CZ207297A3 - Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba - Google Patents

Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba Download PDF

Info

Publication number
CZ207297A3
CZ207297A3 CZ972072A CZ207297A CZ207297A3 CZ 207297 A3 CZ207297 A3 CZ 207297A3 CZ 972072 A CZ972072 A CZ 972072A CZ 207297 A CZ207297 A CZ 207297A CZ 207297 A3 CZ207297 A3 CZ 207297A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
alkyl
substituted
propoxy
piperidinyl
hydroxy
Prior art date
Application number
CZ972072A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ295562B6 (cs
Inventor
László Vígh
Nagy Péter Literáti
Jenö Szilbereky
László Ürögdi
Andrea Jednákovits
László Jaszlits
Katalin Bíró
Ede Márványos
Mihály Barabás
Erzsébet Hegedüs
László Korányi
Mária Kürthy
Gábor Balogh
Ibolya Horváth
Zsolt Török
Éva Udvardy
György Dormán
Dénes Medzihradszky
Bea Mézes
Eszter Kovács
Erno Duda
Beatrix Farkas
Attila Glatz
Original Assignee
Biorex Kutato És Fejleszto Rt.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27270113&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ207297(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biorex Kutato És Fejleszto Rt. filed Critical Biorex Kutato És Fejleszto Rt.
Publication of CZ207297A3 publication Critical patent/CZ207297A3/cs
Publication of CZ295562B6 publication Critical patent/CZ295562B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/02—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by halogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/12—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by nitrogen atoms, e.g. N-hydroxyamidines
    • C07C259/18—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by nitrogen atoms, e.g. N-hydroxyamidines having carbon atoms of hydroxamidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C275/00—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C275/64—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups singly-bound to oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/18—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/89—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C07D215/54—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/22—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/26—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/08—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms
    • C07D295/084—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
    • C07D295/088—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/38—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated

Description

Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba
Dosavadní stav techniky
Molekulární chaperony [angl. chaperons, významově např. chůvy, kmotři} jsou bílkoviny, jež zprostředkovávají skládání bílkovinné struktury. Váží se nekovalentně k odkrytým povrchům bílkovin, jež jsou nově syntetizovány, nebo denaturovány, nebo špatně složeny, a napomáhá jim ke složení do správné konformace. Molekulární chaperony jsou také zapojeny do řady buněčných pochodů, jako jsou syntéza bílkovin, translokace bílkovin a replikace DNA.
Molekulární chaperony zahrnují bílkoviny tepelného šoku, což jsou bílkoviny, jejichž exprese se významně zvyšuje v buňkách vystavených neobvykle vysoké teplotě (tepelnému šoku) nebo vystavených široké paletě fyziologických stresů. Tento vzrůst exprese molekulárních chaperonů pak poskytne buňkám ochranu proti škodlivým účinkům hypertermie, jak prokazuje tolerance buněk k teplotám, jež jsou pro ně jinak letálně vysoké, pokud jsou tyto buňky prekondicionovány krátkým vystavením vysoké teplotě.
Fyziologické stresy, jež indukují bílkoviny tepelného šoku, zahrnují velkou řadu patologických stavů spojených s mnohými chorobami. Syntéza bílkovin tepelného šoku v buňkách vystavených takovýmto stresům ukazuje také na ochranu daných buněk proti daným fyziologickým stresům, podobně jako v případě odezvy na na tepelný šok.
Jedním takovýmto patologickým stavem spojeným s indukcí molekulárních chaperonů je ischemické poškození. Ischemické poškození tkání je důsledkem omezení zásobování krví z jakékoli příčiny. Například: Přetrvávající koronární okluze způsobuje poškození myokardu, jež vede k nekróze srdečního svalu a ohrožuje šance na zhojení, i když se proudění krve navrátí. V mozku mohou být častá poškození způsobována ischemií a mohou vést k odumření mozkové tkáně.
• ·
Bylo pozorováno, že množství bílkoviny tepelného šoku hsp70 se zvyšovalo v myokardu během ischemie vedoucí k nekróze dokonce tehdy, když trvání ischemie bylo krátké. V těchto případech, podobně jako u tepelného šoku, ochraňoval zvýšený obsah buněčné hsp70 buňky proti důsledkům další ischemie, jež by jinak způsobovala nekrózu (DAS, D.K., et al., Cardiovascular Res: 578, 1993). Toto bylo rovněž pozorováno, když byly ischemii podrobeny potkaní buňky v buněčné kultuře (J. Clin. Invest. 93: 759-767 (1994)). Podle tohoto tedy poskytují bílkoviny tepelného šoku syntetizované buňkami myokardu ochranu proti ischemickému poškození.
Situace v mozkové tkáni je podobná, přičemž cerebrální ischemie vede ke zvýšené expresi bílkovin tepelného šoku v mozkové tkáni. Experimenty rovněž potvrdily, že předchozí působení subletální ischemii na zvířata indukuje bílkovinu tepelného šoku (hsp70) a chrání mozek proti závažnějšímu následnému ischemickému napadení (Simon et al., Neurosci. Lett. 163: 135-137 (1993)).
Ještě další příklad fyziologického stresu u tkání a orgánů spojený s molekulárními chaperony poskytují zánětlivá onemocnění. Zánět je nespecifickou odezvou hostitelských buněk na proniknutí cizího materiálu, jak je tomu v případech infekce různými bakteriálními a virovými patogeny, a zahrnuje shlukování a aktivaci leukocytů v místě poranění, což vede k tvorbě a uvolnění vysokých hladin reaktivních forem kyslíku a cytokinů. Tyto cytokiny a reaktivní kyslíkové radikály napadají patogen, ale poškozují také hostitelskou tkáň (Jacquier, Sarlin, Experientia 50: 1031-1038 (1994)). Má se za to, že jako ochranu proti těmto toxickým mediátorům zánětu zvyšuje hostitelská tkáň produkci molekulárních chaperonů. Takto produkované molekulární chaperony chrání hostitelské buňky před poškozením způsobovaným reaktivními formami kyslíku a ochraňují buňky před cytotoxicitou TNF a jiných cytokinů a reaktivních kyslíkových radikálů. Ve studiích na zvířatech bylo prokázáno, že předchozí vystavení zvířete k tepelnému šoku, jenž způsoboval vzrůst exprese bílkoviny tepelného šoku (hsp70), vedlo k značnému snížení ♦ · · · • · • · · · pulmonárních zánětů. Podle tohoto tedy mají molekulární chaperony protizánětlivou funkci.
Příklady uvedené shora ilustrují schopnost molekulárních chaperonů chránit buňky před různými fyziologickými stresy, jež narušují buněčnou homeostatickou rovnováhu a způsobují poškození buněk. U molekulárních chaperonů se rovněž ukázalo, že jsou výhodné v léčení neoplazmat. Bylo například ohlášeno, že když se nádorové buňky transfekují genem kódujícím molekulární chaperon (65 kd hsp), ztrácejí svou tumorigenicitu nebo vykazují její pokles (PCT přihláška č. PCT/GB93/02339). Dále bylo také ohlášeno, že nádorové buňky v odezvě na tepelný šok exprimují molekulární chaperony ve zvýšeném množství. Ty však nejsou přítomné v cytoplazmě ale na povrchu buněčných membrán (Ferrarini M. et al., Int. J. Cancer. 51: 613-619 (1992)). Zvýšená přítomnost molekulárních chaperonů na buněčných površích koreluje se zvýšenou citlivostí NK (přirozených zabijecích) buněk pro nádorové buňky, umožňující lepší cílení, infiltraci a zabíjení nádorových buněk NK buňkami (Kurosawa et al., Eur. J. Immunol. 23: 1029 (1993)).
Vzhledem k výhodám spojeným se zvýšenou expresí molekulárních chaperonů v buňkách by byla metoda na zvýšení této exprese nebo zvýšení aktivity molekulárních chaperonů velmi žádoucí.
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká způsobů zvyšování buněčné exprese molekulárních chaperonů nebo zesilování jejich aktivity. Obzvláště, podle jednoho neomezujícího provedení vynálezu, je poskytnut způsob zahrnující působení na buňku vystavenou fyziologickému stresu účinným množstvím chemické sloučeniny před, v průběhu nebo po fyziologickém stresu, což zvýší expresi molekulárního chaperonů nad množství indukované daným fyziologickým stresem.
Chemickou sloučeninou je přitom hydroxylaminový derivát, jehož tautomerické formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, (i)
NR
Όχ (ΙΌ XR
X
jejich opticky aktivních alkyl, aralkyl, aralkyl soli, včetně nebo jeho stereoisomeru, kde
A je alkyl, substituovaný substituovaný v arylové nebo alkylové části, aryl, substituovaný aryl, heteroarylová nebo substituovaná heteroarylová skupina,
Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu a aralkylu substituovaného v arylové nebo alkylové části,
R je alkyl nebo substituovaný alkyl,
X v tautomeru obecného vzorce I je halogenová nebo substituovaná hydroxylová nebo aminová, monosubstitiuovaná aminová nebo disubstitiuovaná aminová skupina a
X v tautomeru obecného vzorce II je kyslíková, iminová nebo substituovaná iminová skupina a
R' je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl mající substituovanou arylovou nebo alkylovou část, a acylová nebo substituovaná acylová skupina, a sloučeniny obecného vzorce I případně obsahují intramolekulární kruhové struktury tvořené spojením
X a reaktivního substituentu.
Jiným neomezujícím provedením vynálezu je zesílení aktivity molekulárního chaperonu v buňce vystavené fyziologickému stresu jež zahrnuje podávání hydroxylaminového derivátu struktury I nebo II, jak je popsáno výše. Aktivita molekulárního chaperonu se tedy zvýší nad množství indukované daným fyziologickým stresem samotným. V kterémkoli způsobu je výhodné, když buňkou, jíž se hydroxylaminový derivát podává, je eukaryotická buňka.
Podle vynálezu se na eukaryotické buňky působí hydroxylaminovými deriváty, jak jsou definovány shora.
Jiným předmětem vynálezu je způsob léčby nebo možné prevence chorob svázaných s fungováním chaperonového systému nebo spojených s poškozením buněčných nebo buněčné-organelových membrán, přičemž se k potlačení patologických stavů podává • · · · ·· · · ··« hostitelskému organismu účinné množství hydroxylaminového derivátu obecného vzorce I nebo II.
Ještě jiným předmětem vynálezu je použití hydroxylaminového derivátu obecného vzorce I nebo II nebo jejich solí k přípravě farmaceutických prostředků, jež mohou být použity k léčbě kardiovskulárních, vaskulárních, cerebrálních a nádorových onemocnění, chorob kůže nebo slizničné membrány, nebo chorob epithelových buněk a ledvinových kanálků, jakož i k přípravě kosmetických prostředků.
Vynález se dále týká nových hydroxylaminových derivátů majících široký rozsah biologických účinků a užitečných ke zvýšení hladiny molekulárních chaperonů v organismech nebo nebo aktivity řečených molekulárních chaperonů a k přípravě farmaceutických nebo kosmetických prostředků využitelných pro tento účel.
Další předmět tohoto farmaceutickými a kosmetickými hydroxylaminové deriváty spolu vynálezu prostředky, s nosiči je představován jež obsahují nové a přídavky obecně přijatelnými v takovýchto prostředcích.
Tento vynález je, přinejmenším zčásti, založen na nečekaném objevu, že hydroxylaminové deriváty, mající shora popsané struktury, jsou schopné při použití k působení na buňky zvyšovat množství molekulárních chaperonů produkovaných těmito buňkami nebo zvyšovat jejich aktivitu. Tento účinek je obzvláště velký když dané buňky jsou pod fyziologickým stresem, jenž indukuje expresi molekulárních chaperonů. V těchto případech chemické sloučeniny zvyšují expresi molekulárních chaperonů nad množství indukované daným fyziologickým stresem samotným. Tento objev je významný z hlediska role, jíž molekulární chaperony hrají v buňkách, jež se samy chrání před patologickými účinky různých chorob. Tedy: Když nějaká sloučenina je schopna zvyšovat množství nebo aktivitu molekulárních chaperonů exprimovaných buňkami, umožní to buňkám ochranu před škodlivými účinky chorob nebo nápravu poškození jimi způsobovaných.
Stručný popis obrázků
Obrázek 1 ukazuje změny v hladině hsp na myokardu H9c2 potkanů vystavených tepelnému šoku jako účinek působeni maleinátu N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu. Tato sloučenina je vyznačena jako B v Obrázcích a rovněž se na ni jako na sloučeninu B odkazuje v následujícím.
Obrázek 2 ukazuje výsledky experimentu shora uvedeného získané Western analýzou, založené na densitometrickém hodnocení.
Obrázek 3 ukazuje výsledky Northern analýzy hsp70 mRNA získané při zjišéování účinku sloučeniny B na expresi hsp na transkripční úrovni.
Obrázek 4 ukazuje výsledky Northern analýzy hsp26 mRNA získané na buňkách Saccharomyces cerevisiae při zjišťování účinku sloučeniny B na aktivaci hsp.
Obrázek 5 ukazuje účinek benzylalkoholu na aktivaci adenylátcyklasy a membránový stav plazmy.
Obrázek 6 ukazuje úroveň exprese hsp genu na HeLa buňkách s použitím luciferasového reportérového genu pro tento test.
Obrázek 7 ilustruje účinek sloučeniny B na buněčně-povrchovou expresi v buněčné linii K562.
Obrázek 8 ukazuje interakci sloučeniny B a různých lipidových membrán, s ukázáním vzrůstu povrchového napětí.
Obrázek 9 ukazuje účinek sloučeniny B v koncentracích 10 mM a 100 mM na fázový přechod dvouvrstva (L2) =>
T hexagonální (H^) u velkých unilamelárních váčků připravených z dipalmitoyl- fosfatidyl ethanolaminu.
Obrázek 10 je diagram účinku sloučeniny B sérového TNF u zdravých a STZ diabetických potkanů.
Obrázek 11 ukazuje účinek sloučeniny B proti účinku cykloheximidu na růst keratinocytů.
Obrázek 12 ukazuje účinek sloučeniny B proti poškozujícímu účinku cykloheximidu na endothelové buňky.
Obrázek 13 ukazuje účinek sloučeniny B proti buňky poškozujícímu účinku cykloheximidu na buňky linie HeLa.
na hladinu inhibičnímu buňky • · • ·
Obrázek 14 ukazuje účinek sloučeniny B proti růst inhibujícímu účinku cykloheximidu na linii buněk potkaního myokardu H9c2.
Obrázek 15 ukazuje účinek sloučeniny B na aktivitu PÍ transkripčního faktoru v AB 1380 kvasinkových buňkách.
Obrázek 16 ukazuje účinek sloučeniny B na aktivitu API transkripčního faktoru v JF1 kvasinkových buňkách.
Obrázek 17 ukazuje účinek sloučeniny B na aktivitu PÍ transkripčního faktoru v AB 1380 kvasinkových buňkách.
Obrázek 18 ukazuje výsledky testu získané na modelu izolovaného fungujícího ischemického potkaního srdce, přičemž se na daný model působilo sloučeninou B, jak byly stanoveny Western analýzou 2 hodiny po ischemii.
Obrázek 19 ukazuje výsledky testu získané na modelu izolovaného fungujícího ischemického potkaního srdce, přičemž se na daný model působilo sloučeninou B, jak byly stanoveny Western analýzou 3 hodiny po ischemii.
Obrázek 20 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 1 % sloučeniny B.
Obrázek 21 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 2 % sloučeniny B.
Obrázek 22 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 4 % sloučeniny B.
Obrázek 23 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 1 % sloučeniny B, ale s vizuálním hodnocením.
Obrázek 24 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 2 % sloučeniny B, ale s vizuálním hodnocením.
Obrázek 25 ukazuje hojení ran u STZ diabetických potkanů po tepelném zranění při léčbě krémem obsahujícím 4 % sloučeniny B, ale s vizuálním hodnocením.
Obrázek 26 ukazuje porovnávací fotografie (léčba a kontrola) zhotovené v testech uvedených shora pomocí mikroskopické techniky digitální epiluminiscence.
Obrázek 27 ukazuje hladiny hsp7 2 stanovené pomocí Western analýzy ve vzorcích získaných v předcházejících testech při léčbě s krémy obsahujícími 1, 2 a 4 % sloučeniny B.
Obrázek 28 ukazuje hladiny hsp72 stanovené pomocí imunohistochemickou analýzou (léčba a kontrola) u SCID myší vystavených UV-B a léčených sloučeninou B.
Obrázek 29 ukazuje hladiny hsp72 stanovené pomocí Western analýzy u odebraných vzorků kůže SCID myší vystavených UV-B a léčených sloučeninou B.
Podrobný popis vynálezu
Hydroxylaminové deriváty podle vynálezu
Hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomerické formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, se používají ve zde popsaném vynálezu. V obecných vzorcích shora A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl substituovaný v arylové nebo alkylové části, aryl, substituovaný aryl, heteroarylová nebo substituovaná heteroarylová skupina,
Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR3 , kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu a aralkylu substituovaného v arylové nebo alkylové části,
R je alkyl nebo substituovaný alkyl,
X v tautomeru obecného vzorce I je halogenová nebo substituovaná hydroxylová nebo aminová, monosubstitiuovaná aminová nebo disubstitiuovaná aminová skupina a
X v tautomeru obecného vzorce II je kyslíková, iminová nebo substituovaná iminová skupina a
R' je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl mající substituovanou arylovou nebo alkylovou část, a acylová nebo substituovaná acylová skupina, a sloučeniny obecného vzorce I případně obsahují intramolekulární kruhové struktury tvořené spojením
X a reaktivního substituentu.
Kde se uvádí alkyl, míní se přímé nebo větvené alkylové skupiny zahrnující krátké i dlouhé řetězce.
Typický počet uhlíkových atomů výhodných alkylových skupin o krátkém řetězci se pohybuje od 1 do 8a skupinou může být methylová, ethylová, isopropylová, butylová, sec-butylová, terc-pentylová, hexylová, heptylová a oktylová podobně, výhodněji se pohybuje od 1 do 6 a skupinou methylová, ethylová, isopropylová, butylová, pentylová, skupina, a může být sec-butylová, pentylová, terc-pentylová a hexylová skupina.
Typický počet uhlíkových atomů výhodných alkylových skupin o dlouhém řetězci se pohybuje od 9 do 21 a skupinou může být nonylová, decylová, undecylová, dodecylová, tridecylová, tetradecylová, pentadecylová, hexadecylová, heptadecylová, oktadecylová, nonadecylová, eicosylová a heneicosylová skupina, a podobně, výhodněji se pohybuje od 9 do 17 a skupinou může být nonylová, decylová, undecylová, dodecylová, tridecylová, tetradecylová, pentadecylová, hexadecylová a heptadecylová skupina.
Výhodná cykloalkylová skupina znamená cykloalkylovou skupinu mající krátký cykloalkylový řetězec v rozsahu od 3 do 8, a skupinou může být cyklopropylová, cyklobutylová, cyklopentylová, cyklohexylová, cykloheptylová a cyklooktylová skupina, a podobně, výhodněj i od 3 do 7, a skupinou může být cyklopropylová, cyklobutylová, cyklopentylová, cyklohexylová a cykloheptylová skupina.
Případně substituovaný aryl nebo alkyl znamená arylovou nebo alkylovou skupinu mající jednu nebo více substituentových skupin, jako je kyano-, hydroxylová, krátká alkylová (např. methylová, ethylová, propylová, isopropylová, butylová, isobutylová, sec-butylová, pentylová, terc-pentylová, hexylová, heptylová, oktylová a podobně), krátká alkoxylová (např. methoxylová, ethoxylová, propoxylová, isopropoxylová, isobutoxylová, sec-butoxylová, terc-butoxylová, butoxylová, pentoxylová, terc-pentyl-oxylová, hexyloxová a podobně), fenylová, naftylová a podobně), nitro-, monosubstituovaná krátkým alkylem (např. methyl, arylová (např. amino-, aminoetyl, propyl, isopropyl, terc-butyl)amino- a podobně, amino- disubstituovaná krátkými alkyly (např. dimethylamino-, dietylamino-, dipropylamino-, diisopropylamino-, dibutylamino-, dipentylamino-, dihexylamino- a podobně), skupina mono-, di- nebo trihalogenovaného krátkého alkylu (např. chlormethylová, 2,2—dichlorethylová, trifluormethylová a podobně) nebo halogenový atom (např. atom fluóru, chlóru, brómu a jódu), jakož i podobné.
Výhodná aralkylová skupina znamená alkylovou skupinu o krátkém řetězci jak je popsána shora, substituovanou jednou nebo více arylovými skupinami (případně substituovanou), a může jí být skupina benzyl-, benzhydryl-, trityl-, 1-fenyl-ethyl-,
3- fenylpropyl,
4- tritylbutyl, 5-fenylpentyl-, pyrrolidinyl-, perhydro-thiazolyl-,
2-fenylethyl-, 2-benzhydryl-ethyl-, l-methyl-2-fenyl-ethyl-, 1-fenylbutyl-,
1,l-dimethyl-2-fenethyl-, 4-fenylbutyl-,
6-fenylhexyl a podobně, výhodněji nižší alkylové skupiny o 1 až 4 uhlíkových atomech substituované fenylovou skupinou, a může jí být skupina benzyl-, 2-fenylethyl-, l-methyl-2-fenylethyl-. Výhodnými arylovými skupinami mohou být skupiny fenyl-, naftyl-, pentalenyl-, antracenyl- a podobně, výhodnějšími skupiny fenyla naftyl-.
Výhodná 3- až 8-členná, výhodněji 5- až 8-členná, nasycená heterocyklická N-obsahující skupina znamená nasycenou heterocyklickou skupinu obsahující 1-4 dusíkové atomy, a může jí být skupina aziridinyl-, azatidinyl-, oxaziranyl-, imidazolidinyl-, pyrazolidinyl-, perhydro-isoxazolyl, piperidinyl-, piperazinyl-, perhydro-piperidinyl-, perhydro-piperazinyl-, morfolinyl-, perhydro-lH-azepinyl- a podobně.
Výhodná heteroarylová skupina znamená nenasycenou 3- až
8-člennou, výhodněji 5- až 8-člennou, 1 - 4 dusíky obsahující nenasycenou hetero-monocyklickou skupinu a může jí být skupina pyrrolyl-, pyrrolinyl-, imidazolyl-, pyrazolyl-, pyridyl- a její
N-oxid, pyrimidyl-, pyrazinyl, pyridazinyl, triazolyl-, • · • · · benzimidazolyl-, benzotriazolyl-, benzoxadiazolyl výhodněji 5- až tetrazolyl-, dihydrotriazynyl a podobně, nebo znamená nenasycenou 1 - 5 dusíků obsahující kondenzovanou heterocyklickou skupinu a může jí být skupina indolyl-, isoindolyl-, indolizinyl-, chinolyl-, isochinolyl-, indazolyl-, tetrazolopyridyl-, tetrazolopyridazinyl-, dihydro-triazolopyridazinyl a podobně, nebo znamená 3- až 6-člennou, výhodněji 5- až 6-člennou, 1 - 2 kyslíky a 1 - 3 dusíky obsahující nenasycenou hetero-monocyklickou skupinu a může jí být skupina oxazolyl-, isoxazolyl-, oxadiazolyl(1,2,4-oxadiazolyl- a j.) a podobně, nebo znamená nenasycenou 1 - 2 kyslíky a 1 - 3 dusíky obsahující kondenzovanou heterocyklickou skupinu a může jí být skupina benzoxazolyl-, a podobně, nebo znamená 3- až 8-člennou, 6-člennou, 1-2 síry a 1-3 dusíky obsahující nenasycenou hetero-monocyklickou skupinu a může jí být skupina skupina thiazolyl-, 1,2-thiazolyl-, thiazolinyl-, thiadiazolyla podobně, nebo znamená 3- až 8-člennou, výhodněji 5- až 6-člennou, 1 síru obsahující nenasycenou hetero-monocyklickou skupinu a může jí být skupina thienylu, nebo znamená 1 kyslík obsahující nenasycenou hetero-monocyklickou skupinu a může jí být skupina furylu, nebo znamená nenasycenou 1 - 2 síry a 1 - 3 dusíky obsahující kondenzovanou heterocyklickou skupinu a může jí být skupina benzothiazolyl-, benzothiadiazolyl- a podobně.
Výhodná acylová skupina, brána jako taková nebo jako vytvářející část acylované skupiny, znamená s výhodou acylovou skupinu, jíž může být alkanoyl- o krátkém řetězci (např. formyl-, ecetyl-, propionyl-, butyryl- a podobně), alkoxy-karbonyl- o krátkém řetězci (např. methoxy-karbonyl-, ethoxy-karbonyl-, propoxy-karbonyl-, butoxy-karbonyl-, terc-butoxy-karbonyl- a podobně), alkyl-sulfonyl- o krátkém řetězci (např. methyl-sulfonyl-, ethyl-sulfonyl- a podobně), aryl-sulfonyl (např. fenyl-sulfonyl a podobně), aroyl- (např. benzoyl-, naftoyl-, a podobně), aryl-(alkanoyl o krátkém řetězci)- (např. fenyl-acetyl-, fenyl-propionyl- a podobně), cyklo-(alkyl o krátkém řetězci)-(alkanoyl o krátkém řetězci)(např. cyklohexyl-acetyl a podobně), aryl-(alkoxy- o krátkém
- 12 kde acylová jednou nebo řetězci)-karbonyl- (např. benzyloxy-karbonyl a podobně), aryl-karbamoyl- (např. fenyl-karbamoyl-, naftyl-karbamoyla podobně), cykloalkyl-karbamoyl- (např. cyklohexyl-karbamoyla podobně), skupina heteromonocyklického sulfonylu (např. thienyl-sulfonylu, furyl-sulfonylu a podobně), a daná acylová skupina může být případně substituovaná 1 - 3 substituenty, jak se píše shora v odstavci případně substituovaná.
Výhodná U)-amino-alkylová skupina znamená alkylovou skupinu o krátkém řetězci obsahující substituovaný N-atom v uJ pozici alkylového řetězce a u níž je alkylový řetězec případně substituován jedním nebo více substituenty, s výhodou jedním nebo dvěma halogeny (např. chlórem, brómem, fluórem, jódem), hydroxylovou skupinou, nebo acetylovanou hydroxylovou skupinou, skupina je jak byla definována dříve, výhodněji dvěma alkylovými skupinami o krátkém řetězci přičemž definice alkylu je stejná jako shora. N-atom v pozici alkylového řetězce může být substituován jednou nebo dvěma alkylovými skupinami o krátkém řetězci, s výhodou methylem, ethylem, fcerc-butylem a podobně, cykloalkyl-karbamoylem (např. cyklohexyl-karbamoylem a podobně), výhodněji může být N-atom součástí nasycené heterocyklické skupiny, jež obsahuje 1 - 4 dusíkové atomy a jíž může být skupina aziridinyl-, azatidinyl-, oxaziranyl-, pyrrolidinyl-, imidazolidinyl-, pyrazolidinyl-, perhydro-thiazolyl-, perhydro-isoxazolyl, piperidinyl-, piperazinyl-, perhydro-pyrimidinyl-, perhydro-pyridazinyl-, morfolinyl-, perhydro-lH-azepinyl- a podobně, N-atom v pozici může být substituován arylovu skupinou (např. fenylovou a podobně) a může být kvarternarizován krátkým alkylovým substituentem nebo i oxidován.
Pokud je to žádoucí, volné báze obecných vzorců I a II mohou být přeměněny na adiční soli kyselin reakcí s organickými kyselinami a mohou být acetáty, maleináty a podobně, nebo reakcí s anorganickými kyselinami a mohou být hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy, sulfáty, fosfáty a podobně, nebo reakcí s aminokyselinami a mohou být argininové soli, soli kyseliny glutamové a podobně.
• · · · ··· ···· ·· · ···· ···· ·· · • · · · · ··· · ··· · • · · · · · · ·*· ··· ·· ·· ·· ·
V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z kovalentní vazba a X je halogen, s výhodou chlór nebo bróm. Výhodné sloučeniny náležející k této skupině mají jako A: a) aralkyl nebo aralkyl se substituovanou arylovou částí s výhodou fenyl alkyl nebo fenyl alkyl mající jeden nebo dva substituenty, s výhodou alkoxy, b) aryl nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodu substituovaný fenyl obsahující jeden nebo více alkylů, halogenů, haloalkylů, alkoxylů nebo nitroskupin, c) naftyl, d) N-obsahující heteroarylovou skupinu, včetně těch, co mohou být kondenzovány s výhodou pyridyl, e) S-obsahující O-obsahující heteroarylovou skupinu.
této skupině mají jako R:
alkyl mající mono- nebo c) OO-amino alkyl mající s benzenovým kruhem, heteroarylovou skupinu, f)
Výhodné sloučeniny náležející k a) CO-amino alkyl, b) OJ -amino disubstituovanou aminovou část, substituovanou alkylovou část, d) tC-amino alkyl mající mononebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z uO-amino-alkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části.
Určité typy hydroxylaminových derivátů struktury I mající kovalentní vazbu jako Z a halogen jako X jsou zveřejněny v U.S. patentech č. 5 147 879, 5 328 906 a 5 296 606. Tyto sloučeniny mohou být připraveny postupy popsanými v citovaných U.S. patentech, s výhodou diazotací odpovídajících X = NH2 derivátů v přítomnosti patřičného hydrohalidu. Výchozí sloučeniny lze získat známými postupy popsanými např. v maďarském patentu č. 177 578 (1976), jmenovitě spojením amidoximu struktury 1 (R = R = H) s např. reaktivním derivátem strukury 2 v přítomnosti báze, a mohou být diazotovány obvykle bez izolace a purifikace. Koncové skupiny A a R daných sloučenin mohou být dále amidifikovány a derivatizovány podle potřeby.
V jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z kovalentní vazba a X je hydroxy skupina OQ, kde Q je nesubstituovaná nebo substituovaná alkylová nebo aralkylová skupina. Ve výhodném provedení je Q přímý nebo větvený alkyl. V těchto sloučeninách A je aryl nebo heteroaryl, s výhodou N-obsahující heteroarylová skupina, a R je s výhodou:
a) U3-amino alkyl, b) 6C-amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) lO-amino alkyl mající substituovanou alkylovou část, d) (Λ)-amino alkyl mající mononebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z MJ-amino-alkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části.
Zvláštní skupina hydroxylaminových derivátů struktury I, kde je Z kovalentní vazba a X je OQ, má strukturu I'. Struktura 1' obsahuje kruh uzavřený prostřednictvím hydroxylové skupiny. Tyto sloučeniny představují cyklickou formu sloučenin struktury I, přičemž R je -CH2-CH(OH)-R''. R'' je přímý nebo větvený alkyl, nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou i-ť)-amino alkyl, jenž je případně substituován na své aminoskupině a s výhodou obsahuje C-^_5 přímý nebo větvený alkylový řetězec. Nejvýhodněji R'' je vO-amino alkyl mono- nebo disubstituovaný na aminoskupině, kde amino-substituenty nezávisle na sobě mohou být jeden nebo dva přímé nebo větvené alkyly nebo cykloalkyly, nebo dva amino-substituenty spolu s přilehlým N-atomem tvoří 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný heterokruh, jenž případně obsahuje další heteroatom. Z tohoto mají výhodné sloučeniny A, jenž je fenyl, substituovaný fenyl, N-obsahující heteroaryl, substituovaný N-obsahující heteroaryl, S-obsahující heteroaryl nebo substituovaný S-obsahující heteroaryl.
Hydroxylaminové deriváty struktury I mající kovalentní vazbu jako Z a OQ jako X jsou zveřejněny v maďarské patentové přihlášce č. 2385/1992. Tyto sloučeniny lze připravit z odpovídajících halogenových derivátů shora uvedené skupiny (hydroxylaminových derivátů struktury I, kde Z je kovalentní vazba a X je halogen) postupy popsanými v maďarské patentové přihlášce č. 2385/1992, např. reakcí s alkoxidy nebo alkalickým uzavřením kruhu pro cyklické sloučeniny struktury I'.
• · • · · · · ·
V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z kovalentní vazba a X je NR^R2, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, nebo 1 ?
substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl, nebo R a R spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou nasycený 5- až 7-členný kruh.
Ze sloučenin popsaných v právě předcházejícím odstavci jsou obzvlášť výhodné ty, u nichž R je a) LO-amino alkyl, b) LO-amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část,
c) cO -amino alkyl mající substituovanou alkylovou část,
d) U>-amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z ω -amino-alkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části. Z těchto sloučenin jsou výhodnější ty, jejichž A je a) aralkyl nebo aralkyl se substituovanou arylovou částí, s výhodou fenyl alkyl nebo fenyl alkyl mající jeden nebo dva substituenty, s výhodou alkoxy,
b) aryl nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodou substituovaný fenyl obsahující jeden nebo více alkylů, halogenů, haloalkylů, alkoxylů, nitroskupin nebo acylaminoskupin, c) naftyl, d) N-obsahující heteroarylovou skupinu, včetně těch, co mohou být kondenzovány s benzenovým kruhem, s výhodou pyridyl, e) S-obsahující heteroarylovou skupinu, f) O-obsahující heteroarylovou skupinu.
Hydroxylaminové deriváty struktury I, kde je Z kovalentní vazba a X je NR R zahrnují jak známé, tak nové deriváty. Sloučeniny kde X je NH2 jsou zveřejněny v maďarském patentu č. 177578 (1976) a lze je syntetizovat alkylací amidoximových derivátů struktury I (struktura I, kde R1 = R2 = H) s reaktivním derivátem struktury 2 v přítomnosti báze.
Zvláštní skupina hydroxylaminových derivátů struktury I, kde je Z kovalentní vazba a X je NR^R2 je poskytnuta strukturou I1'. Struktura I'' představuje cyklickou formu struktury I, jež obsahuje kruh uzavřený prostřednictvím skupiny NR1R2. Tyto sloučeniny mohou být odvozeny ze sloučenin struktury I, přičemž • ·
- 16 R2 je
H a R -CH2-CH(OH)-R''
R1 je přímý nebo větvený alkyl, nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl.
Ze sloučenin struktury I'' jsou výhodné ty, jejichž A je a) aryl nebo substituovaný uryl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodu substituovaný fenyl obsahující jeden nebo více alkylů, halogenů, haloalkylů, alkoxylů nebo nitroskupin, b) naftyl, c) N-obsahující heteroarylovou skupinu, včetně těch, co mohou být kondenzovány s benzenovým kruhem, s výhodou pyridyl, d) S-obsahující heteroarylovou skupinu, e) O-obsahující heteroarylovou skupinu. Obzvláště výhodné jsou ty sloučeniny, jež obsahují R' ' jíž je: a) Cxj-amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, b) uO-amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou substituovanou alkylovou část. S -amino-alkylu z a) a b) obsahuje
Obzvláště výhodné jsou UJ-amino-alkylové skupiny mající disubstituovanou amino část, přičemž dané substituenty spolu s přilehlým N-atomem tvoří 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Tento heterocyklický kruh může obsahovat další heteroatom(y).
V těchto Uj-amino-alkylových skupinách je amino-substituentem s výhodou přímý nebo větvený alkyl nebo cykloalkyl. Ve sloučeninách obecného vzorce I'' je R1 vodík, aminovou výhodou část a také alkylová část
- 5 uhlíkových atomů.
přímý nebo větvený alkyl, nebo aralkyl substituovaný připravovat uzavřením kruhu nesubstituovaný nebo substituovaný cykloalkyl, nesubstituovaný aralkyl v arylové nebo alkylové části.
Sloučeniny struktury 1'' lze mezi atomy N(4)-C(5). Potřebné deriváty s otevřeným řetězcem jsou sloučeniny struktury I, kde Z kovalentní vazba, X je NR1R2 a R1 je jak je definován v souvislosti se sloučeninami obecného vzorce 1'' shora, R2jeHa Rje skupina vzorce -CH2~CHY5-R'', kde Y5 představuje odcházející skupinu, např. halogenový atom. Takovéto deriváty lze s anorganickými nebo chloridem např. halogenový atom. získat z odpovídajících Y5=OH sloučenin halogenačními činidly, např. thionylchloridem fosforečným. Halogenaci lze provádět s nebo bez inertního rozpouštědla, např.
benzenem, chloroformem,
- 17 tetrahydrofuranem, atd., obvykle za varu. Po odstranění přebytku činidla, např. odpaření thionylchloridu, se surový halogenderivát cyklizuje - buď po izolaci působením silné báze, např. vzniku sloučeniny I', jež nebo purifikaci anebo bez nich butoxidu sodného v t-butanolu za se nakonec izoluje a purifikuje standardními postupy (extrakcí, rekrystalizací, atd.).
V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z kovalentní vazba a X je OQ, kde Q je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl nebo aralkyl mající substituovanou arylovou část nebo substituovanou alkylovou část. Alkyl nebo substituovaný alkyl, jímž je Q, má s výhodou 1 - 4 uhlíkové atomy. Z těchto sloučenin jsou výhodné ty, jejichž A je alkyl nebo substituovaný alkyl, s výhodou o 1 - 4 uhlíkových atomech, nebo aralkyl nebo aralkyl mající substituovanou arylovou část nebo substituovanou alkylovou část. Z těchto sloučenin jsou výhodné ty, jejichž R je: a) oo -amino alkyl, b) LQ-amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) tO-amino alkyl mající substituovanou alkylovou část, d)u> -amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylóvé části.
Tyto hydroxylaminové deriváty struktury I, kde Z je kovalentní vazba a X je OQ lze získat v reakci O-substituovaných hydroxylaminů majících strukturu 6 (viz např. Ger. Off. 2 651 083 (1976)) a ortoesterů majících strukturu 7. Kondenzace se obvykle provádí v činidle samotném jako rozpouštědle, s výhodou za varu. Po odpaření se produkt izoluje krystalizací, v některých případech (když je v bočním řetězci R aminofunkce) ve formě adiční soli kyseliny.
V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z kyslík a X je NR^R2, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, substituovaný přímý nebo větvený alkyl, cykloalkyl, aryl, substituovaný aryl, nebo R1 o > a R spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoři nasycený 3až 7-, s výhodou nasycený 5- až 7-členný kruh. Z těchto sloučenin jsou obzvlášť výhodné ty, u nichž R je a) -amino alkyl, • · • ·
- 18 nebo disubstituovanou aminovou substituovanou alkylovou část, nebo disubstituovanou aminovou
b) CO -amino alkyl část, c) CO -amino d) CaJ -amino alkyl mající monoalkyl mající mající monočást a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z co -amino-alkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části. Z těchto sloučenin jsou výhodnější ty, jejichž A je a) alkyl nebo substituovaný alkyl, b) aralkyl nebo aralkyl se substituovanou arylovou a/nebo substituovanou alkylovou částí, c) aryl nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl. Přípravu těchto sloučenin lze provádět jak je popsáno zde níže, přičemž metody závisí na povaze X, jmenovitě na tom, zda X je nesubstituovaná amino- (NH2) nebo substituovaná amino- funkční skupina.
a) Přípravu sloučenin, kde X je NH2 lze provádět adicí hydroxylaminu struktury 6 k organickému kyanátu struktury A-O-CN (viz např. Chem. Ber. 98, 144 (1965)). Reakce se provádí s výhodou v inertním organickém rozpouštědle, obvykle za pokojové teploty. Izolace často vyžaduje chromátografické čištění.
b) Sloučeniny, jejichž X je monosubstituovaná aminoskupina η
(např. NHR ) se připravují ze známých haloformimidátů struktury 9 (viz. např. Houben-Weil Methoden der Organischen Chemie, svazek E/4, str. 544 (1983)) a sloučeniny struktury 6, v přítomnosti organické báze (např. triethylaminu) nebo anorganické báze, jako je uhličitan sodný, v inertním rozpouštědle, jako je benzen, tetrahydrofuran, atd., s následnými standardními postupy zpracování a čištění.
c) Deriváty, kde X je disubstituovaná aminoskupina lze připravovat reakcí sekundárního aminu struktury5 s sloučeninou struktury 1, kde Z je kyslík a X je OQ (příprava těchto derivátů je popsána shora). Tyto aminační reakce se provádějí v polárních organických rozpouštědlech, např. ethanolu, s refluxováním pokud je zapotřebí.
V jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury I je Z =NR3 , kde R3 je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl nebo aralkyl mající • · • · · ·
substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část, a X je NrIr^, kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, substituovaný přímý nebo větvený alkyl, aryl nebo substituovaný aryl, cykloalkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou nasycený 5- až 7-členný kruh. Z těchto sloučenin jsou dále výhodné ty, jejichž A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl nebo aralkyl mající substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část, arylová nebo substituovaná arylová skupina. Výhodné R pro sloučeniny náležející k této skupině hydroxylaminových derivátů je a) gj -amino alkyl, b) to -amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část,
c) GJ -amino alkyl mající substituovanou alkylovou část,
d) u>-amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Je s výhodou, když alkylové částiω -amino-alkyl skupin a) až d) obsahují 3-8 uhlíkových atomů.
Dané hydroxylaminové deriváty struktury I, kde Z je =NR3 a X je NR R , lze připravovat aminolýzou odpovídajících isomočovinových derivátů, náležejících ke skupině sloučenin popsaných shora (tato skupina odpovídá hydroxylaminovým derivátům struktury I, majícím Z je kyslík a X je NR1R2), s amoniem nebo primárním nebo sekundárním aminem. Tato reakce se provádí s výhodou v polárním rozpouštědle, např. vodě nebo ethanolu, s použitím přebytku aminu. Alternativně mohou být haloformamidy struktury 10 (Houben-Weil Methoden der Organischen Chemie, svazek E/4, str. 544 (1983)) dány do reakce se sloučeninami struktury 6, v přítomnosti organické nebo anorganické báze, také za vzniku sloučenin této skupiny. Reakce se provádí v inertním organickém rozpouštědle, obvykle za pokojové teploty. Sloučeniny, kde R je skupina obecného vzorce b), kde R7 je acyl, se připravují esterifikací odpovídajících sloučenin obsahujících vodík jako R . Alkyl- nebo arylestery se obvykle získávají s použitím chloridu nebo anhydridu kyseliny v přítomnosti ··· · · · · ·· · ···· · ·· · · · · terciárního aminu nebo anorganické báze, s výhodou v inertním rozpouštědle.
Jiná skupina hydroxylaminových derivátů užitečných v tomto vynálezu má strukturu II, jež představuje tautomerní formu sloučenin struktury I. V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury II je Z kovalentní vazba a X je kyslík. Výhodné sloučeniny náležející k této skupině mají A jímž je: a) alkyl, aralkyl nebo aralkyl se substituovanou arylovou nebo alkylovou částí, b) aryl nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl, s výhodu substituovaný fenyl obsahující jeden nebo více substituentů, přičemž preferované skupiny substituentů zahrnují skupiny alkylů, haloalkylů a alkoxylů c) N-obsahující heteroarylová skupina, s výhodou pyridyl, d) S-obsahující heteroarylová skupina. Pro sloučeniny náležející k této skupině výhodné R je: a) cd -amino alkyl, b) -amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c)u) -amino alkyl mající substituovanou alkylovou část, d) cd -amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z -amino-alkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3 - 8 uhlíkových atomů v alkylové části. Výhodné sloučeniny této skupiny mají R' jíž je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl nebo substituovaný aryl, aralkyl nebo aralkyl mající substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část.
Sloučeniny náležející k této skupině jsou zveřejněny v maďarské patentové přihlášce č. 2385/1992. Zde jsou popsány cesty k jejich přípravě: Nejvýhodněji mohou být získány acylací O-substituovaných hydroxylaminových derivátů majících strukturu 6 (viz též Ger. Off. 2 651 083 (1976)) s chloridem kyseliny majícím strukturu 11. Tato cesta může být využita též pro přípravu těch nových sloučenin, kde R' je jiné než vodík, s použitím sloučenin struktury 12 - místo struktury 6 - jako výchozího materiálu.
V jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury II je Z chemická vazba a X je =NR4, kde R4 je H, alkyl,
d)
e)
N-obsahuj ící S-obsahuj ící substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl mající substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část, cykloalkyl, a R' jimž je alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl nebo aralkyl mající substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část. Z těchto sloučenin jsou výhodné ty, jejichž A je: a) aralkyl nebo aralkyl se substituovanou arylovou částí, s výhodou fenylalkyl nebo fenylalkyl obsahující jeden nebo více substituentů, s výhodou alkoxy, b) aryl nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl obsahující jednu nebo více alkylových, haloalkylových nebo nitroskupin, c) naftyl, heteroarylová skupina, s výhodou pyridyl, heteroarylová skupina. Výhodné sloučeniny náležející k této skupině mají jako R: a) co -amino alkyl, b) ík> -amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c)wj -amino alkyl mající substituovanou alkylovou část, d)(x) -amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z y? -amino-alkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části.
Tyto sloučeniny lze připravit buď O-alkylací některého N,N'-disubstituovaného amidoximu struktury 13 s chemickou sloučeninou mající strukturu 2 (k reakčním podmínkám viz preparaci sloučenin struktury I, kde Z je kovalentní vazba a X je NR R ), anebo O-acylací N,O-disubstituovaného hydroxylaminu obecného vzorce 12 s indolylhalidem obecného vzorce 16, přičemž se reakce provádí v inertním rozpouštědle, s výhodou v přítomnosti organického nebo anorganického kyselého vychytávače. Sloučeniny, kde R je skupina obecného vzorce b), kde R je acyl, se připravují esterifikací odpovídajících sloučenin obsahujících vodík jako R7. Alkyl- nebo arylestery se obvykle získávají s použitím chloridu nebo anhydridu kyseliny v přítomnosti terciárního aminu nebo v inertním rozpouštědle.
anorganické báze, s výhodou • ·
V jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury II je Z kyslík a X je kyslík. Výhodné sloučeniny náležející k této skupině mají A jímž je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl nebo aralkyl se substituovanou arylovou nebo R je s výhodu: a) o) -amino alkyl, b) oj -amino mono- nebo disubstituovanou aminovou část, alkyl mající substituovanou alkylovou část, alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou alkylovou částí alkyl mající
c) -amino
d) OJ -amino část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z O -amino-alkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části. Výhodné sloučeniny této skupiny mají R' jimž je alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl nebo aralkyl mající substituovanou arylovou nebo alkylovou část.
Sloučeniny patřící k této skupině jsou zveřejněny v maďarském patentu č. 1756/75 (podaném 15. června 1995). Mohou být připraveny acylací hydroxylaminu majícího strukturu 6 nebo strukturu 12 s chlormravenčanem majícím strukturu 14, podobným způsobem jako s jednoduchým chloridem kyseliny, jak je popsáno pro syntézu sloučenin struktury II, kde Z je kovalentní vazba a X je kyslík. Reakce vyžaduje přítomnost báze, anorganické nebo organické, a může se provádět v inertním rozpouštědle, např. chloroformu. Vedlejší produkt, sůl, se odstraní např. extrakcí vodou a produkt se izoluje z organického roztoku.
V ještě jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury II je Z kyslík, X je =NR4, kde R4 je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl mající substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část, aryl, substituovaný aryl·, heteroarylová nebo substituovaná heteroarylová skupina.
s výhodou alkyl, substituovaný alkyl, nejvýhodněji nesubstituovaný nebo substituovaný fenyl, aralkyl nebo aralkyl se substituovanou arylovou nebo alkylovou částí, a R je s výhodou tJ -aminoalkyl, jenž vhodně obsahuje hydroxy- nebo acyloxyskupinu v alkylovém řetězci, přičemž alkylový řetězec řečené -aminoalkylové skupiny
V těchto sloučeninách je A aryl, substituovaný aryl,
- 23 s výhodou obsahuje 3-8 uhlíkových atomů. V těchto sloučeninách je R' s výhodou alkyl, aryl nebo aralkyl, kteréžto skupiny mohou být nesubstituované nebo substituované.
Tyto sloučeniny jsou N-substituovanými analogy hydroxylaminových derivátů struktury I, kde Z je kyslík a X je i p
NR R , a mohou být připraveny podobně z haloformimidatu struktury 9 a chemické v přítomnosti organické anorganické báze, jako sloučeniny mající strukturu 12, báze (např. triethylaminu) nebo je uhličitan sodný, v inertním rozpouštědle, jako je benzen, tetrahydrofuran, atd., s následnými standardními postupy zpracování a čištění.
V jiném neomezujícím provedení hydroxylaminového derivátu struktury II je Z =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu nebo aralkylu majícího substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část, a X je kyslík. Výhodné sloučeniny této skupiny mají A, mající substituovanou arylovou jímž je: a) aralkyl nebo aralkyl část, s výhodou fenylalkyl nebo
N-obsahuj ící S-obsahuj ící fenylalkyl obsahující jeden nebo více substituentů, s výhodou alkoxy, b) aryl nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl obsahující jednu nebo více alkylových, haloalkylových nebo nitroskupin, c) naftyl, d) heteroarylová skupina, s výhodou pyridyl, e) heteroarylová skupina. Výhodné sloučeniny náležející k této skupině mají jako R: a)uj -amino alkyl, b) -amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) u) -amino alkyl mající substituovanou alkylovou část, d) u) -amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z(P -amino-alkylových skupin
a) až d) jsou obzvlášt výhodné ty, jejichž alkylové skupiny mají 3 - 8 uhlíkových atomů. V těchto sloučeninách je R' s výhodou vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl nebo substituovaný aryl, aralkyl nebo aralkyl mající substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část, aryl nebo substituovaný aryl, acylová nebo substituovaná acylová skupina.
Tyto sloučeniny jsou zveřejněny v současně podané v maďarské patentové přihlášce č. 1756/95 a mohou být připraveny reakcí hydroxylaminové sloučeniny mající strukturu 6 nebo strukturu 12 s isokyanátem majícím strukturu 15, v inertním organickém rozpouštědle, obvykle prostým mícháním za pokojové teploty po 2 - 24 hodin. Konečně: Produkty se izolují - po odpaření rozpouštědla - s výhodu pomocí krystalizace.
V jednom neomezujícím provedení hydroxylaminových derivátů struktury II je Z =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu nebo aralkylu majícího substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část, X je =NR4, kde R4 je H, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl mající substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část, cykloalkyl, a R' je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl nebo aralkyl mající substituovanou arylovou nebo substituovanou alkylovou část, aryl nebo substituovaný aryl. Výhodné sloučeniny patřící k této skupině mají jako R3 vodík, alkyl nebo substituovaný alkyl, R4 je vodík nebo arylová skupina, A je alkyl, substituovaný alkyl, aryl nebo aralkyl, jenž může mít substituovanou arylovou a/nebo alkylovou část. Z těchto sloučenin jsou výhodné ty, jež mají jako R: a) tú -amino alkyl, b) vo -amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část, c) -amino alkyl mající substituovanou alkylovou část, d) ui -amino alkyl mající mono- nebo disubstituovanou aminovou část a také substituovanou alkylovou část, s hydroxy nebo acyloxy skupinou výhodnou jako substituční skupinou alkylové části. Z tů -amino-alkyl skupin a) až d) jsou obzvláště výhodné ty, jež mají 3-8 uhlíkových atomů v alkylové části.
Přípravu sloučenin patřících k této skupině lze provádět aminolýzou odpovídajících isomočovinových derivátů (sloučenin majících strukturu II, kde Z je kyslík a X je NR4) s primárním nebo sekundárním aminem nebo amoniem. Tato reakce se provádí s výhodou v polárním rozpouštědle, např. vodě nebo ethanolu, s použitím přebytku aminu. Alternativně mohou být haloformamidy struktury 10 ponechány reagovat se sloučeninami struktury 12, v přítomnosti organické nebo anorganické báze v inertních rozpouštědlech, obvykle za jejich bodu varu.
Jedno neomezující provedení hydroxylaminových derivátů struktury I definuje novou skupinu sloučenin, kde X je halogen, s výhodou chlór nebo bróm, Z je chemická vazba a A je skupina obecného vzorce (a), kde Y1 je halo-, alkoxy- nebo nitroskupina, nebo haloalkylová skupina, s výhodou haloalkyl obsahující 1-4 uhlíkové atomy, a n je 1, 2 nebo 3; nebo O-obsahující heteroaryl, s výhodou furyl, S-obsahující heteroaryl (s výhodou thienyl), N-obsahující heteroaryl (s výhodou pyridyl, chinolyl nebo isochinolyl), jenž může být kondenzován s benzenovým kruhem a R je skupina mající strukturu (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C4_4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, brané dohromady s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -OR7, kde R7 je H nebo acylová skupina, s výhodou alkyl karbonyl, substituovaný alkyl karbonyl, aryl karbonyl, substituovaný aryl karbonyl, aminoacyl nebo substituovaný aminoacyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je pyridyl nebo naftyl nebo skupina obecného vzorce (a), kde Y1 je halo nebo alkoxy, pak R7 je jiné než H. Tyto sloučeniny mohou případně obsahovat jako A N-obsahující heteroaromatickou skupinu s N-kvarterním C1-4 alkylem nebo oxid řečené N-obsahující heteroaromatické skupiny a/nebo R, kde kruh tvořený koncovými skupinami R6 a R7 je N-kvarterní nebo N-oxidovaný nasycený heterocyklický kruh. Výhodné mezi těmito sloučeninami jsou ty, jejichž A je skupina struktury (a) a kde Y1 je trifluormethyl. Tato skupina hydroxylaminových derivátů obecného vzorce I rovněž zahrnuje stereoisomery sloučenin, kde X je halo, A je pyridyl, Z je chemická vazba a R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou ci_4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, brané dohromady s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až • ···· ·· ·· ·· ···· ··· ···· ·· · • · · · ···· ·· · _ — · · · · · ··· · ··· ·
Ό 9 ··· · · · ζτ *7 *V
7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y je -OR , kde R' je aminoacyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Tyto nové sloučeniny lze připravovat s použitím postupů analogických těm, jež jsou popsány v U.S. patentech č. 5 147 879, 5 328 906 a 5 296 606. Například:
a) Deriváty, kde jak R5, tak R6 jsou jiné než vodík, se připravují diazotací odpovídajících NH2 derivátů (hydroxylaminových derivátů struktury I, kde Z je kovalentní vazba a X je NH2) v přítomnosti patřičného halidu vodíku, podobně jako v postupech popsaných v U.S. patentech č. 5 147 879, 5 328 906 a 5 296 606. Výchozí sloučeniny lze získat též známým postupem popsaným např. v maďarském patentu č. 177578, jmenovitě spojením amidoximu majícího strukturu 1, kde R1 a R2 struktury 1 jsou H, s např. reaktivním derivátem struktury 2 v přítomnosti báze, a lze je diazotovat obvykle bez izolace a čištění.
b) Když v žádané struktuře R7 jeHama jel, syntézu lze provést reakcí oxyranu majícího strukturu 3 a aminu majícího strukturu 4. Tento postup lze použít rovněž pro syntézu R5=H derivátů.
c) Sloučeniny, kde R je skupina struktury (b) a kde R7 této skupiny je acylová skupina, se připravují esterifikací odpovídajících R7=H derivátů. Alkyl- nebo arylestery se obvykle získávají s chloridem nebo anhydridem kyseliny v přítomnosti terciárního aminu nebo anorganické báze, s výhodou v inertním rozpouštědle, nebo v některých případech Schotten-Baumanovým postupem s použitím vodné anorganické báze v dvoufázovém systému. Pro přípravu aminoacylesterů se jako činidla použijí karboxy-aktivované N-chráněné aminokyselinové deriváty (např. aktivní estery), v postupech zásadně známých z peptidové chemie. Tato kondenzace rovněž vyžaduje přítomnost báze (např. triethylaminu). Izolace a čištění daných produktů se provádějí s použitím standardních preparativních technik: Konečný preparát má často formu soli s patřičnou anorganickou nebo organickou kyselinou. U výchozích chirálních aminokyselin jsou dané produkty často diastereoisomery, jež mají druhé chirální centrum ····
·· ···· v R skupině. V průběhu izolace se tyto diastereoisomery často rozdělují a produkt lze získat ve stericky čisté formě.
Sloučeniny, mající strukturu I, kde Z je chemická vazba, X je halo-, s výhodou chlór nebo bróm, A je skupina obecného vzorce (c) a R je skupina obecného vzorce (d), jeden nebo oba o o z Y a Y , z nichž alespoň jeden musí být v molekule přítomný, jsou kyslík, nebo alkyl nebo substituovaný alkyl mající 1-4 uhlíkové atomy a k je 1, 2 nebo 3 a m je 1, 2, nebo 3; Y a Y jsou připojeny tečkovanou čárou, což znamená případnou přítomnost těchto substituentů, jsou rovněž nové hydroxylaminové deriváty. Když je daná sloučenina mono- nebo bivalentní kationt, jejími anionty jsou jeden nebo dva halidy, s výhodou jódové ionty.
Tyto hydroxylaminové deriváty se připravují chemickými modifikacemi (t.j. N-oxidací nebo kvarternarizací) koncové pyridinové a/nebo piperidinové skupiny v jejich nesubstituovaných prekursorech. Pro oxidaci se používají s výhodou perkyseliny, např. substituované kyseliny perbenzoové, v inertních rozpouštědlech (např. chloroformu, dichlormethanu). Když jsou v molekule přítomné obě oxidovátělně skupiny, mohou se tvořit mono- a dioxidy v závislosti na množství použitého činidla. Na konci reakce se přebytek činidla rozloží a produkt se izoluje odpařením. Kvarternarizací lze provést s alkylhalidy (např. methyljodidem), s výhodou s refluxováním činidla ve vhodném rozpouštědle např. acetonu. Produkt je často nerozpustný v prostředí a může být izolován jednoduchou filtrací.
Ještě jinou novou skupinou sloučenin, patřící k hydroxylaminovým derivátům, majícím strukturu I, jsou ty, jejichž Z je chemická vazba, A je aralkyl, substituovaný aralkyl, s výhodou fenylakyl, jenž může mít jednu nebo více alkoxy skupin, s výhodou alkoxy mající 1 až 4 uhlíkové atomy, fenyl, substituovaný fenyl mající jeden nebo více substituentů, přičemž výhodné substituenty zahrnují alkyl, s výhodou alkyl nebo haloalkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy, halo-, acylamino- nebo nitroskupina, nebo N-obsahující heteroarylová skupina, jež může být kondenzována s benzenovým kruhem, s výhodou pyrrolyl, pyridyl, isochinolyl nebo chinolyl, nebo síru obsahující ···· ·· ·· ·· ···· • ······ · ··· · ·· · · · · heteroaromatická skupina, s výhodou thienyl, přičemž dané heteroarylové skupiny mohou být substituovány jedním nebo více alkyly, s výhodou alkyly majícími 1 až 4 uhlíkové atomy; X je -NR-Lr2 , kde R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou alkyl mající 1 až 6 uhlíkových atomů, cykloalkyl, nebo R1 a R2, brané dohromady s dusíkovým atomem k nim připojeným, mohou tvořit nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterokruh; R je skupina struktury (e), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou alkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, brané dohromady s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterokruh, jenž může obsahovat další heteroatomy a substituenty, přičemž substituentem je s výhodou alkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy; Y4 je H nebo alkyl nebo substituovaný alkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy, Y5 je alkyl nebo substituovaný alkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy, nebo OR7, kde R7 je H nebo acyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je fenyl, jenž je nesubstituovaný nebo substituovaný halogenem nebo alkoxy, nebo fenylalkyl substituovaný alkoxy, nebo pyridylová skupina a R7 je H, pak alespoň jeden z R1 a R2 je jiný než H, nebo když A je fenyl, jenž je nesubstituovaný nebo substituovaný halogenem nebo alkoxy, fenylalkyl substituovaný alkoxy, nebo pyridylová skupina, a R^ a R2 jsou oba H, pak R7 je jiný než H.
Sloučeniny, kde X je NH2 derivát, se připravují - podobně jako ve shora zmíněném postupu - reakcí odpovídajících intermediátů majících strukturu 1, kde R1 a R2 struktury 1 jsou H, se sloučeninou mající strukturu 2. Alkylační činidlo (mající strukturu 2) může obsahovat hydroxylové a/nebo aminové substituenty. Reakce vyžaduje přítomnost anorganické nebo organické báze, a ve výhodném způsobu se používá alkoholový roztok alkoholátu jako médium a báze. Produkt se často izoluje ve formě soli s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou.
Jiná skupina shora uvedených nových sloučenin je > > β Ί O charakterizovaná tím, že u těchto derivátu jsou z R a R jeden nebo oba jiné než H. Takovéto struktury lze připravit dvěma cestami.
a) Amidoxim majícího strukturu 1, jenž již obsahuje žádané 1 o substituenty R a/nebo R , může reagovat s reaktivní sloučeninou struktury 2, podobně jako v postupu popsaném v předešlém paragrafu. Substituované amidoximy o struktuře 1, používané jako výchozí materiály, jsou známé z literatury [Chem. Rev. 62, 155-183 (1962)].
b) Substituce halogenových atomů ve sloučeninách majících strukturu I, kde Z je kovalentní vazba a X je halogen, aminem o struktuře 5 může také vést k podobným sloučeninám. V případě derivátů, nesoucích OH substituent v R skupině (Y4=OH), se musí tato hydroxylová skupina předem chránit a po substituční reakci deprotektovat, jinak je upřednostňována cyklický derivátů o struktuře I'. Pro chránění se ukázaly nejuspokojivější chránící skupiny acetylového typu, např. tetrahydropyranylová skupina. Chránění se provede reakcí nechráněné sloučeniny s dihydropyranem, s následným vytěsněním halogenu/aminu, což obvykle vyžaduje refluxování v rozpouštědle, např. alkoholu. Deprotekce produktu může být nakonec provedena kyselým působením, např. vařením ethanolového roztoku v přítomnosti např. kyseliny p-toluensulfonové.
Jak je již zmíněno, jedna skupina nových sloučenin zahrnuje též ty, kde Y5 je alkoxylová skupina. Mohou být připravovány acylací odpovídajících Y5=OH derivátů, jež jsou buď známy z literatury (např. maďarského patentu č. 177578) nebo popsány v tomto vynálezu. Reakce může být provedena stejně jako ta, co je popsána u halo derivátů, kde R7 je acylová skupina (způsob c)).
Nové hydroxylaminové deriváty struktury I zahrnují rovněž ty, kde Z je kyslík nebo =NR3 nebo substituovaná alkylová skupina, kde RJ je nesubstituovaná -NR1R2 π1 π2 skupina, X je -NR^R^, Rx a R nezávisle na sobě jsou vodík, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný
- 30 aralkyl, nebo R1 a R2, když jsou brány spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, jenž případně obsahuje jeden nebo více dalších heteroatomů.
těchto sloučeninách
1θ nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný fenylová skupina, aralkylová skupina, na aryl, s výhodou fenyl nebo substituovaná nebo nesubstituovaná nebo substituovaná a R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, a R nezávisle s výhodou C1-4 s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -OR7, kde R7 je acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo arylkarbonyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Nové hydroxylaminové deriváty, kde Z je kyslík a X je OR, kde Q je nesubstituovaná nebo substituovaná alkylová skupina, nebo nesubstituovaná nebo substituovaná aralkylová skupina, A je nesubstituovaná nebo substituovaná alkoxylová skupina, nebo nesubstituovaná nebo substituovaná aralkylová skupina, a R je skupina obecného vzorce (b), kde R$ a R^ nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou ci_4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R^ a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu až 7 6 tvoří nasycený 3heterocyklický kruh. Y nesubstituovaný nebo arylkarbonyl, k je 1, 2
-, s výhodou j e -OR7, kde substituovaný nebo 3, a m rovněž do rozsahu sloučenin obecného vzorce I.
5- až 7-členný nasycený 7
R je acyl, s výhodou alkylkarbonyl nebo je 1, 2 nebo 3, spadají
Jiná skupina nových je představována těmi, substituovaný aryl, s heteroaromatická skupina, hydroxylaminových derivátů struktury I kde A je nesubstituovaný nebo výhodou fenyl, nebo N-obsahující s výhodou pyridyl, nebo S-obsahující heteroaromatická skupina, Z je chemická vazba, X je -0Q, kde Q je :1-4 alkyl a R je skupina obecného vzorce (b), kde Ró a Re nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou cl-4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány spolu
s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný heterocyklický kruh, Υθ je H, k jel, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Tyto sloučeniny se připravují reakcí odpovídajících hydroxylaminových derivátů obecného vzorce I, kde X je halo, a odpovídajících alkoholátů, s výhodou v alkoholu odpovídajícím alkoholátu, s výhodou za refluxování. Reakční směs se zpracuje způsoby známými v oboru, a produkt se izoluje chromatografií nebo vytvářením soli.
Nové hydroxylaminové deriváty obecného vzorce II rovněž zahrnují skupinu sloučenin, kde X je kyslík, A je c1_2q přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl nebo halofenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, naftyl, nebo N-obsahující heteroaromatická skupina, s výhodou pyridyl, Z je chemická vazba, R' je H, C1-4 alkyl nebo aralkyl, s výhodou fenylalkyl, R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl nebo eykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný heterocyklický kruh. je H nebo -OR7, kde R7 je H, kjel, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je jiné než alkyl a R' je H, pak Y6 je H.
Nové sloučeniny, kde Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR skupina, kde R je vodík nebo nesubstituovaná nebo substituovaná alkylová skupina, X je =NR4. kde R4 je vodík, nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenylová skupina, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, s výhodou fenylalkyl, spadají rovněž do rozsahu sloučenin obecného vzorce II. V těchto sloučeninách je A nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, s výhodou fenylalkyl, R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl, nebo eykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou
brány spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je H nebo -OR7, R7 je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo arylkarbonyl, k je 1,2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Novými hydroxylaminovými deriváty obecného vzorce II jsou rovněž ty, kde X je kyslík, A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, s výhodou fenylalkyl, Z je kyslík, R' je alkyl nebo aralkyl, s výhodou fenylalkyl, R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, když jsou brány spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh.
zr *7 *7
Y je H nebo -OR , R je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo arylkarbonyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Hydroxylaminové sloučeniny obecného vzorce II, kde X je kyslík a Z je =NH jsou rovněž novými sloučeninami.
Jedna skupina těchto sloučenin je tvořena těmi, kde A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, cykloalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, s výhodou fenylalkyl, nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný halo, alkyl, haloalkyl, alkoxy nebo nitro, R je skupina obecného vzorce (b), kde R a R nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R^ a R6, když jsou brány spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je H nebo -OH, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Jiná skupina těchto sloučenin je tvořena těmi, kde A je skupina struktury (a) a kde Y1 je haloalkyl, s výhodou trifluormethyl a n je 1, 2 nebo 3,R' je H aR je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo 5 6
R a R , když jsou brány spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený • · · · • · heterocyklický kruh. Y6 je H nebo -OH, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Nové hydroxylaminové deriváty podle vynálezu rovněž zahrnují cyklické sloučeniny obecného vzorce I'', kde A je nesubstituovaný fenyl, fenyl substituovaný halo nebo nitro, nebo N-obsahující heteroaryl, R1 je H, a R'' je Oj -amino-alkylová skupina mononebo disubstituovaná na aminoskupině, jejíž alkylový řetězec má 1-5 uhlíkových atomů, a dané amino substituenty, nezávisle na sobě, mohou být jedním nebo dvěma přímými nebo větvenými alkyly nebo cykloalkyly, nebo dané dva amino substituenty, spolu s N atomem k nim přilehlým tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, nebo jeho ci_4 alkyl N-kvarterní derivát, s výhradou, že když A je 3-pyridyl, R1' je jiný než 1-piperidinylmethyl.
Způsoby zvýšení exprese molekulárních chaperonů v buňkách
Tento vynález se týká způsobu zvýšování exprese molekulárních chaperonů v buňkách pomocí působení účinného množství hydroxylaminového derivátu na buňky a tkáně. Pro tento způsob se dají používat hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II. Struktury obecných vzorců I a II jsou podrobně rozebrány v předcházející části.
V jednom neomezujícím provedení vynálezu je poskytnut způsob zvýšení exprese molekulárních chaperonů v buňkách vystavených stresu. U tohoto způsobu se na buňky vystavené fyziologickému stresu, jenž vyvolává expresi molekulárních chaperonů buňkami, působí účinným množstvím hydroxylaminových derivátů, jejichž tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II. Hydroxylaminové deriváty zvyšují expresi molekulárních chaperonů v těchto buňkách nad množství indukované daným fyziologickým stresem.
• · • · · ·
V jiném neomezujícím provedení vynálezu se na buňky působí hydroxylaminovými deriváty před tím, než jsou vystaveny fyziologickému stresu. Hydroxylaminové deriváty zvyšují expresi molekulárních chaperonů nad množství indukované daným fyziologickým stresem.
Výraz molekulární chaperon, jak se zde používá, odkazuje na bílkovinu, jež pomáhá jiným bílkovinám ve skládání do správných nebo aktivních struktur, obvykle nekovalentní vazbou k těmto bílkovinám. Chaperony pomáhají nejen opravě a nápravě bílkovin, jež jsou nově syntetizovány, nebo denaturovány, ale i těch, jež jsou denaturovány nebo špatně složeny.
Molekulární chaperony zahrnují mezi jiným bílkoviny tepelného šoku (hsp), z nichž hsp70 a hsp72 mají zvláštní význam ve spojení s tímto vynálezem, jakož i bílkovinu (BiP) vážící těžký řetězec IgG a glukosou regulované bílkoviny (grp). Příklady hsp a grp zahrnují, ale bez omezení, ty jež patří k následujícím třídám: hsp70, hsp60, hsp90, grp94, grp80 a hsp27. organismus
Eukaryotické buňky, na něž se působí hydroxylaminovými deriváty jsou s výhodou savčí buňky, výhodněji lidské buňky. Výraz eukaryotické buňka odkazuje jak na eukaryotické buňky, jež jsou in vitro (buňky, jež jsou mimo živý organismus, např. za kultivačních podmínek), tak in vivo (buňky, jež jsou uvnitř živého organismu, např. buňky tvořící tkáně a orgány).
Z eukaryotických buněk živého organismu se s výhodou působí v souladu s vynálezem na neurony, svalové buňky, buňky cévní stěny, obzvláště endothelové buňky, epithelové buňky a buňky imunitního systému. S výhodou se působí v souladu ze způsobem podle vynálezu rovněž na rostlinné buňky, včetně buněk živého rostlinného organismu.
Pod výrazem fyziologický stres, jak se zde používá, se mají rozumět stavy působící na buňku, jež vyvolávají odezvu buňky k stresu, např. syntézu bílkovin chaperonů. Fyziologické stresy zahrnují faktory, jež způsobují poškození buněk ebo narušují homeostatickou rovnováhu buněk. Jsou jimi například metabolické, oxidativní, lokálně-mechanické stresy, nebo stresy způsobované hypoxií, ischemií, tepelným šokem, radiací nebo • ·
- 35 toxickým materiálem. Důležitá forma metabolického stresu je způsobována diabetem mellitus.
Jiná důležitá vyskytující se forma fyziologických stresů zahrnuje stresy vedoucí k tvorbě volných radikálů nebo zvýšení množství cytokinů v buněčném prostředí. Poškození buněk, jež jsou spojena s různými patologickými stavy, poskytují příklady fyziologických stresů.
V jednom neomezujícím provedení vynálezu fyziologický stres, jenž indukuje buňky k expresi molekulárních chaperonů, je odezvou k fyziologickým stresům vedoucím ke kardiovaskulárním, vaskulárním, mozkovým, alergickým, imunitním, autoimunitním chorobám, virovým a bakteriálním infekcím, chorobám kůže a sliznice, nebo chorobám ledvinových kanálků epithelového původu nebo způsobujícím stavy, jež mají být léčeny kosmetickou intervencí.
Takovéto kardiovaskulární choroby zahrnují nejvýhodněji atherosklerózu vyvolanou fyziologickým stresem, koronární choroby, nebo kardiovaskulární choroby způsobené hypertonií nebo pulmonární hypertonií.
Charakteristickými mozkovými chorobami jsou, mimo jiné, ty, jež jsou způsobeny cerebrovaskulární ischemií, vyvolanou fyziologickým stresem, mrtvice, traumatická poranění hlavy, senilní neurodegenerativní onemocnění, obzvláště senilní demence, AIDS demence, alkoholická demence, Alzheimerova choroba, Prkinsonova choroba nebo epilepsie.
Charakteristické choroby vyvolané onemocněním kůže nebo sliznice jsou dermatologické choroby nebo ulcerální choroby gastrointestinalního systému.
Při shora uvedených chorobách fyziologický stres indukuje expresi molekulárních chaperonů v buňkách, ale tento účinek není dostatečný pro ochranu proti poškozování buněk chorobou. Léčba shora uvedenými hydroxylaminovými deriváty, jež je spojena se zvýšení exprese chaperonů nebo zvýšením jejich aktivity, umožňuje eliminaci strukturálních odchylek způsobovaných chorobou, a tedy regeneraci buněk.
V jednom neomezujícím provedení vynálezu je fyziologickým stresem tepelný šok nebo vystavení buněk neobvykle vysoké teplotě. V jiném neomezujícím provedení vynálezu je fyziologickým stresem buněčné poškození spojené s ischemií. Ischemická léze buněk, obzvláště srdečního svalu a mozkových buněk, je způsobována kardiovaskulárními poruchami, způsobovanými cévní okluzí nebo rupturou, jako jsou srdeční a mosková trombóza, nebo vaskulární okluzí, mrtvicí, embolií, nebo chronickými vaskulárními spasmaty. Ischemie vyvolává odezvu buněk ke stresu, jež vede ke zvýšenému množství hsp, jenž pak zase chrání dané buňky před škodlivými účinky ischemie (Mestril, R. et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 27 45 (1995)).
Při působení účinného množství hydroxylaminových derivátů na tyto buňky může být molekulární exprese chaperonů v buňkách zvýšena nad množství indukované ischemickým stavem a rovněž může být zvýšena aktivita moleklárních chaperonů.
Ve spojitosti s touto záležitostí: Když se vyjímá ze zvířete orgán k transplantaci, takovéto vynětí je fyziologickým stresem způsobujícím poškození buněk tvořících tento orgán, což indukuje expresi chaperonů. V takovémto případě podávání hydroxylaminových derivátů před vynětím orgánu nebo po něm může zvýšit množství chaperonů produkovaného buňkami nebo jeho aktivitu, a tedy poskytovat cytoprotektivní účinek.
Neuronální poškození mohou být indukována vedle ischemie rovněž mnohými jinými stresy, což indukuje produkci molekulárních chaperonů v neuronálních buňkách. Návíc excitotoxická neuronální poškození rovněž indukují produkci molekulárních chaperonů neuronálními buňkami, a jsou zahrnuta do pojmu fyziologický stres.
V ještě jiném příkladu tohoto vynálezu je fyziologický stres poskytován toxickými mediátory zánětů, jako jsou oxidativní radikály a cytokiny, jako je TNF, jež jsou produkovány makrofágy. U buněk vystavených zýšenému množství těchto toxických mediátorů bylo prokázáno, že exprimují zvýšené množství hsp, jenž pak zase chrání tyto buňky před toxicitou (Kantengwa, S. et al., Semin. Immun. 3: 49-56 (1991)). Různá zánětlivá onemocnění, včetně
- 37 pulmonárních zánětlivých stavů, jako je šokový syndrom dospělých, indukují expresi hsp buňkami, účinek (Jacquier-Salin, M.R. (1994)). Když je množství zvýšeno a ten pak vykazuje cytoprotektivní et al., Experientia 50: 1031-1038 molekulárních chaperonů v buňkách nad množství indukované TNF a reaktivními formami kyslíku, buňky mohou být lépe chráněny před těmito cytotoxickými faktory a lépe umožňovat nápravu poškození jimi způsobovanou.
Faktory ovlivňující fyziologický stav buněčných membrán, včetně membránové fluidity, rovněž poskytují příklady fyziologického stresu. Zvýšení exprese molekulárních chaperonů v těchto buňkách nad expresi indikovanou narušením fyziologického stavu buněčných membrán může poskytnout lepší ochranu a rovněž dovolí buňkám nápravu buněčných membrán.
Spojení účinné množství hydroxylaminových derivátů, jak se zde používá ve spojení se zvýšením exprese molekulárních chaperonů v buňkách pod fyziologickým stresem, nebo v buňkách, jež mohou být následně vystaveny fyziologickému stresu, odkazuje na množství, které zvýší expresi molekulárních chaperonů nad hladinu indukovanou fyziologickým stresem samotným. Takovéto množství může být snadno stanoveno tím, kdo je zběhlý v oboru. S výhodou pro buňky in vitro je účinné množství mezi 10-6
- 10 3 M. Výhodněji je účinné množství mezi 10-6 - 5 x 10-4 M.
Při podávání zvířeti se účinné množství liší v závislosti na různých faktorech, jako je způsob podávání, ale stanovení rozsahu účinnosti spadá pod znalosti zběhlých v oboru a nebude vyžadovat zbytečné experimentování. Například: Když se hydroxylaminové deriváty podávají intravenózně, účinné množství je s výhodou mezi 0,1 - 10 mg/kg tělesné hmotnosti, výhodněji 0,5 - 2,0 mg/kg tělesné hmotnosti, když se podávají orálně je účinné množství s výhodou mezi 10 - 500 mg/kg tělesné hmotnosti, výhodněji 50
- 100 mg/kg tělesné hmotnosti.
Zvýšení exprese molekulárních chaperonů v buňkách lze detegovat s použitím dobře zavedených laboratorních postupů, jako jsou postupy Northern a Western analýzy.
Příklad techniky Western analýzy, jenž lze použít, je dán následovně: Buňky se kultivují in vitro při 37°C v Dulbeccově
fetálního (DMEM) doplněném 10 modifikovaném Eaglově médiu telecího séra (GIBCO), v 5 jejichž tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, mohou být přidávány do tkáňové kultury, například 10 M sloučenina je podávána buňkám 16 hodin před fyziologickým stresem, nebo po určitém časovém období následně po fyziologickém stresu. Koncentrace hydroxylaminového derivátu jakož i čas podávání této sloučeniny se však mohou měnit podle žádoucího experimentálního uspořádání.
Šest hodin po tepelném šoku se buňky promyjí dvakrát ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS) a pak seškrabou z povrchu kultivačních misek v PBS. Pak se buňky stočí po 5 minut při 1500 rpm a vezmou do 100 μΐ modifikovaného solubilizčního pufru (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 2 mg/ml aprotininu, 1 μg/ml
C02· Hydroxylaminové deriváty, obsahujícího 50 mM 1 % Triton N-100, chymostatinu, a sonikují 3 x po 20 sekund (2 min. intervaly, nastavení 8).
Koncentrace bílkovin se pak stanoví z 5 μΐ vzorků stanovením Bradfordové (Μ. M. Bradford, Anal. Biochem. Ί2: 248-254 (1976)) ve třech paralelách. Vzorky se nastaví na koncentraci bílkoviny 100 μg/ 30 μΐ pomocí pufru uvedeného shora a dalšího pufru tak, že konečná koncentrace složek v tomto pufru bude: 110 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoethanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a něco bromfenolové modři; pak se třepe při pokojové teplotě po 30 minut. Vzorky takto získané lze použít ke gelové elektroforéze.
Když se zesilující účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu zkouší na buňkách in vivo, aplikuje se fyziologický stres na zvíře, např. ischemie nebo STZ-indukovaný diabetes. V případě ischemie lze myokardiální ischemii ve zvířeti indukovat tak, jak je popsáno v Příkladě 8, a diabetický stav lze indukovat tak, jak je popsáno v Příkladě 10. Hydroxylaminový derivát podle vynálezu může být zvířeti podáván před vystavením fyziologickému
Například:
(U. K. Laemmli, polyakrylamidovém gelu při Bílkoviny se pak vybarví s stresu, v průběhu stresu nebo potom. Jak se uvedlo dříve, načasování podávání lze měnit podle experimentálního uspořádání.
Následující kroky přípravy bílkovin z relevantních tkání zvířete po takovémto působení se provádějí při 0 - 4°C. Tkáně, jako je jaterní tkáň (kolem 15 - 20 g), se homogenizují v domácím mixeru po 2 min. v 80 ml lyzačního pufru obsahujícího 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100 a 1 mM proteázové inhibitory (PMSF, benzamidin, kyselinu aminokapronovou). Homogenát se pak centrifuguje při 20 000 x g po 30 min. v centrifuze Sorvall RC28S.
Koncentrace bílkovin se pak v preparaci stanoví stanovením Bradfordové a nastaví na 5 mg/ml. Vzorky obsahující 1,8 mg bílkoviny se před gelovou elektroforézou solubilizují s 0,6 ml pufru obsahujícího 110 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoethanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a něco bromfenolové modři, a třepou se při pokojové teplotě po 30 minut.
Vzorky bílkovin získané z tkáňových kultur nebo zvířecích tkání, jak se oba typy popisují shora, se použijí ke elektroforéze a následnému imunoblotu (oba postupy jsou v oboru dobře známy a jsou podrobně popsány v Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane, 3. laboratorní manuál, Millipore, a U. K. Laemmli, Nátuře 227: 680-685 (1970).
Elektroforézu lze provádět Nátuře 227: 680-685 (1970)) konstantním napětí Coomassie Brilliant přenesou na Immobilone PVDF /Millipore) při konstantním proudu (300 mA) po 3 hodiny při 4°C v přenosovém pufru (10 mM CAPS, pH 11, 10 % methanol) (Protein Blotting Protocols for the
Immobilon-P Transfer Membrane, 3. laboratorní manuál, Millipore). Po přenosu se zablokují nespecifická místa membrány 2 % bovinním sérovým albuminem (BSA) v TPBS (fosfátem pufrovaný solný roztok obsahující 0,1 % Tween 20) při 4C přes noc. Membrána s přeneseným materiálem může být pak inkubována s protilátkou podle Laemmliho na 8 - 18 %
V přes noc. Blue R-250 nebo specifickou k molekulárnímu chaperonu, např. GRP94 monoklonální protilátkou (SPA-850, StressGen), zředěnou 1:3000, HSP60 monoklonální protilátkou (SPA-600, StressGen), zředěnou 1:2700, HSP72 monoklonální protilátkou (C9F34-5, StressGen), zředěnou 1:1250, nebo HSP90 monoklonální protilátkou (AC88, StressGen), zředěnou 1:2000, po 1 hodinu při pokojové teplotě. Pak se membrána promyje s TPBS pufrem po jednu hodinu, a inkubuje po další 1 hodinu s anti-potkaní (Sigma, 1:4000 zředění, pro grp94) resp. anti-myší (Sigma, adsorbovaná s lidskými a potkaními bílkovinami, 1:3000 zředění, pro Hsp60, HSP72 nebo HSP90) sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidasou. Po následném mytí s TPBS se membrána vyvíjí s ECL (zesíleným chemiluminiscenčním) systémem (Amersham).
Změny v obsahu stresových bílkovin lze kvantifikovat s použitím denzitometru Bio-Rad (Model 1650) a integrátoru Hewlett-Packard (HP 3394 A). Připraví se diluční série z bílkovinných roztoků obsahujících známé množství chaperonu, postup jako shora se zopakuje s danými ředěními, a koncentrace chaperonu v testovaném vzorku se stanoví z kalibrační křivky, získané z dilučního testu.
Northern hybridizace je jiným experimentálním postupem dostupným pro stanovování hladiny zvyšování molekulárních chaperonů (pomocí měření hladiny mRNA) hydroxylaminovými deriváty podle vynálezu. Buňky nebo tkáně lze získávat tak, jak je popsáno v souvislosti s postupem Western analýzy. Celkovou RNA z těchto buněk nebo tkání lze extrahovat s použitím RNAgents (Promega) podle instrukcí výrobce (Protocols and Applications, 2. vydání, 1991, Promega Corporation). Zmrzlé vzorky tkání (kolem 50 až 100 mg) se homogenizují v 1,0 denaturujícím 4 M guanidin thiokyanátu, 42 mM citrátu sodném, 0,83 mM β-merkaptoethanolu, 0,1 % Nonidetu P-40 při 4°C (Brinkmanova homogenizace). Pak se přidá 1/10 objemu 3 M octanu sodného /pH 4,0) a homogenát se extrahuje kyselým fenolem (fenol:chloroform:isoamylalkohol 25:24:1) vortexováním po 10 sekund. Vzorek se inkubuje na ledu po 15 minut, a pak centrifuguje (4’C, 20 min., 10 000 x g). Vodná fáze se pak přenese do nových Eppendorfových zkumavek, postup se
- 41 za pokojové zpracované se změří opakuje a vodná fáze se srazí při -20°C přes noc stejným objemem isopropanolu. Po centrifugaci (4°C, 20 min., 10 000 x g) se precipitát promyje dvakrát 95 % alkoholem a vysuší teploty. RNA se rozpustí v 20 μΐ vody s diethylpyrokarbonátem (DEPC) a koncentrace spektrofotometricky při 260-280 nm. Osm μg celkové RNA se podrobí kapilárnímu přenosu na formaldehyd-agarosovém gelu, RNA z gelu se přenese na nylonovou membránu podle instrukcí výrobce (Zeta-Probe GT, BioRad).
U jednotlivých vzorků se obsah mRNA molekulárního chaperonu porovnává s hladinou mRNA glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasového (GAPDH) genu ve vzorku. cDNA sondy (například lidská hsp70 cDNA plné délky, když sondovanou mRNA je hsp70, a Apa-Ncol fragment potkaní GAPDH cDNA) jsou značeny alfa-32P CTP s použitím soupravy Random Prime DNA Labeling Kit (USB). Radioaktivně značené fragmenty se purifikují na koloně Sephadexu G-50 (Pharmacia) jak je popsáno (Ausubel et al., vyd.: Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, 1987).
Prehybridizace se provádějí při 65°C v H-pufru (0,25 M Na2HPO4, pH 7,2, 7 % SDS) po 15 minut. Hybridizace se provádějí přes noc (65°C, H-pufr) s izotopově značenou cDNA sondou o alespoň 106 cpm/ml. Membrána se pak promyje s 20 mM Na2HPO4, pH 7,2, 5 % SDS (65°C, 2 x 15 min.) a hodnotí autoradiografií.
Tatáž se použije k sondování hsp70 mRNA a měření GAPDH mRNA, používané jako vnitřní standard.
Tento vynález dále zahrnuje způsob léčby nebo prevence různých patologických stavů, například chorob spojených s fungováním chaperonového systému a s poškozeními v buněčných membránách a membránách buněčných organel, pomocí podávání účinného množství hydroxylaminových derivátů, jejichž tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, ke kontrole patologických stavů v organismu. V patologických stavech je v buňkách indukována charakteristická exprese molekulárních chaperonů. Zvýšená exprese molekulárních chaperonů v těchto buňkách jim může napomáhat v nápravě poškození, způsobovaných • · · • · · · . ~ · ···· ·· — 42 “ ··*··· ·· ·· ·· · patologickými stavy, a rovněž při obnovování buněčné homeostatické rovnováhy.
Takovéto patologické stavy zahrnují ischemii, nádorová onemocnění, infekce způsobované mikroorganismy, autoimunní onemocnění a dermatózy.
Jak se zde používá, léčba znamená zlepšování klinického stavu subjektu, a nutně neindikuje, že by se dosahovalo úplného vyléčení. Zlepšování odkazuje na zkrácené trvání chosoby nebo snížení závažnosti choroby, nebo subjektivní zlepšení kvality života subjektu, nebo prodloužené přežití pacienta.
Účinné množství hydroxylaminu podle vynálezu k léčbě odkazuje na množství dostatečné ke zlepšení klinického stavu, jak je popsáno shora. Účinné množství závisí na faktorech jako je způsob podávání a může být snadno stanoveno tím, kdo je zběhlý v oboru. Hydroxylaminové deriváty podle vynálezu lze podávat parenterálně nebo orálně, s výhodou orálně a místně, a účinné množství je 10 - 500 mg/kg tělesné hmotnosti, Výhodněji je účinné množství 20 - 100 mg/kg tělesné hmotnosti.
Při použití způsobu léčby podle vynálezu mohou být tkáně myokardu, mozku a ledvin ochráněny před poškozením tkáně nebo nekrózou, způsobovanou ischemii, přičemž daný způsob zahrnuje podávání účinného množství hydroxylaminových derivátů podle vynálezu subjektu ke snížení, prevenci nebo reverzi škodlivých účinků prolongované ischemie.
Tento vynález zahrnuje použití hydroxylaminových derivátů, jejichž tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, k k výrobě prostředku k léčení patologických stavů zde popsaných.
Ve způsobu měření ochranného účinku hydroxylaminových derivátů se používá test na zvířatech, jak následuje. Potkani jsou anestetizováni pentobarbitalem sodným (Nembutal, 60 mg/kg tělesné hmotnosti, i.p.) a uměle ventilováni ovzduším místnosti (2 ml/100 g, 54 cyklů za minutu) prostřednictvím tracheoktomie. Pravá karotidová tepna se kathetrizuje a spojí se s převodníkem tlaku (BPR-01, Stoelting) k měření systémového tepenného krevního tlaku (BP) pomocí předzesilovače (Hg-02, Experimetria).
·· ···· • ···· ·· ·· ··· «··· · · • ··· · · · · · · · • · · · · ··· · ··· · • · · · · · · ·*· ··· ·· ·· ·· ·
Hydroxylaminové deriváty podle vynálezu se podávají prostřednictvím kanyly k jugulární žíle (i.v) nebo orálně (p.o.). Tep (HR) se měří kardiotachometrem (HR-01, Experimetria) a snímá se elektrokardiogram (ECG standardní vedení II) na záznamové zařízení (MR-12, Medicor) pomocí podkožních nerezových jehlových elektrod. Hrudník se otevře levou thoraktomií a pak se srdce exteriorizuje jemným tlakem na pravou stranu hrudního koše. Aplikuje se tlačka pod levou hlavní koronární arterií, jak je popsáno Selyem et al. (1960). Srdce se opatrně umístí zpět do hrudníku a zvíře je ponecháno zotavit se. Monitoruje se rektální teplota a udržuje se konstantní na 37°C. Experimentální protokol začíná 15 minutovou stabilizační periodou. Když se během této periody pozoruje trvale krevní tlak nižší než 70 mm Hg nebo arytmie, zvíře se vyřadí z dalšího experimentování. Myokardiální ischemie se pak vyvolá koronární okluzí po 5 minut a reperfuze se ponechá po 10 minut.
V průběhu celého pokusu se nepřetržitě zaznamenávají na vícekanálovém zapisovači (R61-6CH, Medicor) krevní tlak (BP), tep (HR) a EKG. Hydroxylaminové deriváty se podávají v 5. a 60. minutě před okluzí i.v. nebo p.o. cestou. Dávky hydroxylaminových derivátů mohou být 0,5, 0,75, 1,0 mg/kg i.v. a 100 mg/kg tělesné hmotnosti p.o., zatímco referenční substance Bepiridil se podává v dávce 1,0 mg/kg i.v. Střední trvání ventrikulární tachykardie (VT) a/nebo ventrikulární fibrilace (VF) v průběhu prvních 3 minut reperfuze se měří a analyzuje.
Tento vynález zahrnuje rovněž způsob udržování fluidity buněčné membrány, když je fluidita buněčné membrány ovlivněna v důsledku fyziologického stresu. Tento způsob zahrnuje působení na buněčné membrány nebo membrány buněčných organel, jež mají změněnou membránovou fluiditu, účinným množstvím hydroxylaminových derivátů k nápravě fluidity řečené membrány. Experimentální protokol uváděný v souvislosti s Příkladem 9 (rovnovážná DPH fluorescenční anisotropie) lze použít pro stanovení účinku hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na fluiditu buněčné membrány.
- 44 • · · · · · · • · ·· ··
Jak bylo zmíněno, tento vynález zahrnuje způsob léčby patologických stavů spojených s buněčnou membránou a membránou buněčných organel. Jedním příkladem takovéhoto patologického stavu je dieabetes mellitus, jakož i choroby spojené s poškozením mitochondrií, jako je ALS (amyotropická laterální skleróza), Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba (HD), určité kardiomyopatie, jako ty, co mají toxický původ, způsobované alkoholem a těžkými kovy, zánětlivé a virální kardiomyopatie, nebo autoimunní kardiomyopatie. V tomto způsobu mohou být použity hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II.
Způsob podle vynálezu může být použit v léčbě nádorových onemocnění. přičmž tento způsob zahrnuje podávání účinného množství hydroxylaminových derivátů organismu s nádorem k zábraně tvorby nebo růstu nádorů. V tomto způsobu mohou být použity hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II.
Farmaceutické a hydroxylaminové deriváty kosmetické prostředky obsahující
Jak již bylo zmíněno, tento vynález se rovněž týká použití hydroxylaminových derivátů obecných vzorců I a II, včetně jejich opticky aktivních stereoisomerů, k výrobě farmaceutických prostředků (a případně kosmetických prostředků) užitečných pro léčbu kardiovaskulárních, vaskulárních, alergických, imunitních, autoimunitních, chorob, chorob způsobovaných virovými a bakteriálními infekcemi, nádorových onemocnění, chorob kůže a sliznice, nebo chorob ledvinových kanálků, provokovaných fyziologickým stresem, nebo těchto stavů, způsobovaných rovněž fyziologickým stresem, jež mohou být léčeny kosmetickou intervencí, přičemž obecné vzorce I a II, nebo jejich soli, zahrnují jejich opticky aktivní stereoisomery.
A je alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, aralkyl substituovaný v arylové nebo alkylové části, aryl, substituovaný • · ·· · aryl, heteroarylová nebo substituovaná heteroarylová skupina,
Z je kovalentní vazba, kyslík nebo =NR3, kde R3 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, aralkylu a aralkylu substituovaného v arylové a/nebo alkylové části,
R je alkyl nebo substituovaný alkyl,
X v tautomeru obecného vzorce I je halogenová nebo substituovaná hydroxylová nebo aminová, monosubstitiuovaná aminová nebo disubstitiuovaná aminová skupina a
X v tautomeru obecného vzorce II je kyslíková, iminová nebo substituovaná iminová skupina a
R' je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, aralkyl, aralkyl mající substituovanou arylovou nebo alkylovou část, a acylová nebo substituovaná acylová skupina, a sloučeniny obecného vzorce I případně obsahují intramolekulární kruhové struktury tvořené spojením X a reaktivního substituentu.
S použitím těchto sloučenin lze připravovat prostředky jak pro preventivní, tak pro léčebné účele, jež mohou být užitečné při podávání nebo aplikaci na lidský nebo zvířecí organismus při prevenci nebo kontrole poškození buněk, způsobovaného shora uvedenými chorobami, a tedy při zvolňování nebo odstraňování patologického stavu daného organismu.
Tyto prostředky mohou být připravovány způsoby známými per se v přípravě kosmetických a farmaceutických prostředků, smícháním aktivního materiálu s odpovídajícími nosiči a/nebo přídavnými látkami. Dané prostředky obecně obsahují 0,5 až 99,5 % hmotn. aktivní sloučeniny. Množství aktivního materiálu v prostředku je určeno povahou a vážností onemocnění, věkem pacienta a způsobem léčby. Hydroxylaminové deriváty obecných vzorců I a II lze formulovat do přípravků k orálnímu a parenterálními jakož i k místnímu použití.
Denní dávka aktivní sloučeniny je kolem 10 až 500 mg/kg, s výhodou 10 až 500 mg/kg, a je, obzvlášú v případě orálních prostředků, rozdělena pro 2-3 podávání.
• · • · · ·
Pro účele orálního podávání jsou prostředky formulovány do dražé, granulátu a když je to žádoucí roztoku nebo suspenze. Parenterální prostředky zahrnují vodné suspenze a sterilní injikovatelné roztoky, zatímco rektální formy podávání jsou, mezi jiným, čípky a místní formy zahrnují mazání, krémy emulze a gely.
Pro přípravu tablet se míchá aktivní složka s vhodným nosičem, jako je škrob, želatina, laktosa, stearát hořečnatý, talek, arabská guma a silikagel, směs se granuluje a slisuje do tablet.
Pro přípravu dražé se z aktivních složek a přídavných látek připraví směs podobná jeko shora, tato směs se granuluje, granulát se slisuje do jádra, jež se pak potáhne cukrem, např. s použitím cukr obsahujícího polyvinylpyrrolidinového roztoku.
Pro přípravu formy kapslí se aktivní složky smíchají s přídavnými látkami, jako je škrob, talek, křemelina, mikrokrystalická celulosa, a směs se želatinových kapslí.
Tyto orální prostředky mohou podporují nebo zpomalují absorbci.
Syrupy, elixíry nebo kapky mohou být připraveny, když se vedle aktivní složky použijí sladidla, methyl- nebo propylparaben, a pokud je to žádoucí, ochucující přídavky, a smíchá se s nimi vodný roztok aktivní složky.
Pro rektální podávání lze čípky připravovat s použidím vhodných přídavných látek, jako je kakaové máslo nebo polyethylenglykol.
Prostředky, vhodnými k parenterálnímu podávání, mohou být injekce, připravované rozpouštěním aktivní složky v sterilním isotonickém solném roztoku, nebo vodné suspenze, jež mohou být připravovány s použitím vhdných dispergačních a zvlhčovačích činidel, jako je propylenglykol a butylenglykol.
Krémy a mazání k místnímu použití lze připravit s použitím primárních nebo sekundárních alkoholů, jako jsou cetylalkohol, stearylalkohol, glycerolu, přírodních tuků a olivový olej, olej z pšeničných klíčků, plní do tvrdých nebo měkých být doplněny aditivy, jež olejů, jako jsou lanolin, delších uhlovodíků, jako je vazelína, jakož i colulosových derivátů. Tyto • · · · • · · ···· ·· ···· · ·· · · ·
látky, jako je kosmetické nebo podobnou cestou, ve vodě rozpostné zahřátím. Když je prostředky mohou obsahovat konzervační methyl-p-hydroxy benzoát.
Prostředky k použití jako lékařsko-kosmetické přípravky lze připravit S výhodou se smíchají lipofilní složky, a složky se rozpustí ve vodě, případně s mírným to žádoucí, upraví se pH směsi lipofilních složek na vhodnou hodnotu a získaná emulze se míchá za chlazení. Aktivní složka se přidá do směsi takto získané ve formě vodného roztoku.
Farmaceutické a kosmetické prostředky, jež obsahují nové hydroxylaminové deriváty, popsané podrobně ve zvlášní sekci tohoto popisu, lze rovněž připravovat shora uvedenými postupy, Tyto prostředky jsou rovněž předmětem vynálezu.
Jedno provedení farmaceutických a kosmetických prostředků podle vynálezu obsahuje hydroxylaminové deriváty podle obecného vzorce I v množství 0,5 až 99,5 % hmotn. spolu s nosiči a přídavnými látkami obecně používanými v takovýchto prostředcích, kde
X je halogen, s výhodou chlór nebo bróm,
Z je chemická vazba a al) A je skupina obecného vzorce (a), kde Y1 je halo-, alkoxy-, haloalkylová nebo nitroskupin a n je 1, 2 nebo 3; nebo O-obsahující heteroaryl, s výhodou furyl, S-obsahující heteroaryl, s výhodou thienyl, neo N-obsahující heteroaromatická skupina případně kondenzovaná s benzenovým kruhem, nebo její Ν-01-4 alkyl kvarterní derivát nebo N-oxid, s výhodou pyridyl, chinolyl nebo isochinolyl,
R je skupina mající strukturu (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R a R , spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený • · • ·
- 48 heterocyklický kruh. Υθ je -OR?, kde R7 je H nebo acylová skupina, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl, arylkarbonyl, nebo aminoacyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1,2 nebo 3 nebo jejich N-C1_4 alkyl kvarterní derivát nebo N-oxid, s výhradou, že když A je pyridyl nebo naftyl nebo skupina obecného vzorce (a), kde Y je halo nebo alkoxy, pak R je jiné než H, nebo a2) A je skupina obecného vzorce (c),
R je skupina obecného vzorce (d), a případné substituenty Y2 a Y3, z nichž alespoň jeden musí být v molekule přítomný, jsou kyslík, nebo C1-4 alkyl a k je 1, 2 nebo 3a m je 1, 2, nebo 3; a když je daná sloučenina mono- nebo bivalentní kationt, jejími anionty jsou jeden nebo dva halidy, s výhodou jódové ionty,
b) X je -NrIr2 , R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný heterocyklický kruh, jenž může obsahovat jeden nebo více dalších heteroatomů,
A je nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl
Z je kyslík nebo =NR3 skupina, kde R3 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl,
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C4_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -OR7, kde R7 je H nebo acyl, s výhodou • ·
- 49 nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo arylkarbonyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3, nebo
c) X je -0Q, kde Q je nesubstituovaný nebo substituovaný aryl nebo aralkyl,
Z je kyslík a
R je skupina obecného vzorce (b) , kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh. Y6 je -0R7, kde R7 je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl, arylkarbonyl nebo aminoacyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3, nebo
d) A je nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl, nebo N-obsahující heteroaromatická skupina, s výhodou pyridyl, nebo S-obsahující heteroaromatická skupina,
Z je chemická vazba,
X je -0Q, kde Q je C1-4 alkyl a
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H, kje 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Jiná skupina farmaceutických a kosmetických prostředků podle vynálezu zahrnuje ty, jež spolu s nosiči a přídavnými látkami obsahují hydroxylaminové deriváty obecného vzorce I v množství kolem 0,5 až 99,5 % hmotn. nebo jejich soli a/nebo jejich opticky aktivní stereoisomery, kde
X je -NrIr2, R1 a R2 nezávisle na sobě jsou H, nesubstituovaný nebo substituovaný přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl, nebo cykloalkyl, nebo R1 a R2 spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterokruh, kondenzována isochinolyl
A je nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, s výhodou fenylakyl substituovaný jednou nebo více alkoxy skupin, s výhodou cl-4 alkoxy, nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný jednou nebo více halo-, alkyl-, haloalkyl-, acylamino- nebo nitroskupinami, nebo nesubstituovaná nebo substituovaná N-obsahující heteroaromatická skupina, jež je případně s benzenovým kruhem, s výhodou pyrrolyl, pyridyl, nebo chinolyl, nebo S-obsahující heteroarylová skupina, s výhodou thienyl, přičemž dané heteroarylové skupiny mohou mít jeden nebo více substituentů, s výhodou jeden nebo více alkylůy, s výhodou 01-4 alkylů,
Z je chemická vazba,
R je skupina struktury (e), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C^_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R a R , spolu s dusíkovým atomem k nim připojeným, tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, jenž může obsahovat další heteroatomy a mít substituenta(y), s výhodou C1-4 alkyl; Y4 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný c1_4 alkyl, Y5 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný C1-4 alkyl, nebo OR7, kde R je H nebo acyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3 s výhradou, že když A je nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný halogenem nebo alkoxy, nebo fenylalkyl substituovaný alkoxy, nebo pyridylová skupina a R7 je H, pak alespoň jeden z R1 a R2 je jiný než H, nebo • · • · · · ··· • · · · • · · · když A je nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný halogenem nebo alkoxy, nebo fenylalkyl substituovaný alkoxy, nebo pyridylová skupina, a R1 a R2 jsou oba H, pak R7 je jiný než H.
Jiná skupina farmaceutických a kosmetických prostředků podle vynálezu zahrnuje ty, jež spolu s nosiči a přídavnými látkami obsahují v množství kolem 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylaminové deriváty obecného vzorce I nebo jejich soli a/nebo jejich opticky aktivní stereoisomery, kde
a) X je kyslík,
A je ci_20 Přímý nebo větvený alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl nebo haloalkyl-fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, naftyl, nebo N-obsahující heteroaromatická skupina, s výhodou pyridyl,
Z je chemická vazba,
R' je H, C1-4 alkyl nebo aralkyl, s výhodou fenylalkyl,
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou Ο^_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6 spolu s N-atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo -OR7, kde R7 je H, k je 1,2 nebo 3, a m je 1,2 nebo 3 s výhradou, že když A je jiné než alkyl a R' je H, pak Y6 je H, nebo
b) X je =NR4 , kde R4 je H, nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, s výhodou fenyl, nebo nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenylalkyl, • · · · · ·
A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl nebo nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl nebo substituovaný fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, s výhodou fenylalkyl, nebo cykloalkyl,
Z je chemická vazba, kyslík nebo =NR3 skupina, kde R3 je H nebo nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl,
R' je nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, s výhodou fenyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, s výhodou fenylalkyl, a
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R^ a R® spolu s N-atomem k nim připojeným tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo -OR7, kde R7 je H nebo acyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3, nebo
c) X je kyslík,
A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, s výhodou fenylalkyl,
Z je kyslík,
R' je alkyl nebo aralkyl, s výhodou fenylalkyl,
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C4_4 alkyl nebo cykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo -OR7, kde R7 je H nebo acyl, s výhodou nesubstituovaný nebo substituovaný alkylkarbonyl nebo arylkarbonyl, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3, nebo • · ·· ·
d) A je nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl, eykloalkyl, nesubstituovaný nebo substituovaný aralkyl, s výhodou fenylalkyl, nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný halo-, haloalkyl-, alkoxy- nebo nitroskupinou,
R' je alkyl nebo aralkyl, s výhodou fenylalkyl,
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C1-4 alkyl nebo eykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo -OH, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3, nebo η
d2) A je skupina obecného vzorce (a), kde Y je haloalkyl, s výhodou trifluormethyl a n je 1, 2 nebo 3,
R' je H,
R je skupina obecného vzorce (b), kde R5 a R6 nezávisle na sobě jsou H, přímý nebo větvený alkyl, s výhodou C4_4 alkyl nebo eykloalkyl, nebo R5 a R6, spolu s N-atomem k nim připojeným, tvoří nasycený 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, Y6 je H nebo -OH, k je 1, 2 nebo 3, a m je 1, 2 nebo 3.
Jiná skupina farmaceutických a kosmetických prostředků podle vynálezu zahrnuje ty, jež spolu s nosiči a přídavnými látkami obsahují v množství kolem 0,5 až 99,5 % hmotn. hydroxylaminové deriváty obecného vzorce I nebo jejich soli a/nebo jejich opticky aktivní stereoisomery, kde
A je nesubstituovaný fenyl nebo fenyl substituovaný halo-, nebo nitroskupinou, N-obsahující heteroarylová skupina, s výhodou pyridyl, • ·· · ··· • · ·· ····
··
R1 je H, a
R'' je CO-amino-alkylová skupina, jež může být mono- nebo disubstituovaná, přičemž alkylový řetězec má 1 - 5 uhlíkových atomů, a dané amino substituenty, nezávisle na sobě, mohou být jedním nebo dvěma přímými nebo větvenými alkyly nebo cykloalkyly, nebo dané dva amino substituenty, spolu s N atomem k nim přilehlým tvoří 3- až 7-členný, s výhodou 5- až 7-členný nasycený heterocyklický kruh, nebo jeho N-C4_4 alkylový kvartem! derivát, s výhradou že když A je pyridyl, R'' je jiný než 1-piperidinylmethyl.
Provedení vynálezu jsou vysvětlena podrobněji v následujících příkladech. Musí se však chápat, že rozsah ochrany není omezen na specifická provedení udávaná v Příkladech.
Příklady provedení vynálezu
CHEMICKÉ PŘÍKLADY A PŘÍKLADY PROSTŘEDKŮ
Příklad 1
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
5,0 g (15,6 mmol) N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]2-thiofenkarboximidamid monohydrochloridu (Příklad 44) se rozpustilo v 19 ml vody, pak se přidalo 6,1 ml koncentrované kyseliny solné. Roztok byl ochlazen na - 5”C, pak se po kapkách přidal chladný roztok 4,4 g (63,8 mmol) dusitanu sodného ve 2,4 ml vody. Během celé reakce byla vnitřní teplota udržována na 0°C. Když bylo přidání úplné, směs se míchala po další jednu hodinu.
• ·· · • · ·
Byl přidán chladný benzen (60 ml) a směs byla zalkalizována pomalým přidáním chladného roztoku 3,2 g (80 mmol) hydroxidu sodného v 45 ml vody. Organická fáze byla oddělena a promývána postupně 20 ml porcemi vody dokud pH < 9 (3 - 5 krát). Organický roztok byl vysušen nad bezvodým síranem sodným, zpracován s uhlím, zfiltrován a odpařen ve vakuu (t < 45°C) za poskytnutí
2,6 g oleje. Tento zbytek byl rozpuštěn v 5 ml isopropylalkoholu a okyselen (pH 2) isopropylalkoholem obsahujícím suchý chlorovodík. Produkt byl krystalizován z n-hexanu za poskytnutí vyběleného materiálu.
Výtěžek: 2,0 g (38 %)
B.t.: 115—123°C
Podle postupu z předcházejícího příkladu byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 2
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-1-isochinolinkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výchozí materiál: Příklad 46 Výtěžek: 48 %
B.t.: 168-172°C
IČ (KBr): 3425, 3128 , 2947, 2866 , 2650, 2540, 1622 , 1597 ,
1556 , 1452 , 1385 , 1364, 1329, 1296, 1281, 1240 ,
1117 , 1092 , 1024 , 1015 , 978, 953, 903 , 881 , 795,
743, 718, 658, 559 cm
Příklad 3
Ν-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-l-chinolinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
V tomto případě byl na konci postupu zpracování konečný produkt izolován rozpuštěním surové báze v acetonu a přidáním ekvivalentního množství kyseliny maleinové.
Výchozí materiál: Příklad 42
Výtěžek: 67 %
B.t.: 159-162°C
IČ (KBr): 3427, 3019, 2947, 2886, 2689, 1583, 1477, 1450,
1352, 1293, 1221, 1194, 1132, 1072, 1045, 939,
919, 872, 833, 754, 650, 557 cm'1
Příklad 4
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-nitro-benzenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výchozí materiál: Příklad 40 Výtěžek: 58 %
B.t.: 185-189°C
Příklad 5
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-4-nitro-benzenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výchozí materiál: Příklad 43 Výtěžek: 47 %
B.t.: 180-182°C *· ····
IČ (KBr): 3331, 2953 , 2853 , 2735, 2654, 2577, 1605, 1568 ,
1516 , 1456 , 1348 , 1261, 1165, 1119, 1072 , 1059 ,
1007 , 960 , 933 , 862, 849, 754, 719 , 690 , 627,
581, 550, 478 cm
Příklad 6
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-nitro-benzenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výchozí materiál: Příklad 45 Výtěžek: 50 %
B.t.: 159-162°C
IČ (KBr): 3298, 2983 , 2932, 2746, 1593, 1574, 1535, 1445,
1391, 1354 , 1317 , 1288, 1242, 1198, 1092, 1069 ,
1020 , 968 , 947, 914, 852, 793, 756 , 708 , 627,
577 , -1 cm
Příklad 7
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-furankarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Postup:
l-Chlor-2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propan [J. Org. Chem. 33(2) str. 523-30 (1968)] (3,0 g, 116,9 mmol) byl rozpuštěn ve vodě (1,8 ml). Přidal se pevný NaOH (1,19 g, 29,8 mmol) a směs se míchala za pokojové teploty po 1 hodinu. Přidal se N-hydroxy-2furankarboximidamid (1,92 g, 15,2 mmol) a směs se ponechala míchat za pokojové teploty přes noc. Přidala se koncentrovaná HC1 (2,1 ml) k úpravě pH na přibl. 4 a roztok byl odpařen ve vakuu do sucha.
Zbytek (5,4 g) byl rozpuštěn v konc. HC1 (37 ml), ochlazen na 0 - 5’C a po kapkách se během 30 minut přidal vodný roztok
9999
- 58 NaNO2 (5,6 g, přidáním 2 N ethylácetátem mmol v 23 ml vody). Roztok se pak zalkalizoval roztoku NaOH (102 ml) na pH = 10, a zextrahoval (2 x 130 ml). Spojené organické fáze se promyly vodou, vysušily nad bezvodým Na2SO4 a odpařily. Zbytek (2,0 g) byl rozpuštěn v malém objemu ethylacetátu (20 ml) a produkt byl sražen přidáním isopropanolového roztoku HC1 (3,2 N, 3 ml). Získaná bílá sraženina byla zfiltrována, promyta a konečně rekrystalizována z isopropanolu.
2745, 1637,
Výtěžek: 11 %
B.t.: 139-141°C
IČ (KBr): 3427, 3267, 3094, 2955, 2922, 2964,
1584, 1479, 1452, 1391, 1319, 1281, 1259, 1157,
1074, 1024, 999, 980, 943, 887, 854, 843, 743,
710, 596 cm1
Podle postupu z předcházejícího příkladu byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 8
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-4-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
V tomto případě byl na konci postupu zpracování konečný produkt izolován rozpuštěním surové báze v acetonu a přidáním ekvivalentního množství kyseliny maleinové.
Výtěžek: 25 %
B.t.: 165,5—169°C • · · ·
Příklad 9
N- [ 3 - [ (1,1-dimethyljamino]-2-hydroxypropoxy]-3-trifluormethyl-benzenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Postup:
a) 50 g (0,245 mol) m-trifluormethyl-benzamidoximu a 33,7 g (0,6 mol) hydroxidu draselného se rozpustilo ve směsi dimethylsulfoxidu a 170 ml vody a směs byla ochlazena na 0°C. Přidalo se 48 ml (0,6 mol) epichlorhydrinu a reakční směs byla míchána po 5 hodin při 0°C a ponechána v lednici přes noc. Další den se přidalo 250 ml vody, a směs se extrahovala ethylacetátem (4 x 250 ml). Spojené organické fáze se promyly vodou, vysušily, zpracovaly s uhlím a odpařily do sucha za poskytnutí m-trifluormethyl-N-(2,3-epoxypropoxy)-benzamidinu jako bezbarvého oleje.
Výtěžek: 61 g (96 %)
b) K získanému oleji se přidalo 400 ml 18 % roztoku kyseliny chlorovodíkové a 60 ml etheru a směs byla ochlazena na -5°C za míchání. Během 40 minut se pomalu přidalo 17,4 g (0,25 mol) dusitanu sodného rozpuštěného v 60 ml vody a reakční směs byla míchána dalších 20 minut. Směs se pak extrahovala etherem (2 x 160 ml) a spojené organické fáze se promyly dvakrát vodou. K éterovému roztoku se přidalo 340 ml 20 % roztoku hydroxidu sodného a dvoufázový systém byl za míchání refluxován po 1 hodinu. Fáze pak byly odděleny, organická vrstva byla promývána solným roztokem do neutrality, vysušena a odpařena do sucha za poskytnutí m-trifluormethyl-N-(2,3-epoxypropoxy)-benzimidoyl chloridu jako bezbarvého oleje.
Výtěžek: 30,5 g (45 %)
c) Směs 1,19 g (4,2 mmol) m-trifluormethyl-N-(2,3-epoxypropoxy ) -benzenkarboximidoyl chloridu a 0,89 ml (8,5 mmol) terc-butylaminu v 12 ml isopropylalkoholu se refluxovala po • · to · · · hod. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, přidalo se 0,98 ml methanolového roztoku chlorovodíku (4,3 N) a směs byla zkoncentrována pod vakuem na malý objem, pak zředěna etherem. Sraženina, jež se vytvořila, se promyla chladným etherem a vysušila.
Výtěžek: 0,48 g B.t.: 150-153°C IČ (KBr): 3423
1441
1072 (32 %)
3233, 2978, 2880, 2784, 1620. 1570, 1479, 1400, 1383, 1340, 1238, 1167, 1128, 1101, 982, 930, 897, 804, 787, 714, 694 cm“1
Podle postupu z předcházejícího příkladu byly připraveny následuj ící sloučeniny:
Příklad 10
N-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]-3-trifluormethyl-benzenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výtěžek: 35 %
B.t.: 105—108°C
IČ (KBr): 3358, 2984, 2883, 2804, 1595, 1441, 1383, 1335,
1238, 1184, 1171, 1121, 1099, 1074, 1011, 995,
947, 906, 891, 798, 779, 696, 681, 567 cm1
Příklad 11
N-[3-(cyklohexylamino)-2-hydroxypropoxy]-3-trifluormethylbenzenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výtěžek: 35 % B.t.: 147-149,5°C
IČ (KBr): 3381, 2951, 2860, 2820, 1580, 1439, 1344, 1267,
1161, 1126, 1099, 1074, 1003, 986, 932, 903, 872, 802, 787, 716, 692, 681, 648 cm-1
Příklad 12
N-[3-(diethylamino)-2-hydroxypropoxy]-3-trifluormethylbenzenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výtěžek: 21 %
B.t.: 121—128°C
IČ (KBr): 3425, 3289, 2951, 2667, 1818. 1443, 1337, 1238,
1178, 1115, 1078, 1049, 997, 910, 804, 781, 696,
683 cm-1
Příklad 13
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-trifluormethylbenzenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid
Výtěžek: 13 %
B.t.: 119-123°C
IČ (KBr): 3366, 2937 , 2854, 2737, 2673, 2538, 1616 , 1570
1439 , 1404 , 1337, 1290, 1236, 1199, 1165, 1101
1074 , 1030 , 984, 972, 933, 901, 829 , 804, 788
717 , 699 , 685, 646 cm-1
• · · ·
Příklad 14
N-[2-hydroxy-3-(piperidin-l-oxid-l-yl)propoxy]-N'-oxy-3pyridinkarboximidoyl chlorid
Postup:
K roztoku N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu (5,0 g, 17,1 mmol) v chloroformu (50 ml) se v malých porcích přidala kyselina m-chlorperbenzoová (7,0 g, 40 mmol), a směs se míchala při pokojové teplotě po 2 hodiny.
Rozpouštědlo bylo odstraněno, ethylacetátu, extrahován vodou, olejovitý produkt byl nakonec poskytnutí produktu jako bělavé pevné látky.
zbytek rozpuštěn v 80 ml vysušen a odpařen. Získaný krystalizován s acetonem za
Výtěžek: 2,21 g (6,7 mmol, 40 %)
B.t.: 140-142°C
IČ (KBr): 3437, 3071, 2943, 2880, 2590, 1801, 1578, 1475,
1454 , 1433, 1375, 1294, 1259, 1194, 1165, 1121,
1088 , 1043, 1011, 995, 924, 905, 888 , 845 , 808,
710 , 671, 554, 513 , 413 cm-1
Příklad 15
N-[2-hydroxy-3-(piperidin-l-oxid-l-yl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid
Postup:
K roztoku N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu (2,0 g, 6,8 mmol) v chloroformu (20 ml) se přidala kyselina m-chlorperbenzoová (1,6 g o 70 % čistoty, 6,5 mmol), a směs se míchala při pokojové teplotě po 30 minut. Roztok se zalkalizoval přidáním 10 % roztoku hydroxidu sodného, pak oddělil a organická vrstva byla promyta solným roztokem, vysušena a odpařena. Tuhý zbytek byl rekrystalizován s ethylacetátem, precipitát byl zfiltrován, promyt a vysušen za získání produktu jako bílé pevné látky.
Výtěžek: 1,03 g (48 %)
B.t.: 127-130°C
IČ (KBr): 3454, 2988, 2945, 2880, 2585, 1585, 1512, 1479,
1443 , 1416, 1393, 1350, 1331, 1289, 1183, 1134,
1072 , 1051, 1030, 997, 953, 939, 879, 847, 808,
702 , 519, 417 cm-1
Příklad 16
N'-[2-hydroxy-3-(1-methyl-l-piperidinium-l-yl)propoxy]-N-methylpyridinium-3-karboximidoyl chlorid dijodid
Postup:
Směs N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu (1,0 g, 3,4 mmol) a 1,2 ml (20 mmol) methyljodidu byla refluxována v acetonu (10 ml) pod dusíkem po 2 hodiny. Výsledný tmavě žlutý precipitát byl zfiltrován a promyt acetonem za získání surového produktu (1,8 g), jenž byl pak rekrystalizován z 20 ml ethanolu
Výtěžek: 1,2 g (60 %)
B.t.: 153-157°C
IČ (KBr): 3462, 3406, 3317 ,
1589, 1504, 1461
1121, 1069, 1047,
706, 673, 635, 589 cm
2941, 2878, 2831, 1729, 1636,
1378, 1350, 1290, 1209, 1171,
1030, 1101, 941, 897, 868, 818, -1 • · • · • · · ·
Příklad 17
N-[2-acetoxy-3-(l-piperidinyUpropoxyJ-l-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
Postup:
1,48 g (5,0 mmol) N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chloridu bylo rozpuštěno v 5 ml acetanhydridu. Teplota směsi byla zvýšena na 40 °C. Po 30 minutách bylo rozpouštědlo při pokojové teplotě úplně odstraněno ve vakuu, zbytek byl rozpuštěn v 30 ml diethyletheru, zpracován s uhlím, zfiltrován a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku za poskytnutí 1,74 g oranžově zabarveného oleje.
Zbytek byl rozpuštěn v 10 ml acetonu a byl přidán roztok 0,6 g (5,17 mmol) kyseliny maleinové v 10 ml acetonu. Krystalický produkt byl oddělen filtrací a promyt acetonem za poskytnutí 1,43 g bělavého materiálu. Rekrystalizace, s odbarvením, z 9 ml isopropylalkoholu poskytla titulní sloučeninu.
Výtěžek: 1,22 g (54 %)
B.t.: 143-144°C
Příklad 18 (S)-N-[2-[2-(R)-(1,1-dimethylethyloxykarbonylamino)-3-fenylpropionyloxy]-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
Postup:
6,7 g (25,5 mmol) N-(terc-butoxykarbonyl)-D-fenylalaninu bylo rozpuštěno v 50 ml dichlormethanu. Roztok byl ochlazen na 0°C a po kapkách se přidalo 4,0 ml triethylaminu a pak 2,5 ml (26 mmol) chlormravenčanu ethylnatého. Směs se míchala po 20 minut při 0°C a pak se během 30 minut přidal roztok N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu.
Reakční směs se míchala při pokojové teplotě po 1 hodinu. Roztok byl extrahován napřed 10 % kyselinou octovou (2 x 100 ml), pak vodou, vysušen bezvodým síranem sodným, a odpařen do sucha. Zbytek (10,7 g) byl rozpuštěn v 71 ml acetonu a bylo přidáno 1,53 g (13 mmol) kyseliny maleinové. Výsledná pevná látka byla zfiltrována a promyta acetonem.
Výtěžek: 4,0 g (6,0 mmol, 23 %)
B.t.: 146,5-148°C
[a] D = + 21,5” [c = 1, MeOH]
IČ (KBr): 3393, 2978, 1744 , 1697 , 1582 , 1518 , 1468, 1454,
1420, 1381, 1358 , 1313, 1290, 1256 , 1169, 1126,
1099, 1084, 57 5 cm·'· 1045 , 1016 , 930 , 908, 870 , 750, 690,
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 19 (R)-N-[2-[2-(S)-(l,1-dimethylethyloxykarbonylamino)-3-fenylpropionyloxy]-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
Výtěžek: 25 %
Tato sloučenina má stejná fyzikální data (b.t., IČ) jak se píše v Příkladu 18.
[a]D = - 23,6° [c = 1, MeOH] • ·
Příklad 20
N-[2-benzoyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid (Z)-2-butendioát (1:1)
Postup:
20,9 g (75,0 mmol) N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]3-pyridinkarboximidamidu [maďarský patent č. 177.578 (1976)] se rozpustilo v 300 ml benzenu. K tomuto roztoku se přidalo 150 ml
N roztoku hydroxidu sodného, s následným přidáním 19,5 ml (168 mmol) benzoylchloridu po kapkách. Po intenzivním míchání směsi po hodiny se přidalo 7,1 g (67 mmol) uhličitanu sodného a další porce benzoylchloridu (9,75 ml, 84 mmol). Pak byly fáze odděleny a organická vrstva byla extrahována 1 sodného a vodou, vysušena a odpařena g oleje) byl rozpuštěn v 150 ml acetonu a bylo přidáno 8,7 g (75 mmol) kyseliny maleinové. Získaný precipitát byl zfiltrován, promyta acetonem a usušen.
N roztokem hydroxidu do sucha. Zbytek (41
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 21
N-[2-benzoyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
Výchozí materiál: U.S. patent č. 5 147 879 (1992) Výtěžek: 64 %
B.t.: 134-136°C
IČ (KBr): 2955 , 2939 , 2517 , 1718 , 1583, 1477, 1452, 1410 ,
1370 , 1354 , 1317 , 1268 , 1209, 1173, 1117, 1057 ,
1057, 1043 , 998, 968 , 939, 870, 748, 723, 714 ,
652 , 582 cm- 1
Příklad 22
N-[2-palmitoyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Postup:
14,7 g (52,8 mmol) N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]3-pyridinkarboximidamidu [maďarský patent č. 177.578 (1976)] se rozpustilo ve 160 ml chloroformu, přidalo se 7,7 ml (55 mmol) triethylaminu, s následným přidáním palmitoylchloridu (14,7 g, 56,5 mmol), v 85 ml chloroformu, po kapkách. Směs se míchala přes noc za pokojové teploty. Další den se přidalo další množství 3,8 ml triethylaminu a 7,4 g palmitoylchloridu, a v míchání se pokračovalo ještě jeden den. Roztok pak byl extrahován postupně vodou, 5 % kyselinou octovou a vodou, vysušen bezvodým síranem sodným, a odpařen do sucha.
Zbytek (28,2 g oleje) byl rozpuštěn v ethylacetátu a produkt byl sražen přidáním 30 ml 1 N HCl/ethylacetátu. Hustý bílý precipitát byl zfiltrován, promyt ethylacetátem a usušen.
Výtěžek: 10,9 g (37 %)
B.t.: 110-113°C
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
• · · · • · • ·
Příklad 23
N-[2-palmitoyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid dihydrochlorid
Výchozí materiál: U.S. patent č. 5 147 879 (1992)
Poznámka: reakce se prováděla refluxováním
Výtěžek: 72 %
B.t.: 69-73,5°C
IČ (KBr): 3425, 2922, 2853, 2648, 2544, 1742, 1632, 1468,
1416, 1377, 1287, 1183, 1113, 1087, 1032, 984,
708, 675 cm-1
Příklad 24
N-[2-furyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid (Z)-2-butendioát (1:1)
Poznámka: produkt byl izolován ve formě maleinové soli
Výtěžek: 52 %
B.t.: 167-171,5°C
Příklad 25
N-[2-(o-chlorbenzoyloxy)-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Poznámka: reakce se prováděla refluxováním
Výtěžek: 50 %
B.t.: 91-94°C • ·
Příklad 26
N-[2-(p-methoxybenzoyloxy)-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Poznámka: reakce se prováděla refluxováním
Výtěžek: 71 %
B.t.: 152-155°C
Příklad 27
N-[2-(m-trifluormethylbenzoyloxy)-3-(1-piperidinyl)propoxy] -3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Poznámka: reakce se prováděla refluxováním
Výtěžek: 45 %
B.t.: 144—147°C
Příklad 28
N-[2-(2-thenoyloxy)-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid (Z)-2-butendioát (1:1)
Poznámka: reakce se prováděla refluxováním a produkt byl izolován ve formě maleinové soli
Výtěžek: 58 %
B.t.: 168-176°C • ·· · ··· ···· * · · ···· · · · · ·· · • «·· ····· ··· ·
Příklad 29
N-[2-acetoxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Postup:
2,5 g (9,0 mmol) N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidamidu bylo rozpuštěno v 27 ml chloroformu, přidalo se 1,6 g (16 mmol) acetanhydridu a míchalo se po 1 hodinu při pokojové teplotě. Reakční směs byla odpařena do sucha a rozpuštěna v isopropylalkoholu obsahujícím ekvimolární množství (9 mmol) suchého chlorovodíku. Roztok byl ochlazen a pevná látka zfiltrována. Rekrystalizace z isopropylalkoholu poskytla krystalickou sloučeninu.
Výtěžek: 1,9 g (59 %)
B.t.: 107°C
Příklad 30
N-[2-(3-pyridinkarbonyloxy)-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidamid (Z)-2-butendioát (1:1)
Postup:
K roztoku N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidamidu (1,68 g, 6,0 mmol) v suchém pyridinu se přidal anhydrid kyseliny nikotinové (1,68 g, 7,4 mmol) a směs se ponechala při pokojové teplotě přes noc. Směs byla odpařena, zbytek rozpuštěn v 30 ml ethylacetátu, zfiltrován, filtrát se extrahoval 10 % roztokem NaHCO^, byl vysušen a odpařen. Získaný olej byl rozpuštěn v 20 ml acetonu a přidalo se 0,53 g kyseliny maleinové, což vedlo ke srážení. Produkt byl odfiltrován a promyt acetonem.
·· ···· ··· ··
·· ·· • · · · • · ·· ·
Výtěžek: 1,84 g (61 %)
B.t.: 157—160°C
Příklad 31
N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid dihydrochlorid
Postup
2,86 g (51,1 mmol) hydroxidu draselného bylo rozpuštěno v 20 ml abs. ethanolu, pak se přidalo 6,45 g (47,0 mmol) N-hydroxy-3-pyridinkarboximidamidu a 7,7 g (47,7 mmol) l-chlor-3- (1-piperidinyl)-propanu a směs se refluxovala po 9 hodin. Pevný podíl byl odstraněn filtrací a filtrát byl odpařen. Surový produkt byl rozpuštěn v 100 ml chloroformu, promyt 1 N roztokem hydroxidu sodného a pak třikrát vodou. Organická vrstva byla vysušena na síranem sodným a rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v malém množství abs. ethanolu a byl přidán isopropylalkohol obsahující suchý chlorovodík (pH 2) za poskytnutí bělavých krystalů.
Výtěžek: 4,8 g (38 %)
B.t.: 95-100°C (rozkl.)
IČ (KBr): 3422, 3294, 3107, 2984, 2937, 2870, 2818, 1649,
1616
1593, 1479, 1462, 1441, 1381, 1309, 1194
1123 , 559 cm
1094, 1059, 1042, 982, 858, 816, 712
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
- 72 Příklad 32
N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-trifluormethyl-benzenkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 42 %
B.t.: 116—119°C
IČ (KBr): 3412, 3082, 2949, 2874, 2827, 1655, 1485, 1447,
1383, 1325, 1283, 1171, 1121, 1094, 1072, 986,
920, 905, 808, 700, 677, 627 cm-1
Příklad 33
N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-(3,4-dimethoxyfenyl)methankarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 35 %
B.t.: 207-209°C
Příklad 34
N-[2,2-dimethyl-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid
Výtěžek: 38 % (olej)
IČ (KBr): 3323, 2935, 2888, 2785, 1637, 1477, 1393, 1360,
1157, 1111, 1057, 995, 943, 960, 814, 789, 708,
627 cm-1
Příklad 35
Ν-[3-(4-methyl-l-piperazinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 23 %
B.t.: 127—130°C
IČ (KBr): 3387, 2947, 2878, 2802, 1730, 1639, 1450, 1389,
1283, 1242, 1194, 1150, 1083, 1015, 964, 933,
814, 710 cm'1
Příklad 36
N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-nitro-benzenkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 51 %
B.t.: 158—162°C
Příklad 37
N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-benzenkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 64 %
B.t. : 207-209 °C
Příklad 38
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2,4,5-trimethylbenzenkarboximidamid
Výtěžek: 44 %
B.t.: 199-201°C
3410, 3103 , 2943 , 2912, 2814 , 2791, 1634 , 1582
1441, 1383 , 1350, 1321, 1304 , 1254 , 1204 , 1146
1111, 1099 , , 1065, , 993, , 878, , 851, 785, 754
525 cm
Příklad 39
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-4-acetaminobenzenkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 25 %
B.t.: 133—137°C
Příklad 40
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-nitrobenzenkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 38 %
B.t.: 190-193°C
• · *
Příklad 41
Ν-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-(1,5-dimethyl)pyrrolkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 20 % B.t.: 144-147°C
IČ (KBr, báze): 3458, 3369, 2930, 2849, 1622, 1587, 1502
1468, 1437, 1396 , 1354 , 1323, 1279, 1254
1200 , 1157 , 1115, 1078 , 1042, 988, 962
930 , 870, 856 , 758, 737, 694, 609 cm-1
Příklad 42
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-chinolinkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 36 %
B.t.: 210—211°C
Příklad 43
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-4-nitro-benzenkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 77 %
B.t.: 184-189°C
Příklad 44
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 73 %
B.t.: 157-170°C
IČ (KBr): 3280 (b), 2940, 1655, 1420, 1120, 1018, 1002 710 cm-1
Příklad 45
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-nitro-benzenkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 47 %
B.t.: 200-208°C
IČ (KBr): 3300 (b), 2960, 1670, 1535, 1347, 1155,
1002, 860, 800, 735 cm'1
Příklad 46
857 ,
1020 ,
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-1-isochinolinkarboximidamid dihydrochlorid
Výtěžek: 56 %
B.t.: 208—216°C
Příklad 47
N-[3-[(1,1-dimethyl]amino]-2-hydroxypropoxy]-3-trifluormethyl-benzenkarboximidamid dihydrochlorid
Postup:
Směs 21,0 g (80,8 mmol) m-trifluormethyl-N-(2,3-epoxypropoxy)-benzamidinu (Příklad 9/a), 105 ml terc-butylaminu, 210 ml etheru a 84 ml 4 N roztoku hydroxidu sodného se refluxovala po 5 hod. Fáze byly odděleny, etherová vrstva byla promývána solným roztokem do neutrality, vysušena a odpařena do sucha. Výsledný olej byl rozpuštěn v 250 ml acetonu, zpracován s uhlím, pak se přidalo 39 ml 4 N HCl/ethylacetátového roztoku za míchání, což vedlo ke srážení bílé pevné látky, jež byla zfiltrována a promyta acetonem.
Výtěžek: 22,8 g (70 %)
B.t.: 186-192°C (rozkl. )
IČ (KBr): 3418, 2984 , 2785, 2625, 2527 , 2401, 1664
1487 , 1437, 1381, 1329, 1173 , 1155 , 1130
905 , 874, 820, 692 , 642, 594 cm -1
1585,
1078,
Příklad 48
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N'-butyl-3pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Postup:
a) Příprava N-[2-[(2-tetrahydropyranyl)oxy]-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu: 21,3 g (71,4 mmol) N—[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu bylo rozpuštěno v 500 ml chloroformu, okyseleno etherovým roztokem kyseliny chlorovodíkové na pH = 3a pak se přidalo 32,6 ml (0,357 mol) 3,4-dihydro-2H-pyranu. Směs se ··· · · ·· · · · · · »· ·· míchala za pokojové teploty po 20 hodin, promyla třikrát 200 ml porcemi 2 N roztoku hydroxidu sodného a čtyřikrát stejným množstvím vody. Organická fáze byla vysušena nad síranem sodným, zfiltrována a odpařena za sníženého tlaku. Olejovitý zbytek byl rozpuštěn v 600 ml ethylacetátu a promýván čtyřikrát 150 ml porcemi pufrového roztoku pH = 5. Organický roztok byl vysušen, zfiltrován a odpařen.
Výtěžek 24,5 g (90 %)
b) Směs 3,7 g (9,68 mmol) N-[2-[(2-tetrahydropyranyl)oxy]-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chloridu a 40 ml (0,41 mol) n-butylaminu byla refluxována po 3 hodiny. Přebytek aminu byl odpařen ve vakuu za poskytnutí tmavě hnědého oleje, jenž byl rozpuštěn v 40 ml ethanolu obsahujícího 3,0 g kyseliny 4-toluensulfonové, a směs byla zahřívána na 60°C po jednu hodinu. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku, zbytek byl zalkalizován (pH 10) s 2 N roztokem hydroxidu sodného a pak extrahován třikrát chloroformem. Organický roztok byla vysušen nad síranem sodným, zfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Tmavý olejovitý zbytek byl chromátografíčky čištěn za poskytnutí čisté báze, jež byla rozpuštěna v 20 ml ethanolu a okyselena ekvivalentním množstvím suché kyseliny chlorovodíkové rozpuštěné v isopropylalkoholu, za poskytnutí titulní sloučeniny jako světle žluté krystalické pevné látky.
Výtěžek: 1,22 g (34 %)
B.t.: 120—122°C
IČ (KBr, báze): 3319 , 3293
1612 , 1580
1221, 1196
988 , 964 ,
602 cm 1
3040, 2959, 2854 , 2842 , 2522 ,
1450, 1427, 1399 , 1333 , 1315 ,
1171, 1126, 1103 , 1051, 1022 ,
928, 899, 858 , 929 , 719, 692 ,
• · • · · · • · ·
Příklad 49
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N'-cyklohexyl-3pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Výtěžek: 0,89 g (24 %)
B.t.: 130-134°C
IČ (KBr): 3280, 2935, 2853, 2640, 1720, 1619, 1551, 1514,
1452, 1404, 1313, 1236, 1155, 1124, 1111, 1090,
1040, 978, 828, 735, 627 cm1
Příklad 50
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N'-(1,1-dimethyl)benzenkarboximidamid
Postup:
chloroformu zfiltrována
Do roztoku 0,92 g (5,2 mmol) l-chlor-2-hydroxy-3(1-piperidinyl)-propanu v 2 ml vody se přidalo 0,42 g (10,4 mmol) hydroxidu sodného a směs se míchala po jednu hodinu. K této směsi se přidalo 1.0 g (5,2 mmol) N-hydroxy-N'-(1,1-dimethyl)-benzenkarboximidamidu rozpuštěného v 20 ml ethanolu a směs se refluxoval po 4 hodiny. Rozpouštědlo bylo odpařeno, přidalo se 50 ml vody a směs se extrahoval třikrát 50 ml porcemi Organická fáze byla vysušena nad síranem sodným, a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Žlutý olejovitý zbytek byl pomalu krystalizován v lednici. Krystaly byly triturovány diethyletherem a odfiltrovány.
Výtěžek: 0,55 g (31 %) B.t.: 134—137°C
IČ (KBr)
- 80 - :
3427, 3254, 2929, 2853
1445, 1391, 1367, 1302
1094, 1067, 1036, 993,
675 cm-1
2814, 1739, 1281, 1190,
1603, 1510, 1140, 1117, 963, 922, 841, 789, 716,
Příklad 51
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N',N'-diethyl-3pyridinkarboximidamid monohydrochlorid
Postup:
0,66 g (16,6 mmol) hydroxidu draselného bylo rozpuštěno v 25 ml abs. ethanolu, pak se přidalo 1,61 g (8,3 mmol) N-hydroxy-N',N'-diethyl-3-pyridinkarboximidamidu a 1,48 g (8,3 mmol) l-chlor-2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propanu a směs se refluxovala po 5 hodin. Rozpouštědlo bylo odpařeno, přidalo se 50 ml vody a směs byla třikrát extrahována s 50 ml porcemi ethylacetátu. Organická vrstva byla vysušena na síranem sodným, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Žlutý olejovitý zbytek byl čištěn chromatografií za poskytnutí čisté báze, jež byla rozpuštěna v 20 ml ethylacetátu a okyselena ekvivalentním množstvím suché kyseliny chlorovodíkové rozpuštěné v ethylacetátu, za poskytnutí titulní sloučeniny jako bílé krystalické pevné látky.
Výtěžek: 1,3 g (42 %)
B.t.: 113-117°C
Příklad 52
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-hexadekanoiamid monohydrochlorid
Postup:
1,74 g (10 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propanu bylo rozpuštěno v 20 ml chloroformu a ochlazeno na 0°C. Po kapkách byl během 10 minut přidán roztok palmitoylchloridu (2,85 g, 10 mmol) v 10 ml chloroformu. Po míchání směsi po 15 minut byl získaný bílý precipitát odfiltrován, promyt chloroformem a vysušen.
Výtěžek: 3,2 g (71 %)
B.t.: 147-150°C
IČ (KBr): 3242, 3090 , 2951, 2916, 2849, 1730, 1653, 1520 ,
1472 , 1439 , 1371, 1300, 1229, 1169, 1136, 1099 ,
1070 , 1009 , 993, 962, 928, 858, 760, 719, 602,
471 cm -i
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byly připraveny následující sloučeniny:
Příklad 53
N-[3—(1-piperidinyl)propoxy]-3-trifluormethyl-benzamid
Výchozí materiál: EP 365 364 (1990)
Výtěžek: 69 % (olej)
IČ (KBr): 3425, 2941, 2864, 2775, 1674, 1614, 1566, 1520,
1483, 1393, 1337, 1277, 1187, 1129, 1072, 922,
914, 750, 698, 650 cm' • · · · · · • · ·· ·
Příklad 54
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]naftalen-l-karboxamid
Výtěžek: 54 %
B.t.: 104—107°C
IČ (KBr): 3375, 2934, 1641, 1593, 1564, 1439, 1340, 1325,
1113, 1026, 941, 810, 779 cm“1
Příklad 55
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N'-heptyl-močovina
Postup:
K roztoku 1,23 g (7,1 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3(1-piperidinyl)-propanu rozpuštěného v 20 ml chloroformu se přidalo 1,0 g (7,1 mmol) heptylisokyanátu a reakční směs byla míchána po 20 hodin. Rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu a zbytek byl čištěn chromátografií za poskytnutí čistého bezbarvého oleje. Bílý krystalický produkt byl získán triturací petroletherem.
Výtěžek: 81 %
B.t.: 49-51°C
Podle postupu popsaného v předcházejícím příkladě byla připravena následující sloučenina:
• · *· ·· ·
Příklad 56
Ν-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-Ν'-propyl-močovina
Výtěžek: 50 % (olej)
IČ (KBr): 3319, 2934, 2878, 2802, 1666, 1551, 1456, 1393,
1308, 1155, 1092, 1040, 993, 889, 793 cm-1
Příklad 57
N-cyklohexyl-N'-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-močovina
Výtěžek: 67 %
B.t.: 108-110°C
IČ (KBr): 3319, 3287, 3188, 2930, 2853, 2797, 1637, 1574,
1452, 1354, 1331, 1300, 1101, 1098, 991 cm-1
Příklad 58
N-hexyl-N'-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-močovina
Výtěžek: 27 %
B.t.: 50-52°C
IČ (KBr): 3310, 2932, 2858, 2804, 1666, 1551, 1454, 1377,
1306, 1092, 1040, 995, 791, 725, 604 cm-1
• · · · · ·
Příklad 59
N-(3-chlorfenyl)-N'-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]močovina
Výtěžek: 34 %
B.t.: 117-118°C
IČ (KBr): 3250, 2939, 2900, 1670, 1597, 1551, 1491, 1429,
1329, 1252, 1119, 972, 775, 718, 700 cm-1
Příklad 60
N-cyklohexyl-N'-[2-hydroxy-3-[N-cyklohexylkarbamoyl-N(1,1-dimethylethyl)-amino]propoxy]-močovina
Výtěžek: 44 %
B.t.: 151-152°C
IČ (KBr): 3312, 2932, 2854, 1668, 1616, 1555, 1450, 1393,
1364, 1354, 1252, 1220, 1130, 941, 891 cm-1
Příklad 61
N-hexy1-N'-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-močovina
Výtěžek: 85 % (olej)
IČ (KBr): 3354, 2932, 2856, 2810, 1666, 1543,
1308, 1155, 1134, 1076 cm1
1486, 1377
Příklad 62
N-terc-butyl-N'-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]močovina
Výtěžek: 38 %
B.t.: 71—73°C
IČ (KBr): 3314, 2945, 2916, 1651, 1555, 1460, 1393, 1384,
1335, 1254, 1111, 988, 903, 839, 781 cm1
Příklad 63
N-(3-mitro-fenyl)-N'-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]močovina
Výtěžek: 54 %
B.t.: 137-139°C
IČ (KBr): 3281, 2943, 2818, 1672, 1607, 1560, 1529, 1486,
1437, 1354, 1283, 1115, 802, 739 cm1
Příklad 64
5,6-Dihydro-5-(1-piperidinyl)methyl-3-(3-pyridyl)-477-1,2,4-oxadiazin
Postup:
a) 17,5 g (0,05 mol) N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]3-pyridinkarboximidamid dihydrochloridu thionylchloridu, vařeno po jednu hodinu do sucha. Zbytek byl rozpuštěn v 300 s uhlím a po filtraci bylo rozpouštědlo odpařeno za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v minimálním množství ethanolu a dán bylo rozpuštěno v 50 ml a pak byla směs odpařena ml methanolu, zpracován do lednice za poskytnutí krystalického (1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid jako intermediární sloučeniny.
N-[3-chlor-3dihydrochloridu
Výtěžek: 13,2 g (71 %) B.t.: 127-145°C
b) 13,2 g (35,7 mmol) N-[3-chlor-3-(1-piperidinyl)propoxy]3-pyridinkarboximidamid 16,5 g (143,5 mmol) v 150 ml terc-butanolu.
dihydrochloridu bylo přidáno k roztoku terc-butoxidu draselného rozpuštěného Směs se vařila 6 hodin, pak se odpařila ve vakuu, přidalo se 100 ml 5 % roztoku hydroxidu sodného a směs se extrahovala třikrát 300 ml porcemi ethylacetátu.
Organická vrstva byla vysušena nad síranem sodným, zfiltrována a odpařena do sucha, Zbytek byl triturován s diethyletherem za poskytnutí titulní sloučeniny jako bílých krystalů.
Výtěžek: 13,2 g (71 %) B.t.: 127—145°C
Příklad 65
N-[3-[(1,1-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-3trifluormethy1-benzamid
Postup:
1,3 ml (15,2 mmol) epichlorhydrinu se přidalo k roztoku 1,6 ml (15,2 mmol) terč-butylaminu v 8 ml ethanolu během 10 minut za míchání a za udržování teploty pod 20°C, a nechalo se stát po 3 dny.
Zvlášť se rozpustilo 0,8 g (14,3 mmol) hydroxidu draselného ve směsi 20 ml ethanolu a 3 ml vody, a do této směsi se přidaly
3,42 g (15,2 mmol) draselné soli N-hydroxy-3-(trifluormethyl)benzamidu a dříve připravená směs epichlorhydrinu a terc-butylaminu. Reakční směs se míchala a vařila po 10 hodin, pak bylo rozpouštědlo odpařeno. Zbytek byl triturován s 20 ml dichlormethanu a 10 promyta 5 ml vody a vysušena nad síranem ml vody, organická fáze byla oddělena, 5 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, sodným, zfiltrována a odpařena. Olejovitý zbytek byl krystalizován ve směsi aceton-hexan za poskytnutí bílé látky jako titulní sloučeniny.
Výtěžek: 0,85 g R +- · 156-158°C
B.t IČ (KBr):
2976 , 1165 , (17,3 %)
2858, 1121, 1556, 1379, 1352, 1313,
ΧΧΖ,Χ, x~»uu, X~
1130, 1072, 694 cm1
Příklad 66
Methyl-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidát (Z)-2-butendioát (1:1)
Postup:
11,4 g (38,2 mmol) N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]3-pyridinkarboximidoyl chloridu se rozpustilo v 60 ml abs. ethanolu a pak se po kapkách během 5 minut přidalo 25 ml (0,1 mol) 25 % methanolového roztoku methoxidu sodného. Reakční směs se vařila po půl hodiny a pak byla odpařena. Zbytek byl míchán s 210 ml dichlormethanu po půl hodiny, chlorid sodný byl odfiltrován a filtrát byl promyt 50 ml vody a 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušen nad síranem hořečnatým a odpařen za sníženého tlaku. Surový produkt byl čištěn chromatografií za poskytnutí titulní sloučeniny jako světle žlutého oleje.
• 9 · ·
Výtěžek: 2,9 g (29 %)
Elementární analýza pro C15H23N3°3 vypočt
61,4 nalezeno
7,90
14,3
61,2
7,91
14,5
Příklad 67
Diethyl-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-iminokarbonát
Postup
Směs 0,87 g (5 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propanu a 1,1 g (5,5 mmol) tetraethyl orthokarbonátu se míchala při 100°C po 3 hodiny v přítomnosti katalytického množství kyseliny p-toluensulfonové. Po odpaření byl zbytek čištěn kolonovou chromatografií (Merck Kieselgel 60, eluent chloroform/methanol/konc. NH4OH 30:5:0,2) za poskytnutí titulní sloučeniny jako světle žlutého oleje.
Výtěžek: 27.7 % (olej) 13C-NMR (d, CDC13): 154,9 (s, C=N), 76,5 (t, N-OCH2), 66,6 (d, CHOH), 64,5 (t, CH3CH2), 61,5 (t, CHCH2N), 54,8 (t, piperidin), 26,0 (t, piperidin), 24,2 (t, piperidin), 14,9 (q, CH3), 14,1 (q, CH3) • ···· ·· ·· ·· · · · · · • ··· · · · · • · · · · ··· • · · · · ······ ·· ·· ·· ···· ···
9
Příklad 68
N-[3-[(1,1-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-O-ethylN'-fenyl-isomočovina
Postup:
18,4 g (0,1 mol) ethyl N-fenyl-chlorformimidátu (F. Lengfeld a J. Stieglitz: Am. Chem. J. 16, 70 (1984)) a 16,2 g (0,1 mol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-[(1,1-dimethylethyl)amino]propanu [Ger. Off. 2 651 083] se rozpustilo v 200 ml tetrahydrofuranu, přidalo se 13,9 ml (0,1 mol) triethylaminu a směs se míchala při pokojové teplotě po 10 hodin. Triethylamin hydrochlorid, jenž se vytvářel, byl odfiltrován a filtrát byl odpařen ve vakuu, zbytek byl rozpuštěn v 200 ml chloroformu a promyt 50 ml vody. Organická vrstva byla vysušena nad síranem sodným, zfiltrována a odpařena za sníženého tlaku. Surový olejovitý zbytek byl čištěn chromatografií za poskytnutí titulní sloučeniny jako světle žlutého oleje.
Výtěžek: 18,5 g (59,8 %)
Elementární analýza pro C16H27N3
vypočt. nalezeno
C % 62,1 61,3
H % 8,8 8,5
N % 13,6 13,7
• » • o • ·
Příklad 69
N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-0-fenyl isokarboxamid
Postup:
3,16 g (20 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propanu se rozpustilo v 50 ml benzenu, přidalo se 2,4 g (20 mmol) fenylkyanátu a směs se míchala za pokojové teploty po 12 hodin. Přidalo se dalších 0,16 g (1,3 mmol) kyanátu a směs se míchala dalších 12 hodin. Po odpaření byl zbytek rozpuštěn v methanolu a tento roztok byl vyčeřen aktivovaným uhlím a odpařen. Produkt byl krystalizován z ethylacetátu/ethylalkoholu za poskytnutí bílého materiálu.
Výtěžek: 46,9 %
B.t.: 63-70°C (ethylacetát) 13C-NMR (d, D20): 152,4; 129,9; 125,8; 119,9; 70.3; 57,4;
54,3; 53,2; 23,0; 22,7; 21,0
Příklad 70
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N'-pentamethylenO-ethyl-isomočovina
Postup:
2,7 g (0,01 mol) diethyl-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-iminokarbonátu (viz Příklad 67) a 0,99 ml (0,01 mol) piperidinu bylo rozpuštěno v 40 ml tetrahydrofuranu a mícháno za pokojové teploty po 2 hodiny, a pak odpařeno do sucha. Zbytek byl čištěn chromatografii za poskytnutí titulní sloučeniny jako oleje.
• »· · • · · • · • · « · · ·
- 91 Výtěžek: 2,1 g (67,1 %)
Elementární analýza pro c16h31n3°3
vypočt. nalezeno
c % 61,3 61,1
H % 10,0 9,8
N % 13,4 13,6
Příklad 71
N,N-dimethyl-N'-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N'' -fenyl-guanidin hydrochlorid
Postup:
1150 mg (6,58 mmol) l-aminooxy-2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propanu (Ger. Off. 2 651 083) se rozpustilo v chloroformu, přidalo se 750 mg Na2CO3, pak se po kapkách přidal roztok 1206 mg (6,58 mmol) N,N-dimethyl-N'-fenyl-chlorformamidinu (BR 888646 /1959/, Bayer, aut.: Kuhle a Eue L.; CA 57, 136961 /1962/) v 10 ml chloroformu. Po 5 hodinách byla pevná fáze odfiltrována a filtrát byl odpařen. Tento rozpuštěn v 10 ml ethylacetátu 10,46 ml 0,54 N HCl/ethylacetát. promyt a konečně rekrystalizován
Výtěžek: 28 %
B.t.: 127-129°C
IČ (KBr): 3220, 2093, 2840,
1433, 1375, 1250
760, 705 cm-1 zbytek (1 800 mg oleje) byl a produkt byl sražen přidáním Žlutý precipitát byl zfiltrován z acetonu, po ethylacetátu.
2690, 2620, 1608, 1580, 1475,
1070, 1050, 1000, 925, 900, • · · · • ·
- 92 Příklad 72
N-[ 3-[(1,1-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-Ν'-fenylguanidin
Postup:
3,1 g (0,01 mol) N-[3-[(l,l-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-0-ethyl-N'-fenyl-isomočoviny (viz v Příkladě 68) se rozpustilo v 20 ml terahydrofuranu, přidalo se 200 ml 25 % roztoku hydroxidu amonného a 0,26 g (5 mmol) chloridu amonného, a směs byla ponechána při pokojové teplotě po 15 hodin. Směs byla odpařena do sucha a čištěna chromatografii za poskytnutí titulní sloučeniny jako oleje.
Výtěžek: 1,7 g (60,7 %)
Elementární analýza pro ci4H24N4°2
vypočt. nalezeno
c % 60,0 60,2
H % 8,6 8,9
N % 20,0 19,8
Příklad 73
N,N'-difenyl-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-benzenkarboxamidin hydrochlorid
Postup:
3,55 g (20 mmol) 3-piperidino-2-hydroxy-l-propanu bylo rozpuštěno v 2,5 ml vody, přidalo se 0,8 g (20 mmol) NaOH a směs byla míchána za pokojové teploty po 1 hodinu. Pak byl přidán • · · · * >
• · • · · · roztok 6,49 (20 mmol) N,N'-difenyl-N-hydroxy-benzen-karboxamidin hydrochloridu v 60 ml ethylalkoholu, po kapkách, a dalších 0,8 g (20 mmol) NaOH. Získaná žlutá suspenze se vařila po 2 hodiny. Vysrážený chlorid sodný byl odfiltrován a promyt ethylacetátem. Rozpouštědlo bylo odpařeno, přidalo se 40 ml ethylacetátu a dvakrát se extrahovalo 40 ml porcemi destilované vody. Organická fáze byla vysušena nad síranem sodným, zfiltrována. Produkt byl sražen přidáním 5,5 ml 3,67 N HCl/ethylacetát. Precipitát byl zfiltrován promyt a konečně rekrystalizován z methano/etheru.
Výtěžek: 42 %
B.t.: 151—155°C (methanol/ether) 13C-NMR (d, CDC13): 159,6; 148,0; 140,9; 131,0; 129,7;
129,3; 128,9; 127,9; 127,5; 64,2; 60,2; 54,5; 22,7; 21,9
Příklad 74
N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-N-methy1-N'-fenyl-O-ethylisokarboxamid
Postup preparace této sloučeniny je stejný jak se píše v Příkladu 68, s použitím l-methylaminooxy-2-hydroxy-3(1-piperidinyl)-propanu a ethyl-N-fenyl-chlorformamidátu jako výchozích materiálů.
Výtěžek: 56 Elementární
C %
H %
N % % (olej) analýza vypočt. 66,4
9,5
13,7 pro C17H29N3°3 nalezeno
66,2
8,9
13,9 • · · ·
Příklad 75
N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-N-methy1-N'-feny1-0-ethylisokarboxamid
Postup preparace této sloučeniny je stejný jak se píše v Příkladu 72, s použitím N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-N-methylN'-fenyl-O-ethyl-isomočoviny (viz Příklad 74) jako výchozího materiálu.
Výtěžek: 43 Elementární % (olej) analýza pro C16H26N4'
vypočt. nalezeno
C % 62,7 62,2
H % 8,5 8,8
N % 18,3 18,4
Příklad 76
Ν,Ν,N'-trimethyl-N'-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-N'''-fenylguanidin
Postup:
344 mg (2,0 mmol) l-methylaminooxy-2-hydroxy-3(1-piperidinyl)-propanu bylo rozpuštěno v chloroformu, přidalo se 750 mg Na2CO3, pak se po kapkách přidal roztok 438 mg (2,0 mmol) N,N-dimethyl-N'-fenyl-chlorformamidinu hydrochloridu v 3 ml chloroformu. Po 8 hodinách byla pevná fáze odfiltrována a filtrát byl odpařen. Tento zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu a produkt byl extrahován přidáním roztoku HCl (pH = 1) k vodě. Vodná fáze byla zalkalizována přidáním 2 N roztoku NaOH na pH =11, a extrahována ethylacetátem. Organická fáze byla odpařena a další « · · ·
- 95 čištění se provedlo kolonovou chromatografií za poskytnutí titulní sloučeniny jako žlutého oleje.
Výtěžek: 10 % (olej) 13C-NMR (d, CDC13): 156,6; 150,5; 128,4; 121,4; 120,5; 70,0; 55,9; 54,4; 40,6; 39,4; 25,8; 25,6; 24,3
Příklad 77 /R/(+)-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1)
Postup:
2,16 g (3,26 mmol) (S)-N-[2-[2-(R)-(1,1-dimethylethyloxykarbonylamino)-3-fenyl-propionyloxy]-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioátu (1:1) (viz Příklad 18) bylo suspendováno v 40 ml methanolu a vařeno 1 hodinu, pak odpařeno do sucha. Zbytek byl triturován s 20 ml ethylacetátu, precipitát byl odfiltrován a promyt ethylacetátem. Tento surový produkt byl rekrystalizován v isopropylalkoholu za poskytnutí titulní sloučeniny.
Výtěžek: 1,16 g (85 %)
B.t.: 136-137°C [a]D = + 5,6° [c = 1, MeOH, t = 27°C] • · · · · · ·
0 0 «000 0 0 · • ••0 · · · · · · · • · 9 · 0 000 0 0·· ·
0 0 0 0 0 0
0 0 ««4 · · 0· ·· ·
Příklad 77
Ν-(3-piperidino-l-propoxy)-3-pyridinkarboximidoyl chlorid dihydrochlorid
Po ochlazení směsi 10 ml destilované vody a 4,36 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové na 0°C se za míchání přidaly 2 g (7,62 mmol) N-(3-piperidino-l-propoxy)-3-pyridinkarboxamidinu (viz Příklad 31). K tomuto žlutému roztoku se po kapkách za míchání během 30 minut při - 5'C přidalo 2,7 g (3,81 mmol) dusitanu sodného rozpuštěného v 10 ml vody. Po míchání tohoto nazelenalého roztoku při - 5C po 1,5 hodiny bylo pH roztoku nastaveno na 10 přidáním 1 N vodného roztoku hydroxidu sodného za chlazení, pak byl roztok extrahován třikrát s 40 ml chloroformu. Organická fáze se promyje 20 ml vody, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Zbytek je čištěn kolonovou chromatografií (Merck Kieselgel 60, eluent chloroform/methanol 1:1) za poskytnutí 1,7 g (79,2 %) báze odpovídající titulní sloučenině.
Titulní hydrochlorid se připraví ze získané báze přidáním ethanolového roztoku chlorovodíku, b.t.: 165-167°C.
IČ (KBr): 3015, 2945, 2617, 2515, 2088, 1982, 1600, 1570,
1437, 1402, 1200, 1060, 988, 912, 808 cm-1
Shora uvedený výchozí materiál lze připravit jak následuje:
Po rozpuštění 2,86 g (51,06 mmol) hydroxidu draselného ve 20 ml abs. ethanolu se po částech za míchání přidalo 6,45 g (47,0 mmol) 3-pyridinkarboxamid oximu. Po rozpuštění se po kapkách přidalo 7,7 g (47,66 mmol) 1-(3-chlorpropyl)piperidinu rozpuštěného v 5 ml ethanolu. Po 9-hodinové reakci byl vysrážený chlorid draselný odfiltrován, ethanolový roztok vyčeřen aktivním uhlím a odpařen. Odpařený zbytek byl po vzetí do 100 ml chloroformu promyt třikrát se 100 ml 1 N roztoku hydroxidu sodného, pak s 50 ml vody. Po oddělení byla organická fáze • · · · • * · ·
..· 1 vysušena nad síranem sodným, zfiltrována a odpařena. Olejovitý zbytek se při ochlazení stává krystalickým. Krystaly se triturují s asi 20 ml etheru, filtrují a suší za poskytnutí béžového produktu ve výtěžku 4,8 g (38,9 %).
IČ (KBr):
3422, 3107, 2937, 2870, 2819, 1640, 1479, 1391,
1309, 1194, 1123, 1059, 1042, 982, 916 cm1
Podle připravena postupu popsaného v následující sloučenina předcházejícím příkladě byla
Příklad 79
O-(3-piperidino-l-propyl)-3-nitro-benzhydroximoyl chlorid hydrochlorid
Výtěžek: 50 %
B.t.: 173—175°C
IČ (KBr): 3420, 2926, 2953, 2649, 2546, 1514, 1591, 1533,
1452, 1354, 1259, 1252, 1049, 994, 733 cm-1
- 98 4 444444 4
444 4 4 4 4 4 4 4
44» 4 4444 444 4 4 4 · 4 4 ·
44» 44 44 44 4
PŘÍKLADY PROSTŘEDKŮ
Příklad 1: Tableta
Tableta obsahující 50 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-thiofen-
karboximidoyl chlorid monohydrochlorid 50,0 mg
kukuřičný škrob 100,0 mg
laktosa 95,0 mg
stearát hořečnatý 4,5 mg
Aktivní složka se jemně semele, smíchá s aditivy, směs
zhomogenizuje a granuluje. Granulát se slisuje do tablet.
Příklad 2: Tableta
Tableta obsahující 5 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-nitro-
benzimidoyl chlorid monohydrochlorid 5,0 mg
kukuřičný škrob 75,0 mg
laktosa 7,5 mg
koloidní kys. křemičitá 7,5 mg
stearát hořečnatý 5,0 mg
Prostředek se připraví ze shora uvedených složek v souladu
s Příkladem 1.
• · · · A * 9
9 · · · · · • · A A · * · · * * • · » · A • · « Λ A A t
Příklad 3: Tableta
Tableta obsahující 5 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[2-benzoyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridin-
karboximidamid (Z)-2-butendioát (1:1) 5,0 mg
kukuřičný škrob 75,0 mg
želatina 7,5 mg
mikrokrystalická celulosa (Apical) 25,05 i mg
stearát hořečnatý 2,5 mg
Prostředek se připraví ze shora uvedených složek v souladu s Příkladem 1.
Příklad 4: Kapsle
Kapsle obsahující 10 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[2-palmitoyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy] -3-pyridin-
karboximidamid monohydrochlorid 10 mg
laktosa 80 mg
kukuřičný škrob 25 mg
talek 3 mg
koloidní kys. křemičitá 3 mg
stearát hořečnatý 2 mg
Aktivní materiál se smíchá s aditivy, směs se zhomogenizuje a naplní do želatinových kapslí.
- 100 »··· · · ·· » · · · · »· · · · · · • 9 · · a · · • · · · » 0 · 0 « «0
Příklad 5: Kapsle
Kapsle obsahující 20 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid 20 mg mikrokrystalická celulosa (Apical) 99 mg amorfní kys. křemičitá 1 mg
Aktivní materiál se smíchá s aditivy, směs se zhomogenizuje a naplní do želatinových kapslí.
Příklad 6: Dražé
Dražé obsahující 25 mg aktivního materiálu se připraví z následujících složek:
N-[3-[(1,1-dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-3trifluormethyl-benzamidin hydrochlorid 25 mg karboxymethylcelulosa 295 mg kyselina stearová 20 mg acetát ftalát celulosy 40 mg
Aktivní materiál se smíchá s karboxymethylcelulosou a kyselinou stearovou a směs se granuluje v roztoku acetátu ftalátu celulosy v 200 ml ethanolu/ethylacetátu. Z granulátu se slisuje jádro, jež se potáhne vodným roztokem polyvinylpyrrolidinu obsahujícího 5 % cukru.
• · · ·
- 101 Příklad 7: Injekce
Injekční roztok se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-nitrobenzimidoyl chlorid sterilní fyziologický roztok soli
Příklad 8: Mazání
Mazání se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenkarboximidoyl chlorid monohydrochlorid kyselina stearová cetyl stearyl alkohol monostearát glycerolu laurylsulfát sodný methyl p-hydroxybenzoát destilovaná voda g
2,0 ml
7.5 g 18,0 g 15,0 g
4,0 g
1.5 g
0,2 g
150 ml
Kyselina stearová, cetyl stearyl alkohol a monostearát glycerolu se roztaví dohromady. Laurylsulfát sodný a methyl p-hydroxybenzoát se rozpustí ve 100 ml vody za mírného zahřívání a pak se přidají do lipofilních složek za míchání, dokud teplota neklesne na pokojovou teplotu. Následně se přidá roztok aktivní složky v 50 ml vody a důkladně promíchá.
- 102 ···· ·« · · • ······ · • to* ···· ·· · • to· · * · · · ··· · • · · · · * ··· ·* ·· ·· ·
Příklad 9: Mazání
Mazání se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy—3-piperidinyl-propoxy]-2-nitro-
benzimidoyl chlorid monohydrochlorid 7,0 g
polysorbát 4,0 g
tekutý parafin 4,0 g
cetyl stearyl alkohol 12,0 g
bílá vazelína 20,0 g
monostearát glycerolu 4,0 g
methyl p-hydroxybenzoát 0,2 g
ethylalkohol 1,8 g
destilovaná voda 150 ml
Prostředek se připraví jako je popsáno v Příkladu 8.
Příklad 9: Krém
Krém se připraví z následujících složek:
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-4-pyridinkarbox-
imidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1) 10,0 g
bílá vazelína 90,0 g
bílý vosk 3,0 g
cetyl stearyl alkohol 3,0 g
tetraboritan sodný 4,0 g
methyl p-hydroxybenzoát 0,2 g
destilovaná voda 90 ml
Roztok ve vodě rozpustných složek se přidá k teplé směsi lipofilních složek jako v Příkladu 8, a do konečné emulze se přidá vodný roztok aktivní sloučeniny.
• ·
- 103
Příklad 6
ÚČINEK N- [ 2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU NA BUNĚČNOU EXPRESI HSP (ZKOUMÁNO NA TRANSLAČNÍ ÚROVNI)
Pozadí
Pokusy uváděné v této sekci byly prováděny za účelem stanovení, zda N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát působí ve zvyšování exprese molekulárních chaperonů buňkou. Nahromadění různých bílkovin tepelného šoku po určitém období vystavení tepelnému šoku samotnému a tepelnému šoku v kombinaci s podáváním N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu bylo zkoumáno přidáváním ΙΟ-5 Μ N-[2-hydroxy3 —(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu před, v průběhu nebo okamžitě po hypertermickém působení na srdeční myogenní buňky (H9c2 buňky).
Materiály a metody
a) podmínky kultivace buněk
Buněčná linie H9c2 odvozená srdečních buněk byla získána z tkáňových kultur (ECACC) (88092904). v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) doplněném 10 3 fetálního telecího séra (GIBCO) v termostatu JOUAN CO2 (5 % CO2).
z embryonálních potkaních Evropské sbírky zvířecích Buňky se udržovaly při 37°C
b) působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridin karboximidoyl chlorid maleátem a podmínky tepelného šoku
Tepelný šok se prováděl při 43°C v CO2 termostatu po dané časové intervaly (20, 40, 60, 90 a 120 minut). Buňky byly vzaty zpět do 37°C na 6 hodin a extrahovaly se bílkoviny pro • · • · · · · ·
- 104
SDS-PAGE. Když se N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát přidával před tepelným šokem, podal se ΙΟ-5 Μ N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3pyridin- karboximidoyl chlorid maleát 16 hodin před stresem. V jiných pokusech se přidal N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3- pyridinkarboximidoyl chlorid maleát v 10-5 M koncentraci těsně po tepelném stresu, během 6-hodinové periody nápravy. Pokusy se opakovaly třikrát.
Pro SDS-PAGE byly buňky rozrůstány v 6 cm Petriho miskách. Množství buněk na začátku pokusu bylo 8 x 105 a buňky byly ještě subkonfluentní když se extrahovala bílkovina. Po 6-hodinové nápravě se buňky promyly dvakrát v PBS a pak seškrabaly z povrchu misek v PBS. Pak se buňky stočily po 5 minut při 1500 rpm a vzaly do 100 μΐ modifikovaného solubilizačního pufru (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) obsahujícího 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Triton N-100, 1 mM PMSF, 2 mg/ml aprotininu, 1 μg/ml chymostatinu, a sonikovaly 3 x po 20 sekund (2 min. intervaly, nastavení 8).
Koncentrace bílkovin se pak stanovila z 5 μΐ vzorků stanovením Bradfordové (Μ. M. Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976)) ve třech paralelách. Vzorky se nastavily na koncentraci bílkoviny 100 μg/ 30 μΐ pomocí pufru uvedeného shora a dalšího pufru tak, že konečná koncentrace složek v tomto pufru bude: lio mM Tris-HCl, pH 6,8, 8,3 mM merkaptoethanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a něco bromfenolové modři; pak se třepe při pokojové teplotě po 30 minut.
Elektroforéza se prováděla podle Laemmliho (U. K. Laemmli, Nátuře 227: 680-685 (1970)) na dvou 8 - 18 % polyakrylamidových gelech při konstantním napětí 50 V přes noc. Bílkoviny se pak buď vybarvily s Coomassie Brilliant Blue R-250, anebo přenesly na Immobilone PVDF /Millipore) při konstantním proudu (300 mA) po 3 hodiny při 4°C v přenosovém pufru (10 mM CAPS, pH 11, 10 % methanol) (Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane, 3. laboratorní manuál, Millipore). Po přenosu se zablokovala nespecifická místa membrány 2 % bovinním sérovým
- 105 protilátkou monoklonální membrána další 1 GRP-94) albuminem (BSA) v TPBS (fosfátem pufrovaný solný roztok obsahující 0,1 % Tween 20) při 4°C přes noc. Membrána s přeneseným materiálem se pak inkubovala s GRP94 monoklonální (SPA-850, StressGen), zředěnou 1:3000, HSP60 protilátkou (SPA-600, StressGen), zředěnou 1:2700,
HSP72 monoklonální protilátkou (C9F34-5, StressGen), zředěnou
1:1250, nebo HSP90 monoklonální protilátkou (AC88, StressGen), zředěnou 1:2000, po 1 hodinu při pokojové teplotě. Pak se promyla s TPBS pufrem po jednu hodinu, a inkubuje po hodinu s anti-potkani (Sigma, 1:4000 zředění, pro resp. anti-myší (Sigma, adsorbovaná s lidskými a potkaními bílkovinami, 1:3000 zředění, pro Hsp60, HSP72 nebo HSP90) sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidasou. Po následném mytí s TPBS se membrána vyvíjela s ECL (zesíleným chemiluminiscenčním) systémem (Amersham).
Diluční série celkové bílkoviny byla pokaždé přenášena a vyvíjena paralelně se vzorky a kalkulovala se kalibrační křivka. Změny v obsahu stresových bílkovin se kvantifikovaly s použitím denzitometru Bio-Rad (Model 1650) a integrátoru Hewlett-Packard (HP 3394 A) a opravily podle kalibrační křivky. Při kalkulacích denzitometrických dat se považoval· pruh dané bílkoviny při 37°C bez N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu za 100 % a všechny další intenzity se porovnávaly s tímto vzorkem.
d) statistická analýza
Data se uvádějí jako střed + SE. Statistická porovnání a výpočty se prováděly jednosměrnou analýzou variance s Posthoc Newman-Keulsovým testem (Pharmacological Calculation System). Statistická významnost byla definována jako P < 0,05.
106 • ··« • ··
Výsledky dramatický. Významné šoku, au 40 minut
Hsp60: Působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu prováděné při 37°C nemělo žádný měřitelný účinek na hladinu této hsp. Tepelný šok při 43°C samotný, trvající po 20 min., může zvýšit množství hsp60 skoro dvakrát. Při prodlužovaném trvání tepelného působení nebylo lze pozorovat žádné další zvyšování hladiny této bílkoviny. Když se podal N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát v 10-^ M koncentraci 16 hodin před stresem, množství hsp60 se zvýšilo přibližně pětkrát (ve srovnání s 37C kontrolou) dokonce i ve vzorcích vystavených k 20-minutovému tepelnému působení. Tento účinek N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu byl evidentní i u vzorků tepelně zpracovaných po 40 resp. 60 minut, ale potom začal klesat. N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát přidaný ve fázi nápravy byl rovněž účinný, i když ve významně menším rozsahu než se pozoroval při přidání této sloučeniny před stresem.
Hsp72: Množství klidové hsp72 bylo v H9c2 buňkách dosti nízké, ale účinek různých působení na hladinu hsp72 byl zvýšení bylo už u 20 minutového tepelného tepelného působení bylo množství téměř 10 krát vyšší než bylo detegováno v kontrolních buňkách. Tepelné působení o delším trvání nemělo za výsledek žádnou významnou změnu v porovnání s 40 min. vzorky. Podání N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu před tepelným stresem mělo velmi značný účinek. Při 60 min. tepelném stresu se se hladina hsp72 zvýšila asi 50 krát ve srovnání s 37°C vzorky, ale významné zvýšení bylo možno detegovat již při tepelném stresu trvajícím po 40 minut. Tato vysoce indukovaná množství hsp72 byla stabilní v buňkách tepelně šokovaných po 120 minut. N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát přidaný ve fázi nápravy byl rovněž účinný, i když v menším stupni.
107
Hsp90: Při 20 min. tepelném působení nebyl teplotní šok sám schopen indukovat zvýšenou hladinu HSP90, avšak když se před tepelným šokem přidal N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát, hladina Hsp90 se zvýšila asi pětkrát. Nejvyšší účinek preinkubace s touto sloučeninou bylo lze pozorovat po její kombinaci s 60 min. tepelným působením. Je zajímavé si povšimnout, že v případě HSP90 byl N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát přidaný po 60 min. 43°C působení účinný stejně (ne-li více) jako když se přidá před stresem vysoké teploty. U inkubací za vysoké teploty delších než 90 minut účinek N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridin-karboximidoyl chlorid maleátu zřetelně slábne.
Grp94: Tvorba stresové bílkoviny Grp94 byla indukována po min. tepelném šoku. Tento účinek měl vrchol při tepelném po čemž následoval prudký sestup již
N-[2-hydroxychlorid maleátu případě, kdy se působení po 60 minut, v případě 90 min. vzorků. Schopnost
3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl indukovat hladinu Grp94 byla nevýraznější v sloučenina přidávala před stresem, ale významný vzestup bylo vidět i když se kombinovalo přidání sloučeniny předem s 20 minut trvajícím tepelným šokem (kde byl čtyřnásobný vzrůst v porovnání s působením 43°C). Na druhé straně: Přidání této sloučeniny během nápravy po tepelném stresu trvajícím 40 nebo 60 minut bylo skoro stejně účinné jako podání N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu po 16 hodin před stresem.
Obrázek 2 ukazuje Western analýzu bílkovin z H9c2 buněk. Použité sondy jsou: Protilátka k hsp60, ukázaná v (1); protilátka k hsp72, ukázaná v (2); protilátka k hsp90, ukázaná v (3); protilátka k grp94, ukázaná v (4). Dráha (-) představuje buňky držené v nepřítomnosti N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu při 37°C a dráha (+) představuje buňky držené v jeho přítomnosti (koncentrace ΙΟ-5 M po 16 hodin). Tepelný šok při 43°C se prováděl po časy vyznačené
- 108
v obrázku. N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát při 10-5 M konc. byl přidán 16 hodin před tepelným působením (dráha (B)) nebo v průběhu periody nápravy (dráha (A)).
Celkový pohled na účinek různých působení na množství různých hsp v H9c2 srdečních buňkách poskytuje Obr. 1. Množství stresových bílkovin samotnému (43 °C) je bílkovin v buňkách, v buňkách vystavených tepelnému šoku představováno (A); množství stresových na něž se působilo ΙΟ-5 Μ N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem před tepelným působení je představováno v (B); a množství stresových bílkovin v buňkách, na něž se působilo 10-5 M N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem v průběhu 6-hodinové periody nápravy je představováno (C). Vodorovná osa představuje časové trvání tepelného působení a svislá osa představuje relativní množství stresových bílkovin.
Tepelné působení indukovalo všechny druhy HSP zkoumané v této studii. Vzrůst byl méně výrazný v případě hsp60. Hladina hsp60 se zvýšila asi dvakrát po vystavení buněk 20 min. tepla, zatímco při delších působeních nebylo lze detegovat žádný další vzrůst. Největší účinek tepelného stresu byl viditelný u hsp72, kde se její množství zvyšovalo na asi dvanáctinásobek. když se N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát přidal 16 hodin před tepelným působením, daná hladina všech HSP se zvyšovala dále na přinejmenším dvojnásobek v porovnání s hladinou pozorovanou pro tepelný stres. Bylo rovněž jasné, že mezi HSP se hladina hsp72 zvyšovala v mnohem větším rozsahu při kombinaci tepelného stresu a N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu, znovu když se porovnává k indukci detegované pro tepelný stres samotný. Když se N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát podával ve fázi nápravy, skoro ve všech zkoumaných případech se obsah hsp zvyšoval, ale opět zvýšení hsp72 bylo nejvýraznější.
• ·
- 109
Rozbor
Wester analýza ukázala značné nahromadění HSP zkoumaných tříd po vystavení srdečních buněk tepelnému šoku. Přidání N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu buď před, anebo po šoku vysokou teplotou, znásobovalo účinek tepelného působení na produkci HSP. Podle tohoto tedy N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát působí synergicky s teplotním stresem indukcí tvorby všech tříd molekulárních chaperonů.
Příklad 7
ÚČINEK N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU NA BUNĚČNOU EXPRESI HSP (ZKOUMÁNO NA TRANSKRIPČNÍ ÚROVNI)
Pozadí
Krátké vystavení ischemii (např. opakovaným tlakem) může prekondicionovat srdce a chránit jej před následnou letální ischemii, jak je doloženo sníženou incidencí ventrikulární fibrilace, zmenšenou velikostí infarktu a lepší nápravou místních funkcí myokardu během reperfuze ischemického srdce. U takovéhoto prekondicionování bylo prokázáno, že indukuje expresi HSP, obzvlášť hsp72. V této sekci se zkoumá účinek N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu pomocí sledování akumulace mRNA v buňkách po ischemii a porovnávání se situací, kdy se ischemie kombinuje s podáváním N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu.
- 110
Materiály a metody
a) indukce tepelného stresu
Experimenty se prováděly na samcích SPRD potkanů. Zvířata byla anestetizována Nembutalem v dávce 60 mg/kg/i.p. Tělesná teplota potkanů byla udržována infralampou umístěnou nad břichem a měřila se tělesná teplota. Po 20 - 40 minutové periodě byla teplota potkanů zvýšena na 42,0 - 42,2°C a tato teplota byla udržována po 15 minut. Po periodě zotavení (2 hod.) byly vzaty vzorky tkání z levých a pravých srdečních komor.
b) indukce srdeční ischemie
Experimenty se prováděly na samcích SPRD potkanů. Zvířata byla anestetizována Nembutalem v dávce 60 mg/kg/i.p. Po otevření hrudníku byla stlačena po 5 minut LAD koronární arterie a pak se zjišťovala incidence a trvání ventrikulární tachykardie a fibrilace v reperfuzní periodě (10 minut). Odebraly se vzorky tkání z levých a pravých srdečních komor.
c) metoda Northern analýzy
Celková RNA se extrahovala s použitím RNAgents (Promega) podle instrukcí výrobce (Protocols and Applications, 2. vydání, 1991, Promega Corporation). Ve stručnosti: Zmrzlé vzorky tkání (vzorky tkání z levých a pravých srdečních komor potkanů podrobených tepelnému stresu nebo srdeční ischemii) vážící 50 až 100 mg se homogenizují v 1,0 ml denaturujícího při + 4°C
Brinkmanovou homogenizací. Pak se přidala 1/10 objemu 3 M octanu sodného (pH 4, 0) a homogenát se extrahoval kyselým fenolem (fenol:chloroform:isoamylalkohol 25:24: 1) vortexováním po 10 sekund. Vzorek se inkuboval na ledu po 15 minut, a pak centrifugoval (4“C, 20 min., 10 000 x g). Vodná fáze se přenesla do nových Eppendorfových zkumavek, postup se opakoval a vodná fáze se srazila při -20 °C přes noc. Po centrifugaci (4’C, ·· ····
- 111 min., 10 000 x g) se precipitát promyl dvakrát 95 % alkoholem a vysušil za pokojové teploty. RNA se rozpustila v 20 μΐ vody zpracované s DEPC. Osm μg celkové RNA se podrobilo kapilárnímu přenosu na formaldehyd-agarosovém gelu, RNA z gelu se přenesla na nylonovou membránu podle instrukcí výrobce (Zeta-Probe GT, BioRad).
Obsah hsp72 mRNA u jednotlivých vzorků se porovnával s hladinou mRNA glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasového (GAPDH) genu odpovídajících sond. DNA sondy (lidská hsp70 cDNA plné délky a Apa-Ncol fragment potkaní GAPDH cDNA) byly značeny alfa-32P CTP s použitím soupravy Random Prime DNA Labeling Kit (USB). Radioaktivně značené fragmenty byly čištěny na koloně Sephadexu G-50 (Pharmacia) jak je popsáno (Ausubel et al., vyd.: Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, 1987).
Prehybridizace se prováděly při 65 °C v H-pufru (0,25 M Na2HPO4, pH 7,2, 7 % SDS) po 15 minut. Hybridizace se prováděly přes noc (65°C, H-pufr) s izotopově značenou cDNA sondou o alespoň 106 cpm/ml. Membrána byla promyta s 20 mM Na2HPO4, pH 7,2, 5 % SDS (65°C, 2 x 15 min.) a hodnocena autoradiografií. Tatáž membrána se použila k sondování hsp70 mRNA a měření GAPDH mRNA se použilo jako vnitřní standard.
Výsledky
Koronární okluze po 5 minut byla následována reperfuzí, což u potkanů vyvolávalo ventrikulární tachykardii a fibrilace. Před-působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem (0,5-, 0,75-, 1,0 mg/kg tělesné hmotnosti i.v. 5 min před okluzí) významně snižovalo střední trvání ventrikulární tachykardie a zlepšovalo přežívání prevencí ventrikulární fibrilace.
Zatímco všechna zvířata (n = 6) kontrolní skupiny zemřela během fáze reperfuze, zvířata, na něž se působilo N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem (100 mg/kg p.o.) nejenže přežívala reperfuzí ···· ··· ·· ···· ··· ··
- 112 • · · • · · • ··· · • · ·· · po 5 min. okluzi, ale byla u nich detegována i značně zýšená exprese hsp72 genu v preparátech srdečního svalu.
Obrázek 3 je Northern analýza celkové RNA izolované z levé komory potkaního srdce, ilustrující výsledky získané v tomto experimentu. Kontrola (dráha 1), tepelné působení (dráha 2), imitační operace (dráha 3), ischemie (dráha 4), N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát plus ischemie (dráha 5), a N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát (dráha 6). GADPH se měřil jako interní sonda. Pro tepelný šok se rektální teplota udržovala na 42°C po 15 minut.
Zaznamenalo se, že samotné podávání N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu nemá schopnost aktivovat hsp72 gen.
Příklad 8
OCHRANNÝ ÚČINEK HYDROXYLAMINOVÝCH DERIVÁTŮ PODLE VYNÁLEZU PROTI SRDEČNÍ ISCHEMII
Samci Sprague-Dawley potkanů pentobarbitalem sodným (Nembutal, 60 i.p.) a uměle ventilováni ovzduším místnosti (2 ml/100 g, 54 cyklů za minutu) prostřednictvím tracheoktomie. Pravá karotidová tepna se kathetrizovala a spojila se s převodníkem tlaku (BPR-01, Stoelting) k měření systémového tepenného krevního tlaku (BP) pomocí předzesilovače (Hg-02, Experimetria). Hydroxylaminové deriváty zveřejněné v Příkladě 5 se podávaly prostřednictvím kanyly k jugulární žíle (i.v) nebo orálně (p.o.). Tep (HR) se měří kardiotachometrem (HR-01, Experimetria) a snímá se elektrokardiogram (ECG standardní vedení II) na záznamové zařízení (MR-12, Medicor) pomocí podkožních nerezových jehlových elektrod. Hrudník se otevřel levou thoraktomií a pak se srdce exteriorizovalo jemným tlakem na pravou stranu hrudního koše. Pod levou hlavní koronární arterii se rychle umístilo 4-0 hedvábné byli anestetizováni mg/kg tělesné hmotnosti,
- 113 šití, jak je popsáno Selyem et al. (1960). Srdce se opatrně umístilo zpět do hrudníku a zvíře bylo ponecháno zotavit se. Monitorovala se rektální teplota a udržovala se konstantní na 37°C. Experimentální protokol začínal 15 minutovou stabilizační periodou během níž pozorování krevního tlaku trvale nižšího než 70 mm Hg nebo arytmie vedlo k vyřazení. Myokardiální ischemie se pak vyvolala koronární okluzí po 5 minut a reperfuze se ponechala po 10 minut.
V průběhu celého pokusu se BP, HR a ECG nepřetržitě zaznamenávaly na vícekanálovém zapisovači (R61-6CH, Medicor). Hydroxylaminové deriváty, jejichž tautomerní formy jsou představovány obecnými vzorci I a II, se podávaly v 5. a 60. minutě před okluzí i.v. nebo p.o. cestou. Dávky hydroxylaminového derivátu z Příkladu 5 byly 0,5, 0,75, 1,0 mg/kg i.v. a 100 mg/kg tělesné hmotnosti p.o., zatímco referenční substance Bepiridil se podávala v dávce 1,0 mg/kg i.v.
Střední trvání ventrikulární tachykardie (VT) a/nebo ventrikulární fibrilace (VF) v průběhu prvních 3 minut reperfuze se analyzovaly jednosměrnou analýzou variance. Incidence VF byla analyzována s použití testu chi-čtverce. Hemodynamické proměnné byly analyzovány Studentovým t-testem. Kritická hladina významnosti byla nastavena na p <0,05. Všechny výsledky byly vyjádřeny jako středy + S.E.M. Sloučeniny byly podávány i.v. v dávce 1 mg/kg tělesné hmotnosti 5 minut před okluzí.
Hydroxylaminové deriváty, u nichž byly nalezeny zvláštní výhody pro ochranu zvířat proti poškození ischemií/reperfuzí jsou dány do následujícího seznamu. Přežití (%) ukazuje procento zvířat, jež přežila účinek 5-minutové koronární okluze.
- 114 • · · · • · ·
Kód Přežití (%)
Příklad 77 i.v. 1 mg/kg těl.hm. 67
Příklad 78 11 100
Příklad 8 »1 100
Příklad 13 II 60
Příklad 9 II 100
Příklad 10 II 67
Příklad 5 II 80
Příklad 6 II 100
Příklad 79 II 100
Příklad 1 If 100
Příklad 16 II 67
Příklad 65 II 78
Příklad 54 ti 80
Příklad 20 II 100
Příklad 22 tl 100
Příklad 47 11 100
Příklad 39 II 60
Příklad 51 11 75
Příklad 64 11 100
Příklad 56 11 67
Příklad 57 11 67
Příklad 58 11 100
Příklad 59 11 86
Příklad 60 11 60
Příklad 61 11 83
- 115 -
Příklad 55 80
Příklad 66 57
Příklad 62 57
Příklad 63 50
Příklad 4 50
Kontrola (bez působení), n = 24 10
Navíc ke sloučeninám uvedeným shora, bylo nalezeno pro následující sloučeniny, že poskytují výhodné výsledky:
N-[2-hydroxy-3-(pyrrolidin-l-yl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1) (U.S. 5 328 906, Příklad 12, mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 67),
N-[2-hydroxy-3-(diethyl-amino)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid hydrochlorid (1:1) (U.S. 5 328 906, Příklad 11, 1 mg/kg t.hm. i.v., přežití %: 62),
N-[2-hydroxy-3-(prop-2-yl-amino)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1) (U.S. 5 328 906, Příklad 13/4, mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 60),
N-[2-hydroxy-3-(morfolin-l-yl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1) (U.S. 5 328 906, Příklad 12, mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 71),
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidyl)-propoxy]-a-(3,4-dimethoxy-fenyl)acetamidoyl chlorid (U.S. 5 328 906, Příklad 14, 1 mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 67),
- 116
N-[2-hydroxy-3-(terc-butyl-amino)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1) (U.S. 5 328 906, Příklad 13/5, 1 mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 57),
Chlorid kyseliny O-(3-piperidino-2-hydroxy-l-propyl)-benzhydroximové hydrochlorid (U.S. 5 147 879, Příklad 1, 1 mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 100),
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1) (U.S. 5 147 879, Příklad 2, mg/kg t.hm., i.v., přežití %: 100, 20 mg/kg t.hm., p.o., přežití %: 100).
Příklad 9
ÚČINEK N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU V NÁPRAVĚ BUNĚČNÉ MEMBRÁNY A ZACHOVÁNÍ MEMBRÁNOVÉ FLUIDITY
ZMĚNA FLUIDITY BUNĚČNÉ MEMBRÁNY SPOJENÁ S BUNĚČNÝM
POŠKOZENÍM INDUKOVANÝM STRESEM SÉROVÉ DEPRIVACE A ÚČINEK
N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU V REVERZI ZMĚNY VE FLUIDITĚ
Pozadí
Jedním přístupem k modelování patofyziologických událostí způsobovaných stresem metabolických poruch provázejících cukrovku je snižování hladiny insulinu v kultivačním médiu. Protože insulin je poskytován přidávaným sérem, částečná nebo totální deprivace se zdá být optimálním prostředkem k detekci změn v různých regulačních úrovních buňky.
- 117
0000
0 0
0
Sérová deprivace je široce používanou metodou k zastavení buněk v Gl/S fázi, t.j. synchronizaci buněčného cyklu (Ashihara, T. Methods in Enzymology, 58: 248-249 (1979)). Bylo pozorováno, že u kultivovaných buněk dochází k apoptotickým procesům při nedostatku přídatného séra (Cohen et al., Adv. in Immunology 50: 50: 50-85 (1991)) a to bylo studováno jako alternativní šok k stautosporinu nebo inhibitorům topoisomerasy na Bal/3T3 buňkách (Kulkami, G. V. et al., J. Cell. Sci. 107: 1169-1179 (1994)), nebo k tepelnému šoku a glutaminové deprivaci v Ehrlichových buňkách (Rowlands, A. G. et al., Eur. J. Biochem. 175: 93-99 (1991)) při zkoumání inhibované proteosyntézy fosforylací eukaryotického iniciačního faktoru (eIF2alfa). Navíc existují důkazy o indukci cytoprotekce v buňkách v sérové deprivaci pomocí podávání externí HSP72 (Johnson, A. D. et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29A: 807-812 (1993)). Zvýšení relativní syntézy
HSP82 a HSP72 sérovou deprivaci bylo rovněž ukázáno (Toye, P. et al., Mol. Biochem. Parasitol. 35: 11-10 (1989)).
Ischemické a hypoxické poškození myokardu a jiných orgánů je zprostředkováno progresivní dysfunkcí membrány a jejím poškozením. Bylo rovněž prokázáno, že v průběhu metabolických poruch srdečních buněk nastávají změny v membránové fluiditě (Buje L. M. et al., In Vivo 5: 233 -238 (1991)). Membránová fluidita primárně odráží orientaci a rychlost pohybu lipidů v její sestavě a každá změna na této úrovni značně ovlivňuje základní membránové funkce (Quinn, P. J. et al., Prog. Biophys. Molec. Biol. 53: 71-103 (1989); Schlame, M. et al., Biochim.
Biophys. Acta 1045: 1-8 (1990)).
V tomto pokuse se provedla pozorování ke stanovení, zda se změny ve fluiditě plazmatické membrány podílejí na vývoji buněčného poškození vyvolaného sérovou deprivaci a zda sérovou deprivaci vyvolaná změna fluidity může být zvrácena podáváním N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu.
- 118 Materiály a metody
Experimenty se prováděly s použitím buněčných linií myších fibrosarkomů WEH1 a potkaních srdečních buněk H9c2, rozdělených do tří skupin:
kontroly (10 % FCS fetálního telecího séra) sérově deprivované zpracované N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem a sérově deprivované
Sérová deprivace a MTT test
Hodnotili jsme různé buněčné linie, koncentraci léčiva, čas před-působení a deprivace, a nalezli jsme nejvhodnější podmínky jak následuje: 5 x 10-4/ml potkaních srdečních buněk H9c2 (n = 6) a myších fibrosarkomů WEH1 (n = 7) se naneslo na 24-jamkové destičky v 10 % FCS DMEM (Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu) a inkubovány po 2 hod při 37°C, 5 % C02. Médium bylo odstraněno a nahrazeno 10 % FCS DMEM, obsahujícím ΙΟ-5 Μ N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát. Po další inkubaci po 6 hodin za podmínek uvedených shora byly misky intenzivně promyty PBS a deprivovány na sérum. Na předem zpracované misky byly až do konce experimentu podáván N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát. Po 18 hodinách hladovění byla většina buněk v sérově deprivované kultuře uvolněna z povrchu, t.j. mrtvá, pozorováno mikroskopicky, zatímco kultury zpracované
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem ukazovaly obraz podobný jako u kontrolních buněk byla měřena v MTT testu založeném na al. (Cancer Res. 49: 4435-4444 (1989)). Jako viability buněk sloužila metoda tetrazoliové buněk. Viabilita metodě Plumba et nepřímé měřítko soli, zahrnující konverzi MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5difenylterazolium bromidu) na zbarvený formazan živými buňkami. MTT se přidával přímo do média v koncentraci 1 mg/ml. Po 2 hod. inkubace při 37°C v temnu byl supernatant odstraněn a k buňkám se okamžitě přidalo 200 μΐ 0,05 M HC1 v isopropanolu. O.D. destiček • · · ·
119 se odečetlo při 570 nm na čtečce ELISA destiček (Labsystems Multiscan Biochromatic, typ 348). Pokusy se v každém případě prováděly přinejmenším v triplikáteh. Relativní viabilita buněk se počítala s definováním kontrolní skupiny jako 100 %.
Stanovení rovnovážné fluorescenční anisotropie
119: 221-227 fluorescence v
Buněčné suspenze 1 x 10b buněk/ml v PBS byly označeny přidáním DPH-PA (3-[p-fenyl)-1,3,5-hexatrienyl]fenylpropionové kyseliny) rozpuštěné v tetrahydrofuranu na finální koncentraci 0,1 μΜ a inkubovány po 10 min. při 37°C. Množství přidaného organického rozpouštědla bylo 0,05 %, aby se zabránilo jeho účinku na buněčné membrány. Membránová sonda DPH-PA byla zvolena pro nábojové vlastnosti sondy, jež umožňují DPH-PA lokalizaci převážně ve vnějším listu plazmatické membrány, s difenyl-hexatrienovou částí interkalovanou mezi horními úseky řetězců mastných kyselin (Kitagawa S. et al., J. Membrane Biol.
(1991)). DPH-PA vykazuje značné zesílení důsledku vazby k lipidům, a poskytuje tak prostředek hodnocení fluorescenční anisotropie jako funkce uspořádání lipidů. Fluorescenční měření byla prováděna při 37’C s použitím Quanta Master QM-1 T-formátového spektrofotometru (Photon Technology Int. Inc., NJ, USA) vybaveného polarizátory v excitační a ve dvou emisních světelných dráhách. Excitační a emisní vlnové délky byly 360 nm (5 nm šířka štěrbiny) resp. 430 nm (5 nm šířka štěrbiny). Měřené fluorescenční intenzity byly opraveny na fluorescenční pozadí a rozptyl světla neznačeným vzorkem. Fluorescenční anisotropie byla kalkulována jako rs = (IW - G.IVH) / (IW + (2 x G.IVH)) kde IW a IVH jsou pozorované intenzity měřené s polarizátory paralelními resp. kolmými k vertikálně polarizovanému excitačnímu paprsku. Faktor G je rovný IVH/IHH a poskytuje opravu na neschopnost přístroje přenášet stejně různě polarizovaná světla a na rozdíl v citlivosti ve dvou emisních kanálech
120 (Kitagawa S. et al., J. Membrane Biol. 119: 221-227 (1991)). IHV a IHH jsou fluorescenční intenzity stanovené při vertikální a horizontální pozici emisního polarizátoru, kdy excitační polarizátor je nastaven horizontálně.
Statistická analýza
Data se uvádějí jako středy + SEM. Statistická porovnání a výpočty se prováděly jednosměrnou analýzou variance s Posthoc Newman-Keulsovým testem (Pharmacological Calculation System). Statistická významnost byla definována jako P < 0,05.
Výsledky
Sérová deprivace jako model pro testování cytoprotektivního účinku N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu:
Sérově deprivované WEH+ a H9c2 buňky vykazovaly 74,8 % resp. 50,5 % relativní buněčné viability. V případě kdy byl v kultivačním médiu přítomen 10-5 M N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát, mělo toto podávání za následek téměř úplné přežívání buněk WEH1 (93 %) a vysokou ochranu potkaních srdečních buněk H9c2 (82,75 %). Pokles relativní buněčné viability sérovou deprivací a ochrana N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem byly u obou buněčných linií signifikantní.
Účinek karboximidoyl deprivovaných
N—[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinchlorid maleátu na fluiditu membrán sérově savčích buněk:
Ke zkoumání účinku sérové deprivace na fluiditu plazmatické membrány kultivovaných savčích buněk byla provedena měření
121
fluorescenční anisotropie s použitím sondy pro plazmatickou membránu, DPH-PA. Fyzikální vlastnosti buněčné plazmatické byly signifikantně změněny sérovou deprivací. Sérová deprivace způsobovala výrazný pokles ve fluorescenční anisotropii DPH-PA, to jest abnormální zvýšení ve fluiditě plazmatické membrány v obou zkoumaných buněčných modelech. Při přidání N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu bylo pozorováno téměř úplné zachování fyzikálního stavu membrány. Tyto změny byly jasně konzistentní s tendencemi popsanými u viability buněk.
Rozbor
Za způsobování metabolických poruch snižovala deprivace normálního kultivačního média u obou studovaných typů buněk jejich viabilitu, jak byla testována MTT metodou. Tento účinek byl téměř plně revertován při přidání N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)- propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu. Sérová deprivace vyvolávala rovněž prominentní změny ve fluiditě plazmatických membrán, o nichž je známo, že přispívají k dysfunkci membrán, provázející poškození myokardu. Na rozdíl od toho byly sérově deprivované buňky kultivované v přítomnosti N-[2-hydroxy- 3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu schopné zachovat si (nebo udržet si) částečně svůj normální fyzikální stav plazmatické membrány.
122
Příklad 10
ÚČINEK INSULINU A N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU NA HLADINU GRP-94 V JÁTRECH STZ DIABETICKÝCH POTKANŮ
Pozadí
Anoxie, glukosové hladovění a několik dalších stavů, jež působí nepříznivě na funkci endoplazmatického retikula (ER), indukují syntézu glukosou regulované třídy stresových bílkovin (GRP) (Lin, Η. Y. et al., Mol. Biol. Cell. 4: 1109-1119 (1993)). 94 kDa člen GRP, GRP-94, z 50 % homologní k 80 kDa stresové bílkovině, je lumenální, vápník-vážící bílkovina endoplazmatického retikula. Zdá se, že spolu s jinými bílkovinami ER funguje GRP-94 jako molekulární chaperon (Nigem, S. K. et. al., J. Biol. Chem. 263: 1744-1749 (1994)). Má se za to, že akumulace molekulárního chaperonu GRP-94 by měla mít příznivý účinek na nápravu buněčného poškození indukovaného STZ diabetem u potkanů. V souladu s tím jsme v experimentech zde uvedených porovnávali různé hladiny GRP-94 v játrech ze zdravých, a diabetických potkanů, z potkanů, jimž se podával N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát a z potkanů, jimž se podával insulin plus N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát.
Materiály a metody
Testované látky: N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát (BIOREX Ltd.), insulin (Protophane HM inj. ) .
Zvířata: Samci Crl (VAF plus) Wistar potkanů (250 - 300 g). Zvířata byla umístěna po 7 na jednu klec při 23-25°C a 50-60 %
- 123 • · · · · · · ·· · · ·· · ·*· · • · · · · • · · · · · · relativní vlhkosti, s cyklem světlo-tma 12/12 hodin. Byl dán volný přístup ke stravě a vodovodní vodě.
Indukce diabetů: Jediná dávka STZ (45 mg/kg i.v.) byla podána ve stavu půstu.
Zvířata byla rozdělena do následujících skupin:
a. Zdravá zvířata
1. Zdravá, s podáváním solného roztoku PO 1 týden (n - 5)
2 . Zdravá, s podáváním solného roztoku po 2 týdny (n = 5)
3 . Zdravá, s podáváním solného roztoku po 4 týdny (n = 5)
4. S podáváním pyridinkarboximidoyl
5. S podáváním pyridinkarboximidoyl
6. S podáváním pyridinkarboximidoyl
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3chlorid maleátu po 1 týden (n = 7)
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3chlorid maleátu po 2 týdny (n = 7)
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3chlorid maleátu po 4 týdny (n = 7)
b. STZ-diabetická zvířata
(n 7 . = 5) Diabetická, s podáváním solného roztoku Po 1 týden
(n 8. = 5) Diabetická, s podáváním solného roztoku PO 2 týdny
(n 9. = 5) Diabetická, s podáváním solného roztoku po 4 týdny
10 . Diabetická, s podáváním N-[2-hydroxy-3-(1- -piperidinyl)
propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu po 1 týden (n = 7)
11. Diabetická, s podáváním N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu po 2 týdny (n = 7) • · ·· ····
- 124
12. Diabetická, s podáváním N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu po 4 týdny (n = 7)
c. Insulinizovaná STZ-diabetická zvířata
13 . Diabetická, léčená isnulinem P° 1 týden (n
14. Diabetická, léčená isnulinem Ρθ 2 týdny (n
15 . Diabetická, léčená isnulinem po 4 týdny (n
7)
7)
7)
c. Insulinizovaná STZ-diabetická zvířata s podáváním N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu
16. Po 1 týden insulinizovaná diabetická zvířata s podáváním N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (n = 7)
17. Po 2 týdny insulinizovaná diabetická zvířata s podáváním N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (n = 7)
18. Po 4 týdny insulinizovaná diabetická zvířata s podáváním N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (n = 7)
Po působení byla játra vyňata a okamžitě zmrazená na -70°C v tekutém dusíku. Působení propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl přísluší): 20 mg/kg/den, p.o.
N—[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) chlorid maleátu (kdekoli
Léčba insulinem: Dvakrát denně v dávkách potřebných k udržení normální hladiny glukosy.
Stanovení hladiny GRP-94
Všechny kroky se prováděly při 0 - 4°C. Potkaní játra (kolem 15 - 20 g) se homogenizovala v domácím mixeru po 2 min. v 80 ml
- 125 modifikovaného lyzačního pufru s jedním detergentem, obsahujícího 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 , 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % Triton X-100 a 1 mM proteázové inhibitory (PMSF, benzamidin, kyselinu aminokapronovou). Homogenát se centrifugoval při 20 000 x g po 30 min. v centrifuze Sorvall RC28S. Většina supernatantu byla zmražena na -20C jako zásobní vzorek, 1 ml se použil k analýze.
Koncentrace bílkovin se stanovila stanovením Bradfordové (Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, sv. 182, Μ. P. Deutscher (vyd.), Academie Press (1990)) ve třech paralelách a nastavila se na 5 mg/ml.
Elektroforéza a přenos
Na ture 227: bílkoviny se
Laboratorní techniky elektroforézy a imunoblotu jsou podrobně popsány v Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane, 3. laboratorní manuál, Millipore, a U. K. Laemmli, 680-685 (1970). Každý vzorek obsahující 1,8 mg před gelovou elektroforézou solubilizoval s 0,6 ml mM Tris-HCl, pH 6,8, 8,3 mM pufru obsahujícího 110 merkaptoethanol, 3 % SDS, 3 % glycerol a něco bromfenolové modři, a třepal se při pokojové teplotě po 30 minut.
Elektroforéza se prováděla podle Laemmliho na 8 % polyakrylamidovém gelu s 30 μg bílkoviny na dráhu při konstantním napětí 50 V přes noc. Bílkoviny se pak buď vybarvily s Coomassie Brilliant Blue R-250 nebo přenesly na Immobilone PVDF /Millipore) při konstantním proudu (300 mA) po 3 hodiny při 4°C v přenosovém pufru (10 mM CAPS, pH 11, 10 % methanol). Nespecifická místa membrány se zablokovala 2 % bovinním sérovým albuminem (BSA) v TPBS (fosfátem pufrovaný solný roztok s 0,1 % Tween 20) při 4°C přes noc. Membrána s přeneseným materiálem byla inkubována s GRP94 monoklonální protilátkou (SPA-850, StressGen), zředěnou 1:3000 po 1 hodinu při pokojové teplotě. Pak se promyla • · ·
- 126 -.
s TPBS pufrem po další 1 hodinu s anti-potkaní protilátkou konjugovanou jednu hodinu, a inkubovala po další (Sigma, 1:4000 zředění) sekundární s křenovou peroxidasou. Po následném mytí s TPBS byla membrána vyvinuta s ECL systémem (Amersham).
Byla připravena diluční série celkové bílkoviny (9/1 vzorek) a přenášena a vyvíjena pokaždé se vzorky, a vypočítala se kalibrační křivka. Změny v obsahu stresových bílkovin byly kvantifikovány s použitím denzitometru Bio-Rad (Model 1650) a integrátoru Hewlett-Packard (HP 3394 kalibrační křivky.
A) a opraveny podle
Statistická analýza
Data se uvádějí jako středy + SEM. Statistická porovnání a výpočty se prováděly jednosměrnou analýzou variance s Posthoc Newman-Keulsovým testem (Pharmacological Calculation System). Statistická významnost byla definována jako P < 0,05.
Výsledky
Signifikantní snížení relativního obsahu GRP-94 je pozorováno u potkanů diabetických po 1 týden, 2 týdny a 4 týdny. Tento účinek u zvířat diabetických po 1 týden a 2 týdny lze úplně zvrátit podáváním N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3maleátu. Podávání insulimu, N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)chlorid maleátem téměř týdnu pyridinkarboximidoyl chlorid samotného nebo v kombinaci s propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl zdvojnásobilo hladiny těchto bílkovin ve vzorcích po a 2 týdnech v porovnání s kontrolním stavem.
Na rozdíl od předešlých nálezů, podávání N-[2-hydroxy3 —(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu samotného nevedlo u zvířat diabetických po 4 týdny k významné změně relativního množství GRP-94. Navíc: U obou insulinizovaných skupin, bez ohledu na podávání N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu, jsme pozorovali návrat GRP-94 ke kontrolní hladině.
- 127 Příklad 11
ÚČINEK N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)-PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU V OCHRANĚ EPIDERMÁLNÍCH BUNĚK PROTI POŠKOZENÍ ZPŮSOBOVANÉMU VYSTAVENÍM TEPLU A UV SVĚTLU
Materiály a metody
HaCaT je spontánně imortalizovaná lidská keratinocytová buněčná linie odvozená z normální kůže dospělého člověka (Boukamp et al., J. Cell. Biol. 106: 761-771 (1988)). HaCaT je buněčná linie s plnou schopností epidermální diferenciace, s normální keratinizací a s netumorogenickým charakterem. Tato rychle se množící keratinocytová linie s vysokou senzitivitou k ditharnolu je rovněž charakterizována přítomností steroidových receptorů. HaCaT buňky (4 x 105 buněk na Petriho misku o průměru 35 mm) se naočkovalo a rozrůstalo v DMEM doplněném 5 % fetálního telecího séra (GIBCO, kat. č. 011-6290H) ve zvlhčené atmosféře o 5 % CO2 při 37°C. Kultury byly 24 hodin po nanesení promyty PBS a zpracovány teplem nebo světlem.
Konfluentní kultury buněk byly vystaveny teplu (42, 44, 46, 47, 48°C) nebo UV světlu (UVA 1, 2, 4, 6 J/cm2). Vystavení teplu bylo zajištěno cirkulujícími vodními lázněmi. Jako zdroj UV světla byl použit přístroj Waldmann PUVA 4000 a s energetickým spektrem konečného výstupu mezi 320 a 390 nm, s vrcholem při 365 nm. Výstupní energie byla monitorována IL-700 radiometrem vybaveným sensory UVA a UVB.
Morfologie buněk byla monitorována s použitím mikroskopie ve fázovém kontrastu (Opton Axioplan Microscope, s fázově-kontrastovými objektivy Plan-Apochromat Ph). Za indikátory cytotoxicity byly považovány následující faktory: a) snížena hustota adherovaných buněk, b) ztráta pravidelného patníkového uspořádání se zvětšením mezibuněčných odstupů, c) změna buněčného tvaru, např. zábrana rozšiřování buněk, botnání, pyknotické svraštění, fragmentace, a d) změny • · · ·
128 cytoplazmy, např. kondenzace nebo vakuolizace. Buněčná viabilita byla rovněž zkoušena, s použitím testu exkluze trypanové modři.
Výsledky
Citlivost HaCaT keratinocytů k tepelnému stresu byla stanovena zkoumáním jejich viability. Výsledky ukázaly že 24 hodin po vystavení teplotě 48°C neexistovaly prakticky žádné živé buňky (2,7 %) v porovnání s kontrolou (100 %) při 37°C. Viabilita HaCaT keratinocytů 24 hodin po vystavení 45°C se ukázala být 59 %. Jenu hodinu po vystavení teplu nebyly v HaCaT kulturách žádné morfologické změny. 24 hodin po působení tepla při 46 °C nebo vyšší teplotě docházelo k signifikantnímu (p < 0,01) uvolňování zachycených buněk a nastávaly morfologické změny, jako je ztráta pravidelného patníkového uspořádání se zvětšením mezibuněčných odstupů, botnání, pyknotické svraštění, a vakuolizace HaCaT keratinocytů. Po vystavení UV bylo nalezeno, že snížení počtu životaschopných buněk mělo přímý vztah k dávce UVA.
Prekondicionování buněk teplem (42°C po 1 hodinu) nebo N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl· chlorid maleátem (v koncentraci 5 x 10-5 M po jednu hodinu) poskytlo buňkám ochranu proti tepelnému vystavení při 48°C. Když se buňky zkoumaly 24 hodin po působení 48°C, bylo nalezeno, že ve srovnání s nezpracovanými buňkami buněčná viabilita se zvýšila na 48 % (při prekondicionování při 42°C) a 84 % (když se předem působilo N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem. Nejvýraznější ochrana (vzrůst ve viabilitě o 140 %) se pozorovala v případě kombinovaného působení (s 42°C a N-[2—hydroxy—3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem).
Tepelné prekondicionování s 42°C, ale ne s 44°C a 45°C, vyvolalo výrazné snížení cytotoxicity způsobované UV-světlem. Působení 42°C poskytlo ochranu k vystavení jak 2, tak 4 J/cm2. Viabilita předem zpracovaných HaCaT keratinocytů se zvýšila
129 o 132 % (při 2 J/cm2) a 218 % (při 4 J/cm2) v porovnání s UV-vystavenými buňkami bez předešlého působení (100 %).
Příklad 12
ÚČINEK N-[ 2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)-PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU V INDUKCI EXPRESE MOLEKULÁRNÍHO CHAPERONU V TKÁNÍCH LIDSKÉ KŮŽE
Ultrafialové UVB světlo (290-320 nm) je jednou ze složek slunečního světla a je o něm známo, že způsobuje poškození kůže. Byla zkoumána role N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu při snižování poškození způsobovaných tkáním kůže vystavením UVB, jakož i účinek N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát ve zvyšování exprese molekulárního chaperonu v tkáních kůže.
Materiály a metody
Tkáň lidské kůže byla roubována na imunodeficientní (SCID) myši. Experimentální protokol zahrnoval působení N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (5,0 mg/kg i.p.) na jednu skupinu myší, a rozpouštědlovým roztokem NaCl (300 μΐ) na druhou, po 7 dní. V den 8 byly obě skupiny myší vystaveny UVB světlu (100 mJ/cm2) a 24 hodin po tomto vystavení byly vzaty vzorky pro histologické vyšetření (řezy barveny hematoxylinem a eosinem) a imunohistochemické vyšetření (nepřímá imunofluorescenční technika s monoklonální protilátkou, mAb).
Výsledky
U UV-ozářených myší, na něž se předem působilo N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid
- 130 maleátem, nebyly pozorovány klinické známky poškození způsobovaného vystavením UV. Naproti tomu u jednoho ze zvířat, na něž se předem nepůsobilo, byla nalezena hnisavá reakce transplantované oblasti. Dále: Imunofluorescenční studie s použitím mAb hsp72 ukázaly intenzivní, lineární barvení podél podkladové membránové zóny lidské a myší kůže u zvířat, na něž se působilo N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem. Tato reakce nebyla pozorovatelná v kůži zvířat, na něž se takto nepůsobilo. Navíc: Jaderný typ barvení granulocytů byl přítomen v hnisavé, zánětlivé kožní reakci zvířete bez působení.
Podle tohoto mělo podávání N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridin- karboximidoyl chlorid maleátu za následek zvýšenou tvorbu hsp v tkáních kůže a poskytovalo ochranu před poškozením v důsledku vystavení UV.
Stanovení hladiny HSP-70 z kůže: Western analýza bílkovin odvozených ze štěpů lidské kůže ve SCID myších podrobených UVB a UVB + N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu.
Metody
Extrakce celkových rozpustných bílkovin z kůže
Všechny kroky se prováděly za pokojové teploty. Kůže (kolem 9 - 35 mg) byla nakrájena na malé kousky a homogenizována pístem z matovaného skla v Eppendorfových zkumavkách po 2 minuty v (2 μl/μg) 2-krát koncentrovaného Laemmliho pufru (65 mM Tris-HCl, pH 6,8, 5 % β-merkaptoethanol, 2 % SDS, 10 % glycerol a 0,1 % bromfenolové modři, všechny tyto materiály byly produkty Sigma). Vzorky byly solubilizovány po dalších 60 minut s nepřetržitým třepáním. Před nanesením na gel byly vzorky centrifugovány při 10 000 rpm po 10 minut.
- 131 -
Elektroforéza a přenos
Elektroforéza se prováděla na 8 % polyakrylamidovém gelu s 10 μΐ vzorkem na dráhu při konstantním napětí (50 V) přes noc. Bílkoviny se buď vybarvily s Coomassie Brilliant Blue R-250 nebo přenesly na membránu Immobilone PVDF (Millipore) při konstantním proudu (300 mA) po 3 hodiny při 4°C v přenosovém pufru (10 mM CAPS, pH 11, 10 % methanol). Nespecifická místa membrány se zablokovala 2 % bovinním sérovým albuminem (BSA) v TPBS (fosfátem pufrovaný solný roztok s 0,1 % Tween 20) při 4°C přes noc. Membrána s přeneseným materiálem byla inkubována s HSP-70 monoklonální protilátkou (SPA-8dc, StressGen), zředěnou 1:1500 po 1 hodinu při pokojové teplotě. Pak se promyla třikrát s TPBS pufrem po další jednu hodinu, a inkubovala po další 1 hodinu s anti-myší (Sigma, 1:1500 zředění) sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidasou. Po následném mytí (třikrát) s TPBS byla membrána vyvinuta s ECL systémem (Amersham).
Příklad 13
ÚČINEK N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)-PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU V AKTIVACI TVORBY HSP A V OCHRANĚ OXIDATIVNÍ FOSFORYLACE
Pozadí
Ukázalo se, že vystavení buněk Saccharomyces cerevisiae tepelnému šoku (5 min. při 42-44°C) vede k poruše spárování oxidativní fosforylace a systému mitochondriálního elektronového transportu, což ovlivňuje schopnost buněk syntetizovat ATP (Patriarca et al., Biochemistry and Cell Biology 70: 207-214, 1992). Když se však na buňky předem působilo N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem po krátký časový úsek při 37°C před tepelným šokem, zmenšilo to narušení spárování a ochránilo mitochondriální
syntézu ATP. Inhibice cytoplazmatické syntézy RNA nebo bílkovin v průběhu tepelného šoku se ukazuje jako zábrana této ochrany mitochondriální aktivity. V souladu s tím se zdá být jednou z rolí hsp role ochrany spárování oxidativní fosforylace a systému mitochondriálního elektronového transportu, jež je narušeno, když jsou buňky vystaveny fyziologickému stresu, např. tepelnému šoku.
V této sekci byl N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát podáván buňkám před tím, než byly vystaveny tepelnému šoku a byl zkoušen jeho účinek na ochranu spárování oxidativní fosforylace se systémem mitochondriálního elektronového transportu před tepelným stresem.
Bylo rovněž zkoumáno, zda aktivita transkripčních faktorů AP-1 a P 1 může být modulována N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem u kvasinkových buněk vystavených různým stresovým stavům.
Materiály a metody
Experimentální protokol ke stanovení odpojení oxidativní fosforylace a mitochondriální syntézy ATP v Saccharomyces cerevisiae je poskytnut v Patriarca et al., Biochemistry and Cell Biology 70: 207-214, 1992, přičemž tento odkaz je zde plně zahrnut odkazem.
K buňkám S. cerevisiae, jež byly udržovány při 25°C, byly přidávány různé koncentrace N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (koncentrace mezi 10 až 100 μΜ) a buňky pak byly inkubovány po jednu hodinu při 25°C v přítomnosti N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu. Teplota pak byla zvýšena na 42°C a byly sejmuta oxygrafová měření, jak se popisuje v Patriarcově publikaci.
Buňky zpracované s N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem byly testovány na doprovodnou indukci hsp genů, s použitím postupu Northern analýzy. Způsoby extrakce, čištění mRNA z eukaryotických buněk ···· ··· ·· ····
- 133 ·· ·· • · · · · · · • · · · · · · • · ··· · ··· · • · · · · ·· ·· ·· · a analyzování mRNA takto získané s použitím postupu Northern analýzy jsou v oboru dobře známy a popsány v Maniatisovi a v Maresca et al., Archives Medical Research 24: 247-249 (1993); oba odkazy jsou zde zahrnuty v úplnosti. Protokol Northern analýzy je rovněž popsán v Příkladě 7, uvedeném výše. Jako sondy se použily DNA sekvence hsp26 a hsp70.
Výsledky
Obrázek 4 je Northern analýza hsp26 mRNA indukované v S. cerevisiae, ilustrující výsledky z tohoto experimentu. Koncentrace dané chemické sloučeniny podávané buňkám a trvání inkubace jsou vyznačeny.
Indukce byla pozorována v buňkách, jež byly inkubovány v přítomnosti N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (10 až 100 μΜ) po 5 minut až jednu hodinu při 25°C. Výsledky se zdají rovněž ukazovat na to, že indukce nastává už po 5-minutové inkubaci.
Bylo rovněž nalezeno, že koncentrace testované sloučeniny mezi 10 a 100 μΜ byly účinné při zmenšování zásahu do spárování oxidativní fosforylace a systému mitochondriálního elektronového transportu v důsledku tepelného soku. Ochrana před narušením mitochondriální syntézy ATP byla v rozsahu pozorovaném, když se termotolerance buněk vyvolávala prekondicionováním za jejich vystavení intermediární teplotě 37°C (40 - 60 % ochrany).
Účinek benzylalkoholu na a) aktivitu adenylát cyklasy a b) fyzikální stav bovinních tyroidních plazmatických membrán je ukázán v Obr. 5. Změna v aktivitě adenylát cyklasy (a) je ukázána bazální (kroužky), TSH-stimulovanou (křížky), forskolinstimulovanou (trojúhelníky), choleratoxin-stimulovanou (obrácené trojúhelníky, a fluoridy stimulovanou (kosočtverce) enzymovou aktivitu. Membrány byly inkubovány s léčivy před přidáním propojovacích [coupling] faktorů. Fyzikální stav membrány byl hodnocen sledováním rovnovážné fluorescenční anisotropie (b) několika fluoroforů zabudovaných do membrány: DPH (kroužky), • · • ·
- 134
12—AS (křížky) a TMA-DPH (trojúhelníky). Měření se prováděla při 37°C. Molární poměr fluorofor/lipid byl vždy 1:500.
-0' min.
Naše pokusy dokázaly, že N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát vykazuje významný vliv na aktivitu AP-1 a že jeho účinek je určován aktuálními metabolickými podmínkami buněk. Zatímco N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát zvyšuje aktivitu AP-1 když je přísun živin nedostatečný, v bohatém médiu aktivitu tohoto faktoru snižuje. Účinek této sloučeniny je nejvýraznější v hustých, pozdně logaritmických kulturách. Opačnou tendenci lze pozorovat pro P 1. Jeho aktivita se snižovala, když byl N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát přidáván k buňkám v minimálním médiu. Je možné, že down regulace P-l byla vyvolána právě změnami v buněčné protistresové mašinérii, způsobenými N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem indukovanou aktivací AP-1. Je zaznamenáno, že P-l odpovídal na všechny typy stresu, ale jeho aktivita nebyla ovlivněna testovaným materiálem. Naše důležitá zjištění, obzvlášt s AP-1, by mohly vysvětlit mnohé aspekty in vivo aktivity této sloučeniny a budou se detailně probírat.
Účinek N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (B) na expresi hsp genu v tkáňové kultuře je ukázán v Obr. 6. HeLa buňky byly transfekovány s reportérovým plasmidovým konstruktem, v němž byl promotor lidského hsp70 genu fúzován k luciferasovému reportérovému genu. Účinek tepelného šoku a/nebo N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu na hsp promotor byl stanovován měřením aktivity luciferasy a stanovováním hladiny hsp bílkoviny z chromosomálního genu) Western analýzou.
Vzorky jsou: 1: kontrola bez DNA, 2: 10 μg transfekované DNA v tn, bez tepelného šoku, 3: 10 μ9 tepelný šok 24 hodin poté, v luminometru (exprimované transfekované DNA v tQ, 4: jako předešlé +
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl • · · ·
- 135 chlorid maleát (B) v tQ , 5: 10 μg transfekované DNA v tQ +
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát (B) v tQ , 6: 10 μg transfekované DNA v tQ, min. tepelný šok 24 hodin poté, N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát (B) přidán v čase tepelného šoku, 7: 10 μ9 transfekované DNA v tQ, min. tepelný šok 24 hodin poté, N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát (B) přidán v čase 0 a v čase tepelného šoku, 8: 10 μ9 transfekované DNA v tQ, bez tepelného šoku, N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát (B) přidán v čase 0 a po 24 hodinách.
Příklad 14
ÚČINEK N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)-PROPOXY] -3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU V INDUKCI MOLEKULÁRNÍHO CHAPERONU V NÁDOROVÝCH BUŇKÁCH
Neletální tepelný šok zvyšuje citlivost k lyži zprostředkované NK buňkami 1,5-krát a tento tepelný šok plus působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu mají synergický účinek na schopnost K562 být lyžovány. Tento dodatečný účinek připisovaný N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu jasně pocházel ze zvýšené exprese hsp72 plazmatické membrány, protože in vivo blokovací studie (s použitím hsp72-specifické monoklonální protilátky) odhalily silnou inhibici NK-lyze.
Na Obr. 7 je ukázán účinek N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (B) na hladiny hsp72 indukované tepelným šokem. N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát samotný nezvyšoval hladiny hsp72, zatímco kombinace tepelného šoku a N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl • · · ·
- 136 chlorid maleátu vedla k signifikantnímu zvýšení exprese hsp72 ve srovnání s tepelným šokem samotným.
Pozadí
O bílkovinách tepelného šoku je známo, že jsou lokalizovány v cytoplazmě, kde vykonávají různé chaperonové funkce. Uvádí se však, že v nádorových buňkách jsou hsp exprimovány také na povrch al., Int. J. Cancer 51: ukazovat, že zvýšení hsp je vyvoláno vystavením buněčné membrány (Ferrarini, M. et 613-619 (1992)). Experimenty se zdají (např. hsp70) na buněčném povrchu nádorových buněk neletálnímu tepelnému šoku, a že toto zvýšení koreluje se zvýšenou citlivostí IL-2 specifických CD-3 přirozených zabijecích buněk (NK) směrem k nádorovým buňkám. Protože pro NK buňky se uvádí, že se zúčastňují v infiltrování a zabíjení nádorových buněk in vivo (Kurosawa, S. et al., Eur. J. Immunol. 23: 1029 (1993)), tato zvýšená citlivost NK buněk k nádorovým buňkám umožňuje lepší zaměřování nádorových buněk NK buňkami. Tedy: Když lze v nádorových buňkách indukovat expresi hsp, se zvýšením hsp na buněčném povrchu, lze takto umožnit lepší zaměřování a zabíjení těchto buněk NK buňkami. V této sekci se zkoušel účinek N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu v indukci exprese hsp72 v nádorových buňkách.
Materiály a metody
Použily se lidské K562 buňky myeloidní nádorové linie, odvozené z pacienta s chronickou myelogenní leukémií v blastické fázi (ATCC, CCL243) (Lozzio B. C. a Lozio B. B. Blood 45: 321, 1975). Na exponenciálně rostoucí buňky se působilo 5 x 10-5 M N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem za neletální teploty (42°C) po dvě hodiny. Po zotavovací periodě 16 hod. při 37°C byly buňky testovány na obsah hsp72 průtokovou cytometrií (Multhoff et al., Int. J. Cancer 61:
• · · · « ·
- 137 • «
272-279 (1995)). Působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu vedlo ke zvýšené hladině hsp72 v nádorových buňkách.
Příklad 15
INTERAKCE N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)-PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU S LIPIDOVÝMI MEMBRÁNAMI. STUDIE MONOVRSTVY.
Pozadí
Mechanismus(my), jimiž je stres (fyzikální, patofyziologický atd.) detegován jako signál a přenášen k transkripčnímu aparátu je dosud neznám. Předpokládá se, že fyzikální stav lipidové membránové matrice, jenž určuje strukturu a funkci membránově vázaných bílkovin, je přímo zapojen do zachycení teplotních změn, jež za podmínek tepelného šoku (HS) perturbují membránovou strukturu a způsobují transdukci signálu, jenž vyvolává transkripci HS genů. Souběžně s indukcí stresové tolerance bylo pro N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát ukázáno, že zvyšuje výkonnost buněk v detekci a signalizaci různých stresových podmínek pomocí up regulace exprese některých chaperonových genů.
Je známo že technika monovrstev s použitím monomolekulárních lipidových vrstev rozprostřených na rozhraní vzduch-voda je účinným nástrojem k ověřování přítomnosti interakcí mezi membránou a membránově aktivními činidly. Chování dvouvrstvého systému je velmi podobné k chování příslušného monovrstvého systému v mnoha ohledech (molekulární velikost membránových složek, účinek fosfolipidů, orientace zabudovaných bílkovin, atd.). Měření změn povrchového napětí, způsobovaných molekulami vstupujícími do monovrstev umožnilo získání pohledu na molekulární rozměr dané interakce.
• · · · • · • ·
- 138 • c ·
Zásadním předpokladem pro názor, že v buněčné membráně mohou nastat určité spouštěcí děje zprostředkované N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem v odezvě na stres, je zajištění důkazů o přímé fyzikální interakci N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu se složkami membrány. Cílem předkládané studie je zkoumat interakci N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu s membránami s použitím monovrstev různých lipidů jako modelových systémů pro biologické membrány.
Materiály a metody
Pokusy s monovrstvami se prováděly na teflonové misce, s objemem 6,5 ml a plochou povrchu 8,8 cm2 při 2 5°C v Langmuirově-Blodgettově přístroji KSV3000 (KSV Instruments Ltd., Helsinki, Finsko), v podstatě jak je popsáno.
Monomolekulární lipidové vrstvy sestávající z 1,2-dipalmitoyl-snglycero-3-fosfocholinu (DPPC), fosfatidylglycerolu vaječného žloutku (EggpG) nebo bovinního srdečního kardiolipinu (BHCL) byly vytvořeny z chloroformových roztoků lipidů za poskytnutí žádaného iniciálního povrchového napětí na subfázi 10 mM Na-fosfátu (pH 7,0). Subfáze byla nepřetržitě míchána magnetickou tyčinku. N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát, rozpuštěný v H20, byl přidáván pod monovrstvu skrz dírku v teflonové komůrce, spojenou se subfázi. Injikované objemy byly vždy <1 % objemu subfáze. Povrchové napětí bylo měřeno Wilhelmyho metodou s použitím platinové destičky. Data zvyšování povrchového napětí byla získána ze souborů surových dat s použitím software LB5000 z měřícího Langmuirova-Blodgettova systému.
139
Výsledky
Interakce N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu s různými fosfolipidy byla testována měřením sloučeninou indukovaného zvýšení povrchového napětí lipidových monovrstev rozprostřených na rozhraní vzduch-voda (Obrázek 8). Monovrstvy byly v této studii vytvářeny z DPPC, EggPG a BHCL a k subfázi se přidával rostoucí množství N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu na dvě koncentrace, 10-^ a 10-^ M. Přidání sloučeniny pod lipidovou monovrstvu vedlo ke zvýšení povrchového napětí, jež bylo ve všech případech závislé na koncentraci N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu v subfázi. U různých lipidových monovrstev však existoval výrazný rozdíl v profilu povrchového napětí, V případě zwitterionického DPPC se napětí měnilo rychle po injekci N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu a pak zůstávalo na konstantní hladině. Při použití monovrstev obsahujících záporně nabitý BHCL vykazoval profil povrchového napětí typickou inzerční kinetiku, to jest napětí stoupalo po asi dvě minuty a potom dosáhlo rovnovážné hladiny. V přítomnosti PG byla inzerční kinetika podobná inzerční kinetice pozorované u BHCL, avšak po dosažení určité hodnoty začínalo napětí klesat. Rychlost poklesu napětí byla závislá na koncentraci sloučeniny v subfázi. Jedno možné vysvětlení tohoto fenoménu je odstraňování N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu z fázového rozhraní, protože pokles napětí pokračoval i po dosažení počátečního napětí čisté lipidové monovrstvy.
K získání dalšího náhledu na specifickou interakci N—[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu s lipidovými monovrstvami bylo zvyšování povrchového napětí indukované danou sloučeninou měřeno při různých počátečních povrchových napětích (Obrázek 8). Způsob extrapolace k vysokému počátečnímu napětí dovoluje určení hraničního inzerčního napětí pro danou molekulu, při němž už
- 140 přestává být schopna inzerce do monovrstvy. Extrapolovaná hraniční povrchová napětí pro inzerci byla 89 mN/m a 39 mN/m pro BHCL resp. DPPC. V případě monovrstev obsahujících záporně nabitý BHCL byla zvýšení napětí vždy vyšší než bylo nalézáno pro zwitterionický DPPC, což napovídalo důležitost elektrostatických interakcí.
Náš výzkum poslouží jako první důkaz, že N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát je při podávání ve fyziologicky relevantních koncentracích schopen interagovat s lipidovými membránami, způsobem specifickým pro řídící skupinu.
V Obrázku 8 je ukázána interakce N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (B) a monomolekulárních lipidových vrstev. U šipek byl k subfázi přidán N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát ve vyznačených koncentracích. V Obr. 9 se předvádí vzrůst povrchového napětí po injekci N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (B) pod monovrstvy BHCL nebo DPPC při různých počátečních napětích. Koncentrace N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu v subfázi byla 10 μΜ. Lineární regresní analýza experimentálních dat vedla ke korelačním koeficientům 0,844 resp. 0,995 pro monovrstvy BHCL resp. DPPC.
Příklad 16
OCHRANNÝ ÚČINEK N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL)-PROPOXY]-3PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU PROTI CYTOTOXICKÝM CYTOKINŮM A CYKLOHEXIMIDU
Pozadí
Účelem těchto studií bylo sledovat možné spojení mezi produkcí cytokinů a patofyziologickými změnami, u nichž se zdá,
- 141 že by N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát měl proti nim ochraňovat.
Naše data napovídají, že N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát je cytoprotektivním činidlem pro buňky tkáňových kultur při působení cytotoxických cytokinů. Působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu zvyšovalo přežívání WEH1 164 buněk (a jiných savčích buněk) při působení TNF, Tento účinek byl závislý na koncentraci, ale nebyl přímo úměrný koncentraci dané sloučeniny. Rozsah ochrany poskytovaný působením N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu byl variabilní od pokusu k pokusu, i když zvýšená resistence k cytotoxickým cytokinům byla u zpracovaných buněk jasnou tendencí ve všech pokusech. Ochrana poskytovaná působením N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu nebyla příliš vysoká, ale u živého zvířete může i tento stupeň ochrany být dostatečný pro moderování nebo zabránění patofyziologických dějů.
Cíl studie
Byly měřeny hladiny sérového TNF a indukovatelnost makrofágů z STZ diabetických a kontrolních zvířat. LPS-indukované sérové TNF aktivity byly v průběhu prvního měsíce diabetů signifikantně zvýšeny v STZ-indukovaných diabetických potkanech (ve věku 6 - 18 týdnů) v porovnání s nediabetickými potkany.
Výsledky radioimunovyšší (480 + (Foss et al.
Střední koncentrace sérového TNF (měřené stanovením) diabetické skupiny byly signifikantně 96 U/ml) než u zdravých kontrol (345 + 48 U/ml)
1992 (Braz. J. Med, Biol. Res. 25: 239) uvedli podobné výsledky pro lidské primáty). Uvnitř diabetické skupiny nebyla žádná korelace mezi hladinami sérového TNF a trváním diabetů. Nenalezli jsme biologicky aktivní TNF v sérech diabetických zvířat pomocí
- 142 • ·
testu cytotoxicity na buňkách L929. Rozdíl mezi RIA a měřením cytotoxicity ukazuje na přítomnost vysokých hladin antagonisty rozpustného TNF receptorů (ochranné protizánětlivé molekuly) a napovídá zapojení TNF do diabetických komplikací.
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát měl nečekaný proliterativní účinek na kvasinkové buňky (a na odlišné, kultivované normální diploidní zvířecí nebo lidské buňky). Vliv N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu byl obzvlášř impresivní v přítomnosti nízkých koncentrací antibiotika inhibujícího růst, cykloheximidu. Kolonie kvasinkových buněk narostlé v přítomnosti N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu a cykloheximidu nevykazovaly zvýšený výskyt genetických změn (mutací resistence k antibiotiku), jen vyšší metabolickou resistenci k inhibičnímu účinku cykloheximidu na proteosyntézu.
Podle našich měření lze účinky N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu vysledovat až ke zvýšené aktivitě AP-1 transkripčního faktoru, jenž zprostředkovává účinky jak mitogenních faktorů, tak různých typů stresu. Výsledky rovněž ukazují, že shora uvedená testovaná sloučenina a podobné sloučeniny ovlivňují detixitu AP-1 a snad i jiných transkripčních faktorů, pomocí udržování účinků růstových faktorů a podmínek metabolického stresu.
V Obr. 10 je předvedena LPS-indukovaná in vitro produkce TNF makrofágů izolovaných z STZ diabetických (1) a normálních zvířat, v Obr. 11 N—[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem indukovaná ochrana keratinocytů před růst inhibujícím účinkem cykloheximidu, v Obr. 12
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem (B) indukovaná ochrana buněk (endothelových buněk) před toxickými účinky cykloheximidu, v Obr. 13 N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem (B) indukovaná ochrana lidských cervikálních buněk HeLa před růst inhibujícím účinkem antibiotika cykloheximidu, v Obr. 14 N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)
- 143 -.
• · « I ·· propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem (B) indukovaná ochrana buněk srdečního svalu před růst inhibujícím účinkem antibiotika cykloheximidu, v Obr. 15 je předveden účinek N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (B) na aktivitu PÍ transkripčního faktoru v kvasinkových buňkách AB1380. Sloupec 6 představuje střední hodnoty, sloupec 5 je prázdný. V Obr. 16 je předveden účinek N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu na aktivitu API transkripčního faktoru
JF1. Sloupec 11 představuje střední je předveden účinek N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (B) na aktivitu PÍ transkripčního faktoru v kvasinkových buňkách AB1380. Sloupec 6 představuje střední hodnoty, sloupec 5 je prázdný.
v kvasinkových buňkách hodnoty. V Obr. 15
Příklad 17
KARDIOPROTEKTIVNÍ ÚČINEK N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL) PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTU V IZOLOVANÝCH POTKANÍCH SRDCÍCH
Účelem této studie bylo zkoumat kardioprotektivní a antiarytmické účinky N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu v izolovaných pracujících potkaních srdcích.
Metody
Po 10-min. aerobní pracující perfuzi byla srdce (n = 10 v každé skupině) podrobena 10-min. koronární okluzi, následované 3-min. reperfuzí v přítomnosti 0,05; 0,5; 5,0; 20,0 resp. 50 mg/1 N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu.
144
V dalších studiích se na potkany předem působilo nejúčinnější dávkou, 20 mg/kg, N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu jednu resp. pět hodin před izolací srdcí. Po excizi byla srdce podrobena protokolu okluze uvedenému shora za perfuze v přítomnosti nebo nepřítomnosti 20 mg/1 N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu.
V oddělených pokusech byly studovány účinky tepelného stresu, ischemie, N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu a jejich kombinací na myokardiální obsah bílkoviny HSP-70. Izolovaná srdce byla podrobena 15 min. tepelnému stresu (42°C), globální normotermické ischemii a perfuzi N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem, následovanou 120 resp. 180 minutovou reperfuzí.
Výsledky
Před ischemii zvyšoval N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát koronární průtok (CF) s koncentrační závislostí odezvy ve tvaru zvonovité křivky. Jiné parametry srdeční funkce nebyly u nižších koncentrací této sloučeniny změněny. N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát v koncentraci 50 mg/1 způsoboval významnou bradykardii, snížení aortického průtoku (AF) a +dP/dtmax , a zvýšení levého ventrikulárního enddiastolického tlaku (LVEDP) před ischemii. V kontrolní skupině koronární okluze značně snížily CF, AF, +/-dP/dtmax , a zvýšily LVEDP. N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát zmírňoval ischemii indukované poruchy srdeční funkce s koncentrační závislostí odezvy ve tvaru zvonovité křivky. Nejvýraznější anti-ischemický účinek vykazovala koncentrace 20 mg/ml N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu. Reperfuze po 10 min. koronární okluzi spouštěla ventrikulární fibrilaci (VF) ve všech srdcích kontrolní skupiny. Vyšší koncentrace N-[2-hydroxy-3- 145 (1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu vedly k dávkově závislému anti-arytmickému účinku.
Po jedné hodině poskytovalo ještě předchozí působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu kardioprotekci a potenciovalo akutní účinky této sloučeniny. Pět hodin po předchozím působení nebyl kardioprotektivní účinek pozorovatelný, ale některé akutní účinky N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátové perfuze byly zvýšeny.
Sloučenina samotná nezvyšovala myokardiální obsah HSP-70. Stetyokardiální obsah HSP-70 byl značně zvýšen v důsledku tepelného stresu, avšak ischemie vedla k mírnému zvýšení HSP-70. Nicméně: Když byla ischemie indukována v přítomnosti mg/1 N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu, obsah HSP-70 byl zvýšen na přibližně stejnou úroveň jako po tepelném šoku.
Docházíme k závěru, že N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát vykazuje anti-ischemické a anti-arytmické účinky. U koncentrace 20 mg/1 bylo nalezeno, že produkuje u izolovaného potkaního srdce značné jak anti-ischemické tak anti-arytmické účinky. I když přímý anti-ischemický účinek této sloučeniny mizí po jedné hodině, stále je zvyšován stupeň ochrany akutním působením N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu. N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát a tepelný stres společně indukují rychlo de novo syntézu HSP-70 v potkaním srdci. N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát samotný syntézu HSP-70 neovlivňuje.
V Obrázcích 18 - 19 jsou předvedeny hladiny hsp bílkoviny, stanovené Western analýzou, z potkanů kontrolních, tepelně šokovaných, s působením ischemie, s působením N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (B), s působením ischemie + N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (Ischemie + B) s následným zotavením po 2 hod. (Obr. 18) nebo 3 hod. (Obr. 19).
146
Příklad 18
NAVÝŠENÍ CHAPERONU N-[2-HYDROXY-3-(1-PIPERIDINYL) PROPOXY]-3-PYRIDINKARBOXIMIDOYL CHLORID MALEÁTEM V PREVENCI A NÁPRAVĚ POŠKOZENÍ KŮŽE: OCHRANA PŘED ULTRAFIALOVÝM SVĚTLEM B V LIDSKÉ KŮŽI TRANSPLANTOVANÉ MYŠÍM S TĚŽKÝM KOMBINOVANÝM
IMUNODEFICIENTNIM ONEMOCNĚNÍM U DIABETICKÝCH POTKANŮ
URYCHLENÉ HOJENI
RAN
Pozadí mellitus, byla Cherian a E. C. 1995). Protože
Hsp hrají obecnou roli ve fyziologické ochraně kůže před stresy z prostředí. Jako molekulární chaperony se zúčastňují v prevenci a nápravě poškození způsobovaných různými expozicemi, jako k mechanickému traumatu, světlu, tepelným a chemickým poškozením, infekcím atd. (E. V. Maytin, JID 104: 448, 1995). U patologických podmínek, jako je diabetes oznámena zeslabená funkce některých hsp (M.
Abraham, Biochem. Biopys. Res. Comm. 212: 184, u N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu bylo ukázáno, že působí navýšení [booster] chaperonů (Vigh et al., v přípravě), očekávali bychom, že tato sloučenina je schopna podporovat nej různější mechanismy ochrany a nápravy.
Účelem této studie bylo otestovat účinky a) systémového a b) místního podávání N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát v:
a) ochraně proti poškození kůže vyvolanému UVB světlem v lidské kůži transplantované myším s těžkým kombinovaným imunodeficientním onemocněním (SCID),
b) v nápravě zničeného procesu hojení ran u STZ-diabetických potkanů.
147
Metody
a) Na SCID myši s transplantovanou lidskou kůží se působilo
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem (5,0 mg/kg i.p.) nebo vehiklem a zvířata byla vystavena UVB světlu (100 mJ/cm2). Po 24 hodinách byly odebrány vzorky kůže pro histologické vyšetření a pro stanovení hsp72 s použitím imunohistochemických technik a technik Western analýzy. Ochrana před UVB světlem indukovaným poškozením kůže předchozím působením N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu byla stanovována klinicky a histologicky. Intenzivní hsp72 vybarvení lineární podkladové membrány bylo pozorovatelné imunofluorescenční technikou, a zvýšené množství hsp72 bylo měřeno Western analýzou vzorků kůže, na níž se působilo N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem.
b) Streptozotocinem indukovaní (STZ) diabetičtí potkani s tepelnými poraněními částečné až plné hloubky, vytvořenými na oboustranně depilované hrudní kůži pomocí elektricky zahřáté sondy (3 mm v průměru, 60°C, po 30, 60 a 90 vteřin), s působením místní aplikace krému obsahujícího 1 %, 2 % nebo 4 %
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu nebo vehiklu se použily ke stanovení hojení ran ve formě samokontroly, porovnání vedle sebe. Uzavírání rány bylo zachyceno fotograficky a s použitím digitální epiluminiscenční mikroskopické techniky. Plocha ran byla měřena planimetricky 48 hodin a 21 dní po poranění. Hladina hsp72 v odebraných vzorcích kůže byla stanovena s použitím Western analýzy.
Výsledky
Působení krému obsahujícího 4 % N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu signifikantně (p < 0,01) urychlilo uzavírání rány a zvýšilo
- 148 hladinu hsp72 ve vzorcích odebrané kůže, v porovnání s kontrolu vehiklu.
Naše výsledky vedly k závěru, že podávání N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu zajištuje ochranu proti poraněním z vystavení UV a že má potenciální terapeutické využití v klinické léčbě stavů s defektem v nápravě zranění nebo po chirurgické intervenci.
Na Obr. 20, 21 a 22 je předveden účinek krémů obsahujících %, 2 % nebo 4 % N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (B) na hojení ran. Na Obr. 23, 24, a 25 jsou výsledky ukázány podle stupně poranění.
V Obr. 26 jsou ukázány fotografické snímky neošetřených a N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem (B) ošetřených ran.
Obr. 27 ukazuje hladiny hsp72 bílkoviny z odebraných vzorků kontrolních a N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem (B) (1%, 2%a4 %) ošetřených ran.
V Obr. 28 je ukázáno imunohistochemické hodnocení hsp72 bílkoviny po působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (B).
V Obr. 28 jsou předvedeny hladiny hsp72 z kožních vzorků SCID myší po působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu (B) a bez tohoto působení (Kontrola).
Příklad 19
HODNOCENÍ STIMULAČNÍHO ÚČINKU HYDROXYLAMINOVÝCH DERIVÁTŮ PODLE VYNÁLEZU NA EXPRESI HSP72 V BUŇKÁCH VYSTAVENÝCH STRESŮM
a) Podmínky kultivace buněk
Z použitých buněk byly 3T3 a L-929 myší fibroblasty kultivovány v MEM médiu a rozrůstány v monovrstvách, lidské
- 149 ·· ·· ·· ···· • · · · · · · • · · · · · · • · · ··· · ··· · • · · · · ·· ·· «· · leukemické buňky U-937 byly udržovány v RPMI-1640 médiu, suspenzní kultuře, zatímco lidské epithelové buňky HeLa byly kultivovány v DMEM médiu a ve formě monovrstev. Buněčné kultury byly udržovány jak se popisuje v Příkladu 6 s tím rozdílem, že byly kultivovány ve shora uvedených kultivačních médiích.
b) Podmínky pokusů
Pokusy se prováděli za aplikace stresu před a po působení sloučeniny. Stres byl provokován teplem nebo chemickým činidlem, působením HgCl2. Testované sloučeniny byly aplikovány v 10-5 M koncentraci.
Studie cytotoxicity, jež byly prováděny 3-denním testem a hodnoceny s MTT (Cytotechnology 11: 49-58) ukázaly, že všechny testované sloučeniny měly 50 %-ní účinek inhibice růstu v koncentracích vyšších než ΙΟ-4 Μ. V důledku toho neměly koncentrace použité v HSP72 studiích žádný významný cytotoxický účinek.
Pokusy s tepelným šokem
Tyto pokusy se provedly na 3T3 a L-929 myších fibroblastech a dále na lidských leukemických buňkách U-937.
Pokusy s aplikací tepelného šoku na 3T3 buňky se provedly jek je popsáno v příslušném bodu Příkladu 6 s tím rozdílem, že stres byl indukován 30 min. vystavením při teplotě 43°C a působení testované sloučeniny se provedlo 15 minut před nebo 100 minut po tepelném šoku.
Imunodetekce se prováděla s použitím HSP72 specifickou SPA 810 primární protilátkou (StressGen) a s A9044 (Sigma) sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidasou. Denzitometrická hodnocení se provedla denzitometrem LKB Ultrascan.
Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 2 a Tabulce 3.
• · · · ·
Tabulka 2
Stimulační účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na tepelným šokem indukovanou produkci hsp72 v 3T3 buňkách, když působení předchází vystavení tepelnému šoku.
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené šoku
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát +++
5,6-Dihydro-5-(1-piperidinyl)methyl-3(3-pyridyl)-477-1,2,4-oxadiazin +++
3-(3-pyridyl)-5-[(1-piperidinyl)methyl]-5,6dihydro-677-1,4,2-dioxazin ( Z )-2-butendioát (1:1) ++
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]benzimidoyl chlorid monohydrochlorid +
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N',N'-diethyl
-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid +++
3-(3-pyridyl)-5-diethylaminomethyl-5,6dihydro-677-1,4,2-dioxazin hydrochlorid +
3-fenyl-5-[(1-piperidinyl)methyl]-5,6dihydro-677-1,4,2-dioxazin hydrochlorid ++ /R/( +)-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1) +++ (-) N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1) +++ • ·
- 151
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]naftalen-1karboxamid +++
3-(3-pyridyl)-5-t-butylamino-5,6-dihydro677-1,4,2-dioxazin +
N-(2-hydroxy-3-piperidino-propoxy)-ethylurethan +
N-[2-palmitoyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid +++
N-[2-hydroxy-3-(l-piperidinyl)propoxy]-N'-propyl-močovina +++
N-(3-chlorfenyl)-N'2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]močovina +++
N-(3-piperidino-l-propoxy)-3-pyridinkarboximidoyl chlorid dihydrochlorid +++
0-(3-diethylamino-propoxy)-3-pyridinkarboximidoyl chlorid hydrochlorid +++
O-(3-piperidino-l-propyl)-3-nitro-benzhydroximoyl chlorid hydrochlorid +++
1-{[3-t-butylamino)-2hydroxy-propoxy]-imino}-l(m-trifluormethyl-fenyl)-ethan acetát +++
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-benzylurethan 0
N' - [2-hydroxy-3-(1-methyl-l-piperidinium-l-yl)propoxy]-Nmethyl-pyridinium-3-karboximidoyl chlorid dijodid +++
N-hexyl-N'-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-močovina ++ • · · · · · • · · · · · ·
-152-: :·: :
N-cyklohexyl-N'-[2-acetoxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]močovina hydrochlorid 0
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-2-nitrobenzimidoyl chlorid monohydrochlorid +++
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-chinolinkarboximidamid dihydrochlorid +++
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N,Ν'-difenylbenzamidin 0
N,N-dimethyl-N'-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N'' -fenyl-guanidin 0
N,N-dimethyl-N'-fenyl-Ν''[3-(1-piperidinyl)propoxy]guanidin hydrochlorid ++
N-methyl-N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-benzamid hydrochlorid +
5,6-dihydro-3-(4-chlorfenyl)-5-[N-methyl-l-piperidinium -l-yl]-methyl-4H-l,2,4-oxadiazin jodid ++
Methyl-{N-[3-(1-piperidinyl)propoxy])-3-pyridinkarboximidát maleát 0
N-methyl-N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-(m-trifluormethy1benzamid hydrochlorid +++
N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-N'-tetramethylen-3-pyridinkarboxamidin hydrochlorid +++
N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-N-methyl-N'-(n-hexyl)močovina
- 153
• · • · · ·
Tabulka 3
Stimulační účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na tepelným šokem indukovanou produkci hsp72 v 3T3 buňkách, když působení následovalo po vystavení tepelnému šoku.
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené stresu
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát 0
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-2-nitrobenzimidoyl chlorid monohydrochlorid 0
5,6-Dihydro-5-(1-piperidinyl)methyl-3( 3-pyridyl)-4/7-1,2,4-oxadiazin 0
O-(3-piperidino-l-propyl)-3-nitro-benzhydroximoyl chlorid hydrochlorid +
N—[2-palmitoyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid +
N-hexyl-N'-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-močovina +++
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]naftalen-1karboxamid ++
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-4-pyridinkarboximidoyl chlorid (Z)-2-butendioát (1:1) ++
Ν'-[2-hydroxy-3-(1-methyl-l-piperidinium-l-yl)propoxy]-Nmethyl-pyridinium-3-karboximidoyl chlorid dijodid +++
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-chinolinkarboximidamid dihydrochlorid +++ • · · ·
- 154
V této Tabulce znamená 0 že působení změnilo o + 20 % stresem indukovanou buněčnou hladinu hsp72, zatímco +, ++ resp. +++ zanmenají 21 - 50 %, 51 - 100 % resp. > 100 % zvýšení relativně k hladině kontroly vystavené soku.
Pokusy s použitím tepelného šoku na U-937 leukemických a L-929 myších fibroblastových buňkách se prováděly podobně jak je popsáno shora, ale působení sloučeniny vždy předcházelo tepelný šok. Sloučenina N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát byla za těchto eperimentálních podmínek testována v 10-5 M koncentraci. Působení vedlo k více než 50 % zvýšení tepelným stresem indukované hladiny hsp7 2
Pokusy se stresem indukovaným chemickým činidlem
Tyto pokusy se prováděly na lidských epithelových buňkách HeLa a na lidských leukemických buňkách U-937 s použitím HgCl2 k indukci stresové odezvy, Působení sloučenin proběhlo před vystavením buněk stresu. Testované kultury byly připraveny a působení probíhalo jako v experimentech s 3T3 buňkami. Po působení sloučenin byly buňky inkubovány 15 min. při 37 °C, pak všechny kultury kromě dvou (kontroly bez stresu) byly vystaveny 0,5 μΐ/ml koncentraci HgCl2 a inkubace pokračovala. Indukované množství hsp72 se měřilo 6 hodin po vystavení stresu. Použitá koncentrace HgCl2 vedla k 15 - 30 % maximální hladiny hsp72.
Na HeLa buňkách zvyšovaly N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)propoxy]-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid a N—[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-3-nitro-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid stresem indukovanou hladinu hsp72 o více než 20 % resp. 50 %.
Na U-937 buňkách zvyšoval N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleát stresem
- 155
indukovanou hladinu hsp72 o více než 20 % ve srovnání s kontrolou vystavenou stresu.
Pokusy na primárních tkáňových explantátech
Tyto pokusy byly provedeny na potkaních explantátech sleziny a varlat s aplikací tepelného stresu po působení experimentálních sloučenin. Pokusy na suspenzích ze sleziny se provedly jak následuje.
Sleziny CFY potkanů vážících 200 a homogenizovány v MEM kultivačním fetálního telecího séra. Koncentrace nastavena na 50-100 mg/ml.
Po 5 ml buněčné suspenze bylo naneseno na jednotlivé kultivační misky o průměru 6 cm a explantáty byly kultivovány po g byly asepticky vyjmuty médiu obsahujícím 10 % buněčné suspenze byla jednu hodinu ve zvlhčovaném vzduchu obsahujícím 5
CO
2' pn
37°C, pak se na kultury působilo 10-5 M koncentrací testované sloučeniny. Po dalších 15 min. při 37 °C byly kultury vystaveny tepelnému šoku při 43°C po 30 min. v inkubátoru. Množství indukovaného hsp7 2' bylo měřeno po dalších 6 hodinách inkubace při 37°C.
Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 4, a zvýšené hladiny hsp72 jsou hodnoceny ve stejné škále jako v Tabulkách 2 a 3.
·· ····
- 156 • · · · · · · • · · · · · · • · ···· · · · · • · · · · • · · · · · ·
Tabulka 4
Stimulační účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na tepelným šokem indukovanou expresi hsp72 v explantátech potkaní sleziny
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené stresu
N-{3-[(1,1-dimethyl-ethyl)amino]-2-hydroxypropoxy}-3trifluormethyl-benzamid +
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-Ν'-heptyl-močovina +++
N-(3-chlorfenyl)-N'-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]močovina +++
5,6-dihydro-5-(l-piperidinyl)methyl-3( 3-pyridyl)-477-1,2,4-oxadiazin 0
Pokusy na potkaních testikulárních explantátech se provedly jak následuje.
Varlata CFY potkanů vážících 200 g byla vyjmuta za sterilních podmínek a uvolněné testikulární tubuly byly suspendovány v MEM kultivačním médiu obsahujícím 10 % fetálního telecího séra tak, že pět ml suspenze obsahovalo 50 - 100 mg tkáně.
Explantáty byly inkubovány po jednu hodinu ve zvlhčovaném vzduchu obsahujícím 5 % CO2, při 37°C, pak se na kultury působilo 10 M koncentraci testované sloučeniny. Po další inkubaci po 15 min. při 37°C byly explantáty vystaveny tepelnému šoku při 43°C po 30 min. v inkubátoru. Množství indukovaného hsp72 bylo měřeno po dalších 6 hodinách inkubace při 37°C.
Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 5, a zvýšení hladiny hsp72 je hodnoceno ve stejné škále jako v Tabulce 4.
- 157 ···· ··· ·· ·· ·· ···· • · · · · 0 0 0 0·· · · · • · ···· ··· · • · · 0 0 •0 0· 00 0
Tabulka 5
Stimulační účinek hydroxylaminových derivátů podle vynálezu na tepelným šokem indukovanou expresi hsp72 v potkaních testikulárních explantátech
Sloučeniny hladina HSP72 relativně ke kontrole vystavené šoku
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleát +++
5,6-dihydro-5-(l-piperidinyl)methyl-3( 3-pyridyl )-427-1,2,4-oxadiazin ++
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]benzimidoyl chlorid monohydrochlorid +++
N-{3-[(1,1-dimethyl-ethyl)amino]-2-hydroxypropoxy}-3trifluormethyl-benzamid 0
N-[2-benzyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl (Z)-2-butendioát (1:1) ++
3-(3-pyridyl)-5-diethylaminomethyl-5,6dihydro-627-1,4,2-dioxazin hydrochlorid ++
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-4-acetamidobenzamidin monohydrochlorid 0
3-(3-pyridyl)-5-t-butylamino-5,6dihydro-627-1 ,4,2-dioxazin 0
N-[2-palmitoyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidamid monohydrochlorid ♦ · · · • · ·· ··♦·
- 158
N-hexyl-N'-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy] močovina
N-(3-piperidino-l-propoxy)-3-pyridinkarboximidoyl chlorid dihydrochlorid
O-(3-diethylamino-propoxy)-3-pyridinkarboximidoyl chlorid hydrochlorid
O-(3-piperidino-l-propyl)-3-nitro-benzhydroximoyl chlorid hydrochlorid
1-{[3-t-butylamino)-2-hydroxy-propoxy]-imino}-1(m-trifluormethyl-fenyl)-ethan acetát
N-{3-[(1,1-dimethyl-ethyl)amino]-2-hydroxypropoxy}-3trifluormethyl-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid
N-[2-palmitoyloxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid dihydrochlorid
N-hexyl-N'-[3-(1-piperidinyl)propoxy]-močovina
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-3-nitro-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-2-nitro-benzimidoyl chlorid monohydrochlorid
N—[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-N'-heptyl-močovina
N—[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-1-isochinolinkarboximidamid dihydrochlorid ++ ++ ++ +
+ +++ +
++ +++ +++
N-methyl-N-[3-(1-piperidinyl)propoxy]benzamid hydrochlorid • · · · ·· ··
- 159
5,6-dihydro-3- (4-chlorfenyl)-5-[N-methyl-l-piperidinium -l-yl]-methyl-4H-l,2,4-oxadiazin jodid +
N-[3-(l-piperidinyl)propoxy]-thiofen-2karboximidoyl chlorid hydrochlorid ++
Příklad 20
MĚŘENÍ HLADINY HSP mRNA V HRUDNÍ AORTĚ POTKANŮ S GENETICKOU HYPERTENZÍ
Potkani s genetickou hypertenzí byli rozděleni do čtyř skupin po čtyřech. Na skupiny se působilo denně, orálně, u první skupiny fyziologickým solným roztokem, u druhé skupiny
N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátem (20 mg/kg) po 5 dnů, u třetí skupiny
N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-benzimidoyl monohydrochloridem (5 mg/kg) po 20 dnů a u N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-2-thiofenchlorid monohydrochloridem (5 mg/kg) po 20 dnů.
chlorid čtvrté skupiny karboximidoyl Zvířata byla usmrcena, aorty byly izolovány a okamžitě zamrazeny dusíku a skladovány do použití při -70°C.
v tekutém
Morfologické zkoumání hrudní aorty
Zkoumání se provedlo podle publikovaných metod (Br. J. Pharmacol. 1995: 115, 514-420) Byla vyříznuta 1 mm2 ploška hrudní aorty a fixována v 2,5 % glutaraldehydu při pokojové teplotě. Postfixace se provedla v 1 % kysličníku osmičelém po jednu hodinu. Tkáň byla dehydrována v ethanolu a zapolymerizována do Durcupanu ACM. Snímky byly brány elektronovým mikroskopem Hitachi 7100 a kvantitativně hodnoceny.
160
Bylo pozorováno, že působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu, N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-benzimidoyl chlorid monohydrochloridu resp. N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-2-thiofen-karboximidoyl chlorid monohydrochloridu podpořilo regeneraci buněk aorty průměrným resp. silným způsobem.
Kvantitativní měření hsp70
Pokusy se prováděly kvantitativní reverzní transkripční polymerasovou řetězovou reakcí. Principem metody je, že když se dva velmi podobné ale rozlišitelné templáty araplifikují ve stejné PCR reakci, pak se v tomto procesu nemění poměr jejich produktů. Když je známo množství jednoho z templátů a relativní poměr produktů je měřitelný, pak lze vypočítat množství neznámého počátečního templátů. V nejčastěji používané metodě se známý templát (kompetitor) a neznámý templát (cíl) liší pouze v délce, kompetitor je kratší, a v důsledku toho jsou produkty PCR separovatelné na základě svých velikostí.
RNA byla z tkání izolována guanidin-isokyanátovou metodou (Choczynski P. a Sacci N., Anal. Biochem. 162: 156, 1987). Koncentrace a kvalita nukleové kyseliny byly hodnoceny spektrofotometrem a agarosovou gelovou elektroforézou za denaturujících podmínek (Sambrook J. et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Izolovaná RNA byla skladována při -70°C.
Byl zkonstruován fragment z cDNA kódující hsp70 gen pomocí vystřižení interní sekvence (PCR-splicing, Riedy M. C et al., Biotechniques 18: 70 1995). Tento fragment byl amplifikován s primery specificky se vážícími k externí části konstruktu (Erlich A.: PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification. Stockton Press, 1989) a po změření koncentrace byl produkt skladován při -70°C.
Reverzní transkripce se provedla za standardních podmínek s použitím 1 ug izolované RNA/vzorek s oligo dT (dT16) primerem (Sambrook J. et al., jako shora).
- 161 • ·
Stejná množství cDNA, připravených s RNA vzorků, byla smíchána s různými množstvími kompetitoru (odvozenými ze seriálních ředění 3 a 10 krát) a templáty byly amplifikovány polymerasovou řetězovou reakcí. Teploty aplikované během cyklů byly následující: denaturace (95°C, 1 min.) hybridizace (58°C, 1 min), syntéza (72°C, 0,5 min.).
Po PCR amplifikaci byly produkty rozděleny na agarosovém gelu (1 %) a vybarveny ethidium-bromidem za standardních podmínek (Sambrook J. et al., jako shora). Vybarvené DNA fragmenty byly vizualizovány UV-transiluminátorem pro fotografii. Množství PCR produktů bylo měřeno denzitometrií z negativů fotografií.
Bylo pozorováno, že hladina hsp70 v hrudní aortě byla po působení N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu, N-[2-hydroxy-3-piperidinyl -propoxy]-benzimidoyl chlorid monohydrochloridu a N-[2-hydroxy3-(1-piperidinyl)-propoxy]-2-thiofen-karboximidoyl chlorid monohydrochloridu o více než 50 % vyšší než hsp70 v kontrolních zvířatech.
Příklad 21
SLEDOVÁNÍ INHIBIČNÍHO ÚČINKU NA STÁRNUTÍ KŮŽE MORČAT
Inhibiční účinek sloučenin podle vynálezu na stárnutí kůže byl sledován u morčat. Kůže pěti zvířat na skupinu byla depilována a plochy 1 cm2 byly ozářeny ze zdroje UV-B s intenzitou 100 mJ/cm2 na obou stranách. Po ozáření se na kůži na jedné straně působilo krémem složeným podle Příkladu 10 a obsahujícím 5 % (hmotn./hmotn.) N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) propoxy]-3-pyridinkarboximidoyl chlorid maleátu, N-[2-hydroxy-3piperidinyl-propoxy]-benzimidoyl chlorid monohydrochloridu nebo N-[2-hydroxy-3-piperidinyl-propoxy]-2-nitro-benzimidoyl chlorid monohydrochloridu, zatímco na druhou stranu zvířat se působilo stejným krémem bez aktivní složky. Byl to experiment se samokontrolou.
162 • ·
Působení započalo okamžitě po ozáření a provádělo se dvakrát denně po dva týdny.
Ozáření UV-B mělo za následky těžká poškození kůže (puchýře, poškození epithelu, tvorbu ran), jež se hojila o 4 dny dříve a u nichž byla velikost ran signifikantně menší, když se na zvířata působilo sloučeninami podle vynálezu. Tyto sloučeniny podporovaly tvorbu epithelu.
Tento pokus ukazuje, že dané působení zvýšilo rezistenci kůže proti ozáření UV-B a zlepšilo její regeneraci.

Claims (1)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob zvyšování exprese molekulárního chaperonů eukaryotickou buňkou vyznačující se tím, že zahrnuj e působení na eukaryotickou buňku vystavenou fyziologickému stresu účinným množstvím chemické sloučeniny ke zvýšení exprese molekulárního chaperonů nad množství indukované daným fyziologickým stresem, přičemž chemickou sloučeninou je hydroxylaminový derivát, jehož tautomerické formy jsou představovány obecnými vzorci I a II.
CZ19972072A 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba CZ295562B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9503141A HU222994B1 (hu) 1995-11-02 1995-11-02 Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
HU9603919 1996-02-09
HU9629820 1996-10-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ207297A3 true CZ207297A3 (cs) 1998-03-18
CZ295562B6 CZ295562B6 (cs) 2005-08-17

Family

ID=27270113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19972072A CZ295562B6 (cs) 1995-11-02 1996-11-01 Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba

Country Status (31)

Country Link
US (4) US6653326B1 (cs)
EP (1) EP0801649B1 (cs)
JP (2) JP4531865B2 (cs)
KR (1) KR19980700976A (cs)
CN (1) CN1152871C (cs)
AT (1) ATE221880T1 (cs)
AU (1) AU720195B2 (cs)
BG (1) BG63944B1 (cs)
BR (1) BR9607565B1 (cs)
CA (1) CA2209167C (cs)
CZ (1) CZ295562B6 (cs)
DE (1) DE69622840T2 (cs)
DK (1) DK0801649T3 (cs)
EE (1) EE04239B1 (cs)
ES (1) ES2176502T3 (cs)
HR (1) HRP960508B1 (cs)
HU (1) HU222994B1 (cs)
IL (1) IL121126A (cs)
MX (1) MX9704988A (cs)
NO (1) NO321140B1 (cs)
NZ (1) NZ320523A (cs)
PL (1) PL195634B1 (cs)
PT (1) PT801649E (cs)
RS (1) RS49981B (cs)
RU (1) RU2206320C2 (cs)
SI (1) SI0801649T1 (cs)
SK (1) SK284823B6 (cs)
TR (1) TR199700574T1 (cs)
UA (1) UA61050C2 (cs)
WO (1) WO1997016439A1 (cs)
ZA (1) ZA969249B (cs)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUT78139A (hu) * 1995-12-22 2000-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Készítmény, különösen a bőr öregedési folyamatainak mérséklésére
UA64716C2 (en) * 1996-08-09 2004-03-15 Pharmaceuticals for therapy or prevention of illnesses connected with dysfunction of vascular endothelial cells
AU5296799A (en) * 1998-08-03 2000-02-28 N-Gene Kutato Kft. Pharmaceutical compositions against autoimmune diseases
HU226617B1 (en) * 1998-12-14 2009-04-28 Cytrx Corp Optically active pyridyl-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives, and pharmaceutical composition containing the compound as active ingredient
HUP9900475D0 (en) * 1999-02-26 1999-04-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl)-hiyroximic acid-halogenid derivative, it's use for treating insulin resistance, and pharmaceutical compositions containing them as active component
FR2792832B1 (fr) * 1999-04-28 2002-05-10 Codif Internat Sa Procede de protection de la peau pour la prevenir de son vieillissement cellulaire
HUP0001583A2 (hu) * 2000-04-18 2002-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Egy piridin-1-oxid-származék és eljárás annak átalakítására gyógyászati hatású vegyületekké
US20030190312A1 (en) * 2001-06-22 2003-10-09 The Regents Of The University Of California Eukaryotic genes involved in adult lifespan regulation
HUP0105205A2 (hu) * 2001-11-29 2003-08-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Metformint és egy hidroxilaminszármazékot tartalmazó, gyógyászati készítmény
PL371251A1 (en) * 2002-01-11 2005-06-13 Biorex Kutato Es Fejlesztö Rt. Carboxamidine derivatives and their use in the treatment of vascular diseases
ATE437371T1 (de) * 2003-03-27 2009-08-15 Childrens Hosp Medical Center Verfahren und kit zum nachweis des frühstadiums einer nierentubuluszellenverletzung
HUP0303584A3 (en) 2003-10-30 2009-12-28 Cytrx Corp Use of a hydroximic acid halide derivative in the treatment of neurodegenerative diseases
US20080207608A1 (en) * 2004-04-12 2008-08-28 Prabhat Kumar 2-Propene-1-Ones As Hsp 70 Inducers
US7786093B2 (en) * 2004-07-07 2010-08-31 Health Wellness Foods Corporation Antistress agent
FR2880022B1 (fr) * 2004-12-24 2007-08-24 Mayoly Spindler Soc Par Action Nouveaux derives de la n-hydroxy-n'-phenyluree et de la n-hydroxy-n'-phenylthiouree et leur utilisation comme inhibiteurs de la synthese de la melanine
TW200831479A (en) * 2006-09-26 2008-08-01 Cytrx Corp Pharmaceutical compositions and methods for treating diseases
AU2007328280A1 (en) * 2006-12-01 2008-06-12 Cytrx Corporation Hydroxylamine derivatives for the treatment of stroke
TW200901958A (en) * 2007-05-04 2009-01-16 Cytrx Corp Diabetic wound healing
KR20100027241A (ko) * 2007-06-29 2010-03-10 토렌트 파마슈티칼스 리미티드 Ｈｓｐ 인듀서로서 신규의 치환된 피페리돈
EP2659904B1 (en) 2008-06-26 2015-09-16 Orphazyme APS Use of Hsp70 as a regulator of enzymatic activity
KR101645937B1 (ko) * 2008-11-11 2016-08-08 (주)아모레퍼시픽 육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법
BRPI0919867A2 (pt) * 2008-11-18 2015-12-15 Santen Pharmaceutical Co Ltd agente terapeutico ou profilatico para uma doenca degenerativa coriorretiniana, e metodo profilatico ou terapeutico para uma doenca degenerativa coriorrentiniana
US20110123473A1 (en) * 2009-11-26 2011-05-26 Basf Se Use of highly-branched polycarbonates in cosmetic and dermatological formulations
PT2646044T (pt) 2010-11-30 2019-11-12 Orphazyme As Métodos para aumentar a atividade intracelular de hsp70
KR101275264B1 (ko) 2011-08-24 2013-06-17 포항공과대학교 산학협력단 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법
HUP1100535A2 (en) 2011-09-26 2013-04-29 Bracelia Invest Ltd Pharmaceutical composition for enhancement of stem cell treatment
HUP1100534A2 (en) 2011-09-26 2013-04-29 Balazs Dr Hazay Pharmaceutical composition for the treatment of muscle atrophy
RU2495928C2 (ru) * 2012-01-30 2013-10-20 Сергей Юрьевич Лешков Средство для стимуляции синтеза белков теплового шока hsp 70 в клетках человека и животных; косметическое средство для стимуляции репаративных процессов; косметическое средство для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур; биологически активная добавка; пищевой продукт; способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур
US10709700B2 (en) 2014-09-15 2020-07-14 Orphazyme A/S Arimoclomol formulation
EP3442530A1 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Orphazyme A/S Heat shock proteins and cholesterol homeostasis
RU2021117465A (ru) * 2016-04-29 2021-07-22 Орфазим А/С Аримокломол для лечения ассоциированных с глюкоцереброзидазой нарушений
CA3063974A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Orphazyme A/S Heat shock protein inducers and frontotemporal disorders
CN108314630B (zh) * 2018-02-08 2020-11-06 广西民族大学 一种肟醚类衍生物及其制备方法与应用
WO2019229078A1 (en) 2018-05-28 2019-12-05 Orphazyme A/S Hsp70 protein levels in pbmc samples as biomarker for disease
HUP1800298A1 (hu) 2018-08-30 2020-05-28 N Gene Res Laboratories Inc Gyógyszerkombináció béta-receptor blokkolók hatásának módosítására és a mellékhatások csökkentésére
CN110048418B (zh) * 2019-05-08 2023-03-24 辽宁工程技术大学 一种基于细胞-组织算法的微电网经济调度方法及装置
WO2021260120A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Orphazyme A/S Arimoclomol for treating gaucher disease
CN112094878A (zh) * 2020-08-18 2020-12-18 周银根 一种二步酶提取香菇多糖的方法、香菇多糖提取物及其应用
CA3202568A1 (en) 2020-11-19 2022-05-27 Zevra Denmark A/S Processes for preparing arimoclomol citrate and intermediates thereof
JP2024502304A (ja) 2020-12-24 2024-01-18 ゼブラ デンマーク エー／エス Ｅｒ型ミスセンス変異を有する患者におけるニーマンピック病ｃ型の治療用アリモクロモル
AU2022354251A1 (en) * 2021-09-28 2024-04-04 Zevra Denmark A/S Dioxazines and their use in treatment of gba-related diseases

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU177578B (en) * 1976-08-27 1981-11-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Process for preparing new 0-/3-amino-2-hydroxy-propyl/-amidoxime derivatives
DE2651083A1 (de) 1976-11-09 1978-05-18 Hoechst Ag Neue o-alkylierte hydroxylamine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
HU207988B (en) 1988-10-20 1993-07-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft Process for producing halogenides of o-/3-amino-2-hydroxy-propyl/hydroximic acid and pharmaceutical compositions containing them as active components
HUT54347A (en) * 1989-01-10 1991-02-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Improved process for producing amidoximes
US5334600A (en) * 1991-07-30 1994-08-02 Ciba-Geigy Corporation Isoquinolyl substituted hydroxylamine derivatives
HU216830B (hu) 1992-07-21 1999-09-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt., N-[2-Hidroxi-3-amino-propoxi]-amidok és -imidátok, valamint dioxazinok, eljárás ezek előállítására, és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
DK0758315T3 (da) * 1994-05-06 1999-05-25 Biorex Kutato Es Fejleszti Rt Hidtil ukendte hydroximsyrederivater, farmaceutiske sammensætninger indeholdende dem og fremgangsmåde til fremstilling af d
HU9502843D0 (en) * 1995-09-29 1995-11-28 Livigene Ltd Pharmaceutical composition

Also Published As

Publication number Publication date
NO973059L (no) 1997-09-02
ZA969249B (en) 1998-03-02
AU720195B2 (en) 2000-05-25
PL322015A1 (en) 1998-01-05
CZ295562B6 (cs) 2005-08-17
ES2176502T3 (es) 2002-12-01
US20040067940A1 (en) 2004-04-08
JPH10512590A (ja) 1998-12-02
EP0801649A2 (en) 1997-10-22
NO973059D0 (no) 1997-07-01
HU222994B1 (hu) 2004-01-28
SK88197A3 (en) 1998-04-08
DE69622840D1 (de) 2002-09-12
CN1177351A (zh) 1998-03-25
US7745465B2 (en) 2010-06-29
US6653326B1 (en) 2003-11-25
SK284823B6 (sk) 2005-12-01
RU2206320C2 (ru) 2003-06-20
JP2009108048A (ja) 2009-05-21
MX9704988A (es) 1998-07-31
US20040019103A1 (en) 2004-01-29
DK0801649T3 (da) 2002-12-02
EP0801649B1 (en) 2002-08-07
BR9607565B1 (pt) 2011-08-23
DE69622840T2 (de) 2003-04-30
BR9607565A (pt) 1999-07-20
NZ320523A (en) 2001-05-25
HRP960508A2 (en) 1998-06-30
HRP960508B1 (en) 2004-10-31
PT801649E (pt) 2002-12-31
JP4531865B2 (ja) 2010-08-25
EE04239B1 (et) 2004-02-16
US20100267711A1 (en) 2010-10-21
CA2209167C (en) 2009-05-19
BG63944B1 (bg) 2003-07-31
PL195634B1 (pl) 2007-10-31
NO321140B1 (no) 2006-03-27
CA2209167A1 (en) 1997-05-09
HUT76659A (en) 1997-10-28
US7148239B2 (en) 2006-12-12
WO1997016439A1 (en) 1997-05-09
IL121126A (en) 2002-07-25
UA61050C2 (en) 2003-11-17
ATE221880T1 (de) 2002-08-15
BG101713A (en) 1998-03-31
KR19980700976A (cs) 1998-04-30
TR199700574T1 (xx) 1999-08-23
HU9503141D0 (en) 1995-12-28
AU7326396A (en) 1997-05-22
SI0801649T1 (en) 2002-12-31
EE9700146A (et) 1997-12-15
RS49981B (sr) 2008-09-29
CN1152871C (zh) 2004-06-09
YU58796A (sh) 1999-09-27
IL121126A0 (en) 1997-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ207297A3 (cs) Hydroxylaminové deriváty užitečné ke zvýšení produkce molekulárních chaperonů a jejich výroba
EP1392639B1 (en) Pyruvate derivatives
JP2000502702A (ja) 抗ヘルペスウイルス性を有するフェニルチアゾール誘導体
JPH11139969A (ja) 医薬組成物
BR112018069930B1 (pt) Compostos agonistas de ppar, uso dos mesmos e composição farmacêutica
JPH02200691A (ja) リゾスフィンゴ脂質誘導体
JP3875731B2 (ja) ３，５−置換されたアミノベンゾイルグアニジン、それらの製法、医薬または診断剤としてのそれらの使用およびそれらを含有する医薬
CA1255299A (en) Guanidinothiazole derivatives containing alkylene bridges, a process for their preparation and their use as medicaments
JP2004517967A (ja) 置換されたヘテロ環−ノルボルニルアミノ誘導体、その製造法、その医薬品または診断剤としての使用、およびそれを含有する医薬品
JPH11514996A (ja) レトロウイルスアスパラギン酸プロテアーゼの置換同配体としてのアザヘキサン誘導体
CZ298542B6 (cs) Použití derivátu hydroxylaminu k príprave léciva pro lécbu a prevenci nemocí spojených s dysfunkcí vaskulárních endoteliálních bunek a farmaceutický prípravek tyto látky obsahující
EP0194572B1 (de) Heterocyclische Sulfide, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Mittel, die diese Verbindungen enthalten
EP3534954A1 (en) Compounds for treatment of neurodegenerative diseases
JPH06502415A (ja) オキシスルホニルカルバメート
KR980009236A (ko) 치환된 인다닐리딘아세틸구아니딘, 이의 제조방법, 약제 또는 진단제로서의 이의 용도 및 이를 함유하는 약제
KR101032006B1 (ko) 히드록시모르폴리논 유도체 및 이의 의약 용도
KR100832750B1 (ko) Ｎ-페닐아마이드 유도체를 함유하는 허혈성 질환의 예방또는 치료용 조성물
FI85140C (fi) Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara n-(1h-indol-4-yl)-bensamidderivat.
KR20210130016A (ko) 신규의 2-아릴티아졸 유도체 또는 이의 염, 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 약학 조성물
BRPI0910391A2 (pt) Compostos moduladores do receptor prostaciclina (pgi2), forma cristalina dos referidos compostos, composição farmacêutica, usos dos mesmos e processo para preparação da referida composição

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20111101