej úrovni)
Pozadie
Pokusy uvádzané v tejto časti boli uskutočňované s cieľom stanoviť, či N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxyj-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát pôsobí na zvyšovanie expresie molekulových chaperónov bunkou. Nahromadenie rôznych bielkovín tepelného šoku po určitom období vystavenia tepelnému šoku samotnému a tepelnému šoku v kombinácii s podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu bolo skúmané pridávaním 10'5 M N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu pred, v priebehu alebo okamžite po hypertermickom pôsobení na srdcové myogénne bunky (H9v2 bunky).
Látky a metódy
Bunkový rad H9c2 odvodený z embryonálnych potkaních srdcových buniek bol získaný z Európskej zbierky zvieracích tkanivových kultúr (ECACC) (88092904). Bunky sa udržovali pri 37 °C v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMDM) doplnenom 10 % fetálneho teľacieho séra (GIBCO) v termostate JOUAN CO2 (5 % CO2).
b) pôsobenie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom a podmienky tepelného šoku
Tepelný šok sa uskutočňoval pri 43 °C v CO2 termostate pre dané časové intervaly (20,40, 60, 90 a 120 minút). Bunky boli odobraté späť do 37 °C na 6 hodín a extrahovali sa bielkoviny pre SDS-PAGE. Keď sa N-[2-hydroxy-3-(l26
-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát pridával pred tepelným šokom, podal sa ΙΟ’3 M N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát 16 hodín pred stresom. V iných pokusoch sa pridal N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát v 10'5 koncentrácii tesne po tepelnom strese, v priebehu 6-hodinovej periódy nápravy. Pokusy sa opakovali trikrát.
Pre SDS-PAGE boli bunky rozrastané v 6 cm Petriho miskách. Množstvo buniek na začiatku pokusu bolo 8 x 105 a bunky boli ešte subkonfluentné, keď sa extrahovala bielkovina. Po 6-hodinovej náprave sa bunky premyli dvakrát v PBS a potom zoškrabali z povrchu misiek v PBS. Potom sa bunky stočili 5 minút pri 1500 rpm a odobrali do 100 gl modifikovaného solubilizačného pufra (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) obsahujúceho 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Triton N-100, 1 mM PMSF, 2 mg/ ml aprotinínu, 1 gg/ml chymostatínu, a sonikovali 3 x 20 sekúnd (2 min. intervaly, nastavenie 8).
Koncentrácia bielkovín sa potom stanovila z 5 gl vzorky stanovením Bradfordovej (M. M. Bradford, Anál. Biochem. 72: 248 - 254 (1976)) v troch paralelách. Vzorky sa nastavili na koncentráciu bielkoviny 100 gg/30 - 1 pomocou pufra uvedeného skôr a ďalšieho pufra tak, že konečná koncentrácia zložiek v tomto pufri bude: 110 mM TrisHCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoetanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a trochu brómfenolovej modrej; potom sa trepe pri izbovej teplote 30 minút.
Elektroforéza sa uskutočňovala podľa Laemmliho (U.
K. Laemmli Náture 227: 680 - 685 (1970)) na dvoch 8 -18 % polyakrylamidových géloch pri konštantnom napätí 50 V cez noc. Bielkoviny sa potom buď vyfarbili s Coomassie Brilliant Blue R-250, alebo preniesli na Immobilone PVDF (Millipore) pri konštantnom prúde (300 mA) 3 hodiny pri 4 °C v prenosovom pufri (10 mM CAPS, pH 11, 10 % metanol) (Proteín Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membráne, 3. laboratórny manuál, Millipore). Po prenose sa zablokovali nešpecifické miesta membrány 2 % bovinným sérovým albumínom (BSA) v TPBS (fosfátom pufrovaný soľný roztok obsahujúci 0,1 % Tween 20) pri 4 °C cez noc. Membrána s prenesenou látkou sa potom inkubovala s GRP94 monoklonálnou protilátkou (SPA-850, StressGen), zriedenou 1 : 3000, HSP60, monoklonálnou protilátkou (SPA-600, Stressgen), zriedenou 1 : 2700, alebo HSP90 monoklonálnou protilátkou (C9F34-5, StressGen), zriedenou 1 : 1250, alebo HSP90 monoklonálnou protilátkou (AC88, StressGen), zriedenou 1 : 2000, 1 hodinu pri izbovej teplote. Potom sa membrána premyla s TPBS pufrom 1 hodinu a inkubuje sa ďalšiu 1 hodinu s antipotkaním (Sigma, 1 : 4000 zriedenie, pre GRP-40) resp. antimyšacím (Sigma, adsorbovaná s ľudskými a potkaními bielkovinami, 1 : 3000 zriedenie, pre Hsp60, HSP72 alebo HSP90) sekundárnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou. Po následnom premytí s TPBS sa membrána vyvíjala s ECL (zosilneným chemiluminiscenčným) systémom (Amersham).
Dilučná séria celkovej bielkoviny bola zakaždým prenášaná a vyvíjaná paralelne so vzorkami a vypočítala sa kalibračná krivka. Zmeny v obsahu stresových bielkovín sa kvantifikovali s použitím denzitometra Bio-Rad (Model 1650) a integrátora Hewlett-Packard (HP 3 394 A) a opravili sa podľa kalibračnej krivky. Pri výpočtoch denzitometrických údajov sa považoval pás danej bielkoviny pri 37 °C bez N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu za 100 % a všetky ďalšie intenzity sa porovnávali s touto vzorkou.
d) Štatistická analýza
Údaje sa uvádzajú ako stred ± SEM. Štatistické porovnanie a výpočty sa uskutočňovali jednosmernou analýzou premeny s Posthoc Newman-Keulusovým testom (Pharmacological Calculation Systém). Štatistická významnosť bola definovaná ako P < 0,05.
Výsledky
Hsp60: Pôsobenie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu uskutočňované pri 37 °C nemalo žiadny merateľný účinok na hladinu tejto hsp. Tepelný šok pri 43 °C, trvajúci 20 minút, môže zvýšiť množstvo hsp60 skoro dvakrát. Pri predlžovanom trvaní tepelného pôsobenia sa nepozorovalo žiadne ďalšie zvyšovanie hladiny tejto bielkoviny. Keď sa podal N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát v 10 M koncentrácii 16 hodín pred stresom, množstvo hsp60 sa zvýšilo približne päťkrát (v porovnaní s 37 °C kontrolou) dokonca aj vo vzorkách vystavených 20 minútovému tepelnému pôsobeniu. Tento účinok N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)-propoxy]-3 -pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu bol evidentný aj pri vzorkách tepelne spracovaných 40, resp. 60 minút, ale potom začal klesať. N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát pridaný vo fáze nápravy bol taktiež účinný, aj keď vo významne menšom rozsahu než sa pozoroval pri pridaní tejto zlúčeniny pred stresom.
Hsp72: Množstvo pokojovej hsp72 bolo v H9c2 bunkách dosť nízke, ale účinok rôznych pôsobení na hladinu hsp72 bol dramatický. Významné zvýšenie bolo už pri 20 minútovom tepelnom šoku, a pri 40 minútach tepelného pôsobenia bolo množstvo takmer 10-krát vyššie než bolo zistené v kontrolných bunkách. Výsledkom tepelného pôsobenia s dlhším trvaním nebola žiadna významná zmena v porovnaní so 40 minútami vzorky. Podanie N-[2-hydroxy-3-(l -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu pred tepelným stresom malo značný účinok. Pri 60 minútovom tepelnom strese sa hladina hsp72 zvýšila asi 50krát v porovnaní s 37 °C vzorky, ale významné zvýšenie bolo možné zistiť už pri tepelnom strese trvajúcom 40 minút. Toto vysoko indukované množstvo hsp72 bolo stabilné v bunkách tepelne šokovaných 120 minút. N-[2-hydroxy-3-(1 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximi-doyl chlorid maleát pridaný vo fáze nápravy bol taktiež účinný, aj keď v menšej miere.
Hsp90: Pri 20 minútovom tepelnom pôsobení nebol sám tepelný šok schopný indukovať zvýšenú hladinu hsp90, ale ak sa pred tepelným šokom pridal N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát hladina hsp90 sa zvýšila asi 5-krát. Najvyšší účinok preinkubácie s touto zlúčeninou bolo možné pozorovať po jej kombinácii so 60 minútovým tepelným pôsobením. Je zaujímavé si povšimnúť, že v prípade hsp90 bol N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát pridaný po 60 minútach 43 °C pôsobenia rovnako účinný (ak nie viac), ako keď sa pridá pred stresom vysoká teplota. Pri inkubáciách s vysokou teplotou dlhších ako 90 minút účinok N-[2-hydroxy-3-(l-pipcridinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu značne slabne.
Grp94: Tvorba stresovej bielkoviny Grp94 bola indukovaná po 20 minútach tepelného šoku. Tento účinok mal vrchol pri tepelnom pôsobení 60 minút, po čom nasledoval prudký zostup vzoriek už v prípade 90 minút. Schopnosť: N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarbo ximidoyl chlorid maleátu indukovať hladinu Grp94 bola najvýraznejšia v prípade, keď sa zlúčenina pridávala pred stresom, ale významný vzostup bolo vidieť aj keď sa kombinovalo pridanie zlúčeniny vopred s 20 minút trvajúcim tepelným šokom (kde bol štvornásobný nárast v porovnaní s pôsobením 43°). Na druhej strane: Pridanie tejto zlúčeniny počas nápravy po tepelnom strese trvajúcom 40 alebo 60 minút bolo takmer rovnako účinné ako podanie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu počas 16 hodín pred stresom.
Obrázok 2 ukazuje „Westem“ analýzu bielkovín z H9c2 buniek. Použité sondy sú: Protilátka k hsp60, ukázaná v (1); protilátka k hsp72, ukázaná v (2); protilátka k hsp90, ukázaná v (3); protilátka k grp94, ukázaná v (4). Dráha (-) predstavuje bunky držané v neprítomnosti N-[2-hydroxy-3-(1 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu pri 37 °C a dráha (+) predstavuje bunky držané v jeho prítomnosti (koncentrácia 10'5 M počas 16 hodín). Tepelný šok pri 43 °C sa uskutočňoval v časoch vyznačených na obrázku. N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát pri 10'5 M koncentrácii bol pridaný 16 hodín pred tepelným pôsobením (dráha (B)) alebo v priebehu periódy nápravy (dráha (A)).
Celkový pohľad na účinok rôznych pôsobení na množstvo rôznych hsp v H9c2 srdcových bunkách poskytuje obr.
1. Množstvo stresových bielkovín v bunkách vystavených tepelnému šoku samotnému (43 °C) je predstavované v (A); množstvo stresových bielkovín v bunkách, na ktoré sa pôsobilo 10'5M N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom pred tepelným pôsobením je predstavované v (B); a množstvo stresových bielkovín v bunkách, na ktoré sa pôsobilo 10-5 N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom v priebehu 6-hodinovej periódy nápravy je predstavované v (C). Vodorovná os predstavuje časové trvanie tepelného pôsobenia a zvislá os predstavuje relatívne množstvo stresových látok.
Tepelné pôsobenie indukovalo všetky druhy HSP skúmané v tejto štúdii. Nárast bol menej výrazný v prípade hspôO. Hladina hsp60 sa zvýšila asi dvakrát po vystavení buniek 20 minútam tepla, zatiaľ čo pri dlhších pôsobeniach nebolo možné zistiť žiadny ďalší nárast. Najväčší účinok tepelného stresu bol viditeľný u hsp72, kde sa jej množstvo zvyšovalo na asi 12-násobok. Keď sa N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát pridal 16 hodín pred tepelným pôsobením, daná hladina všetkých HSP sa zvyšovala ďalej na najmenej dvojnásobok v porovnaní s hladinou pozorovanou pre tepelný stres. Taktiež bolo jasné, že u HSP sa hladina hsp7 2 zvyšovala v omnoho väčšom rozsahu pri kombinácii tepelného stresu a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu, ak sa porovnáva s indukciou zisťovanou pre tepelný stres samotný. Keď sa N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát podával vo fáze nápravy, skoro vo všetkých skúmaných prípadoch sa obsah hsp zvyšoval, ale päť zvýšenie hsp72 bolo najvýraznejšie.
Rozbor „Westem“ analýza ukázala značné nahromadenie HSP skúmaných tired po vystavení srdcových buniek tepelnému šoku. Pridanie N-[2-hydroxy-3-(l-pipcridinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu buď pred šokom alebo po šoku vysokou teplotou, znásobovalo účinok tepelného pôsobenia na produkciu HSP. Podľa tohto teda N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát pôsobí synergicky s teplotným stresom indukciou tvorby všetkých tried molekulových chaperónov.
Príklad 7
Účinok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu na bunkovú expresiu hsp (skúmané na transkripčnej úrovni)
Pozadie
Krátke vystavenie ischémii (napr. opakovaným tlakom) môže prekondiciovať srdce a chránič ho pred následnou letálnou ischémiou, ako je dokladované zníženou incidenciou ventrikulámej fibrilácie, zmenšenou veľkosťou infarktu a lepšou nápravou funkcií myokardu počas reperfúzie ischemického srdca. Pri takomto prekondiciovaní bolo dokázané, že indukuje expresiu HSP, najmä hsp72. V tejto časti sa skúma účinok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxyj3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu pomocou sledovania akumulácie mRNA v bunkách po ischémii a porovnávaní so situáciou, keď sa ischémia kombinuje s podávaním N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinylj-propoxy] -3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu.
Látky a metódy
a) indukcia tepelného stresu
Experimenty sa uskutočňovali na samcoch SPRD potkanov. Zvieratá boli anestetizované Nembutanom v dávke 60 mg/kg/i. p. Telesná teplota potkanov bola udržovaná infralampou umiestnenou nad bruchom a merala sa telesná teplota. Po 20 - 40 minútovej perióde bola teplota potkanov zvýšená na 42,0 - 42,2 °C a táto teplota bola udržovaná 15 minút. Po perióde zotavenia (2 hod) bolo odobraté vzorky tkanív z ľavých a pravých srdcových komôr.
b) indukcia srdcovej ischémie
Experimenty sa uskutočňovali na samcoch SPRD potkanov. Zvieratá boli anestetizované Nembutalom v dávke 60 mg/kg/i. p. Po otvorení hrudníka bola stlačená počas 5 minút LAD koronárna artéria a potom sa zisťovala incidencia a trvanie ventrikulámej tachykardie a fibrilácie v reperfúznej perióde (10 minút). Odobrali sa vzorky tkanív z ľavých a pravých srdcových komôr.
c) metóda „Nothem“ analýzy
Celková RNA sa extrahovala s použitím RNAgents (promega) podľa inštrukcií výrobcu (Protocols and Applications, 2. vydanie, 1991, Promega Corporation). V stručnosti: Zamrznuté vzorky tkanív (vzorky tkanív z ľavých a pravých srdcových komôr potkanov podrobených tepelnému stresu alebo srdcovej ischémii) vážiace 50 až 100 mg sa homogenizujú v 1,0 ml denaturujúceho roztoku pri +4 °C Brinkmanovou homogenizáciou. Potom sa pridala 1/10 objemu 3M octanu sodného (pH 4,0 a homogenát sa extrahoval kyslým fenolom (fenol: chloroform : izoamylalkohol 25 : 24 : 1) vortexovaním počas 10 sekúnd. Vzorka sa inkubovala na ľade 15 minút a potom sa centrifugovala (4 °C, 20 min., 10 000 x g). Vodná fáza sa preniesla do nových Eppendorfových skúmaviek, postup sa opakoval a vodná fáza sa zrazila pri -20 °C cez noc. Po centrifugácii (4 °C, 20 min., 10 000 x g) sa precipitát premyl dvakrát 95 % alkoholom a vysušil pri izbovej teplote. RNA sa rozpustila v 20 gl vody spracovanej s DEPC. Osem gg celkovej RNA sa podrobilo kapilárnemu prenosu na formaldehydagarózovom géle, RNA z gélu sa preniesla na nylonovú membránu podľa inštrukcií výrobcu (Zeta-Probe GT, BioRad).
Obsah hsp72 mRNA jednotlivých vzoriek sa porovnával s hladinou mRNA glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázového (GAPDH) génu zodpovedajúcich sond. DNA sondy (ľudská hsp70 cDNA plnej dĺžky a Apa-Ncol fragment potkaní GAPDH cDNA) boli označené alfa. 32P CTP s použitím súpravy Random Prime DNA Labeling Kit (USB). Rádioaktívne označené fragmenty boli čistené na kolóne Sephadexu G-50 (Pharmacia) ako je opísané (Ausubel et al., vyd.; Current Protocols in Molecular Biology, John Willey&Sons, 1987).
Prehybridizácie sa uskutočňovali pri 65 CC v H-pufri (0,25M Na2HPO4, pH 7,2, 7 % SDS) počas 15 minút. Hybridizácie sa uskutočňovali cez noc (65 °C, H-pufor) s izotopovo označenou cDNA sondou s aspoň 106 cpm/ml. Membrána bola premytá 20 mM Na2HPO4, pH 7,2, 5 % SDS (65 °C, 2 x 15 min.) a hodnotená autorádiografiou. Tá istá membrána sa použila na sondovanie hsp70 mRNA a meranie GAPDH mRNA sa použilo ako vnútorný štandard.
Výsledky
Koronárna oklúzia počas 5 minút bola nasledovaná reperfuziou, čo u potkanov vyvolávalo ventrikulámu tachykardiu a fibriláciu. Predpôsobenie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom (0,5-, 0,75-, 1,0 mg/kg telesnej hmotnosti i. v. 5 minút pred oklúziou) významne znižovalo stredné trvanie ventrikulámej tachykardie a zlepšovalo prežívanie prevencie ventrikulámej ííbrilácie.
Zatiaľ čo všetky zvieratá (n = 6) kontrolnej skupiny zomreli počas fázy reperfuzie, zvieratá, na ktoré sa pôsobilo N-[2-hydroxy-3-(l -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom (100 mg/kd p. o.) nielenže prežívali reperfuziu po 5 minútovej oklúzii, ale bola u nich v preparátoch srdcového svalu zistená aj značná expresia hsp72 génu.
Obrázok 3 je „Nothem“ analýza celkovej RNA izolovanej z ľavej komory potkanieho srdca, ilustrujúca výsledky získané v tomto experimente. Kontrola (dráha 1), tepelné pôsobenie (dráha 2), imitačná operácia (dráha 3), ischémia (dráha 4),N-[2-hydroxy-3-(!-pipcndinyl)-propoxy]-3pyridínkarboximidoyl chlorid maleát plus ischémia (dráha 5), a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridmkarboximi-doyl chlorid maleát (dráha 6). Pre tepelný šok sa rektálna teplota udržovala na 42 °C počas 15 minút.
Zaznamenalo sa, že samotné podávanie N-[2-hydroxy-3 -(1 -piperidinyl)-propoxy] -3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu nemá schopnosť aktivovať hsp72 gén.
Príklad 8
Ochranný účinok hydroxylamínových derivátov podľa vynálezu proti srdcovej ischémii
Samce Sprague-Dawley potkanov boli anestetizované pentobarbitalom sodným (Nembutal, 60 mg/kg telesnej hmotnosti, i. p.) a umelo ventilovani ovzduším miestnosti (2 ml/100 g, 54 cyklov za minútu) prostredníctvom tracheotómie. Pravá karotidová tepna sa katctrizovala a spojila sa s prevodníkom tlaku (BPR-01, Stoelting) na meranie systémového tepnového krvného tlaku (BP) pomocou predzosilňovača (Hg-02, Experimetria). Hydroxylamínové deriváty zverejnené v príklade 5 sa podávali prostredníctvom kanyly k jugunálnej žile (i. v.) alebo orálne (p. o.). Tep (HR) sa meria karditachometrom (HR-01, Experimetria) a sníma sa elektrokardiogram (ECG štandardné vedenie II) na záznamové zariadenie (MR-12, Medicor) pomocou podložných nerezových ihlových elektród. Hrudník sa otvoril ľavou toraktómiou a potom sa srdce exteriorizovalo jemným tlakom na pravú stranu hrudného koša. Pod ľavou koronárnou artériou sa rýchle umiestnilo 4-0 hodvábne šitie, ako je opísané Selyem et al. (1960). Srdce sa opatrne umiestnilo späť do hrudníka a zviera bolo ponechané zotaviť sa. Monitorovala sa rektálna teplota a udržovala sa kon štantná na 37 °C. Experimentálny protokol začínal 15 minútovou stabilizačnou periódou, počas ktorej pozorovanie krvného tlaku trvalé nižšieho než 70 mm Hg alebo arytmia viedlo k vyradeniu. Myokardálna ischémia sa potom vyvolala oklúziou počas 5 minút a reperfúzia sa ponechala 10 minút.
V priebehu celého pokusu sa BP, HR a ECG nepretržite zaznamenávali na viackanálovom zapisovači (R61-6CH, Medicor). Hydroxylamínové deriváty, ktorých tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II), sa podávali v 5. a 60. minúte pred oklúziou i. v. alebo p. o. cestou. Dávky hydroxylamínového derivátu z príkladu 5 boli 0,5, 0,75, 1,0 mg/kg i. v. a 100 mg/kg telesnej hmotností, p. o. zatiaľ čo referenčná substancia Bepiridil sa podávala v dávke 1,0 mg/kg i. v.
Stredné trvanie ventrikulámej tachykardie (VT) a/alebo ventrikulámej fíbrilácie (VF) v priebehu prvých 3 minút reperfúzie sa analyzovali jednosmernou analýzou premeny. Incidencia VF bola analyzovaná s použitím testu „chištvorce“. Hemodynamické premenné boli analyzované Študentovým „t“-testom. Kritická hladina významnosti bola nastavená na p < 0,05. Všetky výsledky boli vyjadrené ako stredy ± SEM. Zlúčeniny boli podávané i. v. v dávke 1 mg/kg telesnej hmotnosti 5 minút pred oklúziou.
Hydroxylamínové deriváty, pri ktorých boli zistené zvláštne výhody pre ochranu zvierat proti poškodeniu ischémiou/reperfúziou sú dané do nasledujúceho zoznamu. Prežitie (%) ukazuje percento zvierat, ktoré prežili účinok 5-minútovej koronárnej oklúzie.
Kód Prežitie (%)
Príklad 77 i v. 1 mg/kg tel. hm. 67
Príklad 78 n 100
Príklad 8 100
Príklad 13 60
Príklad 9 100
Príklad 10 II 67
Príklad 5 80
Príklad 6 II 100
Príklad 79 11 100
Príklad 1 11 100
Príklad 16 11 67
Príklad 65 II 78
Príklad 54 11 80
Príklad 20 100
Príklad 22 11 100
Príklad 47 11 100
Príklad 39 60
Príklad 51 ii 75
Príklad 64 11 100
Príklad 56 11 67
Príklad 57 67
Príklad 58 II 100
Príklad 59 II 86
Príklad 60 60
Príklad 61 11 83
Príklad 55 11 80
Príklad 66 57
Príklad 62 57
Príklad 63 11 50
Príklad 4 50
Kontrola (bez pôsobenia) n = 24 10
Navyše, pre zlúčeniny uvedené skôr bolo zistené, že poskytujú výhodné výsledky s nasledujúcimi zlúčeninami:
N-[2-hydroxy-3-(pyrolidin-l-yl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid hydrochlorid (Z)-2-buténdionát (1:1) (US 5 328 906, príklad 12, 1 mg/kg tel. hm., i. v., prežitie %: 67),
N-[2-hydroxy-3-(dietylamino)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid hydrochlorid (1:1) (US 5 328 906, príklad 11,1 mg/kg tel. hm., i. v., prežitie %: 62), N-[2-hydroxy-3-(prop-2-yl-amino)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1 : 1) (US 5 328 906, príklad 13/4, 1 mg/kg tel. hm., i. v., prežitie %: 60), N-[2-hydroxy-3-(morfolin-l-yl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1:1) (US 5 328 906, príklad 12,1 mg/kg tel. hm., i. v., prežitie %: 71), N-[2-hydroxy-3-(l-pipcridyl)-propoxy]-a-(3,4-dimetoxy-fenyl) acetamidoyl chlorid (US 5 328 906, príklad 14, 1 mg/kg tel. hm., i. v., prežitie %: 71), N-[2-hydroxy-3-(terc-butylamino)-propoxy]-2-pyridínkarboximidoyl (Z)-2-buténdionát (1:1) (US 5 328 906, príklad 13/5, 1 mg/kg tel. hm., i. v., prežitie %: 58), Chlorid kyseliny 0-(3-piperidíno-2-hydroxy-l-propyl)-benzhydroxímovej hydrochlorid (US 5 147 879, príklad 1, 1 mg/kg tel. hm., i. v., prežitie %: 100), N-[2-hydroxy-3 -(1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl (Z)-2-buténdionát (1 : 1) (US 5 147 879, príklad 2, 1 mg/kg tel. hm., p. o., prežitie %: 100).
Príklad 9
Účinok N-[2-hydroxy-3-(l -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu pri náprave bunkovej membrány a zachovanie membránovej fluidity
Zmena fluidity bunkovej membrány spojená s bunkovým poškodením indukovaným stresom sériovej deprivácie a účinok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximi-doyl chlorid maleátu na reverziu zmeny vo fluidite
Pozadie
Jedným prístupom na modelovanie patofyziologických procesov spôsobovaných stresom metabolických porúch sprevádzajúcich cukrovku je znižovanie hladiny inzulínu v kultivačnom médiu. Pretože inzulín je poskytovaný pridávaným sérom, čiastočná alebo totálna deprivácia sa zdá byť optimálnym prostriedkom na detekciu zmien na rôznych regulačných úrovniach bunky.
Sérová deprivácia je široko používanou metódou na zastavenie buniek v Gl/S fáze, 1.1 synchronizácii bunkového cyklu (Ashihara T. Methods in Enzymology, 58: 248 - 249 (1979)). Bolo pozorované, že v kultivovaných bunkách dochádza k apoptotickým procesom pri nedostatku prídavného séra (Cohen et al., Adv. in Immunology 50: 50 - 58, (1991)) a to bolo: študované ako alternatívny šok k stautosporínu alebo inhibítorom topoizomerázy na Bal/3T3 bunkách (Kulkami, G. V. et al., J. Ccll. Sci. 107: 1169 až 1179)), alebo k tepelnému šoku a glutamínovej deprivácii v Ehrlichových bunkách (Rowlands, A. G. et al., Eur. J. Biochem. 175: 93 - 99 (1991)) pri skúmaní inhibovanej proteosyntézy fosforyláciou eukaryotického iniciačného faktora (elF2alfa). Navyše existujú dôkazy o indukcii cytoprotekcie v bunkách sérovej deprivácie pomocou podávania externej HSP72 (Johnson, A: D. et al., In Vitro Celí Dev. Biol. Anim. 29A: 807 - 812 (1993)). Zvýšenie relatívnej syntézy HSP82 a HSP72 sérovou depriváciou bolo taktiež ukázané (Toye, P. et al., Mol. Biochem. Parasitol. 35: 11 až 10(1989)).
Ischemické a hypoxické poškodenie myokardu a iných orgánov je sprostredkované progresívnou dysfunkciou membrány a jej poškodením. Taktiež bolo dokázané, že v priebehu metabolických porúch srdcových buniek nastávajú zmeny v membránovej fluidite (Buje, L. M. et al., In Vivo 5: 233 -238 (1991)). Membránová fluidita primáme odráža orientáciu a rýchlosť pohybu lipidov v jej zostave a každá zmena na tejto úrovni značne ovplyvňuje základné membránové funkcie (Quinn, P. J. et al., Prog. Biophys. Molec. Biol. 53: 71 -103 (1989); Schlame, M. et al., Biochem. Biophys. Acta 1045: 1-8 (1990)).
V tomto pokuse sa uskutočnili pozorovania na stanovenie, či sa zmeny vo fluidite plazmovej membrány podieľajú na vývoji bunkového poškodenia vyvolaného sérovou depriváciou a či sérovou depriváciou vyvolaná zmena fluidity môže byť odvrátená podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu.
Látky a metódy
Experimenty sa uskutočňovali s použitím bunkových radov myšacích fobrosarkómov WEH1 a potkaních srdcových buniek H9c2, rozdelených do troch skupín:
- kontroly (10 % fetálneho teľacieho séra)
- sérovo deprivovanej
- spracovanej N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom s sérovo deprivovanej
Sérová deprivácia a MTT test
Hodnotili sme rôzne bunkové rady, koncentrácie liečiva, čas predpôsobenia a deprivácie, a našli sme najvhodnejšie nasledujúce podmienky: 5 x 10'4/ml potkaních srdcových buniek H9c2 (n = 6) a myšacích fibrosarkómov WEH1 (n = 7) sa nanieslo na 24-jamkové doštičky v 10 % FCS DMEM (Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu) a boli inkubované 2 hodiny pri 37 °C, 5 % CO2. Médium bolo odstránené a nahradené 10 % FCS DMEM, obsahujúcom 10_5M N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát. Po ďalšej inkubácii 6 hodín za podmienok uvedených boli misky intenzívne premyté PBS a deprivované na sérum. Na vopred spracované misky bol až do konca experimentu podávaný N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát. Po 18 hodinách hladovania bola väčšina buniek v sérovo deprivovanej kultúre uvoľnená z povrchu, t. j. mŕtva, sledované mikroskopicky, zatiaľ čo kultúry spracované N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridín-karboximidoyl chlorid maleátom ukazovali obraz podobný ako pri kontrolných bunkách. Viabilita buniek bola meraná v TT teste založenom na metóde Plumba et al. (Cancer Res. 49: 4435 - 4444 (1989)). Ako nepriame meradlo viability buniek slúžila metóda tatrazoliovej soli, zahrnujúca konverziu MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetetrazolium bromidu) na zafarbený formazán živými bunkami. MTT sa pridával priamo do média v koncentrácii 1 mg/ml. Po 2 hodinách inkubácie pri 37 °C v tme bol supematant odstránený a k bunkám sa okamžite pridalo 200 μΐ 0,05 M HCI v izopropanole.
Od doštičiek sa odpočítalo pri 570 nm na čítačke ELISA doštičiek (Labsysteme Multiscan Biochromatic, typ 348). Pokusy sa v každom prípade uskutočňovali najmenej v triplikátoch. Relatívna viabilita buniek sa počítala s definovaním kontrolnej skupiny ako 100 %.
Stanovenie rovnovážnej fluorescenčnej anizotropie
Bunkové suspenzie 1 x 105 buniek/ ml v PBS boli označené pridaním DPH-PA ([3-(p-fenyl)-l,3,5)hexatrienyljfenylpropionovej kyseliny) rozpustenej v tetrahydrofuráne na finálnu koncentráciu 0,1 - M a inkubované 10 minút pri 37 °C. Množstvo pridaného organického rozpúš ťadla bolo 0,05 % na zabránenie jeho účinku na bunkové membrány. Membránová sonda DPH-PA bola zvolená pre nábojové vlastnosti sondy, ktoré umožňujú DPH-PA lokalizáciu prevažne vo vonkajšom liste plazmovej membrány, s defenylhexatriénovou častou interkalovanou medzi hornými úsekmi reťazcov mastných kyselín (Kitagawa S. et al., J. Membráne Biol. 119: 221 - 227 (1991)). DPH-PA vykazuje značné zosilnenie fluorescencie v dôsledku väzby k lipidom a poskytuje tak prostriedok hodnotenia fluorescenčnej anizotropie ako funkcie usporiadania lipidov. Fluorescenčné meranie boli uskutočňované pri 37 °C s použitím Quanta Master QM-1 T-formátového spektrofotometra (Photon Technology Int. Inc., NJ, USA) vybaveného polarizátormi v excitačnej a v dvoch emisných svetelných dráhach. Excitačné a emisné vlnové dĺžky boli 360 nm (5 nm šírka štrbiny), resp. 430 nm (5 nm šírka štrbiny). Merané fluorescenčné intenzity boli opravené na fluorescenčné pozadie a rozptyl svetla neznačenou vzorkou. Fluorescenčná anizotropia bola vypočítaná ako rs = (IW - G. IVH) / (IVV + (2 x G. IVH)), kde IVV a IVH sú pozorované intenzity merané s polarizátormi paralelnými resp. kolmými na vertikálne polarizovaný excitačný lúč. Faktor G sa rovná IVH/IHH a poskytuje opravu na neschopnosť prístroja prenášať rovnako rôzne polarizované svetlá a pre rozdiel v citlivosti vo dvoch emisných kanáloch (Kitagawa S. et al., J. Membráne Biol. 119: 221 - 227 (1991)). IHV a IHH sú fluorescenčné intenzity stanovené pri vertikálnej a horizontálnej polohe emisného polarizátora, keď excitačný polarizátor je nastavený horizontálne.
Štatistická analýza
Údaje sa uvádzajú ako stredy ± SEM: Štatistické porovnanie a výpočty sa uskutočňovali jednosmernou analýzou premeny s Posthoc Newmann-Kelusovým testom (Pharmacological Calculation Systém). Štatistická významnosť bola definovaná ako P < 0,05.
Výsledky
Sérová deprivácia ako model na testovanie cytoprotektívneho účinku N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu:
Sérovo deprivované WEH+ a H9c2 bunky vykazovali 74,8 %, resp. 50,5 % relatívnu bunkovú viabilitu. V prípade, ak bol v kultivačnom médiu prítomný 10'5M N-[2hydroxy-3-(l-piperidi-nyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát, malo toto podávanie za následok takmer úplné prežívanie buniek WEH1 (93 %) a vysokú ochranu potkaních srdcových buniek H9c2 (82,75 %). Pokles relatívnej viability sérovou depriváciou a ochrana N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom boli v oboch bunkových radoch významné.
Účinok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridín-karboximidoyl chlorid maleátu na fluiditu membrán sérovo deprivovaných buniek cicavcov:
Na skúmanie účinku sérovej deprivácie na fluiditu plazmovej membrány kultivovaných buniek cicavcov bolo uskutočnené meranie fluorescenčnej anizotropie s použitím sondy pre plazmovú membránu, DPH.PA. Fyzikálne vlastnosti bunkovej plazmovej membrány boli sérovou depriváciou významne zmenené. Sérová deprivácia spôsobovala výrazný pokles fluorescenčnej anizotropie DPH.PA, t. j. normálne zvýšenie vo fluidite plazmovej membrány v oboch skúmaných bunkových modeloch. Pri pridaní N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu bolo pozorované takmer úplné zachovanie fyzikálneho stavu membrány. Tieto zmeny boli jasne konzistentné s tendenciami opísanými u viability buniek.
Rozbor
Pri spôsobovaní metabolických porúch znižovala deprivácia normálneho kultivačného média v oboch študovaných typoch buniek ich viabilitu, ako bola testovaná MTT metódou. Tento účinok bol takmer úplne revertovaný pri pridaní N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu. Sérová deprivácia vyvolávala taktiež prominentné zmeny vo fluidite plazmových membrán, o ktorých je známe, že prispievajú k dysfunkcii membrán, sprevádzajúcich poškodenie myokardu. Na rozdiel od toho boli sérovo deprivované bunky kultivované v prítomnosti N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu schopné zachovať si (alebo udržať si) čiastočne svoj normálny fyzikálny stav plazmovej membrány.
Príklad 10
Účinok inzulínu a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu na hladinu grp-94 v pečeni STZ diabetických potkanov
Pozadie
Anoxia, glukózové hladovanie a niekoľko ďalších stavov, ktoré pôsobia nepriaznivo na funkciu endoplazmového retikula (ER) indukujú syntézu glukózou regulovanej triedy stresových bielkovín (GRP) (Lin, H. Y. et al., Mol. Biol. Celí. 4: 1109 - 1119 (1993)). 94 kDa člen GRP, GRP-94, na 50 % homologický s 80 kDA stresovou bielkovinou, je lumenálna, vápnik viažuca bielkovina endoplazmového retikula. Zdá sa, že spolu s inými bielkovinami ER funguje GRP-94 ako molekulový chaperón (Nigem, S. K. et al., J. Biol. Chem. 263: 1744 - 1749 (1994)). Uvažuje sa, že akumulácia molekulového chaperónu GRP-94 by mala mať priaznivý účinok na nápravu bunkového poškodenia indukovaného STZ diabetom u potkanov. V súlade s tým sme v tu uvedených experimentoch porovnávali rôzne hladiny GRP-94 v pečeni zo zdravých a diabetických jedincov, ktorým sa podával N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát a z potkanov, ktorým sa podával inzulín plus N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát.
Látky a metódy
Testované látky: N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát (BIOREX Ltd.), inzulín (Protophane HM inj.).
Zvieratá: Samce Crl (VAF plus) Wistar potkanov (250 až 300 g). Zvieratá boli umiestnené po siedmich vjednej klietke pri 23 - 25 °C a 50 - 60 % relatívnej vlhkosti, s cyklom svetlo-tma 12/12 hodín. Bol daný voľný prístup k potrave a vodovodnej vode.
Indukcia diabetu: Jediná dávka STZ (45mg/kk i. v.) bola podaná v stave pôstu.
Zvieratá boli rozdelené do nasledujúcich skupín: a) Zdravé zvieratá
1. Zdravé, s podávaním soľného roztoku 1 týždeň (n = 5)
2. Zdravé, s podávaním soľného roztoku 2 týždne (n = 5)
3. Zdravé, s podávaním soľného roztoku 4 týždne (n = 5)
4. S podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu 1 týždeň (n = 7)
5. S podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu 2 týždne (n = 7)
6. S podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu 4 týždne (n = 7)
b) STZ-diabetické zvieratá
7. Diabetické, s podávaním soľného roztoku 1 týždeň (n = 5)
8. Diabetické, s podávaním soľného roztoku 2 týždne (n = 5)
9. Diabetické, s podávaním soľného roztoku 4 týždne (n = 5)
10. Diabetické, s podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidi-nyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu 1 týždeň (n = 7)
11. Diabetické, s podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu 2 týždne (n = 7)
12. Diabetické, s podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu 4 týždne (n = 7)
c) Inzulínované STZ-diabetické zvieratá
13. Diabetické, liečené inzulínom 1 týždeň (n = 7)
14. Diabetické, liečené inzulínom 2 týždne (n = 7)
15. Diabetické, liečené inzulínom 4 týždne (n = 7)
d) Inzulínované STZ-diabetické zvieratá s podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3pyridínkarboximi-doyl chlorid maleátu
16. 1 týždeň inzulínované STZ-diabetické zvieratá s podávaním N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (n = 7)
17. 2 týždne inzulínované STZ-diabetické zvieratá s podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (n = 7)
18. 4 týždne inzulínované STZ-diabetické zvieratá s podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (n = 7)
Po pôsobeni bola pečeň vybraná a okamžite zmrazená na -70 °C v tekutom dusíku. Pôsobenie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridtnkarboximidoyl chlorid maleátu (kdekoľvek je príslušný): 20 mg/kd/deň, p. o. Liečba inzulínom: Dvakrát denne v dávkach potrebných na udržanie normálnej hladiny glukózy.
Všetky kroky sa uskutočňovali pro 0 - 4 °C. Potkania pečeň (okolo 15 - 20 g) sa homogenizovala v domácom mixéri 2 hodiny v 80 ml modifikovaného lyzačného, pufra s jedným detergentom, obsahujúcim 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100 a 1 mM proteázových inhibítorov (PMSF, benzamidín, kyselina aminokaprónová). Homogenát sa centrifugoval pri 20 000 x g v centrifúge Sorvall RC28S 30 minút. Väčšina supematantu bola zmrazená na -20 °C ako zásobná vzorka, 1 ml sa použil na analýzu.
Koncentrácia bielkovín sa stanovila stanovením Bradfordovej (Guide to Proteín Purification, Methods in Enzymology, zv. 182, M. P. Deutscher (vyd.), Academic Press (1990)) v troch paralelách a nastavila sa na 5mg/ml.
Elektroforéza a prenos
Laboratórne techniky elektroforézy a imunoblotu sú podrobne opísané v Molecular Cloning, A Laboratory Manuál, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Proteín Blooting Protocols for the Immobilon-P Trasfer Membráne, 3. laboratórny manuál, Millipore, a U. K. Laemmli, Náture 227: 680 - 685 (1970). Každá vzorka obsahujúca 1,8 mg bielkoviny sa pred gélovou elektroforézou solubilizovala s 0,6 ml pufra obsahujúceho 110 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoetanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a trochu brómfenolovej modrej, a trepala sa pri izbovej teplote 30 minút.
Elektroforéza sa uskutočňovala podľa Laemmliho na 8 % polyakrylamidovom géli s 30 pg bielkoviny na dráhu pri konštantnom napätí 50 V cez noc. Bielkoviny sa preniesli na Immobilone PVDF (Millipore) pri konštantnom prúde (300mA) 3 hodiny pri 4 °C v prenosovom pufri (10 mM CAPS, pH 11, 10 % metanol). Nešpecifické miesta membrány sa zablokovali 2 % bovinným sérovým albumínom (BSA) v TPBS (fosfátom pufrovaný soľný roztok s 0,1 % Tween 20) pri 4 °C cez noc. Membrána s prenesenou látkou bola inkubovaná s GRP94 monoklonálnou protilátkou (SPA-850, StressGen), zriedenou 1 : 3000, 1 hodinu pri izbovej teplote. Potom sa premyla s TPBS pufrom ďalšiu 1 hodinu a inkubovala ďalšiu hodinu s antipotkaňou (Sigma, 1 : 4000 zriedenie) sekundárnou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou. Po následnom premytí s TPBS bola membrána vyvinutá s ECL systémom (Amersham).
Bola pripravená dilučná séria celkovej bielkoviny (9/1 vzorka) a zakaždým bola prenášaná a vyvíjaná zo vzorky, a vypočítala sa kalibračná krivka. Zmeny v obsahu stresových bielkovín boli kvantifikované s použitím denzitometra Βίο-Rad (Model 1650) a integrátora Hewlett-Packard (HP 3394 A) a opravené podľa kalibračnej krivky.
Štatistická analýza
Údaje sa uvádzajú ako stredy ± SEM. Štatistické porovnanie a výpočty sa uskutočňovali jednosmernou analýzou premeny v Posthoc Newman-Keulsovým testom (Pharmacological Calculation Systém). Štatistická významnosť: bola definovaná ako P < 0,05.
Výsledky
Významné zníženie relatívneho obsahu GRP-94 je pozorované u potkanov diabetických počas 1 týždňa, 2 týždňov, 4 týždňov. Tento účinok u zvierat diabetických počas 1 týždňa a 2 týždňov možno úplne zvrátiť podávaním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu. Podávaním inzulínu, samého alebo v kombinácii s N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom takmer zdvojnásobilo hladiny týchto bielkovín vo vzorkách po 1 týždni a 2 týždňoch v porovnaní s kontrolným stavom.
Na rozdiel od predchádzajúcich nálezov, podávanie N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu samého neviedlo u zvierat diabetických počas 4 týždňov k významnej zmene relatívneho množstva GRP-94. Navyše: V oboch inzulínovaných skupinách, bez ohľadu na podávanie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu sme pozorovali návrat GRP-94 ku kontrolnej hladine.
Príklad 11
Účinok N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu na ochranu epidermálnych buniek proti poškodeniu spôsobovanému vystavením teplu a UV svetlu
Látky a metódy
HaCaT je spontánne imortalizovaný ľudský keratinocytový bunkový rad odvodený z normálnej kože dospelého človeka (Boukamp et al., J. Celí. Biol. 106: 761 - 771 (1988)). HaCaT je bunkový rad s plnou schopnosťou epidermálnej diferenciácie, s normálnou keratinizáciou a s netumorogenickým charakterom. Tento rýchle sa množiaci keratinocytový rad s vysokou senzitivitou k ditamolu je taktiež charakterizovaný prítomnosťou steroidných receptorov. HaCaT bunky (4 x 105 buniek na Petriho miske s priemerom 35 mm) sa naočkovalo a rozrastalo v DMEM doplnenom 5 % fetálneho teľacieho séra (GIBCO, kat. Č. 011-629OH) vo zvlhčenej atmosfére s 5 % CO2 pri 37 °C.
SK 284823 Β6
Kultúry boli 24 hodín po nanesení premyté PBS a spracované teplom alebo svetlom.
Konfluentné kultúry buniek boli vystavené teplu (42, 44, 46, 47, 48 °C) alebo UV svetlu UVA 1, 2, 4, 6J/cm2). Vystavenie teplu bolo zaistené cirkulujúcimi vodnými kúpeľmi. Ako zdroj UV svetla bol použitý prístroj Waldmann PUVA 4000 a s energetickým spektrom konečného výstupu medzi 320a 390nm, s vrcholom pri 365nm. Výstupná energia bola monitorovaná IL-700 rádiometrom vybaveným senzormi UVA a UVB.
Morfológia buniek bola monitorovaná s použitím mikroskopie vo fázovom kontraste (Opton Axioplan Microscope, s fázovo-kontrastnými objektívmi Plan-Apochromat Ph). Za indikátory cytotoxicity boli považované nasledujúce faktory: a) znížená hustota adherovaných buniek, b) strata pravidelného „pätníkového“ usporiadania so zväčšením medzibunkových odstupov, c) zmena bunkového tvaru, napr. zábrana rozširovaniu buniek, napučanie, pyknotické zvráskavenie, fŕagmentácia a d) zmeny cytoplazmy, napr. kondenzácia alebo vakuolizácia. Bunková viabilita bola taktiež skúmaná s použitím testu exklúzie trypanovej modrej.
Výsledky
Citlivosť HaCaT keratinocytov na tepelný stres bola stanovená skúmaním ich viability. Výsledky ukázali, žc 24 hodín po vystavení teplote 48 °C neexistovali prakticky žiadne živé bunky (2,7 %) v porovnaní s kontrolou (100 %) pri 37 °C. Viabilita HaCaT keratinocytov 24 hodín po vystavení 45 °C sa ukázala, že je 59 %. Jednu hodinu po vystavení neboli v HaCaT kultúrach žiadne morfologické zmeny. 24 hodín po pôsobení tepla pri 46 °C alebo vyššej teplote dochádzalo k významnému (p <0,01) uvoľňovaniu zachytených buniek a nastávali morfologické zmeny, ako je strata pravidelného „pätníkového“ usporiadania so zväčšením medzibunkových odstupov, napúčanie, pyknotické zvráskavenie a vakuolizácia HaCaT keratinocytov. Po vystavení UV bolo zistené, že zníženie počtu životaschopných buniek malo priamy vzťah k dávke UVA.
Prekondiciovanie buniek teplom N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom (v koncentrácii 5 x 10‘5M jednu hodinu) poskytlo bunkám ochranu proti tepelnému vystaveniu pri 48 °C. Keď sa bunky skúmali 24 hodín po pôsobení 48 °C, bolo zistené, že v porovnaní s nespracovanými bunkami bunková viabilita sa zvýšila na 48 % (pri prekondiciovaní pri 42 °C) a 84 % (ak sa vopred pôsobilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátom. Najvýraznejšia ochrana (nárast vo viabilite o 140 %) sa pozorovala v prípade kombinovaného pôsobenia (42 °C a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom).
Tepelné prekondiciovanie s 42 “C, ale nie s 44 °C a 45 °C, vyvolalo výrazné zníženie cytotoxicity spôsobovanej UV-svet)om. Pôsobenie 42 °C poskytlo ochranu na vystavenie tak 2, ako i 4J/cm2. Viabilita vopred spracovaných HaCaT keratinocytov sa zvýšila o 132 % (pri 2J/cm2) a 218 % (pri 4J/cm2) v porovnaní s UV-vystavenými bunkami bez predchádzajúceho pôsobenia (100 %).
Príklad 12
Účinok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu na indukciu expresie molekulového chaperónu v tkanivách ľudskej kože
Ultrafialové UVB svetlo (290 - 320 nm) je jednou zo zložiek slnečného svetla a je o ňom známe, že spôsobuje poškodenie kože. Bola skúmaná úloha N-[2-hydroxy-3-(l
-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu pri znižovaní poškodenia spôsobovaných tkanivám kože vystavením UVB, ako aj účinok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu pri zvyšovaní expresie molekulového chaperónu v tkanivách kože.
Látky a metódy
Tkanivo ľudskej kože bolo naočkované na imunodeficientné (SCID) myši. Experimentálny protokol zahrňoval pôsobenie N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (5,0 mg/kg i. p.) na jednu skupinu myší, a rozpúšťadlovým roztokom NaCl (300 μΐ) na druhú, počas 7 dní. Na 8. deň boli obe skupiny myší vystavené UVB svetlu (100J/cm2) a 24 hodín po tomto vystavení boli odobraté vzorky na histologické vyšetrenie (rezy farbené hematoxylínom a eozínom) a imunohistochemické vyšetrenie (nepriama imunofluorescenčná technika s monoklonálnou protilátkou, mAb).
Výsledky
U UV-ožiarených myší, na ktoré sa vopred pôsobilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom, neboli pozorované klinické príznaky poškodenia spôsobovaného vystaveniu UV. Naproti tomu u jedného zo zvierat, na ktoré sa vopred nepôsobilo, bola zistená hnisavá reakcia transplantovanej oblasti. Ďalej: Imunofluorescenčné štúdie s použitím mAb hsp72 ukázali intenzívny, lineárny farebný podiel podkladovej membránovej zóny ľudskej a myšacej kože u zvierat, na ktoré sa pôsobilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximi-doyl chlorid maleátom. Táto reakcia nebola pozorovateľná na koži zvierat, na ktoré sa takto nepôsobilo. Navyše: Výrazný typ farbenia granulocytov bol prítomný v hnisavej, zápalovej kožnej reakcii zvieraťa bez pôsobenia.
Podľa tohto malo podávanie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu za následok zvýšenú tvorbu hsp v tkanivách kože a poskytovalo ochranu pred poškodením v dôsledku vystavenia UV.
Stanovenie hladiny HSP-70 z kože: „Westem“ analýza bielkovín odvodených zo štepov kože v SCID myšiach podrobených UVB a UVB + N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu.
Metódy
Extrakcia celkových rozpustných bielkovín z kože
Všetky kroky sa uskutočňovali pri izbovej teplote. Koža (okolo 9 - 35 mg) bola nakrájaná na malé kúsky a homogenizovaná piestom z matového skla v Eppendorfových skúmavkách 2 minúty v (2 μΙ/pg) 2-krát koncentrovaného Laemmliho pufra (65 mM Tris-HCl, pH 6,8, 5 % (3-merkaptoctanol, 2 % SDS, 10 % glycerol a 0,1 % brómfenolovej modrej, všetky tieto látky boli produktmi Sigma). Vzorky boli solubilizované ďalších 60 minút s nepretržitým trepaním. Pred nanesením na gél boli vzorky centrifugované pri 10000 rpm 10 minút.
Elektroforéza a prenos
Elektroforéza sa uskutočňovala na 8 % polyakrylamidovom géli s 10 /zl vzorkou na dráhu pri konštantnom napätí 50 V cez noc. Bielkoviny sa buď vyfarbili s Coomassie Brilliant Blue R-250 alebo preniesli na membránu Immobilone PVDF (Millipore) pri konštantnom prúde (300 mA) 3 hodiny pri 4 °C v prenosovom pufri (10 mM CAPS, pH 11, 10 % metanol). Nešpecifické miesta membrány sa zablokovali 2 % bovinným sérovým albumínom (BSA) v TPBS (fosfátom pufrovaný soľný roztok s 0,1 % Tween 20) pri 4 °C cez noc. Membrána s prenesenou látkou bola inkubovaná s HSP-70 monoklonálnou protilátkou (SPA-8dc, StressGen), zriedenou 1 : 1500, 1 hodinu pri izbovej teplote. Potom sa premyla s TPBS pufŕom ďalšiu 1 hodinu a inkubovala ďalšiu hodinu s antimyšacou (Sigma, 1 : 1500 zriedenie) sekundárnou protilátkou konjugovanou sa chrenovou peroxidázou. Po následnom premytí (trikrát) s TPBS bola membrána vyvinutá s ECL systémom (Amersham).
Príklad 13
Účinok n-[2-hydroxy-3-(l -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu na aktiváciu tvorby hsp a na ochranu oxidatívnej fosforylácie
Pozadie
Ukázalo sa, že vystavenie buniek Saccharomyces cerevisiae tepelnému šoku (5 min. pri 42 - 44 °C) vedie k poruche spárovania oxidatívnej fosforylácie a systému mitochondriálneho elektrónového transportu, čo ovplyvňuje schopnosť buniek syntetizovať ATP (Patriarca et al., Biochemistry and Celí Biology 70: 207 - 214, 1992). Ak sa však na bunky vopred pôsobilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom krátky časový úsek pri 37 °C pred tepelným šokom, zmenšilo sa narušenie spárovania a ochránila mitochondriálna syntéza ATP. Inhibícia cytoplazmovej syntézy RNA alebo bielkovín v priebehu tepelného šoku sa ukazuje ako zábrana tejto ochrany mitochondriálnej aktivity. V súlade s tým sa zdá byť jednou z úloh hsp úloha ochrany spárovania oxidatívnej fosforylácie a systému mitochondriálneho elektrónového transportu, ktorý je narušený, ak sú bunky vystavené fyziologickému stresu, napr. tepelnému šoku.
V tejto časti bol N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát podávaný bunkám predtým, než boli vystavené tepelnému šoku a bol skúmaný jeho účinok na ochranu spárovania oxidatívnej fosforylácie so systémom mitochondriálneho transportu pred tepelným stresom.
Tiež bolo skúmané, či aktivita transkripčných faktorov AP-1 a P 1 môže byť modulovaná N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom pri kvasinkových bunkách vystavených rôznym stresovým stavom.
Látky a metódy
Experimentálny protokol na stanovenie odpojenia oxidatívnej fosforylácie a mitochondriálnej syntézy ATP v Saccharomyces cerevisiae je poskytnutý v Patriarca et al., Biochemistry and Celí Biology 70: 2077 - 214, 1992, pričom tento odkaz je tu celkovo zahrnutý odkazom.
K bunkám S. cerevisiae, ktoré boli udržované pri 25 °C, boli pridávané rôzne koncentrácie N-[2-hydroxy-3-(1 -piperidinyljpropoxy] -3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (koncentrácie medzi 10 až 100 μΜ) a bunky potom boli inkubované 1 hodinu pri 25 °C v prítomnosti N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu. Teplota potom bola zvýšená na 42 °C a bolo urobené oxigrafové meranie, ako sa opisuje v Patriarcovej publikácii.
Bunky spracované s N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom boli testované na sprevádzajúcu indukciu hsp génov, s použitím postupu „Nothem“ analýzy. Spôsob extrakcie, čistenie mRNA z eukaryotických buniek a analyzovanie mRNA takto získanej použitím postupu „Nothem“ analýzy sú v odbore dobre známe a opísané v Maniatisovi a v Maresca et al., Archives Medical Research 24: 247 - 249 (1993); oba odkazy sú tu úplne zahrnuté. Protokol „Nothem“ analýzy je taktiež opísaný v príklade 7, uvedenom skôr. Ako sondy sa použili DNA sekvencie hsp26 a hsp70.
Výsledky
Obrázok 4 je „Nothem“ analýza hsp26 mRNA indukovanej v S. cerevisiae, ilustrujúcej výsledky tohto experimentu. Koncentrácie danej chemickej zlúčeniny podávané bunkám a trvanie inkubácia sú vyznačené.
Indukcia bola pozorovaná v bunkách, ktoré boli indukované v prítomnosti N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (10 až 100 μΜ) 5 minút až jednu hodinu pri 25 °C. Výsledky taktiež ukazujú na to, že indukcia nastáva už po 5-minútovej inkubácii.
Tiež bolo zistené, že koncentrácie testovanej zlúčeniny medzi 10 a 100 μΜ boli účinné pri zmenšovaní zásahu do spárovania oxidatívnej fosforylácie a systému mitochondriálneho elektrónového transportu v dôsledku tepelného šoku. Ochrana pred narušením mitochondriálnej syntézy ATP bola v pozorovanom rozsahu, ak sa termotolerancia buniek vyvolávala prekondiciovaním pri ich vystavení intermediámej teplote 37 °C (40 - 60 % ochrany).
Účinok benzylalkoholu na a) aktivitu adenylát cyklázy a b) fyzikálny stav bovinných tyroidných plazmových membrán je ukázaný na obr. 5. Zmena aktivity adenylát cyklázy (a) ukazuje bazálnu (krúžky), TSH-stimulovanú (krížiky), forskolínstimulovanú (trojuholníky), choleratoxínstimulovanú (obrátené trojuholníky), a fluoridystimulovanú (kosoštvorce) enzýmovú aktivitu. Membrány boli inkubované s liečivami pred pridaním prepojovacích (coupling) faktorov. Fyzikálny stav membrány bol hodnotený sledovaním rovnovážnej fluorescenčnej anizotropie (b) niekoľkých fluorofórov zabudovaných do membrány: DPH (krúžky), 12-AS (krížiky) a TMA-DPH (trojuholníky). Merania sa uskutočňovali pri 37 °C. Molámy pomer fluorofor/lipidbol vždy 1 : 1500.
Naše pokusy dokázali, že N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát vykazuje významný vplyv na aktivitu AP-1 a že jeho účinok je určovaný aktuálnymi metabolickými podmienkami buniek. Zatiaľ čo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximi-doyl chlorid maleát zvyšuje aktivitu AP-1, keď je prísun živín nedostatočný, v bohatom médiu aktivitu tohto faktora znižuje. Účinok tejto zlúčeniny je najvýraznejší v hustých, neskoro logaritmických kultúrach. Opačnú tendenciu možno pozorovať pre P 1. Jeho aktivita sa znižovala, keď N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát bol pridávaný k bunkám v minimálnom médiu. Je možné, že „down“ regulácia P-l bola vyvolaná práve zmenami v bunkových protistresových pochodoch, spôsobených N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom indukovanou aktiváciou AP-1. Je zaznamenané, že P-l odpovedal na všetky typy stresu, ale jeho aktivita nebola ovplyvnená testovanou látkou. Naše dôležité zistenia, obzvlášť s AP-1, by mohli vysvetliť mnohé aspekty in vivo aktivity tejto zlúčeniny a budú sa detailne rozoberať.
Účinok N-[2-hydroxy-3-(l -piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (B) na expresiu hsp génu v tkanivovej kultúre je ukázaný na obr. 6. HeLa bunky boli transfekované s reportérovým plazmidovým konštruktom, v ktorom bol promótor ľudského hsp70 génu fúzovaný k luciferazovému reportérovému génu. Účinok tepelného šoku a/alebo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu na hsp pro34 motor stanovený meraním aktivity luciferázy v luminometre a stanovovaním hladiny hsp bielkoviny (exprimovanej z chromozomálneho génu) „Westem“ analýzou.
Vzorky sú: 1: kontrola bez DNA, 2: 10 gg transfekovanej DNA v To, bez tepelného šoku, 3: 10 gg transfekovanej DNA v To, 60 min. tepelný šok 24 hodín po, 4: ako predošlé + N-[2-hydroxy-3-(l-piperidmyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát (B) v t0, 5: 10 gg transfekovanej DNA v to + N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát (B) v t0, 6: 10 gg transfekovanej DNA v to, 60 min. tepelný šok 24 hodín po, N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát (B) pridaný v čase tepelného šoku, 7: 10 gg transfekovanej DNA v to, 60 min. tepelný šok 24 hodín po, N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát (B) pridaný v čase 0 a v čase tepelného šoku, 8: 10 gg transfekovanej DNA v t0, bez tepelného šoku, N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát (B) pridaný v čase 0 a po 24 hodinách.
Príklad 14
Účinok n-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu na indukciu molekulového chaperónu v nádorových bunkách
Neletälny tepelný šok zvyšuje citlivosť na lýziu sprostredkovanú NK bunkami 1,5-krát a tento tepelný šok plus pôsobenie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu má synergický účinok na schopnosť K562 byť lyzovaný. Tento dodatočný účinok pripisovaný N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu jasne pochádzal zo zvýšenej expresie hsp72 plazmovej membrány, pretože in vivo blokovacie štúdie (s použitím hsp72 - špecifickej monoklonálnej protilátky) odhalili silnú inhibíciu NK-lýzie. Na obr. 7 je ukázaný účinok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (B) na hladiny hsp72 indukovanej tepelným šokom. N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát samotný nezvyšoval hladiny hsp72, zatiaľ čo kombinácia tepelného šoku a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu viedla k významnému zvýšeniu expresie hsp72 v porovnaní s tepelným šokom samotným.
Pozadie
O bielkovinách tepelného šoku je známe, že sú lokalizované v cytoplazme, kde vykonávajú rôzne chaperónové funkcie. Uvádza sa však, že v nádorových bunkách sú hsp exprimované tiež na povrch bunkovej membrány (Ferrarini, M. et al., Int. J. Cancer 51: 613 - 619 (1992)). Experimenty ukazujú, že zvýšenie hsp (napr. hsp70) na bunkovom povrchu je vyvolané vystavením nádorových buniek neletálnemu tepelnému šoku, a že toto zvýšenie koreluje so zvýšenou citlivosťou IL-2 špecifických CD-3 prirodzených zabíjacích buniek (NK) smerom k nádorovým bunkám. Pretože pre NK bunky sa uvádza, že sa zúčastňujú infiltrovania a zabíjania nádorových buniek in vivo (Kurosawa, S. et al., Eur. J. Immunol. 23: 1029 (1993)), táto zvýšená citlivosť NK buniek na nádorové bunky umožňuje lepšie zameriavanie nádorových buniek NK bunkami. Teda: Keď možno v nádorových bunkách indukovať expresiu hsp, so zvýšením hsp na bunkovom povrchu, možno takto umožniť lepšie zameriavanie a zabíjanie týchto buniek NK bunkami. V tejto časti sa skúmal účinok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu na indukciu expresie hsp72 v nádorových bunkách.
Látky a metódy
Použili sa ľudské K562 bunky myeloidného nádorového radu, odvodené od pacienta s chronickou myelogénnou leukémiou v blastickej fáze (ATCC, CCL243) (Lozzio B. C. a Lozzio B. B. Blood 45: 321, 1975). Na exponenciálne rastúce bunky sa pôsobilo 5 x 10’5M N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom pri neletálnej teplote (42 °C) dve hodiny. Po zotavovacej perióde 16 hodín pri 37 °C boli bunky testované na obsah hsp72 prietokovou cytometriou (Multhoff et al., Int. J. Cancer 61: 272 - 279 (1995)). Pôsobenie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu viedlo ku zvýšenej hladine hsp72 v nádorových bunkách.
Príklad 15
Interakcia n-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu s lipidnými membránami. Štúdia monovrstvy
Pozadie
Mechanizmus(my), ktorými je stres (fyzikálny, patofyziologický atď.) zisťovaný ako signál a prenášaný k transkripčnému aparátu je dosiaľ neznámy. Predpokladá sa, že fyzikálny stav lipidovej membránovej matrice, ktorý určuje štruktúru a funkciu membránovo viazaných bielkovín, je priamo zapojený do zachytenia tepelných zmien, ktoré v podmienkach tepelného šoku (HS) perturbujú membránovú štruktúru a spôsobujú transdukciu signálu, ktorý vyvoláva transkripciu HS génov. Súbežne s indukciou stresovej tolerancie bolo pre N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát ukázané, že zvyšuje výkonnosť buniek v detekcii a signalizácii rôznych stresových podmienok pomocou „up“ regulácie expresie niektorých chaperónových génov.
Je známe, že technika monovrstiev s použitím monomolekulových lipidových vrstiev rozprestierajúcich sa na rozhraní vzduch-voda je účinným nástrojom na overovanie prítomnosti interakcií medzi membránou a membránovo aktívnymi činidlami. Správanie dvojvrstvového systému je veľmi podobné správaniu príslušného monovrstvového systému po mnohých stránkach (molekulová veľkosť membránových zložiek, účinok fosfolipidov, orientácia zabudovaných bielkovín, atď.) Meranie zmien povrchového napätia, spôsobovaných molekulami vstupujúcimi do monovrstiev umožnili získať pohľad na molekulový rozmer danej interakcie.
Zásadným predpokladom pre názor, že v bunkovej membráne sprostredkované N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom v odozve na stres, je zaistenie dôkazov o priamej fyzikálnej interakcii N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu so zložkami membrány. Cieľom predkladanej štúdie je skúmať interakciu N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu s membránami s použitím monovrstiev rôznych lipidov ako modelových systémov pre biologické membrány.
Látky a metódy
Pokusy s monovrstvami sa uskutočňovali na teflónovej miske, s objemom 6,5 ml a plochou povrchu 8,8 cm2 pri 25 °C v Langmuirovom-Blodgettovom prístroji KSV3000 (KSV Instruments Ltd., Helsinki, Fínsko), v podstate ako bolo opísané. Molekulové lipidové vrstvy skladajúce sa l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholínu (DPPC), fosfatidylglycerolu vaječného žĺtka (EggpG) alebo bovinného srdcového kardiolipínu (BHCL) boli vytvorené z chloroformových roztokov lipidov s poskytnutím žiadaného iniciálneho povrchového napätia na subfázu 10 mM Nafosfátu (pH 7,0). Subfáza bola nepretržite miešaná magnetickou tyčinkou. N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát, rozpustený v H2O, bol pridávaný pod monovrstvu cez dierku v teflónovej komôrke, spojenú so subfázou. Injikované objemy boli vždy <1 % objemu subfázy. Povrchové napätie bolo merané Wilhelmyho metódou s použitím platinovej doštičky. Údaje zvyšovania povrchového napätia boli získané zo súborov surových údajov s použitím softvéru LB5000 z meracieho Langmuirovho-Blodgettovho systému.
Výsledky
Interakcia N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu s rôznymi fosfolipidmi bola testovaná meraním indukovaného zvýšenia povrchového napätia lipidových monovrstiev rozprestierajúcich sa na rozhraní vzduch-voda (obrázok 8). Monovrstvy boli v tejto štúdii vytvárané z DPPC, EggPG a BHCL a k subfáze sa pridávalo rastúce množstvo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu v dvoch koncentráciách, 10'6 a 10 5M. Pridanie zlúčeniny pod lipidovú monovrstvu viedlo ku zvýšeniu povrchového napätia, ktoré bolo vo všetkých prípadoch závislé od koncentrácie N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximi-doyl chlorid maleátu v subfáze. V rôznych lipidových monovrstvách však existoval výrazný rozdiel v profile povrchového napätia. V prípade zwitterionického DPPC sa napätie menilo rýchlo po injekcii N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu a potom zostalo na konštantnej hladine. Pri použití monovrstiev obsahujúcich záporne nabitý BHCL vykazoval profil povrchového napätia typickú inzerčnú kinetiku, t. j. napätie stúpalo asi dve minúty a potom dosiahlo rovnovážnu hladinu. V prítomnosti PG bola inzerčná kinetika podobná inzerčnej kinetike pozorovanej u BHCL, ale po dosiahnutí určitej hodnoty začínalo napätie klesať. Rýchlosť poklesu napätia bola závislá od koncentrácie zlúčeniny v subfáze. Jedným možným vysvetlením tohto fenoménu je odstraňovanie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu z fázového rozhrania, pretože pokles napätia pokračoval aj po dosiahnutí počiatočného napätia čistej lipidovej monovrstvy.
Na získanie ďalšieho pohľadu na špecifickú interakciu N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu s lipidovými monovrstvami bolo zvyšovanie povrchového napätia indukované danou zlúčeninou merané pri rôznych počiatočných povrchových napätiach (obrázok 8). Spôsob extrapolácie k vysokému počiatočnému napätiu dovoľuje určenie hraničného inzerčného napätia pre danú molekulu, pri ktorom už prestáva byť schopná inzercie do monovrstvy. Extrapolované hraničné povrchové napätia pre inzerciu boli 89 mN/m a 39 mN/m pre BHCL resp. DPPC. V prípade monovrstiev obsahujúcich záporne nabitý BHCL boli zvýšené napätia vždy vyššie, než bolo zistené pre zwitterionický DPPC, čo odrážalo dôležitosť elektrostatických interakcií.
Náš výskum poslúži ako prvý dôkaz, že N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát je pri podávaní vo fyziologicky relevantných koncentráciách schopný interagovať s lipidovými membránami, spôsobom špecifickým pre riadiacu skupinu.
Na obrázku 8 je ukázaná interakcia N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid ma leátu (B) a monomolekulových lipidových vrstiev. Pri šípkach bol k subfáze pridaný N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát vo vyznačených koncentráciách. Na obr. 9 sa ukazuje nárast povrchového napätia po injekcii N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (B) pod monovrstvy BHCL alebo DPPC pri rôznych počiatočných napätiach. Koncentrácia N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu v subfáze bola 10 μΜ. Lineárna regresná analýza experimentálnych údajov viedla ku korelačným koeficientom 0,844 resp. 0,995 pre monovrstvy BHCL resp DPPC.
Príklad 16
Ochranný účinok n-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu proti cytototoxickým cytokínom a cykloheximidu
Pozadie
Účelom týchto štúdií bolo sledovať možné spojenie medzi produkciou cytokínov a patofyziologickými zmenami, pri ktorých sa zdá, že N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu by mal proti nim ochraňovať.
Naše údaje uvádzajú, že N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát je cytoprotektívnym činidlom pre bunky tkanivových kultúr pri pôsobení cytotoxických cytokínov. Pôsobenie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu zvyšovalo prežívanie WEH1 164 buniek (a iných buniek cicavcov) pri pôsobení TNF. Tento účinok bol závislý od koncentrácie, ale nebol priamo úmerný koncentrácii danej zlúčeniny. Rozsah ochrany poskytovaný pôsobením N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu bol variabilný od pokusu k pokusu, aj keď zvýšená rezistencia proti cytotoxickým cytokínom bola pri spracovaných bunkách jasnou tendenciou pri všetkých pokusoch.
Ochrana poskytovaná N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu nebola príliš vysoká, ale u živého zvieraťa môže aj tento stupeň ochrany byť dostatočný na modelovanie alebo zabránenie patofyziologickým j avom.
Cieľ štúdie
Boli merané hladiny surového TNF a indukovateľnosť makrofágov z STZ diabetických a kontrolných zvierat. LPS-indukovanej sérovej TNF aktivity bolo v priebehu prvého mesiaca diabetu významne zvýšené u STZ-indukovaných diabetických potkanov (vo veku 6-18 týždňov) v porovnaní s nediabetickými potkanmi.
Výsledky
Stredné koncentrácie sérového TNF (merané rádioimunostanovením) diabetickej skupiny boli významne vyššie (480 ±96 U/ml) než pri zdravých kontrolách (345 ±48 U/ml), Foss et al., 1992, (Braz. J. Med. Viol. Res. 25: 239) uviedli podobné výsledky pre ľudské primáty. Vnútri diabetickej skupiny nebola žiadna korelácia medzi hladinami sérového TNF a trvaním diabetu. Nenašli sme biologicky aktívne TNF v sérach diabetických zvierat pomocou testu cytotoxicity na bunkách L929. Rozdiel medzi RIA a meraním cytotoxicity ukazuje na prítomnosť vysokých hladín antagonistu rozpustného TNF receptora (ochranné protizápalové molekuly) a zodpovedá zapojeniu TNF do diabetických kompilácii.
N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát mal nečakaný proliferatívny účinok na kvasinkové bunky (a na odlišné, kultivované normálne diploidné zvieracie alebo ľudské bunky). Vplyv N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu bol obzvlášť impresívny v prítomnosti nízkych koncentrácii antibiotika inhibujúceho rast cykloheximídu. Kolónie kvasinkových buniek, ktoré narástli v prítomnosti N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximi-doyl chlorid maleátu a cykloheximídu nevykazovali zvýšený výskyt genetických zmien (mutáciou rezistencie proti antibiotiku), len vyššiu metabolickú rezistenciu proti inhibitívnemu účinku cykloheximídu na proteosyntézu.
Podľa našich meraní možno účinky N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu sledovať až po zvýšenú aktivitu AP-1 transkripčného faktora, ktorý sprostredkováva účinky tak mitogénnych faktorov, ako aj rôznych typov stresov. Výsledky taktiež ukazujú, že uvedená testovaná zlúčenina a podobné zlúčeniny ovplyvňujú detixitu AP-1 a snáď aj iných transkripčných faktorov, pomocou udržovania účinkov rastových faktorov a podmienok metabolického stresu.
Na obr. 10 je ukázaná LPS-indukovaná in vitro produkcia TNF makrofágov izolovaných z STZ diabetických (1) a normálnych zvierat. Na obr. 11 je N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom indukovaná ochrana keratinocytov pred rast inhibujúcim účinkom cykloheximídu, na obr. 12 je N-[2-hydroxy-3-(1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom (B) indukovaná ochrana buniek (endotelových buniek) pred toxickými účinkami cykloheximídu, na obr. 13 je N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom (B) indukovaná ochrana ľudských cervikálnych buniek HeLa pred rast inhibujúcim účinkom antibiotika cykloheximídu, na obr. 14 je N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom (B) indukovaná ochrana buniek srdcového svalu pred rast inhibujúcim účinkom antibiotika cykloheximídu, na obr. 15 je predvedený účinok N-[2-hydroxy3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (B) na aktivitu PI transkripčného faktora v kvasinkových bunkách AB1380. Stĺpce 6 predstavuje stredné hodnoty, stĺpec 5 je prázdny. Na obr. 16 je predvedený účinok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu na aktivitu PI tTanskripčného faktora v kvasinkových bunkách JF1. Stĺpec 11 predstavuje stredné hodnoty. Na obr. 17 je predvedený účinok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (B) na aktivitu PI transkripčného faktora v kvasinkových bunkách AB138O, stĺpec 6 predstavuje stredné hodnoty, stĺpec 5 je prázdny.
Príklad 17
Kardiprotektívny účinok n-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu v izolovaných potkaních srdciach
Účelom tejto štúdie bolo skúmať kardioprotektívne a antiarytmické účinky N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu v izolovaných pracujúcich potkaních srdciach.
Metódy
Po 10-min. aeróbnej pracujúcej perfúzii boli srdcia (n = = 10 v každej skupine) podrobené 10-min. koronárnej oklúzii, nasledovanej 3-min. reperfúziou v prítomnosti
0,05; 0,5; 5,0; 20,0 resp. 50 mg/1 N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu.
V ďalších štúdiách sa na potkanov vopred pôsobilo najúčinnejšou dávkou 20 mg/kg, N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu jednu, resp. päť hodín pred izoláciou sŕdc. Po excizií boli srdcia podrobené protokolu oklúzie uvedenému pri perfúzii v prítomnosti alebo neprítomnosti N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu.
V oddelených pokusoch boli študované účinky tepelného stresu, ischémie, N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu a ich kombinácii na myokardiálny obsah bielkoviny HSP-70. Izolované srdcia boli podrobené 15 min. tepelnému stresu (42 °C), globálnej normtermickej ischémii a perfúzii N-[2-hydroxy3-(l-pipcridinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom, nasledovanou 120, resp. 180 minútovou reperfúziou.
Výsledky
Pred ischémiou N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maíeát zvyšoval koronárny prietok (CF) s koncentračnou závislosťou reakcie v tvare zvonovitej krivky. Iné parametre srdcovej funkcie neboli pri nižších koncentráciách tejto zlúčeniny zmenené. N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát v koncentrácii 50 mg/1 spôsoboval významnú bradykardiu, zníženie aortového prietoku (AF) a +dP/dtmax, a zvýšenie ľavého ventrikulámeho endiastolického tlaku (LVEDP) pred ischémiou. V kontrolnej skupine koronárnej oklúzie značne znížili CF, AF, +/-dP/dtmax, a zvýšili LVEDP. N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximi-doyl chlorid maleát zmierňoval ischémiu indukovanej poruchy srdcovej funkcie s koncentračnou závislosťou reakcie v tvare zvonovitej krivky. Najvýraznejší antiischemický účinok vykazovala koncentrácia 20 mg/ml N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu. Reperfúzia po 10 min. koronárnej oklúzie spúšťala ventrikulámu fibriláciu (VF) vo všetkých srdciach kontrolnej skupiny. Koncentrácie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu viedli k dávkovo závislému antiarytmickému účinku.
Po jednej hodine poskytovalo ešte predchádzajúce pôsobenie N-[2-hydroxy-3-(l -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu kardioprotekciu a potenciovalo akútne účinky tejto zlúčeniny. Päť hodín po predchádzajúcom pôsobení nebol kardioprotektívny účinok pozorovateľný, ale niektoré akútne účinky N-[2-hydroxy-3-(1 -piperidinyl)-propoxy]-3 -pyridínkarboximidoyl chlorid maleátovej perfúzie boli zvýšené.
Samotná zlúčenina nezvyšovala myokardiálny obsah HSP-70. Stetyokardiálny obsah HSP-70 bol značne zvýšený v dôsledku tepelného stresu, ale ischémia viedla k miernemu zvýšeniu HSP-70. Ale: Keď bola ischémia indukovaná v prítomnosti 20 mg/1 N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu, obsah HSP-70 bol zvýšený na približne rovnakú úroveň ako po tepelnom šoku.
Prichádzame k záveru, že N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát vykazuje antiischemické a antiarytmické účinky. Pri koncentrácii 20 mg/1 bolo zistené, že produkuje v izolovanom potkaňom srdci značné tak antiischemické, ako aj antiarytmické účinky. Aj keď priamy antiischemický účinok tejto zlúčeniny sa stráca po jednej hodine, stále je zvyšovaný stupeň ochrany akútnym pôsobením N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu. N-[2-Hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát a tepelný stres spolu indukujú v potkaňom srdci rýchle de novo syntézu HSP-70. N-[2-Hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát samotný syntézu HSP-70 neovplyvňuje.
Na obrázkoch 18 - 19 sú predvedené hladiny hsp bielkoviny, stanovenej „Westem“ analýzou, z potkanov kontrolných, tepelne šokovaných, s pôsobením ischémie + N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (Ischémia + B) s následným zotavením 2 hodiny (obr. 18) alebo 3 hodiny (obr. 19).
Príklad 18
Zvýšenie chaperónov n-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátom pri prevencii a náprave poškodenia kože: ochrana pred ultrafialovým svetlom b v ľudskej koži transplantovanej myšiam s ťažkým kombinovaným imunodeficitným ochorením a urýchlené hojenie rán u diabetických pacientov
Pozadie
Hsp zohrávajú všeobecnú úlohu vo fyziologickej ochrane pred stresmi prostredia. Ako molekulové chaperóny sa zúčastňujú na prevencii a náprave poškodení spôsobovaných rôznymi expozíciami, ako mechanickým traumatom, svetlom, tepelným a chemickým poškodením, infekciami atď. (E. V. Maytin, JID 104: 448, 1995). Pri patologických podmienkach, ako je diabetes mellitus, bola oznámená zoslabená funkcia niektorých hsp (M. Cherian a E. C. Abraham, Biochem. Biopys. Res. Comm. 212: 184, 1995). Pretože na N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximi-doyl chlorid maleáte bolo ukázané, že spôsobí zvýšenie chaperónov (Vigh et al., v príprave), očakávali by sme, že táto zlúčenina je schopná podporovať najrôznejšie mechanizmy ochrany a nápravy.
Účelom tejto štúdie bolo otestovať účinky a) systémového a b) miestneho podávania N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu v:
a) ochrane proti poškodeniu kože vyvolanému UVB svetlom v ľudskej koži transplantovanej myšiam s ťažkým imunodeficitným ochorením (SCID),
b) náprave zničeného procesu hojenia rán u STZ-diabetických potkanov.
Metódy
a) Na SCID myši s transplantovanou ľudskou kožou sa pôsobilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom (5,0 mg/kd i. p.) alebo vehikulom a zvieratá boli vystavené UVB svetlu (100 mJ/cm2). Po 24 hodinách bolo odobraté vzorky kože na histologické vyšetrenie a na stanovenie hsp72 s použitím imunohistochemických techník a techník „Westem“ analýzy. Ochrana pred UVB svetlom indukovaným poškodením kože predchádzajúcim pôsobením N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu bola stanovovaná klinicky a histologický. Intenzívne hsp72 vyfarbenie lineárnej podkladovej membrány bolo pozorovateľne imunofluorescenčnou technikou a zvýšené množstvo hsp72 bolo merané „Westem“ analýzou vzoriek kože, na ktoré sa pôsobilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximi-doyl chlorid maleátom.
b) Streptozotocinom indukované (STZ) diabetické potkany s tepelnými poraneniami čiastočnej až plnej hĺbky, vytvorenými na obojstranne depilovanej hrudnej koži pomocou elektricky zahriatej sondy (3 mm v priemere, 60 °C, 30, 60 a 90 sekúnd) s pôsobením miestnej aplikácie krému obsahujúceho 1 %, 2 % alebo 4 % N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu alebo vehikula sa použili na stanovenie hojenia rán vo forme „samokontroly“ porovnaním vedľa seba. Uzatváranie rany bolo zachytené fotograficky a s použitím digitálnej epiluminiscenčnej mikroskopickej techniky. Plocha rán bola meraná planimetricky 48 hodín a 21 dni po poranení. Hladina hsp72 v odobratých vzorkách kože bola stanovená s použitím „Westem“ analýzy.
Výsledky
Pôsobenie krému obsahujúceho 4 % N-[2-hydroxy-3-(1 -piperidinyljpropoxy] -3 -pyridínkarboximídoyl chlorid maleátu významne (p < 0,01) urýchlilo uzatváranie rany a zvýšilo hladinu hsp72 vo vzorkách odobratej kože, v porovnaní s kontrolou vehikula.
Naše výsledky viedli k záveru, že podávanie N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu zaisťuje ochranu proti poraneniam z vystavenia UV a že má potenciálne terapeutické využitie v klinickej liečbe stavov s defektom v náprave zranenia alebo po chirurgickej intervencii.
Na obr. 20, 21 a 22 je predvedený účinok krémov obsahujúcich 1 %, 2 % a 4 % N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyljpropoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (B) na hojenie rán. Na obr. 23,24 a 25 sú výsledky ukázané podľa stupňa poranenia.
Na obr. 26 sú ukázané fotografické snímky neošetrených a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom (B) ošetrených rán.
Obr. 27 ukazuje hladiny hsp72 bielkoviny z odobratých vzoriek kontrolných a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátom (B) (1 %, 2 % a 4 %) ošetrených rán.
Na obr. 28 je ukázané imunohistochemické hodnotenie hsp72 bielkoviny po pôsobení N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (B).
Na obr. 28 sú predvedené hladiny hsp72 z kožných vzoriek SCID myší po pôsobení N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu (B) a bez tohto pôsobenia (Kontrola).
Príklad 19
Hodnotenie stimulačného účinku hydroxylamínových derivátov podľa vynálezu na expresiu hsp72 v bunkách vystavených stresom
a) Podmienky kultivácie buniek
Z použitých buniek boli 3T3 a L-929 myšacie fibroplasty kultivované v MEM médiu a rozrastané v monovrstvách, ľudské leukemické bunky U-937 boli udržované v RPMI-1640 médiu, suspenznej kultúre, zatiaľ čo ľudské epitelové bunky HeLa boli kultivované v DMEM médiu a vo forme monovrstiev. Bunkové kultúry boli udržované ako sa opisuje v príklade 6 s tým rozdielom, že boli kultivované v uvedených kultivačných médiách.
b) Podmienky pokusov
Pokusy sa uskutočňovali s aplikáciou stresu pred pôsobením a po pôsobení zlúčeniny. Stres bol provokovaný teplom alebo chemickým činidlom, pôsobením HgCl2. Testované zlúčeniny boli aplikované v 10-5 M koncentrácii.
Štúdie cytotoxicity, ktoré boli uskutočňované 3-denným testom a hodnotené s MTT (Cytotechnology 11: 49 až 58) ukázali, že všetky testované zlúčeniny mali 50 %-ný účinok inhibície rastu v koncentráciách vyšších než 10'4 M.
V dôsledku toho nemali koncentrácie použité v HSP72 štúdiách žiadny významný cytotoxický účinok.
Pokusy s tepelným šokom
Tieto pokusy sa uskutočnili na 3T3 a L-929 myšacích fibroplastoch a ďalej na ľudských leukemických bunkách U-937.
Pokusy s aplikáciou tepelného šoku na 3T3 bunky sa uskutočnili, ako je opísané v príslušnom bode príkladu 6 s tým rozdielom, že stres bol indukovaný 30 minút vystavením pri teplote 43 °C a pôsobení testovanej zlúčeniny sa uskutočnilo 15 minút pred alebo 100 minút po tepelnom šoku.
Imunodetekcia sa uskutočňovala s použitím HSP72 špecifickou SP A 810 primárnou protilátkou (StressGen) a s A9044 (Sigma) sekundárnou protilátkou konjugovanou s chenovou peroxidázou. Denzitometrické hodnotenie sa uskutočnilo denzitometrom LKB Ultrascan.
Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 2 a tabuľke 3.
Tabuľka 2
Stimulačný účinok hydroxylamínových derivátov podľa vynálezu na tepelným šokom indukovanú produkciu hsp72 v 3T3 bunkách, ak pôsobenie predchádza vystaveniu tepelnému šoku.
Zlúčeniny hladina hsp72 relatívne ku kontrole vystavenej šoku
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát
5,6-Dihydro-5-(l-piperidinyl)metyl-3-(3-pyridyl)-4H-1,2,4-oxadiazín 3-(3-pyridyl)-5-[(l-piperidinyl)metyl]-5,6-dihydro-6H-l ,4,2-dioxazín (Z)-2-buténdionát(l : 1)
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-N',N'-dietyl-3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid 3-(3-pyridyl)-5-dietylaminometyl-5,6-dihydro-6H-1,4,2-dioxazín hydrochlorid 3-fenyl-5-[( 1 -piperidinyl)metyl]-5,6-dihydro-6H-1,4,2-dioxazín hydrochlorid /R/ (+)-N - [2-hydroxy-3 -(1 -piperidiny 1-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1 : 1) (-) N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyljpropoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-buténdionát (1:1) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]naftalén-1 -karboxamid
3-(3-pyridyl)-5-t-butylamino-5,6-dihydro-6H-l,4,2-dioxazfn
N-(2-hydroxy-3-piperidínopropoxy)-etyluretán
N-[2-palmitoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxyJ-N'-propylmočovina
N-(3-chlórfenyl)-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]močovina +++ +++ ++ +
+++ +
++ +++ +++ +++ +
+ +++ +++ +++
Zlúčeniny hladina hsp72 relatívne ku kontrole vystavenej šoku
N-(3-piperidíno-1 -propoxy)-3-pyridínkarboximidoyl chlorid dihydrochlorid +++
O-(3-dietylamino-propoxy)-3-pyridínkarboximidoyl chlorid hydrochlorid +++
O-(3-piperidíno-l-propyl)-3-nitrobenzhydroximoyl chlorid hydrochlorid -H-+
1 - {[3-t-butylamino)-2-hydroxy-propoxy]-imino} -1 -(m-trifluórmetylfenyl)-etán acetát -H-+
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-benzyluretán N'-[2-hydroxy-3-( 1 -metyl-1 -piperidínium-1 -yl)propoxy]-N-metyl-pyridinium-3-karboximidoyl chlorid dijodid N-hexyl-N'-[3-(l-piperidinyl)propoxyJ-močovina 0
+++ ++
N-cyklohexyl-N'-[2-acetoxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-močovina hydrochlorid 0
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl)propoxy]-2-nitro-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid 4—H-
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-chinolín-karboximidamid dihydrochlorid +++
N-[2-hydroxy-3 -(1 -piperidinyljpropoxy]- -N,N'-difenylbenzamidín N,N-dimetyl-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-fenylguanidín 0
0
N,N-dimetyl-N'-fenyl-N[3-( 1 -piperidi-
nyl)propoxy]-guanidín hydrochlorid
N-metyl-N-[3-( 1 -piperidinyljpropoxyl-
-benzamid hydrochlorid 5,6-dihydro-3-(4-chlórfenyl)-5-[N-metyl-
-1 -piperidinium-1 -yl]-metyl-4H-1,2,4-oxadiazin jodid Metyl- {N-[3-(1 -piperidinyljpropoxy]} -3-pyridínkarboximidát maleát ++ 0
N-metyl-N-[3-(l -piperidinyljpropoxy]-
-(m-trifluórmetylbenzamid hydrochlorid N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-tetrame-
tylén-3-pyridínkarboxamidín hydrochlorid +++
N-[3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-N-metyl-N'-(n-hexyl)- močovina 0
Tabuľka 3
Stimulačný účinok hydroxylamínových derivátov podľa vynálezu na tepelným šokom indukovanú produkciu hsp72 v 3T3 bunkách, ak pôsobenie predchádza vystaveniu
tepelnému šoku.
hladina hsp72
relatívne ku
Zlúčeniny kontrole vystavenej
stresu
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát 0
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl)propoxy]-2-nitro-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid 0
hladina hsp72 relatívne ku
Zlúčeniny kontrole vystavenej ______________________________________________________stresu
5,6-Dihydro-5-(l -piperidinyl)metyl-3-(3- θ
-pyridyl)-4H-1,2,4-oxadiazín
O-(3 -piperidíno-1 -propyl)-3-nitrobenzhydroximoyl chlorid hydrochlorid N-[2-palmitoyloxy-3-( 1 -piperidinyljpropoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohy- + drochlorid
N-hexyl-N'- [3 -(1 -piperidinyljpropoxy]-močovina
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]naftalén-1 -karboxamid
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]4-pyridínkarboximidoyl chlorid (Z)-2-bu-++ téndionát(l : 1)
N'-[2-hydroxy-3-(l-metyl-l-piperidínium-1 -yl)propoxy]-N-metyl-pyridínium-+++
-3-karboximidoyl chlorid dijodid N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-chinolin-karboximidamid dihydrochlo- +++ rtd
V tejto tabuľke znamená 0, že pôsobenie sa zmenilo o ±20 % stresom indukovanú hladinu hsp72, zatiaľ čo +, ++ resp. +++ znamenajú 21 - 50 %, 51 - 100 %, resp. >100 zvýšenie relatívne ku hladine kontroly vystavenej šoku.
Pokusy s použitím tepelného šoku na U-937 leukemických a L-929 myšacích fibroblastových bunkách sa uskutočňovali podobne, ako je opísané, ale pôsobeniu zlúčeniny vždy predchádzal tepelný šok. Zlúčenina N-[2-hydroxy-31 -piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát bola za týchto experimentálnych podmienok testovaná v 10’5 koncentrácii. Pôsobenie viedlo k viac než 50 % zvýšeniu tepelným stresom indukovanej hladiny hsp72.
Pokusy so stresom indukovaným chemickým činidlom
Tieto pokusy sa uskutočňovali na ľudských epitelových bunkách HeLa a na ľudských leukemických bunkách U-937 s použitím HgCl2 na indukciu stresovej reakcie. Pôsobenie zlúčením prebehlo pred vystavením buniek stresu. Testované kultúry boli pripravené a pôsobenie prebiehalo ako v experimentoch s 3T3 bunkami. Po pôsobení zlúčením boli bunky inkubované 15 minút pri 37 °C, potom všetky kultúry okrem dvoch (kontroly bez stresu) boli vystavené 0,5 μΐ/ml koncentrácii HgCl2 a inkubácia pokračovala. Indukované množstvo hsp72 sa meralo 6 hodín po vystavení stresu. Použitá koncentrácia HgCl2 viedla k 15 - 30 % maximálnej hladine hsp72.
Na HeLa bunkách zvyšovali N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-nitrobenzimidoyl chlorid monohydrochlorid a N-[2-hydroxy-3-piperidinyl)propoxy]-3-nitrobenzimidoyl chlorid monohydrochlorid stresom indukovanú hladinu hsp72 o viac než 20 %, resp. 50 %.
Na U-937 bunkách zvyšoval N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát stresom indukovanú hladinu hsp72 o viac než 20 % v porovnaní s kontrolou vystavenou stresu.
Pokusy na primárnych tkanivových explantátoch
Tieto pokusy boli uskutočnené na potkaních explantátoch sleziny a varlát s aplikáciou tepelného stresu po pôsobení experimentálnych zlúčenín. Pokusy na suspenziách zo sleziny sa uskutočnili nasledovne:
Sleziny CFY potkanov vážiacich 200 g boli aseptický vybrané a homogenizované v MEM kultivačnom médiu obsahujúcom 10 % fetálneho teľacieho séra. Koncentrácia bunkovej suspenzie bola nastavená na 50 - lOOmg/ml.
Po 5 ml bunkovej suspenzie bolo nanesené na jednotlivé kultivačné misky s priemerom 6 cm a explantáty boli jednu hodinu vo zvlhčovanom vzduchu obsahujúcom 5 % CO2, pri 37 °C, potom sa na kultúry pôsobilo 10’5M koncentráciou testovanej zlúčeniny. Po ďalších 15 minútach pri 37 °C boli kultúry vystavené tepelnému šoku pri 43 °C po 30 minútach v inkubátore. Množstvo indukovaného hsp72 bolo merané po ďalších 6 hodinách inkubácie pri 37 °C.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 4 a zvýšené hladiny hsp72 sú hodnotené v rovnakom rozsahu ako v tabuľkách 2 a3.
Tabuľka 4
Stimulačný účinok hydroxylamínových derivátov podľa vynálezu na tepelným šokom indukovanú expresiu hsp72 v explantátoch potkanej sleziny +
±±+ +++ hladina hsp72 relatívne ku Zlúčeniny kontrole vystavenej __________________________________ šoku N- {3 - [ 1,1 -diemetyl-etyl)amino] -2-hydroxypropoxy) -3-trifluórmetylbenzamid N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxyj-N'-heptylmočovina N-(3-chlórfenyl)-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]močovina
5.6- dihydro-5-(l-piperidinyl)metyl-3-(3-pyridyl)-4H-1,2,4-oxadiazín
Pokusy na potkaních testikulámych explantátoch sa uskutočnili nasledovne:
Varlatá CFY potkanov vážiacich 200 g boli vybrané za sterilných podmienok a uvoľnené testikuláme tubule boli suspendované v MEM kultivačnom médiu obsahujúcom 10 % fetálneho teľacieho séra tak, že 5 ml suspenzie obsahovalo 50- 100 mg tkaniva.
Explantáty boli inkubované jednu hodinu vo zvlhčovanom vzduchu obsahujúcom 5 % CO2, pri 37 °C, potom sa na kultúry pôsobilo 10 M koncentráciou testovanej zlúčeniny. Po ďalších 15 minútach pri 37 °C boli kultúry vystavené tepelnému šoku pri 43 °C po 30 minútach v inkubátore. Množstvo indukovaného hsp72 bolo merané po ďalších 6 hodinách inkubácie pri 37 °C.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 5 a zvýšenie hladiny hsp72 sú hodnotené v rovnakom rozsahu ako v tabuľke 4.
Tabuľka 5
Stimulačný účinok hydroxylamínových derivátov podľa vynálezu na tepelným šokom indukovanú expresiu hsp72 v potkaních testikulámych explantátoch hladina hsp72 relatívne ku Zlúčeniny kontrole vystavenej ____________________________________________šoku_____ N-[2-hydroxy-3-(l -piperidinyl)-propoxy]- +++
-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleát
5.6- dihydro-5-(l -piperidinyl)metyl-3-(3- ++
-pyridyl)-4H-1,2,4-oxadiazín hladina hsp72 relatívne ku
Zlúčeniny
N-[2-hydroxy-3 -(1 -piperidinyl)-propoxy] -benzimidoyl chlorid monohydrochlorid N- {3-[ 1,1 -diemetyl-etyl)amino]-2-hydroxypropoxy} -3-trifluórmetylbenzamid N-[2-benzyloxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy] -3 -pyridínkarboximidoyl (Z)-2-buténdionát(l : 1) 3-(3-pyridyl)-5-dietylaminometyl-5,6-dihydro-6H-1,4,2-dioxazín hydrochlorid N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-4-acetamido-benzamidín monohydrochlorid
-fenyl-5-[( 1 -piperidinyl)metyl]-5,6-dihydro-6H-1,4,2-dioxazín N-[2-palmitoyloxy-3-(l-piperidiyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidamid monohydrochlorid
N-hexyl-N'-[3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-močovina
N-(3 -piperidíno-1 -propoxy)-3-pyridínkarboximidoyl chlorid dihydrochlorid 0-(3-dietylamino-propoxy)-3-pyridínkarboximidoyl chlorid hydrochlorid O-(3-piperidíno-1 -propyl)-3-nitrobenzhydroximoyl chlorid hydrochlorid
- {[3-t-butylamino)-2-hydroxy-propoxy]-imino} -1 -(m-trifluórmetylfenyl)-etán acetát
N- {3-[l, 1 -diemetyl-etyl)amino]-2-hydroxypropoxy}-3-trifluórmetyl-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid N-[2-palmitoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid dihydrochlorid
N-hexyl-N'-[3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-močovina
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-3-nitro-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-2-nitro-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-heptylmočovina
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]1 -izochinolin-karboximidamid dihydrochlorid
N-metyl-N-[3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-benzamid hydrochlorid
5,6-dihydro-3-(4-chlórfenyl)-5-[N-metyl-1 -piperidínium-1 -yl] -metyl-4H-1,2,4-oxadiazín jodid
N-[3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-tiofen-2karboximidoyl chlorid hydrochlorid kontrole vystavenej šoku +++ ++ ++ o
o ++ ++ o
++ +
+ +++ o
+ ++ +++ +++ +
+ ++
Príklad 20
Meranie hladiny hsp mRNA v hrudnej aorte potkanov s genetickou hypertenziou
Potkany s genetickou hypertenziou boli rozdelené do štyroch skupín po štyroch. Na skupiny sa pôsobilo denne, orálne, v prvej skupine fyziologickým soľným roztokom, v druhej skupine N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3
-yridínkarboximidoyl chlorid maleátom (20 mg/kg) 5 dní, v tretej skupine N-[2-hydroxy-3-piperidinyl)-benzimidoyl chlorid monohydrochloridom (5 mg/kg) 20 dní a v štvrtej skupine N-[2-hydroxy-3 -(1 -piperidinyl)propoxy] -2-tiofén-karboximidoyl chlorid monohydrochloridom (5 mg/kg) 20 dní. Zvieratá boli usmrtené, aorty boli izolované a okamžite zamrazené a skladované do použitia pri -70 °C.
Morfologické skúmanie hrudnej aorty
Skúmanie sa uskutočnilo podľa publikovaných metód (Br. J. Pharmacol. 1995: 115, 514 - 520). Bola vyrezaná 1 mm2 plocha hrudnej aorty a fixovaná v 2,5 % glutaraldehyde pri izbovej teplote. Postfíxácia sa uskutočnila v 1 % oxide osmičelom jednu hodinu. Tkanivo bolo dehydrované v etanole a zapolymerizované do Durcupanu ACM. Snímky boli urobené elektrónovým mikroskopom Hitachi 7100 a kvantitatívne vyhodnotené.
Bolo pozorované, že pôsobenie N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu, N-[2-hydroxy-3-piperidinyl)-benzimidoyl chlorid monohydrochloridu, resp. N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-tiofén-karboximidoyl chlorid monohydrochloridu podporilo regeneráciu buniek aorty priemerným, resp. silným spôsobom.
Kvantitatívne meranie hsp70
Pokusy sa uskutočňovali kvantitatívnou reverznou transkripčnou polymerickou reťazovou reakciou. Princípom metódy je, že ak sa dva veľmi podobné, ale rozlíšiteľné templáty amplifikujú v rovnakej PCR reakcii, potom sa v tomto procese nemení pomer ich produktov. Keď je známe množstvo jedného z templátov a relatívny pomer produktov je merateľný, potom možno vypočítať množstvo neznámeho počiatočného templátu. V najčastejšej používanej metóde sa známy templát (kompetitor) a neznámy templát (cieľ) líši len v dĺžke, kompetitor je kratší, a v dôsledku toho sú produkty PCR separovateľné na základe svojich veľkostí.
RNA bola z tkanív izolovaná guanidínizokyanátovou metódou (Choczynski P. a Sacci N., Anál. Biochem. 162: 156, 1987). Koncentrácia a kvalita nukleovej kyseliny bola hodnotená spektrofotometrom a agarózovou gélovou elektroforézou za denaturujúcich podmienok (Sambrook J. et al.,: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Izolovaná RNA bola skladovaná pri -70 °C.
Bol vytvorený fragment z cDNA kódujúci hsp70 gén pomocou vystrihnutia internej sekvencie (PCR-slicing, Riedy M. C. et al., Biotechniques 18: 70 1995). Tento fragment bol amplifikovaný s prímermi špecificky sa viažucimi k externej časti vytvorenia (Erlich A.: PCR Technology, Priciples and Applications for DNA Aplification. Stockton Press, 1989) a po zmeraní koncentrácie bol produkt skladovaný pri -70 °C.
Reverzná transkripcia sa uskutočnila pri štandardných podmienkach s použitím 1 μg izolovanej RNA (vzorka s oligo dT (dTl6) prímerom (Sambrook J. et al., ako skôr).
Rovnaké množstvo cDNA, pripravených z RNA vzoriek, bolo zmiešané s rôznymi množstvami kompetítora (odvodenými zo sériových riedení 3- a 10-krát) a templáty bolo aplifikované polymerickou reťazovou reakciou. Teploty aplikované počas cyklu boli nasledujúce: denaturácia (95 °C, 1 min.) hybridizácia (58 °C, 1 min.), syntéza (72 °C, 0,5 min.).
Po PCR amplifíkácii boli produkty rozdelené na agarózovom géli (1 %) a vyfarbené etídiumbromidom za štandardných podmienok (Sambrook J. et al., ako skôr). Vyfarbené DNA fragmenty boli vizualizované UV-transilumi41 nátorom na fotografiu. Množstvo PCR produktov bolo merané denzitometriou z negatívov fotografií.
Bolo pozorované, že hladina hsp70 v hrudnej aorte bola po pôsobení N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu, N-[2-hydroxy-3-piperidi-nyl)-benzimidoyl chlorid monohydrochloridu a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-tiofénkarboximidoyl chlorid monohydrochloridu o viac než 50 % vyššia než hsp70 u kontrolných zvierat.
Príklad 21
Sledovanie inhibitívneho účinku na starnutie kože morčiat
Inhibitívny účinok zlúčenín podľa vynálezu na starnutie kože bol sledovaný u morčiat. Koža piatich zvierat v skupine bola depilovaná a plochy 1 cm2 bolo ožiarené zo zdroja UV-B s intenzitou 100 mJ/cm2 na oboch stranách. Po ožiarení sa na koži na jednej strane pôsobilo krémom zloženým podľa príkladu 10 a obsahujúcim 5 hmotn. % N-[2-hydroxy-3 -(1 -piperidinyl)-propoxy]-3 -pyridínkarboximidoyl chlorid maleátu, N-[2-hydroxy-3-piperidinyl)-benzimidoyl chlorid monohydrochloridu alebo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyľ)propoxy]-2-tiofén-karboxirmdoyl chlorid monohydrochloridu, zatiaľ čo na druhú stranu zvierat sa pôsobilo rovnakým krémom bez aktívnej zložky. Bol to experiment so „samokontrolou“.
Pôsobenie začalo okamžite po ožiarení a uskutočňovalo sa dvakrát denne dva týždne.
Ožiarenie UV-B malo za následky ťažké poškodenia kože (pľuzgiere, poškodenia epitelu, tvorbu rán), ktoré sa hojili o 4 dni skôr a pri ktorých bola veľkosť rán významne menšia, ak sa na zvieratá pôsobilo zlúčeninami podľa vynálezu. Tieto zlúčeniny podporovali tvorbu epitelu.
Tento pokus ukazuje, že dané pôsobenie zvýšilo rezistenciu proti ožiareniu UV-B a zlepšilo jej regeneráciu.
t í
Y4 ~(CHt)u_c—(CHj
YS
-(CH,)k-CH-(CHPm—
OH
NR* R* (<)
N-OH
HNRsRe (*) (e) hnr'r* (5)

Claims (63)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    H2n-o-R (θ)
    A-O
    C(OQ\ (Ό (β) (O
    1. Použitie chemickej zlúčeniny na prípravu farmaceutického prostriedku na zvýšenie expresie molekulových chaperónov exprimovaných bunkou, ktorá je vystavená fyziologickému stresu na zvýšenie expresie molekulového chaperónu v bunke nad množstvo vyvolané daným fyziologickým stresom, pričom chemickou zlúčeninou je hydroxylamínový derivát, ktorého tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II) alebo jeho soľ, a/alebo akýkoľvek jeho opticky aktívny stereoizomér, (Ú kde
    A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti, aryl, substituovaný aryl, heteroaryl alebo substituovaný heteroaryl,
    Z je kovalentná väzba, kyslík alebo =NR3, kde R3 je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu a aralkylu substituovaného v arylovej a/alebo alkylovej časti,
    R je alkyl alebo substituovaný alkyl,
    X v tautomére všeobecného vzorca (I) je halogén alebo substituovaný hydroxyl alebo amín, monosubstituovaný amín alebo disubstituovaný amín, a
    X v tautomére všeobecného vzorca (II) je kyslík, imín alebo substituovaný imín, a
    R' je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl majúci substituovanú arylovú alebo alkylovú časť, a acyl alebo substituovaný acyl, a zlúčeniny všeobecného vzorca (I) prípadne obsahujú intramolekulové kruhové štruktúry vytvorené spojením X a reaktívneho substituenta.
  2. 2. Použitie podľa nároku 1, v ktorom sa na bunku pôsobí pred fyziologickým stresom.
  3. 3. Použitie podľa nároku 1, v ktorom sa na bunku pôsobí po fyziologickom strese.
  4. 4. Použitie chemickej zlúčeniny na prípravu farmaceutického prostriedku na zvýšenie aktivity molekulového chaperónu v eukaryotickej bunke, ktorá je vystavená fyziologickému stresu na zvýšenie aktivity molekulového chaperónu v bunke nad množstvo vyvolané daným fyziologickým stresom, pričom chemickou zlúčeninou je hydroxylaminový derivát, ktorého tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II) alebo jeho soľ, a/alebo akýkoľvek jeho opticky aktívny stereoizomér, x
    ω (») kde
    A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti, aryl, substituovaný aryl, heteroaryl alebo substituovaný heteroaryl,
    Z je kovalentná väzba, kyslík alebo =NR3, kde R3 je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu a aralkylu substituovaného v arylovej a/alebo alkylovej časti,
    R je alkyl alebo substituovaný alkyl,
    X v tautomére všeobecného vzorca (I) je halogén alebo substituovaný hydroxyl alebo amín, monosubstituovaný amín alebo disubstituovaný amín, a
    X v tautomére všeobecného vzorca (II) je kyslík, imín alebo substituovaný imín, a
    R' je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl majúci substituovanú arylovú alebo alkylovú časť, a acyl alebo substituovaný acyl, a zlúčeniny všeobecného vzorca (I) prípadne obsahujú intramolekulové kruhové štruktúry vytvorené spojením X a reaktívneho substituenta.
  5. 5. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, v ktorom eukaryotícká bunka vystavená stresu je bunka cicavca.
  6. 6. Použitie podľa nároku 5, v ktorom bunka cicavca je ľudská bunka.
  7. 7. Použitie podľa nároku 5 alebo 6, v ktorom bunka je jednou z buniek živého organizmu.
  8. 8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, v ktorom bunkou je nervová bunka, svalová bunka, bunka cievnej steny, najmä endotelová, epitelová bunka alebo bunka imunitného systému.
  9. 9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, v ktorom eukaryotickou bunkou vystavenou stresu je rastlinná bunka.
  10. 10. Použitie podľa nároku 9, v ktorom rastlinná bunka je jednou z buniek živého rastlinného organizmu.
  11. 11. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, v ktorom fyziologický stres je metabolický, oxidatívny alebo lokálny mechanický stres alebo stres spôsobený hypoxiou, ischémiou, tepelným šokom, žiarením alebo toxickou látkou.
  12. 12. Použitie podľa nároku 11, v ktorom stres je spôsobený diabetes mellitus.
  13. 13. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, v ktorom fyziologický stres spôsobuje zvýšenie reaktívnych voľných radikálov alebo cytokínov prítomných v oblasti obklopujúcej bunku.
  14. 14. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, v ktorom fyziologický stres vedie k výskytu kardiovaskulárnych, vaskulárnych, mozgových, alergických, imunitných, autoimúnnych ochorení, chorôb vírusového alebo bakteriálneho pôvodu, nádorových ochorení, chorôb kože a/alebo sliznice, alebo chorôb epitelu obličkových kanálikov alebo stavov, ktoré môžu byť liečené kozmetickou intervenciou.
  15. 15. Použitie podľa nároku 14, v ktorom kardiovaskulárne ochorenie je spôsobené aterosklerózou, koronárnymi ochoreniami, hypertóniou alebo pulmonámou hypertóniou vyvolanými fyziologickým stresom.
  16. 16. Použitie podľa nároku 14, v ktorom mozgové ochorenie je vyvolané cerebrovaskulámou ischémiou, mŕtvicou, traumatickým poranením hlavy, senilnými degeneratívnymi ochoreniami, najmä senilnou demenciou, AIDS demenciou, alkoholovou demenciou, Alzheimerovou chorobou, Parkinsonovou chorobou alebo epilepsiou vyvolanými fyziologickým stresom.
  17. 17. Použitie podľa nároku 14, v ktorom ochorenie kože a/alebo sliznice je spôsobené dermatózou alebo ulcerálnym ochorením gastrointestinálneho systému, vyvolanými fyziologickým stresom.
  18. 18. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 17, v ktorom molekulový chaperón je proteínom tepelného šoku (hsp).
  19. 19. Použitie podľa nároku 18, v ktorom hsp je hsp70 alebo hsp72.
  20. 20. Použitie chemickej zlúčeniny na prípravu farmaceutického prostriedku alebo prípadne kozmetického prostriedku na liečenie choroby spojenej s funkciou chaperônového systému alebo spojenej s poškodením bunkovej membrány alebo membrány bunkovej organely, alebo na jej prevenciu, pričom chemickou zlúčeninou je hydroxylamínový derivát, ktorého tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (1) a (II) alebo jeho soľ, a/alebo akýkoľvek jeho opticky aktívny stereoizomér, (l) (») kde
    A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti, aryl, substituovaný aryl, heteroaryl alebo substituovaný heteroaryl,
    Zje kovalentná väzba, kyslík alebo -NR3, kde R3 je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z vodíka, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu a aralkylu substituovaného v arylovej a/alebo alkylovej časti,
    R je alkyl alebo substituovaný alkyl,
    X v tautomére všeobecného vzorca (I) je halogén alebo substituovaný hydroxyl alebo amín, monosubstituovaný amín alebo disubstituovaný amín, a
    X v tautomére všeobecného vzorca (II) je kyslík, imín alebo substituovaný imín, a
    R1 je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl majúci substituovanú arylovú a/alebo alkylovú časť, acyl alebo substituovaný acyl, a zlúčeniny všeobecného vzorca (I) prípadne obsahujú intramolekulové kruhové štruktúry vytvorené spojením X a reaktívneho substituenta.
  21. 21. Použitie podľa nároku 20, v ktorom patologický stav je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z ischémie, nádorového ochorenia, infekcie spôsobenej patogénnym mikroorganizmom, autoimúnneho ochorenia a dermatózy.
  22. 22. Použitie podľa nároku 20 na prípravu farmaceutického prostriedku na ochranu myokardu, mozgového tkaniva a obličiek pred poškodením a/alebo nekrózou spôsobenými ischémiou, v ktorom chemickou zlúčeninou je hydroxylamínový derivát, ktorého tautoméme formy sú predstavované všeobecnými vzorcami (I) a (II), alebo jeho soľ a/alebo ktorýkoľvek jeho opticky aktívny stereoizomér, kde A, Z, R, R' a X sú definované v nároku 20.
  23. 23. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 22 na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na aplikáciu u ľudí.
  24. 24. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 23, v ktorom choroba je mozgovou, alergickou, imunitnou a/alebo autoimúnnou chorobou, chorobou spôsobenou vírusovými alebo bakteriálnymi infekciami, chorobami kože a/alebo sliznice, ako aj chorobou epitelu obličkových kanálikov.
  25. 25. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 a nároku 24, v ktorom sa použijú hydroxylamíny všeobecného vzorca (I), v ktorom
    R je alkyl alebo substituovaný alkyl a
    a) Z je kovalentná väzba a X je halogén;
    b) Z je kovalentná väzba a X je substituovaná hydroxyskupina -OQ, v ktorej Q jc uhľovodík, a prípadne má zlúčenina intramolekulový kruh vytvorený spojením X a reaktívneho substituenta z R;
    c) Z je kovalentná väzba a X je -NR’R2, v ktorom R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, cykloal
    SK 284823 Β6 kyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom, na ktorý sú naviazané, tvoria nasýtený kruh obsahujúci 3 až 7 členov a prípadne zlúčenina má intramolekulový kruh vytvorený spojením X a reaktívneho substituenta z R;
    d) Z je kyslík a X je substituovaná hydroxyskupina -OQ, v ktorej Q je uhľovodíková skupina;
    e) Z je kyslík a X je -NR’R2, v ktorom R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, cykloalkyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom, na ktorý sú naviazané, tvoria nasýtený kruh obsahujúci 3 až 7 členov;
    f) Z je =NR3, v ktorom R3 je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl majúci substituovanú arylovú alebo alkylovú časť, a X jeNR’R2, v ktorom R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, cykloalkyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom, na ktorý sú naviazané, tvoria nasýtený kruh obsahujúci 3 až 7 členov.
  26. 26. Použitie podľa nároku 25, v ktorom R je ω-aminoalkyl, prípadne substituovaný na amino a/alebo alkylovej skupine a alkylový reťazec, ktorý obsahuje prednostne 3 až 8 atómov uhlíka, je priamy alebo rozvetvený, môže byť substituovaný hydroxylom alebo acyloxylom.
  27. 27. Použitie podľa nároku 25 alebo 26, v ktorom R je ω-aminoalkyl mono- alebo disubstituovaný na amino časti, pričom substituenty na amino časti sú nezávisle od seba jeden alebo dva priame alebo rozvetvené alkyly alebo cykloalkyly, alebo dva substituenty na amino časti spoločne s dusíkom, na ktorý sú naviazané tvoria 3 až 7 členný, prednostne 5 až 7 členný nasýtený heterocyklický kruh, ktorý môže obsahovať ďalší (ďalšie) heteroatóm (atómy).
  28. 28. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27, v ktorom Z je chemická väzba a X je halogén, prednostne chlór alebo bróm a A je aralkyl, aralkyl substituovaný v arylovej časti a/alebo alkylovej časti, aryl, substituovaný aryl alebo heteroaryl.
  29. 29. Použitie podľa nároku 28, v ktorom A je nesubstituovaný alebo substituovaný fenylalkyl, ktorý má jeden alebo viac substituentov, výhodne alkoxyl, fenyl, fenyl substituovaný s halogénom, alkylom, alkoxylom alebo halogénaklylom alebo nitroskupinou, naftyl alebo heteroaryl s obsahom dusíka, ktorý môže byť kondenzovaný s benzénovým kruhom, prednostne pyridyl, alebo heteroaryl s obsahom síry alebo kyslíka.
  30. 30. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27, v ktorom Z je chemická väzba a X je substituovaný hydroxyl všeobecného vzorca -OQ, v ktorom Q nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti a A je heteroaryl, prednostne heteroaryl s obsahom dusíka.
  31. 31. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 23 a nároku 24, v ktorom má hydroxylamínový derivát všeobecný vzorec (ľ), v ktorom
    R je alkyl alebo substituovaný alkyl, a
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný aryl alebo heteroaryl.
  32. 32. Použitie podľa nároku 31, v ktorom R je ω-aminoalkyl, ktorý môže byť substituovaný na amino a/alebo alkylovom reťazci a alkylový reťazec má prednostne 1 až 5 atómov uhlíka.
  33. 33. Použitie podľa nároku 31 alebo 32, v ktorom R je ω-aminoalkyl mono- alebo disubstituovaný na amino časti, pričom substituenty na amino časti sú navzájom nezávisle jeden alebo dva priame alebo rozvetvené alkyly alebo cykloalkyly, alebo dva substituenty na amino časti spoločne s dusíkom, na ktorý sú naviazané, tvoria 3 až 7 členný, prednostne 5 až 7 členný nasýtený heterocyklický kruh, ktorý môže obsahovať ďalší (ďalšie) heteroatóm (atómy).
  34. 34. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27, v ktorom
    Zje chemická väzba;
    X je -NR'R2, v ktorom R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, cykloalkyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom, na ktorý sú naviazané, tvoria 3- až 7-členný kruh, prednostne 5 až 7-členný nasýtený kruh, a
    A je aralkyl, aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl alebo heteroaryl.
  35. 35. Použitie podľa nároku 34, v ktorom A je fenylalkyl, fenylalkyl, ktorý má jeden alebo viac substituentov, prednostne alkoxyl na fenylovej časti, fenyl, fenyl substituovaný jedným alebo viacerými alkylmi, halogénmi, halogénalkylmi, nitroskupinami alebo acylaminoskupinami, naftyl alebo heteroaryl s obsahom dusíka, ktorý môže byť kondenzovaný s benzénovým kruhom, prednostne pyridyl, alebo heteroaryl s obsahom síry alebo kyslíka.
  36. 36. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 23 a nároku 24, v ktorom má hydroxylamínový derivát všeobecný vzorec (I), v ktorom
    R je alkyl alebo substituovaný alkyl, a
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný aryl alebo heteroaryl,
    R1 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, cykloalkyl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na alkylovej a/alebo arylovej časti.
  37. 37. Použitie podľa nároku 36, v ktorom R je ω-aminoalkyl, ktorý môže byť substituovaný na amino a/alebo alkylovom reťazci a alkylový reťazec má prednostne 1 až 5 atómov uhlíka.
  38. 38. Použitie podľa nároku 36 alebo 37, v ktorom R je ω-aminoalkyl mono- alebo disubstituovaný na amino časti, pričom substituenty na amino časti sú nezávisle od seba jeden alebo dva priame alebo rozvetvené alkyly alebo cykloalkyly, alebo dva substituenty na amino časti spoločne s dusíkom, na ktorý sú naviazané, tvoria 3 až 7 členný, prednostne 5 až 7 členný nasýtený heterocyklický kruh, ktorý môže obsahovať ďalší (ďalšie) heteroatóm (atómy).
  39. 39. Použitie podľa nároku 34, v ktorom A je fenyl, fenyl substituovaný jedným alebo viacerými alkylmi, halogénmi, alkoxylmi, halogénalkylmi alebo nitroskupinami, naftyl alebo heteroaryl s obsahom dusíka, ktorý môže byť kondenzovaný s benzénovým kruhom, alebo heteroaryl s obsahom síry alebo kyslíka.
  40. 40. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27, v ktorom
    Zje kyslík;
    X je -OQ, v ktorom Q je nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne CM alkyl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti,
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti.
  41. 41. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27, v ktorom
    Zje kyslík;
    X je -NRlR2, v ktorom R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, cykloalkyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom, na ktorý sú naviazané, tvoria nasýtený 3- až 7-členný kruh, prednostne 5- až 7-členný nasýtený kruh, a
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti.
  42. 42. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 25 až 27, v ktorom
    Zje =NR3, v ktorom R3 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, a
    X je-NR'R2, v ktorom R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, cykloalkyl, alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl, alebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atómom, na ktorý sú naviazané, tvoria 3- až 7-členný kruh, prednostne 5- až 7-členný nasýtený kruh, a
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti.
  43. 43. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 23 alebo nároku 24, v ktorom hydroxylamínový derivát má všeobecný vzorec (II), v ktorom
    R je alkyl alebo substituovaný alkyl a
    a) Z je chemická väzba a X je kyslík, alebo
    b) Z je chemická väzba a X je =NR4, pričom R4 je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl alebo cykloalkyl,
    c) Z je kyslík a X je kyslík,
    d) Z je kyslík a X je =NR4, pričom R4 je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, aralkyl alebo aryl; alebo heteroaryl;
    e) Z je =NR3, pričom R3 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, aryl alebo aralkyl, a X je kyslík,
    f) Z je =NR3, pričom R3 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, aryl alebo aralkyl, a X jc =NR4, pričom R4 je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl alebo aralkyl alebo cykloalkyl.
  44. 44. Použitie podľa nároku 43, v ktorom R je ω-aminoalkyl, prípadne substituovaný na amino a/alebo alkylovom reťazci a alkylový reťazec, ktorý obsahuje prednostne 3 až 8 atómov uhlíka, je priamy alebo rozvetvený, môže byť substituovaný hydroxylom alebo acyloxylom.
  45. 45. Použitie podľa nároku 43 alebo 44, v ktorom R je ω-aminoalkyl mono- alebo disubstituovaný na amino časti, pričom substituenty na amino časti sú nezávisle od seba jeden alebo dva priame alebo rozvetvené alkyly alebo cykloalkyly, alebo dva substituenty na amino časti spoločne s dusíkom, na ktorý sú naviazané, tvoria 3- až 7-člcnný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklický kruh, ktorý môže obsahovať ďalší (ďalšie) heteroatóm (atómy).
  46. 46. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 45, v ktorom
    Zje chemická väzba,
    X je kyslík, a
    R' je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, a
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný aryl alebo aralkyl, alebo heteroaryl.
  47. 47. Použitie podľa nároku 46, v ktorom A je fenyl, fenyl substituovaný s jedným alebo viacerými alkylmi, halogénalkylmi alebo alkoxylmi, aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti alebo heteroaryl s obsahom dusíka alebo síry.
  48. 48. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 45, v ktorom
    Zje chemická väzba,
    X je =NR4, pričom R4 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl, aralkyl, alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, alebo cykloalkyl, a
    R' je nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, a
    A je aralkyl, aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl alebo heteroaryl.
  49. 49. Použitie podľa nároku 48, v ktorom A je fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný s jedným alebo viacerými alkoxylmi na fenylovej časti, fenyl, fenyl substituovaný jedným alebo viacerými alkylmi, halogénalkylmi alebo nitroskupinami, naftyl alebo heteroaryl s obsahom dusíka, prednostne pyridyl, alebo hetearyl s obsahom síry.
  50. 50. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 45, v ktorom Z je kyslík, X je kyslík, R1 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, a
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti.
  51. 51. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 45, v ktorom Z je kyslík, X je =NR4, pričom R4 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, aralkyl, alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl, alebo nesubstituovaný alebo substituovaný heteroaryl, a
    R'je nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti.
  52. 52. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 45, v ktorom Z je =NR3, v ktorom R3 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti, X je kyslík a R' je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, alebo acyl a A je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, aralkyl, aryl alebo cykloalkyl.
  53. 53. Použitie podľa nároku 52, v ktorom A je nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, ktorý obsahuje prednostne 4 až 12 atómov uhlíka, cykloalkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný fenylalkyl, fenyl, fenyl substituovaný jedným alebo viacerými halogénmi, alkylmi, halogénalkylmi, alkoxylmi alebo nitroskupinami, alebo heterocyklická skupina obsahujúca dusík.
  54. 54. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 45, v ktorom
    Zje =NR3, v ktorom R3 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný v arylovej a/alebo alkylovej časti,
    X je =NR4, pričom R4 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl, aralkyl, alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, alebo cykloalkyl, prednostne vodík alebo alkyl, a
    R' nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, aralkyl alebo aralkyl substituovaný na arylovej a/alebo alkylovej časti, a
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl alebo substituovaný fenyl.
  55. 55. Zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom
    X (I)
    a) X je halogén, prednostne chlór alebo bróm, Z je chemická väzba a al) A je skupina vzorca (a), v ktorom Y1 je halogén, alkoxyl, halogénalkyl alebo nitroskupina a n je 1,2 alebo 3 alebo heteroaryl s obsahom kyslíka, prednostne furyl, heteroaryl obsahujúci síru, prednostne tienyl alebo heteroaromatická skupina obsahujúca dusík, ktorá môže byť kondenzovaná s benzénovým kruhom, alebo kvartémy derivát N-C|_4 alkylu alebo jeho N-oxid, prednostne pyridyl, chinolyl alebo izochinolyl,
    R je skupina všeobecného vzorca (b), v ktorom R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne CM alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heteorcyklický kruh, Y6 je -OR7, kde R7 je vodík alebo acyl, prednostne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl, arylkarbonyl alebo aminoacyl, k je 1, 2 a 3, a m je 1,2 alebo 3, alebo kvartémy derivát N-C14 alkylu alebo jeho N-oxid, za predpokladu, že keď A je pyridyl alebo naftyl, alebo skupina vzorca (a), v ktorej Y1 je halogén alebo alkoxy, R7 je iné ako vodík, alebo a2) A je skupina všeobecného vzorca (c),
    R je skupina všeobecného vzorca (d) a prípadné substituenty Y2 a Y3, z ktorých aspoň jeden musí byť prítomný v molekule, sú kyslík alebo Cw alkyl, k je 1,2 alebo 3 a m je 1, 2 alebo 3 a keď zlúčenina je mono- alebo divalentný katión, anión je jeden alebo dva halogenidové ióny, prednostne jodid, alebo
    b) X je -NR1 R2, kde R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, alebo R1 alebo R2 spoločne s atómom dusíka, ku ktorému sú naviazané, tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5až 7-členný nasýtený heteorcyklický kruh, ktorý môže obsahovať jeden alebo viac ďalší (ďalšie) heteroatóm(y),
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl,
    Z je kyslík alebo =NR3,kde R3 je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, a
    R je skupina všeobecného vzorca (b), v ktorom R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne C14 alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané, tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heteorcyklický kruh, Y6 je -OR7, kde R7 je vodík alebo acyl, prednostne nesubstitu ovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo arylkarbonyl, kje 1,2 a3, amje 1,2 alebo 3, alebo
    c) X je -OQ, v ktorom Q je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl alebo aralkyl,
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl alebo aralkyl,
    Zje kyslík, a
    R je skupina všeobecného vzorca (b), v ktorom R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne CM alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané, tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heteorcyklický kruh, Y6 je -OR7, kde R7 je vodík alebo acyl, prednostne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo arylkarbonyl, kje 1, 2 a3, amje 1,2 alebo 3,
    d) A je nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl alebo heteroaromatická skupina s obsahom dusíka, prednostne pyridyl alebo heteroaromatická skupina s obsahom síry,
    Zje chemická väzba,
    X je -OQ, kde Q je C,_4 alkyl, a
    R je skupina všeobecného vzorca (b), v ktorom R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne C|.4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané, tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heteorcyklický kruh, Ys je vodík, kje 1,2 a 3, a m je 1,2 alebo 3, alebo na použitie na liečenie choroby spojenej s funkciou chaperónového systému alebo spojeného s poškodením bunky alebo bunkovej organely alebo na jej prevenciu.
    ľ'HoL (a)
    J'
    L
    I —(cn,)..— ch—· I OH (t)
  56. 56. Hydroxylamínový derivát podľa nároku 55, v ktorom A je skupina všeobecného vzorca (a) a Y1 je CM halogénalkyl, prednostne trifluórmetyl.
  57. 57. Opticky aktívny stereoizomér hydroxylamínového derivátu podľa nároku 55, v ktorom
    X je halogén, Z je chemická väzba a R je skupina všeobecného vzorca (b), v ktorom R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík alebo priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne CM alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heteorcyklický kruh, Y6 je -OR7, kde R7 je aminoacyl, kje 1, 2 a3, amje 1, 2 alebo 3.
  58. 58. Hydroxylamínové deriváty všeobecného vzorca (I),
    X (') v ktorom
    X je -NR’R2, kde R1 a R2 nezávisle od seba sú vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne C,_Ď alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný heterocyklický kruh,
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, prednostne fenylalkyl substituovaný jedným alebo viacerými alkoxylmi, prednostne CM alkoxyl, fenyl, fenyl substituovaný s jedným alebo viacerými halogénmi, alkylmi alebo halogénalkylmi, prednostne C, 4 alkylom alebo halogénalkylom alebo acylamino alebo nitroskupinami, alebo nesubstituovaná alebo substituovaná heteroaromatická skupina s obsahom dusíka, ktorá môže byť kondenzovaná s benzénovým kruhom, prednostne pyrolyl, pyridyl, izochinolyl alebo chinolyl, alebo heteroaryl s obsahom síry, prednostne tienyl, v ktorom heteroatómy môžu mať jeden alebo viac alkylových substituentov, prednostne alkyl,
    Z je chemická väzba, a
    R je skupina všeobecného vzorca (e), ľ
    (e) f, XR6
    Ys v ktorom R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík, priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne C[.4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané, tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heteorcyklický kruh, ktorý môže obsahovať ďalší (ďalšie) heteroatóm(y), a prípadne substituent(y), prednostne C|.4 alkyl, Y4 je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný Cb4 alkyl, Y5 je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný Ct_4 alkyl alebo OR7, kde R7 je vodík alebo acyl, k je 1,2 a 3, a m je 1,2 alebo 3, za predpokladu, že keď
    A je fenyl, fenyl substituovaný s halogénom alebo alkoxylom alebo fenylalkyl substituovaný s alkoxylom alebo pyridylová skupina a R7 je vodík, aspoň jedno z R1 a R2 je iné ako vodík, a keď
    A je fenyl, fenyl substituovaný s halogénom alebo alkoxylom alebo fenylalkyl substituovaný s alkoxylom, alebo pyridylová skupina a R1 a R2 sú každé vodík, R7 je iné ako vodík.
  59. 59. Hydroxylaminoderiváty všeobecného vzorca (II), v ktorom
    a) X je kyslík,
    A je Cmo priamy alebo rozvetvený alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl alebo halogénfenyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, naftyl alebo aromatická heteroskupina s obsahom dusíka, prednostne pyridyl,
    Z je chemická väzba,
    R1 je vodík, C,_4 alkyl alebo aralkyl, prednostne fenylalkyl,
    R jc skupina všeobecného vzorca (b), v ktorom R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík alebo priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne Cb4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heteorcyklický kruh, Y6 je -OR7, kde R7 je aminoacyl, k je 1, 2 a 3, a m je 1, 2 alebo 3, za predpokladu, že keď
    A je iné ako alkyl a R'je vodík, Y6 je vodík, alebo
    b) X je =NR4, v ktorom R4 je vodík, nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, prednostne fenylalkyl,
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl, alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, prednostne fenylalkyl alebo cykloalkyl, a
    Z je chemická väzba, kyslík alebo =NR3, v ktorom R3 je vodík alebo nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl,
    R' je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aryl, prednostne fenyl, alebo nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, prednostne fenylalkyl, a
    R je skupina všeobecného vzorca (b), v ktorom R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík alebo priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne CM alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heteorcyklický kruh, Y6 je H alebo -OR7, kde R7 je vodík alebo acyl, prednostne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo acylkarbonyl, k je 1, 2 a 3, a m je 1,2 alebo 3,
    c) X je kyslík
    A je nesubstituovaný alebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, prednostne fenylalkyl,
    Zje kyslík,
    R'je alkyl alebo aralkyl, prednostne fenylalkyl,
    R je skupina všeobecného vzorca (b), v ktorom R5 a R6 nezávisle od seba sú vodík alebo priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heterocyklický kruh, Y6 je H alebo -OR7, kde R7 je vodík alebo acyl, prednostne nesubstituovaný alebo substituovaný alkylkarbonyl alebo arylkarbonyl, k je l,2a3,amje 1,2 alebo 3, alebo
    d) X je kyslík,
    Zje=NH, a dl) A je nenasýtený alebo nasýtený alkyl, cykloalkyl, nesubstituovaný alebo substituovaný aralkyl, prednostne fenylalkyl, fenyl alebo fenyl substituovaný s halogénom, alkylom, halogénalkylom, alkoxylom alebo nitroskupinou, R'je alkyl alebo aralkyl, prednostne fenylalkyl a R je skupina všeobecného vzorca (b), v ktorom R5 a R6 nezávisle od seba sú iné ako vodík alebo priamy alebo rozvetvený alkyl, prednostne C].4 alkyl alebo cykloalkyl, alebo spoločne s atómom dusíka, na ktorý sú naviazané tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný nasýtený heteorcyklický kruh, Yó je vodík alebo -OH, k je 1,2 a 3, a m je 1,2 alebo 3.
    x («)
    Y* (b)
  60. 60. Hydroxylamínové deriváty všeobecného vzorca
    Aje fenyl alebo fenyl substituovaný s halogénom alebo nitroskupinou alebo heteroarylovou skupinou s obsahom dusíka, prednostne pyridyl,
    R'je vodík, a
    R je ω-aminoalkyl, ktorý je prípadne mono- alebo disubstituovaný na amino časti, pričom alkylový reťazec má prednostne 1 až 5 atómov uhlíka a substituenty na amino časti sú nezávisle od seba jeden alebo dva priame alebo rozvetvené alkyly alebo cykloalkyly, alebo dva substituenty na amino časti spoločne s dusíkom, na ktorý sú naviazané, tvoria 3- až 7-členný, prednostne 5- až 7-členný heterocyklický kruh, alebo kvartémy derivát N-Cw alkylu, za predpokladu, že keď
    Aje 3-pyridyl, R je iné ako 1-piperidinylmetyl.
  61. 61. Farmaceutický a prípadne kozmetický prostriedok na liečenie choroby spojenej s funkciou chaperónového systému alebo spojeného s poškodením bunky alebo bunkovej organely alebo prípadne na jej prevenciu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylamínovej zlúčeniny všeobecného vzorca (I),
    X (i) v ktorom A, Z, X a R sú definované v nároku 59 a farmaceutický a/alebo kozmeticky prijateľné nosiče a pomocné látky.
    64. Farmaceutický a pripadne kozmetický prostriedok na liečenie kardiovaskulárnych, vaskulámych, mozgových, alergických, imunitných, autoimúnnych chorôb, chorôb vírusového alebo bakteriálneho pôvodu, nádorových ochorení, chorôb kože a sliznice, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 0,5 až 99,5 hmotn. hydroxylamínovej zlúčeniny všeobecného vzorca (I), x
    v ktorom A, Z, X a R sú definované v nároku 60 a farmaceutický a/alebo kozmeticky prijateľné nosiče a pomocné látky.
    28 výkresov
    X (>) v ktorom A, Z, X a R sú definované v nároku 55 a farmaceutický a/alebo kozmeticky prijateľné nosiče a pomocné látky.
  62. 62. Farmaceutický a prípadne kozmetický prostriedok na liečenie kardiovaskulárnych, vaskulámych, mozgových, alergických, imunitných, autoimúnnych chorôb, chorôb vírusového alebo bakteriálneho pôvodu, nádorových ochorení, chorôb kože alebo sliznice, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylaminovej zlúčeniny všeobecného vzorca (I),
    X (I) v ktorom A, Z, X a R sú definované v nároku 58 a farmaceutický a/alebo kozmeticky prijateľné nosiče a pomocné látky.
  63. 63. Farmaceutický a pripadne kozmetický prostriedok na liečenie kardiovaskulárnych, vaskulámych, mozgových, alergických, imunitných, autoimúnnych chorôb, chorôb vírusového alebo bakteriálneho pôvodu, nádorových ochorení, chorôb kože alebo sliznice, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylamínovej zlúčeniny všeobecného vzorca (I),
SK881-97A 1995-11-02 1996-11-01 Použitie hydroxylamínového derivátu na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na zvýšenie produkcie molekulových chaperónov, hydroxylamínový derivát a farmaceutické alebo kozmetické prostriedky s jeho obsahom SK284823B6 (sk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9503141A HU222994B1 (hu) 1995-11-02 1995-11-02 Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
HU9603919 1996-02-09
HU9629820 1996-10-04
PCT/HU1996/000064 WO1997016439A1 (en) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylamine derivatives useful for enhancing the molecular chaperon production and the preparation thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK88197A3 SK88197A3 (en) 1998-04-08
SK284823B6 true SK284823B6 (sk) 2005-12-01

Family

ID=27270113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK881-97A SK284823B6 (sk) 1995-11-02 1996-11-01 Použitie hydroxylamínového derivátu na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na zvýšenie produkcie molekulových chaperónov, hydroxylamínový derivát a farmaceutické alebo kozmetické prostriedky s jeho obsahom

Country Status (31)

Country Link
US (4) US6653326B1 (sk)
EP (1) EP0801649B1 (sk)
JP (2) JP4531865B2 (sk)
KR (1) KR19980700976A (sk)
CN (1) CN1152871C (sk)
AT (1) ATE221880T1 (sk)
AU (1) AU720195B2 (sk)
BG (1) BG63944B1 (sk)
BR (1) BR9607565B1 (sk)
CA (1) CA2209167C (sk)
CZ (1) CZ295562B6 (sk)
DE (1) DE69622840T2 (sk)
DK (1) DK0801649T3 (sk)
EE (1) EE04239B1 (sk)
ES (1) ES2176502T3 (sk)
HR (1) HRP960508B1 (sk)
HU (1) HU222994B1 (sk)
IL (1) IL121126A (sk)
MX (1) MX9704988A (sk)
NO (1) NO321140B1 (sk)
NZ (1) NZ320523A (sk)
PL (1) PL195634B1 (sk)
PT (1) PT801649E (sk)
RS (1) RS49981B (sk)
RU (1) RU2206320C2 (sk)
SI (1) SI0801649T1 (sk)
SK (1) SK284823B6 (sk)
TR (1) TR199700574T1 (sk)
UA (1) UA61050C2 (sk)
WO (1) WO1997016439A1 (sk)
ZA (1) ZA969249B (sk)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUT78139A (hu) * 1995-12-22 2000-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Készítmény, különösen a bőr öregedési folyamatainak mérséklésére
UA64716C2 (en) * 1996-08-09 2004-03-15 Pharmaceuticals for therapy or prevention of illnesses connected with dysfunction of vascular endothelial cells
AU5296799A (en) * 1998-08-03 2000-02-28 N-Gene Kutato Kft. Pharmaceutical compositions against autoimmune diseases
HU226617B1 (en) * 1998-12-14 2009-04-28 Cytrx Corp Optically active pyridyl-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives, and pharmaceutical composition containing the compound as active ingredient
HUP9900475D0 (en) * 1999-02-26 1999-04-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl)-hiyroximic acid-halogenid derivative, it's use for treating insulin resistance, and pharmaceutical compositions containing them as active component
FR2792832B1 (fr) * 1999-04-28 2002-05-10 Codif Internat Sa Procede de protection de la peau pour la prevenir de son vieillissement cellulaire
HUP0001583A2 (hu) * 2000-04-18 2002-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Egy piridin-1-oxid-származék és eljárás annak átalakítására gyógyászati hatású vegyületekké
WO2003000861A2 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 The Regents Of The University Of California Eukaryotic genes involved in adult lifespan regulation
HUP0105205A2 (hu) * 2001-11-29 2003-08-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Metformint és egy hidroxilaminszármazékot tartalmazó, gyógyászati készítmény
CN1615296A (zh) * 2002-01-11 2005-05-11 拜奥列克斯研究发展公司 甲脒衍生物及其在治疗血管疾病中的用途
ES2754753T3 (es) * 2003-03-27 2020-04-20 Childrens Hospital Med Ct Un método y kit para la detección de la instauración precoz de la lesión de células tubulares renales
HUP0303584A3 (en) * 2003-10-30 2009-12-28 Cytrx Corp Use of a hydroximic acid halide derivative in the treatment of neurodegenerative diseases
CN1964946A (zh) * 2004-04-12 2007-05-16 托伦脱药品有限公司 作为hsp 70诱导物的2－丙烯－1－酮
US7786093B2 (en) * 2004-07-07 2010-08-31 Health Wellness Foods Corporation Antistress agent
FR2880022B1 (fr) * 2004-12-24 2007-08-24 Mayoly Spindler Soc Par Action Nouveaux derives de la n-hydroxy-n'-phenyluree et de la n-hydroxy-n'-phenylthiouree et leur utilisation comme inhibiteurs de la synthese de la melanine
US20080227813A1 (en) * 2006-09-26 2008-09-18 Jack Raymond Barber Pharmaceutical compositions and methods for treating diseases associated with neurodegeneration
MX2009005798A (es) * 2006-12-01 2009-08-12 Cytrx Corp Recuperacion de apoplejia.
TW200901958A (en) * 2007-05-04 2009-01-16 Cytrx Corp Diabetic wound healing
WO2009004650A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Torrent Pharmaceuticals Ltd. Novel substituted piperidones as hsp inducers
PL2659904T3 (pl) 2008-06-26 2016-01-29 Orphazyme Aps Zastosowanie Hsp70 jako regulatora aktywności enzymatycznej
KR101645937B1 (ko) * 2008-11-11 2016-08-08 (주)아모레퍼시픽 육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법
EA201100805A1 (ru) * 2008-11-18 2011-10-31 Сантен Фармасьютикал Ко., Лтд. Терапевтический агент при хориоретинальном дегенеративном заболевании, содержащий в качестве активного ингредиента производное пиридин-3-карбальдегид-o-(пиперидин-1-илпропил)оксима
US20110123473A1 (en) * 2009-11-26 2011-05-26 Basf Se Use of highly-branched polycarbonates in cosmetic and dermatological formulations
PL2646044T3 (pl) 2010-11-30 2020-03-31 Orphazyme A/S Sposoby zwiększenia aktywności wewnątrzkomórkowej Hsp70
KR101275264B1 (ko) 2011-08-24 2013-06-17 포항공과대학교 산학협력단 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법
HUP1100534A2 (en) 2011-09-26 2013-04-29 Balazs Dr Hazay Pharmaceutical composition for the treatment of muscle atrophy
HUP1100535A2 (en) 2011-09-26 2013-04-29 Bracelia Invest Ltd Pharmaceutical composition for enhancement of stem cell treatment
RU2495928C2 (ru) 2012-01-30 2013-10-20 Сергей Юрьевич Лешков Средство для стимуляции синтеза белков теплового шока hsp 70 в клетках человека и животных; косметическое средство для стимуляции репаративных процессов; косметическое средство для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур; биологически активная добавка; пищевой продукт; способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур
JP6678676B2 (ja) 2014-09-15 2020-04-08 オーファザイム エー／エス アリモクロモル製剤
US10898476B2 (en) 2016-04-13 2021-01-26 Orphazyme A/S Heat shock proteins and cholesterol homeostasis
EP3448382B1 (en) 2016-04-29 2020-10-14 Orphazyme A/S Arimoclomol for treating glucocerebrosidase associated disorders
US20200085812A1 (en) 2017-05-24 2020-03-19 Orphazyme A/S Heat shock protein inducers and frontotemporal disorders
CN108314630B (zh) * 2018-02-08 2020-11-06 广西民族大学 一种肟醚类衍生物及其制备方法与应用
WO2019229078A1 (en) 2018-05-28 2019-12-05 Orphazyme A/S Hsp70 protein levels in pbmc samples as biomarker for disease
HUP1800298A1 (hu) 2018-08-30 2020-05-28 N Gene Res Laboratories Inc Gyógyszerkombináció béta-receptor blokkolók hatásának módosítására és a mellékhatások csökkentésére
CN110048418B (zh) * 2019-05-08 2023-03-24 辽宁工程技术大学 一种基于细胞-组织算法的微电网经济调度方法及装置
CA3183559A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Thomas Kirkegaard Jensen Arimoclomol for treating gaucher disease
CN112094878A (zh) * 2020-08-18 2020-12-18 周银根 一种二步酶提取香菇多糖的方法、香菇多糖提取物及其应用
US20230416224A1 (en) 2020-11-19 2023-12-28 Zevra Denmark A/S Processes for preparing arimoclomol citrate and intermediates thereof
WO2022136640A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Orphazyme A/S Arimoclomol for the treatment of niemann pick disease, type c, in patients with er type missense mutations
WO2023053007A1 (en) * 2021-09-28 2023-04-06 Kempharm Denmark A/S Dioxazines and their use in treatment of gba-related diseases

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU177578B (en) 1976-08-27 1981-11-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Process for preparing new 0-/3-amino-2-hydroxy-propyl/-amidoxime derivatives
DE2651083A1 (de) * 1976-11-09 1978-05-18 Hoechst Ag Neue o-alkylierte hydroxylamine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
HU207988B (en) * 1988-10-20 1993-07-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft Process for producing halogenides of o-/3-amino-2-hydroxy-propyl/hydroximic acid and pharmaceutical compositions containing them as active components
HUT54347A (en) 1989-01-10 1991-02-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Improved process for producing amidoximes
US5334600A (en) * 1991-07-30 1994-08-02 Ciba-Geigy Corporation Isoquinolyl substituted hydroxylamine derivatives
HU216830B (hu) 1992-07-21 1999-09-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt., N-[2-Hidroxi-3-amino-propoxi]-amidok és -imidátok, valamint dioxazinok, eljárás ezek előállítására, és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
WO1995030649A1 (en) * 1994-05-06 1995-11-16 Biorex Kutató És Fejleszto^' Rt. Novel hydroximic acid derivatives, pharmaceutical compositions containing them and process for preparing same
HU9502843D0 (en) * 1995-09-29 1995-11-28 Livigene Ltd Pharmaceutical composition

Also Published As

Publication number Publication date
EP0801649A2 (en) 1997-10-22
WO1997016439A1 (en) 1997-05-09
DK0801649T3 (da) 2002-12-02
JP4531865B2 (ja) 2010-08-25
BG63944B1 (bg) 2003-07-31
AU7326396A (en) 1997-05-22
RS49981B (sr) 2008-09-29
HUT76659A (en) 1997-10-28
ATE221880T1 (de) 2002-08-15
UA61050C2 (en) 2003-11-17
IL121126A0 (en) 1997-11-20
CN1177351A (zh) 1998-03-25
CA2209167A1 (en) 1997-05-09
CZ207297A3 (cs) 1998-03-18
NO321140B1 (no) 2006-03-27
IL121126A (en) 2002-07-25
US7745465B2 (en) 2010-06-29
DE69622840D1 (de) 2002-09-12
CN1152871C (zh) 2004-06-09
BG101713A (en) 1998-03-31
SK88197A3 (en) 1998-04-08
TR199700574T1 (xx) 1999-08-23
NO973059L (no) 1997-09-02
PL195634B1 (pl) 2007-10-31
NO973059D0 (no) 1997-07-01
CA2209167C (en) 2009-05-19
US20040067940A1 (en) 2004-04-08
US6653326B1 (en) 2003-11-25
EP0801649B1 (en) 2002-08-07
AU720195B2 (en) 2000-05-25
JPH10512590A (ja) 1998-12-02
CZ295562B6 (cs) 2005-08-17
US7148239B2 (en) 2006-12-12
HRP960508A2 (en) 1998-06-30
HRP960508B1 (en) 2004-10-31
YU58796A (sh) 1999-09-27
NZ320523A (en) 2001-05-25
PL322015A1 (en) 1998-01-05
RU2206320C2 (ru) 2003-06-20
MX9704988A (es) 1998-07-31
US20040019103A1 (en) 2004-01-29
BR9607565A (pt) 1999-07-20
ZA969249B (en) 1998-03-02
BR9607565B1 (pt) 2011-08-23
EE04239B1 (et) 2004-02-16
JP2009108048A (ja) 2009-05-21
KR19980700976A (sk) 1998-04-30
HU9503141D0 (en) 1995-12-28
ES2176502T3 (es) 2002-12-01
HU222994B1 (hu) 2004-01-28
DE69622840T2 (de) 2003-04-30
PT801649E (pt) 2002-12-31
SI0801649T1 (en) 2002-12-31
US20100267711A1 (en) 2010-10-21
EE9700146A (et) 1997-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK284823B6 (sk) Použitie hydroxylamínového derivátu na prípravu farmaceutického alebo kozmetického prostriedku na zvýšenie produkcie molekulových chaperónov, hydroxylamínový derivát a farmaceutické alebo kozmetické prostriedky s jeho obsahom
EP2170814B1 (en) Antibacterial agents
JP5340918B2 (ja) ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤
US6716878B1 (en) Antimicrobial agents
EP0521827B1 (de) Pharmakologisch wirksame Hydrazinderivate und Verfahren zu deren Herstellung
PL207057B1 (pl) Orto-podstawione związki bisarylowe, zawierające azot, preparat farmaceutyczny zawierający związki biasarylowe oraz zastosowanie związków biasarylowych
JPH11139969A (ja) 医薬組成物
US10456405B2 (en) Nitric oxide-releasing prodrug molecule of substituted quinazolines
BR112018069930B1 (pt) Compostos agonistas de ppar, uso dos mesmos e composição farmacêutica
FI113860B (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten 3,5-substituoitujen aminobentsoyyliguanidiinien valmistamiseksi
JPH11514996A (ja) レトロウイルスアスパラギン酸プロテアーゼの置換同配体としてのアザヘキサン誘導体
BR112019010816A2 (pt) composto de fórmula i, composto de fórmula ii, composto de fórmula iii, composto de fórmula iv, composto de fórmula v, composição farmacêutica, compostos, composto de fórmula viii, composto de fórmula ix, e composto de fórmula x
CZ298542B6 (cs) Použití derivátu hydroxylaminu k príprave léciva pro lécbu a prevenci nemocí spojených s dysfunkcí vaskulárních endoteliálních bunek a farmaceutický prípravek tyto látky obsahující
FI72967B (fi) Foerfarande foer framtaellning av farmaceutiskt aktiva 2-amino-3-bensoylfenylacetamidderivat.
EP2292640A2 (de) Basisch-substituierte Benzylaminanaloga als Inhibitoren des Gerinnungsfaktors Xa, ihre Herstellung und Verwendung
DE69912639T2 (de) N-formyl hydroxylamin derivate als antibakterielle mittel
JP2774845B2 (ja) 腫瘍転移阻害剤
KR101032006B1 (ko) 히드록시모르폴리논 유도체 및 이의 의약 용도
FI85140B (fi) Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara n-(1h-indol-4-yl)-bensamidderivat.
DE69720554T2 (de) Metalloproteinase inhibitoren
KR20210130016A (ko) 신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 염, 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 약학 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20111101