JP4531865B2 - 分子シャペロン産生を増強するのに有用なヒドロキシルアミン誘導体およびそれの調製 - Google Patents

分子シャペロン産生を増強するのに有用なヒドロキシルアミン誘導体およびそれの調製 Download PDF

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Description

1. 発明の背景
分子シャペロンはタンパク質の折り畳みを媒介するタンパク質である。それらは新たに合成されたまたは変性もしくは誤って折り畳まれた（misfolded）タンパク質の暴露表面に非共有結合により結合し、それらが正しいコンホメーションに折り畳まれるのを助ける。分子シャペロンはタンパク質合成、タンパク質翻訳およびＤＮＡ複製といった多数の細胞内過程にも関係している。
分子シャペロンは、非常に高い温度への暴露（熱ショック）への暴露または様々な生理的ストレスへの暴露の後で細胞内での発現が有意に増加するタンパク質である、熱ショックタンパク質を包含する。この分子シャペロンの発現の増加は、細胞を高温への短期暴露により予備コンディショニングすると細胞が他の場合には致命的となる温度に対する耐熱性を有することにより証明されるように、結果として高熱の悪影響に対する保護を細胞に与える。
熱ショックタンパク質の発現を誘導する生理的ストレスとしては、多くの病気に関連づけられている多様な病的状態が挙げられる。そのようなストレスに暴露された細胞における熱ショックタンパク質の合成は、熱ショック応答の場合と同様に生理的ストレスに対する細胞の保護を与える。
分子シャペロンの誘導と関係づけられるそのような病的状態の１つは虚血性損傷である。組織の虚血性損傷は、何らかの起こりうる理由での血液供給の悪化から生じる。例えば、長期の冠状動脈閉塞は心筋に重大な損傷を引き起こし、その結果として心筋の壊死に到り、そして血流が元に戻っても回復の見込みを危うくする。脳の場合は、脳組織の致死を引き起こすような重大な損傷が虚血により頻繁に起こり得る。
例え虚血の期間が短くても壊死に至る虚血の間に心筋中の熱ショックタンパク質hsp70の量が増加することが観察された。それらの場合、熱ショックと同様に、細胞中の増加したhsp70含量が、そうでなければ壊死を引き起こすであろう次の虚血の結果に対して細胞を保護する（DAS,D.K.他,Cardiovascular Res.,578,1993）。それは培養中のラット細胞を虚血させた時にも観察されている〔J.Clin.Invest.,93:759-767（1994）〕。従って、心筋細胞により合成された熱ショックタンパク質が虚血性損傷に対する保護を与える。
脳組織における状況も同様であり、脳の虚血は脳組織における熱ショックタンパク質の発現の増加を引き起こす。実験により、致死下の虚血による動物の前処理が熱ストレスタンパク質（hsp70）を誘導し、それがその後のより重い虚血傷害に対して脳を保護することも証明されている〔Simon他,Neurosci.Lett.,163:135-137（1993）〕。
分子シャペロンの誘導に関連づけられる組織および器官に対する生理的ストレスの別の例は、炎症性疾患により与えられる。炎症は、例えば様々な細菌およびウイルス病原体による感染の場合のような、外来物質の進入に対する宿主細胞の非特異的応答であり、損傷部位への白血球の凝集と活性化を含み、結果として高レベルの反応性酸素種とサイトカインの産生と放出を引き起こす。それらのサイトカインおよび反応性酸素基は病原体を攻撃するが、宿主組織も傷つける〔Jaquier Sarlin,Experientia 50:1031-1038（1994）〕。それらの炎症の毒性メディエーターに対する保護として、宿主組織は分子シャペロンの産生を増加させると思われる。こうして産生された分子シャペロンは、反応性酸素種により引き起こされる損傷から宿主細胞を保護し、且つＴＮＦおよび他のサイトカイン並びに反応性酸素基の細胞毒性から細胞を保護する。動物実験において、熱ショックタンパク質（hsp70）発現の増加を生む熱ショックへの動物の予備暴露が、肺炎の顕著な減少をもたらすことが証明された。従って、分子シャペロンは抗炎症作用を有する。
上記例は、細胞の恒常性バランスを破壊し且つ細胞に損傷を引き起こす様々な生理的ストレスに対して細胞を保護する分子シャペロンの能力を例証する。分子シャペロンは新生物を治療するのに有利であることも証明されている。例えば、分子シャペロン（65 kD hsp）をコードする遺伝子を使って腫瘍細胞を穿刺すると、それらが腫瘍形成性を失うかまたは腫瘍形成性の減少を示すことが報告されている（ＰＣＴ出願、PCT/GB93/02339）。更に、腫瘍細胞が熱ストレスに応答して増加した量DE分子シャペロンを発現することも報告されている。しかしながら、それらは細胞質中ではなく細胞膜の表面上に存在する〔Ferrarini,M.他,Int.J.Cancer,51:613-619（1992）〕。細胞表面上の分子シャペロンの存在の増加は、腫瘍細胞に対するＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の感受性の増加と互いに関係があり、ＮＫ細胞による腫瘍細胞のターゲティング、浸潤および致死を改善する〔Kurosawa,S.他,Eur.J.Immunol.23:1029（1993）〕。
細胞中の増加した分子シャペロン発現と関係づけられる利点から見て、そうした分子シャペロンの発現を増加させるかまたは活性を増大させる方法は非常に望ましいだろう。
2. 発明の要約
本発明は、細胞による分子シャペロンの発現を増加させるかまたは分子シャペロンの活性を増強する方法に関する。特に、本発明の１つの非限定的態様によれば、生理的ストレスに暴露される細胞を、生理的ストレスの最中、前または後で、該生理的ストレスにより誘導される量よりも多く細胞中の分子シャペロンの発現を増加させる有効量の化学化合物で処理することを含んで成る方法であって、ここで前記化学化合物はその互変異性体形が式（Ｉ）および（II）により表されるヒドロキシルアミン誘導体、または光学活性立体異性体を含むそれの塩であり、式中、
Ａはアルキル、置換されたアルキル、アラルキル、アリール成分および／またはアルキル成分において置換されたアラルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、または置換されたヘテロアリール基であり、
Ｚは共有結合、酸素または＝ＮＲ3であり、ここでＲ3は水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、並びにアリール成分および／またはアルキル成分において置換されたアラルキルから成る群より選ばれ、
Ｒはアルキルまたは置換されたアルキルであり、
式（Ｉ）の互変異性体中のＸはハロゲン、置換されたヒドロキシ、アミノ、単置換されたアミノ、または二置換されたアミノ基であり、
式（II）の互変異性体中のＸは酸素、イミノまたは置換されたイミノ基であり、そして
Ｒ’は水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、アリール成分および／またはアルキル成分において置換されたアラルキル、アシル、または置換されたアシル基であり、
そして式（Ｉ）の化合物はＸと反応性置換基とをカップリングすることにより形成された分子内環構造を含むことがある
ことを特徴とする方法が提供される。
本発明の別の非限定的態様は、上述したような構造（Ｉ）または（II）のヒドロキシルアミン誘導体の有効量を投与することを含んで成る、生理的ストレスに暴露された細胞中の分子シャペロンの活性を増強する方法である。ここで、分子シャペロンの活性は生理的ストレスのみにより誘導される量よりも増大される。それらの方法のいずれにおいても、ヒドロキシルアミン誘導体が投与される細胞は真核細胞であることが好ましい。
本発明によれば、上記で定義したようなヒドロキシルアミン誘導体で真核細胞が処理される。
本発明の別の目的は、シャペロン系が働くことと関係があるかまたは細胞膜もしくは細胞小器官膜の損傷と関連づけられる病気の治療方法、または考えられ得る予防方法であって、病的状態を抑制するのに有効な量の式（Ｉ）または（II）のヒドロキシルアミン誘導体を宿主生物に投与する方法である。
本発明の更に別の目的は、心臓血管、血管、脳、腫瘍性疾患、皮膚および／または粘膜の疾患または腎小管の上皮細胞の疾患の治療に用いることができる医薬組成物の調製における、並びに化粧品組成物の調製における、式（Ｉ）もしくは（II）のヒドロキシルアミン誘導体またはそれの塩の利用である。
本発明は更に、広範囲の生物学的効果を有し、生物中の分子シャペロンのレベルまたは前記分子シャペロンの活性を増強するのに並びにこの目的に適用できる医薬および化粧品組成物の調製に有用である、新規ヒドロキシルアミン誘導体に関する。
本発明の更なる目的は、医薬および化粧品組成物であって、そのような組成物において一般に許容される担体および助剤と一緒に新規ヒドロキシルアミン誘導体を含んで成る医薬および化粧品組成物である。
本発明は、少なくとも一部は、上述したような構造を有するヒドロキシルアミン誘導体が、細胞の処理の際に使うと、該細胞により生産される分子シャペロンの量を増加させるかまたはそれの活性を増強することができるという意外な発見に基づいている。この効果は、細胞が分子シャペロン発現を誘導する生理的ストレスの下にある時に特に大きい。そのよう場合、この化学化合物は生理的ストレスのみによって誘導される量より大きく細胞による分子シャペロンの発現を増強する。この発見は、分子シャペロンが様々な病気の病理作用に対して自分自身を防御する役割を細胞内で果たすという点から見ても重要である。よって、もし或る化合物が分子シャペロンの量を増加させるかまたは活性を増強することができれば、これを使って病気の有害作用に対して細胞を保護することおよびそれによって引き起こされる損傷を修復することが可能である。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリドマレイン酸塩での処理の結果による熱ショックに暴露されたH9c2ラット心筋に対するhspレベルの変化を示す。この化合物は図面上でＢと表示され、下記でも同様に化合物Ｂと呼称される。
図２は、デンシトメトリー評価に基づいたウエスタンブロット分析により得られた前記実験の結果を示す。
図３は、転写レベルでの細胞のhsp発現に対する化合物Ｂの効果の試験中に得られたhsp70 mRNAノーザンブロット分析の結果を示す。
図４は、hsp活性化に対する化合物Ｂの効果の試験中にサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞について得られたhsp26 mRNAノーザンブロット分析の結果を示す。
図５は、アデニル酸シクラーゼ活性化および原形質膜の状態に対するベンジルアルコールの効果を示す。
図６は、試験にルシフェラーゼレポーター遺伝子を使った、HeLa細胞におけるhsp遺伝子発現速度を示す。
図７は、K562細胞系中でのhsp72細胞表面発現に対する化合物Ｂの効果を示す。
図８は、表面圧の増加を示す種々の脂質膜と化合物Ｂとの相互作用を示す。
図９は、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミンから調製した二重層（Ｌa）
Figure 0004531865
大きな単一層小胞へのＴ六辺形（ＨII）相転移に対する10mMと100mMの濃度の化合物Ｂの効果を示す。
図10は、正常ラットおよびSTZ糖尿病ラットにおける血清ＴＮＦレベルに対する化合物Ｂの効果を表す図解である。
図11は、ケラチン細胞に対するシクロヘキシミドの増殖抑制作用に対する化合物Ｂの効果を示す。
図12は、内皮細胞に対するシクロヘキシミドの増殖抑制作用に対する化合物Ｂの効果を示す。
図13は、HeLa細胞系に対するシクロヘキシミドの細胞傷害作用に対する化合物Ｂの効果を示す。
図14は、H9c2ラット心筋細胞系に対するシクロヘキシミドの増殖抑制作用に対する化合物Ｂの効果を示す。
図15は、AB 1380酵母細胞におけるＰ１転写因子活性に対する化合物Ｂの効果を示す。
図16は、JF1酵母細胞におけるＡＰ１転写因子活性に対する化合物Ｂの効果を示す。
図17は、AB 1380酵母細胞におけるＰ１転写因子に対する化合物Ｂの効果を示す。
図18は、隔離型の機能性虚血ラット心臓モデルを化合物Ｂで処理し、虚血の２時間後にウエスタンブロッティングにより測定した、前記モデルに関して得られた試験結果を示す。
図19は、隔離型の機能性虚血ラット心臓モデルを化合物Ｂで処理し、虚血の３時間後にウエスタンブロッティングにより測定した、前記モデルに関して得られた試験結果を示す。
図20は、１％化合物Ｂを含有するクリームでの処置による、熱傷後のSTZ糖尿病ラットにおける創傷治癒を示す。
図21は、２％化合物Ｂを含有するクリームでの処置による、熱傷後のSTZ糖尿病ラットにおける創傷治癒を示す。
図22は、４％化合物Ｂを含有するクリームでの処置による、熱傷後のSTZ糖尿病ラットにおける創傷治癒を示す。
図23は、１％化合物Ｂを含有するクリームでの処置による、熱傷後のSTZ糖尿病ラットにおける目視評価による創傷治癒を示す。
図24は、２％化合物Ｂを含有するクリームでの処置による、熱傷後のSTZ糖尿病ラットにおける目視評価による創傷治癒を示す。
図25は、４％化合物Ｂを含有するクリームでの処置による、熱傷後のSTZ糖尿病ラットにおける目視評価による創傷治癒を示す。
図26は、デジタル式下方発光顕微鏡技術により上記試験において撮影した比較写真（処置したものと対照）を示す。
図27は、１，２および４％化合物Ｂを含有するクリームでの処置時にウエスタンブロッティングにより測定した上記試験において得られた試料のhsp72レベルを示す。
図28は、UV-B線に暴露し次いで化合物Ｂで処置したSCIDマウスにおける免疫組織化学的分析により測定されたhsp72レベル（処置したものと対照）を示す。
図29は、UV-B線に暴露し次いで化合物Ｂで処置したSCIDマウス皮膚生検試料における免疫組織化学的分析により測定されたhsp72レベルを示す。
4. 発明の詳細な説明
4.1 本発明のヒドロキシルアミン誘導体
互変異性体形が式（Ｉ）および（II）により表されるヒドロキシルアミン誘導体は、本明細書に記載される本発明に従って使うことができる。上記式において、Ａはアルキル、置換されたアルキル、アラルキル、アリール成分および／またはアルキル成分において置換されたアラルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、または置換されたヘテロアリール基であり、
Ｚは共有結合、酸素または＝ＮＲ3であり、ここでＲ3は水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、並びにアリール成分および／またはアルキル成分において置換されたアラルキルから成る群より選ばれ、
Ｒはアルキルまたは置換されたアルキルであり、
式（Ｉ）の互変異性体中のＸはハロゲン、置換されたヒドロキシ、アミノ、単置換されたアミノ、または二置換されたアミノ基であり、
式（II）の互変異性体中のＸは酸素、イミノまたは置換されたイミノ基であり、そして
Ｒ’は水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、アリール成分および／またはアルキル成分において置換されたアラルキル、アシル、または置換されたアシル基であり、
そして式（Ｉ）の化合物はＸと反応性置換基とをカップリングすることにより形成された分子内環構造を含むことがある。
「アルキル」とは、短鎖および長鎖を含む直鎖または枝分かれアルキル基を意味する。
好ましい短鎖アルキル基の炭素原子の典型的な数は１〜８であり、そのような基はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、ペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびオクチル基などであり、より好ましくは１〜６個の炭素原子を含み、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、ペンチル、tert-ペンチルおよびヘキシル基であることができる。
好ましい長鎖アルキル基の炭素原子の典型的な数は９〜21であり、そのような基はノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシルおよびヘンエイコシル基であることができ、より好ましくは９〜17個の炭素原子を含み、そして例えばノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシルおよびヘプタデシル基であることができる。
好ましいシクロアルキル基は、３〜８個の炭素原子を含む短いシクロアルキル鎖を有するシクロアルキル基を意味し、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチル基などであり、より好ましくは３〜７個の炭素原子を含み、そして例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチル基であることができる。
置換されることがあるアリールまたはアルキルとは、１または複数の置換基、例えばシアノ基、ヒドロキシル基、短鎖アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、ペンチル、tert-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等）、短鎖アルコキシ基（例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、tert-ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ基等）、アリール基（例えばフェニル、ナフチル基等）、ニトロ基、アミノ基、単（短鎖アルキル）置換されたアミノ基（例えばメチル−、エチル−、プロピル−、イソプロピル−、tert−ブチル−アミノ基等）、二（単鎖アルキル）置換されたアミノ基（例えばジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、ジペンチルアミノ、ジヘキシルアミノ基等）、モノハロゲン−、ジハロゲン−もしくはトリハロゲン−（短鎖）アルキル基（例えばクロロメチル、２，２−ジクロロエチル、トリフルオロメチル等）またはハロゲン原子（例えばフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨウ素原子）等を有するアリールまたはアルキル基も意味する。
好ましいアラルキル基は、１または複数の（置換されることがある）アリール基により置換された上述したような短鎖アルキル基を意味し、例えばベンジル基、ベンズヒドリル基、トリチル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基、２−ベンズヒドリルエチル基、３−フェニルプロピル基、１−メチル−２−フェニルエチル基、１−フェニルブチル基、４−トリチルブチル基、１，１−ジメチル−２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルヘキシル基等であることができ、より好ましくはフェニル基により置換された１〜４個の炭素原子を含む低級アルキル基、例えば、ベンジル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基および１−メチル−２−フェニルエチル基であることができる。好ましいアリール基はフェニル基、ナフチル基、ペンタレニル基、アントラセニル基等であることができ、より好ましくはフェニル基およびナフチル基である。
好ましい３〜８員の、より好ましくは５〜８員の、Ｎ含有飽和複素環式基は、１〜４個の窒素原子を含む飽和複素環式基を意味し、そしてアジリジニル基、アゼチジニル基、オキサジラニル基、ピロリジニル基、イミダゾリジニル基、ピラゾリジニル基、ペルヒドロチアゾリル基、ペルヒドロイソオキサゾリル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、ペルヒドロピリミジニル基、ペルヒドロピリダジニル基、モルホリニル基、ペルヒドロ−１Ｈ−アゼピニル基等であることができる。
好ましいヘテロアリール基は、不飽和の、３〜８員の、より好ましくは５〜６員の、１〜４個のＮを含む不飽和複素単環式基を意味し、そしてピロリル基、ピロリニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基およびそれのＮ−オキシド、ピリミジニル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ジヒドロトリアジニル基等であることができ；または不飽和の１〜５個のＮを含む縮合複素環式基を意味し、そしてインドリル基、イソインドリル基、インドリジニル基、ベンズイミダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、インダゾリル基、ベンゾトリアゾール基、テトラゾロピリジル基、テトラゾロピリダジニル基、ジヒドロトリアゾロピリダジニル基等であることができ；または３〜６員の、より好ましくは５〜６員の、１〜２個の酸素と１〜３個の窒素を含む不飽和複素単環式基を意味し、そしてオキサゾリル基、イソオキサゾリル基、オキサジアゾリル基（例えば１，２，４−オキサジアゾリルなど）であることができ；または不飽和の、１〜２個の酸素と１〜３個の窒素を含む縮合複素環式基を意味し、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾオキサジアゾリル基などであることができ；または３〜８員の、より好ましくは５〜６員の、１〜２個の硫黄と１〜３個の窒素を含む不飽和複素単環式基を意味し、そしてチアゾリル基、１，２−チアゾリル基、チアゾリニル基、チアジアゾリル基などであることができ；または３〜８員の、より好ましくは５〜６員の、１個のＳを含む不飽和複素単環式基を意味し、そしてチエニル基であることができ；または１個のＯを含む不飽和複素単環式基であり、そしてフリル基であることができ；または不飽和の１〜２個の硫黄と１〜３個の窒素を含む縮合複素環式基を意味し、ベンゾチアゾリル基、ベンゾチアジアゾリル基等であることができる。
本来の形を取った時またはアシル化基の部分を構成している時の好ましい「アシル」基は、好ましくは短鎖アルカノイル基（例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等）、短鎖アルコキシカルボニル基（例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル基等）、短鎖アルキルスルホニル基（例えばメチルスルホニル、エチルスルホニル基等）、アリールスルホニル基（例えばフェニルスルホニル基等）、アロイル基（例えばベンゾイル、ナフトイル基等）、アリール−短鎖アルカノイル基（例えばフェニルアセチル、フェニルプロピオニル基他）、シクロ−短鎖アルキル−短鎖アルカノイル基（例えばシクロヘキシル−アセチル基等）、アリール−短鎖アルコキシ−カルボニル基（例えばベンジルオキシカルボニル基等）、アリール−カルバモイル基（例えばフェニルカルバモイル、ナフチルカルバモイル基等）、シクロアルキルカルバモイル基（例えばシクロヘキシルカルバモイル基等）、複素単環式スルホニル基（例えばチエニルスルホニル、フリルスルホニル基等）であることができるアシル基を意味し；そしてアシル基は、場合により、「置換されることがある」という言葉で始まる段落で上述したような１〜３個の置換基により置換され得る。
好ましいω−アミノアルキル基は、アルキル鎖のω位に置換されたＮ原子を含みそしてアルキル鎖が１または複数の置換基により、好ましくは１個または２個のハロゲン（例えばクロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、ヒドロキシル基またはアシル化ヒドロキシル基（ここでアシル基は前に定義した通りである）により、より好ましくは１個または２個の短鎖アルキル基（ここでアルキルの定義は上述したのと同じである）により置換されることがある短鎖アルキル基を意味する。アルキル鎖のω位のところのＮ原子は、１個または２個の短鎖アルキル置換基、好ましくはメチル、エチル、tert−ブチル等により、シクロアルキルカルバモイル（例えばシクロヘキシルカルバモイル等）により置換されてもよく；より好ましくはＮ原子が１〜４個の窒素原子を含みそしてアジリジニル、アゼチジニル、オキサジラニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ペルヒドロチアゾリル、ペルヒドロイソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、ペルヒドロピリミジニル、ペルヒドロピリダジニル、モルホリニル、ペルヒドロ−１Ｈ−アゼピニル基等であることができる飽和複素環式基の一部であってもよく；ω位のＮ原子がアリール基（例えばフェニル等）により置換されてもよく、そして短鎖アルキル置換基により第四級化されるかまたはその上酸化されてもよい。
所望であれば、一般式（Ｉ）および（II）の遊離塩基は、有機酸と反応させることにより酸付加塩に変換することができ、酢酸塩、マレイン酸塩等であることができ；または無機酸と反応させることにより酸付加塩に変換することができ、そして塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等であることができ；またはアミノ酸と反応させることにより酸付加塩に変換することができ、アルギニン塩、グルタミン酸塩等であることができる。
構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体の非限定的態様では、Ｚは共有結合であり、そしてＸはハロゲン、好ましくはクロロまたはブロモである。この群に属する好ましい化合物は、Ａとして（i）アラルキルまたは置換されたアリール成分を有するアラルキル、好ましくはフェニルアルキルまたは１もしくは複数の置換基（好ましくはアルコキシ）を有するフェニルアルキル；（ii）アリールまたは置換されたアリール、好ましくはフェニルまたは置換されたフェニル、好ましくは１もしくは複数のアルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシまたはニトロ基を含む置換されたフェニル；（iii）ナフチル；（iv）ベンゼン環と縮合したものも包含する、Ｎ含有ヘテロアリール基、好ましくはピリジル；（v）Ｓ含有ヘテロアリール基；または（vi）Ｏ含有ヘテロアリール基を有する。この群に属する好ましい化合物はＲとして（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換もしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換もしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキル（ここでアルキル成分の好ましい置換基はヒドロキシまたはアシルオキシである）を有する。（i）〜（iv）のω−アミノアルキル基のうち、特に好ましいのはＣ3〜Ｃ8のアルキル成分を有するものである。
Ｚとして共有結合を、Ｘとしてハロゲンを有する構造（Ｉ）の特定のタイプのヒドロキシルアミン誘導体は、米国特許5,147,879号、5,328,906号及び5,296,606号に開示される。これらの化合物は、言及された米国特許に記載される手順により、好ましくは適切なハロゲン化水素の存在下での対応するＸ＝NH2誘導体のジアゾ化により調製され得る。開始化合物は、例えばハンガリー特許第177,578（1996）号に記載される周知の手順により、即ち塩基の存在下で、例えば構造２の反応性誘導体と構造１（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ）のアミドオキシムをカップリングすることにより、得られ得、そして通常単離又は精製を行うことなくジアゾ化され得る。本化合物の末端基Ａ及びＲは、必要に応じて更に酸性化又は誘導体化され得る。
構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体の別の非限定的態様では、Ｚは共有結合でありそしてＸは置換されたヒドロキシ基ＯＱ（ここでＱは非置換のまたは置換されたアルキルもしくはアラルキル基である）である。好ましい態様では、Ｑは直鎖または枝分かれアルキル基である。それらの化合物では、Ａはアリールまたはヘテロアリール、好ましくはＮ含有複素環式芳香族基であり；そしてＲは好ましくは（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換されたもしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換もしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルであり、ここでアルキル成分の置換基としてはヒドロキシまたはアシルオキシ基が好ましい。（i）〜（iv）のω−アミノアルキル基のうち、特に好ましいのはＣ3〜Ｃ8アルキル成分を有するものである。
Ｚが共有結合でありそしてＸがＯＱである構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体の特別な化合物群は構造（Ｉ’）を有する。構造（Ｉ’）はヒドロキシ基を経て閉環した環を含む。それらの化合物は、Ｒが-CH2-CH（OH)-Ｒ”（ここでＲ”は直鎖もしくは枝分かれアルキル、または置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはそれのアミノ基上で置換されることがありそして好ましくはＣ1-5直鎖または枝分かれアルキル鎖を含むω−アミノアルキルである）である構造（Ｉ）の化合物の環状形態を表す。最も好ましくは、Ｒ”はアミノ基上で単置換または二置換されたω−アミノアルキルであり、ここでアミノ置換基は、互いに独立に、１個または２個の直鎖もしくは枝分かれアルキルまたはシクロアルキルであることができ、または２つのアミノ置換基が隣接Ｎ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員のヘテロ環（追加のヘテロ原子を含むことがある）を形成してもよい。それらの中で好ましい化合物は、Ａとしてフェニル、置換されたフェニル、Ｎ含有ヘテロアリール、置換されたＮ含有ヘテロアリール、Ｓ含有ヘテロアリールまたは置換されたＳ含有ヘテロアリールを有する。
Ｚとして共有結合を有しそしてＸとしてＯＱを有する構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体は、ハンガリー国特許出願第2385/1992号に開示されている。それらの化合物は、上記群の対応するハロゲン誘導体〔Ｚが共有結合でありそしてＸがハロゲンである構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体〕から、ハンガリー国特許出願第2385/1992号に記載された方法により、例えばアルコキシドとの反応により、または構造（Ｉ’）の環状化合物の場合にはアルカリ環化により、調製することができる。
構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体の非限定的態様では、Ｚは共有結合でありそしてＸはＮＲ1Ｒ2であり、ここでＲ1とＲ2は互いに独立にＨ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、シクロアルキルであるか、またはＲ1とＲ2がそれに隣接した窒素原子と一緒になって、３〜７員を含む飽和環、好ましくは５〜７員の飽和環を形成する。
直前の段落において記載した化合物のうち、特に好ましいのはＲが（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換されたもしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換もしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルである化合物であり、ここでアルキル成分の置換基としてはヒドロキシまたはアシルオキシ基が好ましい。（i）〜（iv）のω−アミノアルキル基のうち、特に好ましいのはＣ3〜Ｃ8アルキル成分を有するものである。それらの化合物のうち、Ａとして（i）アラルキルまたは置換されたアリール成分を有するアラルキル、好ましくはフェニルアルキルまたは１もしくは複数の置換基（好ましくはアルコキシ）を有するフェニルアルキル；（ii）アリールまたは置換されたアリール、好ましくはフェニルまたは置換されたフェニル、好ましくは１もしくは複数のアルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシ、ニトロまたはアシルアミノ基を含む置換されたフェニル；（iii）ナフチル；（iv）ベンゼン環と縮合したものも包含する、Ｎ含有ヘテロアリール基、好ましくはピリジル；（v）Ｓ含有ヘテロアリール基；または（vi）Ｏ含有ヘテロアリール基を有するものが更に好ましい。
Ｚとして共有結合を有しそしてＸとしてＮＲ1Ｒ2を有する構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体は、既知の誘導体と新規誘導体の両方を包含する。ＸがNH2である化合物はハンガリー国特許第177578号（1976）明細書に開示されており、それらの化合物は塩基の存在下での構造２の反応性誘導体による構造１の非置換のアミドオキシム誘導体（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈの構造１）のアルキル化により合成することができる。
Ｚが共有結合でありそしてＸがＮＲ1Ｒ2である構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体の特別な群は、構造（Ｉ”）により与えられる。構造（Ｉ”）はＮＲ1Ｒ2基を経て閉環した環を含む構造（Ｉ）の環状形態を表す。それらの化合物はＲ2がＨでありそしてＲが-CH2-CH（OH）-Ｒ”（ここでＲ”は直鎖もしくは枝分かれアルキル、または置換された直鎖もしくは枝分かれアルキルである）である構造（Ｉ）の化合物から誘導することができる。
構造（Ｉ”）の化合物のうち、Ａが（i）アリールまたは置換されたアリール、好ましくはフェニルまたは置換されたフェニル、好ましくは１もしくは複数のアルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシ、アミノまたはニトロ基を含む置換されたフェニル；（iii）ナフチル；（iv）ベンゼン環と縮合したものも包含する、Ｎ含有ヘテロアリール基；（v）Ｓ含有ヘテロアリール基；および（v）Ｏ含有ヘテロアリール基であるものが特に好ましい。それらの化合物のうち特に好ましいのは、Ｒ”が（i）単置換されたもしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル、または（ii）単置換されたもしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルであり、好ましくは（i）と（ii）のω−アミノアルキルのアルキル成分が１〜５個の炭素原子を含む化合物である。特に好ましいのは、二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル基であって、ω−アミノアルキル基の置換基がそれに隣接した窒素原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成するものである。複素環は１または複数の追加のヘテロ原子を含んでもよい。
それらのω−アミノアルキル基中のアミノ置換基は、好ましくは直鎖もしくは枝分かれアルキル基またはシクロアルキル基である。一般式（Ｉ”）の化合物中、Ｒ1は水素、非置換のまたは置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、シクロアルキル、非置換のアラルキル、またはアリール成分および／またはアルキル成分において置換されたアラルキルである。
構造（Ｉ”）の化合物は、原子Ｎ（4）−Ｃ（5）の間での閉環（環化）により調製することができる。必要な開鎖誘導体は、Ｚが共有結合であり、Ｘが＝ＮＲ1Ｒ2（ここでＲ1は式（Ｉ”）の化合物に関して定義した通りであり、Ｒ2はＨである）であり、そしてＲが式-CH2-CHY5-Ｒ”（ここでＹ5は脱離基、例えばハロゲン原子を表す）の基である、構造（Ｉ）の化合物である。そのような誘導体は、対応するＹ5＝OH化合物から無機ハロゲン化剤、例えば塩化チオニルまたは五塩化リンを使って得ることができる。ハロゲン化は、不活性溶剤、例えばベンゼン、クロロホルム、テトラヒドロフラン等を使ってまたは使わずに、通常は煮沸することにより実施することができる。例えば塩化チオニルの蒸発により、過剰の試薬を除去した後、―単離もしくは精製後または単離もしくは精製せずに―強塩基、例えばｔ−ブタノール中のカリウムブトキシドでの処理により、粗製のハロゲン誘導体を環化せしめて式Ｉ”の化合物を与え、それを標準手順（抽出、再結晶など）により最終的に単離および精製する。
構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体の非限定的態様では、Ｚは酸素であり、そしてＸはＯＱであり、ここでＱはアルキル、置換されたアルキル、アラルキル、または置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキルである。Ｑとしてのアルキルまたは置換されたアルキルは、好ましくは１〜４個の炭素原子を有する。それらの化合物のうち、好ましいのは、Ａが好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルキルまたは置換されたアルキル、あるいはアラルキルまたは置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキルである化合物である。それらの化合物のうち、Ｒが（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換されたもしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換されたもしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルである化合物が好ましく、ここでアルキル成分の置換基としてはヒドロキシまたはアシルオキシ基が好ましい。
Ｚが酸素でありそしてＸがＯＱである構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体は、構造６を有するＯ−置換ヒドロキシルアミン（例えば、ドイツ国公開公報2,651,083（1976）参照）と構造７を有するオルトエステルとの反応により得ることができる。この縮合は、通常は溶媒としての試薬それ自体の中で、好ましくは煮沸により実施される。蒸発後、生成物は結晶化により、場合により（側鎖Ｒ中にアミン機能がある場合）酸付加塩の形で単離される。
構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体の非限定的態様によれば、Ｚは酸素であり、そしてＸはＮＲ1Ｒ2であり、ここでＲ1とＲ2は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、シクロアルキル、アリール、置換されたアリールであるか、またはＲ1とＲ2がそれに隣接した窒素原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和環を形成する。それらの化合物のうち、特に好ましいのはＲが（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換されたもしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換されたもしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルである化合物であり、ここでアルキル成分の置換基としてはヒドロキシまたはアシルオキシ基が好ましい。（i）〜（iv）のω−アミノアルキル基のうち、特に好ましいのはＣ3〜Ｃ8アルキル成分を有するものである。それらの化合物のうち、Ａが（i）アルキルまたは置換されたアルキル；（iii）アラルキルまたは置換されたアリール成分および／または置換されたアルキル成分を有するアラルキル；または（iv）アリールまたは置換されたアリール、好ましくはフェニルまたは置換されたフェニルであるのが好ましい。
それらの化合物の調製は後述のようにして実施することができるが、該方法はＸの性質に依存し、即ちＸが非置換のアミノ（NH2）であるかまたは置換されたアミノ官能性であるかに依存する。
（i）ＸがNH2である化合物の調製は、構造６のヒドロキシルアミンを構造Ａ−Ｏ−ＣＮの有機シアネートに付加することにより達成することができる〔例えばChem.Ber.98,144（1965）を参照のこと〕。この反応は好ましくは不活性有機溶媒中で、通常は室温で行われる。単離にはしばしばクロマトグラフィー精製が必要である。
（ii）Ｘが単置換されたアミノ基（例えばＮＨＲ1）である化合物は、構造９の既知のハロ蟻酸イミデート〔例えばHouben-Weil,“Methoden der Organischen Chemie,”Band E/4,p.544（1983）参照〕と構造６の化合物を、有機塩基（例えばトリエチルアミン）または無機塩基（例えば炭酸ナトリウム）の存在下で不活性溶媒（例えばベンゼン、テトラヒドロフラン等）の中で反応させた後、標準的な後処理と精製手順により、調製される。
（iii）Ｘが二置換されたアミノ基である誘導体は、Ｚが酸素でありそしてＸがＯＱである構造（Ｉ）の化合物（それらの誘導体の調製は上記に記載）と構造５の第二級アミンとの反応により調製される。それらのアミノ化反応は、極性有機溶媒、例えばエタノール中で、必要であれば還流させることにより、行われる。
構造（Ｉ）のヒドロキシルアミンの別の非限定的態様によれば、Ｚは＝ＮＲ3であり、ここでＲ3は水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、または置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキルであり；そしてＸはＮＲ1Ｒ2であり、ここでＲ1とＲ2は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、アリール、置換されたアリール、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ1とＲ2がそれに隣接した窒素原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和環を形成する。
それらの化合物のうち、Ａがアルキル、置換されたアルキル、アラルキル、置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキル、アリール、または置換されたアリールであるのが好ましい。このヒドロキシルアミン誘導体の群に属する化合物に好ましいＲは、（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換もしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換もしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルであり、ここでアルキル成分の置換基としてはヒドロキシまたはアシルオキシ基が好ましい。（i）〜（iv）のω−アミノアルキルのアルキル成分が３〜８個の炭素原子を含むのが好ましい。
ＺがＮＲ3でありそしてＸがＮＲ1Ｒ2である構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体は、アンモニアまたは第一級もしくは第二級アミンを使った上述の化合物の群（この群はＺが酸素でありそしてＸがＮＲ1Ｒ2である構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体に相当する）に属する対応するイソ尿素誘導体のアミノリシスにより調製することができる。この反応は、好ましくは極性溶媒、例えば水またはエタノール中で、過剰量のアミンを使って実施される。あるいはまた、構造10のハロホルムアミド〔Houben-Weil,“Methoden der Organischen Chemie,”Band E/4,553頁（1983）〕を有機または無機塩基の存在下で構造６を有する化合物と反応させてこの群の化合物を得ることもできる。この反応は不活性有機溶媒中で、通常は周囲温度にて実施される。
Ｒが式（b）（式中Ｒ7はアシルである）の基である化合物は、Ｒ7として水素を含む対応する化合物をエステル化することにより調製される。通常、好ましくは不活性溶媒中で、第三級アミンまた無機塩基の存在下で酸クロリドまたは酸無水物を使うことにより、アルキルまたはアリールエステルが得られる。
本発明において有用なヒドロキシルアミン誘導体の別の群は、構造（Ｉ）の化合物の互変異性体形を表す構造（II）を有する。構造（II）のヒドロキシシルアミン誘導体の非限定的態様によれば、Ｚは共有結合でありそしてＸは酸素である。この群に属する好ましい化合物は、Ａとして（i）アルキル、アラルキルまたは置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキル；（ii）アリールまたは置換されたアリール、好ましくはフェニルまたは１もしくは複数の置換基を有する置換されたフェニル（好ましい置換基としてはアルキル、ハロアルキルまたはアルコキシが挙げられる）；（iii）Ｎ含有ヘテロアリール基、好ましくはピリジル；または（iv）Ｓ含有ヘテロアリール基を有する。この群に属する化合物において、好ましいＲは（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換もしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換もしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルであり、ここでアルキル成分の置換基としてはヒドロキシまたはアシルオキシ基が好ましい。（i）〜（iv）のω−アミノアルキルのアルキル成分が３〜８個の炭素原子を含むのが好ましい。この群の好ましい化合物は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、または置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキルであるＲ’を有する。
この群に属する化合物はハンガリー国特許出願第2385/1992号に開示されている。それらの合成手順もその中に記載されており、最も好ましくは、それらは構造11を有する酸クロリドを使った構造６を有するＯ−置換ヒドロキシルアミン誘導体（ドイツ国公開公報第2,651,083号（1976）も参照のこと）のアシル化により得ることができる。この経路は、出発物質として構造６の代わりに構造12の化合物を使って、Ｒ’が水素以外のものであるそれらの新規誘導体の調製にも使用することができる。
構造（II）のヒドロキシルアミン誘導体の別の非限定的態様では、Ｚは化学結合であり；Ｘは＝ＮＲ4（ここでＲ4はＨ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、置換されたアリール基もしくは置換されたアルキル基を有するアラルキル、またはシクロアルキルである）であり；そしてＲ’はアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、または置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキルである。それらの化合物の中で、Ａが（i）アラルキルまたは置換されたアリール成分を有するアラルキル、好ましくはフェニルアルキルまたは１もしくは複数の置換基（好ましくはアルコキシ）を有するフェニルアルキル；（ii）アリールまたは置換されたアリール、好ましくはフェニルまたは置換されたフェニル、好ましくは１もしくは複数のアルキル、ハロアルキルまたはニトロ基を含む置換されたフェニル；（iii）ナフチル；（iv）Ｎ含有ヘテロアリール基、好ましくはピリジル；または（v）Ｓ含有ヘテロアリール基であるものが好ましい。この群に属する好ましい化合物は、Ｒとして（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換もしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換もしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルを有し、ここでアルキル成分の置換基としてはヒドロキシまたはアシルオキシ基が好ましい。（i）〜（iv）のω−アミノアルキル基のうち、特に好ましいのはＣ3〜Ｃ8アルキル成分を有するものである。
これらの化合物は、構造２を有する化学化合物を使った構造13のＮ，Ｎ’−二置換アミドオキシムのＯ−アルキル化（反応条件については、Ｚが共有結合でありそしてＸがＮＲ1Ｒ2である構造Ｉの化合物の調製を参照のこと）によるか、または式16のハロゲン化イミドイルを使った式12のＮ，Ｏ−二置換ヒドロキシルアミンのＯ−アシル化（この反応は、不活性溶媒中で、好ましくは有機または無機酸スカベンジャーの存在下で行われる）により、調製することができる。
Ｒが式（b）（式中、Ｒ7はアシルである）の基である化合物は、Ｒ7として水素を含む対応する化合物をエステル化することにより調製される。通常、好ましくは不活性溶媒中で、第三級アミンまたは無機塩基の存在下で酸クロリドまたは酸無水物を使うことにより、アルキルまたはアリールエステルが得られる。
構造（II）のヒドロキシルアミン誘導体の別の非限定的態様によれば、Ｚは酸素でありそしてＸは酸素である。この群に属する好ましい化合物は、Ａとしてアルキル、置換されたアルキル、アラルキル、または置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキルを有する。Ｒは（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換もしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換もしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルであるのが好ましく、ここでアルキル成分の置換基としてはヒドロキシまたはアシルオキシ基が好ましい。（i）〜（iv）のω−アミノアルキル基のうち、特に好ましいのはＣ3〜Ｃ8アルキル成分を有するものである。この群の好ましい化合物はＲ’として水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、または置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキルを有する。
この群に属する化合物はハンガリー国特許出願第1756/95号（1995年６月15日に出願）に開示されている。それらは、Ｚが共有結合でありそしてＸが酸素である構造IIの化合物の合成について記載したような単純な酸クロリドを使った場合と同様にして、構造14を有するクロロ蟻酸エステルを使った構造６または構造12を有するヒドロキシルアミン誘導体のアシル化により調製される。この反応は無機または有機塩基の存在を必要とし、且つ不活性溶媒中で、例えばクロロホルム中で実施することができる。副生成物の塩は例えば水での抽出により除去され、そして有機溶液から生成物が単離される。
構造（II）のヒドロキシルアミン誘導体の更に別の非限定的態様では、Ｚは酸素であり；Ｘは＝ＮＲ4であり、ここでＲ4はアルキル、置換されたアルキル、アラルキル、置換されたアリール基もしくは置換されたアルキル基を有するアラルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、または置換されたヘテロアリール基である。それらの化合物において、Ａは好ましくはアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、最も好ましくは非置換のもしくは置換されたフェニル、アラルキル、または置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキルであり、そしてＲは好ましくはω−アミノアルキルであり、これは好ましくはアルキル鎖中にヒドロキシまたはアシルオキシ基を含み、そして場合によりアミン窒素上で置換されることがあり、前記ω−アミノアルキル基のアルキル鎖は好ましくは３〜８個の炭素原子を含む。それらの化合物中、Ｒ’は好ましくは非置換であっても置換されていてもよいアルキル、アリールまたはアラルキル基である。
これらの化合物はＺが酸素でありそしてＸがＮＲ1Ｒ2である構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体のＮ−置換類似体であり、それは有機塩基（例えばトリエチルアミン）または無機塩基（例えば炭酸ナトリウム）の存在下で、不活性溶媒（例えばベンゼン、テトラヒドロフラン等）中で構造９を有するハロ蟻酸イミデートと構造12を有する化合物12とを反応させ、次いで標準的な後処理および精製手順により、同様にして調製することができる。
構造（II）のヒドロキシルアミン誘導体の別の非限定的態様では、Ｚは＝ＮＲ3であり、ここでＲ3は水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、および置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキルから成る群より選択され；そしてＸは酸素である。この群に属する好ましい化合物は、Ａとして（i）アラルキルまたは置換されたアルキル成分もしくは置換されたアリール成分を有するアラルキル、好ましくはフェニルアルキルまたは１もしくは複数の置換基を有するフェニルアルキル；（ii）アリールまたは置換されたアリール、好ましくはフェニルまたは置換されたフェニル、好ましくは１個もしくは複数個のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキルまたはニトロ基を含む置換されたフェニル；（iii）Ｎ含有ヘテロアリール基；（iv）直鎖または枝分かれの、好ましくは４〜12個の炭素原子を含む、アルキルまたは置換されたアルキル；または（v）シクロアルキル基を有する。この群に属する好ましい化合物は、Ｒとして（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換もしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換もしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルであり、ここでアルキル成分の置換基としてはヒドロキシまたはアシルオキシ基が好ましい。（i）〜（iv）のω−アミノアルキル基のうち、特に好ましいのはＣ3〜Ｃ8アルキル成分を有するものである。それらの化合物中、Ｒ’は好ましくは水素、アルキル、置換されたアルキル、アラルキル、置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキル、アリール、置換されたアリール、アシル、または置換されたアシル基である。
それらの化合物は同時係属ハンガリー国特許出願第1756/95号に開示されており、そして構造６または構造12を有するヒドロキシルアミン化合物を、不活性溶媒中で、通常は室温にて２〜24時間単に混合物を攪拌することによって、構造15を有するイソシアネートと反応させることにより、調製することができる。最後に、溶媒の蒸発後、好ましくは結晶化により生成物が単離される。
構造（II）のヒドロキシルアミン誘導体の非限定的態様では、Ｚは＝ＮＲ3であり、ここでＲ3は水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、および置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキルから成る群より選択され；Ｘは＝ＮＲ4であり、ここでＲ4はＨ、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、置換されたアリール基もしくは置換されたアルキル基を有するアラルキル、またはシクロアルキルであり；そしてＲ’はアルキル、置換されたアルキル、アラルキル、置換されたアリール成分もしくは置換されたアルキル成分を有するアラルキル、アリール、または置換されたアリールである。この群に属する好ましい化合物は、Ｒ3として水素、アルキルまたは置換されたアルキルを有し、Ｒ4が水素またはアリール基であり、Ａがアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、またはアリール成分および／またはアルキル成分において置換されてもよいアラルキルである。それらの化合物のうち好ましいのは、Ｒとして（i）ω−アミノアルキル；（ii）単置換もしくは二置換されたアミノ成分を有するω−アミノアルキル；（iii）置換されたアルキル成分を有するω−アミノアルキル；（iv）単置換もしくは二置換されたアミノ成分と置換されたアルキル成分も有するω−アミノアルキルであり、ここでアルキル成分の置換基としてはヒドロキシまたはアシルオキシ基が好ましい。（i）〜（iv）のω−アミノアルキル基のうち、特に好ましいのはＣ3〜Ｃ8アルキル成分を有するものである。
この群に属する化合物の調製は、第一級もしくは第二級アミンまたはアンモニアを使った対応するイソ尿素誘導体（Ｚが酸素でありそしてＸがＮＲ4である構造（II）を有する化合物）のアミノリシスにより達成することができる。この反応は好ましくは極性溶媒、例えば水またはエタノール中で、過剰量のアミンを使って行われる。あるいは、構造10を有するハロ蟻酸アミジンを、不活性溶媒中で、通常はそれらの沸点において、有機または無機塩基の存在下で、構造12の化合物と反応させることができる。
式（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体の１つの非限定的態様は、Ｘがハロゲン、好ましくはクロロまたはブロモであり；Ｚが化学結合でありそしてＡが式（a）（式中、Ｙ1はハロ、アルコキシ、ニトロ基またはハロアルキル基、好ましくは１〜４個の炭素原子を含むハロアルキル基であり；そしてｎは１，２または３である）の基、またはＯ−含有ヘテロアリール基（好ましくはフリル）、Ｓ−含有ヘテロアリール（好ましくはチエニル）、ベンゼン環と縮合されてもよいＮ−含有ヘテロアリール基（好ましくはピリジル、キノリルまたはイソキノリル）であり；Ｒが構造（b）（式中、Ｒ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくは置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6がそれに隣接した窒素原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し；Ｙ6は−ＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシル基、好ましくはアルキルカルボニル、置換されたアルキルカルボニル、アリールカルボニルもしくは置換されたアリールカルボニル、またはアミノアシルもしくは置換されたアミノアシル基であり；ｋは１，２または３であり；そしてｍは１，２または３であるる）の基であり、ただし、Ａがピリジルもしくはナフチル、またはＹ1がハロもしくはアルコキシである式（a）の基である時、Ｒ7がＨ以外のものであることを条件とする。それらの化合物は場合によりＡとしてＮ−第四級Ｃ1-4アルキルを含むＮ含有複素環式芳香族基、または前記Ｎ含有複素環式芳香族基のオキシドを含むことがあり、そして／または末端基Ｒ6とＲ7により形成される環がＮ−第四級化またはＮ−酸化飽和複素環式基であるＲを含むことがある。それらの化合物の中で好ましいのは、ＡとしてＹ1がトリフルオロメチルである式（a）の基を有するものである。式（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体のこの群はまた、Ｘがハロであり、Ａがピリジルであり、Ｚが化学結合でありそしてＲが式（b）（式中、Ｒ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6が隣接窒素原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し；Ｙ6は−ＯＲ7であり、ここでＲ7はアミノアシル基であり；ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）の基である化合物の光学活性立体異性体も包含する。
これらの新規化合物は、米国特許第5,147,879号、同第5,328,906号および同第5,296,606号に記載されたのと同様である手順を使って調製することができる。例えば、
（i）Ｒ5とＲ6の両方が水素以外のものである誘導体は、米国特許第5,147,879号、同第5,328,906号および同第5,296,606号に記載された手順と同様に、対応するNH2誘導体（Ｚが共有結合でありそしてＸがNH2である構造（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体）を適当なハロゲン化水素の存在下でジアゾ化することにより調製される。出発化合物は例えばハンガリー国特許第177578号に記載された既知の手順により、すなわちＲ1とＲ2がＨである構造１を有するアミドオキシムを塩基の存在下で構造２を有する反応性誘導体とカップリングせしめることにより得ることができ、そしてそうして得られた出発物質を通常は単離または精製せずにジアゾ化することができる。
（ii）所望の構造中のＲ7がＨでありそしてｍが１であるなら、合成は構造３を有するオキシランと構造４を有するアミンとの反応により達成することができる。この手順はＲ5＝Ｈ誘導体の合成にも用いることができる。
（iii）Ｒが構造（b）の基であり、そしてこの基の中のＲ7がアシル基である化合物は、対応するＲ7＝Ｈ誘導体のエステル化により調製される。一般に第三級アミンまたは無機塩基の存在下で、好ましくは不活性溶媒中で酸クロリドまたは酸無水物を使って、または或る場合には二相系において水性無機塩基を使ったSchotten-Bauman法により、アルキルまたはアリールエステルが得られる。アミノアシルエステルの調製には、基本的にはペプチド化学から公知である手順において試薬としてカルボキシル活性化Ｎ−保護アミノ酸誘導体（例えば活性エステル）が使われる。このカップリングも塩基（例えばトリエチルアミン）の存在を必要とする。生成物の単離および精製は標準的調製技術を使って行われる；最終調製物はしばしば適当な無機または有機酸との塩の形である。キラルアミノ酸から出発すると、生成物はしばしばＲ基中に第二のキラル中心を有するジアステレオマーである。単離の時に、それらのジアスレテオマーはしばしば分離するので、立体的に純粋な形で生成物を得ることができる。
Ｚが化学結合であり、Ｘがハロ、好ましくはクロロまたはブロモであり；Ａが式（c）の基であり；Ｒが式（d）の基であり；分子中に少なくとも一方が存在しなければならないＹ2とＹ3のうちの一方または両方が酸素であるか、または１〜４個の炭素原子を有するアルキルもしくは置換されたアルキルであり；ｋが１，２または３であり；ｍが１，２または３であり；Ｙ2とＹ3が点線により結合される（これはそれらの置換基の任意の存在を意味する）構造（Ｉ）を有する化合物も新規ヒドロキシルアミン誘導体である。該化合物が一価または二価カチオンである時、それのアニオンは１または２つのハロゲン化物イオン、好ましくはヨウ化物イオンである。
それらのヒドロキシルアミン誘導体は、それらの非置換型前駆体中の末端のピリジンおよび／またはピペリジン基の化学修飾（即ちＮ−酸化または第四級化）により調製される。酸化には、不活性溶媒（例えばクロロホルム、ジクロロメタン）中で好ましくは過酸、例えば置換された過安息香酸が使われる。分子中に２つの被酸化性基が存在する場合、使用する試薬の量によってモノオキシドかジオキシドが形成し得る。反応の終わりに、過剰の試薬が分解されそして蒸発により生成物が単離される。第四級化は、ハロゲン化アルキル（例えばヨウ化メチル）を使って、好ましくは該試薬を適当な溶媒（例えばアセトン）中で還流させることにより達成することができる。生成物はしばしば反応媒質中に不溶性であるので、単純な濾過により単離することができる。
構造（Ｉ）を有するヒドロキシルアミン誘導体に属する更に別の新規化合物群は、Ｚが化学結合であり；Ａがアラルキル、置換されたアラルキル、好ましくは１もしくは複数のアルコキシを有することがあるフェニルアルキル、好ましくは１〜４個の炭素原子を含むアルコキシを有することがあるフェニルアルキル、フェニル、１もしくは複数の置換基を有する置換されたフェニル（好ましい置換基としては、アルキル、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルキルまたはハロアルキル、ハロ、アシルアミノまたはニトロ基が挙げられる）、ベンゼン環と縮合されてもよいＮ−含有ヘテロアリール基、好ましくはピロリル、ピリジル、イソキノリルもしくはキノリル、または硫黄含有複素環式芳香族基、好ましくはチエニルであり、ここでヘテロアリール基は１または複数のアルキルにより、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルキルにより、置換されてもよく；Ｘが−ＮＲ1Ｒ2であり、ここでＲ1とＲ2は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくは１〜６個の炭素原子を有するアルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ1とＲ2がそれに隣接した窒素原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成してもよく；Ｒが式（e）の基であり、ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6がそれに隣接した窒素原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、前記飽和複素環は追加のヘテロ原子および置換基を含んでもよく、前記置換基は好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルキルであり；Ｙ4がＨまたは１〜４個の炭素原子を有するアルキルもしくは置換されたアルキルであり；Ｙ5がＨ、１〜４個の炭素原子を有するアルキルもしくは置換されたアルキル、またはＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシルであり；ｋが１，２または３であり；そしてｍが１，２または３であり、ただし
Ａが非置換のフェニル；ハロゲンもしくはアルコキシにより置換されたフェニル；アルコキシにより置換されたフェニルアルキル；またはピリジル基であり、そしてＲ7がＨである時、Ｒ1およびＲ2のうちの少なくとも一方がＨ以外のものであり、または
Ａが非置換のフェニル；ハロゲンもしくはアルコキシにより置換されたフェニル；アルコキシにより置換されたフェニルアルキル；またはピリジル基であり、そしてＲ1とＲ2が各々Ｈである時、Ｒ7がＨ以外のものである
ことを条件とする化合物である。
ＸがNH2誘導体である化合物は、上述した手順と同様にして、構造１のＲ1とＲ2がＨである構造１を有する対応する中間体を、構造２を有する化合物と反応させることにより調製される。アルキル化剤（構造２を有する）はヒドロキシルおよび／またはアミノ置換基を含んでもよい。この反応は無機または有機塩基の存在を必要し、好ましい方法では溶媒および塩基としてアルコール性アルコラート溶液が使われる。生成物はしばしば適当な有機または無機酸との塩の形で単離される。
上記の新規化合物の別の群はＲ1とＲ2により特徴づけられ、それらの誘導体ではＲ1とＲ2の一方または両方がＨ以外のものである。そのような構造は次の２つの方法で調製することができる。
（i）必要な置換基Ｒ1および／またはＲ2を既に含む構造１を有するアミドオキシムを、前の段落で記載した手順と同様に、構造２の反応性化合物と反応させることができる。出発物質として使われ構造１の置換型アミドオキシムは文献から既知である〔Chem.Rev.62,155-183（1962）〕。
（ii）Ｚが共有結合でありそしてＸがハロゲンである構造（Ｉ）を有する化合物中のハロゲン原子の構造５のアミンによる置換もまた同様な化合物をもたらし得る。Ｒ基中にＯＨ置換基を有する誘導体（Ｙ4＝ＯＨ）の場合、構造（Ｉ’）の環状誘導体の形成が望ましい場合とは違って、このヒドロキシル基を置換反応の前に保護し、そして置換反応の後で脱保護しなければならない。保護には、アセチル型保護基、例えばテトラヒドロピラニル基が最も好結果であることがわかった。保護は、未保護の化合物とジヒドロピランとの反応に次いで、通常は溶媒（例えばアルコール）中での還流を必要とするハロゲン／アミン置換により行われる。生成物の脱保護は、最後に、酸処理、例えばｐ−トルエンスルホン酸の存在下でエタノール性溶液を煮沸することにより達成することができる。
上述したように、新規化合物の群はＹ5がアシルオキシ基であるものも包含する。それらは、文献（例えばハンガリー国特許第177578号）から既知であるかまたは本発明に記載される対応するＹ5＝ＯＨ誘導体のアシル化により調製することができる。この反応は、Ｒ7がアシル基である類似のハロ誘導体について記載したのと同様に（方法（iii））行うことができる。
式（Ｉ）の新規ヒドロキシルアミン誘導体は、Ｚが酸素または＝ＮＲ3基であり、ここでＲ3は非置換のまたは置換されたアルキル基であり；Ｘが−ＮＲ1Ｒ2であり、ここでＲ1とＲ2は互いに独立に、水素、非置換のまたは置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、非置換のまたは置換されたアリール、好ましくはフェニル、非置換のまたは置換されたアラルキル基であり、あるいはＲＲ1とＲ2がそれに隣接した窒素原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の、１または複数のヘテロ原子を含むことがある飽和複素環を形成するものを包含する。それらの化合物中、Ａは非置換のもしくは置換されたアルキル、非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニルもしくは置換されたフェニル基、または非置換のもしくは置換されたアラルキル基であり、そしてＲは式（b）の基であり、ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6がそれに隣接したＮ原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6はＨまたは−ＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシル、好ましくは非置換のもしくは置換されたアルキルカルボニルもしくはアリールカルボニルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である。
Ｚが酸素でありそしてＸが−ＯＲであり、ここでＱは非置換のもしくは置換されたアルキル、または非置換のもしくは置換されたアラルキル基であり、Ａが非置換のもしくは置換されたアルコキシ基、または非置換のもしくは置換されたアラルキル基であり、そしてＲが式（b）の基であり、ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6がそれに隣接したＮ原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6はＨまたは−ＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシル、好ましくは非置換のまたは置換されたアルキルカルボニルもしくはアリールカルボニルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である、新規ヒドロキシルアミン誘導体も式（Ｉ）の化合物の範囲内に含まれる。
Ｒ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6がそれに隣接したＮ原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6はＨまたは−ＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシル、好ましくは非置換のまたは置換されたアルキルカルボニルもしくはアリールカルボニルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である。
式（Ｉ）の新規ヒドロキシルアミン誘導体の別の群は、Ａが非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニル、Ｎ−含有複素環式芳香族基、好ましくはピリジル、またはＳ−含有複素環式芳香族基であり、Ｚが化学結合であり、Ｘが−ＯＱであり、ここでＱはＣ1-4アルキルであり、そしてＲが式（b）の基であり、式中Ｒ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6がＨであり、ｋが１，２または３であり、そしてｍが１，２または３であるものにより表される。
それらの化合物は、Ｘがハロである式（Ｉ）の対応するヒドロキシルアミン誘導体と対応するアルコラートとの反応により、好ましくは該アルコラートに対応するアルコール中で、好ましくは還流させることにより調製される。当業界で既知の方法で反応混合物が処理されそしてクロマトグラフィーまたは塩形成により生成物が単離される。
式（II）の新規ヒドロキシルアミン誘導体は、Ｘが酸素であり、ＡがＣ1-20直鎖もしくは枝分かれアルキル、非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニルもしくはハロフェニル、非置換のもしくは置換されたアラルキル、ナフチル、またはＮ−含有複素環式芳香族基、好ましくはピリジルであり、Ｚが化学結合であり、Ｒ’がＨ、Ｃ1-4アルキルまたはアラルキル、好ましくはフェニルアルキルであり、Ｒが式（b）の基であり、式中Ｒ5とＲ6は互いに独立にＨ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6がそれに隣接したＮ原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6がＨまたは−ＯＲ7であり、Ｒ7がＨであり、ｋが１，２または３であり、そしてｍが１，２または３であり、ただしＡがアルキル以外のものでありそしてＲ’がＨである時、Ｙ6がＨであることを条件とする化合物の群も包含する。
Ｚが共有結合、酸素または＝ＮＲ3基であり、ここでＲ3は水素または非置換のもしくは置換されたアルキル基であり、Ｘが＝ＮＲ4であり、ここでＲ4が水素、非置換のもしくは置換されたアルキル、非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニル基、または非置換のもしくは置換されたアラルキル、好ましくはフェニルアルキルである新規化合物も、式（II）の化合物の範囲内に含まれる。それらの化合物では、Ａは非置換のもしくは置換されたアルキル、非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニルもしくは置換されたフェニル、非置換のもしくは置換されたアラルキル、好ましくはフェニルアルキル、またはシクロアルキルであり、Ｒ’は非置換のもしくは置換されたアルキル、非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニル、または非置換のもしくは置換されたアラルキル、好ましくはフェニルアルキルであり、Ｒは式（b）の基であり、ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6がＨまたは−ＯＲ7であり、Ｒ7はＨまたはアシル、好ましくは非置換のまたは置換されたアルキルカルボニルもしくはアリールカルボニルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である。
Ｘが酸素であり、Ａが非置換のもしくは置換されたアルキル、非置換のもしくは置換されたアラルキル、好ましくはフェニルアルキルであり、Ｚが酸素であり、Ｒ’がアルキルまたはアラルキル、好ましくはフェニルアルキルであり、Ｒが式（b）の基であり、ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の複素環を形成し、Ｙ6がＨまたは−ＯＲ7であり、Ｒ7がＨまたはアシル、好ましくは非置換のもしくは置換されたアルキルカルボニルもしくはアリールカルボニルであり、ｋが１，２または３であり、そしてｍが１，２または３である式IIの化合物も新規ヒドロキシルアミン誘導体である。
Ｘが酸素でありそしてＺが＝ＮＨである式（II）のヒドロキシルアミン化合物も新規化合物である。
それらの化合物の１つの群は、Ａが非置換のもしくは置換されたアルキル、シクロアルキル、非置換のもしくは置換されたアラルキル、好ましくはフェニルアルキル、非置換のフェニルまたはハロにより、アルキルにより、ハロアルキルにより、アルコキシによりもしくはニトロにより置換されたフェニルであり、Ｒが式（b）の基であり、ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の複素環を形成し、Ｙ6がＨまたは−ＯＨであり、ｋが１，２または３であり、そしてｍが１，２または３であるものにより構成される。
それらの化合物の別の群は、Ａが式（a）の基であり、ここでＹ1はハロアルキル、好ましくはトリフルオロメチルでありそしてｎは１，２または３であり、Ｒ’がＨであり、Ｒが式（b）の基であり、ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって、３〜７員の、好ましくは５〜７員の複素環を形成し、Ｙ6がＨまたは−ＯＨであり、ｋが１，２または３であり、そしてｍが１，２または３であるものにより構成される。
本発明の新規ヒドロキシルアミン誘導体は、Ａが非置換のフェニル、ハロによりもしくはニトロにより置換されたフェニル、またはＮ含有ヘテロアリールであり、Ｒ1がＨであり、そしてＲ”がアミノ基上で単置換もしくは二置換されたω−アミノアルキル基であって、それのアルキル鎖が１〜５個の炭素原子を有しそしてアミノ置換基が互いに独立に１個または２個の直鎖もしくは枝分かれアルキルまたはシクロアルキルであることができ、あるいは２個のアミノ置換基がそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、またはそれのＣ1-4アルキルＮ−第四級誘導体であり、ただしＡが３−ピリジルである時、Ｒ”が１−ピペリジニルメチルではないことを条件とする。
4.2 細胞中の分子シャペロン発現を増加させる方法
本発明は、細胞および組織を有効量のヒドロキシルアミン誘導体で処理することにより、細胞中の分子シャペロンの発現を増強する方法に関する。互変異性体形が式（Ｉ）または（II）により表されるヒドロキシルアミン誘導体をこの方法に使うことができる。式（Ｉ）および（II）の構造は項目4.1において詳細に記載されている。
本発明の１つの非限定的態様では、ストレスに暴露された細胞において分子シャペロン発現を増加させる方法に関する。この方法では、細胞による分子シャペロンの発現を誘導する生理的ストレスに暴露された細胞を、ストレスの発生後に、互変異性体形が式（Ｉ）または（II）により表されるヒドロキシルアミン誘導体の有効量で処理する。ヒドロキシルアミン誘導体は、生理的ストレスにより誘導される量より大きくそれらの細胞中の分子シャペロンの発現を増加させる。
本発明の別の非限定的態様では、細胞が生理的ストレスに暴露される前にそれらの細胞をヒドロキシルアミン誘導体で処理する。該ヒドロキシルアミン誘導体は生理的ストレスにより誘導される量より大きく分子シャペロン発現を増大させる。
「分子シャペロン」という用語は、本明細書中で用いる時、通常は別のタンパク質への非共有結合により、その別のタンパク質が正しいまたは活性なコンホメーションに折り畳まれるのを助けるタンパク質を指して言う。シャペロンは新しく合成されたタンパク質の補正および再生を助けるだけでなく、変性されてしまったまたは間違って折り畳まれてしまったものの補正および再生も助ける。分子シャペロンとしては、特に、熱ショックタンパク質（hsp）（そのうちhsp70およびhsp72が本発明に関連して特に重要である）、並びにIgG重鎖結合タンパク質（BiP）、およびグルコース調節タンパク質（grp）が挙げられる。hspおよびgrpの例としては、次のクラスに属するものが挙げられるが、それらに限定されない：hsp70,hsp60,hsp90,grp94,grp80およびhsp27。
好ましくは、ヒドロキシルアミン誘導体で処理される真核細胞は哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞である。「真核細胞」という用語は、試験管内にある細胞（生物体の外側にある細胞、例えば培養状態にある細胞）と生体内にある細胞（生物体の内側にある細胞、例えば組織および器官を含む細胞）の両方の真核細胞を指して言う。
生物体の真核細胞から、好ましくは神経細胞、筋細胞、血管壁細胞、特に内皮細胞、上皮細胞および免疫系の細胞を本発明の方法に従って処理することができる。好ましくは植物細胞（生存している植物体の細胞を含む）も本発明に従って処理することができる。
本明細書中で用いる時、「生理的ストレス」という用語は、細胞の「ストレス応答」を誘導するであろう、例えばシャペロンタンパク質合成を誘導するであろう、細胞に影響を及ぼす条件または要因と理解すべきである。生理的ストレスとしては、細胞に損傷を引き起こす要因または細胞の恒常性バランスを破壊する要因が挙げられる。それらは例えば、代謝ストレス、酸化ストレス、局部の機械的ストレス、または低酸素、虚血、熱ショック、放射線もしくは毒性物質により引き起こされるストレスである。代謝ストレスの最も重要な形態は糖尿病により引き起こされる。
生理的ストレスの別の重要な出現形態としては、細胞の環境中にラジカルの形成またはサイトカインの量の増加をもたらすものが挙げられる。様々な病的状態に関連づけられる細胞の損傷は生理的ストレスの一例である。
本発明の或る非限定的態様では、細胞が生理的ストレスに対する応答として分子シャペロンを発現するように誘導する生理的ストレスは、心臓血管疾患、血管疾患、脳疾患、アレルギー疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、ウイルスおよび細菌感染、皮膚および粘膜の疾病または上皮起源の腎小管の疾患に至るか、あるいは化粧品の介在により処置すべきである状態を引き起こすものである。
そのような心臓血管疾患としては、最も好ましくは生理的ストレスにより引き起こされるアテローム動脈硬化症、冠状動脈疾患、または緊張亢進もしくは肺動脈の緊張亢進により引き起こされる心臓血管疾患が挙げられる。
特徴的な脳疾患は、特に、生理的ストレスにより引き起こされる脳血管の虚血、発作、外傷性頭部損傷、老人性神経変性病、特に老人性痴呆、AIDS痴呆、アルコール性痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病または癲癇により引き起こされるものである。
皮膚および粘膜の疾患により引き起こされる特徴的な疾病は、皮膚病または胃腸系の潰瘍性疾患である。
上記疾病の間、生理的ストレスが細胞中のシャペロン発現を誘導するけれども、この作用は疾病により引き起こされる細胞傷害に対して保護するほど十分ではない。シャペロン発現の増強またはシャペロン活性の増加に関係する上記ヒドロキシルアミン誘導体での処理は、前記疾病により引き起こされる構造的偏移（structural deviation）の排除を可能にし、かくして細胞の再生を可能にする。
本発明の１つの非限定的例では、生理的ストレスが熱ショックまたは異常に高い温度への細胞の暴露である。本発明の別の非限定的例では、生理的ストレスが虚血に関連する細胞損傷である。細胞、特に心筋細胞および脳細胞の虚血性病変は、血管閉塞または狂喜（rapture）により引き起こされる心臓血管障害、例えば冠状動脈血栓症もしくは脳血栓症または血管閉塞、発作、塞栓症、または慢性血管痙攣により発生する。虚血は細胞に「ストレス応答」を誘導し、それがhsp量の増加を引き起こし、それが引いては虚血の有害作用に対して細胞を保護する〔Mestril,R.他,J.Mol.Cell Cardiol.27:45（1995）〕。
有効量のヒドロキシルアミン誘導体でそれらの細胞を処理することにより、細胞中の分子シャペロン発現を虚血状態により誘導される量よりも大きく増加させることができ、その上分子シャペロンの活性も増強することができる。
この点について、臓器を移植用に動物から切除する時、そのような切除は、該臓器を含む細胞に損傷を引き起こし、シャペロン発現を誘導する生理的ストレスである。そういった場合、臓器の切除の前または後でのヒドロキシルアミン誘導体の投与は、該臓器の細胞により生産されるシャペロンの量またはそれの活性を増加させることができ、かくして細胞保護効果を与えることができる。
虚血の他に神経細胞の損傷も、神経細胞中の分子シャペロンの生産を誘導する他の多くのストレスによって引き起こされ得る。加えて、毒性促進性（excitotoxic）の神経細胞損傷も神経細胞による分子シャペロンの生産を誘導するので、これは「生理的ストレス」という用語の中に含まれる。
本発明の更に別の例では、生理的ストレスは、マクロファージにより生産される炎症の毒性メディエーター、例えば酸化基およびサイトカイン、例えばＴＮＦにより与えられる。増加した量のそれらの毒性メディエーターに暴露された細胞は、増加した量のhspを発現し、それが毒性に対する細胞の保護を提供することが示されている〔Kantengwa,S.他,Semin.Immun.3:49-56（1991）〕。肺炎状態を含む様々な炎症性疾患、例えば成人呼吸促進症候群は、細胞によるhspの発現を誘導し、それが細胞保護効果を与える〔Jacquier-Salin,M.R.他,Experientia 50:1031-1038（1994）〕。細胞中の分子シャペロンの量がＴＮＦや反応性酸素種により誘導されるものより大きく増加されると、それらの細胞毒性因子に対して細胞をもっと良く保護することができ、且つそれらにより引き起こされる損傷をより一層修復することができる。
細胞膜の生理的状態（細胞膜流動率を含む）に影響を与える要因も生理的ストレスの一例である。細胞膜の生理的状態の妨害により誘導されるものを越えた細胞中の分子シャペロン発現の増加は、より良好な保護を提供し且つ細胞に細胞膜を修復させることが可能である。
生理的ストレス下にある細胞、または後で生理的ストレスに暴露されるだろう細胞中の分子シャペロン生産を増強することに関連して本明細書中で使う時、「有効量のヒドロキシルアミン誘導体」という言い方は、生理的ストレスだけにより誘導されるレベルより上に分子シャペロンの発現を増加するだろう量を意味する。そのような量は当業者により容易に決定することができる。好ましくは、試験管内の細胞については、有効量は10-6〜10-3Ｍである。より好ましくは、有効量は10-6〜5×10-4Ｍである。
動物に投与する時、有効量は投与の形式といった様々な要因に依存して異なるが、有効範囲の決定は当業者の技術の範囲内であり、過度な実験は必要ないであろう。例えば、ヒドロキシルアミン誘導体を静脈内に投与する時、有効量は好ましくは0.1〜10mg／kgbw（キログラム体重）、より好ましくは0.5〜2.0mg／kgbwであり；そして経口投与する時、有効量は好ましくは10〜500mg／kgbw、より好ましくは50〜100mg／kgbwである。
細胞中の分子シャペロン発現の増加は、ノーザンまたはウエスタンブロット法のような十分確立された実験技術を使って検出することができる。
使用することができるウエスタンブロット技術の例を以下に述べる：細胞を10％ウシ胎児血清（GIBCO）が補足されたダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中で５％CO2中で37℃にて試験管内培養する。互変異性体形が式（Ｉ）と（II）により表されるヒドロキシルアミン誘導体を細胞培養物に添加することができ、例えば、生理的ストレスの16時間前に、または生理的ストレス後の一定の時間の後で、細胞に10-5Ｍの化合物を投与する。しかしながら、ヒドロキシルアミン誘導体の濃度、並びにその化合物の投与の時期は、実験計画に望ましいように変えることができる。
熱ショックの６時間後、細胞をリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、次いでＰＢＳの入った培養皿の表面から擦り落とす。次いで細胞を1500rpmで５分間回転させ、50mM Tris-HCl,pH8.0;5mM EDTA;150mM NaCl;15 Triton X-100;1 PMSF；2μg/mlのアプロチニン；1μg/mlのキモスタチン；1μg/mlのペプスタチンを含有する改良された可溶化緩衝液〔Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Sambrook,Fritsche,Maniatis編,Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）〕100μｌ中に取り、そして３×20秒間（２分おき、設定８）超音波処理する。
次いで３系列におけるBradfordアッセイ〔M.M.Bradford,Anal.Biochem.,72:248-254（1976）〕により５μｌ試料からタンパク質濃度を測定する。試料中の緩衝液の成分の最終濃度が110mM Tris-HCl pH6.8,8.3mMメルカプトエターノル，３％ＳＤＳ，３％グリセロールおよび少量のブロモフェノールブルーとなるように、試料を上記緩衝液と次の緩衝液で試料を100μg/30μｌのタンパク質濃度に調整し、そして室温で30分間振盪する。こうして得られた試料をゲル電気泳動に使うことができる。
本発明のヒドロキシルアミン誘導体のシャペロン増強効果を生体内の細胞について調べる時、生理的ストレス、例えば虚血またはSTZ誘発糖尿病が動物に適用される。虚血の場合、心筋虚血は実施例８に記載のようにして動物中に誘導することができ、そして糖尿病状態は実施例10に記載のようにして誘導することができる。本発明のヒドロキシルアミン誘導体は生理的ストレスに暴露される前に、ストレスの最中にまたは後で動物に投与することができる。上述したように、投与の時期は実験計画に従って変えることができる。
こうして処理された動物から得られた関連組織からのタンパク質調製の次の段階は０〜４℃で行う。組織、例えば肝臓組織（約15〜20g）を国産のミキサー中で、50mM Tris-HCl pH8.0,5mM EDTA,150mM NaCl,0.1% SDS,1% Triton X-100および1.1mMプロテアーゼ阻害剤（PMSF、ベンズアミジン、アミノカプロン酸）を含有する80mlの溶解緩衝液中で２分間ホモジナイズする。次いでホモジネートをSorvall RC 28S遠心機中で20000×gで30分間遠心する。
調製物のタンパク質濃度をBradfordアッセイにより決定し、５mg／mlに調整する。1.8mgのタンパク質を含む試料をゲル電気泳動の前に110mM Tris-HCl,pH6.8,8.3mMメルカプトエタノール，３％ＳＤＳ，３％グリセロールおよび幾らかのブロモフェノールブルーを含む緩衝液0.6mlで可溶化し、室温で30分間振盪する。
細胞培養物からまたは動物組織から得られたタンパク質試料（両者は上記に記載）を電気泳動とその後の免疫ブロッティングに使用する〔両技術は当業界で公知であり、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Sambrook,Fritsche,Maniatis編,Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）;Protein Blotting Protocols for the Immunobilon-P Transfer Membrane,3.Laboratory Manual,Millipore;およびU.K.Laemmli,Nature:227:680-685（1970）中に詳細に記載されている〕。
例えば、電気泳動はLaemmli（U.K.Laemmli,Nature,227:680-685（1970））に従って８〜18％ポリアクリルアミドゲル上で定電圧50Vで一晩実施することができる。タンパク質をクーマシーブリリアントブルーR-250で染色するか、または移行緩衝液（10mM CAPS,pH11,10％メタノール）中で定電流（300mA）で４℃で３時間Immobilon PVDF（Millipore）に移行させる（Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane,3,Laboratory Manual,Millipore）。移行後、膜の非特異的結合をTPBS（0.1％Tween 20を含むリン酸塩緩衝化塩溶液）中で４℃にて一晩２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。次いでブロットを分子シャペロンに対して向けられた抗体、例えば1:3000希釈したGRP94モノクローナル抗体（SPA-850,StressGen）と共に、1:2700希釈したHSP60モノクローナル抗体（SPA-600,StressGen）と共に、1:1250希釈したHSP72モノクローナル抗体（C92F34-5,StressGen）と共に、または1:2000希釈したHSP90モノクローナル抗体（AC88,StressGen）と共に室温で１時間インキュベートすることができる。次いで膜をTPBS緩衝液で１時間洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合抗ラット（Sigma、1:4000希釈、grp-94に）または抗マウス（Sigma、ヒトおよびラット血清タンパク質で吸着させたもの、1:3000希釈、HSP60,HSP72またはHSP90に）二次抗体と共にそれぞれ更に１時間インキュベートする。TPBSでの洗浄後、ＥＣＬ（増感化学発光）系（Amersham）を使って膜を発色させる。
ストレスタンパク質含量の変化はBio-Radデンシトメーター（1650型）とHewlett-Packard積分器（HP 3394A）を使って定量することができる。既知量のシャペロンを含むタンパク質溶液から希釈系列を調製し、希釈液を使って上記工程を繰り返し、そして希釈試料から得られた検量線から試験試料のシャペロン濃度を決定する。
ノーザンハイブリダイゼーションは、本発明のヒドロキシルアミン誘導体による分子シャペロンの増強レベルを測定するのに利用可能である別の実験方法である。細胞または組織はウエスタンブロット法に関連して記載したようにして得ることができる。製造業者の指示に従って（Protocols and Applications Guide,第２版,1991,Promega Corporation）RNAgents（Promega）を使って、それらの細胞および組織から全ＲＮＡを抽出することができる。凍結した組織試料（各々約50〜100mg）を1.0mlの変性緩衝液（４Ｍグアニジン−チオシアネート；42mMクエン酸ナトリウム；0.83Ｍβ−メルカプトエタノール；0.1％ Nonidet P-40）中で４℃でホモジナイズする（Brinkman-homogenization）。次いで1/10容の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH4.0）を加え、ホモジネートを10秒間渦動攪拌によって酸性フェノール（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール25:24:1）で抽出する。試料を氷上で15分間インキュベートし、次いで遠心する（４℃、20分、10,000×g）。次いで水相を新しいエッペンドルフ管に移し、前記工程を繰り返し、水相を同容量のイソプロパノールで−20℃にて一晩沈澱させる。遠心分離（４℃、20分、10,000×g）後、沈澱物を95％エタノールで洗浄し、室温で乾燥させる。得られたＲＮＡを20μｌのジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水に懸濁し、濃度を分光光度法により260-280nmで測定する。８μgの全ＲＮＡを毛管移動によりホルムアルデヒド−アガロースゲル上で泳動し、ゲル上のＲＮＡを製造業者の指示（Zeta-Probe GT,BioRad）に従ってナイロン膜上にブロットする。
個々の試料において、分子シャペロンmRNA含量を、試料中のグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子のmRNAレベルと比較する。ランダムプライムＤＮＡ標識キット（ＵＳＢ）を使って、cDNAプローブ（例えば、探査するmRNAがhsp70である時は全長ヒトhsp70 cDNA、およびラットGAPDH cDNAのApa-NcoI断片）をα−32P CTPで標識する。記載された通りに〔Ausubel他編、Current Protocols in Molecular Biology:JOHN WILEY & SONS,1987〕放射性標識ＤＮＡ断片をSephadex G-50（Pharmacia）カラム上で精製する。
予備ハイブリダイゼーションをＨ緩衝液（0.25M Na2HPO4,pH7.2,7% SDS）中で65℃にて15分間行う。少なくとも106cpm/mlの同位体標識cDNAプローブ濃度を使って一晩ハイブリダイゼーションを行う（65℃；Ｈ緩衝液）。次いで膜を20mM Na2HPO4,pH7.2,5% SDS中で洗浄し（65℃；２×15分）、オートラジオグラフィーにより評価する。hsp70 mRNAを探査するためにも同じ膜を使用し、そして内部標準としてGAPDH mRNA測定を使用する。
本発明は更に、生物中の病的状態を抑制するのに有効な量の、互変異性体形が構造（Ｉ）および（II）により表されるヒドロキシルアミン誘導体を投与することにより、様々な病的状態、即ちシャペロン系の機能と関連づけられる疾患並びに細胞および細胞小器官の膜の損傷を治療または予防するための方法を包含する。病的状態では、特徴的な分子シャペロン発現が細胞内に誘導される。それらの細胞において増加された分子シャペロン発現は、それらの細胞が病的状態により引き起こされる損傷を修復するのを助けることができ、また細胞の恒常性バランスを回復するのも助けることができる。
そのような病的状態としては、虚血、腫瘍性疾患、病原性微生物により引き起こされる感染、自己免疫疾患および皮膚病が挙げられる。
本明細書中で使う時、「治療する」とは、患者の臨床状態の改善を言うのであって、必ずしも完全な治癒が達成されることを指すとは限らない。改善は病気の存続期間もしくは病気の重さの減少、または患者の生活の質の主観的改善もしくは患者の長期生存を意味する。
治療のための本発明のヒドロキシルアミンの有効量は、上述のような臨床状態の改善をもたらすのに十分な量を指す。有効量は投与経路などの要因に依存するが、当業者により容易に決定することができる。本発明のヒドロキシルアミン誘導体は非経口的または経口的に、好ましくは経口的にまたは局所的に投与することができ、有効量は10〜500mg／kgbwである。より好ましくは、有効量は20〜100mg／kgbwである。
本発明の治療方法を使うことにより、心筋、脳組織および腎臓を虚血により引き起こされる組織の損傷または壊死に対して保護することができ、該方法は、長期虚血の有害作用を減少、防止または逆転させるのに有効な量の本発明のヒドロキシルアミン誘導体を患者に投与することを含んで成る。
本発明は、本明細書中に記載される病的状態の治療用の薬剤を製造するための、互変異性体形が式（Ｉ）および（II）により表されるヒドロキシルアミン誘導体の利用を包含する。
ヒドロキシルアミン誘導体の保護効果を測定するための方法では、ここに記載される通りに動物実験を使用する。まず、ラットをペントバルビタールナトリウム（Nembutal 60mg／kg体重、i.p.）で麻酔し、そして気管切開術により室内の空気で人工換気する（２ml／100g;54拍動／分）。次いで右頸動脈にカテーテル挿入し、それを予備増幅器（Hg-02,Experimetria）を経由して全身動脈圧（ＢＰ）の測定のために圧変換器（BRP-01,Stoelting）に接続する。本発明のヒドロキシルアミン誘導体はカニューレを経由して頸静脈に（i.v.）または経口的に（p.o.）投与する。カルジオタコメーター（HR-01,Experimetria）により心拍数（ＨＲ）を測定し；そして皮下スチール針電極を使って記録装置（MR-12,Medicor）上に心電図（ＥＣＧ標準誘導II）を記録する。左開胸術により胸部を切開し、次いで肋骨郭の右側に穏やかな圧力をかけることにより心臓を外面化する。Selye他（1960）により記載されたように主左冠状動脈の下に圧迫を適用する。心臓を注意深く胸部に戻し、動物を回復させる。直腸温度をモニタリングし、37℃で一定に維持する。実験プロトコールは15分間の安定化期間から開始する。この期間中に70mmHg未満の持続血圧または不整脈が観察されたら、その動物をその後の実験から外した。次いで５分間の冠状動脈閉塞により心筋虚血を誘導し、10分間再灌流させる。
全実験を通して、継続的に血圧（ＢＰ）、心拍数（ＨＲ）およびＥＫＧをマルチスクリプター（R61-6CH,Medicor）上に記録する。閉塞の５〜60分前にi.v.またはp.o.処理によりヒドロキシルアミン誘導体を投与する。ヒドロキシルアミン誘導体の用量は0.5,0.75,1.0mg／kg i.v.および100mg／kg体重p.o.であることができ、一方で比較物質ベプリジル（Bepridil）は1.0mg／kg i.v.の用量で投与する。再灌流の最初の３分間の間、心室頻拍（ＶＴ）および／または心室細動（ＶＦ）の平均持続時間を測定して分析する。
本発明は、生理的ストレスの結果として細胞膜流動率が影響を受ける時、細胞膜流動率を維持する方法も包含する。この方法は、細胞膜の流動率を回復させるのに有効な量のヒドロキシルアミン誘導体を使って、変化した膜流動率を有する細胞または細胞小器官を処理することを含んで成る。細胞膜流動率に対する本発明のヒドロキシルアミン誘導体の効果を測定するのに、実施例９（定常状態ＤＰＨ蛍光異方性）に関連して記載される実験プロトコールを用いることができる。
上述したように、本発明は細胞膜または細胞小器官膜に関連づけられる病的状態を治療する方法を包含する。そのような病的状態の一例は、真性糖尿病並びにミトコンドリアの損傷に関連がある疾病、例えばＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病（ＨＤ）、幾つかの心筋症、例えばアルコールもしくは重金属により引き起こされる毒性起源のもの、炎症もしくはウイルス性心筋症、または自己免疫心筋症、により提供される。互変異性体形が構造（Ｉ）および（II）により表されるヒドロキシルアミン誘導体を、この方法で使うことができる。
本発明の方法は腫瘍状疾患の治療にも利用でき、該方法は腫瘍の形成または成長を防ぐのに有効な量のヒドロキシルアミン誘導体を腫瘍生物に投与することを含んで成る。互変異性体形が構造（Ｉ）および（II）により表されるヒドロキシルアミン誘導体を、この方法で使うことができる。
4.3. ヒドロキシルアミン誘導体を含有する医薬および化粧品組成物
既に上述した通り、本発明は、生理的ストレスにより引き起こされる心臓血管疾患、血管疾患、アレルギー性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患、ウイルスもしくは細菌感染により引き起こされる疾病、腫瘍、皮膚または粘膜の疾患および腎小管疾患並びに化粧品の介在によって治療することができる生理的ストレスにより引き起こされるそれらの状態の治療に有用である医薬組成物（および場合により化粧品組成物）の調製における、一般式（Ｉ）および（II）のヒドロキシルアミン誘導体（それの光学活性立体異性体を含む）の利用であって、ここで式（Ｉ）および（II）またはそれの光学活性立体異性体を含むそれの塩において、
Ａはアルキル、置換されたアルキル、アラルキル、アリール成分および／またはアルキル成分において置換されたアラルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、または置換されたヘテロアリール基であり、
Ｚは共有結合、酸素または＝ＮＲ3であり、ここでＲ3は水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、並びにアリール成分および／またはアルキル成分において置換されたアラルキルから成る群より選ばれ、
Ｒはアルキルまたは置換されたアルキルであり、
式（Ｉ）の互変異性体中のＸはハロゲン、置換されたヒドロキシ、アミノ、単置換されたアミノ、または二置換されたアミノ基であり、
式（II）の互変異性体中のＸは酸素、イミノまたは置換されたイミノ基であり、そして
Ｒ’は水素、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アラルキル、アリール成分および／またはアルキル成分において置換されたアラルキル、アシルまたは置換されたアシル基であり、
そして式（Ｉ）の化合物はＸと反応性置換基とをカップリングすることにより形成された分子内環構造を含むことがある
ヒドロキシルアミン誘導体の利用に関する。
それらの化合物を使うことにより、予防目的と治療目的の両方の組成物を調製することができ、それをヒトまたは動物生体内に投与するかまたはその上に適用すると、上記疾病により引き起こされる細胞の損傷を予防または抑制することができ、かくして該生物の病的状態を軽減または除去することができる。
それらの組成物は化粧品組成物および医薬組成物の調製においてそれ自体既知である方法により、即ち活性成分と対応する担体および／または助剤とを混合することにより、調製することができる。組成物は通常0.5〜99.5重量％の活性化合物を含有する。組成物中の活性物質の量は、病気の性質や重さ、患者の年齢および治療形態により決定される。式（Ｉ）および（II）のヒドロキシルアミン誘導体は経口的におよび非経口的に並びに局所的に使うことのできる組成物に製剤化することができる。
活性化合物の日用量は約10〜500mg／kg、好ましくは20〜100mg／kgであり、該用量は特に経口用組成物の場合は２〜３回の投与に分割される。
経口投与のためには、組成物は糖剤、粒剤、所望であれば溶液または懸濁液に製剤化される。非経口用組成物としては水性溶液または無菌注射液が挙げられ、一方で直腸投与形態は特に坐剤であり、そして局所投与形態としては軟膏、クリーム、乳液およびゲルが挙げられる。
錠剤を調製するためには、活性成分を適当な担体、例えばデンプン、ゼラチン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガムおよびシリカゲルと混合し、混合物を造粒し、そして錠剤に圧縮する。
糖剤の調製では、活性成分と助剤から上記と同様な混合物を調製し、該混合物を造粒し、粒剤をコアに圧縮し、そのコアを次いで例えば糖含有水性ポリビニルピロリドン溶液を使って糖コーティングする。
カプセル剤形を調製するためには、活性成分をデンプン、タルク、シリカ、微結晶セルロースのような助剤と混合し、そして混合物を硬または軟ゼラチンカプセル中に充填する。
これらの経口組成物を吸収促進性または遅延性添加剤で仕上げてもよい。
シロップ剤またはエリキシル剤またはドロップ剤は、活性成分の他に、甘味剤、メチル−もしくはプロピル−パラベン、および所望により矯味添加剤を使って、活性成分の水溶液をそれらと混合することにより、調製することができる。
直腸投与用には、適当な助剤、例えばココア脂またはポリエチレングリコールを使って坐剤を調製することができる。
非経口投与に適当な組成物は、活性成分を無菌の等張食塩溶液中に溶解させることにより調製された注射剤、または適当な分散剤および湿潤剤、例えばプロピレングリコールもしくはブチレングリコールを使うことによって調製することができる水性懸濁液であることができる。
局所用のクリームおよび軟膏は、第一級または第二級アルコール、例えばセチルアルコール、ステアリルアルコール、グリセリン、天然脂肪および油脂、例えばオリーブ油、小麦胚芽油、ラノリン、長鎖炭化水素、例えばワセリン、並びにセルロース誘導体を使うことによって調製することができる。それらの組成物は更に保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルを含んでもよい。
化粧品または薬用化粧品として使われる組成物も同様にして調製することができる。好ましくは、親油性成分を混合し、そして水溶性成分を水に分散させる（所望によりわずかに温めながら）。所望であれば、後者のｐＨを適当な値に調整し、こうして得られた乳液を冷えるまで攪拌する。こうして水溶液の形で得られた混合物に活性成分を添加する。
本明細書の4.1において詳細に記載した新規ヒドロキシルアミン誘導体を含む医薬および化粧品組成物は、同様に上記方法に従って調製することができる。それらの組成物は本発明の１つの目的を構成する。
本発明に係る医薬および化粧品組成物の一態様は、そのような組成物において一般に使われる担体および助剤と一緒に0.5〜99.5重量％の量で式（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体を含有し、式中、
ａ）Ｘはハロ、好ましくはクロロまたはブロモであり、
Ｚは化学結合であり、そして
a1）Ａは式（a）の基（ここでＹ1はハロ、アルコキシ、ハロアルキルまたはニトロであり、そしてｎは１，２または３である）、またはＯ−含有ヘテロアリール基、好ましくはフリル、Ｓ−含有ヘテロアリール基、好ましくはチエニル、または任意にベンゼン環と縮合したＮ−含有複素環式芳香族基、またはそれのＮ−Ｃ1-4アルキル第四級誘導体もしくはＮ−オキシド、好ましくはピリジル、キノリルもしくはイソキノリルであり、
Ｒは式（b）の基（ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキルまたはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、そしてＹ6は−ＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシル、好ましくは非置換のもしくは置換されたアルキルカルボニル、アリールカルボニルもしくはアミノアシルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）またはそれのＮ−Ｃ1-4アルキル第四級誘導体もしくはＮ−オキシドであり、ただしＡがピリジルもしくはナフチル、またはＹ1がハロもしくはアルコキシである式（a）の基である時、Ｒ7はＨ以外のものであることを条件とし、または
a2）Ａは式（c）の基であり、
Ｒは式（d）の基（ここで少なくとも１つが分子中に存在しなければならない任意置換基Ｙ2とＹ3は酸素またはＣ1-4アルキルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）であり、そして化合物が一価または二価カチオンである時、アニオンは１個または２個のハロゲン化物イオン、好ましくはヨウ化物イオンであり、あるいは
ｂ）Ｘは−ＮＲ1Ｒ2であり、ここでＲ1とＲ2は互いに独立にＨ、非置換のもしくは置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニル、または非置換のもしくは置換されたアラルキルであるか、あるいはＲ1とＲ2はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の複素環を形成し、複素環は１または複数の追加のヘテロ原子を含んでもよく、
Ａは非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニル、または非置換のもしくは置換されたアラルキルであり、
Ｚは酸素または＝ＮＲ3であり、ここでＲ3はＨまたは非置換のもしくは置換されたアルキルであり、そして
Ｒは式（b）の基（ここでＲ5とＲ6は互いに独立にＨ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキルまたはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6はＨまたは−ＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシル、好ましくは非置換のもしくは置換されたアルキルカルボニルもしくはアリールカルボニルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）であり、あるいは
ｃ）Ｘは−ＯＱであり、ここでＱは非置換のまたは置換されたアルキルまたはアラルキルであり、
Ｚは酸素であり、そして
Ｒは式（b）の基（ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキルまたはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、そしてＹ6はＨまたは−ＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシル、好ましくは非置換のまたは置換されたアルキルカルボニル、アリールカルボニルまたはアミノアシルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）であり、あるいは
ｄ）Ａは非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニル、Ｎ含有複素環式芳香族基、好ましくはピリジル、またはＳ含有複素環式芳香族基であり、
Ｚは化学結合であり、
Ｘは−ＯＱであり、ここでＱはＣ1-4アルキルであり、そして
Ｒは式（b）の基（ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキルまたはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6はＨであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）である。
本発明の医薬および化粧品組成物の別の群は、医薬上および化粧品上許容される担体および／または助剤と一緒に、約0.5〜99.5重量％の量で式（Ｉ）のヒドロキシルアミン誘導体またはそれの塩および／またはそれの光学活性立体異性体を含有するものを包含し、ここで
Ｘは−ＮＲ1Ｒ2であり、ここでＲ1とＲ2は互いに独立に、Ｈ、非置換のもしくは置換された直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-6アルキルまたはシクロアルキルであるか、あるいはＲ1とＲ2はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、
Ａは非置換のまたは置換されたアラルキル、好ましくは１もしくは複数のアルコキシにより、好ましくはＣ1-4アルコキシにより置換されたフェニルアルキル、非置換のフェニルまたは１もしくは複数のハロにより、アルキルにより、ハロアルキルにより、アシルアミノによりもしくはニトロにより置換されたフェニル、場合によりベンゼン環と縮合することがある非置換のもしくは置換されたＮ含有複素環式芳香族基、またはＳ含有ヘテロアリール基（ヘテロアリール基は１または複数の置換基、好ましくは１または複数のアルキル基、好ましくはＣ1-4アルキル基を有してもよい）、好ましくはチエニルであり、
Ｚは化学結合であり、そして
Ｒは式（e）の基（ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキルまたはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、前記複素環は追加のヘテロ原子を含んでもよくそして１または複数の置換基、好ましくはＣ1-4アルキル基を含んでもよく、Ｙ4はＨまたは非置換のもしくは置換されたＣ1-4アルキルであり、Ｙ5はＨ、非置換のもしくは置換されたＣ1-4アルキルまたは−ＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）であり、
ただしＡが非置換のフェニル、ハロによりもしくはアルコキシにより置換されたフェニル、アルコキシにより置換されたフェニルアルキル、またはピリジル基でありそしてＲ7がＨである時、Ｒ1およびＲ2の少なくとも一方がＨ以外のものであることを条件とし、そして
Ａが非置換のフェニル、ハロによりもしくはアルコキシにより置換されたフェニル、アルコキシにより置換されたフェニルアルキル、またはピリジル基でありそしてＲ1とＲ2が両方ともＨである時、Ｒ7がＨ以外のものであることを条件とする。
本発明の医薬および化粧品組成物の別の群は、医薬上および化粧品上許容される担体および／または助剤と一緒に、約0.5〜99.5重量％の量で式（II）のヒドロキシルアミン誘導体またはそれの塩および／またはそれの光学活性立体異性体を含有するものを包含し、ここで
ａ）Ｘは酸素であり、
ＡはＣ1-20直鎖もしくは枝分かれアルキル、不飽和もしくは飽和アリール、好ましくはフェニルもしくはハロアルキル−フェニル、非置換のもしくは置換されたアラルキル、ナフチルまたはＮ含有複素環式芳香族基、好ましくはピリジルであり、
Ｚは化学結合であり、
Ｒ’はＨ、Ｃ1-4アルキルまたはアラルキル、好ましくはフェニルアルキルであり、そして
Ｒは式（b）の基（ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキルまたはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6はＨまたは−ＯＲ7であり、Ｒ7はＨであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）であり、
ただしＡがアルキル以外の基であり且つＲ’がＨである時、Ｙ6がＨであることを条件とし、あるいは
ｂ）Ｘは＝ＮＲ4であり、ここでＲ4はＨ、非置換のもしくは置換されたアルキル、非置換のもしくは置換されたアリール、フェニル、または非置換のもしくは置換されたアラルキル、好ましくはフェニルアルキルであり、
Ａは非置換のもしくは置換されたアルキル、非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニルもしくは置換されたフェニルニル、非置換のもしくは置換されたアラルキル、好ましくはフェニルアルキル、またはシクロアルキルであり、
Ｚは化学結合、酸素または＝ＮＲ3であり、ここでＲ3はＨまたは非置換のもしくは置換されたアルキルであり、
Ｒ’は非置換のもしくは置換されたアルキル、非置換のもしくは置換されたアリール、好ましくはフェニル、または非置換のもしくは置換されたアラルキル、好ましくはフェニルアルキルであり、
Ｒは式（b）の基（ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキルまたはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6はＨまたは−ＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシル、好ましくは非置換のもしくは置換されたアルキルカルボニルもしくはアリールカルボニルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）であり、あるいは
ｃ）Ｘは酸素であり、
Ａは非置換のもしくは置換されたアルキル、非置換のもしくは置換されたアラルキル、好ましくはフェニルアルキルであり、
Ｚは酸素であり、
Ｒ’はアルキルまたはアラルキル、好ましくはフェニルアルキルであり、
Ｒは式（b）の基（ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキルまたはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6はＨまたは−ＯＲ7であり、ここでＲ7はＨまたはアシル、好ましくは非置換のもしくは置換されたアルキルカルボニルまたは非置換のもしくは置換されたアリールカルボニルであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）であり、あるいは
ｄ）Ｘは酸素であり、
Ｚは酸素であり、
d1）Ａは非置換のもしくは置換されたアルキル、シクロアルキル、非置換のもしくは置換されたアラルキル、好ましくはフェニルアルキル、非置換のフェニル、またはハロにより、ハロアルキルにより、アルコキシによりもしくはニトロにより置換されたフェニルであり、
Ｒ’はアルキルまたはアラルキル、好ましくはフェニルアルキルであり、そして
Ｒは式（b）の基（ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしくは枝分かれアルキル、好ましくはＣ1-4アルキルまたはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6はＨまたは−ＯＨであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）であり、または
d2）Ａは式（a）の基（ここでＹ1はハロアルキル、好ましくはトリフルオロメチルであり、そしてｎは１，２または３である）であり、
Ｒ’はＨであり、そして
Ｒは式（b）の基（ここでＲ5とＲ6は互いに独立に、Ｈ、直鎖もしもしくは置換されたアルキル、またはシクロアルキルであるか、あるいはＲ5とＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の飽和複素環を形成し、Ｙ6はＨまたは−ＯＨであり、ｋは１，２または３であり、そしてｍは１，２または３である）である。
本発明の医薬および化粧品組成物の別の群は、医薬上および化粧品上許容される担体および／または助剤と一緒に、約0.5〜99.5重量％の量で式（Ｉ”）のヒドロキシルアミン誘導体またはそれの塩および／または光学活性立体異性体を含有するものを包含し、ここで
Ａは非置換のフェニル、ハロによりもしくはニトロにより置換されたフェニル、またはＮ含有ヘテロアリール基、好ましくはピリジル基であり、
Ｒ1はＨであり、そして
Ｒ”は単置換もしくは二置換されることがあるω−アミノアルキル基であり、前記ω−アミノアルキル基のアルキル鎖が１〜 個の炭素原子を含み、そしてアミノ置換基が互いに独立に１個または２個の直鎖もしくは枝分かれアルキルまたはシクロアルキルであり、または２個のアミノ置換基がそれに隣接したＮ原子と一緒になって３〜７員の、好ましくは５〜７員の複素環またはそれのＮ−Ｃ1-4アルキル第四級誘導体を形成し、ただし
Ａがピリジルである時、Ｒ”が１−ピペリジニルメチル以外のものであることを条件とする。
本発明の態様を下記の実施例においてより詳細に説明する。しかしながら、保護範囲は実施例に言及される特定態様に限定されないと理解すべきである。
5. 化合物および組成物例
実施例１：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−２−チオフェンカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
5.0g（15.6ミリモル）のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−２−チオフェンカルボキシミドアミド一塩酸塩（実施例44）を19mlの水に溶かし、次いで6.1mlの濃塩酸を添加した。この溶液を−５℃に冷却し、次いで2.4mlの水に溶かした4.4g（63.8ミリモル）の亜硝酸ナトリウムの冷却溶液を滴下添加した。反応の最中、内部温度を０℃に維持した。添加が終了したら、混合物を更に１時間攪拌した。冷ベンゼン（60ml）を添加し、45mlの水の中の3.2g（80ミリモル）の水酸化ナトリウムの冷却溶液をゆっくり添加することにより混合物をアルカリ性にした。有機相を分離し、pH＜9になるまで20ml部分の水で連続して洗浄した（３〜５回）。有機溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、活性炭で処理し、濾過し、そして真空中で蒸発させて（ｔ＜45℃）2.6gのオイルを得た。この残渣を５mlのイソプロピルアルコール中に溶かし、そして乾燥塩酸を含むイソプロピルアルコールで酸性（pH2）にした。生成物をｎ−ヘキサンから結晶化してオフホワイト色物質を得た。
収率：2.0g（38％）
Mp：115-123℃
上記実施例に記載の方法に従って、下記の化合物を調製した：
実施例２：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−１−イソキノリンカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
出発物質：実施例46
収率：48％
Mp：168-172℃
IR（KBr）:3425,3128,2947,2866,2650,2540,1622,1597,1556,1452,1385,1364,1329,1296,1281,1240,1117,1092,1024,1015,978,953,903,881,795,743,718,658,559cm-1
実施例３：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−キノリンカルボキシミドイルクロリド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
出発物質：実施例42
この場合、アセトン中に粗製塩基を溶かし、当量のマレイン酸を加えることにより、後処理操作の最後に最終生成物を単離した。
収率：67％
Mp：159-162℃
IR（KBr）:3427,3019,2947,2886,2689,1583,1477,1450,1352,1293,1221,1194,1132,1072,1045,939,919,872,833,754,650,557cm-1
実施例４：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ニトロベンゼンカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
出発物質：実施例40
収率：58％
Mp：185-189℃
実施例５：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−４−ニトロベンゼンカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
出発物質：実施例43
収率：47％
Mp：180-182℃
IR（KBr）:3331,2953,2853,2735,2654,2577,2548,1605,1568,1516,1456,1348,1261,1165,1119,1072,1059,1007,960,933,862,849,754,719,690,673,627,581,550,478cm-1
実施例６：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−２−ニトロベンゼンカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
出発物質：実施例45
収率：50％
Mp：159-162℃
IR（KBr）:3298,2983,2932,2746,1593,1574,1535,1445,1391,1354,1317,1288,1242,1198,1117,1092,1069,1020,968,947,914,852,793,756,708,577cm-1
実施例７：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−２−フランカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
手順：
１−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロパン〔J.Org.Chem.33（2）p.523-30（1968）〕（3.0g，116.9ミリモル）を水（1.8ml）に溶かした。固体NaOH（1.19g，29.8ミリモル）を添加し、混合物を室温で１時間攪拌した。Ｎ−ヒドロキシ−２−フランカルボキシイミダミド（1.92g，15.2ミリモル）を加え、混合物を室温で一晩攪拌を続けた。濃HCl（2.1ml）を加えて約４にpHを調整し、溶液を真空中で蒸発乾固せしめた。
残渣（5.4g）を濃HCl（37ml）中に溶かし、０〜５℃に冷却し、NaNO2（5.6g，80ミリモル，23mlの水中）の水溶液を30分間で滴下添加した。次いで2N NaOH溶液（102ml）の添加により溶液をpH＝10にアルカリ性にし、酢酸エチル（２×130ml）で抽出した。合わせた有機相を水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、蒸発させた。残渣（2.0g）を少量の酢酸エチル（20ml）に再溶解し、イソプロパノール性HCl溶液（3.2Ｎ，３ml）の添加により生成物を沈殿させた。得られた白色沈殿を濾過し、洗浄し、最後にイソプロパノールから再結晶した。
収率：11％
Mp：139-141℃
IR（KBr）:3427,3267,3094,2955,2922,2964,2745,1637,1584,1479,1452,1391,1319,1281,1259,1157,1117,1074,1024,999,980,943,887,854,843,743,710,596cm-1
上記実施例に記載の方法に従って、下記の化合物を調製した：
実施例８：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−４−ピリジンカルボキシミドイルクロリド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
この場合、アセトン中に粗製塩基を溶かし、それに当量のマレイン酸を加えることにより、後処理操作の最後に最終生成物を単離した。
収率：25％
Mp：165.5-169℃
実施例９：
Ｎ−｛３−〔（１，１−ジメチルエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロポキシ｝−３−トリフルオロメチルベンゼンカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
手順：
ａ）50g（0.245モル）のｍ−トリフルオロメチルベンズアミドオキシムと33.7g（0.6モル）の水酸化カリウムをジメチルスルホキシドと水170mlの混合物に溶かし、その混合物を０℃に冷却し、48ml（0.6モル）のエピクロロヒドリンを加え、そして反応混合物を０℃で５時間攪拌し、次いで冷蔵庫中に一晩置いておいた。翌日、250mlの水を加え、混合物を酢酸エチルで抽出した（４×250ml）。合わせた有機相を水で洗浄し、乾燥し、活性炭で処理し、蒸発乾固せしめて無色オイルとしてｍ−トリフルオロメチル−Ｎ−（２，３−エポキシプロポキシ）ベンズアミジンを得た。
収率：61g（96％）
ｂ）得られたオイルに400mlの18％塩酸溶液と60mlのエーテルを添加し、混合物を攪拌しながら−５℃に冷却した。60mlの水に溶かした亜硝酸ナトリウム17.4g（0.25モル）を40分かけてゆっくりと添加し、反応混合物を更に20分間攪拌した。次いで該混合物をエーテルで抽出し（２×160ml）、合わせた有機相を水で２回洗浄した。エーテル性溶液に340mlの20％水酸化ナトリウム溶液を加え、二相系を攪拌しながら１時間還流させた。次いで二相を分離し、有機相を中性になるまでブラインで洗浄し、乾燥し、蒸発乾固せしめて、無色オイルとしてｍ−トリフルオロメチル−Ｎ−（２，３−エポキシプロポキシ）ベンズイミドイルクロリドを得た。
収率：30.5g（45％）
ｃ）12mlのイソプロピルアルコール中の1.19g（4.2ミリモル）のＮ−〔（２，３−エポキシ）プロポキシ〕−３−トリフルオロメチルベンゼンカルボキシミドイルクロリドと0.89ml（8.5ミリモル）のtert−ブチルアミンの混合物を２時間還流させた。減圧下で溶媒を留去した。残渣を酢酸エチルに溶かし、そこに0.98mlのメタノール性塩化水素溶液（4.3Ｎ）を加え、混合物を真空中で少量に濃縮し、次いでエーテルで希釈した。生成した沈澱を回収し、冷エーテルで洗浄し、乾燥した。
収率：0.48g（32％）
Mp：150-153℃
IR（KBr）:3423,3233,2978,2880,2784,1620,1570,1479,1441,1400,1383,1340,1238,1167,1128,1101,1072,1038,982,930,897,804,787,714,694cm-1
上記実施例に記載の方法に従って、次の化合物を調製した。
実施例10：
Ｎ−｛２−ヒドロキシ−３−〔（１−メチルエチル）アミノ〕プロポキシ｝−３−トリフルオロメチルベンゼンカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
収率：30％
Mp：105-108℃
IR（KBr）:3358,2984,2883,2804,1595,1441,1383,1335,1238,1184,1171,1121,1099,1074,1011,995,947,906,891,798,779,696,681,567cm-1
実施例11：
Ｎ−〔３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロポキシ〕−３−トリフルオロメチルベンゼンカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
収率：35％
Mp：147-149.5℃
IR（KBr）:3381,2951,2860,2820,1580,1439,1344,1246,1161,1126,1099,1074,1003,986,932,903,872,802,787,716,692,681,648cm-1
実施例12：
Ｎ−〔３−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシプロポキシ〕−３−トリフルオロメチルベンゼンカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
収率：21％
Mp：121-128℃
IR（KBr）:3425,3289,2951,2667,1818,1443,1337,1238,1178,1115,1078,1049,997,910,804,781,696,683cm-1
実施例13：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−トリフルオロメチルベンゼンカルボキシミドイルクロリド一塩酸塩
収率：13％
Mp：119-123℃
IR（KBr）:3366,2937,2854,2737,2673,2538,1616,1570,1439,1404,1337,1290,1236,1199,1165,1129,1101,1074,1030,984,972,933,901,829,804,788,717,699,685,646cm-1
実施例14：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−１−オキシド−１−イル）プロポキシ〕−Ｎ’−オキシ−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリド
手順：
クロロホルム（50ml）中のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリド（5.0g；17.1ミリモル）の溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（7.0g；40ミリモル）を少量ずつ添加し、混合物を室温で２時間攪拌した。溶媒を除去し、残渣を80mlの酢酸エチルに溶かし、水で洗浄し、乾燥し、そして蒸発させた。得られた油状生成物を最後にアセトンで結晶化させてオフホワイト色固体として生成物を得た。
収量：2.21g（6.7ミリモル；40％）
Mp：140-142℃
IR（KBr）:3437,3071,2943,2880,2590,1801,1578,1475,1454,1433,1375,1294,1259,1194,1165,1121,1088,1043,1011,995,924,905,888,845,808,710,671,554,513,413cm-1
実施例15：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−１−オキシド−１−イル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリド
手順：
クロロホルム（20ml）中のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリド（2.0g；6.8ミリモル）の溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（70％純度のもの1.6g；6.5ミリモル）を添加し、混合物を室温で30分間攪拌した。10％水酸化ナトリウム溶液を使って溶液をアルカリ性にし、分離し、有機層をブラインで洗浄し、乾燥し、そして蒸発させた。固体残渣を酢酸エチルから再結晶し、沈澱を濾過し、洗浄し、乾燥させて白色固体として生成物を得た。
収量：1.03g（48％）
Mp：127-130℃
IR（KBr）:3454,2988,2945,2880,2585,1585,1512,1479,1443,1416,1393,1350,1331,1289,1183,1134,1072,1051,1030,997,953,939,879,847,808,702,519,417cm-1
実施例16：
Ｎ’−〔２−ヒドロキシ−３−（１−メチル−１−ピペリジニウム−１−イル）プロポキシ〕−Ｎ−メチルピリジニウム−３−カルボキシミドイルクロリドジヨージド
手順：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリド（1.0g；3.4ミリモル）と1.2ml（20ミリモル）のヨウ化メチルの混合物を窒素下でアセトン（10ml）中で２時間還流させた。得られた暗黄色沈澱を濾過し、アセトンで洗浄して粗生成物（1.8g）を得、それを次いで20mlのエタノールから再結晶した。
収量：1.2g（60％）
Mp：153-157℃
IR（KBr）:3462,3406,3317,3040,2941,2878,2831,1729,1636,1589,1504,1462,1378,1350,1290,1209,1171,1121,1069,1047,1030,1001,941,897,868,818,706,673,635,589cm-1
実施例17：
Ｎ−〔２−アセトキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
手順：
1.48g（5.0ミリモル）のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリドを５mlの無水酢酸に溶かした。反応の温度を40℃まで上げた。室温で30分後、溶媒を真空中で完全に除去し、残渣を30mlのジエチルエーテルに溶かし、活性炭で処理し、濾過し、減圧下で溶媒を除去して1.74gの橙色オイルを得た。
この残渣を10mlのアセトンに溶かし、そこに10mlのアセトン中の0.6g（5.17ミリモル）のマレイン酸の溶液を加えた。結晶質生成物を濾過により取り、アセトンで洗浄して1.43gのオフホワイト色物質を得た。９mlのイソプロピルアルコールを使って脱色しながら再結晶することにより、表題化合物を得た。
収量：1.22g（54％）
Mp：143-144℃
実施例18：
（Ｓ）−Ｎ−｛２−〔２−（Ｒ）−（１，１−ジメチルエチルオキシカルボニルアミノ）−３−フェニルプロピオニルオキシ〕−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ｝−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
手順：
6.7g（25.5ミリモル）のＮ−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｄ−フェニルアラニンを50mlのジクロロメタンに溶かした。この溶液を０℃に冷却し、そして4.0mlのトリエチルアミンに次いで2.5ml（26ミリモル）のクロロ蟻酸エチルを滴下添加した。混合物を０℃で20分間攪拌し、次いで50mlのジクロロメタン中の7.5g（26ミリモル）のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリドの溶液を30分間かけて添加した。反応混合物を室温で１時間攪拌し、まず10％酢酸（２×100ml）で抽出し、次に水で抽出し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾固せしめた。残渣（10.7g）を71mlのアセトンに溶かし、そこに1.53g（13ミリモル）のマレイン酸を添加した。生成した固体を濾過し、アセトンで洗浄した。
収量：4.0g（6.0ミリモル；23％）
Mp：146.5-148℃
〔α〕D＝＋21.5°（ｃ＝１，MeOH）
IR（KBr）:3393,2978,1744,1697,1582,1518,1468,1454,1420,1381,1358,1313,1290,1256,1213,1169,1126,1099,1084,1045,1016,930,908,870,750,690,575cm-1
上記実施例に記載の方法に従って、次の化合物を調製した：
実施例19：
（Ｒ）−Ｎ−｛２−〔２−（Ｓ）−（１，１−ジメチルエチルオキシカルボニルアミノ）−３−フェニルプロピオニルオキシ〕−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ｝−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
収率：25％
この化合物は実施例18に記載したのと同じ物性データ（MpとIR）を有する。
〔α〕D＝−23.6°（ｃ＝１，MeOH）
実施例20：
Ｎ−〔２−ベンゾイルオキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
手順：
20.9g（75.0ミリモル）のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド〔ハンガリー国特許第177,578号（1976）〕を300mlのベンゼンに溶かした。この溶液に150mlの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加し、次いで19.5ml（168ミリモル）の塩化ベンゾイルを滴下添加した。混合物を２時間激しく攪拌した後、7.lg（67ミリモル）の炭酸ナトリウムと追加の量の塩化ベンゾイル（9.75ml；84ミリモル）を加え、攪拌を一晩続けた。次いで相を分離し、有機相を１Ｎ水酸化ナトリウム溶液と水で抽出し、乾燥し、蒸発乾固せしめた。残渣（41gのオイル）を150mlのアセトンに溶かし、そこに8.7g（75ミリモル）のマレイン酸を加えた。得られた沈澱を濾過し、アセトンで洗浄しそして乾燥した。
収率：29.1g（78％）
Mp：194-195℃
前記実施例に記載の方法に従って、次の化合物を調製した：
実施例21：
Ｎ−〔２−ベンゾイルオキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
出発物質：米国特許第5,147,879号（1992）
収率：64％
Mp．：134-136℃
IR（KBr）:2955,2939,2517,1718,1583,1477,1452,1410,1370,1354,1317,1268,1209,1173,1117,1057,1043,998,968,939,903,870,748,723,714,652,582cm-1
実施例22：
Ｎ−〔２−パルミトイルオキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド一塩酸塩
手順：
14.7g（52.8ミリモル）のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド〔ハンガリー国特許第177,578号（1976）〕を160mlのクロロホルムに溶かした。この溶液に7.7ml（55ミリモル）のトリエチルアミンを添加し、次いで85mlのクロロホルム中の塩化パルミトイル（14.7g，56.5ミリモル）の溶液を滴下添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。翌日、追加の量の3.8mlのトリエチルアミンと7.4gの塩化パルミトイルを添加し、もう１日攪拌を続けた。次いで該溶液を水、５％酢酸および水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして蒸発乾固せしめた。
残渣（28.2gのオイル）を酢酸エチルに溶かし、30mlの１Ｎ塩酸／酢酸エチルの添加により生成物を沈澱させた。嵩張った白色沈澱を濾過し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥させた。
収率：10.9g（37％）
Mp．：110-113℃
上記実施例に記載の方法に従って、次の化合物を調製した：
実施例23：
Ｎ−〔２−パルミトイルオキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリド二塩酸塩
出発物質：米国特許第5,147,879号（1992）
注記：還流させることにより反応を実施した。
収率：72％
Mp．：69-73.5℃
IR（KBr）:3425,2922,2853,2648,2544,1742,1632,1468,1416,1377,1287,1183,1113,1087,1032,984,708,675cm-1
実施例24：
Ｎ−〔２−（２−フロイルオキシ）−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
注記：マレイン酸塩の形で生成物を単離した。
収率：52％
Mp．：161-171.5℃
実施例25：
Ｎ−〔２−（ｏ−クロロベンゾイルオキシ）−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド一塩酸塩
注記：還流させることにより反応を実施した。
収率：50％
Mp．：91-94℃
実施例26：
Ｎ−〔２−（ｐ−メトキシベンゾイルオキシ）−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド一塩酸塩
注記：還流させることにより反応を実施した。
収率：71％
Mp．：152-155℃
実施例27：
Ｎ−〔２−（ｍ−トリフルオロメチルベンゾイルオキシ）−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド一塩酸塩
注記：還流させることにより反応を実施した。
収率：45％
Mp．：144-147℃
実施例28：
Ｎ−〔２−（２−チエノイルオキシ）−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
注記：還流させることにより反応を実施し、そしてマレイン酸塩の形で生成物を単離した。
収率：58％
Mp．：168-176℃
実施例29：
Ｎ−〔２−アセトキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド一塩酸塩
手順：
2.5g（9.0ミリモル）のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミドを27mlのクロロホルムに溶かした。それに1.6g（16ミリモル）の酢酸無水物に添加し、室温で１時間攪拌した。反応混合物を蒸発乾固せしめ、等モル量（９ミリモル）の乾燥塩化水素を含むイソプロピルアルコールを添加した。溶液を冷却し、生成した固体を濾過した。イソプロピルアルコールからの再結晶により、白色結晶質化合物が得られた。
収率：1.9g（59％）
Mp．：107℃
実施例30：
Ｎ−〔２−（３−ピリジンカルボニルオキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
手順：
乾燥ピリジン中のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド（1.68g，６ミリモル）の溶液に、1.68g（7.4ミリモル）のニコチン酸無水物を添加し、そして室温で一晩維持した。混合物を蒸発せしめ、残渣を30mlの酢酸エチルに溶かし、濾過し、濾液を10％NaHCO3溶液で抽出し、乾燥し、蒸発せしめた。得られたオイルを20mlのアセトンに溶かし、0.53gのマレイン酸を加えて沈澱を形成させた。生成物を濾過し、アセトンで洗浄した。
収率：1.84g（61％）
Mp．：157-160℃
実施例31：
Ｎ−〔３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド二塩酸塩
手順：
2.86g（51.1ミリモル）の水酸化カリウムを20mlの無水エタノールに溶かし、次いで6.45g（47.0ミリモル）のＮ−ヒドロキシ−３−ピリジンカルボキシミドアミドと7.7g（47.7ミリモル）の１−クロロ−３−（１−ピペリジニル）プロパンを加え、そして９時間還流させた。固体を濾過により除去し、濾液を蒸発せしめた。粗生成物を100mlのクロロホルムに溶かし、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で洗浄し、次いで水で３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を蒸発せしめた。残渣を少量の無水エタノールに溶かし、乾燥塩酸を含むイソプロピルアルコールを加え（pH2）、オフホワイト色結晶を得た。
収率：4.8g（38％）
Mp．：95-100℃（分解）
IR（KBr,塩基）:3422,3294,3107,2984,2937,2870,2818,1649,1616,1593,1479,1462,1441,1381,1309,1194,1123,1094,1059,1042,982,910,858,816,712,559cm-1
上記実施例に記載の方法に従って、次の化合物を調製した：
実施例32：
Ｎ−〔３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−トリフルオロメチルベンゼンカルボキシミドアミド一塩酸塩
収率：42％
Mp．：116-119℃
IR（KBr,塩基）:3412,3082,2949,2874,2827,1655,1485,1447,1383,1325,1283,1171,1121,1094,1072,986,920,905,808,700,677,627cm-1
実施例33：
Ｎ−〔３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−（３，４−ジメトキシフェニル）メタンカルボキシイミダミド二塩酸塩
収率：35％
Mp．：207-209℃
実施例34：
Ｎ−〔２，２−ジメチル−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド
収率：38％（オイル）
IR（KBr）:3323,2935,2888,2785,1637,1477,1393,1360,1157,1111,1057,995,943,860,814,789,708,627cm-1
実施例35：
Ｎ−〔３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド一塩酸塩
収率：23％
Mp．：127-130℃
IR（KBr）:3387,2947,2878,2802,1730,1639,1450,1389,1283,1242,1194,1150,1083,1015,964,933,814,710cm-1
実施例36：
Ｎ−〔３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ニトロベンゼンカルボキシミドアミド一塩酸塩
収率：51％
Mp．：158-162℃
実施例37：
Ｎ−〔３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕ベンゼンカルボキシミドアミド二塩酸塩
収率：64％
Mp．：207-209℃
実施例38：
Ｎ−｛２−ヒドロキシ−３−〔（１−ピペリジニル）プロポキシ〕｝−２，４，６−トリメチルベンゼンカルボキシミドアミド
収率：44％
Mp．：199-201℃
IR（KBr）:3410,3103,2943,2912,2814,2791,1634,1582,1441,1383,1350,1321,1304,1254,1204,1146,1111,1099,1065,993,878,851,785,754,525cm-1
実施例39：
Ｎ−｛２−ヒドロキシ−３−〔（１−ピペリジニル）プロポキシ〕｝−４−アセトアミドベンゼンカルボキシミドアミド一塩酸塩
収率：25％
Mp．：133-137℃
実施例40：
Ｎ−｛２−ヒドロキシ−３−〔（１−ピペリジニル）プロポキシ〕｝−３−ニトロベンゼンカルボキシミドアミド二塩酸塩
収率：38％
Mp．：190-193℃
実施例41：
Ｎ−｛２−ヒドロキシ−３−〔（１−ピペリジニル）プロポキシ〕｝−２−（１，５−ジメチル）ピロールカルボキシミドアミド一塩酸塩
収率：20％
Mp．：144-147℃
IR（KBr,塩基）:3458,3369,2930,2849,1622,1587,1502,1468,1437,1396,1354,1323,1279,1254,1200,1157,1115,1078,1042,988,962,930,870,856,758,737,694,609cm-1
実施例42：
Ｎ−｛２−ヒドロキシ−３−〔（１−ピペリジニル）プロポキシ〕｝−３−キノリンカルボキシミドアミド二塩酸塩
収率：36％
Mp．：210-211℃
実施例43：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−４−ニトロベンゼンカルボキシミドアミド二塩酸塩
収率：77％
Mp．：184-189℃
実施例44：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−２−チオフェンカルボキシミドアミド二塩酸塩
収率：73％
Mp．：157-170℃
IR（KBr）:3280（b）,2940,1655,1420,1120,1018,1002,857,710cm-1
実施例45：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−２−ニトロベンゼンカルボキシミドアミド二塩酸塩
収率：47％
Mp．：200-208℃
IR（KBr）:3300（b）,2960,1670,1535,1347,1155,1020,1002,860,800,753cm-1
実施例46：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−１−イソキノリンカルボキシミドアミド二塩酸塩
収率：56％
Mp．：208-216℃
実施例47：
Ｎ−｛３−〔（１，１−ジメチルエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロポキシ｝−３−トリフルオロメチルベンゼンカルボキシミドアミド二塩酸塩
手順：
21.0g（80.8ミリモル）のｍ−トリフルオロメチル−Ｎ−（２，３−エポキシプロポキシ）ベンズアミジン（実施例９ａ）、105mlのtert−ブチルアミン、210mlのエーテルおよび84mlの４Ｎ水酸化ナトリウム溶液の混合物を５時間還流させた。相を分離し、エーテル層をブラインで洗浄し、乾燥しそして蒸発乾固せしめた。得られたオイル（25.8g）を250mlのアセトンに溶かし、活性炭で処理し、次いで攪拌しながら39mlの4N HCl／酢酸エチル溶液を加え、白色固体の沈澱を生成させ、それを濾過し、そしてアセトンで洗浄した。
収率：22.8g（70％）
Mp．：186-192℃（分解）
IR（KBr）:3418,2984,2785,2625,2527,2401,1664,1585,1487,1437,1381,1329,1173,1155,1130,1078 905,874,820,692,642,594cm-1
実施例48：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−Ｎ’−ブチル−３−ピリジンカルボキシミドアミド一塩酸塩
手順：
ａ）Ｎ−｛２−〔（２−テトラヒドロピラニル）オキシ〕−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ｝−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリドの調製。21.3g（71.4ミリモル）のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリドを500mlのクロロホルムに溶かし、エーテル性塩酸溶液でpH＝３に酸性化し、次いで32.6ml（0.357モル）の３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピランを加えた。混合物を室温で20時間攪拌し、各回200mlの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液で３回洗浄し、そして同量の水で４回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。油状残渣を600mlの酢酸エチルに溶かし、各回150mlずつのpH＝５緩衝液で４回洗浄した。有機溶液を乾燥し、濾過し、そして蒸発させた。
収率：24.5g（90％）
ｂ）3.7g（9.68ミリモル）のＮ−｛２−（２−テトラヒドロピラニル）オキシ〕−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ｝−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリドと40ml（0.41モル）のｎ−ブチルアミンの混合物を３時間還流させた。過剰のアミンを真空中で蒸発させて黒褐色オイルを得、それを3.0gの４−トルエンスルホン酸を含む40mlのエタノール中に溶かし、そして混合物を60℃で１時間加熱した。減圧下で溶媒を留去し、残渣を２Ｎ水酸化ナトリウム溶液でアルカリ性（pH10）にし、次いでクロロホルムで３回抽出した。有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。黒っぽい油状残渣をクロマトグラフィーにより精製して純粋な塩基を与え、それを20mlのエタノールに溶かし、イソプロピルアルコール中に溶かした当量の乾燥塩酸で酸性にし、淡黄色結晶質固体として表題化合物を得た。
収率：1.22g（34％）
Mp．：120-122℃
IR（KBr,塩基）:3319,3293,3040,2959,2928,2854,2842,2552,1612,1580,1450,1427,1399,1333,1315,1221,1196,1171,1126,1103,1051,1022,964,928,899,858,829,719,692,602cm-1
上記実施例に記載の方法に従って、次の化合物を調製した：
実施例49：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−Ｎ’−シクロヘキシル−３−ピリジンカルボキシミドアミド一塩酸塩
収率：0.89g（24％）
Mp．：130-134℃
IR（KBr）:3280,2935,2853,2640,1720,1619,1551,1514,1452,1404,1313,1236,1194,1155,1124,1111,1090,1040,978,828,735,627cm-1
実施例50：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）ベンゼンカルボキシミドアミド
手順：
２mlの水に溶かした0.92g（5.2ミリモル）の１−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロパンの溶液に0.42g（10.4ミリモル）の水酸化ナトリウムを添加し、１時間攪拌した。この混合物に20mlのエタノール中に溶かした1.0g（5.2ミリモル）のＮ−ヒドロキシ−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）ベンゼンカルボキシミドアミドを添加し、そして４時間還流させた。溶媒を蒸発させ、50mlの水を加え、各回50mlのクロロホルムで３回抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。黄色油状残渣を冷蔵庫中でゆっくり結晶化させた。結晶をジエチルエーテルで粉砕し、濾過した。
収率：0.55g（31％）
Mp．：134-137℃
IR（KBr）:3427,3254,2929,2853,2814,1739,1603,1510,1445,1391,1367,1302,1281,1190,1140,1117,1094,1067,1036,993,963,922,841,789,716,675cm-1
実施例51：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−Ｎ’，Ｎ’−ジエチル−３−ピリジンカルボキシミドアミド一塩酸塩
手順：
0.66g（16.6ミリモル）の水酸化ナトリウムを25mlの無水エタノールに溶かし、次いでそこに1.61g（8.3ミリモル）のＮ−ヒドロキシ−Ｎ’，Ｎ’−ジエチル−３−ピリジンカルボキシミドアミドと1.48g（8.3ミリモル）の１−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロパンを添加し、５時間還流させた。溶媒を蒸発させ、50mlの水を加え、各回50mlのクロロホルムで３回抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を真空中で蒸発させた。黄色油状残渣をクロマトグラフィーにより精製して純粋な塩基を与え、それを20mlの酢酸エチルに溶かし、酢酸エチル中に溶かした当量の乾燥塩酸を使って酸性化し、白色結晶質固体として表題化合物を得た。
収率：1.3g（42％）
Mp．：113-117℃
実施例52：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕ヘキサデカン酸アミド一塩酸塩
手順：
1.74g（10ミリモル）の１−アミノオキシ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロパンを20mlのクロロホルムに溶かし、０℃に冷却した。10mlのクロロホルム中の塩化パルミトイル（2.85g，10ミリモル）の溶液を10分間かけて滴下添加した。混合物を15分間攪拌した後、得られた白色沈澱を濾過し、クロロホルムで洗浄し、そして乾燥した。
収率：3.2g（71％）
Mp．：147-150℃
IR（KBr）:3242,3090,2951,2916,2849,1730,1653,1520,1472,1439,1371,1300,1229,1169,1136,1099,1070,1009,993,962,928,858,760,719,602,471cm-1
上記実施例に記載の方法に従って、次の化合物を調製した：
実施例53：
Ｎ−〔３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−トリフルオロメチルベンズアミド
出発物質：EP 365,364（1990）
収率：69％（オイル）
IR（KBr）:3425,2941,2864,2775,1674,1614,1566,1520,1483,1441,1393,1337,1319,1277,1187,1129,1072,922,914,750,698,650cm-1
実施例54：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕ナフタレン−１−カルボキサミド
収率：54％
Mp．：104-107℃
IR（KBr）:3375,2934,1641,1593,1564,1439,1340,1325,1113,1026,941,810,779cm-1
実施例55：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−Ｎ’−ヘプチル尿素
手順：
20mlのクロロホルム中に溶かした1.23g（7.1ミリモル）の１−アミノオキシ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロパンの溶液に1.0g（7.1ミリモル）のヘプチルイソシアネートを添加し、そして反応混合物を20時間攪拌した。真空中で溶媒を蒸発させ、残渣をクロマトグラフィーにより精製して純粋な無色オイルを得た。それを石油エーテルで粉砕することにより、白色結晶質生成物が得られた。
収率：81％
Mp．：49-51℃
上記実施例に記載の方法に従って、次の化合物を調製した：
実施例56：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−Ｎ’−プロピル尿素
収率：50％（オイル）
IR（KBr）:3319,2934,2878,2802,1666,1551,1456,1393,1308,1155,1092,1040,993,889,793cm-1
実施例57：
Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕尿素
収率：67％
Mp．：108-110℃
IR（KBr）:3319,3287,3188,2930,2853,2797,1637,1574,1452,1354,1331,1300,1101,1098,991cm-1
実施例58：
Ｎ−ヘキシル−Ｎ’−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕尿素
収率：27％
Mp．：50-52℃
IR（KBr）:3310,2932,2858,2804,1666,1551,1454,1377,1306,1092,1040,995,791,725,604cm-1
実施例59：
Ｎ−（３−クロロフェニル）−Ｎ’−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕尿素
収率：34％
Mp．：117-118℃
IR（KBr）:3250,2939,2900,1670,1597,1551,1491,1429,1329,1252,1119,972,775,718,700cm-1
実施例60：
Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−｛２−ヒドロキシ−３−〔Ｎ−シクロヘキシルカルバモイル−Ｎ−（１，１−ジメチルエチル）アミノ〕プロポキシ｝尿素
収率：44％
Mp．：151-152℃
IR（KBr）:3312,2932,2854,1668,1616,1555,1450,1393,1364,1354,1252,1220,1130,941,891cm-1
実施例61：
Ｎ−ヘキシル−Ｎ’−〔３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕尿素
収率：85％（オイル）
IR（KBr）:3354,2932,2856,2810,2777,1666,1543,1486,1377,1308,1155,1134,1076cm-1
実施例62：
Ｎ−tert−ブチル−Ｎ’−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕尿素
収率：38％
Mp．：71-73℃
IR（KBr）:3314,2945,2916,1651,1555,1460,1393,1384,1335,1254,1111,988,903,839,781cm-1
実施例63：
Ｎ−（３−ニトロフェニル）−Ｎ’−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕尿素
収率：54％
Mp．：137-139℃
IR（KBr）:3281,2943,2818,1672,1607,1560,1529,1486,1437,1354,1283,1115,802,739cm-1
実施例64：
５，６−ジヒドロ−５−（１−ピペリジニル）メチル−３−（３−ピリジル）−４Ｈ−１，２，４−オキサジアジン
手順：
ａ）17.5g（0.05モル）のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド二塩酸塩を50mlの塩化チオニルに溶かし、１時間煮沸し、次いで混合物を蒸発乾固せしめた。残渣を300mlのメタノールに溶かし、活性炭で処理し、濾過した後、減圧下で溶媒を蒸発させた。残渣を最少量のエタノールに溶かし、冷蔵して、中間体化合物として結晶性Ｎ−〔２−クロロ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド二塩酸塩を得た。
収率：13.2g（71％）
Mp．：127-145℃
ｂ）13.2g（35.7ミリモル）のＮ−〔２−クロロ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドアミド二塩酸塩を、150mlのtert−ブタノール中に溶かした16.5g（143.5ミリモル）のカリウムtert−ブトキシドの溶液に添加した。混合物を６時間煮沸し、次いで真空中で蒸発させた。100mlの５％水酸化ナトリウム溶液を加え、混合物を各回300mlずつの酢酸エチルで３回抽出した。
有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発乾固せしめた。残渣をジエチルエーテルで粉砕して白色結晶として表題化合物を得た。
収率：3.5g（38％）
Mp．：157.5-158℃
実施例65：
Ｎ−｛３−〔（１，１−ジメチルエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロポキシ｝−３−トリフルオロメチルベンズアミド
手順：
1.3ml（15.2ミリモル）のエピクロロヒドリンを、温度を20℃以下に維持しながら、攪拌下で８mlのエタノール中の1.6ml（15.2ミリモル）のtert−ブチルアミンの溶液に10分間かけて添加し、３日間放置しておいた。それとは別に、0.8g（14.3ミリモル）の水酸化カリウムを20mlのエタノールと３mlの水の混合物に溶かし、この溶液に3.42g（15.2ミリモル）のＮ−ヒドロキシ−３−（トリフルオロメチル）ベンズアミドカリウム塩と、前に調製したエピクロロヒドリンとtert−ブチルアミンの溶液を添加した。反応混合物を攪拌し、10時間煮沸し、次いで溶媒を蒸発させた。残渣を20mlのジクロロメタンと10mlの水で粉砕し、有機相を分離し、５mlの水と５mlの飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。油状残渣をアセトン−ヘキサン混合物中で結晶化させ、白色粉末として表題化合物を得た。
収率：0.85g（17.3％）
Mp．：156-158℃
IR（KBr）:2976,2858,1612,1556,1379,1352,1313,1273,1165,1130,1072,694cm-1
実施例66：
メチル−Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミデート（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
手順：
11.4g（38.2ミリモル）のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロリドを60mlの無水メタノールに溶かし、次いで25ml（0.1モル）の25％メタノール性ナトリウムメトキシド溶液を５分間かけて滴下添加した。反応混合物を30分間攪拌し、蒸発させた。残渣を210mlのジクロロメタンと共に30分間攪拌し、塩化ナトリウムを濾過し、濾液を50mlの水、次いで50mlの飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下で蒸発させた。粗生成物（9.8g）をクロマトグラフィーにより精製して淡黄色オイルとして表題化合物を得た。
収量：2.9g（29％）
C15H23N3O3についての元素分析
Figure 0004531865
実施例67：
ジエチル−Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕イミノカーボネート
手順：
0.87g（５ミリモル）の１−アミノオキシ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロパンと1.1g（5.5ミリモル）のテトラエチルオルトカーボネートの混合物を触媒量のｐ−トルエンスルホン酸の存在下で100℃で３時間攪拌した。蒸発後、残渣をカラムクロマトグラフィー（Merck Kieselgel 60；溶離液：クロロホルム／メタノール／濃NH4OH 30:5:0.2）により精製して淡黄色オイルとして表題化合物を得た。
収率：27.7％（オイル）
13C-NMR（d,CDCl3）:154.9（s,C=N）,76.5（t,N-OCH2）,66.6（d,CHOH）,64.5（t,CH3 CH 2）,64.1（t,CH3 CH 2）,61.5（t,CHCH 2N）,54.8（t,ピペリジン）,26.0（t,ピペリジン）,24.2（t,ピペリジン）,14.9（q,CH3）,14.1（q,CH3）
実施例68：
Ｎ−｛３−〔（１，１−ジメチルエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロポキシ｝−Ｏ−エチル−Ｎ’−フェニルイソ尿素
手順：
18.4g（0.1モル）のエチルＮ−フェニルクロロホルムイミデート〔F.LengfeldおよびJ.Stieglitz,Am.Chem.J.16,70（1894）〕と16.2g（0.1モル）の１−アミノオキシ−２−ヒドロキシ−３−〔（１，１−ジメチルエチル）アミノ〕プロパン〔ドイツ国公開公報2 651 083〕を200mlのテトラヒドロフランに溶かした。13.9ml（0.1モル）のトリエチルアミンを添加し、混合物を室温で10時間攪拌した。形成したトリエチルアミン塩酸塩を濾過し、濾液を真空中で蒸発させ、残渣を200mlのクロロホルムに溶かし、50mlの水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗製の油状残渣をクロマトグラフィーにより精製して淡黄色オイルとして表題化合物を得た。
収量：18.5g（59.8％）
C16H27N3O3についての元素分析
Figure 0004531865
実施例69
Ｎ−〔３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−Ｏ−フェニルイソカルボキシアミド
手 順
3.16ｇ（20mmol）の１−アミノキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロパンを50mlのベンゼン中に溶かした。2.4ｇ（20mmol）のフェニルシアネートを加え、その混合物を12時間、室温で撹拌した。更に0.16ｇ（1.3mmol）のシアネートを加え、その混合物を更に12時間、撹拌した。エバポレーションの後、その残留物をメタノールに溶かし、その溶液を活性炭素で浄化してエバポレートした。その生成物を酢酸エチル／エチルアルコールから結晶化して白色材料を供した。
収率：46.9％
Mp．：63−70℃（酢酸エチル）
13C-NMR（d.D2O）:152.4;129.9;125.8;119.9;70.3;57.4;54.3;53.2;23.0;22.7;21.0。
実施例70
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−Ｎ′−ペンタメチレン−Ｏ−エチル−イソ尿素
手 順
2.7ｇ（0.01mol）のジエチル−Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−イミノカルボネート（実施例67を参照のこと）及び0.99ml（0.01mol）のピペリジンを40mlのテトラヒドロフラン中に溶かし、２時間、室温において撹拌し、次に乾燥するまでエバポレートした。その残留物を、クロマトグラフィーにより精製し、油としてタイトル化合物を生成した。
収率：2.1ｇ（67.1％）
元素分析（C16H31N31N3O3）
Figure 0004531865
実施例71
Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ′−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−Ｎ″−フェニル−グアニジンヒドロクロライド
手 順
1150mg（6.58mmol）の１−アミノオキシ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロパン（Ger.Off.2 651 083）をクロロホルム中に溶かし、750mgのNa2CO3を加え、次に10mlのクロロホルム中1206mg（6.58mmol）のＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ′−フェニル−クロロホルムアミジン
Figure 0004531865
の溶液を滴下して加えた。５時間後、その固体状態をろ過して、そのろ液をエバポレートした。この残留物（1800mgの油）を10mlの酢酸エチル中に溶かし、その生成物を、0.54Ｎ HCl／酢酸エチル10.46mlを加えることにより沈殿させた。その黄色沈殿物をろ過して除き、洗浄して、最後に、酢酸エチルの後にアセトンから再結晶化した。
収率：28％
Mp．：127 129℃
IR（KBr）:3220,2093,2840,2690,2620,1608,1580,1475,1433,1375,1250,1070,1050,1000,925,900,760,705cm-1。
実施例72
Ｎ−〔３−〔（１，１−ジメチルエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロポキシ〕−Ｎ′−フェニル−グアニジン
手 順
3.1ｇ（0.01mol）のＮ−〔３−〔（１，１−ジメチルエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロポキシ〕−Ｏ−エチル−Ｎ′−フェニル−イソ尿素（実施例68を参照のこと）を20mlのテトラヒドロフラン中に溶かし、200mlの25％の水酸化アンモニウム水溶液及び0.26ｇ（５mmol）の塩化アンモニウムを加え、その混合物を15時間、室温に維持した。その混合物を乾燥するまでエバポレートし、クロマトグラフィーで精製して油としてタイトル化合物を生成する。
収率：1.7ｇ（60.7％）
元素分析（C14H24N4O2）
Figure 0004531865
実施例73：
Ｎ，Ｎ′−ジフェニル−Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−ベンゼンカルボキサミジンヒドロクロライド
手 順
3.55ｇ（20mmol）の３−ピペリジノ−２−ヒドロキシ−１−プロパンを2.5mlの水に溶かし、0.8ｇ（20mmol）のNaOHを加え、そしてその混合物を室温で１時間、撹拌した。次に60mlのエチルアルコール中6.49ｇ（20mmol）のＮ，Ｎ′−ジフェニル−Ｎ−ヒドロキシ−ベンゼンカルボキサミジンヒドロクロライドの溶液を滴下して加え、更に0.8ｇ（20mmol）のNaOHを加えた。得られた黄色懸濁液を２時間、煮沸した。次に沈殿した塩化ナトリウムをろ過して除き、エチルアルコールで洗浄した。溶媒をエバポレートし、40mlの酢酸エチルを加え、蒸留水40ml部で２回抽出した。その有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させろ過した。その生成物を5.5mlの3.67Ｎ HCl／酢酸エチルを加えることにより沈殿させた。その沈殿をろ過して除き、洗浄して、最後にメタノール／エーテルから再結晶化した。
収率：42％
Mp．：151−155℃（メタノール／エーテル）
13C-NMR（d.CDCl3）:159.6,148.0,140.9,131.0,129.7,129.3,128.9,128.5,127.9,127.5,64.2,60.2,54.5,22.7,21.9。
実施例74：
Ｎ−〔３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−Ｎ−メチル−Ｎ′−フェニル−Ｏ−エチル−イソカルボキシアミド
この化合物の調製のための手順は、開始材料として１−メチルアミノオキシ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロパン及びエチル−Ｎ−フェニル−クロロホルムイミデートを用いて、実施例68に記載されるのと同じである。
収率：56％（油）
元素分析（C17H29N3O3）
Figure 0004531865
実施例75：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−Ｎ−メチル−Ｎ′−フェニル−グアニジン
この化合物を調製するための手順は、開始材料としてＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−Ｎ−メチル−Ｎ′−フェニル−Ｏ−エチル−イソ尿素（実施例74を参照）を用いて実施例72に記載されるのと同じである。
収率：43％（油）
元素分析（C16H26N4O2）
Figure 0004531865
実施例76
Ｎ，Ｎ，Ｎ′−トリメチル−Ｎ′−〔３−（１−ピペリジニル）−プロポキシル〕Ｎ″−フェニル−グアニジン
手 順
344mg（2.0mmol）の１−メチルアミノオキシ−２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロパンをクロロホルム中に溶かして、220mgのNa2CO3を加え、次に３mlのクロロホルム中438mg（2.0mmol）のＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ′−フェニル−クロロホルムアミジンヒドロクロライドの溶液を滴下して加えた。８時間後、その固体状態をろ過し、そのろ液をエバポレートした。この残留物を酢酸エチルに溶かし、その生成物をHCl溶液（pH＝１）を加えて水に抽出した。次にその水相を２Ｎ NaOH溶液を加えてpH＝11とすることによりアルカリ性にし、酢酸エチルで抽出した。その有機相をエバポレートし、カラムクロマトグラフィーにより更なる精製を行って黄色油としてタイトル化合物を供した。
収率：10％（油）
13C-NMR（d,CDCl3）:156.6,150.5,128.4,121.4,120.5,70.0,55.9,54.4,40.6,39.4,25.8,25.6,24.3。
実施例77：
／Ｒ／（＋）−Ｎ−（２−ヒドロキシ）−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ−３−ピリジンカルボキシミドイルクロライド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）
手 順：
2.16ｇ（3.26mmol）の（Ｓ）−Ｎ−〔２−〔２−（Ｒ）−（１，１−ジメチルエチルオキシカルボニルアミノ）−３−フェニルプロピオニロキシ〕−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロライド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）（実施例18参照）を40mlのメタノール中に懸濁し、１時間、煮沸し、次に乾燥するまでエバポレートした。その残留物を20mlの酢酸エチルで粉砕し、その沈殿物をろ過し、酢酸エチルで洗浄した。この粗生成物をイソプロピルアルコール中で再結晶化してタイトル化合物を生成した。
収率：1.16ｇ（85％）
Mp．：136−137℃
〔α〕D：＋5.6°（ｃ＝１，MeOH，ｔ＝27℃）
実施例78：
Ｎ−（３−ピペリジノ−１−プロポキシ）−３−ピリジンカルボキシミドイルクロライドジヒドロクロライド
０℃まで冷やした後、蒸留水10ml及び濃塩酸4.36mlに、２ｇ（7.62mmol）のＮ−（３−ピペリジノ−１−プロポキシ）−３−ピリジンカルボキサミジン（実施例31参照）を撹拌しながら加える。その黄色溶液に、2.7ｇ（3.81mmol）の水10ml中に溶かされた窒化ナトリウムを30分間、−５℃において滴下して加える。緑色をおびた溶液を1.5時間−５℃で撹拌した後、その溶液のpHを、冷却下で１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えることにより10に調節し、次にその溶液を40mlのクロロホルムで３回抽出する。その有機相を20mlの水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて、エバポレートする。その残留物を、カラムクロマトグラフィー（Merck Kieselge）60：溶出液：クロロホルム／メタノール １：１）により抽出し、タイトル化合物に相当する塩基1.7ｇ（79.2％）を得る。
タイトルのヒドロクロライドを、塩化水素のエタノール溶液を加えることにより得られた塩基から調製する。m.p.：165〜167℃
IR（KBr）:3015,2945,2617,2515,2088,1982,1600,1570,1437,1402,1200,1060,988,912,808cm-1。
先の開始材料は次の通り調製され得る：
水酸化カリウム2.86ｇ（51.06mmol）を20mlの無水エタノール中に溶かした後、6.45ｇ（47.0mmol）の３−ピリジンカルボキサミドオキシムを撹拌しながら分けて加える。溶かした後、５mlのエタノール中に溶かされた7.7ｇ（47.66mmol）の１−（３−クロロプロピル）ピペリジンを滴下して加える。９時間の反応の後、沈殿した塩化カリウムをろ過して除き、そのエタノール溶液を活性炭素により浄化してエバポレートする。100mlのクロロホルム中に取った後、そのエバポレーション残留物を各々100mlの１Ｎ水酸化ナトリウムで３回、次に50mlの水で洗浄する。分離した後、その有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過してエバポレートする。油状の残留物は冷やすと結晶状になる。その結晶を約20mlのエーテルで破壊し、ろ過して乾燥させ、4.8ｇ（38.9％）の収率でベージュの生成物を供する。
IR（KBr）:3422,3107,2937,2870,2819,1640,1479,1391,1309,1194,1123,1059,1042,982,916cm-1。
先の実施例に記載される方法に従って、次の化合物を調製した：
実施例79：
Ｏ−（３−ピペリジノプロピル）−３−ニトロ−ベンズヒドロキシモイルクロライドヒドロクロライド
収率：50％
Mp．：173−175℃
IR（KBr）:3420,2926,2953,2649,2546,1514,1591,1533,1452,1354,1259,1252,1049,994,733cm-1。
5.2 製剤例
実施例１：錠剤
50mgの活性材料を含む錠剤を次の構成物から調製する：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−
プロポキシ〕−２−チオフェン−カルボキシミドイル
クロライドモノクロライド 50.0mg
コーンスターチ 100.0mg
ラクトース 95.0mg
タルク 4.5mg
ステアリン酸マグネシウム 0.5mg
活性化合物を細かく粉砕し、添加物と混合し、その混合物をホモジナイズして粒状化する。その粒子を錠剤につめる。
実施例２：錠剤
５mgの活性材料を含む錠剤を次の構成物から調製する：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−
プロポキシ〕−２−ニトロ−ベンジミドイルクロライ
ドモノクロライド 5.0mg
コーンスターチ 75.0mg
ラクトース 7.5mg
コロイド状シリカ 7.5mg
ステアリン酸マグネシウム 5.0mg
本組成物を実施例１に従って先の化合物から調製する。
実施例３：錠剤
５mgの活性材料を含む錠剤を次の構成物から調製する：
Ｎ−〔２−ベンジロキシ−３−（１−ピペリジニル）
−プロポキシ〕−３−ピリジン−カルボキシイミダミ
ド−（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１） 5.0mg
コーンスターチ 75.0mg
ゼラチン 7.5mg
微結晶状セルロース（Apical） 25.05mg
ステアリン酸マグネシウム 2.5mg
本組成物を実施例１に従って先の化合物から調製する。
実施例４：カプセル
10mgの活性材料を含むカプセルを次の化合物から調製する：
Ｎ−〔２−パルミトイロキシ−３−（ピペリジニル）
−プロポキシ〕−３−ピリジン−カルボキシイミダミ
ドモノヒドロクロライド 10mg
ラクトース 80mg
コーンスターチ 25mg
タルク 3mg
コロイド状シリカ 3mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
活性材料を添加物と混合し、その混合物をホモジナイズして、ゼラチンカプセル内に充填する。
実施例５：カプセル
20mgの活性材料を含むカプセルを次の構成物から調製する：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（ピペリジニル）−プロ
ポキシ〕−２−チオフェン−カルボキシイミドイルク
ロライドモノヒドロクロライド 20mg
微結晶状セルロース（Apical） 99mg
アモルファスシリカ 1mg
活性材料を添加物と混合し、その混合物をホモジナイズし、ゼラチンカプセル内に充填する。
実施例６：糖剤
25mgの活性材料を含む糖剤を次の構成物から調製する：
Ｎ−｛３−〔（１，１−ジメチル−エチル）アミノ〕
−２−ヒドロキシ−プロポキシ｝−３−トリフルオロ
メチル−ベンズアミジンヒドロクロライド 25mg
カルボキシメチルセルロース 295mg
ステアリン酸 20mg
セルロースアセテートフタレート 40mg
活性材料をカルボキシメチルセルロース及びステアリン酸と混合し、その混合物を200mlエタノール−酢酸エチル中のセルロースアセテートフタレートの溶液内で粒状化する。５％の糖を含むポリビニルピロリドン水溶液により覆われた粒子からコアをプレスする。
実施例７：注入
注入液を次の構成物から調製する：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−ピペリジニル）−プロポ
キシ〕−２−ニトロ−ベンジミドイルクロライド 5.0ｇ
滅菌生理食塩水 2.0mg
実施例８：軟膏
軟膏を次の構成物から調製する：
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−
プロポキシ〕−２−チオフェン−カルボキシイミドイ
ルクロライドモノヒドロクロライド 7.5ｇ
ステアリン酸 18.0ｇ
セチルステアリルアルコール 15.0ｇ
グリセリンモノステアレート 4.0ｇ
ラウリル硫酸ナトリウム 1.5ｇ
メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート 0.2ｇ
蒸留水 150ml
ステアリン酸、セチルステアリルアルコール及びグリセリンモノステアレートを一緒に溶かす。ラウリル硫酸ナトリウム及びメチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートを少し暖めながら100mlの水に溶かし、次に温度が室温に減少するまで撹拌しながらその疎水性化合物に加える。次に50mlの水中の活性化合物の溶液を加えて全体を混合する。
実施例９：軟膏
軟膏を次の構成物から調製する：
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ピペリジニル−プロポキ
シ）−２−ニトロ−ベンズイミドイルクロライドモノ
ヒドロクロライド 7.0ｇ
ポリソルベート 4.0ｇ
液体パラフィン 4.0ｇ
セチルステアリルアルコール 12.0ｇ
白色ワセリン 20.0ｇ
グリセリンモノステアレート 4.0ｇ
メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート 0.2ｇ
エチルアルコール 1.8ｇ
蒸留水 150ml
本組成物を実施例８に記載されるように調製する。
実施例10：クリーム
クリームを次の構成物から調製する。
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ピペリジニル−プロポキ
シ）−４−ピリジン−カルボキシイミドイルクロライ
ド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１） 10.0ｇ
白色ワセリン 90.0ｇ
白色ワックス 3.0ｇ
セチルステアリルアルコール 3.0ｇ
四ホウ酸ナトリウム 4.0ｇ
メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート 0.2ｇ
蒸留水 90ml
その水溶性構成物の溶液を実施例８のような疎水性構成物の暖かい混合物に加え、活性化合物の水溶液を最終的エマルションに加える。
実施例６：HSPの細胞内発現へのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果
6.1 背 景
本セクションに示される実験を、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートが細胞による分子シャペロンの発現を増加させるよう作用するか否かを決定するために行った。ヒートショックのみの、及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート投与と組み合わせたヒートショックの後の異なるヒートショック蛋白質の蓄積を、熱筋原性細胞（H9c2細胞）の高熱処理の前、間又は直後に10-5ＭのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを加えることにより検査した。
6.2 材料及び方法
6.2（ａ）細胞培養条件：
胚のラットの心臓由来細胞系H9c2をEuropean Collection of Animal cell Cultures（ECACC）から得た（88092904）。その細胞を、JOVAN CO2サーモスタット（５％ CO2）における10％胎児ウシ血清（GIBCO）が補給されたDulbecco’s modified Eagle’s培地（DMEM）中に37℃に維持した。
6.2（ｂ）Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理及びヒートショック条件：
供された時間間隔（20，40，60，90及び120分）についてCO2サーモスタット中でヒートショックを43℃で行った。次に細胞を37℃に６時間、戻し、SDS-PAGEのために蛋白質を抽出した。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートをヒートショックの前に加えた場合、ストレス前16時間、10-5ＭのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを投与した。他のセットの実験において、６時間の回収期間の間、熱ストレス直後にＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを加えた。本実験を３回繰り返した。
6.2（ｃ）ウエスタンブロット
SDS-PAGEのために、細胞を６cmペトリ皿水で増殖させた。実験開始時の細胞の量は８×105であり、蛋白質を抽出した時、なお低融合性であった。６時間後、回収細胞をPBSで２回、洗浄し、次にPBS中で皿の表面からこすり取った。次に細胞を1500rpmで５分間、遠心し、50mM Tris-HCl、pH8.0；5mM EDTA；150mM NaCl；15Tritox N-100；１PMF；２μｇ／mlアプロチニン；１μｇ／mlキモスタチン；１μｇ／mlペプスタチンを含む100mlの改良型可溶緩衝液（Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Ed.Sambrook,Fritsche,Maniatis,Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）、中にとり、３×20秒（２分間隔；セッティング８）、音波処理した。
３つ平行して、Bradfordアッセイ（M.M.Braford.Anal.Biochem.72:248〜254（1976））により５μｌのサンプルから蛋白質濃度を測定した。サンプル中の緩衝液の濃度が110mM Tris-HCl pH6.8、8.3mMメルカプトエタノール、３％ SDS、３％グリセロール及びいくらかのブロモフェノールブルーとなるさらに、サンプルを先の緩衝液及び次の緩衝液で100μｇ／30μｌに調整し、30分間、室温で振とうした。
Laemmli（U.K.Laemmli,Nature,227:680〜685（1970））に従って、一定ボルト数50Ｖで２つの８〜18％ポリアクリルアミドゲル上で一晩、電気泳動を行った。蛋白質をクーマシーブリリアントブルーR-250で染色するか、又は転移緩衝液（10mM CAPS、pH11、10％メタノール）中４℃で３時間、一定電流でImmobilone PVDF膜（Millipore）に移す（Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane,3.Laboratory Manual Millipore）かのいずれかを行った。移した後、その膜の非特異的部位を４℃で一晩、TBS（0.1％ Tween 20を有するリン酸緩衝塩類溶液）中２％のBSAでブロックした。そのブロットを１：3000に希釈したGRP94モノクローナル抗体（SPA-850，StressGen）と共に、１：2700に希釈したHSP60モノクローナル抗体（SPA-600，StressGen）と共に、１：1250に希釈したHSP72モノクローナル抗体（C92F 34-5，StressGen）と共に、又は１：2000に希釈したHSP90モノクローナル抗体（AC88，StressGen）と共に室温で１時間、希釈した。次に１時間、TPBS緩衝液で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合抗ラット（Sigma、１：4000希釈、GRP-94）又は抗マウス（Sigma、ヒト及びラット血清蛋白質に吸着、１：3000希釈、Hsp60，HSP72又はHSP90）第二抗体と共に各々１時間、インキュベートした。TPBSで連続的に洗浄した後、その膜をECLシステム（Amersham）で展開した。
一連の全蛋白質希釈液をブロットして、各々の時間、サンプルと共に平行して展開し、検量線を計算した。ストレス蛋白質成分の変化をBio-Radデンシトメーター（Model 1650）及びHewlett-Packard Integrator（HP3394A）を用いて定量し、検量線に従って補正した。計算を行う場合、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理なしに37℃における供された蛋白質バンドのデンシトメーターデータを100％として考慮し、他の強度をサンプルと比較した。
6.2（ｄ）統計分析
データは平均±SEとして報告される。Posthoc Newman-Keulsテスト（Pharmacological Calculation System）での分散の一元分析により、統計的比較及び計算を行った。統計的有意さはｐ＜0.05として定義した。
6.3 結 果
Hsp60：37℃で行われたＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理はこのhspのレベルに測定可能な効果を与えなかった。20分間続く43℃単独のヒートショックは、ほぼ２倍、hsp60の量を増加させ得る。熱処理の持続時間を伸ばすことにより、この蛋白質のレベルの更なる上昇は観察され得なかった。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを熱ストレスの前16時間、10-5Ｍの濃度で加えた。サンプルを20分の熱処理にさらした場合でさえ、hsp60の量は（37℃対照と比較して）約５倍、増加した。このＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートのhsp60のレベルへの効果は、40及び60分で熱処理したサンプルでも明らかであったが、各々、以後下降した。回収期の間に加えられたＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートも、後にストレス前にこの化合物を加えることにより観察されたかなり少い程度であるが、効果的であった。
Hsp72：残っているhsp72の量はH9c2細胞においてむしろ低いが、hsp70レベルへの異なる処置の効果は劇的であった。20分のヒートショックですでにかなりの増加があり、40分の熱処理においてその量は対照細胞において検出されたそれのほぼ10倍高かった。より長い持続時間の熱処理は、40分のサンプルと比較して大きな変化は生じなかった。熱ストレス前のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの投与は極めて顕著な効果を有した。60分の熱ストレスにおいて、hsp72レベルは、37℃サンプルと比較して約50倍増加したが、既に40分の熱ストレスにおいて大きな増加が検出され得た。これらの高度に誘導されたhsp72の量は、120分の熱処理がされた細胞において安定であった。回収期の間に加えられたＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートも、より少い程度であるが有効であった。
Hsp90：20分の熱処理において、高温のショックのみではHSP90のレベルの上昇を導き得なかったが、熱ストレスの前にＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを加えれば、Hsp90のレベルは約５倍増加した。薬剤プレインキュベーションの最も高い効果は、60分の熱処理との組合せの後に観察され得た。HSP90の場合、43℃で60分の熱処理後に加えられたＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートは、高温ストレスの前に加えたのと（それ以下でないなら）同じくらい有効であった。明らかに、90分を超える高温でのインキュベーションにおいて、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果はうすれた。
Grp94：20分の熱ショックの後にストレス蛋白質Grp94の形成を誘導した。この効果は60分の熱処理においてピークであったが、鋭い下降が90分のサンプルの場合に既に検出されていた。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートがGrp94のレベルを誘導する能力は、その化合物がストレス前に加えられる場合に最も促進されるが、薬剤の予備添加が20分の熱ショックと組み合わせられた場合に大きな上昇が見られ得た（43℃処理と比較して４倍）。他方、40又は60分続く熱ストレスからの回収の間のその化合物の添加は、ストレス前16時間のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの投与とほぼ同様の効果であった。
図２は、H9c2からの蛋白質のウエスタンブロット分析を示す。用いたプローブは、（１）に示されるhsp60抗体；（２）に示されるhsp72抗体；（３）に示されるhsp90抗体及び（４）に示されるgrp94抗体である。レーン（−）は、37℃においてＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの欠如下に維持された細胞を表し；そしてレーン（＋）は、その存在下（16時間、10-5Ｍの濃度）に維持された細胞を表す。43℃でのヒートショックを図に示される時間、行った。10-5ＭのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロピル〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを、熱処理前（レーン（Ｂ））又は回収期の間（レーン（Ａ））に、16時間、加えた。
H9c2ヒート細胞中の異なるhspの量への種々の処理の効果の概要を図１に示す。熱ストレス（43℃）のみにさらされた細胞中のストレス蛋白質の量は（Ａ）で表され；熱処理前に10-5Ｍ Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートで処理された細胞中のストレス蛋白質の量は（Ｂ）で表され；そして６時間の回収期間の間に10-5Ｍ Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートで処理された細胞中のストレス蛋白質の量は（Ｃ）で表される。水平軸は熱処理の持続時間を表し、垂直軸はストレス蛋白質の相対量を表す。
熱処理のみは、本研究で研究された全ての種類のHSPを誘導した。hsp60の場合に増加があまり促進されなかった。hsp60のレベルは細胞を20分の熱処理にさらした後約20倍まで上昇したが、より長い熱処理においては、更なる増加は検出され得なかった。熱ストレスの最も大きな効果はhsp72で見られ得、ここでその量は約12倍まで増加した。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを熱処理の前16時間、加えた場合、全てのHSPのレベルは熱ストレスに基づいて観察されたものと比較して更に少くとも２倍まで増加した。熱ストレスのみで検出された誘導と再び比較して、熱ストレス及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシミドイルクロライドマレエートを組合わせることによりHSPの中でかなり高い程度、hsp72のレベルが増加したことも明らかである。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを、検査されたほとんど全ての場合の回収期の間に投与した場合、hspの含有量は増加したが、hsp72の増加が最も促進された。
6.4 議 論
ウエスタンブロット分析は、ヒートショックへのヒート細胞の露出の後検査された異なるクラスのHSPの著しい蓄積を示した。高温ストレスの前又は後のいずれかでのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの添加は、HSPの産生への熱処理の効果を増加させた。従って、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートは、分子シャペロンの全てのクラスの形成を誘導することにより、温度ストレスと共同的に作用する。
実施例７：HSPの細胞内発現へのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライド材料の効果（転写レベルの検査）
7.1 背 景
虚血した心臓の再灌流の間、心室細動、梗塞の大きさの減少及び局所的な心筋の機能のより優れた回復により証明されるように（例えば繰り返しの気絶による）虚血に短時間さらされることはあらかじめ心臓の状態を整え、後の致命的虚血からそれを保護する。このようなプレコンディションは、HSP、特にhsp72の発現を誘導することが証明されている。このセクションにおいて、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートのhsp72の発現への効果は、虚血後の細胞のmRNA蓄積を検査し、それを虚血がＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの投与と組合わされた状況と比較することにより研究される。
7.2 材料及び方法
7.2（ａ）心臓ストレスの誘導
SPRD雄ラットで実験を行った。動物を、60mg／kg／i.p.の投与量でネンブタールで麻酔した。ラットの体温を腹部上に置いた下方のランプで維持し直腸の温度を測定した。25〜40分後、ラットの温度は42.0〜42.2℃まで増加し、この温度を15分間、維持した。回復期（２時間）の後、組織サンプルを左及び右心室から収集した。
7.2（ｂ）心臓虚血の誘導
SPRD雄ラットで実験を行った。動物を60mg／kg／i.p.の投与量でネンブタールで麻酔した。胸及び心膜を開いた後、CAD冠動脈を５分間、ふさぎ、次の再灌流期間（10分）における心室の心頻拍及び線維攣縮の発生率及び持続性を研究した。組織サンプルを左及び右心室から収集した。
7.3（ｃ）ノーザンブロット法
製造元の説明（Protocols and Applications Guide,2nd edition,1991,Promega Corporation）に従って、RNAgentsキット（Promega）を用いて全RNAを抽出した。要約すると、凍った組織サンプル（熱ストレス又は心臓虚血にさらされた左及び右心室からの組織サンプル）を用いた。50〜100mgの重さの組織サンプルをBrinkmanホモジェニゼーションにより＋４℃において1.0ml変性溶液中でホモジナイズした。次に１／10容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH4.0）を加え、そのホモジネートをボルテックスにより10秒間、酸性フェノール（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール 25：24：１）で抽出した。サンプルを15分間、氷上でインキュベートし、次に遠心した（４℃；20分、10,000×ｇ）。その水相を新しいエッペンドルフチューブに移し、その過程をくり返し、その水性物を一晩、−20℃で沈殿させた。遠心（４℃；20分、10,000×ｇ）の後、その沈殿物を95％エタノールで２回洗浄し、室温で乾燥させた。そのRNAを20μｌ DEPC処理した水中に懸濁した。全RNAの８μｇをキャビラリーで移すことによりホルムアルデヒド−アガロースゲルにかけ、ゲル上のRNAを製造元の説明（Zeta-Probe GT，BioRad）に従ってナイロン膜上にブロットした。
個々のサンプルのhsp72 mRNA成分を対応するプローブのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）のmRNAレベルと比較した。DNAプローブ（全長ヒトhsp70 cDNA及びラットGAPDH cDNAのApa-NcoＩフラグメント）をRandom Primed DNA Labeling Kit（USB）を用いてα-32P CTPでラベルした。放射能標識したDNAフラグメントを記載されるように（Ausubel et al.（eds）:Current Protocols in Molecular Biology:JOHN WILEY & SONS:1987）Sephadex G-50（Pharmacia）カラムで精製した。
Ｈ−緩衝液（0.25Ｍ Na2HPO4、pH7.2、７％ SDS）中で15分間、65℃でプレハイブリダイゼーションを行った。少くとも106cpm／mlのアイソトープラベルプローブ濃度で一晩（65℃：Ｈ−緩衝液）ハイブリダイゼーションを行った。その膜を20mM Na2HPO4、pH7.2、５％ SDS（65℃；２×15分）で洗浄し、オートラジオグラフィーにより測定した。hsp70プローブについて、及び内部標準として用いたGAPDH及びmRNAの測定について同じ膜を用いた。
7.4 結 果
５分間の冠状脈閉塞の後、ラットにおいて心頻拍及び心室の線維攣縮を引きおこす再灌流を行った。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートプレ処理（閉塞前５分、体重の0.5，0.75，1.0mg／kg）は心室の心頻拍の平均持続時間を大きく減少させ、心室の線維攣縮を防ぐことにより生存率を改善した。
対照グループからの全ての動物（ｎ＝６）は、再灌流の間に死んだが、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理（100mg／kgp.o.）したものは、５分の閉塞後、再灌流で生存したばかりか、hsp72の高度に増加された発現がそれらの心筋調製物において検出された。
図３は、ラットの心臓の左心室から単離された全RNAのノーザンブロット分析であり、実験から得られた結果を示す。対照（レーン１）；熱処理（レーン２）；擬似手術（レーン３）；虚血（レーン４）；Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート＋虚血（レーン５）；及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（レーン６）。GADPHを内部プローブとして測定した。ヒートショックのために直腸の温度を15分間、42℃に維持した。
ストレスなしで、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの投与のみではhsp72遺伝子を活性化することができなかったことに注意のこと。
実施例８：心臓虚血に対する本発明のヒドロキシルアミン誘導体の保護効果
雄のSprague-Dawleyラット（380〜450ｇ、b.w.）をペントバルビタール・ナトリウム（Nembutal 60mg／ml体重、i.p.）で麻酔し、気管切開により部屋の空気で人工的に呼吸させた（２ml／100ｇ：54ストローク／分）。プレアンプ（Hg-02，Expermetria）による全身の動脈の血圧（BP）の測定のために右の頸動脈を麻酔し、圧力変換器（BPR-01，Stoelting）に接続した。実施例５に記載されるヒドロキシルアミン誘導体を頸動脈（i.v.）への静脈カニューレにより、及び経口的（p.o.）に投与した。カルジオタコメーター（HR-01，Experimetria）により心拍数（HR）を測定した。皮下のスチール針電極による記録装置（MR-12，Medicor）により、心電図（ECG standard lead II）を記録した。左胸の開胸術により胸を開き、胸郭の右側に静かに圧力をかけることにより外面化した。４−０絹縫合糸をSelyeら（1960）により記載される主要な左の冠動脈下に迅速においた。心臓を注意深く胸に戻し、動物を回復させた。直腸の温度をモニターし、37℃の一定に維持した。閉塞を導く70mmHg未満の血圧が維持され、及び／又は不整脈が起こるのが観察された時、15分の安定化期間で実験プロトコルを開始した。心筋虚血は、５分間の冠状脈閉塞及び10分間の再灌流で心筋の虚血が誘導された。
全ての実験の間、BR，HR及びECGを連続的にマルチスクリプター（R61-6CH，Medicor）に記録した。その互変性形態が構造（Ｉ）及び（II）により表されるヒドロキシルアミン誘導体を、i.v.及びp.o.処理の各々の後の閉塞前、５〜60分に投与した。実施例５のヒドロキシルアミン誘導体の投与量は体重の0.5：0.75：1.0mg／kg（i.v.）及び100mg／kg（p.o.）であり、対照物質Bepridilは1.0mg／kg（i.v.）の投与量で供した。
心室の心頻拍（VT）及び／又は心室の線維攣縮（VF）の平均持続時間を、分散の一元分析により分析した。VFの発生率は、χ自乗テストを用いて分析した。血流力学変数をχ自乗テストを用いて分析した。血流力学変数をStudent’s“t”−テストを用いて分析した。有意の重大なレベルはｐ＜0.05にセットした。全ての結果を平均±S.E.Mとして表した。薬剤は、閉塞前にi.v.で１mg／kgbwで投与した。
虚血／再灌流障害に対して動物を保護するのに特に有利であることが見い出されたヒドロキシルアミン誘導体を以下に列記する。生存率（％）は、５分の冠状脈閉塞の効果で生存した動物の割合を示す。
Figure 0004531865
先の化合物に加えて、以下の化合物も有利な結果を供することが見い出されている。
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（プロリジニ−１−イル）−プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）（U.S.5,328,906、実施例12、１mg／kgbwi.v.、生存率（％）：67）；
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（ジエチル−アミノ）−プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドヒドロクロライド（１：１）（U.S.5,328,906、実施例11、１mg／kgbwi.v.、生存率（％）：62）；
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−プロピ−２−イル−アミノ）−プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライド（Ｚ）−ブテンジオエート（１：１）（U.S.5,328,906、実施例13／４、１mg／kgbwi.v.、生存率（％）：60）；
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（モルホリニ−１−イル）−プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキサミドイルクロライド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）（U.S.5,328,906、実施例12、１mg／kgbwi.v.、生存率（％）：71）；
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジル）−プロポキシ〕−α−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−アセトイミドイルクロライド（U.S.5,328,906、実施例14、１mg／kgbwi.v.、生存率（％）：67）；
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（tert−ブチル−アミノ）−プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシアミドイルクロライド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）（U.S.5,328,906、実施例13／５、１mg／kgbwi.v.、生存率（％）：57）；
Ｏ−（３−ピペリジノ−２−ヒドロキシ−１−プロピル）−ベンズヒドロキサム酸クロライドヒドロクロライド（U.S.5,147,879、実施例１、１mg／kgbwi.v.、生存率（％）：100）；
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライド（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）（U.S.5,147,879、実施例２、１mg／kgbwi.v.、生存率（％）：100、20mg／kgbwp.o.生存率（％）：100）；
実施例９：細胞膜修復及び膜流動性の保護へのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果
9.1 血清欠乏ストレスにより誘導される細胞障害に関連する細胞膜流動性の変化及び流動性の変化を戻すことにおけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドの効果
9.1（ａ）背 景
代謝障害を伴う糖尿病のストレスが原因である病態生理学的出来事をモデリングするための１つの試みは、培養培地中のインスリンのレベルを減少させることである。インスリンは、補給された血清により供されるので、部分的又は全体的欠乏は、細胞の異なる調範レベルにおける変化を検出するための任意の道具であるようである。
血清欠乏は、Ｇ１／Ｓ期における細胞拘束のための広く用いられる方法、即ち細胞サイクルシンクロナイゼーション（Ashihara,T.Methods of Enzymology,58:248〜249（1979））である。培養した細胞が血清補給の欠如においてアポトーシス過程を行うことが観察されており（Cohen,et al,Adv.In.Immunology 50:50〜85（1991））、それは、真核生物開始因子（eIF2α）のリン酸化により阻害された蛋白質合成を研究するため、Balb／3T3細胞におけるスタウロスポリン又はトポシオメラーゼインヒビターのかわりのショック（Kulkarni,G.V.et al.,J.Cell.Sci.107:1169〜1179（1994））、又はEhrlich細胞におけるヒートショック及びグルタミン欠乏（Rowlands,A.G.et al.,Eur.J.Biochem.175:93〜99（1988））として研究されている。更に、外部のHSP72を投与することにより、血清欠乏細胞において細胞保護で誘導される証拠がある（Johnson,A.D.et al.,In Vitro Cell Dev.Biol.Anim.29A:807〜812（1993））。血清欠乏によるHSP82及びHSP72の相対的合成の増加（Toye,P.et al.,Mol.Biochem.Parasitol.35,11〜10（1989））も示される。
心筋及び他の器官の虚血及び低酸素障害は、進行性膜機能不全及び損傷により媒介される。膜流動性の変化は、心筋細胞の代謝損傷の間におこる（Buja L.M.et al.,生体内５:233〜238（1991））。膜流動性は、膜構成脂質の動きの方向及び速度に主に反映し、そのレベルのいずれの変化も基本的な膜の機能に大きく影響を与える（Quinn,P.J.et al.Pro.Biophys.Molec.Biol.53:71〜103（1989）；Schlame,M.et al.,Biochem.Biophys.Acta,1045:1〜8（1990））。
本実験において、形質膜の流動性の変化が血清欠乏により誘導される細胞障害の進行に関与するか否か、及び血清欠乏から誘導された流動性変化が、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの投与により戻り得るかを決定するために、研究を行った。
9.1（ｂ）材料及び方法
３つのグループに分けたWEHIマウス線維肉腫及びH9c2ラット心筋細胞系を用いて実験を行った。
・対照（10％ FCS胎児ウシ血清）
・血清欠乏
・Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（10-5Ｍ）処理及び血清欠乏
9.1（ｂ）（１）血清欠乏及びMTTテスト
我々は、種々の細胞系、薬剤濃度、プレ処理及び欠乏時間をスクリーニングし、我々は次の最も適切な条件を見い出した：５×10-4／ml H9c2ラット心筋細胞（ｎ＝６）及びWEHIマウス線維肉腫細胞（ｎ＝７）を10％ FCS DMEM（Dulbecco modified Eagle’s mediuin）中に24ウエルプレート上にプレートした。培地を捨てて、10-5Ｍ Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを含む10％ FCS DMEMに置き換えた。６時間、先の環境で更にインキュベートした後、プレートをPBSで激しく洗浄し、血清を落とした。プレ処理した細胞にＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを、実験の終りまで投与した。18時間の枯渇の後、ほとんどの細胞を分離し、即ち殺して、血清欠乏培地中で顕微鏡で観察した。ここでＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理した培地は、対照細胞と同様の像を示した。細胞生存度をPlumbら（Cancer Res.49：4435〜4444（1989））の方法に基づくMTTテストにより測定した。生きた細胞により、有色形態へのMTT（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムプロミド）の転化に関するテトラゾリウム塩法を細胞生存度の間接的示標として供した。暗所での37℃での２時間のインキュベーションの後、上清を除去し、イソプロパノール中0.05Ｍ HCl 200μｌを直ちに細胞に加えた。プレートのO.D.をELISAプレートリーダー（Labsystems Multiskan Biochromatic Type：348）上で570nmにおいて読んだ。各々の場合において少くとも３回重複で実験を行った。相対細胞生存度を対照グループを100％と定義して計算した。
9.1（ｂ）（２）定常状態蛍光異方性の測定
PBS中１×105細胞／mlの細胞懸濁液をテトラヒドロフランに溶かされたDPH-PA（３〔ｐ−（６−フェニル）−１，３，５−ヘキサトリエニル〕フェニルプロピオン酸）を、0.1μＭの最終濃度で加えることによりラベルし、37℃で10分間、インキュベートした。加えた有機溶媒の量はその細胞膜への効果を避けるため0.05％とした。ジフェニル−ヘキサトリエン成分が脂肪アシル鎖の上側部分の間に差し込まれると共に、DPH-PAを形質膜の外側リーフレット内に主に局在化させるプローブの特性を変化させるために、膜プローブDPH-PAを選択した（Kitagawa,S.,et al.J.Membrane Biol.119:221〜227（1991））。DPH-PAは、脂質との結合により強い蛍光の増加を示し、脂質配列の関数として蛍光異方性を測定する手段を供する。励起における偏光子及び２つの発光経路を備えたQuanta Master QM-1 T-formatルミネセンススペクトロメーターを用いて蛍光測定を行った。励起及び発光波長は各々360nm（５nmスリット幅）及び430nm（５nmスリット幅）であった。測定された蛍光強度をバックグラウンド蛍光及び非標識サンプルからの光散乱のために補正した。蛍光異方性を、
rs＝（IVV−G.IVH）／（IVV＋（2×G×IVH））
（式中、IVV及びIVHは、各々垂直方向に偏光された励起ビームに対して平行および垂直な偏光子で測定された観察された強度である。因子ＧはIVH／IHHに等しく、装置が異なって偏光された光を著しく透過することができないこと、及び２つの発光チャンネルのセンシティビティーの差を正す（Kitagawa,S.et al.J.Membrane Biol.119:221〜227（1991））。IHV及びIHHは、励起偏光子が水平にセットされた場合の発光偏光子の垂直及び水平位置で測定される蛍光強度である。）
として計算した。
9.1（ｂ）（３）統計分析
データを平均±SEMとして報告する。統計的比較及び計算をPosthoc Newman-Keulsテスト（Pharmacological Calculation System）での分散の一元分析により行った（Pharmacological Calculation System）。統計的有意性はｐ＜0.05として定義した。
9.1（ｃ）結 果
9.1（ｃ）（１）Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの細胞保護効果をテストするためのモデルとしての血清欠乏
血清欠乏WEHI及びH9c2細胞は、各々74.8％及び50.5％の相対細胞生存性を示した。10-5ＭのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートが培養培地中に存在する場合、その投与はほとんど全てのWEHIの生存性（93％）及びH9c2心筋細胞の高い保護（82.75％）となった。両方の細胞系における血清欠乏による相対的細胞生存性の減少及びそのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートによる保護は重大であった。
9.1（ｃ）（２）血清欠乏哺乳動物細胞の流動性へのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果
培養された哺乳動物細胞の形質膜流動性への血清欠乏の効果を検査するために、蛍光異方性測定を、形質膜プローブDPH-PAを用いて行った。細胞形質膜の物理特性は血清欠乏により大きく変わった。血清欠乏は、研究された両方の細胞モデルにおける形質膜流動性の異常な増加であるDPH-PAの蛍光異方性の減少を促進した。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの添加により、我々は、膜の物理的状態のほとんど完全な保護を観察した。これらの変化は、細胞生存度に示される傾向と明らかに一貫していた。
9.1（ｄ）議 論
代謝不全がおこることにより、研究された両方のタイプの細胞における通常の培養培地の欠乏は、MTT法でテストされたようにそれらの生存能を減少させた。この効果は、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの添加によりほとんど十分にもとに戻された。血清の欠乏は、心筋障害を伴う膜機能不全に寄与することが知られている形質膜の流動性の主要な変化も導く。対照的に、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート中で増殖した血清欠乏細胞は、それらの通常の形質膜の物理的状態を部分的に保護（又は保持）することができる。
実施例10：STZ糖尿病のラットの肝臓中のGRP-94のレベルへのインスリン及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果
10.1 背 景
小胞体（ER）の機能に逆の影響を与える無酸素グルコース欠乏及びいくつかの他の条件は、グルコース調節クラスのストレス蛋白質の合成を誘導する（Lin.H.Y.,et al.Mol.Biol.Cell.4:1109〜1119（1993））。90kDaのストレス蛋白質と50％の相同性のGRPの94kDaのメンバーGRP-94は、ERの内腔のカルシウム結合性蛋白質である。ERの他の蛋白質と共に、GRP-94は分子シャペロンとして機能するようである（Nigem.S.K.et al.J.Biol.Chem.263:1744〜1749（1994））。分子シャペロンGRP-94の蓄積はラットのSTZ糖尿病により誘導される細胞障害の修復への有利な効果を有するはずであることが仮定される。従って、本明細書に示される実験において我々は、健康体、糖尿病、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理、及びインスリン＋Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理ラットから得られたGRP-94の種々のレベルを比較した。
10.2 材料及び方法
10.2（ａ）テスト物質：Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（BIOREX Ltd.）
インスリン（Protophane HM inj.）
10.2（ｂ）動物：Crl（VAFplus）Wistar雄ラット（250〜300ｇ）
動物を12／12時間の明−暗サイクルで50〜60％相対湿度で23〜25℃でカゴ当り７匹を収容した。食物及び水道水は自由に取ることができる。
10.2（ｃ）糖尿病の誘導：単一投与のSTZ（45mg／kgi.v.）を断食状態で与えた。
10.2（ｄ）動物を次のグループに分けた：
ａ．健康な動物
１．１週間、塩類溶液で処理した健康体（ｎ＝５）
２．２週間、塩類溶液で処理した健康体（ｎ＝５）
３．４週間、塩類溶液で処理した健康体（ｎ＝５）
４．１週間、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理したもの（ｎ＝７）
５．２週間、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理したもの（ｎ＝７）
６．４週間、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理したもの（ｎ＝７）
ｂ．STZ−糖尿病動物
７．１週間、塩類溶液で処理した糖尿病体（ｎ＝５）
８．２週間、塩類溶液で処理した糖尿病体（ｎ＝５）
９．４週間、塩類溶液で処理した糖尿病体（ｎ＝５）
10．１週間、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理した糖尿病体（ｎ＝７）
11．２週間、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理した糖尿病体（ｎ＝７）
12．４週間、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理した糖尿病体（ｎ＝７）
ｃ．インスリン処理したSTZ−糖尿病動物
13．１週間、インスリン処理した糖尿病体（ｎ＝７）
14．２週間、インスリン処理した糖尿病体（ｎ＝７）
15．４週間、インスリン処理した糖尿病体（ｎ＝７）
ｄ．Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理及びインスリン処理した糖尿病動物
16．１週間、インスリン及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理した糖尿病体（ｎ＝７）
17．２週間、インスリン及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理した糖尿病体（ｎ＝７）
18．４週間、インスリン及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理した糖尿病体（ｎ＝７）
処理の後、肝臓を除去し、直ちに液体窒素中で−70℃に凍らせた。（適用可能な限り）Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理（20mg／kg／日、p.o.）。インスリン処理：通常のグルコースレベルを維持するのに必要とされる投与量において１日２回。
10.2（ｅ）GRP-94のレベルの測定
ラット肝臓からの全ての可溶性蛋白質の抽出
全てのステップを０〜４℃で行った。ラットの肝臓（約15〜20ｇ）を50mM Tris-HCl、pH8.0、5mM EDTA、150mM NaCl、0.1％ SDS、１％ Triton X-100及び１mMプロテアーゼインヒビター（PMSF、ベンズアミジン、アミノ−カプロン酸）を含む改良された単一界面活性融解緩衝液80ml中で２分間、家庭用ミキサーでホモジナイズした。そのホモジネートをServile RC28S遠心機で30分間、20000×ｇで遠心した。その上清のほとんどを保存サンプルとして−20℃で凍結させた。１mlを分析のために用いた。
蛋白質濃度をBradfordアッセイ（Guide to Protein Purification,Methods in Enzymology,vol.182,M.P.Deutscher（Ed.）,Academic Press（1990））により３つ平行して測定し、５mg／mlに調節した。
電気泳動及びイムノブロッティング
電気泳動及びイムノブロッティングは、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Ed.Sambrook,Fritsche,Maniatis,Bold Spring Harbor Laboratory Press（1989）;Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane,3.Laboratory Manual,Millipore;and U.K.Laemmli,Nature:227:680-685（1970）に詳細に記載される。1.8mgの蛋白質からなる各々のサンプルを、110mM Tris-HCl pH6.8、8.3mMメルカプトエタノール、３％ SDS、３％グリセロール及びいくらかのブロモフェノールブルーを含む0.6mlの緩衝液でゲル電気泳動のために可溶化し、30分間、室温で振とうした。一晩、一定ボルト数50Ｖで、レーン当り30μｇの蛋白質で８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行った。蛋白質をクーマシーブリリアントブルーR-250で染色するか、又は転移緩衝液（10mM CAPS pH11、10％メタノール）中で４℃で３時間、一定電流（300mA）でImmobilone PVDF膜（Millipore）に移すかのいずれかを行った。その膜の非特異的部位を一晩、４℃でTPBS（0.1％ Tween 20を有するリン酸緩衝塩類溶液）中２％ BSAでブロックした。そのブロットを室温で１時間、１：3000に希釈されたGRP-94モノクローナル抗体（SPA-850，StressGen）と共にインキュベートした。次に更に１時間、TPBS緩衝液で洗浄した後、１時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合抗ラット第二抗体（Sigma、１：4000希釈）と共にインキュベートした。TPBSで連続的に洗浄した後、その膜をECLシステム（Amersham）で展開した。
一連の全蛋白（９／１サンプル）希釈物をブロットし、毎時間、サンプルと平行して展開し、検量線を計算した。ストレス蛋白質含量の変化を、Bio-Radデンシトメーターモデル1650及びHewlett-Packard Integrator（11P 3394A）を用いて定量し検量線に従って補正した。
統計分析
データは平均±SEMとして報告される。統計的比較及び計算をPosthoc Newman-Keulsテストでの分散の一元分析により行った（Pharmacological Calculation System）。統計的有意をｐ＜0.05として定義した。
10.3 結 果
相対GRP-94含量の大きな減少が１週、２週及び４週間の糖尿病のラットにおいて観察される。１週及び２週間の糖尿病動物におけるこの効果は、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理により完全に元に戻り得た。１週及び２週間のサンプルにおけるインスリン単独又はＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートとの組合せでの投与は、対照の状態と比較してこの蛋白質のレベルをほぼ二倍にした。
先の発見と反対に、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートアセテートのみによる４週間のラット糖尿病体の処理は、GRP-94の相対量の大きな変化は生じなかった。更に、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートでの処理の有無にかかわらず、両方のインスリン処理したグループにおいて、我々はGRP-94の対照レベルへの回復を観察した。
実施例11：熱及びUV光への露出による損傷に対して上皮細胞を保護することにおけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果
11.1 材料及び方法
通常のヒトの成人の皮膚由来のアンキュプロイド（ancuploid）ヒトケラチノサイト細胞系であるHaCaT細胞系を同時に不朽化する（Boukamp et al.,J.Cell Biol.106:761〜771（1988））。HaCaTは十分な上皮分化能力、通常のケラチン形成及び非腫瘍形成特性を有する細胞系である。この高いジスラノールセンシティビティーを有する迅速に増殖するケラチノサイト系は、ステロイドレセプターの存在も特徴とする。HaCaT細胞（35mmの直径のペトリ皿当り４×105細胞）を種つけし、37℃において、５％ CO2の加湿雰囲気下で５％胎児ウシ血清が供されたDMEM（５％胎児ウシ血清）中で増殖させた。プレート後24時間に、その培養物をPBSで洗浄し、熱又は光で処理した。
その細胞の集密的培養物を熱（42，44，46，47，48℃）又はUV光（UVA １，２，４，６Ｊ／cm2）に露出した。熱露出は、循環する水経路において供した。UV光源として、365nmにピークがある320〜390nmの間の最終出力のエネルギースペクトルでのWaldman PUVA 4000を用いた。エネルギー出力をUVA及びUVBセンサーを備えたIL-1700ラジオメーターによりモニターした。
細胞の形態を位相差顕微鏡（Plan-Apochromat Ph位相差対物レンズを備えたOpton Axiplan Microscope）を用いてモニターした。次の因子を細胞毒性の示標として考慮した：（ａ）付着細胞の密度の減少；（ｂ）細胞間距離の拡大に伴う規則正しい“丸石（cobble-stone）”パターンの喪失；（ｃ）細胞の形状の変化、例えば妨げられた細胞の広がり、膨張、核濃縮性収縮、分断；並びに（ｄ）細胞計質の変化、例えば凝集又は空胞化。細胞生存能もTrypan-blue排除テストを用いて検査した。
11.2 結 果
熱ストレスに対するHaCaTケラチノサイトのセンシティビティーを、それらの生存能を検査することにより決定した。その結果は、48℃の温度で熱に露出された後24時間において、37℃での対照（100％）と比較して生きた細胞は事実上なかった（2.7％）。45℃の熱露出後24時間のHaCaTケラチノサイトの生存能は59％であった。熱露出後１時間、HACaT培養物における形態変化はなかった。45℃以上の熱処理後24時間において、HaCaTケラチノサイトの細胞間空間の拡大、膨張、核濃縮性収縮、及び空胞化を伴う規則正しい“丸石”パターンの喪失のような有意な（ｐ＜0.01）細胞分離及び形態変化がおこった。UV露出の後、生存可能な細胞の減少がUVAに直接相関することが見い出された。
細胞を熱（１時間、42℃）又は（１時間、５×10-5Ｍの濃度における）Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートで予め処理することは、その細胞に48℃の熱露出に対する保護を供した。48℃処理の後24時間に細胞を検査した場合、未処理の細胞と比較して、細胞生存率は、48％（42℃で前処理した場合）及び84％（Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートプレ処理したもの）まで増加した。組合せの処理（42℃及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートでのもの）の場合に最も大きな保護（生存率の140％の増加）が観察され得た。
42℃で熱処理するか、44℃及び45℃で行わなかったものは、UV光による細胞毒性の主要な削減を導いた。42℃での処理は、２及び４Ｊ／cm2の両方の保護を供した。プレ処理したHaCaTケラチノサイトの生存率は、プレ処理なしでUV露出した細胞と比較して、132％（２Ｊ／cm2）及び218％（４Ｊ／cm2）に増加した。
実施例12：ヒト皮膚組織における分子シャペロン発現を誘導することにおけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果
紫外UVB光（290〜320nm）は太陽光の構成物の１つであり、皮膚に損傷を与えることが知られている。UVB露出により皮膚組織に引きおこされる損傷を削減することにおけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの役割及び皮膚組織における分子シャペロンの発現を増加させることにおけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果を研究した。
12.1 材料及び方法
ヒトの皮膚組織を免疫欠損（SCID）マウスに移植した。実験手順は、７日間の溶媒NaCl溶液（300μｌ）とのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（5.0mg／kg.i.p.）及び他のものでの処理に関する。８日目に、両方のグループのマウスを24時間、UVB光（100mJ／cm2）に露出し、その露出の後、組織学的（ヘマトキシリン及びエオシンで染色されたセクション）、及び免疫組織学的実験（モノクローナル抗体（mAB）での間接的イムノフルオレセンス技術）のために皮膚バイオプシーを取った。
12.2 結 果
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートでプレ処理されたUV照射マウスにおいて、UV露出による損傷の臨床的症状は観察され得なかった。反対に、未処理の動物の１つにおいて、移植された領域の膿疱性反応が見い出された。更に、mABhsp72を用いる間接的イムノフルオレセンス研究は、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理した動物のヒト及びマウス皮膚の基底膜ゾーンに沿った激しい直線状の染色を示した。同じ反応は未処理の動物の皮膚において観察され得なかった。更に、顆粒球の染色の核の１つのタイプが未処理の動物の膿疱（炎症性皮膚反応）中に存在した。
従って、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの皮膚組織への投与は、皮膚組織におけるhsp72の形成を増加させ、UV露出からの損傷に対する保護を供した。
12.3 皮膚からのHSP-70のレベルの決定：SCIDマウスに移植されたUVB及びUVB＋Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理したヒト皮膚から得られた蛋白質のウエスタンブロット分析
方 法：
ａ．皮膚からの全ての可溶性蛋白質の抽出
全てのステップを室温で行った。皮膚（約９〜35mg）を小さな断片に切断し、２倍濃度のLaemmli緩衝液（65mM Tris-HCl、pH6.8；５％ β−メルカプトエタノール；２％ SDS；10％グリセロール；0.1％ブロモフェノールブルー；これら全ての材料はSigmaの製品である）中（２μｌ／μｇ皮膚）で２分間、エッペンドルフチューブ中ですりガラス乳棒でホモジナイズした。次にサンプルを連続的に振とうしながら、更に60分、可溶化した。そのホモジネートをゲルに充填する前に10分間、10,000rpmで遠心した。
ｂ．電気泳動及びイムノブロッティング（５，７，８）
一晩、一定ボルト数（50Ｖ）でレーン当り10μｌのサンプルで８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行った。
蛋白質をクーマシーブルーR-250で染色し、又は転移緩衝液（10mM CAPS pH11、10％メタノール）中で４℃３時間、一定電流（300mA）でImmobilone PVDF膜（Millipore）に移すかのいずれかを行った。
その膜の非特異的部位を、４℃で一晩、TPBS（0.1％ Tween 20を有するリン酸緩衝塩類溶液）中２％ BSAでブロックした。そのブロットを室温で１時間、１：1500に希釈されたHSP-70モノクローナル抗体（SPA-8dc…StressGen）と共にインキュベートした。次に更に１時間、TPBS緩衝液で３回、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合抗マウス第２抗体（Sigma、１：1500希釈）と共に１時間、インキュベートした。
TPBSで連続的に洗浄した後（３回）、その膜をECLシステム（Amersham）で展開した。
実施例13：HSP形成の活性化及び酸化的リン酸化の保護におけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果
13.1 背 景
サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞をヒートショックにさらすこと（５分、42〜44℃）が、酸化的リン酸化及びミトコンドリア電子伝達系のカップリングの障害を引きおこし、細胞がATPを合成する能力に影響を与えることが示されている（Patriarca et al.,Biochemistry and Cell Biology,70:207〜214,1992）。しかしながら、細胞をヒートショックの前に37℃で短時間、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートでプレ処理した場合、それは、カップリングの障害を減らし、ミトコンドリアのATP合成を保護した。ヒートショックの間の細胞質のRNA又は蛋白質合成の阻害は、このミトコンドリア活性の保護を防ぐようである。従って、hspの役割の１つは、細胞が生理的ストレス、例えばヒートショックにさらされた場合に妨害される酸化的リン酸化及びミトコンドリアの電子伝達系のカップリングを保護することのようである。
このセクションにおいて、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートは、ヒートショックにさらされる前に細胞に投与され、熱ストレスに対してミトコンドリアの伝達系との酸化的リン酸化のカップリングを保護することへのその効果が検査される。
AP-1及びＰ１転写因子の活性が種々のストレス条件にさらされたイースト細胞においてＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートにより変調され得るか否かも研究した。
13.2 材料及び方法
サッカロマイセス・セレビシアエにおける酸化的リン酸化及びミトコンドリアのATP合成の損傷を決定するための実験プロトコルは、引用により本明細書にその全てが組み込まれるPatriareaら、Biochemistry and Cell Biology,70:207〜214,1992に供される。
25℃に維持されたＳ．セレビシアエ細胞に種々の濃度のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを導入し（10〜100μＭの濃度）、次に細胞をＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの存在下で25℃で１時間、インキュベートした。次に温度を42℃まで上げて、Patriareaの引用文献に記載されるように、オキシグラフ測定を行った。
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートで処理した細胞を、ノーザンブロット法を用いてhsp遺伝子の同時誘導についてテストした。抽出し、真核細胞からmRNAを精製し、そしてノーザンブロット法を用いてこのように得られたRNAを分析する方法は、当該技術で公知であり、その両方が本明細書に全て組み込まれるManiatis及びMarescaら、Archires Medical Research 24:247〜249（1993）に記載される。ノーザンブロットのプロトコルは先の実施例７にも記載され、Hsp26及びhsp70 DNA配列をプローブとして用いた。
13.3 結 果
13.3.1
図４は、Ｓ．セレビシアエにおいて誘導されたhsp26 mRNAのノーザンブロット分析であり、本実験から得られた結果を示す。細胞に投与された化学化合物の濃度及びインキュベーションの持続時間を示す。
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの存在下で５分〜１時間、25℃でインキュベートされた細胞において、hsp26の誘導が観察された。その結果は、５分のインキュベーションの後でさえ誘導がおこることを示すようでもある。
10〜100μＭのテスト化合物の濃度が、ヒートショックを生ずる酸化的リン酸化とミトコンドリアの電子伝達系との間のカップリングの損傷を減少するのに有効であることも見い出された。ミトコンドリアのATP合成の損傷からの保護は、熱耐性がそれらを37℃の中間の温度にさらすこと（40〜60％保護）により細胞をプレ処理することにより誘導される場合に得られた範囲内であった。
13.3.2
（ａ）アデニル酸シクラーゼ及び（ｂ）ウシ甲状腺形質膜の物理的状態へのベンジルアルコールの効果を図５に示す。（ａ）アデニル酸シクラーゼ活性及び（ｂ）ウシ甲状腺形質膜の物理的状態へのベンジルアルコールの効果。アデニル酸シクラーゼ活性の変化（ａ）は、基底状態（○−○）、TSH刺激（−）、ホルスコリン（forskolin）刺激（△−△）、コレラ毒素刺激（▽−▽）、及びフルオライド刺激（◇−◇）酵素活性について示される。その膜を、カップリング因子を加える前に薬剤と共にインキュベートした。膜の物理的状態を、膜内に埋め込まれたいくつかの蛍光団の定常状態蛍光異方性（ｂ）に従うことにより評価した：DPH（○−○）、12-AS（−）及びTMA-DPH（△−△）。測定は37℃で行った。蛍光団／脂質モル比は常に１：500であった。
13.3.3
我々の実験は、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートがAP-1の活性へ大きな影響を及ぼし、その効果が細胞の実際の代謝状態により決定されることを証明した。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートが、栄養素の供給が不適切であるなら、AP-1の活性を増加させ、豊かな培地なら、その因子の活性を減少させる。薬剤の効果は濃密な遅い対数培地において最も促進される。反対の傾向がＰ１について見られ得る。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートが最小培地中の細胞に投与されたなら、その活性は減少した。Ｐ−１の下降調節がＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート誘導性AP-1活性化により機械的に引きおこされた細胞の抗ストレスにおける大きな変化により引きおこされた。Ｐ−１は全てのタイプのストレスに応答するが、その活性はテスト材料により影響を受けないことに注意のこと。特にAP-1での１つの重要な発見は、薬剤の生体内活性の多くの面を説明し、詳細に議論されよう。
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの組織培養におけるhsp遺伝子発現への効果（Ｂ）を図６に示す。Hela細胞にヒトhsp70遺伝子のプロモーターがルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合されるレポータープラスミド構成物を移入した。ヒートショック及び／又はＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートのhspプロモーターへの効果を、ルミノメーターにおいてルシフェラーゼの活性を測定することにより、及びウエスタンブロット上の（染色体遺伝子から発現された）hsp蛋白質レベルを測定することにより決定した。
サンプルは：
１：無DNA対照；２：ｔ0において10μｇ DNAを移入、ヒートショックなし；３：t0において10μｇのDNAを移入、24時間後60分のヒートショック；４：先の通り＋ｔ0においてＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）；５：ｔ0において10μｇのDNAを移入＋ｔ0においてＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）；６：ｔ0において10μｇのDNAを移入、24時間後に60分のヒートショック、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）をヒートショックの時に加える；７：ｔ0において10μｇのDNAを移入、24時間後60分のヒートショック、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）を０時、及びヒートショックの時に加える；８：ｔ0において10μｇのDNAを移入、ヒートショックなし、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを０時及び24時間後に加える。
実施例14：腫瘍細胞中で分子シャペロンを誘導することにおけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果
非致死的ヒートショックは、NK細胞により媒介される溶解へのセンシティビティーを増加させ、ヒートショック＋Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートでの処理は、K562細胞の溶解性に協同的効果を有する。（hsp72特異的モノクローナルAbを用いる）生体内抗体ブロッキング研究は、NK−溶解の強力な阻害を示すので、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートで説明されるこの更なる効果は、hsp72の形質膜発現の上昇から明らかに生ずる。
図７において、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）のヒートショック誘導性hsp72レベルへの効果が示される。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート単独ではhsp72レベルを増加させなかったが、ヒートショックとＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理との組合せはヒートショックのみと比較してhsp72発現の大きな増加を生じた。
14.1 背 景
ヒートショック蛋白質は、それらが種々のシャペロニン機能を行う細胞質に局在化していることが知られている。しかしながら、腫瘍細胞において、hspは細胞膜の表面上にも発現されることが報告されている（Ferrarni,M.et al.Int.J.Cancer,51,613619,（1992））。実験は、細胞表面上で増加したhsp（例えばhsp70）が非致死的ヒートショックへの腫瘍細胞の露出により誘導され、この増加が腫瘍細胞に対するIL-2特異的CD-3ナチュラルキラー細胞（NK）のセンシティビティーの増加と相関することを示すようである。NK細胞は生体内で腫瘍細胞に侵入してそれを殺すことに関与することが報告されており（Kurosawa,S.et al.Eur.J.Immunol.23:1029（1993））、この腫瘍細胞に対するNK細胞のセンシティビティーの増加がNK細胞による腫瘍細胞のより優れた標識づけを許容する。これにより、hspの発現が細胞表面上のhspの増加と共に腫瘍細胞中に誘導され得るなら、それは、NK細胞によるこれらの細胞のより優れた標識づけ及びそれらを殺すことを許容し得る。このセクションにおいて、腫瘍細胞におけるhsp72の発現を誘導することにおけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果を検査する。
14.2 材料及び方法
割球期における慢性骨髄白血病の患者から得られた骨髄腫瘍細胞系のヒトK562細胞（ATCC．CCL243）を用いた（Lozzio.BC an Lozzio,BB Blood 45:321,1975）。指数的に増殖中の細胞を非致死的温度（42℃）で２時間、５×10-5ＭのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートで処理した。37℃で16時間の回収期間の後、細胞を、フローサイトメトリーによりhsp72のレベルについてテストした（Multhoff et al.,Int.J.Cancer:61,272〜279.（1995））。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートでの処理は、腫瘍細胞におけるhsp72のレベルを増加させた。
実施例15：脂質膜とのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの相互作用。単層研究。
15.1 背 景
ストレス（物理的、病理学的等）がシグナルとして検出され、転写装置に導入されるメカニズムは従来知られていない。膜結合蛋白質の構造及び機能を決定する膜脂質マトリックスの物理的状態は温度変化の認知に直接関連し、ヒートショック（HS）条件下において膜構造の不安定状態がHS遺伝子の転写を誘導するシグナルのトランスダクションを引きおこすことが仮定された。ストレス耐性の誘導と平行して、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートは、いくつかのシャペロン遺伝子の発現を上昇調節することにより種々のストレス条件を検出しシグナルを送る細胞の効能を増加させることが示された。
空気−水界面に広がった単一分子脂質層を用いる単層技術は、膜と膜活性剤との間の相互作用の存在を確認するための有効な道具である。二層システムのふるまいは、多くの点（膜構成物の分子領域、ホスホリパーゼ作用、挿入された分子の方向等）で各々の単層システムのそれと極めて類似する。単層内に挿入された分子により引きおこされる表面圧の変化を測定することにより、その相互作用の分子の寸法を研究することが可能になる。
ストレス応答におけるいくらかのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートにより媒介される早期の誘発が細胞膜内でおこり得るという仮定の重大な必要条件は、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの膜構成物との直接的な物理的相互作用に基づく証拠を供することである。本研究の目的は、生物膜のためのモデルシステムとして異なる脂質単層を用いることにより、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの膜との相互作用を研究することであった。
15.2 材料及び方法
本質的に記載されるように、KSV3000 Langmuir-Blodgett装置（KSV Instrumenes Ltd.,Helsinki,Finland）において、25℃で6.5mlの容量及び8.8cm2の表面領域でTeflon皿において単層実験を行った。１，２−ジパルミトイル−Sn−グリセロ−３−ホスホコリン（DPPC）、卵黄ホスファチジルグリセロール（EggpG）又はウシ心臓カルジオリピン（BHCL）からなる単分子層を、10mMのNa−ホスフェート（pH7.0）のサブ相上に要求される開始表面圧を供するため、クロロホルム脂質溶液から広げた。そのサブ相をマグネチックバーで連続的に撹拌した。H2Oに溶かしたＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートをサブ相につないだTeflonチャンバー内の穴を通して単層の下に加えた。注入した容量は、常に全サブ相容量の１％未満であった。プラチナプレートを用いるWilhelmy法により、表面圧を測定した。Langmuir-Blodget測定システムのLB5000ソフトウエアーにより、生のデータファイルから表面圧増加データを注出した。
15.3 結 果
異なるリン脂質とのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの相互作用を、空気−水界面に広げた脂質単層の薬剤誘導性表面圧増加を測定することによりテストした（図８）。本研究における単層はDPPC、EggPG及びBHCLから形成されており、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの増加量を２つの濃度（10-6Ｍ，10-5Ｍ）でそのサブ相に加えた。脂質相の下への薬剤の添加は、全ての場合において、サブ相におけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの濃度に依存する表面圧増加を生じた。しかしながら、異なる脂質単層の表面圧プロファイルにおける顕著な差があった。両性イオン性DPPCの場合、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの注入の後圧力が迅速に変化し、次に一定レベルに保たれた。負電荷のBHCLを含む単層を用いることにより、その表面圧プロファイルは、約２分間、圧力が増加する典型的な挿入速度論を示し、その後平衡レベルに達した。PGの存在において、薬剤の挿入速度論は、BHCLで観察されたものと類似したが、特定の値に達した後、圧力は減少し始めた。圧力の減少の比率は、サブ相における薬剤の濃度に依存した。この現象の１つの可能な説明は、純粋な脂質単相の開始圧に達した後でさえ、圧力の減少が続いてからの、その界面からのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート−EggPC複合体の除去である。
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの脂質単層との特異的相互作用を更に研究するために、異なる開始表面圧において、薬剤誘導性表面圧増加を測定した（図８）。高い開始表面圧へ外挿する方法は、もはや単層内に挿入され得ない分子のための限定的挿入圧の評価を許容する。外挿された限定的開始表面圧は、BHCL及びDPPCについて各々89mN／ｍ，39mN／ｍであった。負電荷のBHCLを含む単層の場合、圧力増加は、静電相互作用の重要さを示すことにより両性イオン性DPPCについて見い出されたものより常に高かった。
我々の研究は、生理的に関連する濃度におけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの投与に基づいてそれがヘッド基特異的様式で脂質膜と相互作用することができるという第１の証拠を供する。
図８において、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）と単分子脂質層との相互作用を示す。矢印において、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートを示される濃度においてサブ相に加えた。異なる開始圧におけるBHCL又はDPPCの単層の下へのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）の注入の後に表面圧の増加が示される。サブ相におけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート濃度は10μmolであった実験データの線形回帰分析は、BHCL及びDPPC単層各々について0.884及び0.995の相関係数を生じた。
実施例16：細胞毒性サイトカイン及びシクロヘキシミドに対するＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの保護効果
16.1 背 景
これらの研究の目的は、サイトカインの保護とＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートが保護するであろう病理学的変化との可能な関係を研究することであった。
我々のデータは、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートが細胞毒性サイトカインで処理された組織培養された細胞のための細胞保護剤であることを示唆した。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理はTNF処理したWEHI164（及び他の哺乳動物）細胞の生存比率を増加させた。この効果は濃度依存性であるか、薬剤濃度に直接比例するわけではない。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理により供される保護の程度は、細胞毒性サイトカインに対する処理された細胞の耐性の増加の傾向が全ての実験において明らかであったが、実験間で種々であった。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理により供される保護はそれほど高くなかったが、生きている動物においては、この程度の保護でさえ病理的過程を緩和する又は防ぐのに十分であり得よう。
16.2 研究の目的
STZ糖尿病及び対照動物からのマクロファージの血清TNFレベル及び誘導性を測定した。TNF活性は、糖尿病の最初の月の間、糖尿病でないラットのそれと比較してSTZ誘導性糖尿病ラット（年齢６〜18週）において大きく増加された。
16.3 結 果
糖尿病のグループの（ラジオイムノアッセイにより測定された）平均血清濃度は、健康な対照（345±48Ｕ／ml）よりかなり高かった（480±98Ｕ／ml）（Foss et al.1992 Braz.J.Med.Biol.Res.25,239はヒトの患者で同様の結果を報告した）。糖尿病グループにおいて、血清TNFレベルと糖尿病の持続期間との間に相関関係はなかった。我々は、L929細胞に基づく細胞毒性アッセイにより糖尿病動物の血清中に生物に活性なTNFを見い出されなかった。RIAと細胞毒性測定との間の差は、高レベルの可溶性TNFレセプターアンタゴニストの存在を示し、これは糖尿病の合併病におけるTNFの関連を示す。
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートは、イースト細胞への（及び異なる培養された通常の二倍体動物又はヒト細胞への）予期せぬ増殖効果を有していた。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの影響は、低濃度の成長阻害性抗菌サイトヘキサミドの存在に特に影響を与える。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート及びサイトヘキサミドの存在下で増殖したイースト細胞コロニーは、遺伝的変化の増加された頻度（抗生物質耐性変異）を示さず、蛋白質合成へのサイトヘキシミドの阻害効果に対するより高い代謝耐性を示すだけを示す。
我々の測定によれば、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果は、分裂促進因子及び異なるタイプのストレスの両方の効果を媒介するAP-1転写因子の活性の増加に起因し得る。その結果は、先のテスト化合物及び類似した化合物が、成長因子及び代謝ストレス条件の効果を維持することにより、AP-1及びおそらく他の転写因子のデティキシティー（detixity）に影響を与えることも示す。
図10において、LPSは、STZ糖尿病（１）及び通常（２）の動物から単離されたマクロファージの試験管内のTNF生産を誘導し、図11において、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートはシクロヘキシミドの増殖阻害効果に対するケラチノサイトの保護を誘導し、図12において、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）は、シクロヘキシミドの毒性効果に対する細胞（内皮細胞）の保護を誘導し、図13において、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）は抗生物質シクロヘキシミドの増殖阻害効果に対するヒト頸管HeLa細胞の保護を誘導し、図14において、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）は抗生物質シクロヘキシミドの成長阻害効果に対する心筋細胞の保護を誘導し、そして図15において、AB1380イースト細胞におけるＰ１転写因子活性へのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果が示される。Row6は平均値を表す。Row5は何もないことを示す。図16において、JF１イースト細胞におけるAP１転写因子活性へのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの効果が示される。Row11は平均値を表す。図17において、AB1380イースト細胞におけるＰ１転写因子活性へのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）の効果が示されるRow6は平均値を表す。Row5は何もないことを示す。
実施例17：単離されたラットの心臓におけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの心臓保護効果
17.1
本研究の目的は、単離された作動中のラットの心臓におけるＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの心臓保護及び抗不整脈効果を研究することであった。
17.2 方 法
10分の空気作動性灌流の後、心臓（各々のグループにおいてｎ＝10）に、10分間の冠状脈閉塞、次に0.05，0.5，5.0，20.0、及び50mg／ＬのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの存在下での３分間の再灌流を行った。
更なる研究において、心臓を単離する前、各々０及び５時間に、最も有効な（20mg／kg）投与量のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートでラットをプレ処理した。心臓の切除の後、先に詳説される冠状脈閉塞プロトコルにかけ、それらを20mg／ＬのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの存在／欠如下で灌流した。
別個の実験において、心臓ストレス、虚血、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート及びそれらの組合せの効果を心筋HSP-70蛋白質含量に基づいて研究した。単離した心臓を、15分の熱ストレス（42℃）、全体的に適温の虚血、及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート灌流の後、各々120及び180分再灌流した。
17.3 結 果
虚血の前に、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートは、ベル形状の濃度応答関係で冠状脈の流れ（CF）を増加させた。他の心機能のパラメータは、低濃度の薬剤により変化されなかった。50mg／ＬのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートは、虚血の前に大きな徐脈、大動脈の流れ（AF）及び＋dP／dtmaxの減少、並びに左心室の拡張終期の圧（LVEDP）の増加を生じた。対照のグループにおいて、冠状脈閉塞は、CF，AF，＋／−dP／dtmaxを減少させ、LVEDPを増加させた。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートはベル形状の濃度応答関係で心機能の虚血で導かれる悪化を緩和した。20mg／Ｌの濃度のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートは、最も顕著な抗虚血効果を示した。10分の冠状脈閉塞の後の再灌流は、対照のグループの全ての心臓における心室の線維攣縮（VF）を誘発した。より高濃度のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートは、投与量依存性の抗不整脈効果を生じた。
１時間のプレ処理の後、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートはなお心臓保護を供し、その化合物の急性的効果の可能性を示した。プレ処理後５時間、心臓保護効果は観察され得なかったが、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート灌流の急性的効果のいくらかは増加された。
本化合物のみでは、心筋のHSP-70含有量を増加させなかった。心筋のHSP-70含有量は熱ストレスのため著しく増加したが、虚血はゆるやかなHSP-70の上昇を生じた。しかしながら、虚血が20mg／ＬのＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの存在下で誘導された場合、HSP-70含有量は熱ストレス後に見い出されるのとほぼ同じレベルまで増加した。
我々は、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートが抗虚血及び抗不整脈効果を発揮すると結論づけた。20mg／Ｌの濃度は、単離されたラットの心臓において著しい抗虚血及び抗不整脈効果の両方を示すことが見い出された。本薬剤の直接的抗虚血効果が１時間後に消滅する場合、それはなお急性的Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理により供される保護の程度を増加させる。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート及び虚血ストレスは、一緒にラットの心臓におけるHSP-70の迅速な新たな合成を誘導する。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートのみはHSP-70合成に影響を与えない。
図18〜19において、ウエスタンブロッティングにより測定されるhsp蛋白質レベルは、対照、ヒートショック、虚血処理、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）並びに虚血＋Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理（虚血＋Ｂ）ラットの２（図18）又は３時間（図19）の回復により示される。
実施例18：皮膚損傷の防止及び修復におけるシャペロンブースターＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート；ヒト皮膚を移植された激しく合併した免疫欠損病マウスにおける紫外線Ｂ保護及び糖尿病マウスにおける創傷治癒の加速。
18.1 背 景
Hspは環境的ストレスからの皮膚を生理的に保護する一般的役割を演ずるようである。分子シャペロンとして、それらは、機械的外傷、光、熱及び化学的傷害、感染等のような種々の曝露により引きおこされる損傷の防止及び修復に関与する（E.V.Maxtin,JID104：448,1995）。糖尿病のような病理学的条件において、特定のhspの減衰された機能が報告されている（M.Cherian and E.C.Abraham,Biochem.Biophys.Res.Com.212:184,1995）。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートはシャペロンブースターとして作用することが示されている（Vigh et al.,in prepatation）ので、我々は、本薬剤がほとんどの種々の保護及び修復メカニズムを増強することができると予想した。
本研究の目的は、
（ｉ）激しく合併した免疫欠損病（SCID）マウスに移植されたヒト皮膚におけるUVB光誘導性皮膚傷害に対する保護において、
（ii）STZ−糖尿病ラットにおける破壊された創傷治癒過程の修復において、
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの（ｉ）全身及び（ii）局所的投与の効果をテストすることである。
（ｉ）Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（5.0mg／kg.i.p.）又はビヒクルにより処理されたヒト皮膚移植SCIDマウスをUVB光（100ml／cm2）に露出した。24時間後、皮膚バイオプシーを、免疫組織学的及びウエスタンブロッティング技術を用いて組織学的検査のため、及びhsp72測定のためにとった。Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートでのプレ処理は、臨床的及び組織学的に決められたUVB光誘導性皮膚傷害を防いだ。直線状の基底膜の強いhsp72染色が、イムノフルオレセンス技術により観察され得、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理した皮膚サンプルのウエスタンブロッティングによりhsp72の量の増加が測定された。
18.2 方 法
（ii）クリーム又はビヒクルを含む１％，２％又は４％のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの局部的適用により処理された、プローブを加熱（３mm直径；60℃；30，60及び90秒）することにより左右の胸郭の除毛した皮膚上に形成された部分へ全体厚の熱創傷を有するストレプトゾトシン誘導性糖尿病（STZ）ラットを自己調節の互いを比較する形態における創傷治癒を測定するのに用いた。創傷が閉じるのを写真により、及びデジタルエピルミネセンス顕微鏡技術を用いて記録した。創傷領域を熱傷害後48時間及び21日の面積測定により測定した。皮膚バイオプシーサンプルのhsp72のレベルをウエスタンブロット分析を用いて決定した。
18.3 結 果
クリームを含む４％のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートでの処理は、創傷が閉じるのを大きく加速し（ｐ＜0.01）、ビヒクル対照と比較して皮膚バイオプシーサンプル中のhsp72レベルを上昇させた。
我々の結果は、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートの投与がUV露出からの傷害に対する保護を提供し、創傷修復において、又は外科的介入の後の欠損を有する条件の臨床的治療のための潜在的治療適用性を有する。
図20，21，22において、クリームを含む１％，２％，４％のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）の効果が創傷治癒に基づいて示される。図23，24，25において、その結果は創傷のグレードに従って示される。
図26において、未処理及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）処理した創傷の写真を示す。
図27は、対照及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（１％，２％及び４％）処理した創傷からのバイオプシー試料のhsp72蛋白質レベルを示す。
図28において、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）処理の後のhsp72蛋白質の免疫組織学的評価が示される。
図29において、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（Ｂ）処理及び未処理（対照）のSCIDマウスの皮膚サンプルからのhsp72レベルを示す。
19．ストレスにさらされた細胞におけるHSP72発現への本発明によるヒドロキシルアミン誘導体の刺激効果の測定
ａ）細胞培養条件
適用した細胞から、3T3及びL-929マウス繊維芽細胞をMEM培地中で培養し、単層内で増殖させ、U-937ヒト白血病細胞を懸濁培地中RPMI-1640培地中に維持し、他方HeLaヒト上皮細胞をDMEM培地内に単層の形態で培養した。細胞培養を、細胞を先に言及される培地内で培養した以外は実施例6.2（ａ）に記載されるように維持した。
ｂ）実験の条件
薬剤処理の前及び後にストレスを適用する実験を行った。ストレスを熱により、化学薬剤、HgCl2処理により刺激した。テスト化合物は10-5Ｍ濃度で処理に適用した。
３日間のアッセイにより行われ、MTT（Cytotechnology 11：49〜58）により測定された細胞毒性研究は、全てのテスト化合物が10-4Ｍより大きい濃度で50％増殖阻害効果を有したことを示した。結果として、HSP72研究に用いた濃度は大きな細胞毒性効果を有しなかった。
19.1 熱ストレスでの実験
これらの実験を3T3及びL-929マウス繊維芽細胞、更にV-937ヒト白血病細胞に基づいて行った。
熱ストレスを適用する3T3細胞での実験を、ストレスを43℃の温度での30分の露出により誘導し、テスト化合物での処理を熱処理15分前又は100分後に行った他は実施例６の6.2（ｃ）点に記載されるように行った。
HSP72特異的SPA810（Stress Gene）第１及び西洋ワサビペルオキシダーゼ接合A9044（Sigma）第２抗体を用いて行った。デンシトメーター測定をLKB Ultrascan XLデンシトメーターにより行った。
結果を表２及び表３に要約する。
Figure 0004531865
Figure 0004531865
Figure 0004531865
Figure 0004531865
Figure 0004531865
Figure 0004531865
Figure 0004531865
表において、０は、処理が細胞中の±20％のストレス誘導性hsp72レベルだけ変わったことを示し、＋，++，+++はストレスにさらした対照に対するhsp72レベルにおける各々21〜50％，51〜100％及び100％超の増加を示す。
V-937白血病及びL-929マウス繊維芽細胞へのヒートショックを用いる実験を、これらのテストでの薬剤処理を熱ストレスより常に先に行った以外は先に記載されるのと同様に行った。化合物Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエートをこれらの実験条件下で10-5Ｍ濃度でテストした。
処理は、熱ストレス誘導性hsp72レベルの50％超の増加を生じた。
19.2 化学薬剤により誘導されるストレスでの実験
これらの実験は、ストレス応答を誘導するためにHgCl2を用いて、Hela、ヒト上皮及びV-939、ヒト白血病細胞で行った。薬剤処理を細胞をストレスにさらす前に行った。テスト培養物を調製し、3T3細胞での実験として行った。薬剤処理細胞を15分間；37℃でインキュベートした後、２つ（ストレス対照でないもの）を除く全ての培養物を0.5μｇ／ml濃度のHgCl2にさられ、インキュベーションを続けた。誘導された量のhsp72をストレスへさらした後６時間、測定した。適用された濃度のHgCl2は最大hsp72レベルの15〜30％を生じた。
HeLa細胞において、Ｎ〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ−ベンジミドイル−クロライドモノヒドロクロライド及びＮ−〔３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−３−ニトロ−ベンジミドイル−クロライドモノヒドロクロライドは、ストレスで誘導されたhsp72レベルを各々20％超及び50％超増加させた。
V-937細胞において、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート処理は、ストレス露出した対照に対してストレス誘導性hsp72レベルを20％超増加させた。
19.3 第１の組織外植片での実験
実験化合物での処理の後、熱ストレスを適用するこれらの実験は、ラット脾臓及び精巣組織外植片で行った。脾臓懸濁液での実験は次の通り行った。
体重200ｇのCFYラットの脾臓を無菌状態で除去し、MEM培養培地を含む10％胎児ウシ血清中でホモジナイズした。その細胞懸濁液の濃度を50〜100mg／５mlに調節した。
５mlの細胞懸濁液を直径６cmの培養皿の各々にとり、その外植片を37℃で加湿空気を含む５％ CO2において１時間インキュベートし、次に10-5Ｍ濃度のテスト化合物で処理した。37℃での更なるインキュベーションの後、その培養物をインキュベーター内で30分間、43℃でヒートショックにさらした。37℃で６時間の更なるインキュベーションの後、誘導されたhsp72の量を測定した。
結果を表４に示し、hsp72の増加レベルを表２及び３と同じスケールで評価する。
Figure 0004531865
ラット精巣外植片での実験は次の通り行った。
200ｇの体重のCFYラットの精巣を滅菌状態で除去し、その単離した精巣細管を、５ml懸濁液が50〜100mg組織を含むようにMEM培養培地を含む10％胎児ウシ血清中に懸濁した。その外植片を１時間、37℃において加湿した空気を含む５％ CO2中でインキュベートし、次にその培養物を10-5Ｍ濃度のテスト化合物で処理した。37℃における15分間の更なるインキュベーションの後、外植片を30分間、43℃でヒートショックにさらした。誘導されたhsp72の量を、37℃での更なる６時間のインキュベーションの後に測定した。
結果を表５に要約する。hsp72レベルの増加を表４と同じスケールで評価する。
Figure 0004531865
Figure 0004531865
Figure 0004531865
実施例20：遺伝的高血圧のラットの胸大動脈中のHSPmRNAのレベルの測定
遺伝的高血圧を有するラットを４匹の４つのグループに分けた。そのグループを第１のグループは生理食塩水で、第２のグループはＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート（20mg／kg）で８日間、第３のグループはＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−ベンズイミドイル−クロライドモノヒドロクロライド（５mg／kg）で20日間、そして第４のグループはＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−２−チオフェン−カルボキシイミドイル−クロライドモノヒドロクロライド（５mg／kg）で20日間、毎日経口的に処理した。動物を殺し、大動脈を単離し、液体窒素中でスキップ凍結し、使用するまで−70℃に保存した。
ｂ）胸大動脈の形態学的実験
文献の方法（Br.J.of Pharmacol.,1995:115,515〜420）に従って実験を行った。胸大動脈の１mm2領域を切除し、室温で2.5％グルタルアルデヒド中で固定した。後の固定を１％四酸化オスミウム中で１時間、行った。その組織をエタノール中で脱水し、Durcupan ACM中に浸した。Hitachi7100電子顕微鏡で写真をとり、定性的に評価した。
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−ベンズイミドイル−クロライドモノヒドロクロライド及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−２−チオフェンカルボキシイミドイル−クロライドモノヒドロクロライド処理が各々平均的及び強力な様式で大動脈の細胞の再生を容易にした。
ｃ）hsp70の定量的測定
定量的逆転写ポリメラーゼ鎖反応により実験を行った。本方法の原理は、２つの極めて類似するが区別可能なテンプレートが同じPCR反応において増幅されるなら、それらの生成物の比率はその過程の間、変化しないことである。そのテンプレートの１つの開始量が知られており、その生成物の相対量が測定可能である場合、未知の開始テンプレートの量が計算され得る。最も頻繁に用いられる方法において、周知のテンプレート（拮抗体）及び未知のテンプレート（標的）はその長さにおいてのみ異なり、その拮抗体が短かければ、結果としてPCR生成物はそれらの大きさに基づいて分離可能である。
RNAをグラニジウム−イソシアネート法（Chomczynski P.及びSacci N;Anal Biochem.162:156,1987）により組織から単離した。核酸の濃度及び量を、分光光度計により、及び変性条件におけるアガロースゲル電気泳動（Shambrook J.et al.:Molecular Cloning,A Laboratory Manual.Cold Spring Harbour Laboratory Press,1989）により測定した。単離されたRNAを−70℃に保存した。
内部配列をスプライシングで除くことにより、hsp-70コーディングcDNAからフラグメントを作製した（PCR−スプライシング、Riedy MC et al.:Biotechnigue 18:70,1995）。そのフラグメントを構成物の外側部分に特異的に結合するプライマーにより、−70℃に保存された生成物の濃度を測定した後、増幅した（Erlich A:PCR Technology,Principles and Applications for DNA Amplification Stockton Press,1989）。
ヘルプオリゴdT（dT16）プライマーと共に１μｇの単離RNA／サンプルを用いて、標準的条件により、逆転写を行った（Shambrook J.et al.,先と同じ）。
RNAサンプルから調製された等量のcDNAを種々の量の合成拮抗体（３，10倍連続希釈から得られたもの）と混合し、そのテンプレートをポリメラーゼ鎖反応により増幅した。サイクルの間に適用された温度は次の通りであった：変性（95℃、１分）、アニーリング（58℃、１分）、合成（72℃、0.5分）。
PCR増幅の後、その生成物をアガロースゲル（１％）上で分離し、標準的条件下でエチジウムブロミドにより染色した（Sambrook et al.,先に同じ）。染色されたDNAフラグメントを写真のためのUV−トランスイルミネーターにより視覚化した。PCR生成物の量を、写真のネガからデンシトメトリーにより測定した。
Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート、Ｎ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−ベンズイミドイル−クロライドモノヒドロクロライド及びＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−２−チオフェン−カルボキシイミドイル−クロライド−モノヒドロクロライド処理したラットの胸大動脈中のhsp-70レベルが対照動物中のhsp-70より５％高いことが観察された。
実施例21：モルモットの皮膚の老化への阻害効果の検査
皮膚の老化に基づく本発明による化合物の阻害効果をモルモットで検査した。グループ当り５匹の動物の皮膚を除毛して、１cm2領域を両側に100mJ／cm2の強度のUV-B源から照射した。照射の後、皮膚の１方の側を実施例10に従って作られ、５％（ｖ／ｖ）のＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ〕−３−ピリジンカルボキシイミドイルクロライドマレエート又はＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−ベンズイミドイル−クロライドモノヒドロクロライド又はＮ−〔２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ〕−２−ニトロ−ベンズイミドイル−クロライド−モノヒドロクロライドを含むクリームで処理し、他方動物の他の側を活性成分のない同じクリームで処理した。これは自己調節実験であった。
照射後直ちに処理を始め、２週間に２回、行った。
UV-B照射は、４日早く治癒した激しい皮膚障害（嚢、水疱、上皮の障害及び創傷形成）を生じ、その創傷の大きさは本発明による化合物で動物を処理した場合、かなり小さかった。その化合物は上皮の形成を容易にした。
本実験は、その処理が、UV-B照射に対する皮膚の耐性を増加させ、皮膚の再生を改善したことを示す。

Claims (6)

  1. 以下の式（Ｉ）：
    Figure 0004531865
    〔式中、
    ａ）
    Ｘはハロゲンであり、
    Ｚは化学的結合であり、
    Ａは、以下の式（ａ）：
    Figure 0004531865
    ｛式中、
    Ｙ1は、ハロゲン、Ｃ 1〜4 アルコキシ、トリフルオロメチルもしくはニトロであり、ｎは１又は２である｝により表される基、又は
    ５〜６員の、Ｏ含有ヘテロアリール、Ｓ含有ヘテロアリール、又はベンゼン環と縮合され得るＮ含有ヘテロアリール、又はＮ−Ｃ1〜4アルキル第４誘導体もしくはそのＮ−オキシドであり、
    Ｒは、以下の式（ｂ）：
    Figure 0004531865
    ｛式中、Ｒ5及びＲ6は互いに独立して、直鎖もしくは分枝鎖のＣ1〜4アルキル、又はＣ 5〜7 シクロアルキルであるか、又はＲ5及びＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって飽和ヘテロ環式５〜７員環を形成し、
    Ｙ6は、−ＯＲ7（式中、Ｒ7はＨ又はＣ 1〜4 アルカノイルである）である｝であり、
    但し、Ａがピリジル、又は以下の式（ａ）：
    Figure 0004531865
    ｛式中、Ｙ1はハロゲン又はＣ 1〜4 アルコキシである｝により表される基である場合、Ｒ7はＨ以外であり；又は
    ｂ）
    Ｘはハロゲンであり、
    Ｚは化学的結合であり、
    Ａは、以下の式（ｃ）：
    Figure 0004531865
    により表される基であり、
    Ｒは、以下の式（ｄ）：
    Figure 0004531865
    により表される基であり、その１つが分子内に存在しなければならない任意の置換基Ｙ2及びＹ3が、酸素又はＣ1〜4アルキルであり、そして前記化合物が二価カチオンである場合、そのアニオンは２のハロゲン化物イオンであり；又は
    ｃ）
    Ｘは、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立して、Ｈ、Ｃ 1〜4 アルキル又はフェニルである）であり、
    Ａは、Ｃ 1〜15 アルキル、Ｃ 1〜4 アルキルによって置換されたＣ 1〜15 アルキル、Ｃ 6〜10 アリール、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、Ｃ 1〜4 アルキル、Ｃ 1〜4 アルコキシもしくはＣ 1〜4 アシルアミノによって置換されたＣ 6〜10 アリール、Ｃ 7〜11 アラルキル、又はＣ 1〜4 アルコキシによって置換されたＣ 7〜11 アラルキルであり、
    Ｚは、酸素又は＝ＮＲ3（式中、Ｒ3はＨ又はＣ 1〜4 アルキルである）であり、そして
    Ｒは、以下の式（ｂ）：
    Figure 0004531865
    ｛式中、Ｒ5及びＲ6は互いに独立して、直鎖もしくは分枝鎖のＣ1〜4アルキル又はＣ 5〜7 シクロアルキルであるか、又はＲ5及びＲ6はそれに隣接するＮ原子と一緒になって飽和ヘテロ環式５〜７員環を形成し、
    Ｙ6は、Ｈ又は−ＯＲ7（式中、Ｒ7はＨ又はＣ 1〜4 アシルである）である｝により表される基である。〕
    により表される化合物。
  2. 前記Ａが以下の式（ａ）：
    Figure 0004531865
    により表される基であり、Ｙ1がトリフルオロメチルであることを特徴とする、請求項１に記載のヒドロキシルアミン誘導体。
  3. 前記Ｘがハロゲンであり、前記Ｚが化学的結合であり、そして、前記Ｒは以下の式（ｂ）：
    Figure 0004531865
    ｛式中、Ｒ5及びＲ6は互いに独立して、直鎖もしくは分枝鎖のＣ1〜4アルキルもしくはＣ 5〜7 シクロアルキルであるか、又はＲ5及びＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって飽和ヘテロ環式５〜７員環を形成し、
    Ｙ6 は、−ＯＲ7（式中、Ｒ7はＣ 1〜4 アミノアルカノイルである）である｝により表される基である、請求項１に記載のヒドロキシルアミン誘導体の光学活性立体異性体。
  4. 以下の式（Ｉ）：
    Figure 0004531865
    〔式中、
    Ｘは、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立して、Ｈ又はＣ 1〜4 アルキルである）であり、
    Ａは、Ｃ 7〜11 アラルキル、Ｃ 1〜4 アルコキシで置換されたＣ 7〜11 アラルキル、ベンゼン環と縮合し得る５〜６員のＮ含有ヘテロアリール、又は５〜６員のＳ含有ヘテロアリールであり、ここで該ヘテロアリールは１以上のＣ1〜4アルキル置換基を有してよく、
    Ｚは化学的結合であり、そして
    Ｒは、以下の式（ｅ）：
    Figure 0004531865
    ｛式中、Ｒ5及びＲ6は互いに独立して直鎖もしくは分枝鎖のＣ1〜4アルキル又はＣ 5〜7 シクロアルキルであるか、又はＲ5及びＲ6はそれに隣接するＮ原子と一緒になって更なるヘテロ原子及びＣ1〜4アルキル置換基を有し得る飽和ヘテロ環式５〜７員環を形成し、
    Ｙ4は、Ｈ又はＣ1〜4アルキルであり、
    Ｙ5は、Ｃ1〜4アルキル又は−ＯＲ7（式中、Ｒ7はＨ又はＣ 1〜4 アルカノイルである）である｝であり、
    但し、Ｒ7がＨである場合、Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つはＨ以外であり、そして
    Ｒ1及びＲ2が各々Ｈである場合、Ｒ7はＨ以外である。〕
    により表されるヒドロキシルアミン誘導体。
  5. 以下の式（II）：
    Figure 0004531865
    〔式中、
    ａ）
    Ｘは酸素であり、
    Ａは、Ｃ 1〜15 アルキル、Ｃ 6〜10 アリール、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、Ｃ 1〜4 アルキル、Ｃ 1〜4 アルコキシもしくはＣ 1〜4 アシルアミノによって置換されたＣ 6〜10 アリール、Ｃ 7〜11 アラルキル、Ｃ 1〜4 アルコキシによって置換されたＣ 7〜11 アラルキル、又は５〜１０員のＮ含有ヘテロアリールであり、
    Ｚは化学的結合であり、
    Ｒ′は、Ｈ又はＣ 1〜4 アルキルであり、
    Ｒは、以下の式（ｂ）：
    Figure 0004531865
    ｛式中、Ｒ5及びＲ6は互いに独立して直鎖もしくは分枝鎖のＣ 1〜4 アルキル又はＣ 5〜7 シクロアルキルであるか、又はＲ5及びＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって飽和ヘテロ環式５〜７員環を形成し、
    Ｙ6は、Ｈ又は−ＯＲ7（式中、Ｒ7はＨである）であり、
    但し、ＡがＣ 1〜4 アルキル以外であり、Ｒ′がＨである場合、Ｙ6はＨである｝であり；又は
    ｂ）
    Ｘは酸素であり、
    Ａは、Ｃ 1〜15 アルキル、Ｃ 1〜4 アルキルで置換されたＣ 1〜15 アルキル、Ｃ 7〜11 アラルキル又はＣ 1〜4 アルコキシで置換されたＣ 7〜11 アラルキルであり、
    Ｚは酸素であり、
    Ｒ′は、Ｃ 1〜4 アルキルであり、そして
    Ｒは、以下の式（ｂ）：
    Figure 0004531865
    ｛式中、Ｒ5及びＲ6は互いに独立して直鎖もしくは分枝鎖のＣ1〜4アルキルもしくはＣ 5〜7 シクロアルキルであるか、又はＲ5及びＲ6はそれに隣接するＮ原子と一緒になって飽和ヘテロ環式５〜７員環を形成し、
    Ｙ6は、Ｈ又は−ＯＲ7（式中、Ｒ7はＨ又はＣ1〜20アシルである）である｝により表される基であり；又は
    ｃ）
    Ｘは酸素であり、
    Ｚは＝ＮＨであり、
    Ａは、Ｃ 1〜15 アルキル、Ｃ 1〜4 アルキルで置換されたＣ 1〜15 アルキル、Ｃ 7〜11 アラルキル又はＣ 1〜4 アルコキシで置換されたＣ 7〜11 アラルキル、フェニル、又はハロゲン、Ｃ 1〜4 アルキル、トリフルオロメチル、Ｃ 1〜4 アルコキシもしくはニトロで置換されたフェニルであり、
    Ｒ′はＣ 1〜4 アルキルであり、
    Ｒは、以下の式（ｂ）：
    Figure 0004531865
    ｛式中、Ｒ5及びＲ6は互いに独立して直鎖もしくは分枝鎖のＣ 1〜4 アルキル又はＣ 5〜7 シクロアルキルであるか、又はＲ5及びＲ6はそれに隣接したＮ原子と一緒になって飽和ヘテロ環式５〜７員環を形成し、
    Ｙ6はＨ又は−ＯＨである｝により表される基である。〕
    により表されるヒドロキシルアミン誘導体。
  6. 以下の式（Ｉ″）：
    Figure 0004531865
    ｛式中、
    Ａは、フェニル、ハロゲンもしくはニトロで置換されたフェニル又は５〜１０員のＮ含有ヘテロアリールであり、
    Ｒ1はＨであり、
    Ｒ″は、そのアミノ基において二置換されたω−アミノ−Ｃ 1〜4 アルキルであり、そしてそのアミノ置換基は互いに独立して直鎖もしくは分枝鎖のＣ 1〜4 アルキルアルキルもしくはＣ 5〜7 アルキルシクロアルキルであるか、又はその２つのアミノ置換基はそれらに結合したＮ原子と一緒になって５〜７員ヘテロ環又はＮ−Ｃ1〜4アルキル第４誘導体もしくはそのＮ−オキシドを形成し、
    但し、Ａが３−ピリジルである場合、Ｒ″は１−ピペリジニル−メチル以外である。｝により表されるヒドロキシルアミン誘導体。
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