CZ295562B6 - Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba - Google Patents

Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba Download PDF

Info

Publication number
CZ295562B6
CZ295562B6 CZ19972072A CZ207297A CZ295562B6 CZ 295562 B6 CZ295562 B6 CZ 295562B6 CZ 19972072 A CZ19972072 A CZ 19972072A CZ 207297 A CZ207297 A CZ 207297A CZ 295562 B6 CZ295562 B6 CZ 295562B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
alkyl
substituted
phenyl
unsubstituted
phenylalkyl
Prior art date
Application number
CZ19972072A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ207297A3 (cs
Inventor
László Vígh
Nagy Péter Literáti
Jenö Szilbereky
László Ürögdi
Andrea Jednákovits
László Jaszlits
Katalin Bíró
Ede Márványos
Mihály Barabás
Erzsébet Hegedüs
László Korányi
Mária Kürthy
Gábor Balogh
Ibolya Horváth
Zsolt Török
Éva Udvardy
György Dormán
Dénes Medzihradszky
Bea Mézes
Eszter Kovács
Erno Duda
Beatrix Farkas
Attila Glatz
Original Assignee
Biorex Kutato És Fejleszto Rt.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27270113&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ295562(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biorex Kutato És Fejleszto Rt. filed Critical Biorex Kutato És Fejleszto Rt.
Publication of CZ207297A3 publication Critical patent/CZ207297A3/cs
Publication of CZ295562B6 publication Critical patent/CZ295562B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/02—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by halogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/12—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by nitrogen atoms, e.g. N-hydroxyamidines
    • C07C259/18—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by nitrogen atoms, e.g. N-hydroxyamidines having carbon atoms of hydroxamidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C275/00—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C275/64—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups singly-bound to oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/18—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/89—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C07D215/54—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/22—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/26—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/08—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms
    • C07D295/084—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
    • C07D295/088—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/38—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Hydroxylaminové deriváty obecného vzorce I a II, a farmaceutický a případně kosmetický prostředek pro léčbu kardiovaskulárních, vaskulárních, mozkových, alergických, imunitních, autoimunních onemocnění, chorob způsobovaných virovými nebo bakteriálními infekcemi, nádorových onemocnění, chorob kůže a sliznice, který obsahuje 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylaminové sloučeniny obecného vzorce I a II, spolu s farmaceuticky a/nebo kosmeticky přijatelnými nosiči a přídavnými látkami, způsoby zvyšování buněčné exprese molekulárních chaperonů nebo zesilování jejich aktivity, přičemž chemickou sloučeninou, zvyšující expresi molekulárního chaperonu nad množství indukované daným fyziologickým stresem samotným, je hydroxylaminový derivát, resp. jeho tautomerní formy, včetně jejich opticky aktivních stereoizomerů a solí.ŕ

Description

Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba
Oblast techniky
Tento vynález se týká použití hydroxylaminového derivátu k přípravě farmaceutického přípravku ke zvyšování exprese molekulárního chaperonů projevující se tím, že buňka vystavení fyziologickému stresu zvyšuje expresi molekulárního chaperonů nad množství indukované daným fyziologickým stresem.
Dosavadní stav techniky
Molekulární chaperony [angl. chaperons, významově např. chůvy, kmotři} jsou bílkoviny, jež zprostředkovávají skládání bílkovinné struktury. Váží se nekovalentně k odkrytým povrchům bílkovin, jež jsou nově syntetizovány, nebo denaturovány, nebo špatně složeny, a napomáhá jim ke složení do správné konformace. Molekulární chaperony jsou také zapojeny do řady buněčných pochodů, jako jsou syntéza bílkovin, translokace bílkovin a replikace DNA.
Molekulární chaperony zahrnují bílkoviny tepelného šoku, což jsou bílkoviny, jejichž exprese se významně zvyšuje v buňkách vystavených neobvykle vysoké teplotě (tepelnému šoku) nebo vystavených široké paletě fyziologických stresů. Tento vzrůst exprese molekulárních chaperonů pak poskytne buňkám ochranu proti škodlivým účinkům hypertermie, jak prokazuje tolerance buněk k teplotám, jež jsou pro ně jinak letálně vysoké, pokud jsou tyto buňky prekondicionovány krátkým vystavením vysoké teplotě.
Fyziologické stresy, jež indukují bílkoviny tepelného šoku, zahrnují velkou řadu patologických stavů spojených s mnohými chorobami. Syntéza bílkovin tepelného šoku v buňkách vystavených takovýmto stresům ukazuje také na ochranu daných buněk proti daným fyziologickým stresům, podobně jako v případě odezvy na tepelný šok.
Jedním takovýmto patologickým stavem spojeným s indukcí molekulárních chaperonů je ischemické poškození. Ischemické poškození tkání je důsledkem omezení zásobování krví z jakékoli příčiny. Například: Přetrvávající koronární okluze způsobuje poškození myokardu, jež vede k nekróze srdečního svalu a ohrožuje šance na zhojení, i když se proudění krve navrátí. V mozku mohou být častá poškození způsobována ischemií a mohou vést k odumření mozkové tkáně.
Bylo pozorováno, že množství bílkoviny tepelného šoku hsp70 se zvyšovalo v myokardu během ischemie vedoucí k nekróze dokonce tehdy, když trvání ischemie bylo krátké. V těchto případech, podobně jako u tepelného šoku, ochraňoval zvýšený obsah buněčné hsp70 buňky proti důsledkům další ischemie, jež by jinak způsobovala nekrózu (DAS, D. K., et al., Cardiovascular Res: 578, 1993). Toto bylo rovněž pozorováno, když byly ischemii podrobeny potkaní buňky v buněčné kultuře (J Clin. Invest. 93: 759-767 (1994)). Podle tohoto tedy poskytují bílkoviny tepelného šoku syntetizované buňkami myokardu ochranu proti ischemickému poškození.
Situace v mozkové tkáni je podobná, přičemž cerebrální ischemie vede ke zvýšené expresi bílkovin tepelného šoku v mozkové tkáni. Experimenty rovněž potvrdily, že předchozí působení subletální ischemii na zvířata indukuje bílkovinu tepelného šoku (hsp70) a chrání mozek proti závažnějšímu následnému ischemickému napadení (Simon et al., Neurosci. Lett. 163: 135-137 (1993)).
Ještě další příklad fyziologického stresu u tkání a orgánů spojený s molekulárními chaperony poskytují zánětlivá onemocnění. Zánět je nespecifickou odezvou hostitelských buněk na proniknutí cizího materiálu, jak je tomu v případech infekce různými bakteriálními a virovými
-1 CZ 295562 B6 patogeny, a zahrnuje shlukování a aktivaci leukocytů v místě poranění, což vede k tvorbě a uvolnění vysokých hladin reaktivních forem kyslíku a cytokinů. Tyto cytokiny a reaktivní kyslíkové radikály napadají patogen, ale poškozují také hostitelskou tkáň (Jacquier, Sarlin, Experientia 50: 1031-1038 (1994)). Má se za to, že jako ochranu proti těmto toxickým mediátorům zánětu zvyšuje hostitelská tkáň produkci molekulárních chaperonů. Takto produkované molekulární chaperony chrání hostitelské buňky před poškozením způsobovaným reaktivními formami kyslíku a ochraňují buňky před cytotoxicitou TNF a jiných cytokinů a reaktivních kyslíkových radikálů. Ve studiích na zvířatech bylo prokázáno, že předchozí vystavení zvířete tepelnému šoku, jenž způsoboval vzrůst exprese bílkoviny tepelného šoku (hsp70), vedlo k značnému snížení pulmonálních zánětů. Podle tohoto tedy mají molekulární chaperony protizánětlivou funkci.
Příklady uvedené shora ilustrují schopnost molekulárních chaperonů chránit buňky před různými fyziologickými stresy, jež narušují buněčnou homeostatickou rovnováhu a způsobují poškození buněk. U molekulárních chaperonů se rovněž ukázalo, že jsou výhodné v léčení neoplazmat. Bylo například ohlášeno, že když se nádorové buňky transferují genem kódujícím molekulární chaperon (65 kd hsp), ztrácejí svou tumorigenicitu nebo vykazují její pokles (PCT přihláška č. PCT/GB93/02339). Dále bylo také ohlášeno, že nádorové buňky v odezvě na tepelný šok exprimují molekulární chaperony ve zvýšeném množství. Ty však nejsou přítomné v cytoplazmě ale na povrchu buněčných membrán (FerrariniM. et al., Int. J. Cancer. 51: 613-619 (1992). Zvýšená přítomnost molekulárních chaperonů na buněčných površích koreluje se zvýšenou citlivostí NK (přirozených zabijecích) buněk pro nádorové buňky, umožňující lepší cílení, infiltraci a zabíjení nádorových buněk NK buňkami (Kurosawa et al., Eur. J. Immunol. 23: 1029 (1993)).
Vzhledem k výhodám spojeným se zvýšenou expresí molekulárních chaperonů v buňkách by byla metoda na zvýšení této exprese nebo zvýšení aktivity molekulárních chaperonů velmi žádoucí.
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká způsobů zvyšování buněčné exprese molekulárních chaperonů nebo zesilování jejich aktivity. Obzvláště, podle jednoho neomezujícího provedení vynálezu, je poskytnut způsob zahrnující působení na buňku vystavenou fyziologickou stresu účinným množstvím chemické sloučeniny před, v průběhu nebo po fyziologickém stresu, což zvýší expresi molekulárního chaperonů nad množství indukované daným fyziologickým stresem.
Chemickou sloučeninou je přitom hydroxylaminový derivát, jehož tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, nebo jeho soli, včetně jejich opticky aktivních stereoizomerů, kde
A je Ci 2oalkyl, Ci_20alkyl substituovaný kyanem, hydroxylem, Ci^alkoxylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci^alkylaminoskupinou, di-Ci_6alkylamino-skupinou, halogen-C]_6alkylaminoskupinou nebo halogenem; fenyl-Ci_6alkyl, fenyl-C]_6alkyl substituovaný ve fenylové části kyanem, hydroxylem, Ci^alkylem, C|_6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci_6alkylaminoskupinou, di—C16alkylaminoskupinou, halogen-C^alkylaminoskupinou nebo halogenem; fenyl, fenyl substituovaný ve fenylové části kyanem, hydroxylem, Ci_6alkylem, Ci..6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci_6alkylaminoskupinou, di-Cj_6alkylaminoskupinou, halogen-Ci_6alkylaminoskupinou nebo halogenem; 5- nebo 6-členná heteroarylová skupina, obsahující N, S nebo O;
Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku a Ci_6alkylu;
-2CZ 295562 B6
R je Ci_6alkyl nebo ω-aminoalkylová skupina s přímým nebo větveným C3 8alkylovým řetězcem, popřípadě substituovaná hydroxy- nebo alkoxyskupinou a popřípadě substituovaná na atomu dusíku jedním nebo dvěma shodnými nebo různými Ci^alkyly nebo C5 7cykloalkyly, nebo dva aminosubstituenty společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 5-7členný heterocyklický kruh, který může dále obsahovat další heteroatom N nebo O a nesoucí popřípadě Ci_4alkylsubstituent na druhém dusíkovém heteroatomu;
X v tautomeru obecného vzorce I je halogenovaná nebo Ci^alkoxyskupina nebo NR!R2, kde R1 a R2 jsou nezávisle vodík, lineární nebo větvený Cj_6alkyl nebo cykloalkyl, nebo R1 a R2 společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3-7-členný, výhodně 5-7členný kruh a
X v tautomeru obecného vzorce lije kyslíková, iminová nebo substituovaná iminová skupina,
R' je vodík, C^alkyl, fenyl, fenyl-Cj^alkyl nebo acylová skupina, a sloučeniny obecného vzorce I případně obsahují intramolekulámí kruhové struktury tvořené spojením X a reaktivního substituentu R.
Jiným neomezujícím provedením vynálezu je zesílení aktivity molekulárního chaperonu v buňce vystavené fyziologického stresu jež zahrnuje podávání hydroxylaminového derivátu struktury I nebo II, jak je popsáno výše. Aktivita molekulárního chaperonu se tedy zvýší nad množství indukované daným fyziologickým stresem samotným. V kterémkoli způsobu je výhodné, když buňkou, jíž se hydroxylaminový derivát podává, je eukaryotická buňka.
Podle vynálezu se na eukaryotické buňky působí hydroxylaminovými deriváty, jak jsou definovány shora.
Jiným předmětem vynálezu je způsob léčby nebo možné prevence chorob svázaných s fungováním chaperonového systému nebo spojených s poškozením buněčných nebo buněčně-organelových membrán, přičemž se k potlačení patologických stavů podává hostitelskému organizmu účinné množství hydroxylaminového derivátu obecného vzorce I nebo II.
Ještě jiným předmětem vynálezu je použití hydroxylaminového derivátu obecného vzorce I nebo II nebo jejich solí k přípravě farmaceutických prostředků, jež mohou být použity k léčbě kardiovaskulárních, vaskulámích, cerebrálních a nádorových onemocnění, chorob kůže nebo slizniční membrány, nebo chorob epitelových buněk a ledvinových kanálků, jakož i k přípravě kosmetických prostředků.
Vynález se dále týká nových hydroxylaminových derivátů majících široký rozsah biologických účinků a užitečných ke zvýšení hladiny molekulárních chaperonů v organizmech nebo aktivity řečených molekulárních chaperonů a k přípravě farmaceutických nebo kosmetických prostředků využitelných pro tento účel.
Další předmět tohoto vynálezu je představován farmaceutickými a kosmetickými prostředky, jež obsahují nové hydroxylamínové deriváty spolu s nosiči a přídavky obecně přijatelnými v takovýchto prostředcích.
Tento vynález je, přinejmenším zčásti, založen na nečekaném zjištění, že hydroxylaminové deriváty, mající shora popsané struktury, jsou schopné při použití k působení na buňky zvyšovat množství molekulárních chaperonů produkovaných těmito buňkami nebo zvyšovat jejich aktivitu. Tento účinek je obzvláště velký, když dané buňky jsou pod fyziologickým stresem, jenž indukuje expresi molekulárních chaperonů. V těchto případech chemické sloučeniny zvyšují expresi molekulárních chaperonů nad množství indukované daným fyziologickým stresem samotným. Toto zjištění je významné z hlediska role, již molekulární chaperony hrají v buňkách, jež se samy
-3 CZ 295562 B6 chrání před patologickými účinky různých chorob. Tedy: když nějaká sloučenina je schopna zvyšovat množství nebo aktivitu molekulárních chaperonů exprimovaných buňkami, umožní to buňkám ochranu před škodlivými účinky chorob nebo nápravu poškození jimi způsobovaných.
Stručný popis obrázků
Obrázek 1 ukazuje změny v hladině hsp na myokardu H9c2 potkanů vystavených tepelnému šoku jako účinek působení maleinátu N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu. Tato sloučenina je vyznačena jako B v obrázcích a rovněž se na nijako na sloučeninu B odkazuje v následujícím.
Obrázek 2 ukazuje výsledky experimentu shora uvedeného získané „Western“ analýzou, založené na denzitometrickém hodnocení.
Obrázek 3 ukazuje výsledky „Northern“ analýzy hsp70 mRNA získané při zjišťování účinku sloučeniny B na expresi hsp na transkripční úrovni.
Obrázek 4 ukazuje výsledky „Northern“ analýzy hsp26 mRNA získané na buňkách Saccharomyces cerevisiae při zjišťování účinku sloučeniny B na aktivaci hsp.
Obrázek 5 ukazuje účinek benzylalkoholu na aktivaci adenylátcyklázy a membránový stav plazmy.
Obrázek 6 ukazuje úroveň exprese hsp genu na HeLa buňkách s použitím luciferázového reportérového genu pro tento test.
Obrázek 7 ilustruje účinek sloučeniny B na buněčně-povrchovou expresi v buněčné linii K562.
Obrázek 8 ukazuje interakci sloučeniny B a různých lipidových membrán, s ukázáním vzrůstu povrchového napětí.
Obrázek 9 ukazuje účinek sloučeniny B v koncentracích 10 mM a 100 mM na fázový přechod „dvouvrstvá (L2) => T hexagonální (Hn)“ u velkých unilamelárních váčků připravených z dipalmitoyl-fosfatidylethanolaminu.
Obrázek 10 je diagram účinku sloučeniny B na hladinu sérového TNF u zdravých a STZ diabetických potkanů.
Obrázek 11 ukazuje účinek sloučeniny B proti inhibičnímu účinku cykloheximidu na růst keratinocytů.
Obrázek 12 ukazuje účinek sloučeniny B proti buňky poškozujícímu účinku cykloheximidu na endothelové buňky.
Obrázek 13 ukazuje účinek sloučeniny B proti buňky poškozujícímu účinku cykloheximidu na buňky linie HeLa.
Obrázek 14 ukazuje účinek sloučeniny B proti růst inhibujícímu účinku cykloheximidu na linii buněk potkaního myokardu H9c2.
Obrázek 15 ukazuje účinek sloučeniny B na aktivitu Pl transkripčního faktoru vAB 1380 kvasinkových buňkách.
-4CZ 295562 B6
Obrázek 16 ukazuje účinek sloučeniny B na aktivitu API transkripčního faktoru v JF1 kvasinkových buňkách.
Obrázek 17 ukazuje účinek sloučeniny B na aktivitu Pl transkripčního faktoru vAB 1380 kvasinkových buňkách.
Obrázek 18 ukazuje výsledky testu získané na modelu izolovaného fungujícího ischemického potkaního srdce, přičemž se na daný model působilo sloučeninou B, jak byly stanoveny „Western“ analýzou 2 hodiny po ischemii.
Obrázek 19 ukazuje výsledky testu získané na modelu izolovaného fungujícího ischemického potkaního srdce, přičemž se na daný model působilo sloučeninou B, jak byly stanoveny „Western“ analýzou 3 hodiny po ischemii.
Obrázek 20 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 1 % sloučeniny B. Obrázek 21 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 2 % sloučeniny B. Obrázek 22 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 4 % sloučeniny B. Obrázek 23 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 1 % sloučeniny B, ale s vizuálním hodnocením.
Obrázek 24 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 2 % sloučeniny B, ale s vizuálním hodnocením.
Obrázek 25 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 4 % sloučeniny B, ale s vizuálním hodnocením.
Obrázek 26 ukazuje porovnávací fotografie (léčba a kontrola) zhotovené v testech uvedených shora pomocí mikroskopické techniky digitální epiluminiscence.
Obrázek 27 ukazuje hladiny hsp72 stanovené pomocí „Western“ analýzy ve vzorcích získaných v předcházejících testech při léčbě s krémy obsahujícími 1, 2 a 4 % sloučeniny B.
Obrázek 28 ukazuje hladiny hsp72 stanovené imunohistochemickou analýzou (léčba a kontrola) u SCID myší vystavených UV-B a léčených sloučeninou B.
Obrázek 29 ukazuje hladiny hsp72 stanovené pomocí „Western“ analýzy u odebraných vzorků kůže SCID myší vystavených UV-B a léčených sloučeninou B.
Podrobný popis vynálezu
Hydroxylaminové deriváty podle vynálezu
Hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, se používají ve zde popsaném vynálezu. V obecných vzorcích shora A je C|.2oalkyl, fenyl-C|.6alkyl, feny 1-Cí^alky 1 substituovaný ve fenylové části kyanem, hydroxylem, Ci_6alkylem, Ci_6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci„6alkylaminoskupinou, di-C]_6alkylaminoskupinou, halogen-C]_6alkylaminoskupinou nebo halogenem; fenyl, fenyl substituovaný ve fenylové části kyanem, hydroxylem, Ci_6alkylem, Ci_6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-C|_6alkylaminoskupinou, di-Ci_6alkylaminoskupinou, halogen-Ci_6alkylaminoskupinou nebo halogenem; 5- nebo 6-členná heteroarylová skupina, obsahující N, S nebo O;
Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku a C]_6alkylu;
-5 CZ 295562 B6
R je ω-aminoalkylová skupina s přímým nebo větveným C3_8alkylovým řetězcem, popřípadě substituovaná hydroxy- nebo alkoxyskupinou a popřípadě substituovaná na atomu dusíku jedním nebo dvěma shodnými nebo různými Ci_6alkyly nebo C5_7cykloalkyly, nebo dva aminosubstituenty společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 5-7-členný heterocyklický kruh, který může dále obsahovat další heteroatom N nebo O a nesoucí popřípadě Ci^alkylsubstituent na druhém dusíkovém heteroatomu;
X v tautomeru obecného vzorce I je halogenovaná nebo C]_6alkoxyskupina nebo NR*R2, kde R1 a R2 jsou nezávisle vodík, lineární nebo větvený Ci_ealkyl nebo cykloalkyl, nebo R1 a R2 společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3-7-členný, výhodně 5-7členný kruh a
X tautomeru obecného vzorce II je kyslíková, iminová nebo substituovaná iminová skupina,
R' je vodík, C)_6alkyl, fenyl, fenyl-Ci_6alkyl nebo acylová skupina, a sloučeniny obecného vzorce I případně obsahují intramolekulámí kruhové struktury tvořené spojením X a reaktivního substituentu R.
Kde se uvádí „alkyl“, míní se přímé nebo větvené alkylové skupiny zahrnující krátké i dlouhé řetězce.
Typický počet uhlíkových atomů výhodných alkylových skupin o krátkém řetězci se pohybuje od 1 do 8 a skupinou může být methylová, ethylová, izopropylová, butylová, .seÁ:-butylová, pentylová, /erc-pentylová, hexylová, heptylová a oktylová skupina, a podobně, výhodněji se pohybuje od 1 do 6 a skupinou může být methylová, ethylová, izopropylová, butylová, seAr-butylová, pentylová, /erc-pentylová a hexylová skupina.
Typický počet uhlíkových atomů výhodných alkylových skupin o dlouhém řetězci se pohybuje od 9 do 21 a skupinou může být nonylová, decylová, undecylová, dodecylová, tridecylová, tetradecylová, pentadecylová, hexadecylová, heptadecylová, oktadecylová, nonadecylová, eikosylová a heneikosylová skupina, a podobně, výhodněji se pohybuje od 9 do 17 a skupinou může být nonylová, decylová, undecylová, dodecylová, tridecylová, tetradecylová, pentadecylová, hexadecylová a heptadecylová skupina.
Výhodná cykloalkylová skupina znamená cykloalkylovou skupinu mající krátký cykloalkylový řetězec v rozsahu od 3 do 8, a skupinou může být cyklopropylová, cyklobutylová, cyklopentylová, cyklohexylová, cykloheptylová a cyklooktylová skupina, a podobně, výhodněji od 3 do 7, a skupinou může být cyklopropylová, cyklobutylová, cyklopentylová, cyklohexylová a cykloheptylová skupina.
Případně substituovaný fenyl nebo alkyl znamená fenylovou nebo alkylovou skupinu mající jednu nebo více substituentových skupin, jako je kyano-, hydroxylová, krátká alkylová (např. methylová, ethylová, propylová, izopropylová, butylová, izobutylová, seA-butylová, pentylová, /erc-pentylová, hexylová, heptylová, oktylová a podobně), krátká alkoxylová (např. methoxylová, ethoxylová, propoxylová, izopropoxylová, butoxylová, izobutoxylová, sekbutoxylová, /erc-butoxylová, pentoxylová, /erc-pentoxylová, hexoxylová a podobně), fenylová, nitro-, amino-, amino- monosubstituovaná krátkým alkylem (např. methyl, ethyl, propyl, izopropyl, /erc-butyl)amino- a podobně, amino- disubstituovaná krátkými alkyly (např. dimethylamino-, diethylamino-, dipropylamino-, diizopropylamino-, dibutylamino-, dipentylamino-, dihexylamino- a podobně), skupina mono-, di- nebo trihalogenovaného krátkého alkylu (např. chlormethylová, 2,2-dichlorethylová, trifluormethylová a podobně) nebo halogenový atom (např. atom fluoru, chloru, bromu a jodu), jakož i podobné.
-6CZ 295562 B6
Výhodná fenylalkylová skupina znamená alkylovou skupinu o krátkém řetězci jak je popsána shora, substituovanou jednou nebo více fenylovými skupinami (případně substituovanými), a může jí být skupina benzyl-, benzhydryl-, trityl—, 1-fenylethyl-, 2-fenylethyl-, 2-benzhydrylethyl-, 3-fenylpropyl, l-methyl-2-fenylethyl-, 1-fenylbutyl-, 4-tritylbutyl, l,l-dimethyl-2fenethyl-, 4-fenylbutyl-, 5-fenylpentyl-, 6-fenylhexyl a podobně, výhodněji nižší alkylové skupiny o 1 až 4 uhlíkových atomech substituované fenylovou skupinou, a může jí být skupina benzyl-, 2-fenylethyl-, l-methyl-2-fenylethylVýhodná 3- až 8-členná, výhodněji 5- až 8-členná, nasycená heterocyklická N-obsahující skupina znamená nasycenou heterocyklickou skupinu obsahující 1 - 4 dusíkové atomy, a může jí být skupina aziridinyl-, azatidinyl-, oxaziranyl-, pyrrolidinyl-, imidazolidinyl-, pyrazolidinylperhydrothiazolyl-, perhydro-izoxazolyl, piperidinyl-, piperazinyl-, perhydropiperidinylperhydropiperazinyl-, morfolinyl-, perhydro-lH-azepinyl- a podobně.
Výhodná heteroarylová skupina znamená nenasycenou 3- až 8-člennou, výhodněji 5- až 8-člennou, 1 - 4 dusíky obsahující nenasycenou hetero-monocyklickou skupinu a může jí být skupina pyrrolyl-, pyrrolinyl-, imidazolyl-, pyrazolyl-, pyridyl- a její N-oxid, pyrimidylpyrazinyl, pyridazinyl, triazolyl-, tetrazolyl-, dihydrotriazynyl a podobně, nebo znamená nenasycenou 1 - 5 dusíků obsahující kondenzovanou heterocyklickou skupinu a může jí být skupina indolyl-, izoindolyl-, indolizinyl-, benzimidazolyl-, chinolyl-, izochinolyl-, indazolylbenzotriazolyl-, tetrazolopyridyl-, tetrazolopyridazinyl-, dihydro-triazolopyridazinyl a podobně, nebo znamená 3- až 6-člennou, výhodněji 5- až 6-člennou, 1-2 kyslíky a 1 - 3 dusíky obsahující nenasycenou hetero-monocyklickou skupinu a může jí být skupina oxazolylizoxazolyl-, oxadiazolyl- (1,2,4-oxadiazoIyl- a j.) a podobně, nebo znamená nenasycenou 1 - 2 kyslíky a 1 - 3 dusíky obsahující kondenzovanou heterocyklickou skupinu a může jí být skupina benzoxazolyl-, benzoxadiazolyl a podobně, nebo znamená 3- až 8-člennou, výhodněji 5- až
6-člennou, 1 - 2 síry a 1 - 3 dusíky obsahující nenasycenou hetero-monocyklickou skupinu a může jí být skupina thiazolyl-, 1,2-thiazolyl-, thiazolinyl-, thiadiazolyl- a podobně, nebo znamená 3- až 8-člennou, výhodněji 5- až 6-člennou, 1 síru obsahující nenasycenou heteromonocyklickou skupinu a může jí být skupina thienylu, nebo znamená 1 kyslík obsahující nenasycenou hetero-monocyklickou skupinu a může jí být skupina furylu, nebo znamená nenasycenou 1-2 síry a 1 - 3 dusíky obsahující kondenzovanou heterocyklickou skupinu a může jí být skupina benzothiazolyl-, benzothiadiazolyl- a podobně.
Výhodná „acylová“ skupina, brána jako taková nebo jako vytvářející část acylované skupiny, znamená s výhodou acylovou skupinu, jíž může být alkanoyl- o krátkém řetězci (např. formyl-, acetyl-, propionyl-, butyryl- a podobně), alkoxykarbonyl- o krátkém řetězci (např. methoxykarbonyl-, ethoxykarbonyl-, propoxykarbonyl-, butoxykarbonyl-, /erc-butoxykarbonyla podobně), alkylsulfonyl- o krátkém řetězci (např. methylsulfonyl-, ethylsulfonyl- a podobně), fenylsulfonyl (např. fenylsulfonyl a podobně), aroyl- (např. benzoyl-, naftoyl-, a podobně), fenyl-(alkanoyl o krátkém řetězci)- (např. fenylacetyl-, fenylpropionyl- a podobně), cyklo-(alkyl o krátkém řetězci)-(alkanoyl o krátkém řetězci)- (např. cyklohexylacetyl a podobně), fenyl-(alkoxy- o krátkém řetězci)-karbonyl- (např. benzyloxykarbonyl a podobně), fenylkarbamoyl- (např. fenylkarbamoyl- a podobně), cykloalkylkarbamoyl- (např. cyklohexylkarbamoyl- a podobně), skupina heteromonocyklického sulfonylu (např. thienylsulfonylu, furylsulfonylu a podobně), a daná acylová skupina může být případně substituovaná 1-3 substituenty, jak se píše shora v odstavci „případně substituovaná“.
Výhodná aminoalkylová skupina znamená alkylovou skupinu o krátkém řetězci obsahující substituovaný N-atom v pozici alkylového řetězce a u níž je alkylový řetězec případně substituován jedním nebo více substituenty, s výhodou jedním nebo dvěma halogeny (např. chlorem, bromem, fluorem, jodem), hydroxylovou skupinou, nebo acetylovanou hydroxylovou skupinou, kde acylová skupina je jak byla definována dříve, výhodněji jednou nebo dvěma alkylovými skupinami o krátkém řetězci přičemž definice „alkylu“ je stejná jako shora. N-atom v pozici alkylového řetězce může být substituován jednou nebo dvěma alkylovými skupinami
-7CZ 295562 B6 o krátkém řetězci, s výhodou methylem, ethylem, /erc-butylem a podobně, cykloalkylkarbamoylem (např. cyklohexylkarbamoylem a podobně), výhodněji může být N-atom součástí nasycené heterocyklické skupiny, jež obsahuje 1-4 dusíkové atomy a jíž může být skupina aziridinyl-, azatidinyl-, oxaziranyl-, pyrrolidinyl-, imidazolidinyl-, pyrazolidinyl-, perhydrothiazolyl-, perhydroizoxazolyl, piperidinyl-, piperazinyl-, perhydropyrimidinyl-, perhydropyridazinyl-, morfolinyl-, perhydro-lH-azepinyl- a podobně, N-atom v pozici může být substituován fenylovou skupinou (např. fenylovou a podobně) a může být kvartemizován krátkým alkylovým substituentem nebo i oxidován.
Pokud je to žádoucí, volné báze obecných vzorců I a II mohou být přeměněny na adiční soli kyselin reakcí s organickými kyselinami a mohou být acetáty, maleináty, a podobně, nebo reakcí s anorganickými kyselinami a mohou být hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy, sulfáty, fosfáty a podobně, nebo reakcí s aminokyselinami a mohou být argininové soli, soli kyseliny glutamové a podobně.
V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Zkovalentní vazba a X je halogen, s výhodou chlor nebo brom. Výhodné sloučeniny náležející k této skupině mají jako A: a) fenylalkyl nebo fenylalkyl se substituovanou fenylovou částí, s výhodou fenyíalkyl nebo fenylalkyl mající jeden nebo dva substituenty, s výhodou alkoxy, b) fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodou substituovaný fenyl obsahující jeden nebo více alkylů, halogenů, halogenalkylů, alkoxylů nebo nitroskupin, c) N-obsahující heteroarylovou skupinu, včetně těch, co mohou být kondenzovány s benzenovým kruhem, s výhodou pyridyl, d) S-obsahující heteroarylovou skupinu, e) O-obsahující heteroarylovou skupinu. Výhodné sloučeniny náležející ktéto skupině mají jako R: a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) aminoalkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z aminoalkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části.
Určité typy hydroxylaminových derivátů struktury I mající kovalentní vazbu jako Z a halogen jako X jsou zveřejněny v US patentech č. 5 147 879, 5 328 906 a 5 296 606. Tyto sloučeniny mohou být připraveny postupy popsanými v citovaných US patentech, s výhodou diazotací odpovídajících X = NH2 derivátů v přítomnosti patřičného hydrohalidu. Výchozí sloučeniny lze získat známými postupy popsanými např. v maďarském patentu HU 177 578 (1976), jmenovitě spojením amidoximu struktury 1 (R1 = R2 = H) s např. reaktivním derivátem struktury 2 v přítomnosti báze, a mohou být diazotovány obvykle bez izolace a purifikace. Koncové skupiny A a R daných sloučenin mohou být dále amidifíkovány a derivatizovány podle potřeby.
V jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z kovalentní vazba a X je hydroxy skupina OQ, kde Q je nesubstituovaná nebo substituovaná alkylová nebo fenylalkylová skupina. Ve výhodném provedení je Q přímý nebo větvený alkyl. V těchto sloučeninách A je fenyl nebo heteroaryl, s výhodou N-obsahující heteroarylová skupina, a R je s výhodou: a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) aminoalkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z aminoalkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části.
Zvláštní skupina hydroxylaminových derivátů struktury I, kde je Z kovalentní vazba a X je OQ, má strukturu I'. Struktura Γ obsahuje kruh uzavřený prostřednictvím hydroxylové skupiny. Tyto sloučeniny představují cyklickou formu sloučenin struktury I, přičemž R je -CH2-CH(OH)-R. R je přímý nebo větvený alkyl, nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou aminoalkyl, jenž je případně substituován na své aminoskupině a s výhodou obsahuje Ci _5 přímý nebo větvený alkylový řetězec. Nejvýhodnější R'' je aminoalkyl mono- nebo disubstituovaný na
-8CZ 295562 B6 aminoskupině, kde amino-substituenty nezávisle na sobě mohou být jeden nebo dva přímé nebo větvené alkyly nebo cykloalkyly, nebo dva amino-substituenty spolu s přilehlým N-atomem tvoří 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný heterocyklus, jenž případně obsahuje další heteroatom. Z tohoto mají výhodné sloučeniny A, jenž je fenyl, substituovaný fenyl, N-obsahující heteroaryl, substituovaný N-obsahující heteroaryl, S-obsahující heteroaryl nebo substituovaný S-obsahující heteroaryl.
Hydroxylaminové deriváty struktury I mající kovalentní vazbu jako Z a OQ jako X jsou zveřejněny v maďarské patentové přihlášce HU 2385/1992. Tyto sloučeniny lze připravit zodpovídajících halogenových derivátů shora uvedené skupiny (hydroxylaminových derivátů struktury I, kde Z je kovalentní vazba a X je halogen) postupy popsanými v maďarské patentové přihlášce HU 2385/1992, např. reakcí s alkoxidy nebo alkalickým uzavřením kruhu pro cyklické sloučeniny struktury I'.
V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z kovalentní vazba a X je NR*R2, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou nasycený 5- až 7-členný kruh.
Ze sloučenin popsaných v právě předcházejícím odstavci jsou obzvlášť výhodné ty, u nichž R je
a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) aminoalkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z aminoalkylskupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části. Z těchto sloučenin jsou výhodnější ty, jejichž A je a) feny laiky 1 nebo fenylalkyl se substituovanou fenylovou částí, s výhodou fenylalkyl nebo feny laiky 1 mající jeden nebo dva substituenty, s výhodou alkoxy, b) fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodou substituovaný fenyl obsahující jeden nebo více alkylů, halogenů, halogenalkylů, alkoxylů, nitroskupin nebo acylaminoskupin, c) N-obsahující heteroarylovou skupinu, včetně těch, co mohou být kondenzovány s benzenovým kruhem, s výhodou pyridyl, d) S-obsahující heteroarylovou skupinu, e) O-obsahující heteroarylovou skupinu.
Hydroxylaminové deriváty struktury I, kde je Z kovalentní vazba a X je NR^2 zahrnují jak známé, tak nové deriváty. Sloučeniny kde X je NH2 jsou zveřejněny v maďarském patentu HU 177578 (1976) a lze je syntetizovat alkylací amidoximových derivátů struktury 1 (struktura I, kde R1 = R2 = H) s reaktivním derivátem struktury 2 v přítomnosti báze.
Zvláštní skupina hydroxylaminových derivátů struktury I, kde je Z kovalentní vazba a X je NR*R2 je poskytnuta strukturou I. Struktura I představuje cyklickou formu struktury I, jež obsahuje kruh uzavřený prostřednictvím skupiny NR*R2. Tyto sloučeniny mohou být odvozeny ze sloučenin struktury I, přičemž R2 je H a R -CH2-CH(OH)-R. R je přímý nebo větvený alkyl, nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl.
Ze sloučenin struktury I jsou výhodné ty, jejichž A je a) fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodou substituovaný fenyl obsahující jeden nebo více alkylů, halogenů, halogenalkylů, alkoxylů nebo nitroskupin, b) N-obsahující heteroarylovou skupinu, včetně těch, co mohou být kondenzovány s benzenovým kruhem, s výhodou pyridyl, c) S-obsahující heteroarylovou skupinu, d) O-obsahující heteroarylovou skupinu. Obzvláště výhodné jsou ty sloučeniny, jež obsahují R jíž je: a) aminoalkyl mající mono-nebo disubstituovanou aminovou část, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část. S výhodou alkylová část aminoalkylu z a) a b) obsahuje 1-5 uhlíkových atomů. Obzvláště výhodné jsou aminoalkylové skupiny mající disubstituovanou amino část, přičemž dané substituenty spolu s přilehlým N-atomem tvoří 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Tento heterocyklický kruh může obsahovat další heteroatom(y).
-9CZ 295562 B6
V těchto aminoalkylových skupinách je aminosubstituentem s výhodou přímý nebo větvený alkyl nebo cykloalkyl. Ve sloučeninách obecného vzorce Γ' je R1 vodík, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl, nesubstituovaný fenylalkyl nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové nebo alkylové části.
Sloučeniny struktury I lze připravovat uzavřením kruhu mezi atomy N(4)-C(5). Potřebné deriváty s otevřeným řetězcem jsou sloučeniny struktury I, kde Z je kovalentní vazba, X je NR]R2 a R1 je jak je definován v souvislosti se sloučeninami obecného vzorce I shora, R2 je H aR je skupina vzorce -CH2-CHY5-R, kde Y5 představuje odcházející skupinu, např. halogenový atom. Takovéto deriváty lze získat z odpovídajících Y5=OH sloučenin s anorganickými halogenačními činidly, např. thionylchloridem nebo chloridem fosforečným. Halogenaci lze provádět s nebo bez inertního rozpouštědla, např. s benzenem, chloroformem, tetrahydrofuranem, atd., obvykle za varu. Po odstranění přebytku činidla, např. odpaření thionylchloridu, se surový halogenderivát cyklizuje - buď po izolaci nebo purifíkaci anebo bez nich - působením silné báze, např. butoxidu sodného v /-butanolu za vzniku sloučeniny Γ, jež se nakonec izoluje a purifíkuje standardními postupy (extrakcí, rekrystalizací, atd.).
V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z kovalentní vazba a X je OQ, kde Q je alkyl, substituovaný alkyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou část nebo substituovanou alkylovou část. Alkyl nebo substituovaný alkyl, jímž je Q, má s výhodou 1-4 uhlíkové atomy. Z těchto sloučenin jsou výhodné ty, jejichž A je alkyl nebo substituovaný alkyl, s výhodou o 1 - 4 uhlíkových atomech, nebo fenylalkyl nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou část nebo substituovanou alkylovou část. Z těchto sloučenin jsou výhodné ty, jejichž R je: a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) amino- alkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Tyto hydroxylaminové deriváty struktury I, kde Z je kovalentní vazba a Xje OQ lze získat v reakci O-substituovaných hydroxylaminů majících strukturu 6 (viz např. Ger. Off. 2 651 083 (1976)) a orthoesterů majících strukturu 7. Kondenzace se obvykle provádí v činidle samotném jako rozpouštědle, s výhodou za varu. Po odpaření se produkt izoluje krystalizací, v některých případech (když je v bočním řetězci R aminofunkce) ve formě adiční soli kyseliny.
V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z kyslík a Xje NR'R2, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl, fenyl, substituovaný fenyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou nasycený 5- až 7-členný kruh. Z těchto sloučenin jsou obzvlášť výhodné ty, u nichž R je a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) aminoalkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxyskupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z aminoalkylskupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části. Z těchto sloučenin jsou výhodnější ty, jejichž A je a) alkyl nebo substituovaný alkyl, b) fenylalkyl nebo fenylalkyl se substituovanou fenylovou a/nebo substituovanou alkylovou částí, c) fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl. Přípravu těchto sloučenin lze provádět jak je popsáno zde níže, přičemž metody závisí na povaze X, jmenovitě na tom, zda X je nesubstituovaná amino- (NH2) nebo substituovaná amino- funkční skupina.
a) Příprava sloučenin, kde X je NH2 lze provádět adicí hydroxylaminů struktury 6 k organickému kyanátu struktury A-O-CN (viz např. Chem. Ber. 98, 144 (1965)). Reakce se provádí s výhodou v inertním organickém rozpouštědle, obvykle za teploty místnosti. Izolace často vyžaduje chromatografícké čištění.
-10CZ 295562 B6
b) Sloučeniny, jejichž X je monosubstituovaná aminoskupina (např. NHR1) se připravují ze známých halogenformimidátů struktury 9 (viz. např. Houben-Weil „Methoden der Organischen Chemie“, svazek E/4, str. 544 (1983)) a sloučeniny struktury 6, v přítomnosti organické báze (např. triethylaminu) nebo anorganické báze, jako je uhličitan sodný, v inertním rozpouštědle, jako je benzen, tetrahydrofuran, atd., s následnými standardními postupy zpracování a čištění.
c) Deriváty, kde X je disubstituovaná aminoskupina lze připravovat reakcí sekundárního aminu struktury 5 se sloučeninou struktury 1, kde Z je kyslík a X je OQ (příprava těchto derivátů je popsána shora). Tyto aminační reakce se provádějí v polárních organických rozpouštědlech, např. ethanolu, s refluxováním, pokud je zapotřebí.
V jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z =NR3, kde R3 je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, fenyl, substituovaný fenyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část, a X je ΝΕ'Η2, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, substituovaný přímý nebo větvený alkyl, fenyl nebo substituovaný fenyl, cykloalkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou nasycený 5- až 7-členný kruh. Z těchto sloučenin jsou dále výhodné ty, jejichž A je alkyl, substituovaný alkyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část, fenylová nebo substituovaná fenylová skupina. Výhodné R pro sloučeniny náležející k této skupině hydroxylaminových derivátů je a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) aminoalkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Je s výhodou, když alkylové části aminoalkyl skupin a) až d) obsahují 3-8 uhlíkových atomů.
Dané hydroxylaminové deriváty struktury I, kde Z je =NR3 a X je NR!R2, lze připravovat aminolýzou odpovídajících izomočovinových derivátů, náležejících ke skupině sloučenin popsaných shora (tato skupina odpovídá hydroxylaminovým derivátům struktury I, kde Z je kyslík a X je NR^2), s amoniem nebo primárním nebo sekundárním aminem. Tato reakce se provádí s výhodou v polárním rozpouštědle, např. vodě nebo ethanolu, s použitím přebytku aminu. Alternativně mohou být halogenformamidy struktury 10 (Houben-Weyl „Methoden der Organischen Chemie“, svazek E/4, str. 544 (1983)) dány do reakce se sloučeninami struktury 6, v přítomnosti organické nebo anorganické báze, také za vzniku sloučenin této skupiny. Reakce se provádí v inertním organickém rozpouštědle, obvykle za teploty místnosti. Sloučeniny, kde R je skupina obecného vzorce b), kde R7 je acyl, se připravují esterifikací odpovídajících sloučenin obsahujících vodík jako R7. Alkyl- nebo fenylestery se obvykle získávají s použitím chloridu nebo anhydridu kyseliny v přítomnosti terciárního aminu nebo anorganické báze, s výhodou v inertním rozpouštědle.
Jiná skupina hydroxylaminových derivátů užitečných v tomto vynálezu má strukturu II, jež představuje tautomerní formu sloučenin struktury I. V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury II je Zkovalentní vazba a X je kyslík. Výhodné sloučeniny náležející ktéto skupině mají A jímž je: a) alkyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl se substituovanou fenylovou nebo alkylovou částí, b) fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodou substituovaný fenyl obsahující jeden nebo více substituentů, přičemž preferované skupiny substituentů zahrnují skupiny alkylů, halogenalkylů a alkoxylů c) N-obsahující heteroarylová skupina, s výhodou pyridyl, d) S-obsahující heteroarylová skupina. Pro sloučeniny náležející ktéto skupině výhodné Rje: a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) aminoalkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mononebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy- nebo acyloxyskupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z aminoalkyl skupin a) až
d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části. Výhodné sloučeniny této skupiny mají R'jíž je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, fenyl nebo substituovaný
-11 CZ 295562 B6 fenyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část.
Sloučeniny náležející k této skupině jsou zveřejněny v maďarské patentové přihlášce HU 2385/1992. Zde jsou popsány cesty k jejich přípravě: Nejvýhodněji mohou být získány acylací O-substituovaných hydroxylaminových derivátů majících strukturu 6 (viz též Ger. Off. 2 651 083 (1976)) s chloridem kyseliny majícím strukturu JJ. Tato cesta může být využita též pro přípravu těch nových sloučenin, kde R' je jiné než vodík, s použitím sloučenin struktury 12 místo struktury 6 - jako výchozího materiálu.
V jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury II je Z chemická vazba a X je =NR4, kde R4 je H, alkyl, substituovaný alkyl, fenyl, substituovaný fenyl, fenylalkyl, fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část, cykloalkyl, a R' jímž je alkyl, substituovaný alkyl, fenyl, substituovaný fenyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část. Z těchto sloučenin jsou výhodné ty, jejichž A je: a) fenylalkyl nebo fenylalkyl se substituovanou fenylovou částí, s výhodou fenylalkyl nebo fenylalkyl obsahující jeden nebo více substituentů, s výhodou alkoxy, b) fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl obsahující jednu nebo více alkylových, halogenalkylových nebo nitroskupin, c) N-obsahující heteroarylová skupina, s výhodou pyridyl, d) S-obsahující heteroarylová skupina. Výhodné sloučeniny náležející ktéto skupině mají jako R: a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) aminoalkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mononebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z aminoalkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části.
Tyto sloučeniny lze připravit buď O-alkylací některého Ν,Ν'-disubstituovaného amidoximu struktury 13 s chemickou sloučeninou mající strukturu 2 (k reakčním podmínkám viz preparaci sloučenin struktury I, kde Z je kovalentní vazba a X je NR*R2), anebo O-acylací N,Odisubstituovaného hydroxylaminu obecného vzorce 12 s indolylhalidem obecného vzorce 16, přičemž se reakce provádí v inertním rozpouštědle, s výhodou v přítomnosti organického nebo anorganického kyselého vychytávače. Sloučeniny, kde R je skupina obecného vzorce b), kde R7 je acyl, se připravují esterifíkací odpovídajících sloučenin obsahujících vodík jako R7. Alkylnebo fenylestery se obvykle získávají s použitím chloridu nebo anhydridu kyseliny v přítomnosti terciárního aminu nebo anorganické báze, s výhodou v inertním rozpouštědle.
V jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury lije Z kyslík a X je kyslík. Výhodné sloučeniny náležející k této skupině mají A jímž je alkyl, substituovaný alkyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl se substituovanou fenylovou nebo alkylovou část. R je s výhodou: a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) aminoalkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z aminoalkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části. Výhodné sloučeniny této skupiny mají R' jímž je alkyl, substituovaný alkyl, fenyl, substituovaný fenyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo alkylovou část.
Sloučeniny patřící ktéto skupině jsou zveřejněny v maďarském patentu HU 1756/75 (podaném 15. června 1995). Mohou být připraveny acylací hydroxylaminu majícího strukturu 6 nebo strukturu 12 s chlormravenčanem majícím strukturu 14, podobným způsobem jako s jednoduchým chloridem kyseliny, jak je popsáno pro syntézu sloučenin struktury II, kde Z je kovalentní vazba a X je kyslík. Reakce vyžaduje přítomnost báze, anorganické nebo organické, a může se provádět v inertním rozpouštědle, např. chloroformu. Vedlejší produkt, sůl, se odstraní např. extrakcí vodou a produkt se izoluje z organického roztoku.
- 12CZ 295562 B6
V ještě jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury II je Z kyslík, X je =NR4, kde R4 je alkyl, substituovaný alkyl, fenylalkyl, fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část, fenyl, substituovaný fenyl, heteroarylová nebo substituovaná heteroarylová skupina. V těchto sloučeninách je A s výhodou alkyl, substituovaný alkyl, fenyl, substituovaný fenyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl se substituovanou fenylovou nebo alkylovou částí, a R je s výhodou aminoalkyl, jenž vhodně obsahuje hydroxy- nebo acyloxyskupinu v alkylovém řetězci, přičemž alkylový řetězec řečené aminoalkylové skupiny s výhodou obsahuje 3-8 uhlíkových atomů. V těchto sloučeninách je R' s výhodou alkyl, fenyl nebo fenylalkyl, kteréžto skupiny mohou být nesubstituované nebo substituované.
Tyto sloučeniny jsou N-substituovanými analogy hydroxylaminových derivátů struktury I, kde Z je kyslík a X je NR*R2, a mohou být připraveny podobně z halogenformimidátů struktury 9 a chemické sloučeniny mající strukturu 12, v přítomnosti organické báze (např. triethylaminu) nebo anorganické báze, jako je uhličitan sodný, v inertním rozpouštědle, jako je benzen, tetrahydrofuran, atd., s následnými standardními postupy zpracování a čištění.
V jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury II je Z =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, fenylu, substituovaného fenylu, feny laiky lu nebo feny laiky lu mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část, a X je kyslík. Výhodné sloučeniny této skupiny mají A, jímž je: a) fenylalkyl nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou část, s výhodou fenylalkyl nebo fenylalkyl obsahující jeden nebo více substituentů, s výhodou alkoxy, b) fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodou obsahující jednu nebo více alkylových, halogenalkylových nebo nitroskupin, c) N-obsahující heteroarylová skupina, s výhodou pyridyl, d) S-obsahující heteroarylová skupina. Výhodné sloučeniny náležející ktéto skupině mají jako R: a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) aminoalkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z aminoalkylových skupin a) až d) jsou obzvlášť výhodné ty, jejichž alkylové skupiny mají 3-8 uhlíkových atomů. V těchto sloučeninách je R' s výhodou vodík, alkyl, substituovaný alkyl, fenyl nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část, fenyl nebo substituovaný fenyl, acylová nebo substituovaná acylová skupina.
Tyto sloučeniny jsou zveřejněny v současné podané maďarské patentové přihlášce HU 1756/95 a mohou být připraveny reakcí hydroxylaminové sloučeniny mající strukturu 6 nebo strukturu 12 s izokyanátem majícím strukturu 15, v inertním organickém rozpouštědle, obvykle prostým mícháním za pokojové teploty po 2 - 24 hodin. Konečně: Produkty se izolují - po odpaření rozpouštědla - s výhodou pomocí krystalizace.
V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminových derivátů struktury II je Z =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, fenylu, substituovaného fenylu, feny laiky lu nebo feny laiky lu mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část, X je =NR4, kde R4 je H, alkyl, substituovaný alkyl, fenyl, substituovaný fenyl, fenylalkyl, fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část, cykloalkyl, a R' je alkyl, substituovaný alkyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo substituovanou alkylovou část, fenyl nebo substituovaný fenyl. Výhodné sloučeniny patřící k této skupině mají jako R3 vodík, alkyl nebo substituovaný alkyl, R4 je vodík nebo fenylová skupina, A je alkyl, substituovaný alkyl, fenyl nebo fenylalkyl, jenž může mít substituovanou fenylovou a/nebo alkylovou část. Z těchto sloučenin jsou výhodné ty, jež mají jako R: a) aminoalkyl, b) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) aminoalkyl mající substituovanou alkylovou část, d) aminoalkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z aminoalkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části.
-13CZ 295562 B6
Přípravu sloučenin patřících ktéto skupině lze provádět aminolýzou odpovídajících izomočovinových derivátů (sloučenin majících strukturu II, kde Z je kyslík a X je NR4) s primárním nebo sekundárním aminem nebo amoniem. Tato reakce se provádí s výhodou v polárním rozpouštědle, např. vodě nebo ethanolu, s použitím přebytku aminu. Alternativně mohou být halogenformamidy struktury 10 ponechány reagovat se sloučeninami struktury 12, v přítomnosti organické nebo anorganické báze v inertních rozpouštědlech, obvykle za jejich bodu varu. Jedno neomezující provedení hydroxylaminových derivátů struktury I definuje novou skupinu sloučenin, kde X je halogen, s výhodou chlor nebo brom, Z je chemická vazba a A je skupina obecného vzorce (a), kde Y1 je halogen-, alkoxy- nebo nitroskupina, nebo halogenalkylová skupina, s výhodou halogenalkyl obsahující 1 - 4 uhlíkové atomy, a n je 1, 2 nebo 3; nebo O-obsahující heteroaryl, s výhodou furyl, S-obsahující heteroaryl (s výhodou thienyl), N-obsahující heteroaryl (s výhodou pyridyl, chinolyl nebo izochinolyl), jenž může být kondenzován s benzenovým kruhem a R je skupina mající strukturu (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Cm alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, brané dohromady s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -OR7, kde R7 je H nebo acylová skupina, s výhodou alkyl karbonyl, substituovaný alkylkarbonyl, fenylkarbonyl, substituovaný fenylkarbonyl, aminoacyl nebo substituovaný aminoacyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je pyridyl nebo skupina obecného vzorce (a), kde Y1 je halogen nebo alkoxy, pak R7 je jiné než H. Tyto sloučeniny mohou případně obsahovat jako A N-obsahující heteroaromatickou skupinu sN-kvartémím Ci_4 alkylem nebo oxid řečené N-obsahující heteroaromatické skupiny a/nebo R, kde kruh tvořený koncovými skupinami R6 a R7 je Nkvartérní nebo N-oxidovaný nasycený heterocyklický kruh. Výhodně mezi těmito sloučeninami jsou ty, jejichž A je skupina struktury (a) a kde Y1 je trifluormethyl. Tato skupina hydroxylaminových derivátů obecného vzorce I rovněž zahrnuje stereoizomery sloučenin, kde X je halogen, A je pyridyl, Z je chemická vazba a R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, brané dohromady s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y je -OR7, kde R7 je aminoacyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1,2 nebo 3.
Tyto nové sloučeniny lze připravovat s použitím postupů analogických těm, jež jsou popsány v US patentech č. 5 147 879, 5 328 906 a 5 296 606. Například:
a) Deriváty, kde jak R5 a R6 jsou jiné než vodík, se připravují diazotací odpovídajících NH2 derivátů (hydroxylaminových derivátů struktury I, kde Z je kovalentní vazba a X je NH2) v přítomnosti patřičného halidu vodíku, podobně jako v postupech popsaných v US patentech č.5 148 879, 5 328 906 a 5 296 606. Výchozí sloučeniny lze získat též známým postupem popsaným např. v maďarském patentu HU 177578, jmenovitě spojením amidoximu majícího strukturu 1, kde R1 a R2 struktury 1 jsou H, s např. reaktivním derivátem struktury 2 v přítomnosti báze, a lze je diazotovat obvykle bez izolace a čištění.
b) Když v žádané struktuře R7 je H a m je 1, syntézu lze provést reakcí oxiranu majícího strukturu 3 a aminu majícího strukturu 4. Tento postup lze použít rovněž pro syntézu R5=H derivátů.
c) Sloučeniny, kde R je skupina struktuiy (b) a kde R7 této skupiny je acylová skupina, se připravují esterifikací odpovídajících R7=H derivátů. Alkyl- nebo fenylestery se obvykle získávají s chloridem nebo anhydridem kyseliny v přítomnosti terciárního aminu nebo anorganické báze, s výhodou v inertním rozpouštědle, nebo v některých případech SchottenBaumanovým postupem s použitím vodné anorganické báze v dvoufázovém systému. Pro přípravu aminoacylesterů se jako činidla použijí karboxy-aktivované N-chráněné aminokyselinové deriváty (např. aktivní estery), v postupech zásadně známých z peptidové chemie. Tato kondenzace rovněž vyžaduje přítomnost báze (např. triethylaminu). Izolace a čištění daných
-14CZ 295562 B6 produktů se provádějí s použitím standardních preparativních technik: konečný preparát má často formu soli s patřičnou anorganickou nebo organickou kyselinou. U výchozích chirálních aminokyselin jsou dané produkty často diastereoizomery, jež mají druhé chirální centrum v R skupině. V průběhu izolace se tyto diastereoizomery často rozdělují a produkt lze získat ve stericky čisté formě.
Sloučeniny, mající strukturu I, kde Z je chemická vazba, X je halogen-, s výhodou chlor nebo brom, A je skupina obecného vzorce (c) a R je skupina obecného vzorce (d), jeden nebo oba z Y2 a Y3, z nichž alespoň jeden musí být v molekule přítomný, jsou kyslík, nebo alkyl nebo substituovaný alkyl mající 1-4 uhlíkové atomy a k je 1, 2 nebo 3 a m je 1, 2, nebo 3; Y2 a Y3 jsou připojeny tečkovanou čárou, což znamená případnou přítomnost těchto substituentů, jsou rovněž nové hydroxylaminové deriváty. Když je daná sloučenina mono- nebo bivalentní kationt, jejími anionty jsou jeden nebo dva halidy, s výhodou jodové ionty.
Tyto hydroxylaminové deriváty se připravují chemickými modifikacemi (tj. N-oxidací nebo kvartemarizací) koncové pyridinové a/nebo piperidinové skupiny v jejich nesubstituovaných prekurzorech. Pro oxidaci se používají s výhodou perkyseliny, např. substituované kyseliny perbenzoové, v inertních rozpouštědlech (např. chloroformu, dichlormethanu). Když jsou v molekule přítomné obě oxidovatelné skupiny, mohou se tvořit mono- a dioxidy v závislosti na množství použitého činidla. Na konci reakce se přebytek činidla rozloží a produkt se izoluje odpařením. Kvarternarizaci lze provést s alkylhalidy (např. methyljodidem), s výhodou s refluxováním činidla ve vhodném rozpouštědle např. acetonu. Produkt je často nerozpustný v prostředí a může být izolován jednoduchou filtrací.
Ještě jinou novou skupinou sloučenin, patřící k hydroxylaminovým derivátům, majícím strukturu I, jsou ty, jejichž Z je chemická vazba, A je fenylalkyl, substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, jenž může mít jednu nebo více alkoxy skupin, s výhodou alkoxy mající 1 až 4 uhlíkové atomy, fenyl, substituovaný fenyl mající jeden nebo více substituentů, přičemž výhodné substituenty zahrnují alkyl, s výhodou alkyl nebo halogenalkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy, halogen-, acylamino- nebo nitroskupina, nebo N-obsahující heteroarylová skupina, jež může být kondenzována s benzenovým kruhem, s výhodou pyrrolyl, pyridyl, izochinolyl nebo chinolyl, nebo síru obsahující heteroaromatická skupina, s výhodou thienyl, přičemž dané heteroarylové skupiny mohou být substituovány jedním nebo více alkyly, s výhodou alkyly majícími 1 až 4 uhlíkové atomy; X je -NR'R2, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou alkyl mající 1 až 6 uhlíkových atomů, cykloalkyl, nebo R1 a R2, brané dohromady s dusíkovým atomem k nim připojeným, mohou tvořit nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až Ίčlenný nasycený heterokruh; R je skupina struktury (e), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou alkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, brané dohromady s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterokruh, jenž může obsahovat další heteroatomy a substituenty, přičemž substituentem je s výhodou alkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy; Y4 je H nebo alkyl nebo substituovaný alkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy, Y5 je alkyl nebo substituovaný alkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy, nebo OR7, kde R7 je H nebo acyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je fenyl, jenž je nesubstituovaný nebo substituovaný halogenem nebo alkoxy, nebo fenylalkyl substituovaný alkoxy, nebo pyridylová skupina a R7 je H, pak alespoň jeden z R1 a R2 je jiný než H, nebo když A je fenyl, jenž je nesubstituovaný nebo substituovaný halogenem nebo alkoxy, fenylalkyl substituovaný alkoxy, nebo pyridylová skupina, a R1 a R2 jsou oba H, pak R7 je jiný než H.
Sloučeniny, kde X je NH2 derivát, se připravují - podobně jako ve shora zmíněném postupu reakcí odpovídajících intermediátů majících strukturu 1, kde R1 a R2 struktury 1 jsou H, se sloučeninou mající strukturu 2. Alkylační činidlo (mající strukturu 2) může obsahovat
- 15CZ 295562 B6 hydroxylové a/nebo aminové substituenty. Reakce vyžaduje přítomnost anorganické nebo organické báze, a ve výhodném způsobu se používá alkoholový roztok alkoholátů jako médium a báze. Produkt se často izoluje ve formě soli s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou.
Jiná skupina shora uvedených nových sloučenin je charakterizována tím, že u těchto derivátů jsou z R1 a R2 jeden nebo oba jiné než H. Takovéto struktury lze připravit dvěma cestami.
a) Amidoxim mající strukturu 1, jenž již obsahuje žádané substituenty R1 a/nebo R2, může reagovat s reaktivní sloučeninou struktury 2, podobně jako v postupu popsaném v předešlém paragrafu. Substituované amidoximy o struktuře 1, používané jako výchozí materiály, jsou známé z literatury [Chem. Rev. 62, 155-183 (1962)].
b) Substituce halogenových atomů ve sloučeninách majících strukturu I, kde Z je kovalentní vazba a X je halogen, aminem o struktuře 5 může také vést k podobným sloučeninám. V případě derivátů, nesoucích OH substituent v R skupině (Y4=OH), se musí tato hydroxylové skupina předem chránit a po substituční reakci deprotektovat, jinak je upřednostňován cyklický derivát o struktuře I'. Pro chránění se ukázaly nejuspokojivější chránící skupiny acetylového typu, např. tetrahydropyranylová skupina. Chránění se provede reakcí nechráněné sloučeniny s dihydropyranem, s následným vytěsněním halogenu/aminu, což obvykle vyžaduje refluxování v rozpouštědle, např. alkoholu. Deprotekce produktu může být nakonec provedena kyselým působením např. vařením ethanolového roztoku v přítomnosti např. kyseliny 79-toluensulfonové.
Jak je již zmíněno, jedna skupina nových sloučenin zahrnuje též ty, kde Y5 je alkoxylová skupina. Mohou být připravovány acylací odpovídajících Y5=OH derivátů, jež jsou buď známy z literatury (např. maďarského patentu č. 177578) nebo popsány v tomto vynálezu. Reakce může být provedena stejně jako ta, co je popsána u halogen derivátů, kde R7 je acylová skupina (způsob c)).
Nové hydroxylaminové deriváty struktury I zahrnují rovněž ty, kde Z je kyslík nebo =NR3 skupina, kde R3 je nesubstituovaná nebo substituovaná alkylová skupina, X je -NR*R2, R1 a R2 nezávisle na sobě jsou vodík, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, nebo R1 a R2, když jsou brány spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, jenž případně obsahuje jeden nebo více dalších heteroatomů. V těchto sloučeninách A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo substituovaná fenylová skupina, nebo nesubstituovaná nebo substituovaná fenylalkylová skupina, a R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Cjm alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu sN-atomem knim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -OR7, kde R7 je acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo fenylkarbonyl, k je 1,2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Nové hydroxylaminové deriváty, kde Z je kyslík a X je OR, kde Q je nesubstituovaná nebo substituovaná alkylová skupina, nebo nesubstituovaná nebo substituovaná fenylalkylová skupina, A je nesubstituovaná nebo substituovaná alkoxylová skupina, nebo nesubstituovaná nebo substituovaná fenylalkylová skupina, a R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -OR7, kde R7 je acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo fenylkarbonyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3, spadají rovněž do rozsahu sloučenin obecného vzorce I.
-16CZ 295562 B6
Jiná skupina nových hydroxylaminových derivátů struktury I je představována těmi, kde A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nebo N-obsahující heteroaromatická skupina, s výhodou pyridyl, nebo S-obsahující heteroaromatická skupina, Z je chemická vazba, X je - OQ, kde Q je C]_4 alkyl a R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný heterocyklický kruh, Y6 je H, k je 1,2 nebo 3, a m je 1,2 nebo 3.
Tyto sloučeniny se připravují reakcí odpovídajících hydroxylaminových derivátů obecného vzorce I, kde X je halogen, a odpovídajících alkoholátů, s výhodou v alkoholu odpovídajícím alkoholátu, s výhodou za refluxování. Reakční směs se zpracuje způsoby známými v oboru, a produkt se izoluje chromatografií nebo vytvářením soli.
Nové hydroxylaminové deriváty obecného vzorce II rovněž zahrnují skupiny sloučenin, kde X je kyslík, A je C]_2o přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo halogenfenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl nebo N-obsahující heteroaromatická skupina, s výhodou pyridyl, Z je chemická vazba, R' je H, Cm alkyl nebo fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až
7-členný heterocyklický kruh. Y6 je H nebo -OR7, kde R7 je H, kje 1,2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je jiné než alkyl a R' je H, pak Y6 je H.
Nové sloučeniny, kde Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR3 skupina, kde R3 je vodík nebo nesubstituované nebo substituovaná alkylová skupina, X je =NR4, kde R4 je vodík, nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenylová skupina, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, spadají rovněž do rozsahu sloučenin obecného vzorce II. V těchto sloučeninách je A nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C]_4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je H nebo -OR7, R7 je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo fenylkarbonyl, kje 1,2 nebo 3, a mje 1,2 nebo 3.
Novými hydroxylaminovými deriváty obecného vzorce II jsou rovněž ty, kde X je kyslík, A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, Z je kyslík, R' je alkyl nebo fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je H nebo -OR7, R7 je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo fenylkarbonyl, kje 1,2 nebo 3, a mje 1,2 nebo 3.
Hydroxylaminové sloučeniny obecného vzorce II, kde X je kyslík a Z je =NH jsou rovněž novými sloučeninami.
Jedna skupina těchto sloučenin je tvořena těmi, kde A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, cykloalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný halogenem, alkylem, halogenalkylem, alkoxy nebo nitro, R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je H nebo -OH, kje 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
-17CZ 295562 B6
Jiná skupina těchto sloučenin je tvořena těmi, kde A je skupina struktury (a) a kde Y1 je halogenalkyl, s výhodou trifluormethyl a n je 1, 2 nebo 3, R’jeHaRje skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány spolu sN-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je H nebo -OH, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Nové hydroxylaminové deriváty podle vynálezu rovněž zahrnují cyklické sloučeniny obecného vzorce I, kde A je nesubstituovaný fenyl, fenyl substituovaný halogenem nebo nitro, nebo N-obsahující heteroaryl, R1 je H, a R je aminoalkylová skupina mono- nebo disubstituovaná na aminoskupině, jejíž alkylový řetězec má 1 - 5 uhlíkových atomů, a dané amino substituenty, nezávisle na sobě, mohou být jedním nebo dvěma přímými nebo větvenými alkyly nebo cykloalkyly, nebo dané dva amino substituenty, spolu s N atomem k nim přilehlým tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, nebo jeho Ci_4 alkyl N-kvartérní derivát, s výhradou, že když A je 3-pyridyI, R je jiný než 1-piperidinylmethyl.
Způsoby zvýšení exprese molekulárních chaperonů v buňkách
Tento vynález se týká způsobu zvyšování exprese molekulárních chaperonů v buňkách pomocí působení účinného množství hydroxylaminového derivátu na buňky a tkáně. Pro tento způsob se dají používat hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II. Struktury obecných vzorců I a II jsou podrobně rozebrány v předcházející části.
V jednom neomezujícím provedení vynálezu je poskytnout způsob zvýšení exprese molekulárních chaperonů v buňkách vystavených stresu. U tohoto způsobu se na buňky vystavené fyziologickému stresu, jenž vyvolává expresi molekulárních chaperonů buňkami, působí účinným množstvím hydroxylaminových derivátů, jejichž tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II. Hydroxylaminové deriváty zvyšují expresi molekulárních chaperonů v těchto buňkách nad množství indukované daným fyziologickým stresem.
V jiném neomezujícím provedení vynálezu se na buňky působí hydroxylaminovými deriváty předtím, než jsou vystaveny fyziologickému stresu. Hydroxylaminové deriváty zvyšují expresi molekulárních chaperonů nad množství indukované daným fyziologickým stresem.
Výraz „molekulární chaperon“, jak se zde používá, odkazuje na bílkovinu, jež pomáhá jiným bílkovinám ve skládání do správných nebo aktivních struktur, obvykle nekovalentní vazbou k těmto bílkovinám. Chaperony pomáhají nejen opravě a nápravě bílkovin, jež jsou nově syntetizovány, nebo denaturovány, ale i těch, jež jsou denaturovány nebo špatně složeny.
Molekulární chaperony zahrnují mezi jiným bílkoviny tepelného šoku (hsp), z nichž hsp70 a hsp72 mají zvláštní význam ve spojení s tímto vynálezem, jakož i bílkovinu (BiP) vážící těžký řetězec IgG a glukózou regulované bílkoviny (grp). Příklady hsp a grp zahrnují, ale bez omezení, ty jež patří k následujícím třídám: hsp70, hsp60, hsp90, grp94, grp80 a hsp27.
Eukaryotické buňky, na něž se působí hydroxylaminovými deriváty jsou s výhodou savčí buňky, výhodněji lidské buňky. Výraz „eukaryotické buňka“ odkazuje jak na eukaryotické buňky, jež jsou in vitro (buňky, jež jsou mimo živý organizmus, např. za kultivačních podmínek), tak in vivo (buňky, jež jsou uvnitř živého organizmu, např. buňky tvoří tkáně a orgány).
Z eukaryotických buněk živého organizmu se s výhodou působí v souladu s vynálezem na neurony, svalové buňky, buňky cévní stěny, obzvláště endothelové buňky, epithelové buňky a buňky imunitního systému. S výhodou se působí v souladu se způsobem podle vynálezu rovněž na rostlinné buňky, včetně buněk živého rostlinného organizmu.
-18CZ 295562 B6
Pod výrazem „fyziologický stres“, jak se zde používá, se mají rozumět stavy působící na buňku, jež vyvolávají „odezvu buňky k stresu“, např. syntézu bílkovin chaperonů. Fyziologické stresy zahrnují faktory, jež způsobují poškození buněk nebo narušují homeostatickou rovnováhu buněk. Jsou jimi například metabolické, oxidativní, lokálně-mechanické stresy, nebo stresy způsobované hypoxií, ischemií, tepelným šokem, radiací nebo toxickým materiálem. Důležitá forma metabolického stresuje způsobována diabetem mellitus.
Jiná důležitá vyskytující se forma fyziologických stresů zahrnuje stresy vedoucí k tvorbě volných radikálů nebo zvýšení množství cytokinů v buněčném prostředí. Poškození buněk, jež jsou spojena s různými patologickými stavy, poskytují příklady fyziologických stresů.
V jednom neomezujícím provedení vynálezu fyziologický stres, jenž indukuje buňky k expresi molekulárních chaperonů, je odezvou k fyziologickým stresům vedoucím ke kardiovaskulárním, vaskulárním, mozkovým, alergickým, imunitním, autoimunitním chorobám, virovým a bakteriálním infekcím, chorobám kůže a sliznice, nebo chorobám ledvinových kanálků epithelového původu nebo způsobujícím stavy, jež mají být léčeny kosmetickou intervencí.
Takovéto kardiovaskulární choroby zahrnují nejvýhodněji aterosklerózu vyvolanou fyziologickým stresem, koronární choroby, nebo kardiovaskulární choroby způsobené hypertonií nebo pulmonámí hypertonií.
Charakteristickými mozkovými chorobami jsou, mimo jiné, ty, jež jsou způsobeny cerebrovaskulární ischemií, vyvolanou fyziologickým stresem, mrtvice, traumatická poranění hlavy, senilní neurodegenerativní onemocnění, obzvláště senilní demence, AIDS demence, alkoholická demence, Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba nebo epilepsie.
Charakteristické choroby vyvolané onemocněním kůže nebo sliznice jsou dermatologické choroby nebo ulcerální choroby gastrointestinálního systému.
Při shora uvedených chorobách fyziologický stres indukuje expresi molekulárních chaperonů v buňkách, ale tento účinek není dostatečný pro ochranu proti poškozování buněk chorobou. Léčba shora uvedenými hydroxylaminovými deriváty, jež je spojena se zvýšením exprese chaperonů nebo zvýšením jejich aktivity, umožňuje eliminaci strukturálních odchylek způsobovaných chorobou, a tedy regeneraci buněk.
V jednom neomezujícím provedení vynálezu je fyziologickým stresem tepelný šok nebo vystavení buněk neobvykle vysoké teplotě. V jiném neomezujícím provedení vynálezu je fyziologickým stresem buněčné poškození spojené s ischemií. Ischemická léze buněk, obzvláště srdečního svalu a mozkových buněk, je způsobována kardiovaskulárními poruchami, způsobovanými cévní okluzí nebo rupturou, jako jsou srdeční a mozková trombóza, nebo vaskulární okluzí, mrtvicí, embolií, nebo chronickými vaskulámími spasmaty. Ischemie vyvolává „odezvu buněk ke stresu“, jež vede ke zvýšenému množství hsp, jenž pak zase chrání dané buňky před škodlivými účinky ischemie (Mestril, R. et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 27 45 (1995)).
Při působení účinného množství hydroxylaminových derivátů na tyto buňky může být molekulární exprese chaperonů v buňkách zvýšena nad množství indukované ischemickým stavem a rovněž může být zvýšena aktivita molekulárních chaperonů.
Ve spojitosti s touto záležitostí: Když se vyjímá ze zvířete orgán k transplantaci, takovéto vynětí je fyziologickým stresem způsobujícím poškození buněk tvořících tento orgán, což indukuje expresi chaperonů. V takovémto případě podávání hydroxylaminových derivátů před vynětím orgánu nebo po něm může zvýšit množství chaperonů produkovaného buňkami nebo jeho aktivitu, a tedy poskytovat cytoprotektivní účinek.
-19CZ 295562 B6
Neuronální poškození mohou být indukována vedle ischemie rovněž mnohými jinými stresy, což indukuje produkci molekulárních chaperonů v neuronálních buňkách. Navíc excitotoxická neuronální poškození rovněž indukují produkci molekulárních chaperonů neuronálními buňkami, a jsou zahrnuta do pojmu „fyziologický stres“.
V ještě jiném příkladu tohoto vynálezu je fyziologický stres poskytován toxickými mediátory zánětů, jako jsou oxidativní radikály a cytokiny, jako je TNF, jež jsou produkovány makrofágy. U buněk vystavených zvýšenému množství těchto toxických mediátorů bylo prokázáno, že exprimují zvýšené množství hsp, jenž pak zase chrání tyto buňky před toxicitou (Kantengwa, S. et al., Semin. Immun. 3: 49-56 (1991)). Různá zánětlivá onemocnění, včetně pulmonárních zánětlivých stavů, jako je šokový syndrom dospělých, indukují expresi hsp buňkami, a ten pak vykazuje cytoprotektivní účinek (Jacquier-Salin, M. R. et al., Experientia 50: 1031-1038 (1994)). Když je množství molekulárních chaperonů v buňkách zvýšeno nad množství indukované TNF a reaktivními formami kyslíku, buňky mohou být lépe chráněny před těmito cytotoxickými faktory a lépe umožňovat nápravu poškození jimi způsobovanou.
Faktory ovlivňující fyziologický stav buněčných membrán, včetně membránové fluidity, rovněž poskytují příklady fyziologického stresu. Zvýšení exprese molekulárních chaperonů v těchto buňkách nad expresi indikovanou narušením fyziologického stavu buněčných membrán může poskytnout lepší ochranu a rovněž dovolí buňkám nápravu buněčných membrán.
Spojení „účinné množství hydroxylaminových derivátů“, jak se zde používá ve spojení se zvýšením exprese molekulárních chaperonů v buňkách pod fyziologickým stresem, nebo v buňkách, jež mohou být následně vystaveny fyziologickému stresu, odkazuje na množství, které zvýší expresi molekulárních chaperonů nad hladinu indukovanou fyziologickým stresem samotným. Takovéto množství může být snadno stanoveno tím, kdo je zběhlý v oboru. S výhodou pro buňky in vitro je účinné množství mezi 10“6 - 10“3M. Výhodněji je účinné množství mezi 10“6 - 5 x 104 M.
Při podávání zvířeti se účinné množství liší v závislosti na různých faktorech, jako je způsob podávání, ale stanovení rozsahu účinnosti spadá pod znalostí zběhlých v oboru a nebude vyžadovat zbytečné experimentování. Například: když se hydroxylaminové deriváty podávají intravenózně, účinné množství je s výhodou mezi 0,1 - 10 mg/kg tělesné hmotnosti, výhodněji 0,5 - 2,0 mg/kg tělesné hmotnosti, když se podávají orálně je účinné množství s výhodou mezi 10 - 500 mg/kg tělesné hmotnosti, výhodněji 50- 100 mg/kg tělesné hmotnosti.
Zvýšení exprese molekulárním chaperonů v buňkách lze detekovat s použitím dobře zavedených laboratorních postupů, jako jsou postupy „Northern“ a „Western“ analýzy.
Příklad techniky „Western“ analýzy, jenž lze použít, je dán následovně: Buňky se kultivují in vitro při 37 °C Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) doplněném 10% fetálního telecího séra (GIBCO), v 5 % CO2. Hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, mohou být přidávány do tkáňové kultury, například 10-5 M sloučenina je podávána buňkám 16 hodin před fyziologickým stresem, nebo po určitém časovém období následně po fyziologickém stresu. Koncentrace hydroxylaminového derivátu jakož i čas podávání této sloučeniny se však mohou měnit podle žádoucího experimentálního uspořádání.
Šest hodin po tepelném šoku se buňky promyjí dvakrát ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS) a pak seškrabou z povrchu kultivačních misek v PBS. Pak se buňky stočí po 5 minut při 1500 rpm a vezmou do 100 μΐ modifikovaného solubilizačního pufru (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) obsahujícího 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Triton N-100, 1 mM PMSF, 2 mg/ml aprotininu, 1 pg/ml chymostatinu, a sonikují 3 x po 20 sekund (2 min intervaly, nastavení 8).
-20CZ 295562 B6
Koncentrace bílkovin se pak stanoví z 5 μΐ vzorků stanovením Bradfordové (Μ. M. Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976)) ve třech paralelách. Vzorky se nastaví na koncentraci bílkoviny 100 pg/30 μΐ pomocí pufru uvedeného shora a dalšího pufru tak, že konečná koncentrace složek v tomto pufru bude: 110 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoethanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a něco bromfenolové modři; pak se třepe při teplotě místnosti po 30 minut. Vzorky takto získané lze použít ke gelové elektroforéze.
Když se zesilující účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu zkouší na buňkách in vivo, aplikuje se fyziologický stres na zvíře, např. ischemie nebo STZ-indukovaný diabetes. V případě ischemie lze myokardiální ischemii ve zvířeti indukovat tak, jak je popsáno v příkladě 8, a diabetický stav lze indukovat tak, jak je popsáno v příkladě 10. Hydroxylaminový derivát podle vynálezu může být zvířeti podáván před vystavením fyziologickému stresu, v průběhu stresu nebo potom. Jak se uvedlo dříve, načasování podávání lze měnit podle experimentálního uspořádání.
Následující kroky přípravy bílkovin z relevantních tkání zvířete po takovémto působení se provádějí při 0 - 4 °C. Tkáně, jako je jaterní tkáň (kolem 15-20 g), se homogenizují v domácím mixéru po 2 min v 80 ml lyzačního pufru obsahujícího 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100 a 1 mM proteázové inhibitory (PMSF, benzamidin, kyselinu aminokapronovou). Homogenát se pak centrifugu) í při 20 000 x g po 30 min v centrifuze Sorvall RC28S.
Koncentrace bílkovin se pak v preparaci stanoví stanovením Bradfordové a nastaví na 5 mg/ml. Vzorky obsahující 1,8 mg bílkoviny se před gelovou elektroforézou solubilizují s 0,6 ml pufru obsahujícího 110 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoethanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a něco bromfenolové modři, a třepou se při teplotě místnosti po 30 minut.
Vzorky bílkovin získané z tkáňových kultur nebo zvířecích tkání, jak se oba typy popisují shora, se použijí k elektroforéze a následnému imunoblotu (oba postupy jsou v oboru dobře známy a jsou podrobně popsány v Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratoiy Press (1989), Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane, 3. laboratorní manuál, Millipore, a U. K. Laemmli, Nátuře 227: 680-685 (1970).
Například: elektroforézu lze provádět podle Laemmliho (U. K. Laemmli, Nátuře 227: 680-685 (1970)) na 8 - 18 % polyakrylamidovém gelu při konstantním napětí 50 V přes noc. Bílkoviny se pak vybarví s Coomassie Brilliant Blue R-250 nebo přenesou na Immobilone PVDF/Millipore) při konstantním proudu (300 mA) po 3 hodiny při 4 °C v přenosovém pufru (10 mM CAPS, pH 11, 10 % methanol) (Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane, 3. laboratorní manuál, Millipore). Po přenosu se zablokují nespecifická místa membrány 2 % bovinním sérovým albuminem (BSA) v TPBS (fosfátem pufrovaný solný roztok obsahující 0,1 % Tween 20) při 4 °C přes noc. Membrána s přeneseným materiálem může být pak inkubována s protilátkou specifickou k molekulárnímu chaperonu, např. GRP94 monoklonální protilátkou (SPA-850, StressGen), zředěnou 1:3000, HSP60 monoklonální protilátkou (SPA-600, StressGen), zředěnou 1:2700, HSP72 monoklonální protilátkou (C9F34-5, StressGen), zředěnou 1:1250, nebo HSP90 monoklonální protilátkou (AC88, StressGen), zředěnou 1:2000, po 1 hodinu při teplotě místnosti. Pak se membrána promyje s TPBS pufrem po jednu hodinu, a inkubuje po další 1 hodinu s anti-potkaní (Sigma, 1:4000 zředění, pro grp94) resp. anti-myší (Sigma, adsorbovaná s lidskými a potkaními bílkovinami, 1:3000 zředění, pro Hsp60, HSP72 nebo HSP90) sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. Po následném mytí s TPBS se membrána vyvíjí s ECL (zesíleným chemiluminiscenčním) systémem (Amersham).
Změny v obsahu stresových bílkovin lze kvantifikovat s použitím denzitometru Bio-Rad (Model 1650) a integrátoru Hewlett-Packard (HP 3394 A). Připraví se diluční série z bílkovinných
-21 CZ 295562 B6 roztoků obsahujících známé množství chaperonu, postup jako shora se zopakuje s danými ředěními, a koncentrace chaperonu v testovaném vzorku se stanoví z kalibrační křivky, získané z dilučního testu.
„Northern“ hybridizace je jiným experimentálním postupem dostupným pro stanovování hladiny zvyšování molekulárních chaperonů (pomocí měření hladiny mRNA) hydroxylaminovými deriváty podle vynálezu. Buňky nebo tkáně lze získávat tak, jak je popsáno v souvislosti s postupem „Western“ analýzy. Celkovou RNA z těchto buněk nebo tkání lze extrahovat s použitím RNAgents (Promega) podle instrukcí výrobce (Protocols and Applications, 2. vydání, 1991, Promega Corporation). Zmrzlé vzorky tkání (kolem 50 až 100 mg) se homogenizují v 1,0 denaturujícím 4 M guanidin thiokyanátu, 42 mM citrátu sodném, 0,83 mM β-merkaptoethanolu, 0,1 % Nonidetu P-40 při 4 °C (Brinkmanova homogenizace). Pak se přidá 1/10 objemu 3 M octanu sodného/pH 4,0) a homogenát se extrahuje kyselým fenolem (fenol:chloroform:izoamylalkohol 25:24:1) vortexováním po 10 sekund. Vzorek se inkubuje na ledu po 15 minut, a pak centrifuguje (4 °C, 20 min, 10 000 x g). Vodná fáze se pak přenese do nových Eppendorfových zkumavek, postup se opakuje a vodná fáze se srazí při -20 °C přes noc stejným objemem izopropanolu. Po centrifugaci (4 °C, 20 min, 10 000 x g) se precipitát promyje dvakrát 95 % alkoholem a vysuší za teploty místnosti. RNA se rozpustí v 20 μΐ vody zpracované s diethylpyrokarbonátem (DEPC) a koncentrace se změří spektrofotometricky při 260-280 nm. Osm pg celkové RNA se podrobí kapilárnímu přenosu na formaldehyd-agarózovém gelu, RNA z gelu se přenese na nylonovou membránu podle instrukcí výrobce (Zeta-Probe GT, BioRad).
U jednotlivých vzorků se obsah mRNA molekulárního chaperonu porovnává s hladinou mRNA glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázového (GAPDH) genu ve vzorku. cDNA sondy (například lidská hsp70 cDNA plné délky, když sondovanou mRNA je hsp70, a Apa-Ncol fragment potkaní GAPDH cDNA) jsou značeny alfa-32P CTP s použitím soupravy Random Prime DNA Labeling Kit (USB). Radioaktivně značené fragmenty se purifíkují na koloně Sephadexu G-50 (Pharmacia) jak je popsáno (Ausubel et al., vyd.: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987).
Prehybridizace se provádějí při 65 °C v H-pufru (0,25 M Na2HPO4, pH 7,2, 7 % SDS) po 15 minut. Hybridizace se provádějí přes noc (65 °C, H-pufr) s izotopově značenou cDNA sondou o alespoň 106 cpm/ml. Membrána se pak promyje s 20 mM Na2HPO4, pH 7,2, 5 % SDS (65 °C, 2x 15 min) a hodnotí autoradiografií. Tatáž se použije k sondování hsp70 mRNA a měření GAPDH mRNA, používané jako vnitřní standard.
Tento vynález dále zahrnuje způsob léčby nebo prevence různých patologických stavů, například chorob spojených s fungováním chaperonového systému a s poškozeními v buněčných membránách a membránách buněčných organel, pomocí podávání účinného množství hydroxylaminových derivátů, jejichž tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, ke kontrole patologických stavů v organizmu. V patologických stavech je v buňkách indukována charakteristická exprese molekulárních chaperonů. Zvýšená exprese molekulárních chaperonů v těchto buňkách jim může napomáhat v nápravě poškození, způsobovaných patologickými stavy, a rovněž při obnovování buněčné homeostatické rovnováhy.
Takovéto patologické stavy zahrnují ischemii, nádorová onemocnění, infekce způsobované mikroorganizmy, autoimunitní onemocnění a dermatózy.
Jak se zde používá, „léčba“ znamená zlepšování klinického stavu subjektu, a nutně neindikuje, že by se dosahovalo úplného vyléčení. Zlepšování odkazuje na zkrácené trvání choroby nebo snížení závažnosti choroby, nebo subjektivní zlepšení kvality života subjektu, nebo prodloužené přežití pacienta.
Účinné množství hydroxylaminu podle vynálezu k léčbě odkazuje na množství dostatečné ke zlepšení klinického stavu, jak je popsáno shora. Účinné množství závisí na faktorech jako je
-22CZ 295562 B6 způsob podávání a může být snadno stanoveno tím, kdo je zběhlý v oboru. Hydroxylaminové deriváty podle vynálezu lze podávat parenterálně nebo orálně, s výhodou orálně a místně, a účinné množství je 10 - 500 mg/kg tělesné hmotnosti. Výhodněji je účinné množství ΣΟΙ 00 mg/kg tělesné hmotnosti.
Při použití způsobu léčby podle vynálezu mohou být tkáně myokardu, mozku a ledvin ochráněny před poškozením tkáně nebo nekrózou, způsobovanou ischemií, přičemž daný způsob zahrnuje podávání účinného množství hydroxylaminových derivátů podle vynálezu subjektu ke snížení, prevenci nebo reverzi škodlivých účinků prolongované ischemie.
Tento vynález zahrnuje použití hydroxylaminových derivátů, jejichž tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, k výrobě prostředku k léčení patologických stavů zde popsaných.
Ve způsobu měření ochranného účinku hydroxylaminových derivátů se používá test na zvířatech, jak následuje. Potkani jsou anestetizováni pentobarbitalem sodným (Nembutal, 60 mg/kg tělesné hmotnosti, i.p.) a uměle ventilováni ovzduším místnosti (2 ml/100 g, 54 cyklů za minutu) prostřednictvím tracheoktomie. Pravá karotidová tepna se kathetrizuje a spojí se s převodníkem tlaku (BRP-01, Stoelting) k měření systémového tepenného krevního tlaku (BP) pomocí předzesilovače (Hg-02, Experimentria). Hydroxylaminové deriváty podle vynálezu se podávají prostřednictvím kanyly kjungulámí žíle (i.v) nebo orálně (p.o.). Tep (HR) se měří kardiotachometrem (HR-01, Experimetria) a snímá se elektrokardiogram (ECG standardní vedení II) na záznamové zařízení (MR-12, Medicor) pomocí podkožních nerezových jehlových elektrod. Hrudník se otevře levou thoraktomií a pak se srdce exteriorizuje jemným tlakem na pravou stranu hrudního koše. Aplikuje se tlačka pod levou hlavní koronární arterií, jak je popsáno Selyem et al. (1960). Srdce se opatrně umístí zpět do hrudníku a zvíře je ponecháno zotavit se. Monitoruje se rektální teplota a udržuje se konstantní na 37 °C. Experimentální protokol začíná 15 minutovou stabilizační periodou. Když se během této periody pozoruje trvale krevní tlak nižší než 70 mm Hg nebo arytmie, zvíře se vyřadí z dalšího experimentování. Myokardiální ischemie se pak vyvolává koronární okluzí po 5 minut a reperfuze se ponechá po 10 minut.
V průběhu celého pokusu se nepřetržitě zaznamenávají na vícekanálovém zapisovači (R61-6CH, Medicor) krevní tlak (BP), tep (HR) a EKG. Hydroxylaminové deriváty se podávají v 5. a 60. minutě před okluzí i.v. nebo p.o. cestou. Dávky hydroxylaminových derivátů mohou být 0,5, 0,75, 1,0 mg/kg i.v. a 100 mg/kg tělesné hmotnosti p.o., zatímco referenční substance Bepiridil se podává v dávce 1,0 mg/kg i.v. Střední trvání ventrikulámí tachykardie (VT) a/nebo ventrikulární fibrilace (VF) v průběhu prvních 3 minut reperfuze se měří a analyzuje.
Tento vynález zahrnuje rovněž způsob udržování fluidity buněčné membrány, když je fluidita buněčné membrány ovlivněna v důsledku fyziologického stresu. Tento způsob zahrnuje působení na buněčné membrány nebo membrány buněčných organel, jež mají změněnou membránovou fluiditu, účinným množstvím hydroxylaminových derivátů k nápravě fluidity řečené membrány. Experimentální protokol uváděný v souvislosti s příkladem 9 (rovnovážná DPH fluorescenční anisotropie) lze použít pro stanovení účinku hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na fluiditu buněčné membrány.
Jak bylo zmíněno, tento vynález zahrnuje způsob léčby patologických stavů spojených s buněčnou membránou a membránou buněčných organel. Jedním příkladem takovéhoto patologického stavu je diabetes mellitus, jakož i choroby spojené s poškozením mitochondrií, jako je ALS (amyotropická laterální skleróza), Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba (HD), určité kardiomyopatie, jako ty, co mají toxický původ, způsobované alkoholem a těžkými kovy, zánětlivé a virální kardiomyopatie, nebo autoimunní kardiomyopatie. V tomto způsobu mohou být použity hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II.
-23 CZ 295562 B6
Způsob podle vynálezu může být použit v léčbě nádorových onemocnění, přičemž tento způsob zahrnuje podávání účinného množství hydroxylaminových derivátů organizmu s nádorem k zábraně tvorby nebo růstu nádorů. V tomto způsobu mohou být použity hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II.
Farmaceutické a kosmetické prostředky obsahující hydroxylaminové deriváty
Jak již bylo zmíněno, tento vynález se rovněž týká použití hydroxylaminových derivátů obecných vzorců I a II, včetně jejich opticky aktivních stereoizomerů, k výrobě farmaceutických prostředků (a případně, kosmetických prostředků) užitečných pro léčbu kardiovaskulárních, vaskulámích, alergických, imunitních, autoimunitních, chorob, chorob způsobovaných virovými a bakteriálními infekcemi, nádorových onemocnění, chorob kůže a sliznice, nebo chorob ledvinových kanálků, provokovaných fyziologickým stresem, nebo těchto stavů, způsobovaných rovněž fyziologickým stresem, jež mohou být léčeny kosmetickou intervencí, přičemž obecné vzorce I a II, nebo jejich soli, zahrnují jejich opticky aktivní stereoizomery.
A je alkyl, substituovaný alkyl, fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný ve fenylové nebo alkylové části, fenyl, substituovaný fenyl, heteroarylová nebo substituovaná heteroarylová skupina,
Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, fenylu, substituovaného fenylu, fenylalkylu a fenylalkylu substituovaného ve fenylové a/nebo alkylové části,
R je alkyl nebo substituovaný alkyl,
X vtautomeru obecného vzorce I je halogenovaná nebo substituovaná hydroxylová nebo aminová, monosubstituovaná aminová nebo disubstituovaná aminová skupina a
X v tautomeru obecného vzorce lije kyslíková, iminová nebo substituovaná iminová skupina a
R' je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, fenyl, substituovaný fenyl, fenylalkyl, fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo alkylovou část, a acylová nebo substituovaná acylová skupina, a sloučeniny obecného vzorce I případně obsahují intramolekulámí kruhové struktury tvořené spojením X a reaktivního substituentu.
S použitím těchto sloučenin lze připravovat prostředky jak pro preventivní, tak pro léčebné účele, jež mohou být užitečné při podávání nebo aplikaci na lidský nebo zvířecí organizmus při prevenci nebo kontrole poškození buněk, způsobovaného shora uvedenými chorobami, a tedy při zvolňování nebo odstraňování patologického stavu daného organizmu.
Tyto prostředky mohou být připravovány způsoby známými per se v přípravě kosmetických a farmaceutických prostředků, smícháním aktivního materiálu s odpovídajícími nosiči a/nebo přídavnými látkami. Dané prostředky obecně obsahují 0,5 až 99,5 % hmotn. aktivní sloučeniny. Množství aktivního materiálu v prostředku je určeno povahou a vážností onemocnění, věkem pacienta a způsobem léčby. Hydroxylaminové deriváty obecných vzorců I a II lze formulovat do přípravků k orálnímu a parenterálními jakož i k místnímu použití.
Denní dávka aktivní sloučeniny je kolem 10 až 500 mg/kg, s výhodou 10 až 500 mg/kg, a je, obzvlášť v případě orálních prostředků, rozdělena pro 2-3 podávání.
Pro účely orálního podávání jsou prostředky formulovány do dražé, granulátu a když je to žádoucí roztoku nebo suspenze. Parenterální prostředky zahrnují vodné suspenze a sterilní injikovatelné roztoky, zatímco rektální formy podávání jsou, mezi jiným, čípky a místní formy zahrnují mazání, krémy emulze a gely.
-24CZ 295562 B6
Pro přípravu tablet se míchá aktivní složka s vhodným nosičem, jako je škrob, želatina, laktóza, stearát hořečnatý, talek, arabská guma a silikagel, směs se granuluje a slisuje do tablet.
Pro přípravu dražé se z aktivních složek a přídavných látek připraví směs podobná jako shora, tato směs se granuluje, granulát se slisuje do jádra, jež se pak potáhne cukrem, např. s použitím cukr obsahujícího polyvinylpyrrolidinového roztoku.
Pro přípravu formy kapslí se aktivní složky smíchají s přídavnými látkami, jako je škrob, talek, křemelina, mikrokrystalická celulóza, a směs se plní do tvrdých nebo měkkých želatinových kapslí.
Tyto orální prostředky mohou být doplněny aditivy, jež podporují nebo zpomalují absorpci.
Sirupy, elixíry nebo kapky mohou být připraveny, když se vedle aktivní složky použijí sladidla, methyl- nebo propylparaben, a pokud je to žádoucí, ochucující přídavky, a smíchá se s nimi vodný roztok aktivní složky.
Pro rektální podávání lze čípky připravovat s použitím vhodných přídavných látek, jako je kakaové máslo nebo polyethylenglykol.
Prostředky, vhodnými k parenterálnímu podávání, mohou být injekce, připravované rozpouštěním aktivní složky v sterilním izotonickém solném roztoku, nebo vodné suspenze, jež mohou být připraveny s použitím vhodných dispergačních a zvlhčovačích činidel, jako je propylenglykol a butylenglykol.
Krémy a mazání k místnímu použití lze připravit s použitím primárních nebo sekundárních alkoholů, jako jsou cetylalkohol, stearylalkohol, glycerolu, přírodních tuků a olejů, jako jsou olivový olej, olej z pšeničných klíčků, lanolin, delších uhlovodíků, jako je vazelína, jakož i celulózových derivátů. Tyto prostředky mohou obsahovat konzervační látky jako je methyl-phydroxy-benzoát.
Prostředky k použití jako kosmetické nebo lékařsko-kosmetické přípravky lze připravit podobnou cestou. S výhodou se smíchají lipofilní složky, a ve vodě rozpustné složky se rozpustí ve vodě, případně s mírným zahřátím. Když je to žádoucí, upraví se pH směsi lipofílních složek na vhodnou hodnotu a získaná emulze se míchá za chlazení. Aktivní složka se přidá do směsi takto získané ve formě vodného roztoku.
Farmaceutické a kosmetické prostředky, jež obsahují nové hydroxylaminové deriváty, popsané podrobně ve zvláštní sekci tohoto popisu, lze rovněž připravovat shora uvedenými postupy. Tyto prostředky jsou rovněž předmětem vynálezu.
Jedno provedení farmaceutických a kosmetických prostředků podle vynálezu obsahuje hydroxylaminové deriváty podle obecného vzorce I v množství 0,5 až 99,5 % hmotn. spolu s nosiči a přídavnými látkami obecně používanými v takovýchto prostředcích, kde
X je halogen, s výhodou chlor nebo brom,
Z je chemická vazba a al) A je skupina obecného vzorce (a), kde Y1 je halogen-, alkoxy-, halogenalkylová nebo nitroskupina a n je 1, 2 nebo 3; nebo O-obsahující heteroaryl, s výhodou furyl, S-obsahující heteroaryl, s výhodou thienyl, nebo N-obsahující heteroaromatická skupina případně kondenzovaná s benzenovým kruhem, nebo její N-C|_4 alkyl kvartémí derivát nebo N-oxid, s výhodou pyridyl, chinolyl nebo izochinolyl,
-25CZ 295562 B6
R je skupina mající strukturu (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Cu alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -OR7, kde R7 je H nebo acylová skupina, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl, fenylkarbonyl, nebo aminoacyl, kje 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 nebo jejich N-Ci_4 alkyl kvartérní derivát nebo N-oxid, s výhradou, že když A je pyridyl nebo skupina obecného vzorce (a), kde Y1 je halogen nebo alkoxy, pak R7 je jiné než H, nebo a2) A je skupina obecného vzorce (c),
R je skupina obecného vzorce (d), a případné substituenty Y2 a Y3, z nichž alespoň jeden musí být v molekule přítomný, jsou kyslík, nebo C|_4 alkyl a kje 1, 2 nebo 3 a m je 1, 2, nebo 3; a když je daná sloučenina mono- nebo bivalentní kationt, jejími anionty jsou jeden nebo dva halidy, s výhodou jódové ionty,
b) X je -NR^2, R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří 3- až 7členný, s výhodou 5- až 7-členný heterocyklický kruh, jenž může obsahovat jeden nebo více dalších heteroatomů,
A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl,
Z je kyslík nebo =NR3 skupina, kde R3 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl,
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ch alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -OR7, kde R7 je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo fenylkarbonyl, kje 1,2 nebo 3, a mje 1, 2 nebo 3, nebo
c) X je -OQ, kde Q je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl nebo fenylalkyl,
A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl nebo fenylalkyl,
Z je kyslík a
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -OR7, kde R7 je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl, fenylkarbonyl nebo aminoacyl, kje 1,2 nebo 3, a mje 1, 2 nebo 3, nebo
d) A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nebo N-obsahující heteroaromatická skupina, s výhodou pyridyl, nebo S-obsahující heteroaromatická skupina,
Z je chemická vazba,
X je -OQ, kde Q je CH alkyl a
-26CZ 295562 B6
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Cm alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je H, kje 1,2 nebo 3, a m je 1,2 nebo 3.
Jiná skupina farmaceutických a kosmetických prostředků podle vynálezu zahrnuje ty, jež spolu s nosiči a přídavnými látkami obsahují hydroxylaminové deriváty obecného vzorce I v množství kolem 0,5 až 99,5 % hmotn. nebo jejich soli a/nebo jejich opticky aktivní stereoizomery, kde
X je -NR^2, R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Cm alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterokruh,
A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl substituovaný jednou nebo více alkoxy skupinami, s výhodou Cm alkoxy, nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný jednou nebo více halogen-, alkyl-, halogenalkyl-, acylamino- nebo nitroskupinami, nebo nesubstituovaná nebo substituovaná N-obsahující heteroaromatická skupina, jež je případně kondenzována s benzenovým kruhem, s výhodou pyrrolyl, pyridyl, izochinolyl nebo chinolyl, nebo S-obsahující heteroarylová skupina, s výhodou thienyl, přičemž dané heteroarylové skupiny mohou mít jeden nebo více substituentů, s výhodou jeden nebo více alkylů, s výhodou Ci_4 alkyly,
Z je chemická vazba,
R je skupina struktury (e), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Cm alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, jenž může obsahovat další heteroatomy a mít substituenta(y), s výhodou Ci_4 alkyl; Y4 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný C|_4 alkyl, Y5 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný Cj_4 alkyl, nebo OR7, kde R7 je H nebo acyl, kje 1, 2 nebo 3, a mje 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný halogenem nebo alkoxy, nebo fenylalkyl substituovaný alkoxy, nebo pyridylová skupina a R7 je H, pak alespoň jeden z R1 a R2 je jiný než H, nebo když A je nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný halogenem nebo alkoxy, nebo fenylalkyl substituovaný alkoxy, nebo pyridylová skupina, a R1 a R2 jsou oba H, pak R7 je jiný než H.
Jiná skupina farmaceutických a kosmetických prostředků podle vynálezu zahrnuje ty, jež spolu s nosiči a přídavnými látkami obsahují v množství kolem 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylaminové deriváty obecného vzorce I nebo jejich soli a/nebo jejich opticky aktivní stereoizomery, kde
a) X je kyslík,
A je Ci_2o přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo halogenalkyl-fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl nebo N-obsahující heteroaromatická skupina, s výhodou pyridyl,
Z je chemická vazba,
R' je H, Cm alkyl nebo fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl,
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Cm alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je H,
-27CZ 295562 B6 nebo -OR7, kde R7 je H, k je 1,2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je jiné než alkyl a R' je H, pak Y6 je H, nebo
b) X je =NR4, kde R4 je H, nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenylalkyl,
A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, nebo cykloalkyl,
Z je chemická vazba, kyslík nebo =NR3 skupina, kde R3 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl,
R' je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, a
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Cw alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je H, nebo -OR7, kde R7 je H nebo acyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1,2 nebo 3, nebo
c) X je kyslík,
A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl,
Z je kyslík,
R' je alkyl nebo fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl,
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ck4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je H, nebo -OR7, kde R7 je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo fenylkarbonyl, k je 1,2 nebo 3, a m je 1,2 nebo 3, nebo
d) A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, cykloalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný halogenhalogenalkyl-, alkoxy- nebo nitroskupinou,
R' je alkyl nebo fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl,
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-clenný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo -OH, k je 1,2 nebo 3, a m je 1,2 nebo 3, nebo d2) A je skupina obecného vzorce (a), kde Y1 je halogenalkyl, s výhodou trifluormethyl a n je 1, 2 nebo 3,
R' jeH,
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným,
-28CZ 295562 B6 tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo-OH, kje 1, 2 nebo 3, am je 1, 2 nebo 3.
Jiná skupina farmaceutických a kosmetických prostředků podle vynálezu zahrnuje ty, jež spolu s nosiči a přídavnými látkami obsahují v množství kolem 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylaminové deriváty obecného vzorce I nebo jejich solí a/nebo jejich opticky aktivní stereoizomery, kde
A je nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný halogenem-, nebo nitroskupinou, Nobsahující heteroarylová skupina, s výhodou pyridyl,
R1 je H, a
R je aminoalkylová skupina, jež může být mono- nebo disubstituovaná, přičemž alkylový řetězec má 1 - 5 uhlíkových atomů, a dané amino substituenty, nezávisle na sobě, mohou být jedním nebo dvěma přímými nebo větvenými alkyly nebo cykloalkyly, nebo dané dva amino substituenty, spolu s N atomem k nim přilehlým tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, nebo jeho N-Cm alkylový kvartémí derivát, s výhradou, že když A je pyridyl, R je jiný než 1-piperidinylmethyl.
Provedení vynálezu jsou vysvětlena podrobněji v následujících příkladech. Musí se však chápat, že rozsah ochrany není omezen na specifická provedení udávaná v příkladech.
Příklady provedení vynálezu
Chemické příklady a příklady prostředků
Příklad 1
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid
5,0 g (15,6 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidamid monohydrochloridu (příklad 44) se rozpustilo v 19 ml vody, pak se přidalo 6,1 ml koncentrované kyseliny solné. Roztok byl ochlazen na -5 °C, pak se po kapkách přidal chladný roztok 4,4 g (63,8 mmol) dusitanu sodného ve 2,4 ml vody. Během celé reakce byla vnitřní teplota udržována na 0 °C. Když bylo přidání úplné, směs se míchala po další jednu hodinu. Byl přidán chladný benzen (60 ml) a směs byla zalkalizována pomalým přidáním chladného roztoku 3,2 g (80 mmol) hydroxidu sodného v 45 ml vody. Organická fáze byla oddělena a promývána postupně 20ml porcemi vody dokud pH < 9 (3 - 5 krát). Organický roztok byl vysušen nad bezvodým síranem sodným, zpracován s uhlím, zfíltrován a odpařen ve vakuu (t < 45 °C) za poskytnutí 2,6 g oleje. Tento zbytek byl rozpuštěn v 5 ml izopropylalkoholu a okyselen (pH 2) izopropylalkoholem obsahujícím suchý chlorovodík. Produkt byl krystalizován z n-hexanu za poskytnutí vyběleného materiálu. Výtěžek: 2,0 g (38 %). t.t.: 115-123 °C.
Podle postupu z předcházejícího příkladu byly připraveny následující sloučeniny:
-29CZ 295562 B6
Příklad 2
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-l-izochinolin-karboximidoylchlorid monohydrochlorid
Výchozí materiál: Příklad 46. Výtěžek: 48 %. t.t.: 168- 172 °C.
IČ (KBr): 3425, 3128, 2947, 2866, 2650, 2540, 1622, 1597, 1556, 1452, 1385, 1364, 1329,1296, 1281, 1240, 1117, 1092, 1024, 1015,978, 953, 903,881,795, 743,718, 658, 559 cm’1.
Příklad 3
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-l-chinolinkarboximidoylchlorid (Zý-2-butendioát (1:1)
V tomto případě byl na konci postupu zpracování konečný produkt izolován rozpuštěním surové báze v acetonu a přidáním ekvivalentního množství kyseliny maleinové. Výchozí materiál: Příklad 42. Výtěžek: 67 %. t.t.: 159-162 °C.
IČ (KBr): 3427, 3019, 2947, 2886, 2689, 1583, 1477, 1450, 1352, 1293, 1221, 1194, 1132, 1072, 1045, 939, 919, 872, 833, 754, 650, 557 cm-1.
Příklad 4
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidiny l)propoxy]-3-nitro-benzenkarboximidoy lchlorid monohydrochlorid
Výchozí materiál: Příklad 40. Výtěžek: 58 %. t.t.: 185-189 °C.
Příklad 5
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidiny l)propoxy]-4-nitro-benzenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid
Výchozí materiál: Příklad 43. Výtěžek: 47 %. t.t.: 180-182 °C.
IČ (KBr): 3331, 2953, 2853, 2735, 2654, 2577, 1605, 1568, 1516, 1456, 1348, 1261, 1165, 1119, 1072, 1059, 1007, 960, 933, 862, 849, 754, 719, 690, 627, 581, 550, 478 cm’1.
Příklad 6
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-nitro-benzenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid
Výchozí materiál: Příklad 45. Výtěžek: 50 %. t.t.: 159-162 °C.
IČ (KBr): 3298, 2983, 2932, 2746, 1593, 1574, 1535, 1445, 1391, 1354, 1317, 1288, 1242, 1198, 1092, 1069, 1020, 968, 947, 914, 852, 793, 756, 708, 627, 577 cm’1.
-30CZ 295562 B6
Příklad 7
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-furankarboximidoylchlorid monohydrochlorid l-Chlor-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propan [J. Org. Chem. 33(2) str. 523-30 (1968)] (3,0 g, 116,9 mmol) byl rozpuštěn ve vodě (1,8 ml). Přidal se pevný NaOH (1,19 g, 29,8 mmol) a směs se míchala za teploty místnosti po 1 hodinu. Přidal se N-hydroxy-2-furankarboximidamid (1,92 g, 15,2 mmol) a směs se ponechala míchat za teploty místnosti přes noc. Přidala se koncentrovaná HC1 (2,1 ml) k úpravě pH na přibl. 4 a roztok byl odpařen ve vakuu do sucha. Zbytek (5,4 g) byl rozpuštěn v konc. HC1 (37 ml), ochlazen na 0 - 5 °C a po kapkách se během 30 minut přidal vodný roztok NaNO2 (5,6 g, 80 mmol v 23 ml vody). Roztok se pak zalkalizoval přidáním 2 N roztoku NaOH (102 ml) na pH = 10, a zextrahoval ethylacetátem (2 x 130 ml). Spojené organické fáze se promyly vodou, vysušily nad bezvodým Na2SO4 a odpařily. Zbytek (2,0 g) byl rozpuštěn v malém objemu ethylacetátu (20 ml) a produkt byl sražen přidáním izopropanolového roztoku HC1 (3,2 N, 3 ml). Získaná bílá sraženina byla zfíltrována, promyta a konečně rekrystalizována z izopropanolu. Výtěžek: 11 %. t.t.: 139-141 °C.
IČ (KBr): 3427, 3267, 3094, 2955, 2922, 2964, 2745, 1637, 1584, 1479, 1452, 1391, 1319, 1281, 1259, 1157, 1074, 1024, 999, 980, 943, 887, 854, 843, 743, 710, 596 cm’1.
Podle postupu z předcházejícího příkladu byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 8
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-4-pyridinkarboximidoylchlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
V tomto případě byl na konci postupu zpracování konečný produkt izolován rozpuštěním surové báze v acetonu a přidáním ekvivalentního množství kyseliny maleinové. Výtěžek: 25 %. t.t.: 165,5-169 °C.
Příklad 9
N-[3-[(l,l-dimethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-3-trifluormethyl-benzenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid
a) 50 g (0,245 mol) m-trifluormethyl-benzamidoximu a 33,7 g (0,6 mol) hydroxidu draselného se rozpustilo ve směsi dimethylsulfoxidu a 170 ml vody a směs byla ochlazena na 0 °C. Přidalo se 48 ml (0,6 mol) epichlorhydrinu a reakční směs byla míchána po 5 hodin při 0 °C a ponechána v lednici přes noc. Další den se přidalo 250 ml vody, a směs se extrahovala ethylacetátem (4 x 250 ml). Spojené organické fáze se promyly vodou, vysušily, zpracovaly s uhlím a odpařily do sucha za poskytnutí m-trifluormethyl-N-(2,3-epoxypropoxy)-benzamidinu jako bezbarvého oleje. Výtěžek: 61 g (96 %).
b) K získanému oleji se přidalo 400 ml 18% roztoku kyseliny chlorovodíkové a 60 ml etheru a směs byla ochlazena na -5 °C za míchání. Během 40 minut se pomalu přidalo 17,4 g (0,25 mol) dusitanu sodného rozpuštěného v 60 ml vody a reakční směs byla míchán dalších 20 minut. Směs se pak extrahovala etherem (2 x 160 ml) a spojené organické fáze se promyly dvakrát vodou. K etherovému roztoku se přidalo 340 ml 20% roztoku hydroxidu sodného a dvoufázový systém byl za míchání refluxován po 1 hodinu. Fáze pak byly odděleny, organická vrstva byla promývána solným roztokem do neutrality, vysušena a odpařena do sucha za poskytnutí mtrifluormethyl-N-(2,3-epoxypropoxy)benzimidoylchloridu jako bezbarvého oleje. Výtěžek:
30,5 g (45 %).
-31 CZ 295562 B6
c) Směs 1,19 g (4,2 mmol) m-trifluormethyl-N-(2,3-epoxypropoxy)benzenkarboximidoyl chloridu a 0,89 ml (8,5 mmol) /erc-butylaminu v 12 ml izopropylalkoholu se refluxovala po 2 hod. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, přidalo se 0,98 ml methanolového roztoku chlorovodíku (4,3 N) a směs byla zkoncentrována pod vakuem na malý objem, pak zředěna etherem. Sraženina, jež se vytvořila, se promyla chladným etherem a vysušila. Výtěžek: 0,48 g (32 %). t.t.: 150-153 °C.
IČ (KBr): 3423, 3233, 2978, 2880, 2784, 1620, 1570, 1479, 1441, 1400, 1383, 1340, 1238, 1167, 1128, 1101, 1072, 982, 930, 897, 804, 787, 714, 694 cm’1.
Podle postupu z předcházejícího příkladu byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 10
N-[2-hydroxy-3-[(l-methylethyl)amino]propoxy]-3-trifluor-methyl-benzenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid
Výtěžek: 35 %. t.t.: 105-108 °C.
IČ (KBr): 3358, 2984, 2883,2804, 1595, 1441, 1383, 1335, 1238, 1184, 1171, 1121, 1099, 1074, 1011, 995, 947, 906, 891, 798, 779, 696, 681, 567 cm’1.
Příklad 11
N-[3-(cyklohexylamino)-2-hydroxypropoxy]-3-trifluormethyl-benzenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid
Výtěžek: 35 %. t.t.: 147-149,5 °C.
IČ (KBr): 3381, 2951, 2860, 2820, 1580, 1439, 1344, 1267, 1161, 1126, 1099, 1074, 1003, 986, 932, 903, 872, 802, 787, 716, 692, 681, 648 cm’1.
Příklad 12
N-[3-(diethylamino)-2-hydroxypropoxy]-3-trifluormethyl-benzenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid
Výtěžek: 21 %. t.t.: 121-128 °C.
IČ (KBr): 3425, 3289, 2951, 2667, 1818, 1443, 1337, 1238, 1178, 1115, 1078, 1049, 997, 910, 804, 781,696, 683 cnT1.
Příklad 13
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-trifluormethylbenzenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid
Výtěžek: 13 %. t.t.: 119-123 °C.
-32CZ 295562 B6
IČ (KBr): 3366, 2937, 2854, 2737, 2673, 2538, 1616, 1570, 1439, 1404, 1337, 1290, 1236, 1199, 1165, 1101, 1074, 1030, 984, 972, 933, 901, 829, 804, 788, 717, 699, 685, 646 cm’1.
Příklad 14
N-[2-hydroxy-3-(piperidin-l-oxid-l-yl)propoxy]-N'-oxy-3-pyridinkarboximidoylchlorid
K roztoku N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu (5,0 g, ío 17,1 mmol) v chloroformu (50 ml) se v malých porcích přidala kyselina w-chlorperbenzoová (7,0 g, 40 mmol), a směs se míchala při teplotě místnosti po 2 hodiny. Rozpouštědlo bylo odstraněno, zbytek rozpuštěn v 80 ml ethylacetátu, extrahován vodou, vysušen a odpařen. Získaný olejovitý produkt byl nakonec krystalizován s acetonem za poskytnutí produktu jako bělavé pevné látky: Výtěžek: 2,21 g (6,7 mmol, 40 %). t.t.: 140-142 °C.
IČ (KBr): 3437, 3071, 2943, 2880, 2590, 1801, 1578, 1475, 1454, 1433, 1375, 1294, 1259, 1194, 1165, 1121, 1088, 1043, 1011,995,924, 905, 888, 845, 808,710, 671, 554, 513, 413 cm’1.
Příklad 15
N-[2-hydroxy-3-(piperidin-l-oxid-yl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid
K roztoku N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchloridu (2,0 g, 25 6,8 mmol) v chloroformu (20 ml) se přidala kyselina m-chlorperbenzoová (1,6 g o 70 % čistotě,
6,5 mmol), a směs se míchala při teplotě místnosti po 30 minut. Roztok se zalkalizoval přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného, pak oddělil a organická vrstva byla promyta solným roztokem, vysušena a odpařena. Tuhý zbytek byl rekrystalizován s ethylacetátem, precipitát byl zfiltrován, promyt a vysušen za získání produktu jako bílé pevné látky. Výtěžek: 1,03 g (48 %). t.t.: 30 127-130°C.
IČ (KBr): 3454, 2988, 2945, 2880, 2585, 1585, 1512, 1479, 1443, 1416, 1393, 1350, 1331, 1289, 1183, 1134, 1072, 1051, 1030, 997, 953,939, 879, 847, 808, 702, 518, 417 cm’1.
Příklad 16
N-[2-hydroxy-3-(l-methyl-l-piperidinium-l-yl)propoxy]-N-methylpyridinium-3-karboximidoylchlorid dijodid
Směs N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchloridu (1,0 g, 3,4 mmol) a 1,2 ml (20 mmol) methyljodidu byla refluxována v acetonu (10 ml) pod dusíkem po 2 hodiny. Výsledný tmavě žlutý precipitát byl zfiltrován a promyt acetonem za získání surového produktu (1,8 g), jenž byl pak rekrystalizován z 20 ml ethanolu. Výtěžek: 1,2 g (60%). 45 t.t.: 153-157 °C.
IČ (KBr): 3462, 3406, 3317, 2941, 2878, 2831, 1729, 1636, 1589, 1504, 1461, 1378, 1350, 1290, 1209, 1171, 1121, 1069, 1047, 1030, 1101,941,897, 868,818, 706, 673,635,589 cm’1.
-33CZ 295562 B6
Příklad 17
N-[2-acetoxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
1,48 g (5,0 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchloridu bylo rozpuštěno v 5 ml acetanhydridu. Teplota směsi byla zvýšena na 40 °C. Po 30 minutách bylo rozpouštědlo při teplotě místnosti úplně odstraněno ve vakuu, zbytek byl rozpuštěn v 30 ml diethyletheru, zpracován s uhlím, zfiltrován a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku za poskytnutí 1,74 g oranžově zbarveného oleje. Zbytek byl rozpuštěn v 10 ml acetonu a byl přidán roztok 0,6 g (5,17 mmol) kyseliny maleinové v 10 ml acetonu. Krystalický produkt byl oddělen filtrací a promyt acetonem za poskytnutí 1,43 g bělavého materiálu.
Rekrystalizace, s odbarvením, z 9 ml izopropylalkoholu poskytla titulní sloučeninu. Výtěžek: 1,22 g (54%). t.t.: 143-144 °C.
Příklad 18 (S)-N-[2-[2-(R)-( 1,1 -dimethylethyloxykarbonylamino)-3-feny l-propionyloxy]-3-( 1 piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
6,7 g (25,5 mmol) N-(tórc-butoxykarbonyl)-D-fenylalanmu bylo rozpuštěno v 50 ml dichlormethanu. Roztok byl ochlazen na 0 °C a po kapkách se přidalo 4,0 ml triethylaminu a pak 2,5 ml (26 mmol) chlormravenčanu ethylnatého. Směs se míchala po 20 minut při 0 °C a pak se během 30 minut přidal roztok N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu. Reakční směs se míchala při teplotě místnosti po 1 hodinu. Roztok byl extrahován napřed 10% kyselinou octovou (2 x 100 ml), pak vodou, vysušen bezvodým síranem sodným, a odpařen do sucha. Zbytek (10,7 g) byl rozpuštěn v 71 ml acetonu a bylo přidáno 1,53 g (13 mmol) kyseliny maleinové. Výsledná pevná látka byla zfiltrována a promyta acetonem. Výtěžek: 4,0 g (6,0 mmol, 23 %). t.t.: 146,5-148 °C.
[a]D = + 21,5° [c = 1, MeOH].
IČ (KBr): 3393, 2978, 1744, 1697, 1582, 1518, 1468, 1454, 1420, 1381, 1358, 1313, 1290, 1256, 1169, 1126, 1099, 1084, 1045, 1016, 930, 908, 870, 750, 690, 575 cm’1.
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 19 (R)-N-[2-[2-(S)-( 1, l-dimethylethyloxykarbonylamino)-3-fenyl-propionyloxy]-3-( 1piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
Výtěžek: 25 %. Tato sloučenina má stejná fyzikální data (t.t., IČ) jak se píše v příkladu 18.
[a]D = -23,6° [c= l,MeOHJ.
-34CZ 295562 B6
Příklad 20
N-[2-benzoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid (Z)-2-butendioát (1:1)
20,9 g (75,0 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamidu [maďarský patent HU 177.578 (1976)] se rozpustilo v 300 ml benzenu. K tomuto roztoku se přidalo 150 ml IN roztoku hydroxidu sodného, s následným přidáním 19,5 ml (168 mmol) benzoylchloridu po kapkách. Po intenzivním míchání směsi po 2 hodiny se přidalo 7,1 g (67 mmol) uhličitanu sodného a další porce benzoylchloridu (9,75 ml, 84 mmol). Pak byly fáze odděleny a organická vrstva byla extrahována IN roztokem hydroxidu sodného a vodou, vysušena a odpařena do sucha. Zbytek (41 g oleje) byl rozpuštěn v 150 ml acetonu a bylo přidáno
8.7 g (75 mmol) kyseliny maleinové. Získaný precipitát byl zfíltrován, promyt acetonem a usušen.
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 21
N-[2-benzoyloxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyIchlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
Výchozí materiál: US 5 147 879 (1992). Výtěžek: 64 %. t.t.: 134-136 °C.
IČ (KBr): 2955,2939, 2517, 1718, 1583, 1477, 1452, 1410, 1370, 1354, 1317, 1268, 1209, 1173, 1117, 1057, 1057, 1043, 998, 968, 939, 870, 748, 723, 714, 652, 582 cm’1.
Příklad 22
N-[2-palmitoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
14.7 g (52,8 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperídmyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamidu [maďarský patent HU 177.578 (1976)] se rozpustilo ve 160 ml chloroformu, přidalo se 7,7 ml (55 mmol) triethylaminu, s následným přidáním palmitoylchloridu (14,7 g, 56,5 mmol), v 85 ml chloroformu, po kapkách. Směs se míchala přes noc za teploty místnosti. Další den se přidalo další množství 3,8 ml triethylaminu a 7,4 g palmitoylchloridu, a v míchání se pokračovalo ještě jeden den. Roztok pak byl extrahován postupně vodou, 5 % kyselinou octovou a vodou, vysušen bezvodým síranem sodným, a odpařen do sucha. Zbytek (28,2 g oleje) byl rozpuštěn v ethylacetátu a produkt byl sražen přidáním 30 ml 1 N HCl/ethylacetátu. Hustý bílý precipitát byl zfíltrován, promyt ethylacetátem a usušen. Výtěžek: 10,9 g (37 %). t.t.: 110-113 °C.
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 23
N-[2-palmitoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid dihydrochlorid
Výchozí materiál: US 5 147 879 (1992). Poznámka: reakce se prováděla refluxováním. Výtěžek: 72 %. t.t.: 69-73,5 °C.
IČ (KBr): 3425, 2922, 2853,2648,2544, 1742, 1632, 1468, 1416, 1377, 1287, 1183, 1113, 1087, 1032, 984, 708, 675 cm“1.
-35CZ 295562 B6
Příklad 24
N-[2-furyloxy-3-(l-piperidinyl)prc)poxy]-3-pyridinkarboximidamid (Z)-2-butendioát (1:1)
Poznámka: produkt byl izolován ve formě maleinové soli. Výtěžek: 52 %. t.t.: 167-171,5 °C.
Příklad 25
N-[2-(o-chlorbenzoyloxy)-3-(l-piperidmyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Poznámka: reakce se prováděla refluxováním. Výtěžek: 50 %. t.t.: 91-94 °C.
Příklad 26
N-[2-(p-methoxybenzoyloxy)-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Poznámka: reakce se prováděla refluxováním. Výtěžek: 71 %. t.t.: 152-155 °C.
Příklad 27
N-[2-(m-trifluormethylbenzoyloxy)-3-(l-piperidmyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Poznámka: reakce se prováděla refluxováním. Výtěžek: 45 %. t.t.: 144-147 °C.
Příklad 28
N-[2-(2-thienoy loxy )-3-( 1 -piperidiny l)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid (Z)-2-butendioát (1:1)
Poznámka: reakce se prováděla refluxováním a produkt byl izolován ve formě maleinové soli. Výtěžek: 58 %. t.t.: 168-176 °C.
Příklad 29
N-[2-acetoxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
2,5 g (9,0 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamidu bylo rozpuštěno v 27 ml chloroformu, přidalo se 1,6 g (16 mmol) acetanhydridu a míchalo se po 1 hodinu při teplotě místnosti. Reakční směs byla odpařena do sucha a rozpuštěna v izopropylalkoholu obsahujícím ekvimolární množství (9 mmol) suchého chlorovodíku. Roztok byl ochlazen a pevná látka zfíltrována. Rekrystalizace z izopropylalkoholu poskytla krystalickou sloučeninu. Výtěžek: 1,9 g (59 %). t.t.: 107 °C.
-36CZ 295562 B6
Příklad 30
N-[2-(3-pyridinkarbonyloxy)-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid (Z)-2butendioát (1:1)
K roztoku N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyI)propoxy]-3-pyridinkarboximidamidu (1,68 g, 6,0 mmol) v suchém pyridinu se přidal anhydrid kyseliny nikotinové (1,68 g, 7,4 mmol) a směs se ponechala při teplotě místnosti přes noc. Směs byla odpařena, zbytek rozpuštěn v 30 ml ethylacetátu, zfiltrován, filtrát se extrahoval 10% roztokem NaHCO3, byl vysušen a odpařen. Získaný olej byl rozpuštěn v 20 ml acetonu a přidalo se 0,53 g kyseliny maleinové, což vedlo ke srážení. Produkt byl odfiltrován a promyt acetonem. Výtěžek: 1,84 g (61 %). t.t.: 157-160 °C.
Příklad 31
N-[3-( 1 -piperidiny l)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid dihydrochlorid
2,86 g (51,1 mmol) hydroxidu draselného bylo rozpuštěno v 20 ml abs. ethanolu, pak se přidalo 6,45 g (47,0 mmol) N-hydroxy-3-pyridinkarboximidamidu a 7,7 g (47,7 mmol) l-chlor-3-(lpiperidinyl)propanu a směs se refluxovala po 9 hodin. Pevný podíl byl odstraněn filtrací a filtrát byl odpařen. Surový produkt byl rozpuštěn v 100 ml chloroformu, promyt 1 N roztokem hydroxidu sodného a pak třikrát vodou. Organická vrstva byla vysušena nad síranem sodným a rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v malém množství abs. ethanolu a byl přidán izopropylalkohol obsahující suchý chlorovodík (pH 2) za poskytnutí bělavých krystalů. Výtěžek: 4,8 g (38 %). t.t.: 95-100 °C (rozkl.).
IČ (KBr): 3422, 3294, 3107, 2984, 2937, 2870, 2818, 1649, 1616, 1593, 1479, 1462, 1441,1381, 1309, 1194, 1123, 1094, 1059,1042, 982, 858, 816, 712, 559 cm1.
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 32
N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-trifluormethylbenzenkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 42 %. t.t.: 116-119 °C.
IČ (KBr): 3412, 3082, 2949, 2874, 2827, 1655, 1485, 1447, 1383, 1325, 1283, 1171, 1121, 1094, 1072, 986, 920, 905, 808, 700, 677, 627 cm'1.
Příklad 33
N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-(3,4-dimethoxyfenyl)methankarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 35 %. t.t.: 207-209 °C.
Příklad 34
N-[2,2-dimethyl-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid
Výtěžek: 38 % (olej).
-37CZ 295562 B6
IČ (KBr): 3323, 2935, 2888, 2785, 1637, 1477, 1393, 1360, 157, 111, 1057, 995, 943, 960, 814, 789, 708, 627 cm'1.
Příklad 35
N-[3-(4-methyl-l-piperazinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 23 % t.t.: 127-130 °C.
IČ (KBr): 3387, 2947, 2878, 2802, 1730, 1639, 1450, 1389, 1283, 1242, 1194, 1150, 1083,1015, 964, 933, 814, 710 cm1.
Příklad 36
N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-nitro-benzenkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 51 %. t.t.: 158-162 °C.
Příklad 37
N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]benzenkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 64 %. t.t.: 207-209 °C.
Příklad 38
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2,4,5-trimethylbenzenkarboximidamid
Výtěžek: 44 %. t.t.: 199-201 °C.
IČ (KBr): 3410, 3103, 2943, 2912, 2814, 2791, 1634, 1582, 1441, 1383, 1350, 1321, 1304, 1254, 1204, 1146, 1111, 1099, 1065, 993, 878, 851, 785, 754, 525 cm'1.
Příklad 39
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-4-acetaminobenzenkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 25 %. t.t.: 133-137 °C.
Příklad 40
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-nitrobenzenkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 38 %. t.t.: 190-193 °C.
-38CZ 295562 B6
Příklad 41
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-2-( 1,5-dimethyl)-pyrrolkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 20 %. t.t.: 144-147 °C.
IČ (KBr, báze): 3458, 3369, 2930, 2849, 1622, 1587, 1502, 1468, 1437, 1396, 1354, 1323, 1279, 1254, 1200, 1157, 1115, 1078, 1042, 988, 962, 930, 870, 856, 758, 737, 694, 609 cm’1.
Příklad 42
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-chinolinkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 36 %. t.t.: 210-211 °C.
Příklad 43
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-4-nitrobenzenkarboximidamid dihydrochloid
Výtěžek: 77 %. t.t.: 184-189 °C.
Příklad 44
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 73 %. t.t.: 157-170 °C.
IČ (KBr): 3280 (b), 2940, 1655, 1420, 1120, 1018, 1002, 857, 710 cm’1.
Příklad 45
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-2-nitrobenzenkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 47 %. t.t.: 200-208 °C.
IČ (KBr): 3300 (b), 2960, 1670, 1535, 1347, 1155, 1002, 860, 800, 735 cm’1.
Příklad 46
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-l-izochinolinkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 56 %. t.t.: 208-216 °C.
-39CZ 295562 B6
Příklad 47
N-[3-[( 1, l-dimethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-3-trifluormethylbenzenkarboximidamid dihydrochlorid
Směs 21,0 g (80,8 mmol) m-trifluormethyl-N-(2,4~epoxypropoxy)benzamidinu (příklad 9/a), 105 ml terc-butylaminu, 210 ml etheru a 84 ml 4N roztoku hydroxidu sodného se refluxovala po 5 hod. Fáze byly odděleny, etherová vrstva byla promývána solným roztokem do neutrality, vysušena a odpařena do sucha. Výsledný olej byl rozpuštěn v 250 ml acetonu, zpracován s uhlím, pak se přidalo 39 ml 4 N HCl/ethylacetátového roztoku za míchání, což vedlo ke srážení bílé pevné látky, jež byla zfíltrována a promyta acetonem. Výtěžek: 22,8 g (70 %). t.t.: 186-192 °C (rozkl.).
IČ (KBr): 3418, 2984, 2785,2625,2527, 2401, 1664, 1585, 1487, 1437, 1381, 1329, 1173, 1155, 1130, 1078, 905, 874, 820, 692, 642, 594 cm’1.
Příklad 48
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-butyl-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
a) Příprava N-[2-[(2-tetrahydropyranyl)oxy]-3-( 1 -piperidiny l)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu: 21,3 g (71,4 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidmyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu bylo rozpuštěno v 500 ml chloroformu, okyseleno etherovým roztokem kyseliny chlorovodíkové na pH = 3 a pak se přidalo 32,6 ml (0,357 mol) 3,4-dihydro-2Hpyranu. Směs se míchala za teploty místnosti po 20 hodin, promyla třikrát 200ml porcemi 2 N roztoku hydroxidu sodného a čtyřikrát stejným množstvím vody. Organická fáze byla vysušena nad síranem sodným, zfdtrována a odpařena za sníženého tlaku. Olejovitý zbytek byl rozpuštěn v 600 ml ethylacetátu a promýván čtyřikrát 150ml porcemi pufrového roztoku pH = 5. Organický roztok byl vysušen, zfíltrován a odpařen. Výtěžek 24,5 g (90 %).
b) Směs 3,7 g (9,68 mmol) N-[2-[(2-tetrahydropyranyl)oxy]-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chloridu a 40 ml (0,41 mol) w-butylaminu byla refluxována po 3 hodiny. Přebytek aminu byl odpařen ve vakuu za poskytnutí tmavě hnědého oleje, jenž byl rozpuštěn v 40 ml ethanolu obsahujícího 3,0 g kyseliny 4-toluensulfonové, a směs byla zahřívána na 60 °C po jednu hodinu. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku, zbytek byl zalkalizován (pH 10) s 2 N roztokem hydroxidu sodného a pak extrahován třikrát chloroformem. Organický roztok byl vysušen nad síranem sodným, zfdtrován a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Tmavý olejovitý zbytek byl chromatografícky čištěn za poskytnutí čisté báze, jež byla rozpuštěna v 20 ml ethanolu a okyselena ekvivalentním množstvím suché kyseliny chlorovodíkové rozpuštěné v izopropylalkoholu, za poskytnutí titulní sloučeniny jako světle žluté krystalické pevné látky. Výtěžek: 1,22 g (34 %). t.t.: 120-122 °C.
IČ (KBr, báze): 3319, 3293, 3040, 2959, 2854, 2842, 2522, 1612, 1580, 1450, 1427, 1399, 1333, 1315, 1221, 1196, 1171, 1126, 1103, 1051, 1022, 988, 964, 928, 899, 858, 929, 719, 692, 602 cm-1.
Příklad 49
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-N'-cyklohexyl-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 0,89 g (24 %). t.t.: 130-134 °C.
-40CZ 295562 B6
IČ (KBr): 3280, 2935, 2853,2640, 1720, 1619, 1551, 1514, 1452, 1404, 1313, 1236, 1155, 1124, 1111, 1090, 1040, 978, 828, 735, 627 cm’1.
Příklad 50
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-N'-( 1,1 -dimethyl)benzenkarboximidamid
Do roztoku 0,92 g (5,2 mmol) l-chlor-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propanu v 2 ml vody se přidalo 0,42 g (10,4 mmol) hydroxidu sodného a směs se míchala po jednu hodinu. Ktéto směsi se přidalo 1,0 g (5,2 mmol) N-hydroxy-N'-(l,l-dimethyl)-benzenkarboximidamidu rozpuštěného v 20 ml ethanolu a směs se refluxoval po 4 hodiny. Rozpouštědlo bylo odpařeno, přidalo se 50 ml vody a směs se extrahovala třikrát 50ml porcemi chloroformu. Organická fáze byla vysušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Žlutý olejovitý zbytek byl pomalu krystalizován v lednici. Krystaly byly triturovány diethyletherem a odfiltrovány. Výtěžek: 0,55 g (31 %). t.t.: 134-137 °C.
IČ (KBr): 3427, 3254, 2929, 2853,2814, 1739, 1603, 1510, 1445, 1391, 1367, 1302, 1281, 1190, 1140, 1117, 1094, 1067, 1036, 993, 963, 922, 841, 789, 716, 675 cm1.
Příklad 51
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidiny l)propoxy]-N' ,N'-diethyl-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
0,66 g (16,6 mmol) hydroxidu draselného bylo rozpuštěno v 25 ml abs. ethanolu, pak se přidalo 1,61 g (8,3 mmol) N-hydroxy-N',N'-diethyl-3-pyridinkarboximidamidu a 1,48 g (8,3 mmol) l-chlor-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propanu a směs se refluxovala po 5 hodin. Rozpouštědlo bylo odpařeno, přidalo se 50 ml vody a směs byla třikrát extrahována s 50ml porcemi ethylacetátu. Organická vrstva byla vysušena nad síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Žlutý olejovitý zbytek byl čištěn chromatografíí za poskytnutí čisté báze, jež byla rozpuštěna v 20 ml ethylacetátu a okyselena ekvivalentním množstvím suché kyseliny chlorovodíkové rozpuštěné v ethylacetátu, za poskytnutí titulní sloučeniny jako bílé krystalické pevné látky. Výtěžek: 1,3 g (42 %). t.t.: 113-117 °C.
Příklad 52
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]hexadekanoiamid monohydrochlorid
1,74 g (10 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propanu bylo rozpuštěno v 20 ml chloroformu a ochlazeno na 0 °C. Po kapkách byl během 10 minut přidán roztok palmitoylchloridu (2,85 g, 10 mmol) v 10 ml chloroformu. Po míchání směsi po 15 minut byl získaný bílý precipitát odfiltrován, promyt chloroformem a vysušen. Výtěžek: 3,2 g (71 %). t.t.: 147-150 °C.
IČ (KBr): 3242, 3090, 2951, 2916, 2849, 1730, 1653, 1520, 1472, 1439, 1371, 1300,1229, 1169, 1136, 1099, 11070, 1009, 993, 962, 928, 858, 760, 719, 602, 471 cm *.
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
-41 CZ 295562 B6
Příklad 53
N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-trifluormethyl-benzamid
Výchozí materiál: EP 365 364 (1990). Výtěžek: 69 % (olej).
IČ (KBr): 3425, 2941, 2864, 2775, 1674, 1614, 1566, 1520, 1483, 1393, 1337, 1277, 1187, 1129, 1072, 922, 914, 750, 698, 650 cm’1.
Příklad 54
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]naftalen-l-karboxamid
Výtěžek: 54 %. t.t.: 104-107 °C.
IČ (KBr): 3375, 2934, 1641, 1593, 1564,1439, 1340, 1325, 1113, 1026, 941,810, 779 cm”1.
Příklad 55
N-[2-hydroxy-3-( 1-piperidinyl)propoxy]-N'-heptylmočovina
K roztoku 1,23 g (7,1 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propanu rozpuštěného v 20 ml chloroformu se přidalo 1,0 g (7,1 mmol) heptylizokyanátu a reakční směs byla míchána po 20 hodin. Rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu a zbytek byl čištěn chromatografíí za poskytnutí čistého bezbarvého oleje. Bílý krystalický produkt byl získán triturací petroletherem. Výtěžek: 81 %.t.t.: 49-51 °C.
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 56
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-propylmočovina
Výtěžek: 50 % (olej).
IČ (KBr): 3319, 2934, 2878, 2802, 1666, 1551, 1456, 1393, 1308, 1155, 1092, 1040, 993, 889, 793 cm”1.
Příklad 57
N-cyklohexy l-N'-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]močovina
Výtěžek: 67 %. t.t.: 108-110 °C.
IČ (KBr): 3319, 3287, 3188, 2930, 2853, 2797, 1637, 1574, 1452, 1354, 1331, 1300,1101, 1098, 991 cm”1.
-42CZ 295562 B6
Příklad 58
N-hexyl-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]močovina
Výtěžek: 27 %. t.t.: 50-52 °C.
IČ (KBr): 3310, 2932, 2858, 2804, 1666, 1551, 1454, 1377, 1306, 1092, 1040, 995, 791, 725, 604 cm-1.
Příklad 59
N-(3-chlorfenyl)-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]močovina
Výtěžek: 34 %. t.t.: 117-118 °C.
IČ (KBr): 3250, 2939, 2900, 1670, 1597, 1551, 1491, 1429, 1329, 1252, 1119, 972, 775, 718, 700 cm’1.
Příklad 60
N-cyklohexyl-N'-[2-hydroxy-3-[N-cyklohexylkarbamoyl-N-( 1, l-dimethylethyl)amino]propoxyjmočovina
Výtěžek: 44 %. t.t.: 151-152 °C.
IČ (KBr): 3312, 2932, 2854, 1668, 1616, 1555, 1450, 1393, 1364, 1354, 1252, 1220, 1130, 941, 891 cm'1.
Příklad 61
N-hexyl-N'-[3-( 1 -piperidinyl)propoxy]močovina
Výtěžek: 85 % (olej).
IČ (KBr): 3354, 2932,2856, 2810, 1666, 1543, 1486, 1377, 1308, 1155, 1134, 1076 cm'1.
Příklad 62
N-Zerc-butyl-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]močovina
Výtěžek: 38 %. t.t.: 71-73 °C.
IČ (KBr): 3314, 2945, 2916, 1651, 1555, 1460, 1393, 1384, 1335, 1254, 1111, 988, 903, 839, 781 cm'1.
-43 CZ 295562 B6
Příklad 63
N-(3-nitro-fenyl)-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]močovina
Výtěžek: 54 %.
t.t.: 137-139 °C.
IČ (KBr): 3281, 2943, 2818, 1672, 1607, 1560, 1529, 1486, 1437, 1354, 1283, 1115, 802, 739 cm'1.
Příklad 64
5,6-Dihydro-5-( 1 -piperidinyl)methyl-3-(3-pyridyl)-477-l ,2,4-oxadiazin
a) 17,5 g (0,05 mol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid dihydrochloridu bylo rozpuštěno v 50 ml thionylchloridu, vařeno po jednu hodinu a pak byla směs odpařena do sucha. Zbytek byl rozpuštěn v 300 ml methanolu, zpracován s uhlím a po filtraci bylo rozpouštědlo odpařeno za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v minimálním množství ethanolu a dán do lednice za vzniku krystalického N-[3-chlor-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid dihydrochloridu jako intermediámí sloučeniny. Výtěžek: 13,2 g (71 %). t.t.: 127-145 °C.
b) 13,2 g (35,7 mmol) N-[3-chlor-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid dihydrochloridu bylo přidáno k roztoku 16,5 g (143,5 mmol) terc-butoxidu draselného rozpuštěného v 150 ml fórc-butanolu. Směs se vařila 6 hodin, pak se odpařila ve vakuu, přidalo se 100 ml 5% roztoku hydroxidu sodného a směs se extrahovala třikrát 300ml porcemi ethylacetátu. Organická vrstva byla vysušena nad síranem sodným, zfíltrována a odpařena do sucha. Zbytek byl triturován s diethyletherem za poskytnutí titulní sloučeniny jako bílých krystalů. Výtěžek: 13,2 g (71 %). t.t.: 127-145 °C.
Příklad 65
N-[3-[( 1, l-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-3-trifluormethylbenzamid
1,3 ml (15,2 mmol) epichlorhydrinu se přidalo k roztoku 1,6 ml (15,2 mmol) terc-butylaminu v 8 ml ethanolu během 10 minut za míchání a za udržování teploty pod 20 °C, a nechalo se stát po 3 dny. Zvlášť se rozpustilo 0,8 g (14,3 mmol) hydroxidu draselného ve směsi 20 ml ethanolu a 3 ml vody, a do této směsi se přidaly 3,42 g (15,2 mmol) draselného soli N-hydroxy-3(trifluormethyl)-benzamidu a dříve připravená směs epichlorhydrinu a terc-butylaminu. Reakční směs se míchala a vařila po 10 hodin, pak bylo rozpouštědlo odpařeno. Zbytek byl triturován s 20 ml dichlormethanu a 10 ml vody, organická fáze byla oddělena, promyta 5 ml vody a 5 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušena nad síranem sodným, zfíltrována a odpařena. Olej ovitý zbytek byl krystalizován ve směsi aceton-hexan za poskytnutí bílé látky jako titulní sloučeniny. Výtěžek: 0,85 g (17,3 %). t.t.: 156-158 °C.
IČ (KBr): 2976, 2858, 1121, 1556, 1379, 1352, 1313, 1273, 1165, 1130, 1072, 694 cm'1.
-44CZ 295562 B6
Příklad 66
Methyl-N-[2-hydroxy-3-(l-píperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidát (Z)-2-butendioát (1:1)
11.4 g (38,2 mmol) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchloridu se rozpustilo v 60 ml abs. ethanolu a pak se po kapkách během 5 minut přidalo 25 ml (0,1 mol) 25% methanolového roztoku methoxidu sodného. Reakční směs se vařila půl hodiny a pak byla odpařena. Zbytek byl míchán s 210 ml dichlormethanu půl hodiny, chlorid sodný byl odfiltrován a filtrát byl promyt 50 ml vody a 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušen nad síranem hořečnatým a odpařen za sníženého tlaku. Surový produkt byl čištěn chromatografíí za poskytnutí titulní sloučeniny jako světle žlutého oleje. Výtěžek: 2,9 g (29 %). Elementární analýza pro C15H23N3O3: vypočt. nalezeno: C % 61,4; 61,2; H % 7,90; 7,91; N % 14,3; 14,5.
Příklad 67
Diethyl-N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]iminokarbonát
Směs 0,87 g (5 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propanu a 1,1 g (5,5 mmol) tetraethylorthokarbonátu se míchala při 100 °C po 3 hodiny v přítomnosti katalytického množství kyseliny p-toluensulfonové. Po odpaření byl zbytek čištěn kolonovou chromatografíí (Měrek Kieselgel 60, eluent chloroform/methanol/konc. NH4OH 30:5:0,2) za poskytnutí titulní sloučeniny jako světle žlutého oleje. Výtěžek: 27,7 % (olej).
13C-NMR (d, CDCI3): 154,9 (s, C=N), 76,5 (t, N-OCH2), 66,6 (d, CHOH), 64,5 (t, CH3CH2),
61.5 (t, CHCH2N), 54,8 (t, píperidin), 26,0 (t, piperidin), 24,2 (t, piperidin), 14,9 (q, CH3), 14,1 (q, CH3).
Příklad 68
N—[3—[( 1,1 -dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-0-ethyl-N'-feny 1-izomočovina
18,4 g (0,1 mol) ethyl N-fenyl-chlorformimidátu (F. Lengfeld a J. Stieglitz: Am. Chem. J. 16, 70 (1984)) a 16,2 g (0,1 mol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-[(l,l-dimethylethyl)amino]propanu [Ger. Off. 2 651 083] se rozpustilo v 200 ml tetrahydrofuranu, přidalo se 13,9 ml (0,1 mol) triethylaminu a směs se míchala při teplotě místnosti po 10 hodin. Triethylamin hydrochlorid, jenž se vytvářel, byl odfiltrován a filtrát byl odpařen ve vakuu, zbytek byl rozpuštěn v 200 ml chloroformu a promyt 50 ml vody. Organická vrstva byla vysušena nad síranem sodným, zfíltrována a odpařena za sníženého tlaku. Surový olejovitý zbytek byl čištěn chromatografíí za poskytnutí titulní sloučeniny jako světle žlutého oleje. Výtěžek: 18,5 g (59,8 %). Elementární analýza pro C]6H27N3O3: vypočt. nalezeno: C % 62,1; 61,3; H % 8,8; 8,5; N % 13,6; 13,7.
Příklad 69
N-[3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-O-fenyl izokarboxamid
3,16 g (20 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propanu se rozpustilo v 50 ml benzenu, přidalo se 2,4 g (20 mmol) fenylkyanátu a směs se míchal za teploty místnosti po 12 hodin. Přidalo se dalších 0,16 g (1,3 mmol) kyanátu a směs se míchala dalších 12 hodin. Po odpaření byl zbytek rozpuštěn v methanolu a tento roztok byl vyčeřen aktivovaným uhlím a odpařen. Produkt byl kiystalizován z ethylacetátu/ethylalkoholu za poskytnutí bílého materiálu. Výtěžek: 46,9 %. t.t.: 63-70 °C (ethylacetát).
-45 CZ 295562 B6 13C-NMR (d, D2O): 152,4; 129,9; 125,8; 119,9; 70,3; 57,4; 54,3; 53,2; 23,0; 22,7; 21,0.
Příklad 70
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-pentamethylen-0-ethyl-izomočovina
2,7 g (0,01 mol) diethyl-N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]iminokarbonátu (viz příklad 67) a 0,99 ml (0,01 mol) piperidinu bylo rozpuštěno v 40 ml tetrahydrofuranu a mícháno za teploty místnosti po 2 hodiny, a pak odpařeno do sucha. Zbytek byl čištěn chromatografíí za poskytnutí titulní sloučeniny jako oleje. Výtěžek: 2,1 g (67,1 %) Elementární analýza pro Ci6H3iN3O3: vypočt. nalezeno: C % 61,3; 61,1; H % 10,0; 9,8; N % 13,4; 13,6.
Příklad 71
N,N-dimethyl-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N-fenylguanidin hydrochlorid
1150 mg (6,58 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propanu (Ger. Off. 2 651 083) se rozpustilo v chloroformu, přidalo se 750 mg Na2CO3, pak se po kapkách přidal roztok 1206 mg (6,58 mmol) N,N-dimethyl-N'-fenyl-chlorformamidinu (BR 888646 /1959/, Bayer, aut.: Kiihle a Eue L.; CA 57, 136961 /1962/) v 10 ml chloroformu. Po 5 hodinách byla pevná fáze odfiltrována a filtrát byl odpařen. Tento zbytek (1800 mg oleje) byl rozpuštěn v 10 ml ethylacetátu a produkt byl sražen přidáním 10,46 ml 0,54 N HCl/ethylacetát. Žlutý precipitát byl zfiltrován promyt a konečně rekrystalizován z acetonu, po ethylacetátu. Výtěžek: 28 %. t.t.: 127-129 °C.
IČ (KBr): 3220, 2093, 2840, 2690, 2620, 1608, 1580, 1475, 1433, 1375, 1250, 1070, 1050, 1000, 925, 900, 760, 705 cm’1.
Příklad 72
N—[3—[( 1, l-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-N'-fenylguanidin
3,1 g (0,01 mol) N-[3-[(l,l-dimethylethyl)amino]-2-hydroxy-propoxy]-O-ethyl-N'-fenylizomočoviny (viz v příkladě 68) se rozpustilo v 20 ml tetrahydrofuranu, přidalo se 200 ml 25% roztoku hydroxidu amonného a 0,26 g (5 mmol) chloridu amonného, a směs byla ponechána při teplotě místnosti po 15 hodin. Směs byla odpařena do sucha a čištěna chromatografíí za poskytnutí titulní sloučeniny jako oleje. Výtěžek: 1,7 g (60,7 %). Elementární analýza pro Ci4H24N4O2 vypočt: nalezeno: C % 60,0; 60,2; H % 8,6; 8,9; N % 20,0; 19,8.
Příklad 73
N, N'-difenyl-N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]benzenkarboxamidin hydrochlorid
3,55 g (20 mmol) 3-piperidin-2-hydroxy-l-propanu bylo rozpuštěno v 2,5 ml vody, přidalo se
O, 8 g (20 mmol) NaOH a směs byla míchána za teploty místnosti po 1 hodinu. Pak byl přidán roztok 6,49 (20 mmol) N,N'-difenyl-N-hydroxy-benzen-karboxamidin hydrochloridu v 60 ml ethylalkoholu, po kapkách, a dalších 0,8 g (20 mmol) NaOH. Získaná žlutá suspenze se vařila po 2 hodiny. Vysrážený chlorid sodný byl odfiltrován a promyt ethylacetátem. Rozpouštědlo bylo odpařeno, přidalo se 40 ml ethylacetátu a dvakrát se extrahovalo 40ml porcemi destilované vody.
-46CZ 295562 B6
Organická fáze byla vysušena nad síranem sodným, zfíltrována. Produkt byl sražen přidáním
5,5 ml 3,67 N HCl/ethylacetát. Precipitát byl zfiltrován promyt a konečně rekrystalizován z methanol/etheru. Výtěžek: 42 %. t.t.: 151-155 °C (methanol/ether).
13C-NMR (d, CDC13): 159,6; 148,0; 140,9; 131,0; 129,7; 129,3; 128,9; 127,9; 127,5; 64,2; 60,2; 54,5; 22,7; 21,9.
Příklad 74
N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-N-methyl-N'-fenyl-0-ethylizokarboxamid
Postup preparace této sloučeniny je stejný, jako se píše v příkladu 68, s použitím 1-methylaminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propanu a ethyl-N-fenylchloroformamidátu jako výchozích materiálů. Výtěžek: 56 % (olej). Elementární analýza pro C17H29N3O3: vypočt. nalezeno: C % 66,4; 66,2; H % 9,5; 8,9; N % 13,7; 13,9.
Příklad 75
N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-N-methyl-N'-fenyl-O-ethylizokarboxamid
Postup preparace této sloučeniny je stejný, jako se píše v příkladu 72, s použitím N-[3-(lpiperidinyl)propoxy]-N-methyl-N'-fenyl-O-ethylizomočoviny (viz příklad 74) jako výchozího materiálu. Výtěžek: 43 % (olej). Elementární analýza pro C16H26N4O2: vypočt. nalezeno: C % 62,7; 62,2; H % 8,5; 8,8; N % 18,3; 18,4.
Příklad 76
N,N,N'-trimethyl-N'-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-fenylguanidin
344 mg (2,0 mmol) l-methylaminooxy-2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propanu bylo rozpuštěno v chloroformu, přidalo se 750 mg Na2CO3, pak se po kapkách přidal roztok 438 mg (2,0 mmol) N,N-dimethyl-N'-fenyl-chlorformamidinu hydrochloridu v 3 ml chloroformu. Po 8 hodinách byla pevná fáze odfdtrována a fdtrát byl odpařen. Tento zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu a produkt byl extrahován přidáním roztoku HC1 (pH = 1) k vodě. Vodná fáze byla zalkalizována přidáním 2N roztoku NaOH na pH = 11, a extrahována ethylacetátem. Organická fáze byla odpařena a další čištění se provedlo kolonovou chromatografii za poskytnutí titulní sloučeniny jako žlutého oleje. Výtěžek: 10 % (olej).
13C-NMR (d, CDCI3): 156,6; 150,5; 128,4; 121,4; 120,5; 70,0; 55,9; 54,4; 40,6; 39,4; 25,8; 25,6;
24,3.
Příklad 77 /R/(+)-N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
2,16 g (3,26 mmol) (S)-N-[2-[2-(R)-(l,l-dimethylethyloxykarbonylamino)-3-fenylpropionyloxy]-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioátu (1:1) (viz příklad 18) bylo suspendováno v 40 ml methanolu a vařeno 1 hodinu, pak odpařeno do sucha. Zbytek byl triturován s 20 ml ethylacetátu, precipitát byl odfdtrován a promyt ethylacetátem.
-47CZ 295562 B6
Tento surový produkt byl rekrystalizován v izopropylalkoholu za poskytnutí titulní sloučeniny.
Výtěžek: 1,16 g (85 %). t.t.: 136-137 °C.
[a]D = + 5,6° [c = 1, MeOH, t = 27 °CJ.
Příklad 78
N-(3-piperidin-l-propoxy)-3-pyridinkarboximidoylchlorid dihydrochlorid
Po ochlazení směsi 10 ml destilované vody a 4,36 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové na 0 °C se za míchání přidaly 2 g (7,62 mmol) N-(3-piperidin-l-propoxy)-3-pyridinkarboxamidinu (viz příklad 31). K tomuto žlutému roztoku se po kapkách za míchání během 30 minut při -5 °C přidalo 2,7 g (3,81 mmol) dusitanu sodného rozpuštěného v 10 ml vody. Po míchání tohoto nazelenalého roztoku při -5 °C po 1,5 hodiny bylo pH roztoku nastaveno na 10 přidáním IN vodného roztoku hydroxidu sodného za chlazení, pak byl roztok extrahován třikrát s 40 ml chloroformu. Organická fáze se promyje 20 ml vody, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Zbytek je čištěn kolonovou chromatografíí (Měrek Kieselgel 60, eluent chloroform/methanol 1:1) za poskytnutí 1,7 g (79,2 %) báze odpovídající titulní sloučenině. Titulní hydrochlorid se připraví ze získané báze přidáním ethanolového roztoku chlorovodíku, t.t.: 165-167 °C.
IČ (KBr): 3015, 2945, 2617, 2515, 2088, 1982, 1600, 1570, 1437, 1402, 1200, 1060, 988, 912, 808 cm1.
Shora uvedený výchozí materiál lze připravit jak následuje:
Po rozpuštění 2,86 g (51,06 mmol) hydroxidu draselného ve 20 ml abs. ethanolu se po částech za míchání přidalo 6,45 g (47,0 mmol) 3-pyridinkarboxamidoximu. Po rozpuštění se po kapkách přidalo 7,7 g (47,66 mmol) l-(3-chlorpropyl)piperidinu rozpuštěného v 5 ml ethanolu. Po 9hodinové reakci byl vysrážený chlorid draselný odfiltrován, ethanolový roztok vyčeřen aktivním uhlím a odpařen. Odpařený zbytek byl po vzetí do 100 ml chloroformu promyt třikrát se 100 ml IN roztoku hydroxidu sodného, pak s 50 ml vody. Po oddělení byla organická fáze vysušena nad síranem sodným, zfiltrována a odpařena. Olejovitý zbytek se při ochlazení stává krystalickým. Krystaly se triturují s asi 20 ml etheru, filtrují a suší za poskytnutí béžového produktu ve výtěžku 4,8 g (38,9%).
IČ (KBr): 3422, 3107, 2937, 2870, 2819, 1640, 1479, 1391, 1309, 1194, 1123, 1059, 1042, 982, 916 cm-1.
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byla připravena následující sloučenina:
Příklad 79
O-(3-piperidino-l-propyl)-3-nitrobenzhydroximoylchlorid hydrochlorid
Výtěžek: 50 %. t.t.: 173-175 °C.
IČ (KBr): 3420, 2926, 2953, 2649, 2546, 1514, 1591, 1533, 1452, 1354, 1259, 1252, 1049, 994, 733 cm’1.
-48CZ 295562 B6
Příklady prostředků
Příklad 1: Tableta
Tableta obsahující 50 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid 50,0 mg, kukuřičný škrob 100,0 mg, laktóza 95,0 mg, stearát hořečnatý 4,5 mg.
Aktivní složka se jemně semele, smíchá s aditivy, směs se zhomogenizuje a granuluje. Granulát se slisuje do tablet.
Příklad 2: Tableta
Tableta obsahující 5 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-nitrobenzimidoylchlorid monohydrochlorid
5,0 mg, kukuřičný škrob 75,0 mg, laktóza 7,5 mg, koloidní kys. křemičitá 7,5 mg, stearát hořečnatý 5,0 mg.
Prostředek se připraví ze shora uvedených složek v souladu s příkladem 1.
Příklad 3: Tableta
Tableta obsahující 5 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[2-benzoyloxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid (Z)-2-butendioát (1:1) 5,0 mg, kukuřičný škrob 75,0 mg, želatina 7,5 mg, mikrokrystalická celulóza (Apical) 25,05 mg, stearát hořečnatý 2,5 mg.
Prostředek se připraví ze shora uvedených složek v souladu s příkladem 1.
-49CZ 295562 B6
Příklad 4: Kapsle
Kapsle obsahující 10 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[2-palmitoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid 10 mg, laktóza 80 mg, kukuřičný škrob 25 mg, talek 3 mg, koloidní kys. křemičitá 3 mg, stearát hořečnatý 2 mg.
Aktivní materiál se smíchá s aditivy, směs se zhomogenizuje a naplní do želatinových kapslí.
Příklad 5: Kapsle
Kapsle obsahující 20 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid 20 mg, mikrokrystalická celulóza (Apical) 99 mg, amorfní kys. křemičitá 1 mg.
Aktivní materiál se smíchá s aditivy, směs se zhomogenizuje a naplní do želatinových kapslí.
Příklad 6: Dražé
Dražé obsahující 25 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[3-[( 1, l-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-3-trifluormethylbenzamidin hydrochlorid 25 mg, karboxymethylcelulóza 295 mg, kyselina stearová 20 mg, acetát ftalát celulózy 40 mg.
Aktivní materiál se smíchá s karboxymethylcelulózou a kyselinou stearovou a směs se granuluje v roztoku acetátftalátu celulózy v 200 ml ethanolu/ethylacetátu. Z granulátu se slisuje jádro, jež se potáhne vodným roztokem polyvinylpyrrolidinu obsahujícího 5 % cukru.
-50CZ 295562 B6
Příklad 7: Injekce
Injekční roztok se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-2-nitrobenzimidoylchlorid 5 g, sterilní fyziologický roztok soli 2,0 ml.
Příklad 8: Mazání
Mazání se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidoylchlorid monohydrochlorid
7,5 g, kyselina stearová 18,0 g, cetyl-stearyl alkohol 15,0 g, monostearát glycerolu 4,0 g, laurylsulfát sodný 1,5 g, methyl /2-hydroxybenzoát 0,2 g, destilovaná voda 150 ml.
Kyselina stearová, cetyl stearyl alkohol a monostearát glycerolu se roztaví dohromady. Laurylsulfát sodný a methyl p-hydroxybenzoát se rozpustí ve 100 ml vody za mírného zahřívání a pak se přidají do lipofilních složek za míchání, dokud teplota neklesne na teplotu místnosti. Následně se přidá roztok aktivní složky v 50 ml vody a důkladně promíchá.
Příklad 9: Mazání
Mazání se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-2-nitrobenzimidoylchlorid monohydrochlorid 7,0 g, polysorbát 4,0 g, tekutý parafín 4,0 g, cetyl stearyl alkohol 12,0 g, bílá vazelína 20,0 g, monostearát glycerolu 4,0 g, methyl p-hydroxybenzoát 0,2 g, ethylalkohol 1,8 g, destilovaná voda 150 ml.
-51 CZ 295562 B6
Prostředek se připraví jako je popsáno v příkladu 8.
Příklad 10: Krém
Krém se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-4-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)10,0 g, bílá vazelína 90,0 g, bílý vosk 3,0 g, cetyl stearyl alkohol 3,0 g, tetraboritan sodný 4,0 g, methyl /?-hydroxybenzoát 0,2 g, destilovaná voda 90 ml.
Roztok ve vodě rozpustných složek se přidá k teplé směsi lipofílních složek jako v příkladu 8, a do konečné emulze se přidá vodný roztok aktivní sloučeniny.
Příklad 6
Účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu na buněčnou expresi HSP (zkoumáno na translační úrovni)
Pozadí
Pokusy uváděné v této sekci byly prováděny za účelem stanovení, zda N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát působí ve zvyšování exprese molekulárních chaperonů buňkou. Nahromadění různých bílkovin tepelného šoku po určitém období vystavení tepelnému šoku samotnému a tepelnému šoku v kombinaci s podáváním N-[2hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu bylo zkoumáno přidáváním 10~5 M N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu před, v průběhu nebo okamžitě po hypertermickém působení na srdeční myogenní buňky (H9c2 buňky).
Materiály a metody
a) podmínky kultivace buněk
Buněčná linie H9c2 odvozená z embryonálních potkaních srdečních buněk byla získána z Evropské sbírky zvířecích tkáňových kultur (ECACC) (88092904). Buňky se udržovaly při 37 °C v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) doplněném 10% fetálního telecího séra (GIBCO) v termostatu JOUAN CO2 (5 % CO2).
-52CZ 295562 B6
b) působení N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidiny l)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem a podmínky tepelného šoku
Tepelný šok se prováděl při 43 °C v CO2 termostatu po dané časové intervaly (20, 40, 60, 90 a 120 minut). Buňky byly vzaty zpět do 37 °C na 6 hodin a extrahovaly se bílkoviny pro SDS-PAGE. Když se N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát přidával před tepelným šokem, podal se 10‘5 M N-[2-hydroxy-3-(l -piperidiny 1)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát v ΙΟ'5 M koncentraci těsně po tepelném stresu, během 6-hodinové periody nápravy. Pokusy se opakovaly třikrát.
Pro SDS-PAGE byly buňky rozrůstány v 6cm Petriho miskách. Množství buněk na začátku pokusu bylo 8x 105 a buňky byly ještě subkonfluentní když se extrahovala bílkovina. Po 6hodinové nápravě se buňky promyly dvakrát v PBS a pak seškrabaly z povrchu misek v PBS. Pak se buňky stočily po 5 minut při 25 ot/s a vzaly do 100 μΐ modifikované solubilizačního pufru (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) obsahujícího 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Triton N-100, 1 mM PMSF, 2 mg/ml aprotininu, 1 pg/ml chymostatinu, a sonikovaly 3 x po 20 sekund (2 min intervaly, nastavení 8).
Koncentrace bílkovin se pak stanovila z 5μ1 vzorků stanovením Bradfordové (M.M. Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976)) ve třech paralelách. Vzorky se nastavily na koncentraci bílkoviny 100 pg/30 pg pomocí pufru uvedeného shora a dalšího pufru tak, že konečná koncentrace složek v tomto pufru bude: llOmM Tris-HCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoethanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a něco bromfenolové modři; pak se třepe při teplotě místnosti po 30 minut.
Elektroforéza se prováděla podle Laemmliho (U. K. Laemmli, Nátuře 227: 680-685 (1970)) na dvou 8-18% polyakrylamidových gelech při konstantním napětí 50 V přes noc. Bílkoviny se pak buď vybarvily s Coomassie Brilliant Blue R-250, anebo přenesly na Immobilone PVDF/Millipore) při konstantním proudu (300 mA) po 3 hodiny při 4 °C v přenosovém pufru (10 mM CAPS, pH 11, 10% methanol) (Protein Blotting Protocols far the Immobilon-P Transfer Membrane, 3. laboratorní manuál, Millipore). Po přenosu se zablokovala nespecifická místa membrány 2% bovinním sérovým albuminem (BSA) v TPBS (fosfátem pufrovaný solný roztok obsahující 0,1 % Tween 20) při 4 °C přes noc. Membrána s přeneseným materiálem se pak inkubovala s GRP94 monoklonální protilátko (SPA-850, StressGen), zředěnou 1:3000, HSP60 monoklonální protilátkou (SPA-600, StressGen), zředěnou 1:1250, nebo HSP90 monoklonální protilátkou (AC88, StressGen), zředěnou 1:2000, po 1 hodinu při teplotě místnosti. Pak se membrána promyla s TPBS pufrem po jednu hodinu, a inkubuje po další 1 hodinu s antipotkaní (Sigma, 1:4000 zředění, pro GRP-94) resp. anti-myší (Sigma, adsorbovaná s lidskými a potkaními bílkovinami, 1:3000 zředění, pro Hsp60, HSP72 nebo HSP90) sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. Po následném mytí s TPBS se membrána vyvíjela s ECL (zesíleným chemiluminiscenčním) systémem (Amersham).
Diluční série celkové bílkoviny byla pokaždé přenášena a vyvíjena paralelně se vzorky a kalkulovala se kalibrační křivka. Změny v obsahu stresových bílkovin se kvantifikovaly s použitím denzitometru Bio-Rad (Model 1650) a integrátoru Hewlett-Packard (HP 3394 A) a opravily podle kalibrační křivky. Při kalkulacích denzitometrických dat se považoval pás dané bílkoviny při 37 °C bez N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu za 100 % a všechny další intenzity se porovnávaly s tímto vzorkem.
-53 CZ 295562 B6
c) statistická analýza
Data se uvádějí jako střed ± SE. Statistická porovnání a výpočty se prováděly jednosměrnou analýzou variace s Posthoc Newman-Kaulsovým testem (Pharmacological Calculation Systém). Statistická významnost byla definována jako P < 0,05.
Výsledky
Hsp60: Působení N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu prováděné při 37 °C nemělo žádný měřitelný účinek na hladinu této hsp. Tepelný šok při 43 °C samotný, trvající po 20 min, může zvýšit množství hsp60 skoro dvakrát. Při prodlužovaném trvání tepelného působení nebylo lze pozorovat žádné další zvyšování hladiny této bílkoviny. Když se podal N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát v ΙΟ’5 M koncentraci 16 hodin před stresem, množství hsp60 se zvýšilo přibližně pětkrát (ve srovnání s 37 °C kontrolou) dokonce i ve vzorcích vystavených k 20-minutovému tepelnému působení. Tento účinek N-[2-hydroxy-3-(l~piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu byl evidentní i u vzorků tepelně zpracovaných po 40 resp. 60 minut, ale potom začal klesat. N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát přidaný ve fázi nápravy byl rovněž účinný, i když ve významně menším rozsahu než se pozoroval při přidání této sloučeniny před stresem.
Hsp72: Množství klidové hsp72 bylo v H9c2 buňkách dosti nízké, ale účinek různých působení na hladinu hsp72 byl dramatický. Významné zvýšení bylo už u 20 minutového tepelného šoku, au 40minut tepelného působení bylo množství téměř 10krát vyšší než bylo detekováno v kontrolních buňkách. Tepelné působení o delším trvání nemělo za výsledek žádnou významnou změnu v porovnání s 40 min vzorky. Podání N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátu před tepelným stresem mělo velmi značný účinek. Při 60 min tepelném stresu se hladina hsp72 zvýšila asi 50 krát ve srovnání s 37 °C vzorky, ale významné zvýšení bylo možno detekovat již při tepelném stresu trvajícím po 40 minut. Tato vysoce indukovaná množství hsp72 byla stabilní v buňkách tepelně šokovaných po 120 minut. N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát přidaný ve fázi nápravy byl rovněž účinný, i když v menším stupni.
Hsp90: Při 20 min tepelném působení nebyl tepelný šok sám schopen indukovat zvýšenou hladinu HSP90, avšak když se před tepelným šokem přidal N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát, hladina Hsp90 se zvýšila asi pětkrát. Nejvyšší účinek preinkubace s touto sloučeninou bylo lze pozorovat po její kombinaci s 60 min tepelným působením. Je zajímavé si povšimnout, že v případě HSP90 byl N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát přidaný po 60 min 43 °C působení účinné stejně (ne-li více) jako když se přidá před stresem vysoké teploty. U inkubací za vysoké teploty delších než 90 minut účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu zřetelně slábne.
Grp94: Tvorba stresové bílkoviny Grp94 byla inkubována po 20 min tepelném šoku. Tento účinek měl vrchol při tepelném působení po 60 minut, po čemž následoval prudký sestup již v případě 90 min vzorků. Schopnost N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu indukovat hladinu Grp94 byla nevýraznější v případě, kdy se sloučenina přidávala před stresem, ale významný vzestup bylo vidět i když se kombinovalo přidání sloučeniny předem s 20 minut trvajícím tepelným šokem (kde byl čtyřnásobný vzrůst v porovnání s působením 43 °C). Na druhé straně: Přidání této sloučeniny během nápravy po tepelném stresu trvajícím 40 nebo 60 minut bylo skoro stejně účinné jako podání N-[2-hydroxy3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu po 16 hodin před stresem.
-54CZ 295562 B6
Obrázek 2 ukazuje „Western“ analýzu bílkovin z H9c2 buněk. Použité sondy jsou: Protilátka khsp60, ukázaná v (1); protilátka khsp72, ukázaná v (2); protilátka khsp90, ukázaná v (3); protilátka k grp94, ukázaná v (4). Dráha (-) představuje buňky držené v nepřítomnosti N-[2hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu při 37 °C a dráha (+) představuje buňky držené v jeho přítomnosti (koncentrace 10'5 M po 16 hodin). Tepelný šok při 43 °C se prováděl po časy vyznačené v obrázku. N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát při 10'5 M konc. byl přidán 16 hodin před tepelným působením (dráha (B)) nebo v průběhu periody nápravy (dráha (A)).
Celkový pohled na účinek různých působení na množství různých hsp v H9c2 srdečních buňkách poskytuje obr. 1. Množství stresových bílkovin v buňkách vystavených tepelnému šoku samotnému (43 °C) je představováno (A); množství stresových bílkovin v buňkách, na něž se působilo 10’5 M N-[2-hydroxy-3-(l-piperidmyl)propoxy]-3-pyridmkarboximidoylchlorid maleátem před tepelným působením je představováno v (B); a množství stresových bílkovin v buňkách, na něž se působilo 10‘5M N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem v průběhu 6-hodinové periody nápravy je představováno (C). Vodorovná osa představuje časové trvání tepelného působení a svislá osa představuje relativní množství stresových bílkovin.
Tepelné působení indukovalo všechny druhy HSP zkoumané v této studii. Vzrůst byl méně výrazný v případě hsp60. Hladina hsp60 se zvýšila asi dvakrát po vystavení buněk 20 min tepla, zatímco při delších působeních nebylo lze detekovat žádný další vzrůst. Největší účinek tepelného stresu byl viditelný u hsp72, kde se její množství zvyšovalo na asi dvanáctinásobek, když se N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát přidal 16 hodin před tepelným působením, daná hladina všech HSP se zvyšovala dále na přinejmenším dvojnásobek v porovnání s hladinou pozorovanou pro tepelný stres. Bylo rovněž jasné, že mezi HSP se hladina hsp72 zvyšovala v mnohem větším rozsahu při kombinaci tepelného stresu a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu, znovu když se porovnává k indukci detekované pro tepelný stres samotný. Když se N-[2-hydroxy-3(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát podával ve fázi nápravy, skoro ve všech zkoumaných případech se obsah hsp zvyšoval, ale opět zvýšení hsp72 bylo nejvýraznější.
Rozbor „Western“ analýza ukázala značné nahromadění HSP zkoumaných tříd po vystavení srdečních buněk tepelnému šoku. Přidání N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu buď před, anebo po šoku vysokou teplotou, znásobovalo účinek tepelného působení na produkci HSP. Podle tohoto tedy N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát působení synergicky s teplotním stresem indukcí tvorby všech tříd molekulárních chaperonů.
Příklad 7
Účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu na buněčnou expresi HSP (zkoumáno na transkripční úrovni)
Pozadí
Krátké vystavení ischemii (např. opakovaným tlakem) může prekondiciovat srdce a chránit jej před následnou letální ischemii, jak je doloženo sníženou incidencí ventikulámí fíbrilace, zmenšenou velikostí infarktu a lepší nápravou místních funkcí myokardu během reperfuze ischemického srdce. U takovéhoto prekondicionování bylo prokázáno, že indukuje expresi HSP,
-55 CZ 295562 B6 obzvlášť hsp72. V této sekci se zkoumá účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátu pomocí sledování akumulace mRNA v buňkách po ischemii a porovnávání se situací, kdy se ischemie kombinuje s podáváním N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu.
Materiály a metody
a) indukce tepelného stresu
Experimenty se prováděly na samcích SPRD potkanů. Zvířata byla anestetizována Nembulatem v dávce 60 mg/kg/i.p. Tělesná teplota potkanů byla udržována infralampou umístěnou nad břichem a měřila se tělesná teplota. Po 20-40 minutové periodě byla teplota potkanů zvýšena na 42,0-42,2 °C a tato teplota byla udržována po 15 minut. Po periodě zotavení (2 hod.) byly vzaty vzorky tkání z levých a pravých srdečních komor.
b) indukce srdeční ischemie
Experimenty se prováděly na samcích SPRD potkanů. Zvířata byla anestetizována Nembulatem v dávce 60 mg/kg/i.p. Po otevření hrudníku byla stlačena po 5 minut LAD koronární arterie a pak se zjišťovala incidence a trvání ventrikulámí tachykardie a fíbrilace vreperfuzní periodě (10 minut). Odebraly se vzorky tkání z levých a pravých srdečních komor.
c) metoda „Northern“ analýzy
Celková RNA se extrahovala s použitím RNAgents (Promega) podle instrukcí výrobce (Protocols and Applications, 2. vydání, 1991, Promega Corporation). Ve stručnosti: zmrzlé vzorky tkání (vzorky tkání z levých a pravých srdečních komor potkanů podrobených tepelnému stresu nebo srdeční ischemii) vážící 50 až 100 mg se homogenizují v 1,0 ml denaturujícího při +4°C Brinkmanovou homogenizací. Pak se přidala 1/10 objemu 3 m octanu sodného (pH 4,0) ahomogenát se extrahoval kyselým fenolem (fenol:chloroformňzoamylalkoholu 25:24:1) vortexováním po 10 sekund. Vzorek se inkuboval na ledu po 15 minut, a pak centrifugoval (4 °C, 20 min, 10 000 x g). Vodná fáze se přenesla do nových Eppendorfových zkumavek, postup se opakoval a vodná fáze se srazila při -20 °C přes noc. Po centrifugaci (4 °C, 20 min, 10 000 x g) se precipitát promyl dvakrát 95% alkoholem a vysušil za teploty místnosti. RNA se rozpustila v 20 μΐ vody zpracované s DEPC. Osm pg celkové RNA se podrobilo kapilárnímu přenosu na formaldehyd-agarózovém gelu, RNA z gelu se přenesla na nylonovou membránu podle instrukcí výrobce (Zeta-Probe GT, BioRad).
Obsah hsp72 mRNA u jednotlivých vzorků se porovnával s hladinou mRNA glyceraldehyd-3fosfát dehydrogenázového (GAPDH) genu odpovídajících sond. DNA sondy (lidská hsp70 cDNA plné délky a Apa-Ncol fragment potkaní GAPDH cDNA) byly značeny alfa-32P CTP s použitím soupravy Ramdom prime DNA Labeling Kit (USB). Radioaktivně značené fragmenty byly čištěny na koloně Sephadexu G-50 (Pharmacia) jak je popsáno (Ausubel et al., vyd.: Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, 1987).
Prehybridizace se prováděly při 65 °C v H-pufru (0,25 M Na2HPO4, pH 7,2, 7 % SDS) po 15 minut. Hybridizace se prováděly přes noc (65 °C, H-pufr) s izotopově značenou cDNA sondou o alespoň 106 cpm/ml. Membrána byla promyta s 20 mM Na2HPO4, pH 7,2, 5 % SDS (65 °C, 2 x 15 min) a hodnocena autoradiografií. Tatáž membrána se použila k sondování hsp70 mRNA a měření GAPDH mRNA se použilo jako vnitřní standard.
Výsledky
Koronární okluze po 5 minut byla následována reperfuzí, což u potkanů vyvolávalo ventrikulámí tachykardii a fíbrilace. Před-působení N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridin
-56CZ 295562 B6 karboximidoylchlorid maleátem (0,5-, 0,75-, 1,0 mg/kg tělesné hmotnosti i.v. 5 min před okluzí) významně snižovalo střední trvání ventrikulámí tachykardie a zlepšovalo přežívání prevenci ventrikulární fibrilace.
Zatímco všechna zvířata (n = 6) kontrolní skupiny zemřela během fáze reperfuze, zvířata, na něž se působilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem (100 mg/kg p.o.) nejenže přežívala reperfuzi po 5 min okluzi, ale byla u nich detekována i značně zvýšená exprese hsp72 genu v preparátech srdečního svalu.
Obrázek 3 je „Northern“ analýza celkové RNA izolované z levé komory potkaního srdce, ilustrující výsledky získané v tomto experimentu. Kontrola (dráha 1), tepelné působení (dráha 2), imitační operace (dráha 3), ischemie (dráha 4), N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleát plus ischemie (dráha 5), aN-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát (dráha 6). GADPH se měřil jako interní sonda. Pro tepelný šok se rektální teplota udržovala na 42 °C po 15 minut.
Zaznamenalo se, že samotné podávání N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu nemá schopnost aktivovat hsp72 gen.
Příklad 8
Ochranný účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu proti srdeční ischemii
Samci Sprague-Dawley potkanů byli anestetizováni pentobarbitalem sodným (Nembutal, 60 mg/kg tělesné hmotnosti, i.p.) a uměle ventilováni ovzduším místnosti (2 ml/100 g, 54 cyklů za minutu) prostřednictvím tracheotomie. Pravá karotidová tepna se katetrizovala a spojila se s převodníkem tlaku (BPR-01, Stoelting) k měření systémového tepenného krevního tlaku (BP) pomocí předzesilovače (Hg-02, Experimetria). Hydroxylaminové deriváty zveřejněné v příkladu 5 se podávaly prostřednictvím kanyly k jugulámí žíle (i.v.) nebo orálně (p.o.). Tep (HR) se měří kardiotachometrem (HR-01, Experimetria) a snímá se elektrokardiogram (ECG standardní vedení II) na záznamové zařízení (MR-12, Medicor) pomocí podkožních nerezových jehlových elektrod. Hrudník se otevřel levou thoraktomií a pak se srdce exteriorizovalo jemným tlakem na pravou stranu hrudního koše. Pod levou hlavní koronární artérii se rychle umístilo 4-0 hedvábné šití, jak je popsáno Selyem et al. (1960). Srdce se opatrně umístilo zpět do hrudníku a zvíře bylo ponecháno zotavit se. Monitorovala se rektální teplota a udržovala se konstantní na 37 °C. Experimentální protokol začínal 15 minutovou stabilizační periodou během níž pozorování krevního tlaku trvala nižšího než 70 mm Hg nebo arytmie vedlo k vyřazení. Myokardiální ischemie se pak vyvolala koronární okluzí po 5 minut a reperfuze se ponechala po 10 minut.
V průběhu celého pokusu se BP, HR a ECG nepřetržitě zaznamenávaly na vícekanálovém zapisovači (R61-6CH, Medicor). Hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, se podávaly v 5. a 60. minutě před okluzí i.v. nebo p.o. cestou. Dávky hydroxylaminového derivátu z příkladu 5 byly 0,5, 0,75, 1,0 mg/kg i.v. a 100 mg/kg tělesné hmotnosti p.o., zatímco referenční substance Bepiridil se podávala v dávce 1,0 mg/kg i.v.
Střední trvání ventrikulámí tachykardie (VT) a/nebo ventrikulámí fibrilace (VF) v průběhu prvních 3 minut reperfuze se analyzovaly jednosměrnou analýzou variace. Incidence VF byla analyzována s použití testu „chi-čtverce“. Hemodynamické proměnné byly analyzovány Studentovým t-testem. Kritická hladina významnosti byla nastavena na p < 0,05. Všechny výsledky byly vyjádřeny jako středy ± S.E.M. Sloučeniny byly podávány i.v. v dávce 1 mg/kg tělesné hmotnosti 5 minut před okluzí.
-57CZ 295562 B6
Hydroxylaminové deriváty, u nichž byly nalezeny zvláštní výhody pro ochranu zvířat proti poškození ischemií/reperfuzí jsou dány do následujícího seznamu. Přežití (%) ukazuje procento zvířat, jež přežila účinek 5-minutové koronární okluze.
Kód Přežití %
Příklad 77 i.v. 1 mg/kg těl. hm. 67
Příklad 78 100
Příklad 8 100
Příklad 13 60
Příklad 9 100
Příklad 10 67
Příklad 5 80
Příklad 6 100
Příklad 79 100
Příklad 1 100
Příklad 16 67
Příklad 65 78
Příklad 54 80
Příklad 20 100
Příklad 22 100
Příklad 47 100
Příklad 39 60
Příklad 51 75
Příklad 64 100
Příklad 56 67
Příklad 57 67
Příklad 58 100
Příklad 59 86
Příklad 60 60
Příklad 61 83
Příklad 55 80
Příklad 66 57
Příklad 62 57
Příklad 63 50
Příklad 4 50
Kontrola (neošetřeno) n=24
Navíc ke sloučeninám uvedeným shora, bylo nalezeno pro následující sloučeniny, že poskytují výsledné výsledky:
N-[2-hydroxy-3-(pyrrolidin-l-yl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid (Z)-2-butendioát (1:1) (US 5 328 906, příklad 12, 1 mg/kgt.hm., i.v, přežití %: 67),
N-[2-hydroxy-3-(diethyl-amino)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid hydrochlorid (1:1) (US 5 328 906, příklad 11,1 mg/kg t.hm. i.v., přežití %: 62),
N-[2-hydroxy-3-(Prop-2-yl-amino)propoxy]-3-pyridmkarboximidoylchlorid (Z)-2-butendioát (1:1) (US 5 328 906, příklad 13/4, 1 mg/kgt.hm., i.v., přežití %: 60),
N-[2-hydroxy-3-(morfolin-l-yl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid (Z)-2-butendioát (1:1) (US 5 328 906, příklad 12, 1 mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 71),
-58CZ 295562 B6
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidyl)propoxy]-a-(3,4-dimethoxyfenyl)acetamidoylchlorid (US 5 328 906, příklad 14,1 mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 67),
N-[2-hydroxy-3-(/erc-butylamino)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid (Z)-2-butendioát (1:1) (US 5 328 906, příklad 13/5, 1 mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 57),
Chlorid kyseliny O-(3-piperidino-2-hydroxy-l-propyl)benzhydroximové hydrochlorid (US 5 147 879, příklad 1, 1 mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 100),
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid (Z)-2-butendioát (1:1) (US 5 147 879, příklad 2, 1 mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 100, 20 mg/kg t.hm., p.o., přežití %: 100).
Příklad 9
Účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridin-karboximidoylchlorid maleátu v nápravě buněčné membrány a zachování membránové fluidity
Změna fluidity buněčné membrány spojená s buněčným poškozením indukovaným stresem sérové deprivace a účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu v reverzi změny ve fluiditě
Pozadí
Jedním přístupem k modelování patoíyziologických událostí způsobovaných stresem metabolických poruch provázejících cukrovku je snižování hladiny inzulínu v kultivačním médiu. Protože inzulín je poskytován přidávaným sérem, částečná nebo totální deprivace se zdá být optimálním prostředkem k detekci změn v různých regulačních úrovních buňky.
Sérová deprivace se široce používanou metodou k zastavení buněk v Gl/S fázi, tj. synchronizaci buněčného cyklu (Ashihara, T. Methods in Enzymology, 58: 248-249 (1979)). Bylo pozorováno, že u kultivovaných buněk dochází k apoptotickým procesům při nedostatku přídavného séra (Cohen et al., Adv. in Immunology 50:50:50-85 (1991)) a to bylo studováno jako alternativní šok k stautosporinu nebo inhibitorům topoizomerázy na Bal/3T3 buňkách (Kulkami, G.V. et al., J. Cell. Sci. 107: 1169-1179 (1994)), nebo k tepelnému šoku a glutaminové deprivaci v Ehrlichových buňkách (Rowlands, A. G. et al., Eur. J. Biochem. 175: 93-99 (1991)) při zkoumání inhibované proteosyntézy fosforylací eukaryotického iniciačního faktoru (elF2alfa). Navíc existují důkazy o indukci cytoprotekce v buňkách v sérové deprivaci pomocí podávání externí HSP72 (Johnson, A. D., et al., In vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29A: 807-812 (1993)). Zvýšení relativní syntézy HSP82 a HSP72 sérovou deprivaci bylo rovněž ukázáno (Toye, P. et al., Mol. Biochem. Parasitol. 35: 11-10(1989)).
Ischemické a hypoxické poškození myokardu a jiných orgánů je zprostředkováno progresivní dysfunkcí membrány a jejím poškozením. Bylo rovněž prokázáno, že v průběhu metabolických poruch srdečních buněk nastávají změny v membránové fluiditě (Buje L. M. et al., In Vivo 5: 233-238 (1991)). Membránová fluidita primárně odráží orientaci a rychlost pohybu lipidů a její sestavě a každá změna na této úrovni značně ovlivňuje základní membránové funkce (Quinn, P. J. et al., Prog, Biophys. Molec. Biol. 53:71-103 (1989); Schlame , M. et al., Biochim. Biophys Acta 1045: 1-8(1990)).
V tomto pokuse se provedla pozorování ke stanovení, zda se změny ve fluiditě plazmatické membrány podílejí na vývoji buněčného poškození vyvolaného sérovou deprivaci a zda sérovou
-59CZ 295562 B6 deprivací vyvolaná změna fluidity může být zvrácena podáváním N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidolychlorid maleátu.
Materiály a metody
Experimenty se prováděly s použitím buněčných linií myších fibrosarkomů WEH1 a potkaních srdečních buněk H9c2, rozdělených do tří skupin:
- kontroly (10% FCS fetálního telecího séra),
- sérově deprivované, zpracované N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem a sérově deprivované.
Sérová deprivace a MTT test
Hodnotili jsme různé buněčné linie, koncentraci léčiva, čas před-působení a deprivace, a nalezli jsme nejvhodnější podmínky jak následuje: 5 x 10'4/ml potkaních srdečních buněk H9c2 (n=6) a myších fibrosarkomů WEH1 (n = 7) se naneslo na 24-jamkové destičky v 10 % FCS DMEM (Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu) a inkubovány po 2 hodin při 37 °C, 5 % CO2. Médium bylo odstraněno a nahrazeno 10 % FCS DMEM, obsahujícím ΙΟ'5 M N-[2-hydroxy-3(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridmkarboximidoylchlorid maleát. Po další inkubaci po 6 hodin za podmínek uvedených shora byly misky intenzivně promyty PBS a deprivovány na sérum. Na předem zpracované misky byl až do konce experimentu podáván N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát. Po 18 hodinách hladovění byla většina buněk v sérově deprivované kultuře uvolněna z povrchu, tj. mrtvá, pozorováno mikroskopicky, zatímco kultury zpracované N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem ukazovaly obraz podobný jako u kontrolních buněk. Viabilita buněk byla měřena v MTT testu založeném na metodě Plumba et al., (Cancer Res. 49: 4435-4444 (1989)). Jako nepřímé měřítko viability buněk sloužila metoda tetrazoliové soli, zahrnující konverzi MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenylterazoliumbromidu) na zbarvený formazan živými buňkami. MTT se přidával přímo do média v koncentraci 1 mg/ml. Po 2 hod. inkubace při 37 °C v temnu byl supematant odstraněn a k buňkám se okamžitě přidalo 200 μΐ 0,05 M HC1 v isopropanolu. O.D. destiček se odečetlo při 570 nm na čtečce ELISA destiček (Labsystems Multiscan Biochromatic, typ 348). Pokusy se v každém případě prováděly přinejmenším v triplikátech. Relativní viabilita buněk se počítala s definováním kontrolní skupiny jako 100 %.
Stanovení rovnovážné fluorescenční anisotropie
Buněčné suspenze 1 x 105 buněk/ml v PBS byly označeny přidáním DPH-PA (3-[p-fenyl)1,3,5-hexatriethylJfenylpropionové kyseliny) rozpuštěné v tetrahydrofuranu na finální koncentraci 0,1 μΜ a inkubovány po 10 min při 37 °C. Množství přidaného organického rozpouštědla bylo 0,05 %, aby se zabránilo jeho účinku na buněčné membrány. Membránová sonda DPH-PA byla zvolena pro nábojové vlastnosti sondy, jež umožňují DPH-PA lokalizaci převážně ve vnějším listu plazmatické membrány, s difenylhexatrienovou částí interkalovanou mezi horními úseky řetězců mastných kyselin (Kitagawa S. et al., J. Membrane Biol. 119:221-227 (1991)). DPH-PA vykazuje značné zesílení fluorescence v důsledku vazby k lipidům, a poskytuje tak prostředek hodnocení fluorescenční anisotropie jako funkce uspořádání lipidů. Fluorescenční měření byla prováděna při 37 °C s použitím Quanta Master QM-1 T-formátového spektrofotometru (Photon Technology Int. Inc., NJ, USA) vybaveného polarizátory v excitační a ve dvou emisních světelných dráhách. Excitační a emisní vlnové délky byly 360 nm (5 nm šířka štěrbiny)
-60CZ 295562 B6 resp. 430 nm (5 nm šířka štěrbiny). Měřené fluorescenční intenzity byly opraveny na fluorescenční pozadí a rozptyl světla neznačeným vzorkem. Fluorescenční anisotropie byla kalkulována jako rs = (IVV - G.IVH)/(IVV + (2 x G.IVH)) kde IVV a IVH jsou pozorované intenzity měřené s polarizátory paralelními resp. kolmými k vertikálně polarizovanému excitačnímu paprsku. Faktor G je rovný IVH/IHH a poskytuje opravu na neschopnost přístroje přenášet stejně různě polarizovaná světla a na rozdíl v citlivosti ve dvou emisních kanálech (Kitagawa, S. et al., J. Membrane Biol. 119: 221-227 (199)). IHV alHH jsou fluorescenční intenzity stanovené při vertikální a horizontální pozici emisního polarizátoru, kde excitační polarizátor je nastaven horizontálně.
Statistická analýza
Data se uvádějí jako středy + SEM. Statistická porovnání a výpočty se prováděly jednosměrnou analýzou variace se Prosthoc Newman-Keulsovým testem (Pharmacological Calculation Systém). Statistická významnost byla definována jako P < 0,05.
Výsledky
Sérová deprivace jako model pro testování cytoprotektivního účinku N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu:
Sérově deprivované WEH+ a H9c2 buňky vykazovaly 74,8 % resp. 50,5 % relativní buněčné viability. V případě kdy byl v kultivačním médiu přítomen 10'5 M N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát, mělo toto podávání za následek téměř úplné přežívání buněk WEH1 (93 %) a vysokou ochranu potkaních srdečních buněk H9c2 (82,75 %). Pokles relativní buněčné viability sérovou deprivací a ochrana N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem byly u obou buněčných linií signifikantní.
Účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu na fluiditu membrán sérově deprivovaných savčích buněk:
Ke zkoumání účinku sérové deprivace na fluiditu plazmatické membrány kultivovaných savčích buněk byla provedena měření fluorescenční anisotropie s použitím sondy, pro plazmatickou membránu DPH-PA, Fyzikální vlastnosti buněčné plazmatické membrány byly signifikantně změněny sérovou deprivací. Sérová deprivace způsobovala výrazný pokles ve fluorescenční anisotropii DPH-PA, to jest abnormální zvýšení ve fluiditě plazmatické membrány v obou zkoumaných buněčných modelech. Při přidání N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátu bylo pozorováno téměř úplné zachování fyzikálního stavu membrány. Tyto změny byly jasně konzistentní s tendencemi popsanými u viability buněk.
Rozbor
Za způsobování metabolických poruch snižovala deprivace normálního kultivačního média u obou studovaných typů buněk jejich viabilitu, jak byla testována MTT metodou. Tento účinek byl téměř plně reverzován při přidání N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu. Sérová deprivace vyvolávala rovněž prominentní změny ve fluiditě plazmatických membrán, o nichž je známo, že přispívají k dysfunkci membrán, provázející poškození myokardu. Na rozdíl od toho byly sérově deprivované buňky kultivované v přítomnosti N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu schopné zachovat si (nebo udržet si) částečně svůj normální fyzikální stav plazmatické membrány.
-61 CZ 295562 B6
Příklad 10
Účinek inzulínu a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu na hladinu GRP-94 v jádrech STZ diabetických potkanů
Pozadí
Anoxie, glukózové hladovění a několik dalších stavů, jež působí nepříznivě na funkci endoplazmatického retikula (ER), indukují syntézu glukózou regulované třídy stresových bílkovin (GRP) (Lin, Η. Y. et al., Mol. Biol. Cell. 4: 1109-1119 (1993)). 94 kDa člen GRP, GRP-94, z 50 % homologní k 80 kDa stresové bílkovině, je lumenální, vápník-vážící bílkovina endoplazmatického retikula. Zdá se, že spolu sjinými bílkovinami ER funguje GRP-94 jako molekulární chaperon (Nigem, S. K. et. al., J. Biol. Chem. 263: 1744-1749 (1994)). M8 se za to, že akumulace molekulárního chaperonu GRP-94 by měla mít příznivý účinek na nápravu buněčného poškození indukovaného STZ diabetem u potkanů. V souladu s tím jsme v experimentech zde uvedených porovnávali různé hladiny GRP-94 v játrech ze zdravých, a diabetických potkanů, z potkanů, jimž se podával N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát a z potkanů, jímž se podával inzulín plus N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát.
Materiály a metody
Testované látky: N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát (BIOREX Ltd.), inzulín (Protephane HM inj.).
Zvířata: Samci Crl (VAF plus) Wistar potkanů (250 - 300 g). Zvířata byla umístěna po 7 na jednu klec při 23-25 °C a 50-60 % relativní vlhkosti, s cyklem světlo-tma 12/12 hodin. Byl dán volný přístup ke stravě a vodovodní vodě.
Indukce diabetů: Jediná dávka STZ (45 mg/kg i.v.) byla podána ve stavu půstu.
Zvířata byla rozdělena do následujících skupin:
а. Zdravá zvířata
1. Zdravá, s podáváním solného roztoku po 1 týden (n = 5)
2. Zdravá, s podáváním solného roztoku po 2 týdny (n = 5)
3. Zdravá, s podáváním solného roztoku po 4 týdny (n = 5)
4. S podáváním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu po 1 týden (n = 7)
5. S podáváním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu po 2 týdny (n = 7)
б. S podáváním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu po 4 týdny (n = 7)
-69 .
b. STZ-diabetická zvířata
7. Diabetická, s podáváním solného roztoku po 1 týden (n = 5)
8. Diabetická, s podáváním solného roztoku po 2 týdny (n = 5)
9. Diabetická, s podáváním solného roztoku po 4 týdny (n = 5)
10. Diabetická, s podáváním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu po 1 týden (n = 7)
11. Diabetická, s podáváním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu po 2 týdny (n = 7)
12. Diabetická, s podáváním N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu po 4 týdny (n = 7)
c. Inzulinizovaná STZ-diabetická zvířata
13. Diabetická, léčená inzulínem po 1 týden (n - 7)
14. Diabetická, léčená inzulínem po 2 týdny (n = 7)
15. Diabetická, léčená inzulínem po 4 týdny (n = 7)
d. Inzulinizovaná STZ-diabetická zvířata s podáváním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu
16. Po 1 týden inzulinizovaná diabetická zvířata s podáváním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (n = 7)
17. Po 2 týdny inzulinizovaná diabetická zvířata s podáváním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidin)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (n = 7)
18. Po 4 týdny inzulinizovaná diabetická zvířata s podáváním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (n = 7)
Po působení byla játra vyňata a okamžitě zamrazena na -70 °C v tekutém dusíku. Působení N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (kdekoli přísluší): 20 mg/kg/den, p.o. Léčba inzulínem: Dvakrát denně v dávkách potřebných k udržení normální hladiny glukózy.
Stanovení hladiny GRP-94
Všechny kroky se prováděly při 0-4 °C. Potkaní játra (kolem 15-20 g) se homogenizovala v domácím mixéru po 2 min v 80 ml modifikovaného lyzačního pufru s jedním detergentem, obsahujícího 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100 a 1 mM proteázové inhibitory (PMSF, benzamidin, kyseliny aminokapronovou). Homogenát se centrifugoval při 20 000 x g po 30 min v centrifuze Sorvall RC28A. Většina supernatantu byla zmražena na -20 °C jako zásobní vzorek, 1 ml se použil k analýze.
Koncentrace bílkovin se stanovila stanovením Bradfordové (Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, sv. 182, M.P. Deutscher (vyd.), Academie Press (1990)) ve třech paralelách a nastavila se na 5 mg/ml.
-63 CZ 295562 B6
Elektroforéza a přenos
Laboratorní techniky elektroforézy a imunoblotu jsou podrobně popsány v Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane, 3. laboratorní manuál, Milipore, a U. K. Laemmli, Nátuře 227: 680-685 (1970). Každý vzorek obsahující 1,8 mg bílkoviny se před gelovou elektroforézou solubilizoval s 0,6 ml pufru obsahujícího llOmM Tris-HCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoethanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a něco bromfenolové modři, a třepal se při teplotě místnosti po 30 minut.
Elektroforéza se prováděla podle Laemmliho a 8% polyakrylamidovém gelu s 30 pg bílkoviny na dráhu při konstantním napětí 50 V přes noc. Bílkoviny se pak buď vybarvily s Coomessie Brilliant Blue R-250 nebo přenesly na Immobilone PVDF/Millipore) při konstantním proudu (300 mA) po 3 hodiny při 4 °C v přenosovém pufru (10 mM CAPS, pH 11, 10% methanol). Nespecifická místa membrány se zablokovala 2% bovinním sérovým albuminem (BSA) v TPBS (fosfátem pufrovaný solný roztok s 0,1 % Tween 20) při 4 C přes noc. Membrána s přeneseným materiálem byla inkubována s GRP94 monoklonální protilátkou (SPA-850, StressGen), zředěnou 1:3000 po 1 hodinu při teplotě místnosti. Pak se promyla s TPBS pufrem po další jednu hodinu, a inkubovala po další 1 hodinu s anti-potkaní (Sigma, 1:4000 zředění) sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. Po následném mytí s TPBS byla membrána vyvinuta s EC1 systémem (Amersham).
Byla připravena diluční série celkové bílkoviny (9/1 vzorek) a přenášena a vyvíjena pokaždé se vzorky, a vypočítala se kalibrační křivka. Změny v obsahu stresových bílkovin byly kvantifikovány s použitím denzitometru Bio-Rad (Model 1650) a integrátoru Hewlett-Packard (HP 3394 A) a opraveny podle kalibrační křivky.
Statistická analýza
Data se uvádějí jako středy ± SEM. Statistická porovnání a výpočty se prováděly jednosměrnou analýzou variace s Posthoc Newman-Keulsovým testem (Pharmacological Calculation Systém). Statistická významnost byla definována jako P < 0,05.
Výsledky
Signifikantní snížení relativního obsahu GRP-94 je pozorováno u potkanů diabetických po 1 týden, 2 týdny a 4 týdny. Tento účinek u zvířat diabetických po 1 týden a 2 týden lze úplně zvrátit podáváním N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu. Podávání inzulínu, samotného nebo v kombinaci sN-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem téměř zdvojnásobilo hladiny těchto bílkovin ve vzorcích po 1 týdnu a 2 týdnech v porovnání s kontrolním stavem.
Na rozdíl od předešlých nálezů, podávání N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu samotného nevedlo u zvířat diabetických po 4 týdny k významné změně relativního množství GRP-94. Navíc: u obou inzulinizovaných skupin, bez ohledu na podávání N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu, jsme pozorovali návrat GRP-94 ke kontrolní hladině.
-64CZ 295562 B6
Příklad 11
Účinek N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu v ochraně epidermálních buněk proti poškození způsobovanému vystavením teplu a UV světlu
Materiály a metody
HaCaT je spontánně imortalizovaná lidská keratinoctová buněčná linie odvozená z normální kůže dospělého člověka (Boukamp et al., J. Cell. Biol. 106: 761-771 (1988)). HaCaT je buněčná linie s plnou schopností epidermální diferenciace, s normální keratinizací a s netumorogenickým charakterem. Tato rychle se množící keratinocytová linie s vysokou senzitivitou k dithamolu je rovněž charakterizována přítomností steroidových receptorů. HaCaT buňky (4 χ 105 buněk na Petriho misku o průměru 35 mm) se naočkovalo a rozrůstalo v DMEM doplněném 5 % fetálního telecího séra (GIBCO, kat. č. 011-6290H) ve zvlhčené atmosféře o 5 % CO2 při 37 °C. Kultury byly 24 hodin po nanesení promyty PBS a zpracovány teplem nebo světlem.
Konfluentní kultury buněk byly vystaveny teplu (42, 44, 46, 47, 48 °C) nebo UV světlu (UVA 1, 2, 4, 6 J/cm2). Vystavení teplu bylo zjištěni cirkulujícími vodními lázněmi. Jako zdroj UV světla byl použit přístroj Waldmann PUVA 4000 a s energetickým spektrem konečného výstupu mezi 320 a 390 nm, s vrcholem při 365 nm. Výstupní energie byla modifikována IL-700 radiometrem vybaveným senzory UVA a UVB.
Morfologie buněk byla monitorována s použitím mikroskopie ve fázovém kontrastu (Opton Axioplan Microscope, s fázově-kontrastovými objekty Plan-Apochromat Ph). Za indikátory cytoxicity byly považovány následující faktory: a) snížena hustota adherovaných buněk, b) ztráta pravidelného „patníkového“ uspořádání se zvětšením mezibuněčných odstupů, c) změna buněčného tvaru, např. zábrana rozšiřování buněk, botnání, pyknotické svraštění, fragmentace, d) změny cytoplazmy, např. kondenzace nebo vakuolizace. Buněčná viabilita byla rovněž zkoušena, s použitím testu exkluze trypanové modři.
Výsledky
Citlivost HaCaT keratinocytů k tepelnému stresu byla stanovena zkoumáním jejich viability. Výsledky ukázaly že 24 hodin po vystavení teplotě 48 °C neexistovaly prakticky žádné živé buňky (2,7 %) v porovnání s kontrolou (100 %) při 37 °C. Viabilita HaCaT keratinocytů 24 hodin po vystavení 45 °C se ukázala být 59 %. Jednu hodinu po vystavení teplu nebyly v HaCaT kulturách žádné morfologické změny. 24 hodin po působení tepla při 46 °C nebo vyšší teplotě docházelo k signifikantnímu (p <0,01) uvolňování zachycených buněk a nastávaly morfologické změny, jako je ztráta pravidelného „patníkového“ uspořádání se zvětšením mezibuněčných odstupů, botnání, pyknotické svraštění, a vakuolizace HaCaT keratinocytů. Po vystavení US bylo nalezeno, že snížení počtu životaschopných buněk mělo přímý vztah k dávce UVA.
Prekondicionování buněk teplem (42 °C po 1 hodinu) nebo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem (v koncentraci 5 χ 10'5 M po jednu hodinu) poskytlo buňkám ochranu proti tepelnému vystavení při 48 °C. Když se buňky zkoumaly 24 hodin po působení 48 °C, bylo nalezeno, že ve srovnání s nezpracovanými buňkami buněčná viabilita se zvýšila na 48 % (při prekondicionování při 42 °C) a 84 % (když se předem působilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem. Nejvýraznější ochrana (vzrůst ve viabilitě o 140 %) se pozorovala v případě kombinovaného působení (s 42 °C a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem).
Tepelné prekondicionování s 42 °C, ale ne s 44 °C a 45 °C, vyvolalo výrazné snížení cytotoxicity způsobované UV-světlem. Působení 42 °C poskytlo ochranu k vystavení jak 2, tak 4 J/cm2. Viabilita předem zpracovaných HaCaT keratinocytů se zvýšila o 132 % (při 2 J/cm2) a 218 % (při 4 J/cm2) v porovnání s UV-vystavenými buňkami bez předešlého působení (100 %).
-65CZ 295562 B6
Příklad 12
Účinek N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu v indukci exprese molekulárního chaperonu v tkáních lidské kůže
Ultrafialové UVB světlo (290-320 nm) je jednou ze složek slunečního světla a je o něm známo, že způsobuje poškození kůže. Byla zkoumána role N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátu při snižování poškození způsobovaných tkání kůže vystavením UVB, jakož i účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu ve zvyšování exprese molekulárního cheperonu v tkáních kůže.
Materiály a metody
Tkáň lidské může byla roubována na imunodefícientní (SCID) myši. Experimentální protokol zahrnoval působení N-[2-hydroxy-3-( 1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (5,0 mg/kg i.p.) na jednu skupinu myší, a rozpouštědlovým roztokem NaCl (300 μΐ) na druhou, po 7 dní. V den 8 byly obě skupiny myší vystaveny UVB světlu (100 mJ/cm2) a 24 hodin po tomto vystavení byly vzaty vzorky pro histologické vyšetření (řezy barveny hematoxylinem a eosinem) a imunohistochemické vyšetření (nepřímá imunofluorescenční technika s monoklonální protilátkou, mAb).
Výsledky
U UV-ozáření myší, na něž se předem působilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátem, nebyly pozorovány klinické známky poškození způsobovaného vystavení UV. Naproti tomu u jednoho ze zvířat, na něž se předem nepůsobilo, byla nalezena hnisavá reakce transplantované oblasti. Dále: imunofluorescenční studie s použitím mAb hsp72 ukázaly intenzivní, lineární barvení podél podkladové membránové zóny lidské a myší kůže u zvířat, na něž se působilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem. Tato reakce nebyla pozorovatelná v kůži zvířat, na něž se takto nepůsobilo. Navíc: jaderný typ barvení granulocytů byl přitom v hnisavé, zánětlivé kožní reakci zvířete bez působení.
Podle tohoto mělo podávání N-[2-hydroxy-3-(l-piperidiny l)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu za následek zvýšenou tvorbu hsp v tkáních kůže a poskytovalo ochranu před poškozením v důsledku vystavení UV.
Stanovení hladiny HSP-70 z kůže: „Western“ analýza bílkovin odvozených ze štěpů lidské kůže se SCID myších podrobených UVB a UVB + N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátu.
Metody
Extrakce celkových rozpustných bílkovin z kůže
Všechny kroky se prováděly za teploty místnosti. Kůže (kolem 9-35 mg) byla nakrájena na malé kousky a homogenizována pístem z matovaného skla v Eppendorfových zkumavkách po 2 minuty v (2 μΙ/pg) 2-krát koncentrovaného Laemmiliho pufru (65 mM Tris-HCl, pH 6,8 5 % β-merkaptoethanol, 2 % SDS, 10 % glycerol a 0,1% bromfenolové modři, všechny tyto materiály byly produkty Sigma). Vzorky byly solubilizovány po dalších 60 minut s nepřetržitým třepáním. Před nanesením na gel byly vzorky centrifugovány při 167 ot/s po 10 minut.
-66CZ 295562 B6
Elektroforéza a přenos
Elektroforéza se prováděla na 8% polyakrylamidovém gelu s 10μ1 vzorkem na dráhu při konstantním napětí (50 V) přes noc. Bílkoviny se buď vybarvily s Coomassie Briliant Blue R-250 nebo přenesly na membránu Immobilone PVDF (Millipore) při konstantním proudu (300 mA) po 3 hodiny při 4 °C v přenosovém pufru (10 mM CAPS, pH 11, 10 % methanol). Nespecifická místa membrány se zablokovala 2% bovinním sérovým albuminem (BSA) v TPBS (fosfátem pufrovaný solný roztok s 0,1 % Tween 20) při 4 °C přes noc. Membrána s přeneseným materiálem byla inkubována s HSP-70 monoklonální protilátkou (SPA-8dc, StressGen), zředěnou 1:1500 po 1 hodinu při pokojové teplotě. Pak se promyla třikrát s TPBS pufrem po další jednu hodinu, a inkubovala po další 1 hodinu s anti-myší (Sigma, 1:1500 zředění) sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. Po následném myší (třikrát) s TPBS byla membrána vyvinuta s ECL systémem (Amersham).
Příklad 13
Účinek N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu v aktivaci tvorby HSP a v ochraně oxidativní fosforylace
Pozadí
Ukázalo se, že vystavení buněk Saccharomyces cerevisiae tepelnému šoku (5 min při 42-44 °C) vede k poruše spárování oxidativní fosforylace a systému mitochondriálního elektronového transportu, což ovlivňuje schopnost buněk syntetizovat ATP (Patriarca et al., Biochemistry and Cell Biology 70: 207-214, 1992). Když se však na buňky předem působilo N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem po krátký časový úsek při 37 °C před tepelným šokem, zmenšilo to narušení spárování a ochránilo mitochondriální syntézu ATP. Inhibice cytoplazmatické syntézy RNA nebo bílkovin v průběhu tepelného šoku se ukazuje jako zábrana této ochrany mitochondriální aktivity. V souladu s tím se zdá být jednou z rolí hsp role ochrany spárování oxidativní fosforylace a systému mitochondriálního elektronového transportu, jež je narušeno, když jsou buňky vystaveny fyziologickému stresu, např. tepelnému šoku.
V této sekci byl N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát podáván buňkám předtím, než byly vystaveny tepelnému šoku a byl zkoušen jeho účinek na ochranu spárování oxidativní fosforylace se systémem mitochondriálního elektronového transportu před tepelným stresem. Bylo rovněž zkoumáno, zda aktivita transkripčních faktorů AP-1 a P 1 může být modulována N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem u kvasinkových buněk vystavených různým stresem stavů.
Materiály a metody
Experimentální protokol ke stanovení odpojení oxidativní fosforylace a mitochondriální syntézy ATP v Saccharomyces cerevisiae je poskytnut v Patriarca et al, Biochemistry and Cell Biology 70: 207-214, 1992, přičemž tento odkaz je zde plně zahrnut odkazem.
K buňkám X cerevisiae, jež byly udržovány při 25 °C, byly přidávány různé koncentrace N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (koncentrace mezi 10 až 100 μΜ) a buňky pak byly inkubovány po jednu hodinu při 25 °C v přítomnosti N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu. Teplotě pak byla zvýšena na 42 °C a byla sejmuta oxygrafová měření, jak se popisuje v Patriarcově publikaci.
Buňky zpracované s N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem byly testovány na doprovodnou indukci HSP genů, s použitím postupu „Northem“
-67CZ 295562 B6 analýzy. Způsoby extrakce, čištěné mRNA z eukaryotických buněk a analyzování mRNA takto získané s použitím postupu „Northem“ analýzy jsou v oboru dobře známy a popsány v Maniatisovi a v Maresce et al., Archives Medical Research 24: 247-249 (1993); oba odkazy jsou zde zahrnuty v úplnosti. Protokol „Northem“ analýzy je rovněž popsán v příkladě 7, uvedeném výše. Jako sondy se použily DNA sekvence hsp26 a hsp70.
Výsledky
Obrázek 4 je „Northern“ analýza hsp26 mRNA indukované v S. cerevisiae, ilustrující výsledky z tohoto experimentu. Koncentrace dané chemické sloučeniny podávané buňkám a trvání inkubace jsou vyznačeny.
Indukce byla pozorována v buňkách, jež byly inkubovány v přítomnosti N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (10 až 100 μΜ) po 5 minut až jednu hodinu při 25 °C. Výsledky se zdají rovněž ukazovat na to, že indukce nastává až o 5-minutové inkubaci.
Bylo rovněž nalezeno, že koncentrace testované sloučeniny mezi 10 a 100 μΜ byly účinné při zmenšování zásadu do spárování oxidativní fosforylace a systému mitochondriálního elektronového transportu v důsledku tepelného šoku. Ochrana před narušením mitochondriální syntézy ATP byla v rozsahu pozorovaném, když se termotolerance buněk vyvolávala prekondicionováním za jejich vystavení intermediární teplotě 37 °C (40-60 % ochrany).
Účinek benzylalkoholu na a) aktivitu adenylátcyklázy a b) fyzikální stav bovinních tyroidních plazmatických membrán je ukázán na obr. 5. Změna v aktivitě adenylátcyklázy (a) je ukázána bazální (kroužky), TSH-stimulovanou (křížky), forskolin-stimulovanou (trojúhelníky), choleratoxin-stimulovanou (obrácené trojúhelníky, a fluoridy stimulovanou (kosočtverce) enzymovou aktivitou. Membrány byly inkubovány s léčivy před přidáním propojovacích [coupling] faktorů. Fyzikální stav membrány byl hodnocen sledováním rovnovážné fluorescenční anisotropie (b) několika fluoroforů zabudovaných do membrány: DPH (kroužky), 12-AS (křížky) a TMA-DPH (trojúhelníky). Měření se provádělo při 37 °C. Molámí poměr fluorofor/lipid byl vždy 1:500.
Naše pokusy dokázaly, že N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát vykazuje významný vliv na aktivitu AP-1 a že jeho účinek je určován aktuálními metabolickými podmínkami buněk. Zatímco N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát zvyšuje aktivitu AP-1 když je přísun živin nedostatečný, v bohatém médiu aktivitu tohoto faktoru snižuje. Účinek této sloučeniny je nej výraznější v hustých, pozdně logaritmických kulturách. Opačnou tendenci lze pozorovat pro P 1. Jeho aktivita se snižovala, když byl N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát přidáván k buňkám v minimálním médiu. Je možné, že „down“ regulace P-l byla vyvolána právě změnami v buněčné protistresové mašinérii, způsobenými N-[2hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem indukovanou aktivací AP-1. Je zaznamenáno, že P-l odpovídal na všechny typy stresu, ale jeho aktivita nebyla ovlivněna testovaným materiálem. Naše důležitá zjištění, obzvlášť sAP-1, by mohly vysvětlit mnohé aspekty in vivo aktivity této sloučeniny a budou se detailně probírat.
Účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (B) na expresi hsp genu v tkáňové kultuře je ukázán na obr. 6. HeLa buňky byly transfekovány s reportérovým plazmidovým konstruktem, v němž byl promotor lidského hsp70 genu fúzován k luciferázovému reportérovému genu. Účinek tepelného šoku a/nebo N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu na hsp promotor byl stanovován měřením aktivity luciferázy v luminometru a stanovováním hladiny hsp bílkoviny (exprimované z chromozomálního genu) „Western“ analýzou.
-68CZ 295562 B6
Vzorky jsou: 1: kontrola bez DNA, 2: 10 pg transfekované DNA vt0, bez tepelného šoku, 3: 10 pg transfekované DNA v to, 60 min tepelný šok 24 hodin poté, 4: jako předešlé + N-[2hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát (B) v to, 5: 10 pg transfekované DNA v to + N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát (B) v to, 6: 10 pg transfekované DNA v to, 60 min tepelný šok 24 hodin poté, N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát (B) přidán v čase tepelného šoku, 7: 10 pg transfekované DNA v to, 60 min tepelný šok 24 hodin poté, N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát (B) přidán v čase 0 a v čase tepelného šoku, 8: 10 pg transfekované DNA v to, bez tepelného šoku, N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát (B) přidán v čase 0 a po 24 hodinách.
Příklad 14
Účinek N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridmkarboximidoylchlorid maleátu v indukci molekulárního chaperonů v nádorových buňkách
Neletální tepelný šok zvyšuje citlivost k lyži zprostředkované NK buňkami 1,5-krát a tento tepelný šok plus působení N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu mají synergický účinek na schopnost K562 být lyžovány. Tento dodatečný účinek připisovaný N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu jasně pocházel ze zvýšené exprese hsp72 plazmatické membrány, protože in vivo blokovací studie (s použitím hsp72-specifické monoklonální protilátky) odhalily silnou inhibici NK-lyze.
Na obr. 7 je ukázán účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (B) na hladiny hsp72 indukované tepelným šokem. N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát samotný nezvyšoval hladiny hsp72, zatímco kombinace tepelného šoku a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu vedla k signifikantnímu zvýšení exprese hsp72 ve srovnání s tepelným šokem samotným.
Pozadí
O bílkovinách tepelného šoku je známo, že jsou lokalizovány vcytoplazmě, kde vykonávají různé chaperonové funkce. Uvádí se však, že v nádorových buňkách jsou hsp exprimovány také na povrch buněčné membrány (Ferrarini, M. et al., Int. J. Cancer 51: 613-619 (1992)). Experimenty se zdají ukazovat, že zvýšení hsp (např. hsp70) na buněčném povrchu je vyvoláno vystavením nádorových buněk neletálnímu tepelnému šoku, a že toto zvýšení koreluje se zvýšenou citlivostí IL-2 specifických CD-3 přirozených zabij ecích buněk (NK) směrem k nádorovým buňkám. Protože pro NK buňky se uvádí, že se zúčastňují v infiltrování a zabíjení nádorových buněk in vivo (Kurosawa, S et al., Eur. J. Immunol. 23: 1029 (1993)), tato zvýšená citlivost NK buněk k nádorovým buňkám umožňuje lepší zaměřování nádorových buněk NK buňkami. Tedy: když lze v nádorových buňkách indukovat expresi hsp, se zvýšením hsp na buněčném povrchu, lze takto umožnit lepší zaměřování a zabíjení těchto buněk NK buňkami. V této sekci se zkoušel účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu v indukci exprese hsp72 v nádorových buňkách.
Materiály a metody
Použily se lidské K562 buňky myeloidní nádorové linie, odvozené z pacienta s chronickou myelogenní leukémií v blastické fázi (ATCC, CCL243) (Lozzio B. C. a Lozio B. B. Blood 45: 321, 1975). Na exponenciálně rostoucí buňky se působilo 5 x 10‘5 M N-[2-hydroxy-3-ýl
-69CZ 295562 B6 piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem za neletální teploty (42 °C) po dvě hodiny. Po zotavovací periodě 16 hod. při 37 °C byly buňky testovány na obsah hsp72 průtokovou cytometrií (Multhoff et al., Int. J. Cancer 61. 272-279 (1995)). Působení N-[2hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu vedlo ke zvýšené hladině hsp72 v nádorových buňkách.
Příklad 15
Interakce N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu s lipidovými membránami. Studie monovrstvy.
Pozadí
Mechanismus(my), jimiž je stres (fyzikální, patofyziologický atd.) detekován jako signál a přenášen k transkripčnímu aparátu je dosud neznám. Předpokládá se, že fyzikální stav lipidové membránové matrice, jenž určuje strukturu a funkci membránově vázaných bílkovin, je přímo zapojen do zachycení teplotních změn, jež za podmínek tepelného šoku (HS) perturbují membránovou strukturu a způsobují transdukci signálu, jenž vyvolává transkripci HS genů. Souběžně s indukcí stresové tolerance bylo pro N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu ukázáno, že zvyšuje výkonnost buněk a detekci a signalizaci různých stresových podmínek pomocí „up“ regulace exprese některých chaperonových genů.
Je známo, že technika monovrstev s použitím monomolekulámích lipidových vrstev rozprostřených na rozhraní vzduch-voda je účinným nástrojem k ověřování přítomnosti interakcí mezi membránou a membránově aktivními činidly. Chování dvouvrstvého systému je velmi podobné k chování příslušného monovrstvého systému v mnoha ohledech (molekulární velikost membránových složek, účinek fosfolipidů, orientace zabudovaných bílkovin, atd.). Měření změn povrchového napětí, způsobovaných molekulami vstupujícími do monovrstev umožnilo získání pohledu na molekulární rozměr dané interakce.
Zásadním předpokladem pro názor, že v buněčné membráně mohou nastat určité spouštěcí děje zprostředkované N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem v odezvě na stres, je zajištění důkazů o přímé fyzikální interakci N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu se složkami membrány. Cílem předkládané studie je zkoumat interakci N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu s membránami s použitím monovrstev různých lipidů jako modelových systémů pro biologické membrány.
Materiály a metody
Pokusy s monovrstvami se prováděly na teflonové misce, s objemem 6,5 ml a plochou povrchu 8,8 cm2 při 25 °C v Langmuirově-Blodgettově přístroji KSV3000 (KSV Instruments Ltd., Helsinki, Finsko), v podstatě jak je popsáno. Monomolekulámí lipidové vrstvy sestávající z l,2-dipalmitoyl-s«-glycero-3-fosfocholinu (DPPC), fosfatidylglycerolu vaječného žloutku (EggpG) nebo bovinního srdečního kardiolipinu (BHCL) byly vytvořeny z chloroformových roztoků lipidů za poskytnutí žádaného iniciálního povrchového napětí na subfázi 10 mM Na-fosfátu (pH 7,0). Subfáze byla nepřetržitě míchána magnetickou tyčinku. N-[2-hydroxy-3(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát, rozpuštěný v H2O, byl přidáván pod monovrstvu skrz dírku v teflonové komůrce, spojenou se subfázi. Injikované objemy byly vždy < 1 % objemu subfáze. Povrchové napětí bylo měřeno Wilhelmyho metodou s použitím platinové destičky. Data zvyšování povrchového napětí byla získána ze souborů surových dat s použitím software LB5000 z měřicího Langmuirova-Blodgettova systému.
-70CZ 295562 B6
Výsledky
Interakce N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu s různými fosfolipidy byla testována měřením sloučeninou indukovaného zvýšení povrchového napětí lipidových monovrstev rozprostřených na rozhraní vzduch-voda (obrázek 8). Monovrstvy byly v této studii vytvářeny z DPPC, EggPG a BHC1 a k subfázi se přidávalo rostoucí množství N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu na dvě koncentrace, 10'6 a 10'5M. Přidání sloučeniny pod lipidovou monovrstvu vedlo ke zvýšení povrchovému napětí, jež bylo ve všech případech závislé na koncentraci N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu v subfázi. U různých lipidových monovrstev však existoval výrazný rozdíl v profilu povrchového napětí. V případě zwitterionického DPPC se napětí měnilo rychle po injekci N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátu a pak zůstávalo na konstantní hladině. Při použití monovrstev obsahujících záporně nabitý BHCL vykazoval profil povrchového napětí typickou inzerční kinetiku, to jest napětí stoupalo po asi dvě minuty a potom dosáhlo rovnovážné hladiny. V přítomnosti PG byla inzerční kinetika podobná inzerční kinetice pozorované v BHC1, avšak po dosažení určené hodnoty začínalo napětí klesat. Rychlost poklesu napětí byla závislá na koncentraci sloučeniny v subfázi. Jedno možné vysvětlení tohoto fenomému je odstraňování N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu z fázového rozhraní, protože pokles napětí pokračoval i po dosažení počátečního napětí čisté lipidové monovrstvy.
K získání dalšího náhledu na specifickou interakci N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu s lipidovými monovrstvami bylo zvyšováno povrchové napětí indukované danou sloučeninou měřeno při různých počátečních povrchových napětí (obrázek 8). Způsob extrapolace k vysokému počátečnímu napětí dovoluje určení hraničního inzerčního napětí pro danou molekulu, při němž už přestává být schopna inzerce do monovrstvy. Extrapolovaná hraniční povrchová napětí pro inzerci byla 89 mN/m a 39 mN/m pro BHC1 resp. DPPC. V případě monovrstev obsahujících záporně nabitý BHCL byla zvýšení napětí vždy vyšší než bylo nalézáno po zwitterionický DPPC, což napovídalo důležitost elektrostatický interakcí.
Náš výzkum poslouží jako první důkaz, že N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát je při podávání ve fyziologicky relevantních koncentracích schopen interagovat s lipidovými membránami, způsobem specifickým pro řídicí skupinu.
Na obrázku 8 je ukázána interakce N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (B) a monomolekulámích lipidových vrstev. U šipek byl k subfázi přidán N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát ve vyznačených koncentracích. Na obr. 9 se předvádí vzrůst povrchového napětí po injekci N-[2-hydroxy3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (B) pod monovrstvy HBC1 nebo DPPC při různých počátečních napětích. Koncentrace N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu v subfázi byla 10 μΜ. Lineární regresní analýzy experimentálních dat vedla ke korelačním koeficientům 0,844 resp. 0,995 pro monovrstvy BHC1 resp. DPPC.
-71 CZ 295562 B6
Příklad 16
Ochranný účinek N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu proti cytotoxickým cytokinům a cykloheximidu
Pozadí
Účelem těchto studií bylo sledovat možné spojení mezi produkcí cytokinů a patofyziologickými změnami, u nichž se zdá, že by N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát měl proti nim ochraňovat.
Naše data napovídají, že N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát je cytoprotektivním činidlem pro buňky tkáňových kultur při působení cytotoxických cytokinů. Působení N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu zvyšovalo přežívání WEH1 164 buněk (a jiných savčích buněk) při působení TNF. Tento účinek byl závislý na koncentraci, ale nebyl přímo úměrný koncentraci dané sloučeniny. Rozsah ochrany poskytovaný působením N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu byla variabilní od pokusu k pokusu, i když zvýšená rezistence k cytotoxickým cytokinům byla u zpracovaných buněk jasnou tendenci ve všech pokusech. Ochrana poskytovaná působením N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátu nebyla příliš vysoká, ale u živého zvířete může i tento stupeň ochrany být dostatečný pro moderování nebo zabránění patofyziologických dějů.
Cíl studie
Byly měřeny hladiny sérového TNF a indukovatelnost makrofágů z STZ diabetických a kontrolních zvířat. LPS-indukované sérové TNF aktivity byly v průběhu prvního měsíce diabetů signifikantně zvýšeny v STZ-indukovaných diabetických potkanech (ve věku 6 - 18 týdnů) v porovnání s nediabetickými potkany.
Výsledky
Střední koncentrace sérového TNF (měřené radioimunostanovením) diabetické skupiny byly signifikantně vyšší (480 + 96 U/ml) než u zdravých kontrol (345 + 48 U/ml). (Foss et al., 1992 (Braz. J. Med. Biol. Res. 25: 239) uvedli podobné výsledky pro lidské primáty). Uvnitř diabetické skupiny nebyla žádná korelace mezi hladinami sérového TNF a trváním diabetů. Nenalezli jsme biologicky aktivní TNF v sérech diabetických zvířat pomocí testu cytotoxicity na buňkách L929. Rozdíl mezi RIA a měřením cytotoxicity ukazuje na přítomnost vysokých hladin antagonisty rozpustného TNF receptoru (ochranné protizánětlivé molekuly) a napovídá zapojení TNF do diabetických komplikací.
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát měl nečekaný proliferativní účinek na kvasinkové buňky (a na odlišné, kultivované normální diploidní zvířecí nebo lidské buňky). Vliv N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu byl obzvlášť impresivní v přítomnosti nízkých koncentrací antibiotika inhibujícího růst, cykloheximidu. Kolonie kvasinkových buněk narostlé v přítomnosti N-[2-hydroxy3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu a cykloheximidu nevykazovaly zvýšený výskyt genetických změn (mutací rezistence k antibiotiku), jen vyšší metabolickou rezistenci k inhibičnímu účinku cykloheximidu na proteosyntézu.
Podle našich měření lze účinky N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu vysledovat až ke zvýšené aktivitě AP-1 transkripčního faktoru, jenž zprostředkovává účinky jak mitogenních faktorů, tak různých typů stresu. Výsledky rovněž ukazují, že shora uvedená testovaná sloučenina a podobné sloučeniny ovlivňují detixitu AP-1
-72CZ 295562 B6 a snad i jiných transkripčních faktorů, pomocí udržování účinků růstových faktorů a podmínek metabolického stresu.
Na obr. 10 je předvedena LPS-indukovaná in vitro produkce TNF makrofágů izolovaných z STZ diabetických (1) a normálních zvířat, na obr. 11 N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátem indukovaná ochrana keratinocytů před růst inhibujícím účinkem cykloheximidu, na obr. 12 N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem (B) indukovaná ochrana buněk (endothelových buněk) před toxickými účinky cykloheximidu, na obr. 13 N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátem (B) indukovaná ochrana lidských cervikálních buněk HeLa před růst inhibujícím účinkem antibiotika cykloheximidu, na obr. 14 N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (B) indukovaná ochrana buněk srdečního svalu před růst inhibujícím účinkem antibiotika cykloheximidu, na obr. 15 je předveden účinek N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (B) na aktivitu PÍ transkripčního faktoru v kvasinkových buňkách AB1380. Sloupec 6 představuje střední hodnoty, sloupec 5 je prázdný. Na obr. 16 je předveden účinek N-[2hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu na aktivitu API transkripčního faktoru v kvasinkových buňkách JF1. Sloupec 11 představuje střední hodnoty. Na obr. 15 je předveden účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoy 1chlorid maleátu (B) na aktivitu PÍ transkripčního faktoru v kvasinkových buňkách AB1380. Sloupec 6 představuje střední hodnoty, sloupec 5 je prázdný.
Příklad 17
Kardioprotektivní účinek N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu v izolovaných potkaních srdcích
Účelem této studie bylo zkoumat kardioprotektivní a antiarytmické účinky N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu v izolovaných pracujících potkaních srdcích.
Metody
Po 10-min aerobní pracující perfuzí byla srdce (n = 10 v každé skupině) podrobena 10-min koronární okluzi, následované 3-min reperfuzí v přítomnosti 0,05; 0,5; 5,0; 20,0 resp. 50 mg/1 N[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu.
V dalších studiích se na potkany předem působilo nejúčinnější dávkou, 20 mg/kg, N-[2hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu jedno resp. pět hodin před izolací srdcí. Po excizi byla srdce podrobena protokolu okluze uvedenému shora za perfuze v přítomnosti nebo nepřítomnosti 20 mg/1 N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátu.
V oddělených pokusech byly studovány účinky tepelného stresu, ischemie, N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu a jejich kombinaci na myokardiální obsah bílkoviny HSP-70. Izolovaná srdce byla podrobena 15 min tepelnému stresu (42 °C), globální normotermické ischemii a perfuzi N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem, následovanou 120 resp. 180 minutovou reperfuzí.
Výsledky
Před ischemii zvyšoval N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát koronární průtok (CF) s koncentrační závislostí odezvy ve tvaru zvonovité křivky.
-73 CZ 295562 B6
Jiné parametry srdeční funkce nebyly u nižších koncentrací této sloučeniny změněny. N-[2hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát v koncentraci 50 mg/1 způsoboval významnou bradykardii, snížení aortického průtoku (AF) a +dP/dtmax, a zvýšení levého ventrikulárního enddiastolického tlaku (LVEDP) před ischemii. V kontrolní skupině koronární okluze značně snížily CF, AF, +/-dP/dtmax, a zvýšily LVEDP. N-[2-hydroxy3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát zmírňoval ischemii indukované poruchy srdeční funkce s koncentrační závislostí odezvy ve tvaru zvonovité křivky. Nejvýraznější anti-ischemický účinek vykazoval koncentrace 20 mg/ml N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu. Reperfuze po 10 min koronární okluzi spouštěla ventrikulámí fibrilaci (VF) ve všech srdcích kontrolní skupiny. Vyšší koncentrace N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu vedly k dávkově závislému anti-arytmickému účinku.
Po jedné hodině poskytovalo ještě předchozí působení N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu kardioprotekci a potenciovalo akutní účinky této sloučeniny. Pět hodin po předchozím působení nebyl kardioprotektivní účinek pozorovatelný, ale některé akutní účinky N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátové perfuze byly zvýšeny.
Sloučenina samotná nezvyšovala myokardiální obsah HSP-70. Stetyokardiální obsah HSP-70 byl značně zvýšen v důsledku tepelného stresu, avšak ischemie vedla k mírnému zvýšení HSP-70. Nicméně: Když byla ischemie indukována v přítomnosti 20 mg/1 N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu, obsah HSP-70 byl zvýšen na přibližně stejnou úroveň jako po tepelném šoku.
Bylo zjištěno, že N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát vykazuje anti-ischemické a anti-arytmické účinky. U koncentrace 20 mg/1 bylo nalezeno, že produkuje u izolovaného potkaního srdce značné jak anti-ischemické tak antiarytmické účinky. I když přímý anti-ischemický účinek této sloučeniny mizí po jedné hodině, stále je zvyšován stupeň ochrany akutním působením N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátu. N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát a tepelný stres společně indukují rychlou de novo syntézu HSP-70 v potkaním srdci. N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát samotný syntézu HSP-70 neovlivňuje.
Na obrázcích 18-19 jsou předvedeny hladiny hsp bílkoviny, stanovené „Western“ analýzou, z potkanů kontrolních, tepelně šokovaných, s působením ischemie, s působením N-[2-hydroxy3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (B), s působením ischemie + N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (Ischemie + B) s následným zotavením pod 2 hod. (obr. 18) nebo 3 hod. (obr. 19).
Příklad 18
Navýšení chaperonu N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem prevenci a nápravě poškození kůže: ochrana před ultrafialovým světlem B v lidské kůži transplantované myším s těžkým kombinovaným imunodeficietním onemocněním a urychlené hojení ran u diabetických potkanů
Pozadí
Hsp hrají obecnou roli ve fyziologické ochraně kůže před stresy z prostředí. Jako molekulární chaperony se zúčastňují v prevenci a nápravě poškození způsobovaných různými expozicemi, jako k mechanickému traumatu, světlu, tepelným a chemickým poškozením, infekcím atd. (E. V.
-74CZ 295562 B6
Maytin, JID 104: 448, 1995). U patologických podmínek, jako je diabetes mellitus, byla oznámena zeslabená funkce některých hsp (M. Cherian a E. C. Abraham, Biochem. Biopys. Res. Comm. 212: 184, 1995). Protože u N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu bylo ukázáno, že působí navýšení [booster} chaperonů (Vigh et al, v přípravě), očekávali bychom, že tato sloučenina je schopna podporovat nejrůznější mechanismy ochrany a nápravy.
Účelem této studie bylo otestovat účinky a) systémového a b) místního podávání N-[2-hydroxy3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu v:
a) ochraně proti poškození kůže vyvolanému UVB světlem v lidské kůži transplantované myším s těžkým kombinovaným imunodefícientním onemocněním (SCID),
b) v nápravě zničeného procesu hojení ran u STZ-diabetických potkanů.
Metody
a) Na SCID myši s transplantovanou lidskou kůží se působilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem (5,0 mg/kg i.p.) nebo vehikulem a zvířata byla vystavena UVB světlu (100mJ/cm2). Po 24 hodinách byly odebrány vzorky kůže pro histologické vyšetření a pro stanovení hsp72 s použitím imunohistochemických technik a technik „Western“ analýzy. Ochrana před UVB světlem indukovaným poškozením kůže předchozím působením N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu byla stanovována klinicky a histologicky. Intenzivní hsp72 vybarvení lineární podkladové membrány bylo pozorovatelné imunofluorescenční technikou, a zvýšené množství hsp72 bylo měřeno „Western“ analýzou vzorků kůže, na níž se působilo N-[2-hydroxy-3-(l-piperidiny 1)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem.
b) Streptozotocinem indukovaní (STZ) diabetičtí potkani s tepelnými poraněními částečné až plné hloubky, vytvořenými na oboustranně depilované hrudní kůži pomocí elektricky zahřáté sondy (3 mm v průměru, 60 °C, po 30, 60 a 90 vteřin), s působením místní aplikace krému obsahujícího 1 %, 2 % nebo 4 % N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu nebo vehikulu se použily ke stanovení hojení ran ve formě „samokontroly“, porovnání vedle sebe. Uzavírání rány bylo zachyceno fotograficky a s použitím digitální epiluminiscenční mikroskopické techniky. Plocha ran byla měřena planimetricky 48 hodin a 21 dní po poranění. Hladina hsp72 v odebraných vzorcích kůže byla stanovena s použitím „Western“ analýzy.
Výsledky
Působení krému obsahujícího 4 % N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu signifikantně (p <0,01) urychlilo uzavírání rány a zvýšilo hladinu hsp72 ve vzorcích odebrané kůže, v porovnání s kontrolu vehikulu.
Naše výsledky vedly k závěru, že podávání N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoylchlorid maleátu zajišťuje ochranu proti poraněním z vystavení UV a že má potenciální terapeutické využití v klinické léčbě stavů s defektem v nápravě zranění nebo po chirurgické intervenci.
Na obr. 20, 21 a 22 je předveden účinek krémů obsahujících 1 %, 2 % nebo 4 % N-[2-hydroxy3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (B) na hojení ran. Na obr. 23, 24 a 25 jsou výsledky ukázány podle stupně poranění.
-75CZ 295562 B6
Na obr. 26 jsou ukázány fotografické snímky neošetřených a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem (B) ošetřených ran.
Obr. 27 ukazuje hladiny hsp72 bílkoviny z odebraných vzorků kontrolních a N-[2-hydroxy-3(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátem (B) (1 %, 2 % a 4 %) ošetřených ran.
Na obr. 28 je ukázáno imunohistochemické hodnocení hsp72 bílkoviny po působení N-[2hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (B).
Na obr. 28 jsou předvedeny hladiny hsp72 z kožních vzorků SCID myší po působení N-[2hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu (B) a bez tohoto působení (Kontrola).
Příklad 19
Hodnocení stimulačního účinku hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na expresi HSP72 v buňkách vystavených stresům
a) Podmínky kultivace buněk
Z použitých buněk byly 3T3 a L-929 myší fibroblasty kultivovány v MEM médiu a rozrůstány v monovrstvách, lidské leukemické buňky U-937 byly udržovány vRPMI-1640 médiu, suspenzní kultuře, zatímco lidské epitelové buňky HeLa byly kultivovány v DMEM médiu a ve formě monovrstev. Buněčné kultury byly udržovány jak se popisuje v příkladu 6 s tím rozdílem, že byly kultivovány ve shora uvedených kultivačních médiích.
b) Podmínky pokusů
Pokusy se prováděly za aplikace stresu před a po působení sloučeniny. Stres byl provokován teplem nebo chemickým činidlem, působením HgCl2. Testované sloučeniny byly aplikovány v 10'5 M koncentraci.
Studie cytotoxicity, jež byly prováděny 3-denní testem a hodnoceny s MTT (Cytotechnology 11: 49-58) ukázaly, že všechny testované sloučeniny měly 50% účinek inhibice růstu v koncentracích vyšších než 10'4 Μ. V důsledku toho neměly koncentrace použité v HSP72 studiích žádný významný cytotoxický účinek.
Pokusy s tepelným šokem
Tyto pokusy se provedly na 3T3 a L-929 myších fibroblastech a dále na lidských leukemických buňkách U-937.
Pokusy s aplikací tepelného šoku na 3T3 buňky se provedly jak je popsáno v příslušném bodu příkladu 6 a s tím rozdílem, že stres byl indukován 30 min vystavením při teplotě 43 °C a působení testované sloučeniny se provedlo 15 minut před nebo 100 minut po tepelném šoku.
Imunodetekce se prováděla s použitím HSP72 specifickou SPA 810 primární protilátkou (StressGen) a s A9044 (Sigma) sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. Denzitometrická hodnocení se provedla denzitometrem LKB Ultrascan.
Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2 a tabulce 3.
-76CZ 295562 B6
Tabulka 2
Stimulační účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na tepelným šokem indukovanou produkci hsp72 v T3T buňkách, když působení předchází vystavení tepelnému šoku.
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené šoku
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát +++
5,6-dihydro-5-( 1 -piperidinyl)methyl-3-(3-pyridyl)-47/-l ,2,4-oxadiazin +++ 3-(3-pyridyl)-5-[(l-piperidinyl)methyl]-5,6-dihydro-6J7-l,4,2-dioxazin (Z)-2-butendioát (1:1)++
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]benzimidoylchlorid monohydrochlorid +
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N',N'-diethyl-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid +++
3-(3-pyridyl)-5-diethylaminomethyl-5,6-dihydro-67f-1,4,2-dioxazin hydrochlorid +
3-fenyl-5-[( l-piperidinyl)methyl]-5,6-dihydro-677-l ,4,2-dioxazin hydrochlorid ++ /R/(+)-N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid (Z)-2-butendioát (1:1) +++ (-)N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid (Z)-2-butendioát (1:1)+++
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]naftalen-l-karboxamid +++
3-(3-pyridyl)-5-/-butylamino-5,6-dihydro-6Z/-l ,4,2-dioxazin + N-(2-hydroxy-3-piperidinopropoxy)ethylurethan +
N-[2-palmitoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid +++
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-N'-propylmočovina +++
N-(3-chlorfeny l)-N'-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxymočovina +++
N-(3-piperidino-l-propoxy)-3-pyridinkarboximidoylchlorid dihydrochlorid +++ 0-(3-diethylamino-propoxy)-3-pyridinkarboximidoylchlorid hydrochlorid +++ 0-(3-piperidino-l-propyl)-3-nitro-benzhydroximoylchlorid hydrochlorid +++
1—{ [3-ř-butylamino)-2-hydroxypropoxy]imino}-l-(m-trifluormethylfenyl)ethan acetát +++
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]benzylurethan 0
-77CZ 295562 B6
Tabulka 2 (pokračování)
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené šoku
N'-[2-hydroxy-3-(l-methyl-l-piperidinium-l-yl)propoxy]-N-methyl-pyridinium-3-karboximidoylchlorid dijodid +++
N-hexyl-N'-[3-( l-piperidinyl)propoxy]močovina ++
N-cyklohexyl-N'-[2-acetoxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]močovina hydrochlorid 0
N-[2-hydroxy-3-piperidinylpropoxy]-2-nitrobenzimidoylchlorid monohydrochlorid +++
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-chinolinkarboximidamid dihydrochlorid +++
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-N,N'-difenylbenzamidin 0
N,N-dimethyl-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N-fenylguanidin 0
N,N-dimethyl-N'-feny 1-N'' [3-( 1 -piperidinyl)propoxy] guanidin hydrochlorid ++
N-methyl-N-[3-(í-piperidinyl)propoxy]benzamid hydrochlorid +
5.6- diohydro-3-(4-chlorfenyl)-5-[N-methy 1-1-piperidinium-1-y l]-methyl-4H-1,2,4oxadiazin jodid ++
Methyl-{N-[3-( l-piperidinyl)propoxy] }-3-pyridinkarboximidát maleát 0
N-methyl-N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-7n-trifluormethylbenzamid hydrochlorid +++
N-[3-( l-piperidinyl)propoxy]-N'-tetramethylen-3-pyridinkarboxamidin hydrochlorid +++
N-[3-( l-piperidinyl)propoxy]-N-methyl-N'-(«-hexyl)močovina 0
Tabulka 3
Stimulační účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na tepelným šokem indukovanou produkci hsp72 v 3T3 buňkách, když působení následovalo po vystavení tepelného šoku.
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené stresu
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidiny l)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát 0
N-[2-hydroxy-3-piperidinylpropoxy]-2-nitrobenzimidoylchlorid monohydrochlorid 0
5.6- dihydro-5-(l-piperidinyl)methyl-3(3-pyridyl)-4//-l,2,4-oxadiazin 0
O-(3-piperidino-l-propyl)-3-nitrobenzhydroximoylchlorid hydrochlorid +
N-[2-palmitoyloxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid +
N-hexyl-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]močovina +++
-78CZ 295562 B6
Tabulka 3 (pokračování)
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené stresu
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]naftalen-l-karboxamid ++
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-4-pyridinkarboximidoychlorid (Z)-2-butendioát (1:1)++
N'-[2-hydroxy-3-(l-methyl-l-piperidinium-l-yl)propoxy]-N-methylpyridinium-3karboximidoylchlorid dijodid +++
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-chinolinkarboximidamid dihydrochlorid +++
V této tabulce znamená 0 že působení způsobilo o ± 20 % stresem indukovanou buněčnou hladinu hsp72, zatímco +, ++ resp. +++ znamenají 21-50 %, 51-100 % resp. > 100 % zvýšení relativně k hladině kontroly vystavenému šoku.
Pokusy s použitím tepelného šoku na U-937 leukemických a L-929 myších fíbroblastových buňkách se prováděly podobně jak je popsáno shora, ale působení sloučeniny vždy předcházelo tepelný šok. Sloučeniny N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát byla za těchto experimentálních podmínek testována v 10'5 M koncentraci. Působení vedlo k více než 50% zvýšení tepelným stresem indukované hladiny hsp72.
Pokusy se stresem indukovaným chemickým činidlem
Tyto pokusy se prováděly na lidských epitelových buňkách HeLa a na lidských leukemických buňkách U-937 s použitím HgCl2 k indukci stresové odezvy. Působení sloučeniny proběhlo před vystavením buněk stresu. Testované kultury byly připraveny a působení probíhalo jako v experimentech s 3T3 buňkami. Po působení sloučenin byly buňky inkubovány 15 min při 37 °C, pak všechny kultury kromě dvou (kontroly bez stresu) byly vystaveny 0,5 μΐ/ml koncentraci HgCl2 a inkubace pokračovala. Indukované množství hsp72 se měřilo 6 hodin po vystavení stresu. Použitá koncentrace HgCl2 vedla k 15-30 % maximální hladiny hsp72.
Na HeLa buňkách zvyšovaly N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]benzimidoylchlorid monohydrochlorid a N-[2-hydroxy-3-piperidinylpropoxy]-3-nitrobenzimidoylchlorid monohydrochlorid stresem indukovanou hladinu hsp72 o více než 20 % resp. 50 %.
Na U-937 buňkách zvyšoval N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát stresem indukovanou hladinu hsp72 o více než 20 % ve srovnání s kontrolou vystavenou stresu.
Pokusy na primárních tkáňových explantátech
Tyto pokusy byly provedeny na potkaních explantátech sleziny a varlat s aplikací tepelného stresu po působení experimentálních sloučenin. Pokusy na suspenzích ze sleziny se provedly jak následuje.
Sleziny CFY potkanů vážících 200 g byly asepticky vyjmuty a homogenizovány v MEM kultivačním médiu obsahujícím 10 % fetálního telecího séra. Koncentrace buněčné suspenze byla nastavena na 50-100 mg/ml.
-79CZ 295562 B6
Po 5 ml buněčné suspenze bylo naneseno na jednotlivé kultivační misky o průměru 6 cm a explantáty byly kultivovány po jednu hodinu ve zvlhčovaném vzduchu obsahujícím 5 % CO2 při 37 °C, pak se na kultury působilo ΙΟ'5 M koncentrací testované sloučeniny. Po dalších 15 min při 37 °C byly kultury vystaveny tepelnému šoku při 43 °C po 30 min v inkubátoru. Množství indukovaného hsp72 bylo měřeno po dalších 6 hodinách inkubace při 37 °C.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4, a zvýšené hladiny hsp72 jsou hodnoceny ve stejné škále jako v tabulkách 2 a 3.
Tabulka 4
Stimulační účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na tepelným šokem indukovanou expresi hsp72 v explantátech potkaní sleziny
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené stresu
N-{ 3—[(1, l-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy}-3-trifluormethylbenzamid +
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-N-heptylmočovina +++
N-(3-chlorfenyl)-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]močovina +++
5,6-dihydro-5-( 1 -p i per idi nyl)methyl-3-(3-pyridy 1)-4//-1,2,4-oxadiazin 0
Pokusy na potkaních testikulárních explantátech se provedly jak následuje.
Varlata CFY potkanů vážících 200 g byla vyjmuta ze sterilních podmínek a uvolněné testikulární tubuly byly suspendovány vMEM kultivačním médiu obsahujícím 10 % fetálního telecího séra tak, že pět ml suspenze obsahovalo 50 - 100 mg tkáně.
Explantáty byly inkubovány po jednu hodinu ve zvhlčováném vzduchu obsahujícím 5 % CO2, při 37 °C, pak se na kultury působilo ΙΟ'5 M koncentrací testované sloučeniny. Po další inkubaci po 15 min při 37 °C byly explantáty vystaveny tepelnému šoku při 43 °C po 30 min v inkubátoru. Množství indukovaného hsp72 bylo měřeno po dalších 6 hodinách inkubace při 37 °C.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5, a zvýšení hladiny hsp72 je hodnoceno ve stejné škále jako v tabulce 4.
Tabulka 5
Stimulační účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na tepelným šokem indukovanou expresi hsp72 v potkaních testikulárních explantátech
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené šoku
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleát +++
5,6-dihydro-5-( l-piperidinyl)methyl-3-(3-pyridyl)-4řř-l ,2,4-oxadiazin ++
N-[2-hydroxy-3-( l-piperidinyl)propoxy]benzimidoylchlorid monohydrochlorid ++
-80CZ 295562 B6
Tabulka 5 (pokračování)
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené šoku
N-{ 3-[( 1, l-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy }-3-trifluormethyl-benzamid 0
N-[2-benzyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl (Z)-2-butendioát (1:1)++ 3-(3-pyridyl)-5-diethylaminomethyl-5,6-dihydro-6J/-l ,4,2-dioxazin hydrochlorid ++
N-[2-hydroxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-4-acetamidobenzamidin monohydrochlorid 0 3-(3-pyridyl)-5-/-butylamino-5,6-dihydro-6J/-l,4,2-dioxazin 0
N-[2-palmitoyloxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid 0
N-hexyl-N'-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]močovina ++
N-(3-piperidino-l-propoxy)-3-pyridinkarboximidoylchlorid dihydrochlorid ++
O-(3-diethylaminopropoxy)-3-pyridinkarboximidoylchlorid hydrochlorid 0
O-(3-piperidino-l-propyl)-3-nitro-benzhydroximoylchlorid hydrochlorid ++
1—{ [3-/-butylamino)-2-hydroxypropoxy]imino}-l-(m-trifliionnethylfenyl)ethan acetát +
N-{3-[(l,l-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy}-3-triflormethylbenzimidoylchlorid monohydrochlorid +
N-[2-palmitoyloxy-3-( 1 -piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid dihydrochlorid +++
N-hexyl-N'-[3-( l-piperidinyl)propoxy]-močovina 0
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-3-nitrobenzimidoylchlorid monohydrochlorid +
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-2-nitrobenzimidoylchlorid monohydrochlorid ++
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-heptylmočovina +++
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-l-isochinolinkarboximidamid dihydrochlorid +++ N-methyl-N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]benzamid hydrochlorid +
5,6-dihydro-3-(4-chlorfeny l)-5-[N-methyl-1 -piperidinium-1 -yl]-methyl-4H-l ,2,4-oxadiazin jodid +
N-[3-( 1 -piperidinyl)propoxy]thiofen-2-karboximidoylchlorid hydrochlorid ++
-81 CZ 295562 B6
Příklad 20
Měření hladiny HSP mRNA v hrudní aortě potkanů s genetickou hypertenzí
Potkani s genetickou hypertenzí byly rozděleni do čtyř skupin po čtyřech. Na skupiny se působilo denně, orálně, u první skupiny fyziologickým solným roztokem, u druhé skupiny N-[2-hydroxy3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem (20 mg/kg) po 5 dnů, u třetí skupiny N-[2-hydroxy-3-piperidinylpropoxy]benzimidoylchlorid monohydrochloridem (5 mg/kg) po 20 dnů a u čtvrté skupiny N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidoylchlorid monohydrochloridem (5 mg/kg) po 20 dnů. Zvířata byla usmrcena, aorty byly izolovány a okamžitě zamrazeny v tekutém dusíku a skladovány do použití při -70 °C.
Morfologické zkoumání hrudní aorty
Zkoumání se provedlo podle publikovaných metod (Br. J. Pharmacol. 1995: 115, 514-420). Byla vyříznuta 1 mm2 ploška hrudní aorty a fixována v 2,5 % glutaraldehydu při teplotě místnosti. Postfíxace se provedla v 1% kysličníku osmičelém po jednu hodinu. Tkáň byla dehydrována v ethanolu a zapolymerizována do Durcupanu ACM. Snímky byly brány elektronovým mikroskopem Hitachi 7100 a kvantitativně hodnoceny.
Bylo pozorováno, že působení N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu, N-[2-hydroxy-3-piperidinylpropoxy]benzimidoylchlorid monohydrochloridu resp. N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidoylchlorid monohydrochloridu podpořilo regeneraci buněk aorty průměrným resp. silným způsobem.
Kvantitativní měření hsp70
Pokusy se prováděly kvantitativní reverzní transkripční polymerázovou řetězovou reakcí. Principem metody je, že když se dva velmi podobné ale rozlišitelné templáty amplifikují ve stejné PCR reakci, pak se v tomto procesu nemění poměr jejich produktů. Když je známo množství jednoho ztemplátů a relativní poměr produktů je měřitelný, pak lze vypočítat množství neznámého počátečního templátu. V nejčastěji používané metodě se známý templát (kompetitor) a neznámý templát (cíl) liší pouze v délce, kompetitor je kratší, a v důsledku toho jsou produkty PCR separovatelné na základě svých velikostí.
RNA byla z tkání izolována guanidin-isokyanátovou metodou (Choczynski P. a Sacci N., Anal. Biochem. 162: 156, 1987). Koncentrace a kvalita nukleové kyseliny byly hodnoceny spektrofotometrem a agarózovou gelovou elektroforézou za denaturujících podmínek (Sambrook J. et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Izolovaná RNA byla skladována při -70 °C.
Byl zkonstruován fragment z cDNA kódující hsp70 gen pomocí vystřižení interní sekvence (PCR-splicing, Riedy M. C et al., Biotechniques 18: 70 1995). Tento fragment byl amplifíkován s primery specificky se vážícími k externí části konstruktu (Erlich A.: PCR Technology, Principles and Applications for DNA Aplication. Stockton Press, 1989) a po změření koncentrace byl produkt skladován při -70 °C.
Reverzní transkripce se provedla za standardních podmínek s použitím 1 pg izolované RNA/vzorek s oligo dT (dTl6) primerem (Sambrook J. et al., jako shora).
Stejná množství cDNA, připravených s RNA vzorků, byla smíchána s různými množstvími kompetitoru (odvozenými ze seriálních ředění 3 a 10 krát) a templáty byly amplifíkovány polymerázovou řetězovou reakcí. Teploty aplikované během cyklů byly následující: denaturace (95 °C, 1 min) hybridizace (58 °C, 1 min), syntéza (72 °C, 0,5 min).
-82CZ 295562 B6
Po PCR amplifikaci byly produkty rozděleny na agarózovém gelu (1 %) a vybarveny ethidiumbromidem za standardních podmínek (Sambrook J. et al., jako shora). Vybarvené DNA fragmenty byly vizualizovány UV-transiluminátorem po fotografii. Množství PCR produktů bylo měřeno denzitometrií z negativů fotografií.
Bylo pozorováno, že hladina hsp70 v hrudní aortě byla po působení N-[2-hydroxy-3-(lpiperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu, N-[2-hydroxy-3-piperidinylpropoxyjbenzimidoylchlorid monohydrochloridu a N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]2-thiofenkarboximidoylchlorid monohydrochloridu o více než 50 % vyšší než hsp70 v kontrolních zvířatech.
Příklad 21
Sledování inhibičního účinku na stárnutí kůže morčat
Inhibiční účinek sloučenin podle vynálezu na stárnutí kůže byl sledován u morčat. Kůže pěti zvířat na skupinu byla depilována a plochy 1 cm2 byly ozářeny ze zdroje UV-B s intenzitou 100 mJ/cm2 na obou stranách. Po ozáření se na kůže na jedné straně působilo krémem složeným podle příkladu 10 a obsahujícím 5 % (hmotn./hmotn.) N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoylchlorid maleátu, N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy] benzimidoylchlorid monohydrochloridu nebo N-[2-hydroxy-3-piperidinylpropoxy]-2-nitrobenzimidoylchlorid monohydrochloridu, zatímco na druhou stranu zvířat se působilo stejným krémem bez aktivní složky. Byl to experiment se „samokontrolou“.
Působení započalo okamžitě po ozáření a provádělo se dvakrát denně po dva týdny.
Ozáření UV-B mělo za následky těžká poškození kůže (puchýře, poškození epitelu, tvorbu ran), jež se hojila o 4 dny dříve a u nichž byla velikost ran signifikantně menší, když se na zvířata působilo sloučeninami podle vynálezu. Tyto sloučeniny podporovaly tvorbu epitelu.
Tento pokus ukazuje, že dané působení zvýšilo rezistenci kůže proti záření UV-B a zlepšilo její regeneraci.

Claims (64)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití hydroxylaminového derivátu k přípravě farmaceutického přípravku ke zvyšování exprese molekulárního chaperonu projevující se tím, že buňka vystavená fyziologickému stresu zvyšuje expresi molekulárního chaperonu nad množství indukované daným fyziologickým stresem, přičemž se jedná o hydroxylaminový derivát, jehož tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, («) nebo jeho sůl, a/nebo jakýkoli jejich opticky aktivní stereoizomer, kde
    A je Ci_2oalkyl, Ci_2oalkyl substituovaný kyanem, hydroxylem, Ci_6alkoxylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci_6alkylaminoskupinou, di-Ci_6alkylamino-skupinou, halogen-C|..6alkylaminoskupinou nebo halogenem; fenyl-Ci_6alkyl, fenyl-Ci_6alkyl substituovaný ve fenylové části kyanem, hydroxylem, Ci ^alkylem, Ci_6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci_6alkylaminoskupinou, di-Cι-ealkylaminoskupinou, halogen-Ci_6alkylaminoskupinou nebo halogenem; fenyl, fenyl substituovaný ve fenylové části kyanem, hydroxylem, Ci_6alkylem, Ci_6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-C]_6alkylaminoskupinou, di—Ci_6alkylaminoskupinou, halogen-Ci^alkylaminoskupinou nebo halogenem; 5- nebo 6-členná heteroarylová skupina, obsahující N, S nebo O;
    Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku a Ci_6alkylu;
    R je C i^alky 1 nebo ω-aminoalkylová skupina s přímým nebo větveným C3^8alkylovým řetězcem, popřípadě substituovaná hydroxy- nebo alkoxyskupinou a popřípadě substituovaná na atomu dusíku jedním nebo dvěma shodnými nebo různými C|_6alkyly nebo C5_7cykloalkyly, nebo dva aminosubstituenty společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 5-7členný heterocyklický kruh, který může dále obsahovat další heteroatom N nebo O a nesoucí popřípadě C j _4alkylsubstituent na druhém dusíkovém heteroatomu;
    X vtautomeru obecného vzorce I je halogenovaná nebo C|_6alkoxyskupina nebo NR*R2, kde R1 a R2 jsou nezávisle vodík, lineární nebo větvený Ci_6alkyl nebo cykloalkyl, nebo R1 a R2 společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3-7-členný, výhodně 5-7členný kruh a
    X v tautomeru obecného vzorce lije kyslíková, iminová nebo substituovaná iminová skupina,
    R' je vodík, Ci^alkyI, fenyl, fenyl-Ci_6alkyl nebo acylová skupina, a sloučeniny obecného vzorce I případně obsahují intramolekulámí kruhové struktury tvořené spojením X a reaktivního substituentu R.
    -84CZ 295562 B6
  2. 2. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 1, kde se na buňku se působí před fyziologickým stresem.
  3. 3. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 1, kde se na buňku se působí po fyziologickém stresu.
  4. 4. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 1 při přípravě farmaceutického přípravku ke zvyšování aktivity molekulárního chaperonu v eukaryotické buňce vystavené fyziologickému stresu ke zvýšení aktivity molekulárního chaperonu nad množství indukované daným fyziologickým stresem, přičemž se jedná o hydroxylaminový derivát, jehož tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, nebo jeho sůl, a/nebo jejich opticky aktivní stereoizomer, kde
    A je Ci_20alkyl, Ci_20alkyl substituovaný kyanem, hydroxylem, C]_6alkoxylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci_6alkylaminoskupinou, di-Ci^alkylamino-skupinou, halogen-C|_6alkylaminoskupinou nebo halogenem; fenyl-Ci_6alkyl, fenyl-Ci_6alkyl substituovaný ve fenylové části kyanem, hydroxylem, C]_6alkylem, Ci_6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci_6alkylaminoskupinou, di-Ci_6alkylaminoskupinou, halogen-Ci^alkylaminoskupinou nebo halogenem; fenyl, fenyl substituovaný ve fenylové části kyanem, hydroxylem, Ci_6alkylem, C]_6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci_6alkylaminoskupinou, di—C| 6alkylaminoskupinou, halogen-C]_6alkylaminoskupinou nebo halogenem; 5- nebo 6-členná heteroarylová skupina, obsahující N, S nebo O;
    Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku a Cj_6alkylu;
    R je Ci_éalkyl nebo ω-aminoalkylová skupina s přímým nebo větveným C3_8alkylovým řetězcem, popřípadě substituovaná hydroxy- nebo alkoxyskupinou a popřípadě substituovaná na atomu dusíku jedním nebo dvěma shodnými nebo různými Ci_6alkyly nebo C5_7cykloalkyly, nebo dva aminosubstituenty společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 5-7členný heterocyklický kruh, který může dále obsahovat další heteroatom N nebo O a nesoucí popřípadě C|_4alkylsubstituent na druhém dusíkovém heteroatomu;
    X vtautomeru obecného vzorce I je halogenovaná nebo Ci^alkoxyskupina nebo NR^2, kde R1 a R2 jsou nezávisle vodík, lineární nebo větvený C]_6alkyl nebo cykloalkyl, nebo R1 a R2 společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3-7-členný, výhodně 5-7členný kruh a
    X v tautomeru obecného vzorce lije kyslíková, iminová nebo substituovaná iminová skupina,
    R' je vodík, C]_6alkyl, fenyl, fenyl-C i^alky 1 nebo acylová skupina, a sloučeniny obecného vzorce I případně obsahují intramolekulámí kruhové struktury tvořené spojením X a reaktivního substituentu R.
  5. 5. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde eukaryotická buňka pod fyziologickým stresem je savčí buňka.
  6. 6. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 5, kde savčí buňka je lidská buňka.
  7. 7. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 5 nebo 6, kde buňka je jednou z buněk živého organismu.
    -85CZ 295562 B6
  8. 8. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, kde buňka je neuronální buňka, svalová buňka, buňka cévní stěny, obzvláště endothelová, epitelová buňka nebo buňka imunitního systému.
  9. 9. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde eukaryotická buňka vystavená stresem je rostlinná buňka.
  10. 10. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 9, kde rostlinná buňka je jednou z buněk živého rostlinného organismu.
  11. 11. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, kde fyziologický stres je metabolický, oxidativní nebo lokální mechanický stres, nebo stres způsobovaný ischemií, tepelným šokem, radiací nebo toxickým materiálem.
  12. 12. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 11, kde stres způsobuje diabetes mellitus.
  13. 13. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, kde fyziologický stres způsobuje zvýšení reaktivních volných radikálů nebo cytokinů přítomných v oblasti obklopující buňku.
  14. 14. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, kde fyziologický stres vede k výskytu kardiovaskulárních, vaskulámích, mozkových, alergických, a imunitních, autoimunních onemocnění, chorob virového nebo bakteriálního původu, nádorových onemocnění, chorob kůže a sliznice, nebo chorob epitelu ledvinových kanálků, nebo stavů jež mohou být léčeny kosmetickou intervencí.
  15. 15. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 14, kde kardiovaskulární onemocnění způsobují ateroskleróza, koronární onemocnění, hypertonie nebo pulmonální hypertonie, vyvolané fyziologickým stresem.
  16. 16. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 14, kde mozkové onemocnění je způsobeno cerebrovaskulární ischemií, mrtvicí, traumatickým poraněním hlavy, senilními degenerativními onemocněními, obzvláště senilní demencí, AIDS demencí, alkoholickou demencí, Alzheimerovou chorobou, Parkinsonovou chorobou nebo epilepsií, vyvolanými fyziologickým stresem.
  17. 17. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 14, kde onemocnění kůže nebo sliznice je způsobeno dermatózou nebo ulcerální chorobou gastrointestinálního systému, vyvolaným fyziologickým stresem.
  18. 18. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároků 1 až 17, kde molekulární chaperon je bílkovina tepelného šoku, hsp.
  19. 19. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 18, kde hsp je hsp 70 nebo hsp72.
  20. 20. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení nemoci spojené s funkcí chaperonového systému nebo spojené s poškozením buněčné membrány nebo membrány buněčné organely, případně prevence téhož, přičemž se jedná o hydroxylaminový derivát, jehož tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, uvedenými v nároku 1, nebo jeho sůl, a/nebo jakýkoli jejich opticky aktivní stereoizomer, kde
    A je Ci_2oalkyl, Cj_2oalkyl substituovaný kyanem, hydroxylem, Ci_6alkoxylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci„6alkylaminoskupinou, di-C| 6alkylamino-skupinou, halogen-Ci_6alkylaminoskupinou nebo halogenem; fenyl-C i ^alky 1, fenyl-C i^alkyl substituovaný ve fenylové části kyanem, hydroxylem, Ci_6alkylem, Ci_6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou,
    -86CZ 295562 B6 mono-Ci^alkylaminoskupinou, di-Ci_6alkylaminoskupinou, halogen-Ci^alkylaminoskupinou nebo halogenem; fenyl, fenyl substituovaný ve fenylové části kyanem, hydroxylem, C^alkylem, Ci_6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci_6alkylaminoskupinou, di—Ci 6alkylaminoskupinou, halogen-C i^alky lam inoskupinou nebo halogenem; 5- nebo 6-členná heteroarylová skupina, obsahující N, S nebo O;
    Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku a C^alkylu;
    R je Ci_6alkyl nebo ω-aminoalkylová skupina s přímým nebo větveným C3_salkylovým řetězcem, popřípadě substituovaná hydroxy- nebo alkoxyskupinou a popřípadě substituovaná na atomu dusíku jedním nebo dvěma shodnými nebo různými C^alkyly nebo C5_7cykloalkyly, nebo dva aminosubstituenty společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 5-7členný heterocyklický kruh, kteiý může dále obsahovat další heteroatom N nebo O a nesoucí popřípadě Ci_4alkylsubstituent na druhém dusíkovém heteroatomu;
    X v tautomeru obecného vzorce I je halogenovaná nebo Ci_6alkoxyskupina nebo NR!R2, kde R1 a R2 jsou nezávisle vodík, lineární nebo větvený Ci_6alkyl nebo cykloalkyl, nebo R1 a R2 společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3-7-členný, výhodně 5-7členný kruh a
    X v tautomeru obecného vzorce II je kyslíková, iminová nebo substituovaná iminová skupina,
    R' je vodík, Ci_6alkyl, fenyl, fenyl-C i^alky 1 nebo acylová skupina, a sloučeniny obecného vzorce I případně obsahují intramolekulámí kruhové struktury tvořené spojením X a reaktivního substituentu R.
  21. 21. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 20, kde se patologický stav vybere ze skupiny sestávající z ischemie, nádorového onemocnění, infekce způsobené patogenním mikroorganismem, autoimunního onemocnění a dermatózy.
  22. 22. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 20 k přípravě farmaceutického přípravu na ochranu myokardu, mozkové tkáně nebo ledvin před poškozením tkáně a/nebo nekrózou, způsobovanými ischemií, kde jde o hydroxylaminový derivát, jehož tautomemí formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, uvedenými v nároku 1 nebo jeho sůl, a/nebo jakýkoli jejich opticky aktivní stereoizomer, kde A, Z, R, R' a X jsou definovány v nároku 20.
  23. 23. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 20 až 22 k přípravě léčivého přípravku pro humánní aplikaci.
  24. 24. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 20 až 23 k výrobě farmaceutického prostředku pro léčbu mozkových, alergických, imunitních a autoimunních onemocnění, chorob, způsobených virovými nebo bakteriálními infekcemi, chorob kůže a sliznice, nebo chorob epitelu ledvinových kanálků.
  25. 25. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 1 až 2, přičemž se jedná o hydroxylaminy obecného vzorce I, uvedeného v nároku 1, kde
    R je Ci_6alkyl nebo ω-aminoalkylová skupina s přímým nebo větveným C3_8alkylovým řetězcem, popřípadě substituovaná hydroxy- nebo alkoxyskupinou a popřípadě substituovaná na atomu dusíku jedním nebo dvěma shodnými nebo různými Cj^alkyly nebo C5_7cykloalkyly, nebo dva aminosubstituenty společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 5-7členný heterocyklický kruh, který může dále obsahovat další heteroatom N nebo O a nesoucí popřípadě C 14alkylsubstituent na druhém dusíkovém heteroatomu; a
    -87CZ 295562 B6
    a) Z j e kovalentní vazba a X j e halogen,
    b) Z je kovalentní vazba a X je substituovaná hydroxylová skupina -OQ, kde Q je Ci^alkyl, a případně tato sloučenina má intramolekulámí kruh tvořený spojením X a reaktivního substituentu skupiny R,
    c) Z je kovalentní vazba a X je -NR*R2, R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený Ci_6alkyl, substituovaný přímý nebo větvený Cj^alkyl, cykloalkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený kruh obsahující 3 až 7 členů, a případně tato sloučenina má intramolekulámí kruh tvořený spojením X a reaktivního substituentu skupiny R,
    d) Z je kyslík a X je substituovaná hydroxylová skupina -OQ, kde Q je C^alkyl,
    e) Z je kyslík a X je -NR]R2, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený Ci_6alkyl, substituovaný přímý nebo větvený C]_6alkyl, cykloalkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem, knim připojeným, tvoří nasycený kruh obsahující 3 až 7 členů, a případně tato sloučenina má intramolekulámí kruh tvořený spojením X a reaktivního substituentu skupiny R,
    f) Z je =NR3, kde R3 je H, C^alkyl, substituovaný Ci_6alkyl, fenyl, substituovaný fenyl, fenyl-Ci_6alkyl, nebo fenylalkyl mající substituovanou fenylovou nebo alkylovou částí, a X je -NR*R2, R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem knim připojeným tvoří nasycený kruh obsahující 3 až 7 členů.
  26. 26. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 25, kde R je amino-Ci ^alkyl, případně substituovaný na amino- a/nebo alkylové skupině, a daný alkylový řetězec, jenž s výhodou obsahuje 3-8 uhlíkových atomů a je přímý nebo větvený, může být substituován hydroxy- nebo acyloxy-
  27. 27. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 25 nebo 26, kde R je amino-C|_6alkyl mono nebo disubstituovaný na aminoskupině, kde substituenty aminoskupiny nezávisle na sobě jsou jeden nebo dva přímé nebo větvené alkyly nebo cykloalkyly, nebo dva substituenty aminoskupiny spolu s přilehlým N-atomem tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklus, jenž případně může obsahovat další heteroatomy.
  28. 28. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 25 až 27, kde Z je chemická vazba a X je halogen, s výhodou chlor nebo brom, a A je fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, fenyl, substituovaný fenyl nebo heteroaryl.
  29. 29. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 28, kde A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, jenž má jeden nebo více substituentů, s výhodou alkoxy, fenyl, fenyl substituovaný halogen, alkyl-, alkoxy- nebo halogenalkyl- nebo nitro- nebo N-obsahující heteroaryl, jenž může být kondenzován s benzenovým kruhem, s výhodou pyridyl, nebo Sobsahující heteroaryl.
  30. 30. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 25 až 27, kde Z je chemická vazba a X je substituovaný hydroxyl obecného vzorce -OQ, kde Q je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, a A je heteroaryl, s výhodou N-obsahující heteroaryl.
    -88CZ 295562 B6
  31. 31. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 1 až 24, kde hydroxylaminový derivát má obecný vzorec Γ, kde
    R je Ci_6alkyl nebo ω-aminoalkylová skupina s přímým nebo větveným (J-salkylovým řetězcem, popřípadě substituovaná hydroxy- nebo alkoxyskupinou a popřípadě substituovaná na atomu dusíku jedním nebo dvěma shodnými nebo různými Ci_6alkyly nebo C5.7cykloalkyly, nebo dva aminosubstituenty společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 5-7členný heterocyklický kruh, který může dále obsahovat další heteroatom N nebo O a nesoucí popřípadě Ci_4alkylsubstituent na druhém dusíkovém heteroatomu; a
    A je fenyl nesubstituovaný nebo substituovaný kyanem, hydroxylem, C]_6alkoxylem, fenylem, nitroskupinou, aminoskupinou, mono-Ci_6alkylaminoskupinou, di-Ci_6alkylaminoskupinou, halogen-Ci_6alkylaminoskupinou nebo halogenem; nebo heteroaryl.
  32. 32. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 31, kde R je aminoalkyl, jenž může být substituován na amino- a/nebo alkylovém řetězci, a alkylový řetězec má s výhodou 1-5 uhlíkových atomů.
  33. 33. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 25 nebo 26, kde R je aminoalkyl mono- nebo disubstituovaný na aminoskupině, a kde substituenty aminoskupiny nezávisle na sobě jsou jeden nebo dva přímé nebo větvené alkyly nebo cykloalkyly, nebo dva substituenty aminoskupiny spolu s přilehlým N-atomem tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklus, jenž případně může obsahovat další heteroatomy.
  34. 34. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 25 až 27, kde Z je chemická vazba,
    X je -NR*R2, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem, k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený kruh, a
    A je fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl nebo heteroaryl.
  35. 35. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 24, kde A je fenylalkyl, fenylalkyl, jenž může mít jeden nebo více substituentů, s výhodou alkoxy ve fenylové části, fenyl, fenyl substituovaný jednou nebo více alkyl-, halogen-, alkoxy-, halogenalkyl-, nitro- nebo acylaminoskupinami nebo N-obsahující heteroaryl, jenž může být kondenzován s benzenovým kruhem, s výhodou pyridyl, nebo S-obsahující nebo O-obsahující heteroaryl.
    -89CZ 295562 B6
  36. 36. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 1 až 24, kde hydroxylaminový derivát má obecný vzorec I, kde R je Ci^alkyl nebo ω-aminoalkylová skupina s přímým nebo větveným C3_.8alkylovým řetězcem, popřípadě substituovaná hydroxy- nebo alkoxyskupinou a popřípadě substituovaná na atomu dusíku jedním nebo dvěma shodnými nebo různými Ci„6alkyly nebo C5.7cykloalkyly, nebo dva aminosubstituenty společně s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 5-7členný heterocyklický kruh, který může dále obsahovat další heteroatom N nebo O a nesoucí popřípadě C^alkylsubstituent na druhém dusíkovém heteroatomu;
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl nebo heteroaryl, a
    R1 je H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části.
  37. 37. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 36, kde R” je aminoalkyl, jenž může být substituován na amino- a/nebo alkylovém řetězci, a alkylový řetězec má s výhodou 1-5 uhlíkových atomů.
  38. 38. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 36 nebo 37, kde R” je aminoalkyl mono- nebo disubstituovaný na aminoskupině, kde substituenty aminoskupiny nezávisle na sobě jsou jeden nebo dva přímé nebo větvené alkyly nebo cykloalkyly, nebo dva substituenty aminoskupiny spolu s přilehlým N-atomem tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklus, jenž případně může obsahovat další heteroatomy.
  39. 39. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 34, kde A je fenyl, fenyl substituovaný jednou nebo více alkyl-, halogen-, alkoxy-, halogenalkyl- nebo nitroskupinami nebo Nobsahující heteroaryl, jenž může být kondenzován s benzenovým kruhem, s výhodou pyridyl, nebo S-obsahující nebo O-obsahující heteroaryl.
  40. 40. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 25 až 27, kde Z je kyslík,
    X je -OQ, kde Q je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části.
  41. 41. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 25 až 27, kde Z je kyslík,
    X je -ΝΡ'Κ2, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem, k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený kruh, a
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl nebo heteroaryl.
    -90CZ 295562 B6
  42. 42. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 25 až 27, kde Z je =NR3, kde R3 je H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části,
    X je -NR^2, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem, k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený kruh, a
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části.
  43. 43. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 1 až 24, kde hydroxylaminový derivát má obecný vzorec II, uvedený v nároku 1, kde
    R je alkyl nebo substituovaný alkyl a
    a) Z j e kovalentní vazba a X j e kyslík, nebo
    b) Z je kovalentní vazba a X je =NR4, kde R4 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl nebo cykloalkyl,
    c) Z je kyslík a X je kyslík,
    d) Z je kyslík a X je =NR4, kde R4 je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, fenylalkyl nebo fenyl; nebo heteroaryl,
    e) Z je =NR3, kde R3 je H, nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, fenyl nebo fenylalkyl, a X je kyslík,
    f) Z je =NR3, kde R3 je H, nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, fenyl nebo fenylalkyl, a X je =NR4, kde R4 je H, nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl nebo fenylalkyl, nebo cykloalkyl.
  44. 44. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 43, kde R je aminoalkyl, případně substituovaný na amino- a/nebo alkylové skupině, a alkylový řetězec obsahuje s výhodou 3-8 uhlíkových atomů, a je přímý nebo větvený, může být substituován hydroxy- nebo acyloxy skupinou.
  45. 45. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 43 nebo 44, kde R je aminoalkyl mononebo disubstituovaný na aminoskupině, kde substituenty aminoskupiny nezávisle na sobě jsou jeden nebo dva přímé nebo větvené alkyly nebo cykloalkyly, nebo dva substituenty aminoskupiny spolu s přilehlým N-atomem tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklus, jenž případně může obsahovat další heteroatomy.
  46. 46. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 43 až 45, kde Z je chemická vazba, X je kyslík a
    R' je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, a
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, fenylalkyl nebo fenyl; nebo heteroaryl.
    -91 CZ 295562 B6
  47. 47. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 46, kde A je fenyl, fenyl substituovaný jednou nebo více alkyl-, halogenalkyl- nebo alkoxy-, fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, N-obsahující heteroaryl nebo S-obsahující heteroaryl.
  48. 48. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 43 až 45, kde Z je chemická vazba, X je =NR4, kde R4 je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, nebo cykloalkyl, a
    R' je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, a
    A je fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl nebo heteroaryl.
  49. 49. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 48, kde A je fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný jednou nebo více alkoxyskupinami ve fenylové části, fenyl, fenyl substituovaný jednou nebo více alkyl-, halogenalkyl- nebo nitroskupinami nebo N-obsahující heteroaryl, s výhodou pyridyl, nebo S-obsahující heteroaryl.
  50. 50. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 43 až 45, kde Z je kyslík, X je kyslík, R' je H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, a
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, fenylalkyl, nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části.
  51. 51. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 43 až 45, kde Z kyslík, X je =NR4, kde R4 je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný heteroaryl, a R' je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části.
  52. 52. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 43 až 45, kde Z je =NR3, R3je H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, X je kyslík, a R' je H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, nebo acyl a A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, fenylalkyl, fenyl nebo heteroaryl nebo cykloalkyl.
  53. 53. Použití hydroxylaminového derivátu podle nároku 52, kde A nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, jenž obsahuje s výhodou 4 až 12 uhlíkových atomů, cykloalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, fenyl, fenyl substituovaný jednou nebo více halogen-, alkyl—, halogenalkyl- alkoxy- nebo nitroskupinami, nebo N-obsahující heterocyklická skupina.
  54. 54. Použití hydroxylaminového derivátu podle kteréhokoli z nároků 43 až 45, kde Z je =NR3, kde R3 je H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části,
    -92CZ 295562 B6
    X je =NR4, kde R4 je H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části, nebo cykloalkyl, s výhodou H nebo alkyl.
    R' je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, fenylalkyl, nebo fenylalkyl substituovaný ve fenylové a/nebo alkylové části,
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl.
  55. 55. Hydroxylaminový derivát obecného vzorce I, uvedený v nároku 1, kde
    a) X je halogen, s výhodou chlor nebo brom,
    Z je chemická vazba a al) A je skupina obecného vzorce (a), (a), kde Y1 je halogen-, alkoxy-, halogenalkylová nebo nitroskupina a n je 1, 2 nebo 3; nebo Oobsahující heteroaryl, s výhodou furyl, S-obsahující heteroaryl, s výhodou thienyl, nebo Nobsahující heteroaromatická skupina případně kondenzovaná s benzenovým kruhem, nebo její N-Ci_4alkyl kvartérní derivát nebo N-oxid, s výhodou pyridyl, chinolyl nebo isochinolyl,
    R je skupina mající strukturu (b), (CHpk-CH—N
    Ar6 kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený C|_6alkyl, s výhodou substituovaný přímý nebo větvený C]_6alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 s R6, spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -OR7, kde R7 je H nebo Ci_6acylová skupina, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný C|_6alkylkarbonyl, fenylkarbonyl, nebo aminoacyl, kje 1, 2 nebo 3, a m je 1,2 nebo 3 nebo jejich N-Cm alkyl kvartérní derivát nebo N-oxid, s výhradou, že když A je pyridyl nebo skupina obecného vzorce (a), kde Y je halogen nebo Cj^alkoxy, pak
    R7 j e j iné než H, nebo
    -93 CZ 295562 B6 a2) A je skupina obecného vzorce (c),
    R je skupina obecného vzorce (d) a případné substituenty Y2 a Y3, z nichž alespoň jeden musí být v molekule přítomný, jsou kyslík, nebo Cj_4 alkyl a k je 1, 2 nebo 3 a m je 1, 2 nebo 3; a když je daná sloučenina mono- nebo bivalentní kationt, jejími anionty jsou jeden nebo dva halogenidy, s výhodou jodové ionty,
    b) X je -NR!R2, R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený C^alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl-Cj_6alkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný heterocyklický kruh, jenž může obsahovat jeden nebo více dalších heteroatomů,
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl-Ci_6alkyl,
    Z je kyslík nebo =NR3 skupina, kde R3 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný Ci-ealkyl,
    R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený Ci-éalkyl, s výhodou C I 4al kyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je -OR7, kde R7 je H nebo Ci_6acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný Ci_6alkylkarbonyl nebo fenylkarbonyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3, nebo
    c) X je -OQ, kde Q je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl nebo fenyl-C^alkyl,
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl nebo fenyl-Ci_6alkyl,
    Z je kyslík a
    R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený C]_6alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je -OR7, kde R7 je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný Ci_6alkylkarbonyl, fenylkarbonyl nebo aminoacyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3, nebo
    -94CZ 295562 B6
    d) A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nebo N-obsahující heteroaromatická skupina, s výhodou pyridyl, nebo S-obsahující heteroaromatická skupina,
    Z je chemická vazba,
    X je-OQ, kde Q je C]_4 alkyl a
    R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený Ci_6alkyl, s výhodou Cu alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu sN-atomem knim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
  56. 56. Hydroxylaminový derivát podle nároku 55, kde A je skupina obecného vzorce (a) a Y1 je Cj_4 halogenalkyl, s výhodou trifluormethyl.
  57. 57. Opticky aktivní stereoizomer hydroxylaminového derivátu podle nároku 55, kde
    X je halogen, Z je chemická vazba a R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C]^ alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, brány dohromady s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je -OR7, kde R7 je aminoacyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
  58. 58. Hydroxylaminový derivát obecného vzorce I, uvedeného v nároku 1, kde
    X je -NR]R2, R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C[_4alkyl nebo cykloalkyl, nebo R1 a R2 brány dohromady s N-atomem k nim připojeným tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklus,
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, substituovaný jednou nebo více alkoxyskupin, s výhodou C]_4alkoxy-, fenyl, fenyl substituovaný jednou nebo více halogen-, alkylnebo halogenalkyl-, s výhodou C^alkyl- nebo halogenalkyl-, nebo acylamino- nebo nitroskupinami, nebo nesubstituovaná nebo substituovaná N-obsahující heteroaromatická skupina, jež může být kondenzována s benzenovým kruhem, s výhodou pyrrolyl, pyridyl, isochinolyl nebo chinolyl, nebo S-obsahující heteroarylová skupina, s výhodou thienyl, kde heteroatomy mohou mít jeden nebo více substituentů, s výhodou jeden nebo více alkylů, s výhodou C]_4alkylů,
    Z je chemická vazba,
    R je skupina struktury (e), ~(CH2)k—C—(CH2)m— N ( e ) ;
    Ys kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 s R6, když jsou brány spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, jenž má další heteroatomy a popřípadě substituenty, s výhodou CI 4alkyl; Y4 je H nebo nesubstituovaný nebo
    -95CZ 295562 B6 substituovaný Ci^alkyl, Y5 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný C^alkyl, nebo OR7, kde R7 je H nebo acyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je fenyl, fenyl substituovaný halogenem nebo alkoxyskupinou, nebo fenylalkyl substituovaný alkoxyskupinou, nebo pyridylová skupina, a R7 je H, pak alespoň jeden z R1 a R2 je jiný než H, nebo když A je fenyl, fenyl substituovaný halogenem nebo alkoxyskupinou, nebo fenylalkyl substituovaný alkoxyskupinou, nebo pyridylová skupina, a R1 a R2 jsou oba H, pak R7 je jiný než H.
  59. 59. Hydroxylaminový derivát obecného vzorce II, uvedeného v nároku 1, kde
    a) X je kyslík,
    A je Ci_2o přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo halogenfenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, nebo N-obsahující heteroaromatická skupina, s výhodou pyridyl,
    Z je chemická vazba,
    R' je H, Ci^alkyl nebo fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl,
    R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ci_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6 brány dohromady s N-atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo -OR7, kde R7 je H, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je jiné než alkyl a R' je H, pak Y6 je H, nebo
    b) X je =NR4, kde R4 je H, nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenylalkyl,
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, nebo cykloalkyl,
    Z je chemická vazba, kyslík nebo =NR3 skupina, kde R3 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl,
    R' je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, a
    R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Cb4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6 brány dohromady s N-atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo -OR7, kde R7 je H nebo acyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2, nebo 3, nebo
    c) X je kyslík,
    A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl,
    Z je kyslík,
    R' je alkyl nebo fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl,
    -96CZ 295562 B6
    R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány dohromady s Natomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo -OR7, kde R7 je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo fenylkarbonyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1,2 nebo 3, nebo
    d) X je kyslík,
    Z je =NH a dl) A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, cykloalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl, fenyl, fenyl substituovaný halogen-, halogenalkylalkoxy- nebo nitroskupinou,
    R' je alkyl nebo fenylalkyl, s výhodou fenylalkyl,
    R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C|_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány dohromady sNatomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo -OH, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2, nebo 3.
  60. 60. Hydroxylaminový derivát obecného vzorce I, uvedeného v nároku 36, kde
    A je fenyl nebo fenyl substituovaný halogen-, nebo nitroskupinou, nebo N-obsahující heteroarylová skupina s výhodou pyridyl
    R1 je H, a
    R je aminoalkylová skupina, jež je případně mono- nebo disubstituovaná, přičemž alkylový řetězec má 1-5 uhlíkových atomů, a substituenty aminoskupiny mohou být, nezávisle na sobě, jedním nebo dvěma přímými nebo větvenými alkyly nebo cykloalkyly, nebo dva substituenty aminoskupiny, když jsou brány dohromady sN atomem knim přilehlým tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, nebo jeho N-Ci^-alkylový kvartémí derivát, s výhradou že když A je 3-pyridyl, R je jiný než 1-piperidinylmethyl.
  61. 61. Farmaceutický a případně kosmetický prostředek pro léčbu kardiovaskulárních, vaskulámích, mozkových, alergických, imunitních, autoimunních onemocnění, chorob způsobovaných virovými nebo bakteriálními infekcemi, nádorových onemocnění, chorob kůže asliznice, vyznačující se tím, že obsahuje 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylaminové sloučeniny obecného vzorce I, podle nároku 55, spolu s farmaceuticky a/nebo kosmeticky přijatelnými nosiči a přídavnými látkami.
  62. 62. Farmaceutický a případně kosmetický prostředek pro léčbu kardiovaskulárních, vaskulámích, mozkových, alergických, imunitních, autoimunitních onemocnění, chorob způsobovaných virovými nebo bakteriálními infekcemi, nádorovými onemocněními, chorob kůže a sliznice vyznačující se tím, že obsahuje 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylaminové sloučeniny obecného vzorce I, podle nároku 58, spolu s farmaceuticky a/nebo kosmeticky přijatelnými nosiči a přídavnými látkami.
  63. 63. Farmaceutický a případně kosmetický prostředek pro léčbu kardiovaskulárních, vaskulámích, mozkových, alergických, imunitních, autoimunních onemocnění, chorob způsobovaných virovými nebo bakteriálními infekcemi, nádorových onemocnění, chorob kůže asliznice, vyznačující se tím, že obsahuje 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylaminové sloučeniny obecného
    -97CZ 295562 B6 vzorce II podle nároku 59, spolu s farmaceuticky a/nebo kosmeticky přijatelnými nosiči a přídavnými látkami.
  64. 64. Farmaceutický a případně kosmetický prostředek pro léčbu kardiovaskulárních, vaskulámích, 5 mozkových, alergických, imunitních, autoimunních onemocnění, chorob způsobovaných virovými nebo bakteriálními infekcemi, nádorových onemocnění, chorob kůže asliznice, vyznačující se tím, že obsahuje 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylaminové sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 60, spolu s farmaceuticky a/nebo kosmeticky přijatelnými nosiči a přídavnými látkami.
CZ19972072A 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba CZ295562B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9503141A HU222994B1 (hu) 1995-11-02 1995-11-02 Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
HU9603919 1996-02-09
HU9629820 1996-10-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ207297A3 CZ207297A3 (cs) 1998-03-18
CZ295562B6 true CZ295562B6 (cs) 2005-08-17

Family

ID=27270113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19972072A CZ295562B6 (cs) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba

Country Status (31)

Country Link
US (4) US6653326B1 (cs)
EP (1) EP0801649B1 (cs)
JP (2) JP4531865B2 (cs)
KR (1) KR19980700976A (cs)
CN (1) CN1152871C (cs)
AT (1) ATE221880T1 (cs)
AU (1) AU720195B2 (cs)
BG (1) BG63944B1 (cs)
BR (1) BR9607565B1 (cs)
CA (1) CA2209167C (cs)
CZ (1) CZ295562B6 (cs)
DE (1) DE69622840T2 (cs)
DK (1) DK0801649T3 (cs)
EE (1) EE04239B1 (cs)
ES (1) ES2176502T3 (cs)
HR (1) HRP960508B1 (cs)
HU (1) HU222994B1 (cs)
IL (1) IL121126A (cs)
MX (1) MX9704988A (cs)
NO (1) NO321140B1 (cs)
NZ (1) NZ320523A (cs)
PL (1) PL195634B1 (cs)
PT (1) PT801649E (cs)
RS (1) RS49981B (cs)
RU (1) RU2206320C2 (cs)
SI (1) SI0801649T1 (cs)
SK (1) SK284823B6 (cs)
TR (1) TR199700574T1 (cs)
UA (1) UA61050C2 (cs)
WO (1) WO1997016439A1 (cs)
ZA (1) ZA969249B (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ298542B6 (cs) * 1996-08-09 2007-10-31 Biorex Kutato és Fejlesztö Rt. Použití derivátu hydroxylaminu k príprave léciva pro lécbu a prevenci nemocí spojených s dysfunkcí vaskulárních endoteliálních bunek a farmaceutický prípravek tyto látky obsahující

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUT78139A (hu) * 1995-12-22 2000-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Készítmény, különösen a bőr öregedési folyamatainak mérséklésére
WO2000007580A2 (en) * 1998-08-03 2000-02-17 N-Gene Kutató Kft. Pharmaceutical compositions against autoimmune diseases
HU226617B1 (en) * 1998-12-14 2009-04-28 Cytrx Corp Optically active pyridyl-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives, and pharmaceutical composition containing the compound as active ingredient
HUP9900475D0 (en) * 1999-02-26 1999-04-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl)-hiyroximic acid-halogenid derivative, it's use for treating insulin resistance, and pharmaceutical compositions containing them as active component
FR2792832B1 (fr) * 1999-04-28 2002-05-10 Codif Internat Sa Procede de protection de la peau pour la prevenir de son vieillissement cellulaire
HUP0001583A2 (hu) * 2000-04-18 2002-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Egy piridin-1-oxid-származék és eljárás annak átalakítására gyógyászati hatású vegyületekké
US20030190312A1 (en) * 2001-06-22 2003-10-09 The Regents Of The University Of California Eukaryotic genes involved in adult lifespan regulation
HUP0105205A2 (hu) * 2001-11-29 2003-08-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Metformint és egy hidroxilaminszármazékot tartalmazó, gyógyászati készítmény
NZ533795A (en) * 2002-01-11 2006-03-31 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft Carboxamidine derivatives and their use in the treatment of vascular diseases
JP5392980B2 (ja) * 2003-03-27 2014-01-22 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 早発型の腎尿細管細胞障害を検出するための方法およびキット
HUP0303584A3 (en) 2003-10-30 2009-12-28 Cytrx Corp Use of a hydroximic acid halide derivative in the treatment of neurodegenerative diseases
KR100825492B1 (ko) * 2004-04-12 2008-04-28 토렌트 파마슈티칼스 리미티드 에이치에스피70 유도 물질로서의 2-프로펜-1-온
WO2006006267A1 (ja) * 2004-07-07 2006-01-19 House Wellness Foods Corporation 抗ストレス剤
FR2880022B1 (fr) * 2004-12-24 2007-08-24 Mayoly Spindler Soc Par Action Nouveaux derives de la n-hydroxy-n'-phenyluree et de la n-hydroxy-n'-phenylthiouree et leur utilisation comme inhibiteurs de la synthese de la melanine
TW200831479A (en) * 2006-09-26 2008-08-01 Cytrx Corp Pharmaceutical compositions and methods for treating diseases
JP2010511622A (ja) * 2006-12-01 2010-04-15 シトルックス コーポレイション 発作の回復
TW200901958A (en) * 2007-05-04 2009-01-16 Cytrx Corp Diabetic wound healing
WO2009004650A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Torrent Pharmaceuticals Ltd. Novel substituted piperidones as hsp inducers
CA3004867C (en) 2008-06-26 2020-09-15 Orphazyme Aps Use of hsp70 as a regulator of enzymatic activity
KR101645937B1 (ko) * 2008-11-11 2016-08-08 (주)아모레퍼시픽 육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법
EP2356988A4 (en) * 2008-11-18 2012-05-09 Santen Pharmaceutical Co Ltd THERAPEUTIC FOR CHORIORETINAL DEGENERATION WITH PYRIDINE-3-CARBALDEHYDE O- (PIPERIDIN-1-YL-PROPYL) OXIM DERIVATIVE AS ACTIVE SUBSTANCE
US20110123473A1 (en) * 2009-11-26 2011-05-26 Basf Se Use of highly-branched polycarbonates in cosmetic and dermatological formulations
CA2817773A1 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Orphazyme Aps Methods for increasing intracellular activity of hsp70
KR101275264B1 (ko) * 2011-08-24 2013-06-17 포항공과대학교 산학협력단 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법
HUP1100534A2 (en) 2011-09-26 2013-04-29 Balazs Dr Hazay Pharmaceutical composition for the treatment of muscle atrophy
HUP1100535A2 (en) 2011-09-26 2013-04-29 Bracelia Invest Ltd Pharmaceutical composition for enhancement of stem cell treatment
RU2495928C2 (ru) 2012-01-30 2013-10-20 Сергей Юрьевич Лешков Средство для стимуляции синтеза белков теплового шока hsp 70 в клетках человека и животных; косметическое средство для стимуляции репаративных процессов; косметическое средство для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур; биологически активная добавка; пищевой продукт; способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур
KR102638203B1 (ko) 2014-09-15 2024-02-19 제브라 덴마크 에이/에스 아리모클로몰 제제
EP3442530A1 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Orphazyme A/S Heat shock proteins and cholesterol homeostasis
BR112018070653A2 (pt) * 2016-04-29 2019-02-05 Orphazyme As ingrediente farmacêutico ativo, e, composição
CN110753544A (zh) 2017-05-24 2020-02-04 奥菲泽米有限公司 热激蛋白诱导物和额颞病况
CN108314630B (zh) * 2018-02-08 2020-11-06 广西民族大学 一种肟醚类衍生物及其制备方法与应用
AU2019276048A1 (en) 2018-05-28 2021-01-21 Zevra Denmark A/S Hsp70 protein levels in PBMC samples as biomarker for disease
HUP1800298A1 (hu) 2018-08-30 2020-05-28 N Gene Res Laboratories Inc Gyógyszerkombináció béta-receptor blokkolók hatásának módosítására és a mellékhatások csökkentésére
CN110048418B (zh) * 2019-05-08 2023-03-24 辽宁工程技术大学 一种基于细胞-组织算法的微电网经济调度方法及装置
EP4171559A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 Zevra Denmark A/S Arimoclomol for treating gaucher disease
CN112094878A (zh) * 2020-08-18 2020-12-18 周银根 一种二步酶提取香菇多糖的方法、香菇多糖提取物及其应用
JP2024500632A (ja) 2020-11-19 2024-01-10 ゼブラ デンマーク エー／エス アリモクロモルクエン酸塩及びその中間体の調製プロセス
US20240115558A1 (en) 2020-12-24 2024-04-11 Zevra Denmark A/S Arimoclomol for the treatment of niemann pick disease, type c, in patients with er type missense mutations
CA3237171A1 (en) * 2021-09-28 2023-04-06 Zevra Denmark A/S Dioxazines and their use in treatment of gba-related diseases

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU177578B (en) 1976-08-27 1981-11-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Process for preparing new 0-/3-amino-2-hydroxy-propyl/-amidoxime derivatives
DE2651083A1 (de) 1976-11-09 1978-05-18 Hoechst Ag Neue o-alkylierte hydroxylamine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
HU207988B (en) 1988-10-20 1993-07-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft Process for producing halogenides of o-/3-amino-2-hydroxy-propyl/hydroximic acid and pharmaceutical compositions containing them as active components
HUT54347A (en) 1989-01-10 1991-02-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Improved process for producing amidoximes
US5334600A (en) 1991-07-30 1994-08-02 Ciba-Geigy Corporation Isoquinolyl substituted hydroxylamine derivatives
HU216830B (hu) 1992-07-21 1999-09-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt., N-[2-Hidroxi-3-amino-propoxi]-amidok és -imidátok, valamint dioxazinok, eljárás ezek előállítására, és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
EP0758315B1 (en) * 1994-05-06 1998-08-26 Biorex Kutato Es Fejlesztö Rt. Novel hydroximic acid derivatives, pharmaceutical compositions containing them and process for preparing same
HU9502843D0 (en) * 1995-09-29 1995-11-28 Livigene Ltd Pharmaceutical composition

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ298542B6 (cs) * 1996-08-09 2007-10-31 Biorex Kutato és Fejlesztö Rt. Použití derivátu hydroxylaminu k príprave léciva pro lécbu a prevenci nemocí spojených s dysfunkcí vaskulárních endoteliálních bunek a farmaceutický prípravek tyto látky obsahující

Also Published As

Publication number Publication date
US20100267711A1 (en) 2010-10-21
MX9704988A (es) 1998-07-31
RS49981B (sr) 2008-09-29
US20040019103A1 (en) 2004-01-29
DE69622840D1 (de) 2002-09-12
PT801649E (pt) 2002-12-31
JP2009108048A (ja) 2009-05-21
WO1997016439A1 (en) 1997-05-09
SK284823B6 (sk) 2005-12-01
JP4531865B2 (ja) 2010-08-25
EE04239B1 (et) 2004-02-16
EP0801649B1 (en) 2002-08-07
SI0801649T1 (en) 2002-12-31
US7745465B2 (en) 2010-06-29
US6653326B1 (en) 2003-11-25
BG63944B1 (bg) 2003-07-31
CA2209167A1 (en) 1997-05-09
HUT76659A (en) 1997-10-28
CN1152871C (zh) 2004-06-09
CZ207297A3 (cs) 1998-03-18
KR19980700976A (cs) 1998-04-30
CN1177351A (zh) 1998-03-25
BR9607565A (pt) 1999-07-20
ZA969249B (en) 1998-03-02
DE69622840T2 (de) 2003-04-30
IL121126A0 (en) 1997-11-20
AU720195B2 (en) 2000-05-25
BR9607565B1 (pt) 2011-08-23
PL322015A1 (en) 1998-01-05
EP0801649A2 (en) 1997-10-22
ATE221880T1 (de) 2002-08-15
US7148239B2 (en) 2006-12-12
HRP960508A2 (en) 1998-06-30
HRP960508B1 (en) 2004-10-31
UA61050C2 (en) 2003-11-17
NO321140B1 (no) 2006-03-27
IL121126A (en) 2002-07-25
AU7326396A (en) 1997-05-22
EE9700146A (et) 1997-12-15
US20040067940A1 (en) 2004-04-08
HU222994B1 (hu) 2004-01-28
TR199700574T1 (xx) 1999-08-23
CA2209167C (en) 2009-05-19
JPH10512590A (ja) 1998-12-02
NZ320523A (en) 2001-05-25
YU58796A (sh) 1999-09-27
RU2206320C2 (ru) 2003-06-20
BG101713A (en) 1998-03-31
DK0801649T3 (da) 2002-12-02
HU9503141D0 (en) 1995-12-28
NO973059L (no) 1997-09-02
PL195634B1 (pl) 2007-10-31
ES2176502T3 (es) 2002-12-01
SK88197A3 (en) 1998-04-08
NO973059D0 (no) 1997-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ295562B6 (cs) Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba
JPH11139969A (ja) 医薬組成物
BR112018069930B1 (pt) Compostos agonistas de ppar, uso dos mesmos e composição farmacêutica
EP3522873B1 (en) Compositions and methods for the treatment of xerostomia
JP3875731B2 (ja) ３，５−置換されたアミノベンゾイルグアニジン、それらの製法、医薬または診断剤としてのそれらの使用およびそれらを含有する医薬
AU2022201182A1 (en) Compositions and Methods for the Treatment of Fungal Infections
AU2017363973B2 (en) Compositions and methods for the treatment of oral infectious diseases
CZ298542B6 (cs) Použití derivátu hydroxylaminu k príprave léciva pro lécbu a prevenci nemocí spojených s dysfunkcí vaskulárních endoteliálních bunek a farmaceutický prípravek tyto látky obsahující
FI72967B (fi) Foerfarande foer framtaellning av farmaceutiskt aktiva 2-amino-3-bensoylfenylacetamidderivat.
KR980009236A (ko) 치환된 인다닐리딘아세틸구아니딘, 이의 제조방법, 약제 또는 진단제로서의 이의 용도 및 이를 함유하는 약제
JP2774845B2 (ja) 腫瘍転移阻害剤
FI85140B (fi) Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara n-(1h-indol-4-yl)-bensamidderivat.

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20111101