BR9607565B1 - derivados de hidroxilamina úteis para produção de protetores moleculares e composições que os contêm. - Google Patents

derivados de hidroxilamina úteis para produção de protetores moleculares e composições que os contêm. Download PDF

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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"DERIVADOS DE HIDROXILAMINA ÚTEIS PARA PRODUÇÃO DEPROTETORES MOLECULARES E COMPOSIÇÕES QUE OS CONTÊM".
1. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Protetores moleculares são proteínas que medeiama dobra de proteína. Elas se ligam, não co-valentementeàs superfícies expostas de proteínas que são recentemen-te sintetizadas ou são desnaturadas oú mau dobradas e asauxiliam a dobrar em conformações corretas. Os proteto- res moleculares também estão envolvidos em um número deprocessos celulares, tais como, a síntese de proteínas,translocação de proteínas e replicação de DNA.
Os protetores moleculares incluem proteínas de cho-que térmico, que são proteínas cuja expressão aumenta, signi- ficativamente, em células em seguida a uma exposição a tempe-ratura incomumente alta (choque térmico) ou uma exposição auma ampla variedade de tensões fisiológicas. Esse aumento naexpressão do protetor molecular, por sua vez, dota as célulasde uma proteção contra os efeitos adversos de hipertermia, conforme demonstrado pela termotolerância das células paratemperaturas de outro modo letais, se as células forem pré-condicionadas por uma breve exposição à alta temperatura.As tensões fisiológicas, qúe induzem a expressãode proteínas de choque térmico, incluem uma ampla varie-dade de condições patológicas associadas com muitas doen-ças. A síntese de proteínas de choque térmico em célulasexpostas a essas tensões indica a proteção da célula con-tra as tensões fisiológicas, como também no caso da res-posta ao choque térmico.
Uma dessas condições patológicas associadas coma indução de protetores moleculares é o dano isquêmico. 0dano isquêmico aos tecidos resulta da deterioração do su-primento de sangue por alguma razão. Por exemplo, a oclu-são coronária prolongada causa danos graves ao miocárdio,levando a necrose do miocárdio e prejudicando as possibi-lidades de recuperação, mesmo que o fluxo sangüíneo sejarestabelecido. No cérebro, danos significativos , fre-qüentemente, podem ser causados pela isquemia, levando àmorte do tecido cerebral.
Foi observado que a quantidade de proteínas dechoque térmico hsp 70 aumentava no miocárdio, durante aisquemia, levando à necrose, mesmo se a duração da isque-mia for curta. Nesses casos, como em um choque térmico, oteor aumentado de hsp 70 das células protege as mesmascontra as conseqüências de uma isquemia a seguir, que, deoutro modo, causaria a necrose (DAS, D.K. e outros. Car-diovascular Res.: 578. 1993). Isso também tem sido obser-vado, quando células de ratos, em cultura, foram submeti-das à isquemia (J. Clin. Invest.. 93: 759 - 767 (1994).
Conseqüentemente, as proteínas de choque térmico, sinte-tizadas pelas células do miocárdio proporcionam proteçãocontra os danos isquêmicos.
A situação no tecido cerebral é similar, em quea isquemia cerebral resulta em expressão aumentada deproteínas de choque térmico no tecido cerebral. Experi-mentos também têm demonstrado que o pré-tratamento deanimais com isquemia sub-letal induz a proteína de tensãotérmica (hsp 70) e protege o cérebro contra danos isquê-micos subsequentes mais graves (Simon e outros, Neurosci.Lett.. 163: 135 - 137 (1993)).
Ainda outro exemplo de tensão fisiológica sobretecidos e órgãos associados com a indução de protetoresmoleculares é proporcionado pelas doenças inflamatórias.A inflamação é uma resposta não específica das célulashospedeiras à entrada de material estranho, tal como, nocaso de infecção por vários patógenos bacterianos e vi-rais e envolve a agregação e a ativação de leucócitos nolocal danificado, o que resulta na produção e na libera-ção de altos níveis de espécies de oxigênio reativo e ci-tocinos. Esses citocinos e radicais de oxigênio reativoatacam o patogene, mas também danificam os tecidos hospe-deiros (Jaquier, Sarlin, Experientia, 50: 1031 - 1038/1994/). Acredita-se que, como uma proteção contra essesmediadores tóxicos da inflamação, os tecidos hospedeirosaumentam a produção de protetores moleculares. Os prote-tores moleculares assim produzidos protegem as célulashospedeiras contra os danos causados pelas espécies deoxigênio reativo e protegem as células da citotoxicidadede TNF e outros citocinos e radicais de oxigênio reativo.Em estudos com animais, tem sido demonstrado que a pré-exposição de um animal a um choque térmico, com o aumentoresultante de uma expressão de proteínas de choque térmi-co (hsp 70) , resultava em diminuição notável na inflama-ção pulmonar. Conseqüentemente, os protetores molecularesservem a uma função anti-inflamatória.
Os exemplos acima ilustram a capacidade dos pro-tetores moleculares para proteger as células contra vári-as tensões fisiológicas perturbam o equilíbrio homeostá-tico celular e causando danos às células. Os protetoresmoleculares também têm demonstrado ser vantajosos no tra-tamento de neoplasmas. Por exemplo, tem sido relatadoque, quando células tumorígenas são perfuradas com um ge-ne que codifica um protetor molecular (65 kd hsp) , elasperdem ou mostram uma diminuição em sua tumorigenicidade(Pedido de PCT No. PCT/GB93/02339) . Além disso, tem sidorelatado que as células tumorígenas, em resposta a umatensão térmica, expressam protetores moleculares em quan- tidade aumentada. Contudo, eles não estão presentes nocitoplasma, mas na superfície das membranas celulares(Ferrarini. M e outros, Int. J. Caner, 51: 613 - 619/1992/). A presença aumentada de protetores molecularesnas superfícies celulares se correlaciona com a sensiti-vidade aumentada das células NK (natural killer - exter-minadoras naturais) com relação às células tumorígenas,permitindo melhor ataque, infiltração e morte das célulastumorígenas pelas células NK (Korosawa, S e outros, Eur.J. Immunol. 23: 1029/ 1993/).
Em vista das vantagens associadas com a expres-são aumentada de protetores moleculares nas células, ummétodo que aumentasse essa expressão ou aumentasse a ati-vidade dos protetores moleculares seria altamente desejável.
2. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção se refere a métodos para aumentar aexpressão ou intensificar a atividade dos protetores mo-leculares por um célula. Em particular, de acordo com umaconcretização não limitadora da invenção, um método éproporcionado, compreendendo o tratamento de uma célulaque é exposta a uma tensão fisiológica com uma quantidadeefetiva de um composto químico, durante ou após a tensãofisiológica , que aumenta a expressão de um protetor mo-lecular na célula, além da quantidade induzida pela ten-são fisiológica, em que o composto químico é um derivadode hidroxilamina, cujas formas tautoméricas são represen-tadas pelas fórmulas (I) e (II) ou seu sal, incluindo osseus estereoisômeros oticamente ativos, em que:
A é um grupo alquil, alquil substituído, aral-quil substituído na aril e/ ou na metade alquil, aril,aril substituído, heteroaril ou heteroaril substituído.
Z é uma ligação co-valente, oxigênio ou =NR , emque R3 é selecionado do grupo que consiste de hidrogênio,um alquil, alquil substituído, aril, aril substituído,aralquil, ou aralquil substituído na metade aril e/ ou nametade alquil.R é um alquil ou alquil substituído.
X, no tautômero da fórmula (I) , é halogênio ouum grupo hidroxi ou amino, amino mono-substituído ou ami-no di-substituído e
X, no tautômero da fórmula (II) é oxigênio, imi-no ou grupo imino substituído e
R' é hidrogênio, um grupo alquil, alquil substi-tuído, aril, aril substituído, aralquil, aralquil tendometade aril e/ ou alquil substituído, acil ou acil subs-tituído;
e os compostos da fórmula )I), opcionalmente,contêm estruturas de anéis intramoleculares, formadaspelo X de acoplamento e um substituinte reativo.
Uma outra concretização não limitadora da inven-ção é o método de intensificação da atividade de um pro-tetor molecular em uma célula exposta a uma tensão fisio-lógica, que compreende a administração de uma quantidadeefetiva de um derivado de hidroxilamina de estrutura (I)ou (II), conforme descrito acima. Desse modo, a atividadedo protetor molecular é aumentada além da quantidade in-duzida pela tensão fisiológica sozinha. Em ambos essesmétodos, é preferido que a célula à qual o derivado dehidroxilamina é administrado seja uma célula eucariótica.
De acordo com a invenção, as células eucarióti-cas são tratadas com os derivados de hidroxilamina, comodefinido acima.
Outro objetivo da invenção é o método de trata-mento ou possível prevenção de doenças relacionadas com ofuncionamento do sistema de proteção ou associadas comdanos da membrana celular ou da membrana organelocelular, em que, para a supressão da condição patológica,uma quantidade efetiva de um derivado de hidroxilamina dafórmula (I) ou (II) é administrada ao organismo hospedei-ro .
Ainda outro objetivo da invenção é o uso dos de-rivados de hidroxilamina da fórmula (I) ou (II) ou seussais na preparação de composições farmacêuticas que podemser usadas no tratamento de doenças cardiovasculares,vasculares, cerebrais, tumorígenas, doenças da pele e/ ouda membrana da mucosa ou aquelas das células epiteliaisou túbulos renais, bem como na preparação de composiçõescosméticas.
A invenção ainda se refere a novos derivados dehidroxilamina que possuem uma ampla faixa de efeitos bio-lógicos e são úteis para intensificar o nivel de protetormolecular em organismos ou a atividade dos referidos pro-tetores moleculares e para a preparação de composiçõesfarmacêuticas e cosméticas aplicáveis a essa finalidade.
Um outro objetivo da invenção é representado pe-las composições farmacêuticas e cosméticas, que compreen-dem novos derivados de hidroxilamina junto com veículos eauxiliares aceitáveis, de um modo geral, nessas composi-ções.
A presente invenção está baseada, pelo menos emparte, em uma descoberta inesperada de que os derivadosde hidroxilamina, tendo estruturas conforme descrito aci-ma, quando usados no tratamento de'células, são capazesde aumentar a quantidade de protetores moleculares produ-zidos por aquela célula ou intensificar a sua atividade.Esse efeito é, particularmente, grande quando a célulaestá sob tensão fisiológica, o que induz a expressão deprotetor molecular. Nesses casos, o composto químico in-tensifica a expressão de protetores moleculares pela cé-lula, além daquela quantidade induzida pela tensão fisio-lógica sozinha. Essa descoberta é significativa, em vista do papel que os protetores moleculares representam na de-fesa das células contra os efeitos patológicos de váriasdoenças. Assim, se um composto for capaz de aumentar aquantidade ou intensificar a atividade dos protetores mo-leculares que é expressa pelas células, isso permite que as células sejam protegidas contra os efeitos prejudici-ais das doenças e reparar os danos causados por elas.
3. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra as mudanças no nível de hsp emmiocárdio de rato H9c2, exposto ao choque térmico pelo efeito de tratamento com maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1-piperidinil) - propoxi] -3- piridinacarboxi-midoil. Esse composto é rotulado B nas Figuras e referidocomo composto B no que segue.
A Figura 2 mostra os resultados do experimento acima obtidos através da análise de mancha de Western,baseada na avaliação densitométrica.
A Figura 3 mostra os resultados da análise demancha De Northern de RNA de hsp 70m, obtida durante oexame do efeito do composto B sobre a expressão de hspcelular em nível de transcrição.
A Figura 4 mostra os resultados da análise demancha De Northern de RNA de hsp 26 m, obtida em células5 de Saccharomyces cerevisiae, durante exame do efeito docomposto B sobre a ativação de hsp.
A Figura 5 mostra o efeito do álcool benzílicosobre a ativação de ciclato de adenilato e o estado demembrana do plasma.
A Figura 6 mostra a taxa de expressão do gene dehsp sobre as células de HeLa, usando gene de relatório deluciferase para o teste.
A Figura 7 ilustra o efeito do composto B sobrea expressão da superfície da célula de hsp72 em linha decélulas K562.
A Figura 8 mostra a interação do composto B ediferentes membranas de lipídios, mostrando o aumento dapressão superficial.
A Figura 9 mostra o efeito do composto B na con-centração de 10 mM e 100 mM na transferência de fase bi-lateral (La) => T hexagonal (H11) de grandes vesículasunilamelares preparadas de di-palmitoil - fosfatidil eta-nolamina.
A Figura 10 é o diagrama do efeito do composto Bsobre o nível de soro de TNF em ratos sadios e diábeticos.
A Figura 11 mostra o efeito do composto B contrao efeito inibidor do crescimento de ceratinocito da ci-clo-hexilimida.
A Figura 12 mostra o efeito do composto B contrao efeito danoso sobre a célula da ciclo-heximida sobre alinha de células de HeLa.
A Figura 13 mostra o efeito citoprotetor do com-posto B contra o efeito danoso sobre a célula da ciclo-heximida sobre a linha de células HeLa.
A Figura 14 mostra o efeito do composto B contrao efeito inibidor do crescimento da ciclo-hexilimida so-bre a linha de células do miocárdio de rato H9c2.
A Figura 15 mostra o efeito do composto B sobrea atividade do fator de transcrição de Pl em células delevedura AB 1380.
A Figura 16 mostra o efeito do composto B sobrea atividade do fator de transcrição de API em células delevedura de JFl.
A Figura 17 mostra o efeito do composto B sobrea atividade do fator de transcrição de Pl em células delevedura de AB 1380.
A Figura 18 mostra os resultados de teste obti-dos em modelo de coração de rato isquêmico com funciona-mento isolado, em que o modelo foi tratado com o compostoB, determinados por mancha De Western, 2 horas após a is-quemia.
A Figura 19 mostra os resultados de teste obti-dos em modelo de coração de rato isquêmico com funciona-mento isolado, em que o modelo foi tratado com o compostoB, determinados por mancha De Western, 3 horas após a is-quemia.
A Figura 20 mostra a cicatrização de ferida emratos diabéticos STZ após o dano causado pelo calor atra-vés do tratamento com creme contendo 1% do composto B.
A Figura 21 mostra a cicatrização de ferida emratos diabéticos STZ, após o dano causado pelo caloratravés do tratamento com creme contendo 2% do compostoB.
A Figura 22 mostra a cicatrização de ferida emratos diabéticos STZ, após o dano causado pelo caloratravés do tratamento com creme contendo 4% do compostoB.
A Figura 23 mostra a cicatrização de ferida emratos diabéticos STZ após o dano causado pelo calor atra-vés do tratamento com creme contendo 1% do composto B,mas avaliada visualmente.
A Figura 24 mostra a cicatrização de ferida emratos diabéticos STZ, após o tratamento com creme conten-do 2% do composto B, mas avaliado visualmente.A Figura 25 mostra a cicatrização de ferida em
ratos diabéticos STZ, após o tratamento com creme conten-do 4% do composto B, mas avaliado visualmente.
A Figura 26 mostra fotografias comparativas(tratados e controle) feitas nos testes acima por meio detécnica microscópica de epiluminescência digital.
A Figura 27 mostra o nível de hsp 7 2 das amos-tras obtidas nos testes anteriores determinados por man-cha De Western nos tratamentos com cremes contendo 1, 2 e4% do composto Β.
A Figura 28 mostra os níveis de hsp72 determina-dos por análise imuno-histoquímica (tratos e controle) emcamundongos SCID expostos ao raio UV-B e tratados com ocomposto B.
A Figura 29 mostra os níveis de hsp72 determina-dos por mancha De Western em amostras de biópsia de pelede camundongos SCID expostos ao raio UV-B e tratados como composto B.
4. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
4.5. DERIVADOS DE HIDROXILAMINA DA INVENÇÃO
Os derivados de hidroxilamina, cujas formas tau-toméricas são representadas pelas fórmulas (I) e (II) ,podem ser usados de acordo com a invenção aqui descrita.Na fórmula A acima está um grupo alquil, alquil substitu-ído, aralquil, aralquil substituído na metade aril e/ oualquil, aril, aril substituído, heteroaril ou heteroarilsubstituído.Z e uma ligação co-valente, oxigênio ou =NR3 , emque R3 é selecionado do grupo que consiste de hidrogênio,um alquil, alquil substituído, aril, aril substituído,aralquil e aralquil substituído na metade aril e/ ou al-quil .
R é um alquil ou alquil substituído.
X no tautômero da fórmula (I) é halogênio ou um
hidroxi ou amino substituído, um grupo amino mono-substituído ou amino di-substituído e X no tautômero dafórmula (II) é oxigênio, imino ou um grupo imino substi-tuído e
R' é hidrogênio, um grupo alquil, alquil substi-tuído, aril, aril substituído, aralquil, aralquil tendo ametade aril ou alquil substituído, acil ou acil substituido ;
e os compostos da fórmula (I) , opcionalmente,contêm estruturas de anéis intramoleculares, formadaspelo X de acoplamento e um substituinte reativo.
Onde "alquil" é mencionado, isso significa gru-pos alquil de cadeia reta ou ramificada, compreendendocadeias curas e longas, igualmente.
O número típico de átomos de carbono de grupoalquil de cadeia curta preferido oscila de 1 a 8 e podeser grupos metil-, etil-, propil-, isopropil-, butil,isobutil-, buti-sec.-, pentil-, pentil-terc.-, hexil-,heptil- e octil- e semelhantes, mais preferivelmente, de1 a 6, e poderia ser grupos metil-, etil-, propil-, iso-propil-, butil-, isobutil-, butil-sec-, pentil-, pentil-terc- e hexil.
O número típico de átomos de carbono de um grupoalquil de cadeia longa preferido oscila de 9 a 21 e pode-ria ser grupos nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tride-cil-, tetradecil-, pentadecil-, hexadecil-, heptadecil-,octadecil-nonadecil-, eicosil e heneicosil e semelhantes,mais preferivelmente, de 9 a 17 e poderia ser nonil-, de-ci-, undecil.
Um grupo cicloalquil preferido significa um gru-po cicloalquil, tendo uma cadeia curta de cicloalquil,oscila de 3 a 8 e poderia ser grupos ciclopropil-, ciclo-butil-, ciclopentil-, cicloexil-, cicloeptil- e ciclo-octil e semelhantes e, mais preferivelmente, de 3 a 7 epoderia ser grupos ciclopropil-, ciclobutil-, ciclopen-til-, cicloexil- e cicloeptil.
Aril ou alquil opcionalmente substituídos signi-fica um grupo aril- ou alquil tendo um ou mais substi-tuintes, tais como, ciano-, hidroxil-, alquil de cadeiacurta- (por exemplo, metil-, etil-, propil-, isopropil-,butil-, isobutil-, butil-sec.-, pentil-, pentil-terc.-,hexil-, heptil-, octil- e semelhantes), alcoxi- de cadeiacurta (por exemplo, metoxi-, etoxi-, propoxi-, isopropo-xi-, butoxi-, isobutoxi-, butoxi-sec.-, butoxi-terc.-,pentiloxi-, pentil- oxi- terc.-, hexiloxi- e semelhan-tes), aril- (por exemplo, naftil- e semelhantes); nitro-,amino-, amino mono- (alquil de cadeia curta)- amino subs-tituído- (por exemplo, metil, etil, propil, isopropil,butil-terc.) - e semelhantes, amino di(alquil de cadeiacurta)- amino substituído (por exemplo, dimetilamino-,dietilamino-, dipropilamino-, diisopropilamino-, dibuti-lamino-, dipentilamino-, di-hexilamino- e semelhantes),mono- halogênio, di- halogênio- ou tri- halogênio - al-quil (de cadeia curta)- (por exemplo, clorometil, 2,2-dicloroetil, trifluoro metil e semelhantes) ou átomo dehalogênio (por exemplo, átomo de flúor-, cloro-, bromo- eiodo) e semelhantes.
Um grupo aralquil preferido significa um grupoalquil de cadeia curta, conforme escrito acima, substitu-ido por um ou mais grupos aril (opcionalmente substituí-dos) e poderia ser grupos benzil-, benzidril-, tritil-,1-fenil - etil-, 2-fenil -etil- 2-benzidril - etil-, 3-fenilpropil-, 1-metil -2- fenil- etil-, 1- fenilbutil-, 4- tritilbutil-, 1,1- dimetil -2- feniletil-, 4- fenilbu-til-, 5- fenilpentil-, 6- fenil - hexil e semelhantes,mais preferivelmente, grupo alquil inferior de 1 a 4 áto-mos de carbono, substituído por um grupo fenil e poderiaser grupos benzil-, 1- feniletil-, 2- feniletil- e 1- me- til -2- feniletil. Um grupo aril preferido poderia sergrupos fenil-, naftil-, pentalenil-, antracenil- e seme-lhantes, mais preferivelmente grupos fenil- e naftil.
Um grupo heterocíclico saturado , contendo N-,preferido, de 3 - 8 elementos, mais preferivelmente de 5 - 8 elementos, significa um grupo heterocíclico saturado,contendo de 1 a 4 átomos de nitrogênio e poderia ser gru-pos aziridinil-, azetidinil-, oxaziranil-, pirrolidinil-,imidazolidinil-, pirazolidinil-, peridro- tiazolil-, pe-ridro- isoxazolil-, piperidinil-, piperazinil-, peridro- pirimidinil-, peridro- piridazinil-, morfolinil-, peri-dro- 1H- azepinil e semelhantes.
Um grupo heteroaril preferido significa um grupohetero- monocíclico não saturado contendo 1-4 N-, de 3 -8 elementos, mais preferivelmente 5-6 elementos, e po- deria ser um grupo pirrolil- pirrolinil-, imidazolil-,pirazolil-, piridil- e seu grupo N- óxido, pirimidinil-,pirazinil-, piridazinil-, triazolil-, tetrazolil-, dii-drotriazinil-, e semelhantes; ou significa grupo hetero-cíclico condensado contendo 1-5 N- não saturado e poderiaser um grupo indolil-, isoindolil-, indolizinil-, benzi-midazolil-, quinolil-, isoquinolil-, indazolil-, benzo-triazolil-, tetrazolopiridil-, tetrazolopiridazinil-,diidro- triazolopiridazinil- e semelhantes; ou significaum grupo hetero- monocíclico não saturado contendo 1-2oxigênio- e 1-3 N-, de 3 - 6 elementos, mais preferivel-mente, 5-6 elementos e poderia ser um grupo oxazolil-,isoxazolil-, oxadiazolil-, (por exemplo, 1,2,4- oxadiazo-lil- e outros) e semelhantes; ou significa um grupo hete-rocíclico condensado, contendo 1-2 oxigênio- e 1-3 N-,não saturado e poderia ser um grupo benzoxazolil-, benzo-xadiazolil-, e semelhantes; ou significa um grupo hetero-monocíclico não saturado, contendo 1-2 enxofre- e 1-3 N-,de 3 - 8 elementos, mais preferivelmente, 5-6 elementose poderia ser um grupo tiazolil-, tiazolinil-, tiadiazo-lil e semelhantes; ou significa um grupo hetero- monocí-clico não saturado, contendo S-, de 3 - 8 elementos, maispreferivelmente, 5 -6 elementos e poderia ser um grupotienil; ou significa um grupo hetero- monocíclico não sa-turado, contendo 0 e poderia ser um grupo furil; ou si-gnifica um grupo heterociclico condensado contendo 1-2enxofre- e 1-3 N-, não saturado e poderia ser um grupobenzotiazolil-, benzotiadiazolil- e semelhantes.Um grupo "acil" preferido, quando tomado em siou formando parte de um grupo acilado, de preferência,significa um grupo acil, que poderia ser um alcanoil decadeia curta (por exemplo, formil-, acetil-, propionil-,butiril- e semelhantes) , um alcoxi - carbonil- de cadeiacurta (por exemplo, metoxi - carbonil, etoxi - carbonil,propoxi - carbonil, butoxi - carbonil, butoxi-terc- car-bonil e semelhantes), um alquil - sulfonil de cadeia cur-ta (por exemplo, metil - sulfonil, etil - sulfonil e se-melhantes) aril - sulfonil (por exemplo, fenil - sulfonile semelhantes), aroil (por exemplo, benzoil, naftoil esemelhantes), aril ( alcanoil de cadeia curta) (por exem-plo, fenil - acetil, fenil - propionil e semelhantes),ciclo- (alquil de cadeia curta)- (alcanoil de cadeia cur-ta) (por exemplo, ciclo-hexil - acetil e semelhantes),aril (alcoxi de cadeia curta) - carbonil (por exemplo,benziloxi - carbonil e semelhantes), aril - carbamoil(por exemplo, fenil - carbamoil, naftil carbamoil e seme-lhantes), cicloalquil - carbamoil (por exemplo, ciclo-hexil - carbamoil e semelhantes), grupo sulfonil hetero -monocíclico (por exemplo, tienil - sulfonil, furil - sul-fonil e semelhantes); e o grupo acil pode, opcionalmente,ser substituído por 1- 3 substituintes, conforme escritoacima no parágrafo "opcionalmente substituído".
Um grupo τπ-amino - alquil preferido significaum grupo alquil de cadeia curta, contendo átomo de Nsubstituído na posição ϖ- da cadeia de alquil em que acadeia de alquil é, opcionalmente, substituída por um oumais substituintes, de preferência, por um ou dois halo-gêneos, por exemplo, cloro, bromo, flúor, iodo), grupohidroxil ou grupo hidroxil acilado, onde o grupo acil foidefinido antes: mais preferivelmente, por um ou dois gru-pos alquil de cadeia curta e a definição de "alquil" é amesma que a escrita acima. 0 átomo N- na posição tu- dacadeia de alquil pode ser substituído por um ou doissubstituintes de alquil de cadeia curta, de preferência,metil, etil, butil-terc. e semelhantes; com cicloalquilcarbamoil (por exemplo, ciclo-hexil - carbamoil e seme-lhantes), mais preferivelmente o átomo N- pode ser umaparte de um grupo heterociclico saturado, que contém 1 -4 átomos de nitrogênio e poderia ser grupos aziridinil,azetidinil, oxaziranil, pirrolidinil, imidazolidinil, pi-razolidinil, peridro - tiazolil, morfolinil, peridro -IH-azepinil e semelhantes; o átomo N na posição w- pode sersubstituído por um grupo aril (por exemplo, fenil e seme-lhantes) e pode ser quaternizado por um substituinte dealquil de cadeia curta ou oxidado, igualmente.
Se desejado, as bases livres das fórmulas gerais(I) e (II) podem ser transformadas em sais de adição deácido através da reação com ácidos orgânicos e podem seracetato, maleato e semelhantes; ou através da reação comácidos inorgânicos e podem ser hidrocloreto, hidrobrome-to, hidroiodeto, sulfato, fosfato e semelhantes; ou atra-vés da reação com amino ácidos e podem ser sal de argini-na, sal de ácido glutâmico e semelhantes. Em uma concre-tização não limtadora do derivado de hidroxilamina de es-trutura (I), Zé uma ligação co-valente e χ é um halogê-neo, de preferência, cloro ou bromo. Compostos preferi-dos, pertencentes a esse grupo, tem como A (i) aralquilou aralquil tendo metade aril substituído, de preferên-cia, fenil alquil ou fenil alquil tendo um ou mais subs-tituintes, de preferência, alcoxi; (ii) aril ou aril5 substituído, de preferência, fenil ou fenil substituído,de preferência, fenil substituído contendo um ou maisdentre os grupos alquil, halogêneo, haloalquil, alcoxi ounitro; (iii) naftil; (iv) um grupo heteroaril contendo N-, incluindo aqueles que podem ser condensados com um anelde benzeno, de preferência, piridil; (v) um grupo hetero-aril contendo S- ou (vi) um grupo heteroaril contendo 0-.Compostos preferidos pertencentes a esse grupo têm como R
(i) ϖ-amino - alquil, (ii) ϖ- amino - alquil, tendo me-tade amino mono ou di-substituído; (iii) ϖ-amino alquiltendo metade alquil substituído; (iv) ϖ-amino alquil
tendo metade amino mono ou di-substituído e também metadealquil substituído, com um grupo hidroxi ou aciloxi sendoo grupo substituinte preferido para a metade alquil. Dogrupo TO-amino - alquil de (i) a (iv) , particularmentepreferidos são aqueles com a metade alquil com 3 a 8 áto-mos de carbono.
Certos tipos do derivado de hidroxilamina da es-trutura (I), tendo ligação co-valente como Z e halogêneocomo X, são divulgados nas patentes norte-americanas Nos.5.147.879 e 5.296.606. Esses compostos podem ser prepara-dos por procedimentos descritos nas patentes norte-americanas citadas, de preferência, por diazotização dosderivados de X = NH2 correspondentes, na presença do hi-droaleto apropriado. Os compostos de iniciação podem serobtidos por procedimentos conhecidos descritos, por exem-plo, na patente húngara No. 177.578 (1976), a saber, poracoplamento de uma amidoxima de estrutura 1 (R1 = R2 =Η), com, por exemplo, um derivado reativo de estrutura 2,na presença de uma base, e podem ser diazotizados, usual-mente, sem isolamento ou purificação. Os grupos terminaisAeR dos compostos podem ser ainda amidificados ou deri-vatizados, conforme desejado.
Em outra concretização não limitadora do deriva-do de hidroxilamina da estrutura (I), Zé uma ligação co-valente e X é um grupo hidroxi substituído OQ, em que Q éum grupo alquil ou aralquil não substituído ou substituí-do. Em uma concretização preferida, Q é alquil linear ouramificado. Nesses compostos, A é aril ou heteroaril, depreferência, um grupo heteroaromático contendo N-; e R é,de preferência, um (i) tn-amino - alquil, (ii) τσ-amino -alquil, tendo metade amino mono ou di-substituído; (iii)Ѡ-amino - alquil, tendo metade alquil substituído; (iv)Ѡ-amino - alquil, tendo metade amino mono ou di-substituído e também metade alquil substituído, com umgrupo hidroxi ou aciloxi sendo o grupo substituinte pre-ferido para a metade alquil. Do grupo Ѡ-amino - alquilde (i) a (iv), particularmente preferidos são aqueles coma metade alquil com 3 a 8 átomos de carbono.
Um grupo especial dos derivados de hidroxilaminada estrutura (I), em que Z é uma ligação co-valente e X éOQ, é de estrutura (I'). A estrutura (I1) contém um anelfechado através do grupo hidroxi. Esses compostos repre-sentam uma forma cíclica dos compostos da estrutura (I),em que R é um CH2-CH(OH)-R". R" sendo um alquil linear ouramificado ou um alquil linear ou ramificado substituído,de preferência,, ισ-amino - alquil, que é, opcionalmente,substituído em seu grupo amino e, de preferência, contémcadeia de alquil reta ou ramificada de C1-5. Mais prefe-rivelmente, R" é um tu-amino - alquil mono- ou di-substituído no grupo amino, em que os substituintes ami-no, independentemente um do outro, podem ser um ou doisalquil ou cicloalquil de cadeia reta ou ramificada, oudos dois substituintes amino, junto com o átomo N- adja- cente formam um anel hetero , de preferência, com 5 a 7elementos, que, opcionalmente, contém átomo de heteroadicional. Desses, os compostos preferidos têm A, que éum fenil, fenil substituído, heteroaril contendo N-, he-teroaril contendo N- substituído, heteroaril contendo S-ou heteroaril contendo S- substituído.
Os derivados de hidroxilamina da estrutura (I),tendo ligação co-valente como Z e OQ como X têm sido di-vulgados no Pedido de Patente húngara No. 2385/1992. Es-ses compostos podem ser preparados a partir de derivados de halogêneo correspondentes do grupo acima (derivados dehidroxilamina de estrutura (I) , em que Z é uma ligaçãoco-valente e X é halogêneo) por meio de procedimentosdescritos no Pedido de Patente húngara No. 2385/1992, porexemplo, por meio da reação como alcóxidos ou por fecha-mento de anel alcalino para os compostos cíclicos de es-trutura (I') .
Em uma concretização não limitadora do derivadode hidroxilamina de estrutura (I) , Z é uma ligação co-valente e X é NR1 R2 , em que R1 e R2 , independentemente umdo outro, são H, um alquil linear ou ramificado, um al-quil linear ou ramificado substituído, cicloalquil, ou R1e R2 , junto com o átomo de Nitrogênio anexado aos mesmos,formam um anel saturado, contendo um anel saturado de 3 a7 elementos, de preferência, de 5 a 7 elementos.
Dos compostos descritos no parágrafo imediata-mente precedentes, especialmente preferidos são aquelesem que R é um (i) ΐΒ-amino - alquil, (ii) ω-amino - al-quil, tendo metade amino mono ou di-substituído; (iii)ω-amino - alquil, tendo metade alquil substituído; (iv)ω-amino - alquil, tendo metade amino mono ou di-substituído e também metade alquil substituído, com umgrupo hidroxi ou aciloxi sendo o grupo substituinte pre-ferido para a metade alquil. Do grupo TD-amino - alquilde (i) a (iv), particularmente preferidos são aqueles coma metade alquil com 3 a 8 átomos de carbono. Desses com-postos, mais preferidos aqueles que têm A, que é (i)aralquil ou aralquil tendo metade aril substituído, depreferência, fenil alquil ou fenil alquil tendo um oumais substituintes, de preferência, alcoxi; (ii) aril ouaril substituído, de preferência, fenil ou fenil substi-tuído, de preferência, fenil substituído contendo um oumais dentre os grupos alquil, halogêneo, haloalquil, al-coxi, nitro ou acilamino; (iii) naftil; (iv) um grupo he-teroaril contendo N- incluindo aqueles que podem ser con-densados com um anel de benzeno, de preferência, piridil;(v) um grupo heteroaril contendo S- ou (vi) um grupo he-teroaril contendo O-. Os derivados de hidroxilamina deestrutura (I) , tendo uma ligação como Z e NR1 R2 como X,incluem tanto os derivados conhecidos como os novos. Oscompostos onde X é NH2 são divulgados na Patente húngaraNo. 177578 (1976) e podem ser sintetizados por alquilaçãode derivados de amidoxima não substituído de estrutura 1(estrutura 1, em que R1=R2=H com um derivado reativode estrutura 2, em presença de uma base.
Um grupo especial dos derivados de hidroxilaminade estrutura (I), em que Z é uma ligação co-valente e X éNR1 R2 , é proporcionado pela estrutura (I") . A estrutura(II") representa uma forma cíclica de estrutura (I), quecontém um anel fechado através do grupo NR1 R2 . Esses com-postos podem ser derivados de compostos da estrutura (I),em que R2 é H e R é CH2-CH(OH)-R". R sendo um alquil li-near ou ramificado ou alquil linear o ramificado substi-tuído.
Dos compostos de estrutura (I"), preferidos sãoaqueles em que A é (i) aril ou aril substituído, de pre-ferência, fenil ou fenil substituído, de preferência, fe-nil substituído contendo um ou mais um ou mais dentre osgrupos alquil, halogêneo, haloalquil, alcoxi, amino ounitro; (ii) naftil; (iii) um grupo heteroaril contendo N-incluindo aqueles que podem ser condensados com um anelde benzeno; (iv) um grupo heteroaril contendo S- e (v) umgrupo heteroaril contendo O-. Desses compostos, os espe-cialmente preferidos contêm R", que (i) cj-amino - al-quil, tendo metade amino mono ou di-substituído ou (ii)GJ-amino - alquil, tendo metade amino mono ou di-substituído e também metade alquil substituído, de prefe-rência, a metade alquil de τσ-amino - alquil de (i) e(ii) contém de 1 a 5 átomos de carbono. Especialmentepreferidos são o grupo üJ-amino - alquil, tendo a metadeamino , em que os substituintes, junto com o átomo de ni-trogênio a eles anexado, formam um anel saturado com de 3a 7 elementos, de preferência, 5 a 7 elementos. 0 anelheterocíclico contém heteroátomo(s) adicional (ais). Nes-ses grupos ta-amino - alquil, o substituinte amino é, de
preferência, um grupo alquil linear ou ramificado ou ci-cloalquil. Nos compostos da fórmula geral (I""), R é hi-drogênio, alquil linear ou ramificado não substituído ousubstituído, cicloalquil, aralquil não substituído ouaralquil substituído na metade aril- e/ ou alquil.
Os compostos da estrutura (I") podem ser prepa-rados pelo ..fechamento do anel entre os átomos N(4)-C(5).Os derivados de cadeia aberta requeridos são compostos deestrutura (I) , em que Z é uma ligação co-valente , X éNR1 R2 , em que R1 é como definido em relação com os com-postos da fórmula (I"") acima, R2 é H e R é um grupo dafórmula -CH2-CHY5-R", em que Y5 representa um grupo deresíduo, por exemplo, um átomo de halogêneo. Esses deri-vados poderiam ser obtidos dos compostos Y5 = OH corres-pondentes com agentes inorgânicos de halogenação, porexemplo, cloreto de tionil ou pentacloreto de fósforo. Ahalogenação pode ser realizada com ou sem um solventeinerte, por exemplo, benzeno, clorofórmio, tetraidrofura-no, etc, usualmente, por ebulição. Após a remoção do ex-cesso de reagente, por exemplo , por evaporação do clore-to de tionil, o derivo de halogêneo cru é ciclizado -após ou sem isolamento ou purificação - através do trata-mento com uma base forte, por exemplo, butóxido de potás-sio em butanol terciário, a fim de proporcionar o compos-to I", que é, finalmente, isolado e purificado por proce-dimentos padrão (extração, recristalização, etc.).
Em uma concretização não limitadora do derivadode hidroxilamina de estrutura (I), Zé oxigênio e X é 0Q,em que Q é um alquil, alquil substituído, aralquil, ouaralquil tendo metade aril substituído ou metade alquilsubstituído. 0 alquil ou alquil substituído, que é Q,tem, de preferência, 1 a 4 átomos de carbono. Desses com-postos, os preferidos têm A, que é um alquil ou alquilsubstituído, de preferência, com de 1 a 4 átomos de car-bono, ou aralquil ou aralquil tendo metade aril substitu-ído ou alquil substituído. Desses compostos, os preferi-dos têm R, que é (i) Ѡ-amino - alquil, (ii) tn-amino -alquil tendo metade amino mono ou di-substituído; (iii)w-amino - alquil tendo metade alquil substituído; (iv)w-amino - alquil tendo metade amino mono ou di-substituido e também metade alquil substituído; (iv) w-amino - alquil tendo metade amino mono ou di-substituídoe também metade alquil substituído, com um grupo hidroxiou alcoxi sendo o grupo substituinte preferido para a me-tade alquil.
Esses derivados de hidroxilamina de estrutura(I) , em que Z é uma ligação co-valente e X é OQ, podemser obtidos na reação de hidroxilaminas O-substituídas ,tendo estrutura 6 (veja, por exemplo, a P. alemã2.651.083 (1976), e ortoésteres, tendo a estrutura 7. Acondensação é realizada, usualmente, no próprio reagente,como um solvente, de preferência, por ebulição. Após aevaporação, o produto é isolado por cristalização, ocasi-onalmente (se houver uma função de amina na cadeia late-ral R), na forma de sal de adição de ácido.
Em uma concretização não limitadora do derivadode hidroxilamina de estrutura (1) , Z é oxigênio e X éNR1R2 , em que R1 e R2 , independentemente um do outro, saoH, um alquil linear ou ramificado, um alquil linear ouramificado substituído, cicloalquil, aril, aril substitu-ido ou R1 e R2 , junto com o átomo de nitrogênio a elesanexados, formam um anel saturado, contendo de 3 a 7 ele-mentos, de preferência, um anel saturado com 5 a 7 ele-mentos . Desses compostos, especialmente preferidos sãoaqueles em que R é um (i) to-amino - alquil, (ii) w-amino-alquil, tendo metade amino mono ou di-substituído;
(iii) ϖ-amino - alquil, tendo metade alquil substituído;
(iv) ϖ-amino - alquil, tendo metade amino mono ou di-substituído e também metade alquil substituído, com umgrupo hidroxi ou aciloxi sendo o grupo substituinte pre-ferido para a metade alquil. Desses compostos , é prefe-rido que A seja (i) alquil ou alquil substituído; ou (iv)aril ou aril substituído, de preferência, fenil ou fenilsubstituído.
A preparação dos compostos podem ser preparadosconforme descrito aqui abaixo, em que os métodos dependemda natureza de X, a saber, que X tenha uma funcionalidadede um amino não substituído (NH2) ou um amino substituí-do.
(i) A preparação dos compostos onde X é NH2 pode
ser realizada através da adição de hidroxilamina de es-trutura 6 a um cianato orgânico de estrutura A-O-CN(veja, por exemplo, Chem. Ber. .98. 144 (1965) . A reação érealizada, de preferência, em um solvente orgânico iner-te, usualmente em temperatura ambiente. 0 isolamento,freqüentemente , requer purificação cromatográfica.
(ii) Os compostos tendo X, que é um grupo aminomono-substituído (por exemplo, NHR1) , são preparados apartir de haloformimidatos conhecidos de estrutura 9(veja, por exemplo, Houben-Weil , "Methoden der Organis-che Chemie", Band E/4, p. 544 (1983) e um composto de es-trutura 6, na presença de uma base orgânica (por exemplo,trietilamina) ou uma base inorgânica, tal como; carbonatode sódio em um solvente inerte, como benzeno, tetraidro-furano, etc., seguido por procedimentos padrão de fabri-cação e purificação.
(iii) Derivados onde X é um grupo amino di-substituido são preparados através da reação de uma aminasecundária de estrutura 5 com um composto de estrutura I,onde Z é oxigênio e X é OQ (a preparação desses deriva-dos é descrita acima). Essas reações de aminação são rea-lizadas em solventes orgânicos polares, por exemplo, eta-nol, através de refluxo, se necessário.
Em outra concretização não limitadora do deriva-do de hidroxilamina de estrutura (I), Z é = NR3, em querR3 é hidrogênio, um alquil, alquil substituído, aril,aril substituído, aralquil ou aralquil tendo metade arilsubstituído ou alquil substituído; e Z é NR1R2, em que R1e R2, independentemente um do outro, são H, um alquil li-near ou ramificado, um alquil linear ou ramificado subs-tituído, aril ou aril substituído, cicloalquil ou R1 eR2, junto com o átomo de nitrogênio a eles anexados, for-mam um anel saturado contendo de 3 a 7 elementos, de pre-ferência, um anel saturado contendo de 5 a 7 elementos.
Desses compostos, é ainda preferido que A sejaum alquil, alquil substituído, aralquil, aralquil tendometade aril substituído ou alquil substituído, grupo arilou aril substituído. R preferido para compostos perten-centes a esse grupo de derivado de hidroxilamina é (i)τσ-amino - alquil; (ii) τσ-amino - alquil tendo metadeamino mono ou di-substituído; (iii) TD-amino - alquiltendo metade alquil substituído; (iv) ro-amino - alquiltendo metade amino mono ou di-substituído e também metadealquil substituído, com um grupo hidroxi ou aciloxi sendoo grupo substituinte preferido para a metade alquil. Épreferido que a metade alquil de üj-amino - alquil de (i)a (iv) contenha 3 a 8 átomos de carbono.
Os derivados de hidroxilamina de estrutura (I) ,em que Z é NR3 e X é NR1 R2 , podem ser preparados por ami-nólise dos derivados de isouréia correspondentes perten-centes a um grupo de compostos descritos acima (esse gru-po corresponde aos derivados de hidroxilamina de estrutu-ra (I) , em que Z é oxigênio e X é 1) com amônia ou umaamina primária ou secundária. A reação é realizada, depreferência, em um solvente polar, por exemplo, água ouetanol, usando excesso da amina. Alternativamente, halo-formamidas de estrutura 10 (Houben-Well "Methoden der Or-ganischen Chemie", Band E/4, página 5 53 (1983) podem serreagidas com um composto tendo a estrutura 6, na presençade uma base orgânica ou inorgânica, a fim de proporcionarcompostos desse grupo, igualmente. A reação realizada emum solvente orgânico, usualmente, em temperatura ambien-te.
Os compostos em que R é um grupo da fórmula (b),em que R7 é acil, são preparados através de esterifícaçãodos compostos correspondentes contendo hidrogênio comoR7 . Os ésteres de alquil ou acil, usualmente, são obtidosatravés do uso de um cloreto ou anidreto ácido, na pre-sença de uma amina terciária ou uma base inorgânica, depreferência, em um solvente inerte.
Outro grupo de derivados de hidroxilamina úteisna presente invenção tem a e tem a e (II), que representaa forma tautomérica dos compostos da estrutura (I) . Emuma concretização não limitadora do derivado de hidroxi-lamina de estrutura (II), Zé uma ligação co-valente e Xé oxigênio. Compostos preferidos pertencentes a esse gru-po têm A, que é (i) alquil, aralquil ou aralquil tendometade aril ou alquil substituído; (ii) aril ou arilsubstituído, de preferência, fenil ou fenil substituído,tendo um ou mais substituintes, grupos substituintes pre-feridos incluindo um grupo alquil , haloalquil ou alcoxi;(iii) um grupo heteroaril contendo N-, de preferência,piridil; ou (iv) grupo heteroaril contendo S-. Para com-postos pertencentes a esse grupo, R preferido é (i) XU-
amino - alquil; (ii) τπ-amino - alquil tendo metade aminomono ou di-substituído; (iii) üJ-amino - alquil tendo me-tal alquil substituído; (iv) tu-amino - alquil tendo me-tade amino mono ou di-substituído e também metade alquilsubstituído, com um grupo hidroxi ou alcoxi sendo o gruposubstituinte preferido para a metade alquil. Do grupo w-amino - alquil de (i) a (iv), particularmente preferidossão aqueles com metade alquil com 3 a 8 átomos de carbo-no. Compostos preferidos desse grupo têm R' que é hidro-gênio, um alquil, alquil substituído aril, aril substitu-ido, aralquil ou aralquil tendo metade aril ou alquilsubstituído.
Compostos pertencentes a esse grupo são divulga-dos no Pedido de Patente húngara No. 2385/ 1992. Os cami-nhos para a sua preparação são nele descritos, mais pre-ferivelmente, eles podem ser obtidos por meio de acilaçãode derivados de hidroxilamina 0- substituídos, tendo aestrutura 6 (veja, também, por exemplo, a Patente alemã2.651.083 (1976) com um cloreto ácido, tendo a estrutura11. Esse caminho pode ser empregado, também, para a pre-paração daqueles novos derivados, onde R1 é outro que nãohidrogênio, usando o composto da estrutura 12 - em lugarda estrutura 6 - como o material de iniciação.
Em outra concretização não limitadora do deriva-do de hidroxilamina da estrutura (II) , Z é uma ligaçãoquímica; X é =NR4 , em que R4 é H, um alquil, alquil subs-tituído, aril, aril substituído, aralquil, aralquil tendoum grupo aril substituído ou alquil substituído, cicloal-quil; e R', que é um alquil, alquil substituído aril,aril substituído, aralquil ou aralquil tendo metade arilsubstituído ou alquil substituído. Entre esses compostos,preferidos são aqueles em que A é (i) aralquil ou aral-quil tendo metade aril substituído, de preferência, fenilalquil ou fenil alquil tendo um ou mais substituintes, depreferência, alcoxi; (ii) aril ou aril substituído, depreferência, fenil ou fenil substituído, de preferência,fenil substituído contendo um ou mais dentre um grupo al-quil, haloalquil ou nitro; (ii) naftil; (iv) um grupo he-teroaril contendo Ν-, de preferência, piridil; ou (vj umgrupo heteroaril contendo
S-. Compostos preferidos pertencentes a esse
grupo têm como R (i) tu-amino - alquil; (ii) tu-amino -alquil tendo metade amino mono ou di-substituído; (iii)Ѡ-amino - alquil tendo metade alquil substituído; (iv)Ѡ-amino - alquil tendo metade amino mono ou di-substituído e também metade alquil substituído, com umgrupo hidroxi ou aciloxi sendo o grupo substituinte pre-ferido para a metade alquil. Do grupo tD-amino - alquilde (i) a (iv), particularmente preferidos são aqueles comuma metade alquil com 3 a 8 átomos de carbono.
Esses compostos podem ser preparados por alqui-lação de O- de uma amidoxima N,N'- di-substituída de es-trutura 13, com um composto químico tendo a estrutura 2(para as condições da reação, veja a preparação de com-postos de estrutura I, em que Z é uma ligação co-valentee X é NR R ) ou por acilação de 0 de uma hidroxilaminaN,0- di-substituída da fórmula 12, com um haleto de imi-doil da Figura 16, a reação sendo realizada em um solven-te inerte, de preferência, na presença de um desoxidantede ácido orgânico ou inorgânico.
Os compostos em que R é um grupo da fórmula (b),em que R7 e acil, são preparados por meio de esterifica-ção dos compostos correspondentes contendo hidrogêniocomo R7 . Os ésteres de alquil ou aril, usualmente, sãoobtidos através do uso de um cloreto ou anidreto ácido,na presença de uma amina terciária ou base inorgânica; depreferência, em um solvente inerte.
Em outra concretização não limitadora do deriva-do de hidroxilamina de estrutura (II), Zé oxigênio e X éoxigênio. Compostos preferidos pertencentes a esse grupotêm A, que é um alquil, alquil substituído, aralquil,aralquil com metade aril ou alquil substituído. É prefe-rido que R seja (i) ta-amino - alquil; (ii) td-amino - al-quil tendo metade amino mono ou di-substituído; (iii) ra-amino - alquil tendo metade alquil substituído; (iv) gj-amino - alquil tendo metade amino mono ou di-substituídoe também metade alquil substituído, com um grupo hidroxiou aciloxi sendo o grupo substituinte preferido para ametade alquil. Do grupo üJ-amino - alquil de (i) a (iv) ,particularmente preferidos são aqueles com metade alquilcom 3 a 8 átomos de carbono. Compostos preferidos dessegrupo têm R', que é hidrogênio, um alquil, alquil substi-tuído, aril, aril substituído, aralquil ou aralquil commetade aril ou alquil substituído.
Compostos pertencentes a esses grupo são divul-gados no Pedido de Patente húngara No. 17 5 6/ 9 5(depositado em 15 de junho de 199 5). Eles são preparadosatravés de acilação de uma hidroxilamina tendo a estrutu-ra 6 ou a estrutura 12, com um cloroformato tendo a es-trutura 14, de maneira similar àquela com cloretos áci-dos, conforme descrito para a síntese de compostos da es-trutura II, em que Z é uma ligação co-valente e X é oxi-gênio. A reação requer a presença de uma base, inorgânicaou orgânica, e pode ser realizada em um solvente inerte,por exemplo, em clorofórmio. O sal produto colateral éremovido, por exemplo, através de extração com água, e oproduto é isolado da solução orgânica.
Ainda em outra concretização não limitadora doderivado de hidroxilamina de e (II) , Zé oxigênio; X é=NR4, em que R4 é alquil, alquil substituído, aralquil,aralquil tendo um grupo aril substituído ou alquil subs-tituido, aril, aril substituído, mais preferivelmente,fenil não substituído ou substituído, aralquil ou aral-quil com metade aril ou alquil substituído, e R é, depreferência,, τπ-amino - alquil, que, adequadamente, con-tém um grupo hidroxi ou alcoxi na cadeia de alquil e é,opcionalmente, substituído no nitrogênio da amina, em quea cadeia de alquil do referido grupo τσ-amino - alquil,de preferência, contém de 3 a 8 átomos de carbono. Nessescompostos, R' é, de preferência, alquil aril ou aralquil,cujos grupos podem ser não substituídos ou substituídos.
Esses compostos são análogos N- substituídos dederivados de hidroxilamina de estrutura (I) , em que Z éoxigênio e X é 1 e podem ser preparados, similarmente, apartir de haloformimidatos, tendo a estrutura 9, e umcomposto químico tendo a estrutura 12, na presença de umabase orgânica (por exemplo, trietilamina) ou base inorgâ-nica, por exemplo, carbonato de sódio em um solventeinerte, como benzeno, tetraidrofurano, etc, seguido porprocedimentos padrão de fabricação e purificação.
Em outra concretização não limtadora dos deriva-dos de hidroxilamina de estrutura (II) , Zé =NR , em queR3 é selecionado do grupo que consiste de hidrogênio, umalquil, alquil substituído, aril, aril substituído earalquil tendo metade aril substituído ou alquil substi-tuído; e X é oxigênio. Compostos preferidos desse grupotêm A, que é (i) aralquil ou aralquil tendo metade arilou alquil substituído, de preferência, fenil alquil oufenil alquil tendo um ou mais substituintes; (ii) aril ouaril substituído , de preferência, fenil ou fenil substi-tuído, de preferência, fenil substituído contendo um oumais dentro os grupos alquil, alcoxi, halogêneo, haloal-quil ou nitro; (iii) um grupo heteroaril contendo N-; ou(iv) um alquil ou alquil substituído, linear ou ramifica-do, de preferência, contendo de 4 a 12 átomos de carbono;ou (v) um grupo cicloalquil. Compostos preferidos perten-centes a esse grupo têm (i) tu-amino - alquil; (ii) τσ-amino - alquil tendo metade amino mono ou di-substituído;(iii) tn-amino - alquil tendo metade alquil substituído;(iv) TO-amino - alquil tendo metade amino mono ou di-substituído e também metade alquil substituído, com umgrupo hidroxi ou aciloxi sendo o grupo substituinte pre-ferido para a metade alquil. Do grupo τσ-amino - alquilde (i) a (iv), particularmente preferidos são aqueles commetade alquil tendo de 3 a 8 átomos de carbono. Nessescompostos R' é, de preferência, hidrogênio, um alquilsubstituído, aralquil ou aralquil tendo metade aril oualquil substituído, aril, aril substituído, acil ou acilsubstituído.
Esses compostos são divulgados no Pedido de Pa-tente húngara No. 1756/ 95 e podem ser preparados atravésda reação de um composto de hidroxilamina, tendo a estru-tura 6 ou a estrutura 12, com um isocianato tendo a es-trutura 15, em um solvente inerte, usualmente, através dasimples agitação da mistura em temperatura ambiente du-rante 2-24 horas. Finalmente, os produtos são isolados- após evaporação do solvente - de preferência, por meiode cristalização.
Em uma concretização não limitadora dos deriva-dos de hidroxilamina da estrutura (II) , Zé =NR3 , em queR3 é selecionado do grupo que consiste de hidrogênio, umalquil, alquil substituído, aril, aril substituído, aral-quil e aralquil tendo metade aril substituído ou alquilsubstituído; X é =NR4 , em que R4 é H, um alquil, alquilsubstituído, aril, aril substituído, aralquil, aralquiltendo um grupo aril substituído ou alquil substituído,cicloalquil; e R' é um alquil, alquil substituído, aral-quil ou aralquil tendo metade aril substituído ou alquilsubstituído, ou aril ou aril substituído. Compostos per-tencentes a esse grupo têm como R3 hidrogênio, alquil oualquil substituído. R4 é hidrogênio ou um grupo aril, A éalquil, alquil substituído, aril ou aril substituído, ouaralquil, o qual pode ser substituído na metade aril e/ou alquil. Desses compostos, os preferidos têm R, que é(i) Ѡ-amino - alquil; (ii) to-amino - alquil, tendo meta-de amino mono ou di-substituído; (iii) Ѡ-amino - alquil,tendo metade alquil substituído; (iv) Ѡ-amino - alquil,tendo metade amino mono ou di-substituído e também metadealquil substituído, com um grupo hidroxi ou alcoxi sendoo grupo preferido para a metade alquil. Do grupo Ѡ-amino- alquil de (i) a (iv), particularmente preferidos sãoaqueles com a metade alquil tendo de 3 a 8 átomos de carbono.
A preparação de compostos pertencentes a essegrupo pode ser realizada por meio de aminólise dos deri-vados de isouréia correspondentes (compostos tendo a es-trutura (II) , em que Z é oxigênio e X é NR4 ) com umaamônia ou amina primária ou secundária. A reação é reali-zada, de preferência, em um solvente polar, por exemplo,água ou etanol, usando um excesso da amina. Alternativa-mente, haloformamidinas, tendo a estrutura 10, podem rea-gir com um composto da estrutura 12, na presença de umabase orgânica ou inorgânica, em solventes inertes, usual-mente, em seu ponto de ebulição.
Uma concretização não limitadora do derivado dehidroxilamina da estrutura (I) define um novo grupo decompostos, em que X é halogêneo, de preferência, um cloroou bromo; Z é uma ligação química e A é um grupo da fór-mula (a), em que Y1 é halo, alcoxi, um grupo nitro ou umgrupo haloalquil, de preferência, haloalquil contendo de1 a 4 átomos de carbono; e η é 1, 2 ou 3; ou heteroarilcontendo
0-, de preferência, furil, heteroaril contendoS- (de preferência, tienil), ou um grupo heteroaril con-tendo N- (de preferência, piridil, quinolil ou isoquino-lil), que pode ser condensado com um anel de benzeno e éum grupo tendo a estrutura (b) , em que R5 e R6, indepen-dentemente um do outro, são H, um alquil linear ou rami-ficado, de preferência, um alquil linear ou ramificadosubstituído, de preferência, um alquil com C1-4, ou ci-cloalquil ou R e R , quando tomados juntamente com oátomo de nitrogênio a eles anexado, formam um anel hete-rociclico saturado com 3 a 7 elementos, de preferência, 5a 7 elementos, Y é -OR , em que R é H ou um grupo acil,de preferência, alquil carbonil, alquil carbonil substi-tuído, aril carbonil ou aril carbonil substituído, ouaminoacil ou aminoacil substituído; kél, 2ou3;emé1, 2 ou 3, com a ressalva de que, quando A é piridil ounaftil, ou um grupo da fórmula (a) , em que Y1 é halo oualcoxi, então R e outro que não H. Esses compostos po-dem, opcionalmente, conter como A um grupo heteroaromáti-co, contendo N-, com alquil de C1-4 N- quaternário ou oóxido do referido grupo heteroaromático contendo N- e/ ouum R em que o anel formado pelos grupos terminais ReRé um anel heterocíclico saturado N- quaternário ou N-oxidado. Preferidos entre esses compostos são aqueles emque A é um grupo da fórmula (a), em que Y1 é trifluorome-til. Esse grupo dos derivados de hidroxilamina da fórmula(I) também inclui estereoisômeros dos compostos, em que Xé halo, A é piridil, Z é uma ligação química e R é o gru-po da fórmula (b) , em que R5 e R6 , independentemente um
do outro, são H, alquil reto ou ramificado, de preferên-cia, alquil ou cicloalquil de C1-4 ou R5 e R6 , junto comoo átomo N adjacente, formam um anel heterociclico com de3 a 7 elementos, mais preferivelmente, contendo de 5 a 7elementos, Y6 é -OR7 , em que R7 é aminoacil, k é 1, 2 ou3 e m é l, 2 ou 3.
Esses novos compostos podem ser preparados usan-do-se procedimentos que são análogos àqueles descritosnas patentes norte-americanas Nos. 5.147.879; 5.328.906 e5.296.606. Por exemplo:
(i) Os derivados onde R5 e R6 são outros que nãohidrogênio, são preparados pela diazotização dos deriva-dos de NH2 correspondentes (os derivados de hidroxilaminade estrutura (I), em que Z é uma ligação co-valente e X éNH2), na presença do haleto de hidrogênio apropriado, si-milarmente ao procedimento descrito nas patentes norte-americanas Nos. 5.147.879; 5.328.906 e 5.296.606. Os com-postos de iniciação podem ser obtidos também por um pro-cedimento conhecido, descrito, por exemplo, na patentehúngara No. 177578, a saber, através do acoplamento deuma amidoxima tendo a estrutura 1, em que R1 e R2 de es-trutura 1 é H, com, por exemplo, um derivado reativo,tendo a estrutura 2, na presença de uma base e podem serdiazotizados, usualmente, sem isolamento ou purificação.
(ii) Se, na estrutura desejada, R7 é H e m é 1,a síntese pode ser realizada através da reação de um oxi-rano tendo a estrutura 3 e amina tendo a estrutura 4.Esse procedimento também pode ser usado para a síntese dederivados de R =H.
(iii) Os compostos onde R é um grupo da estrutu-ra (b) e onde R nesse grupo é um grupo acil, são prepa-rados pela esterificação dos derivados de R =H corres-pondentes. Esteres de alquil ou aril são, usualmente, ob-tidos com um cloreto ou anidreto ácido, na presença deuma amina terciária ou uma base inorgânica, de preferên-cia, em um solvente inerte, ou, em certos casos, peloprocedimento de Schotten - Bauman, usando base inorgânicaaquosa em um sistema bifásico. Para a preparação doe és-teres de amino acil, derivados de amino ácido protegidocom N, ativado com carboxil (por exemplo, ésteres ativos)são usados como reagentes nos procedimentos basicamenteconhecidos da química dos peptídeos. Esse acoplamentotambém requer a presença de uma base (por exemplo, trie-tilamina). O isolamento e a purificação dos produtos sãorealizados através do uso de técnicas preparativas pa-drão; a preparação final, freqüentemente, está na formade um sal com ácidos inorgânicos ou orgânicos apropria-dos. Partindo dos amino ácidos quirais, os produtos são,freqüentemente , diastereômeros, possuindo o segundo cen-tro quiral no grupo R. Durante o isolamento, esses dias-tereômeros, freqüentemente , se separam e o produto podeser obtido na forma de estéreo puro.
Compostos tendo a estrutura (I) , em que Z é umaligação química, X é halo, de preferência, cloro ou bro-mo, A é um grupo da fórmula (c ) e R e um grupo da fórmu-la (d) ; um ou ambos dentre Y2 e Y3 , dos quais pelo menosum deve estar presente na molécula, são oxigênio ou umalquil ou alquil substituído, tendo de 1 a 4 átomos decarbono; k é 1, 2ou3;emel, 2 ou 3. Y2 e Y3 sao ane-xados por meio da linha tracejada, o que significa a pre-sença opcional desses substituintes, também são novos de-rivados de hidroxilamina. Quando o composto é um cationtemono- ou bivalente, o seu anionte é um ou dois haletos,de preferência, íon de iodeto.
Esses derivados de hidroxilamina são preparadospelas modificações químicas (isto é, oxidação de N ouquaternização) dos grupos terminais piridina e/ ou pipe-ridina em seus precursores não substituídos. Para a oxi-dação, de preferência, perácidos, por exemplo, ácidosperbenzóicos substituídos são usados em solventes inertes(por exemplo, clorofórmio, diclorometano). Se ambos osgrupos oxidáveis estiverem presentes na molécula, mono-ou bióxidos podem se formar, dependendo da quantidade doreagente usada. No final da reação, o reagente em excessoé decomposto e o produto é isolado por meio de evapora-ção. A quaternização pode ser realizada com haletos dealquil (por exemplo, iodeto de metil), de preferência,através do refluxo do reagente em um solvente adequado,por exemplo, acetona. 0 produto, freqüentemente , é inso-lúvel no meio e pode ser isolado por meio de simples filtração.
Ainda outro novo grupo de compostos pertencentesaos derivados de hidroxilamina tendo a estrutura (I) sãoaqueles em que Z é uma ligação química, A é um aralquil,aralquil substituído, de preferência, fenil alquil, quepode ter um ou mais alcoxi, de preferência, alcoxi tendo1 a 4 átomos de carbono, fenil, fenil substituído, tendoum ou mais substituintes, grupos substituintes preferidosincluindo um alquil, de preferência, alquil ou haloal-quil, tendo de 1 a átomos de carbono, halo, acilamino ougrupo nitro; ou um grupo heteroaril contendo N-, que podeser condensado com anel de benzeno, de preferência, pir-rolil, piridil, isoquinolil ou quinolil, ou um grupo he-teroaromático contendo enxofre, de preferência, tienil,em que os grupos heteroaril podem ser substituídos por umou mais alquil, de preferência, alquil tendo de 1 a 4átomos de carbono; X é -NR1R2 , em que R1 e R2 , indepen-dentemente um do outro, são H, um alquil linear ou rami-ficado, um alquil linear ou ramificado substituído, depreferência, alquil tendo de 1 a 6 átomos de carbono, umcicloalquil ou R1 e R2 , junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, podem formar um anel hetero saturado comcontendo de 3 a 7 elementos , mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos; R é um grupo da fórmula (e), emque R5 e R6 , independentemente um do outro, são H, um al-quil linear ou ramificado ou um alquil linear ou ramifi-cado substituído, de preferência, alquil tendo de 1 a 4átomos de carbono, ou cicloalquil, ou R5 e R6, tomadosjunto com o átomo de nitrogênio a eles anexados, formamum anel hetero saturado, contendo de 3 a 7 elementos,mais preferivelmente, contendo de 5 a 7 elementos, quepode conter átomos hetero adicionais e substituintes, ossubstituintes sendo, de preferência, alquil tendo 1 a 4átomos de carbono; Y é H ou um alquil ou alquil substi-tuído tendo de 1 a 4 átomos de carbono; Y5 é H, ou um al-quil ou alquil substituído tendo de 1 a 4 átomos de car-bono, ou OR , em que R é H ou um acil; k. é 1, 2 ou 3; em é 1, 2 ou 3, com a condição de que, quando A é fenil,que é substituído por halogêneo ou alcoxi, ou fenil al-quil substituído por alcoxi ou um grupo piridil e R é H,então pelo menos um dentre R e R é outro que não H, ouquando A é fenil, que não é substituído ou substituídocom halogêneo ou alcoxi; fenil alquil substituído por al-coxi; ou piridil e R e R são, cada um deles, H, entãoR7 é outro que não H.
Os compostos, em que X é um derivado de NH2, sãopreparados - similarmente ao procedimento mencionado aci-ma - pela reação dos intermediários correspondentes tendoa estrutura 1, em que R e R da estrutura 1 são H, comum composto tendo a estrutura 2. 0 agente de alquilação(tendo a estrutura 2) pode conter substituintes hidroxile/ ou amino. A reação requer a presença e uma base orgâ-nica ou inorgânica, de maneira preferível, uma solução dealcoolato alcoólico é usada como meio e base. Os produtossão, freqüentemente , isolados na forma de um sal com umácido orgânico ou inorgânico adequado.
Outro grupo dos novos compostos acima é caracte-rizado por R1 e R2 , um ou ambos sendo outro que não Hnesses derivados. Essas estruturas podem ser preparadasde duas maneiras:
(i) Uma amidoxima tendo a estrutura 1, que jácontém os substituintes R e/ ou R requeridos, pode rea-gir com um composto reativo da estrutura 2, similarmenteao procedimento descrito no parágrafo anterior. As amido-ximas substituídas da estrutura 1, usadas como os materi-ais de iniciação, são conhecidas da literatura [ Chem.Ver. 62, 155 - 183 (1962)].
(ii) A substituição dos átomos de halogêneo noscompostos tendo a estrutura (I) , em que Z é uma ligaçãoco-valente e X é halogêneo, por uma amina da estrutura 5pode resultar em compostos similares, igualmente. No casode derivados portanto um substituinte OH no grupo R (Y =OH) , esse grupo hidroxil tem que ser protegido antes edesprotegido após a reação de substituição, caso contrá-rio, a formação dos derivados cíclicos da estrutura (I1)é favorecida. Para a proteção, grupos protetores do tipoacetil, por exemplo, grupo tetraidropiranil , têm de-monstrado ser mais satisfatórios. A proteção é realizadaatravés da reação do composto não protegido com diidropi-rano, seguida pelo deslocamento de halogêneo/ amina, que,usualmente, requer o refluxo em um solvente, por exemplo,em álcool. A desproteção do produto, finalmente, pode serrealizada por tratamento com ácido, por exemplo, atravésda ebulição da solução etanólica na presença de, porexemplo, ácido p-tolueno sulfônico.
Conforme mencionado, um grupo dos novos compos-tos também inclui aqueles em que Y5 e um grupo aciloxi.Eles podem ser preparados por acilação dos derivados deY5 = OH correspondentes, que são conhecidos da literatura(por exemplo, a patente húngara no. 177578) ou descritosna presente invenção. As reações podem ser realizadasidenticamente àquela que é descrita para os derivadoshalo análogos, em que R é um grupo acil (método (iii)).
Os novos derivados de hidroxilamina da fórmula(I) também incluem aqueles em que Z é oxigênio ou um gru-po =NR3, em que R é um grupo alquil não substituído ousubstituído, X é NR1R2 e R1 e R2, independentemente um dooutro, são hidrogênio, alquil reto ou ramificado nãosubstituído ou substituído, aril não substituído ou subs-tituído, de preferência, fenil ou um grupo aralquil subs-tituído ou não substituído, ou R1 e R2, junto com o átomode nitrogênio a eles anexados, formam um anel heterocí-clico saturado, contendo de 3 a 7 elementos, mais prefe-rivelmente, contendo de 5 a 7 elementos, que, opcional-mente, contém um ou mais átomos hetero. Nesses compostos,A é um alquil substituído ou não substituído ou arilsubstituído ou não substituído, de preferência, um grupofenil ou fenil substituído ou um grupo aralquil substitu-ído ou não substituído e R é um grupo da fórmula (b), emque R5 e R6, independentemente um do outro, são H, al-quil reto ou ramificado, de preferência, alquil de C1-4ou cicloalquil, ou R5 e R6, junto com o átomo de nitrogê-nio a eles anexados, formam anel heterocíclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, Y6 é H ou -OR7, em que R7 é Hou acil, de preferência, alquil carbonil substituído ounão substituído, kél, 2 ou 3 e m é 1, 2 ou 3.
Os novos derivados de hidroxilamina, em que Z éoxigênio e X é -OR, em que Q é um alquil substituído ounão substituído ou um grupo aralquil substituído ou nãosubstituído, A é um grupo alcoxi substituído ou não subs-tituído ou um grupo aralquil substituído ou não substitu-ído e R é um grupo da fórmula (b), em que R5 e R6, inde-pendentemente um do outro,, são H, alquil reto ou ramifi-cado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6, junto com o átomo de nitrogênio a eles anexados,formam anel heterociclico saturado, contendo de 3 a 7
elementos, mais preferivelmente, contendo de 5 a 7 ele-mentos, Y6 é H ou -OR7 , em que R é H ou acil, de prefe-rência, alquil carbonil substituído ou não substituído, ké I1 2 ou 3 e m é 1, 2 ou 3, também estão dentro do esco-po dos compostos da fórmula (I).
R5 e R6, independentemente um do outro,, são H,alquil reto ou ramificado, de preferência, alquil de C1-4ou cicloalquil, ou R5 e R6, junto com o átomo de nitrogê-nio a eles anexados, formam anel heterociclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, Y6 é H ou -OR7 ,R7 é H ou acil,de preferência, alquil carbonil substituído ou não subs-tituído, kél, 2 ou 3 e m é 1, 2 ou 3.
Outro grupo dos novos derivados de hidroxilaminada fórmula (I) é representado por aqueles em que A é arilsubstituído ou não substituído, de preferência, fenil ou
um grupo heteroaromático contendo N-, de preferência, pi-ridil ou um grupo heteroaromático contendo S-, Zé umaligação química, X é -OQ, em que Q é C1-4 e R é um grupoda fórmula (b) , em que R5 e R6, independentemente um dooutro, são H, alquil reto ou ramificado, de preferência,alquil de C1-4 ou cicloalquil, ou R e R , quando juntoscom o átomo de nitrogênio a eles anexados, formam anelheterocíclico saturado, contendo de 3 a 7 elementos, maispreferivelmente, contendo de 5 a 7 elementos, Y6 é H, k é1, 2 ou 3 e m é 1, 2 ou 3.
Esses compostos são preparados através da reaçãodos derivados de hidroxilamina correspondentes da fórmula(I), em que X é halo e os alcoolatos correspondentes, depreferência, em um álcool correspondente ao alcoolato, depreferência, através de refluxo. A mistura da reação étratada com métodos conhecidos na técnica e o produto éisolado por cromatografia ou formação de sal.
Os novos derivados de hidroxilamina da fórmula(II) também incluem o grupo de compostos em que X é oxi-gênio, A é um alquil reto ou ramificado de C1-20 » arilsubstituído ou não substituído de preferência, fenil ouhalofenil, aralquil substituído ou não substituído, naf-til ou um grupo heteroaromático contendo N-, de preferên-cia, piridil, Z é uma ligação química, R1 é H, alquil ouaralquil de C1-4, de preferência, fenil alquil, R é umgrupo da fórmula (b) , em que R5 e R6, independentementeum do outro, são H, alquil reto ou ramificado, de prefe-rência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ou R5 e R6 , quandotomados junto com o átomo de nitrogênio a eles anexados,formam anel heterociclico saturado, contendo de 3 a 7elementos, mais preferivelmente, contendo de 5 a 7 ele-mentos, Y6 é H ou -OR7 , R7 é H, k é 1, 2 ou 3 e m é 1, 2ou 3, com a condição de que, quando A é outro que não al-quil e R1 é H, Y6 seja H.
Os novos compostos em que Z é uma ligação co-valente, oxigênio ou um grupo =NR ,em que R é hidrogênioou um grupo alquil não substituído ou substituído, X é=NR4 , em que R4 é hidrogênio , um alquil não substituídoou substituído, aril não substituído ou substituído, depreferência, um grupo fenil ou aralquil substituído ounão substituído, de preferência, fenil alquil, estão den- tro do escopo dos compostos da fórmula (II) . Nesses com-postos, A é um alquil não substituído ou substituído, ouum aril não substituído ou substituído, de preferência,um grupo fenil ou fenil substituído ou aralquil não subs-tituído ou substituído, de preferência, fenil alquil, ou cicloalquil, R' é um alquil substituído ou não substituí-do ou um aril não substituído ou substituído, de prefe-rência, um grupo fenil ou aralquil não substituído ousubstituído, de preferência, fenil alquil, R é um grupoda fórmula (b) , em que R5 e R6 , independentemente um do outro, são H, alquil reto ou ramificado, de preferência,alquil de C1-4 ou cicloalquil, ou R5 e R6, quando tomadosjunto com o átomo de nitrogênio a eles anexados, formamum anel heterociclico saturado, contendo de 3 a 7 elemen-tos, mais preferivelmente, contendo de 5 a 7 elementos,
Y6 é H ou -OR ,R7 é H ou acil, de preferência, alquilcarbonil ou aril carbonil substituído ou não substituído,k é 1, 2 ou 3 e m é 1, 2 ou 3.
Novos derivados de hidroxilamina também sãoaqueles da fórmula (II) , em que X é oxigênio, A é alquilsubstituído ou não substituído, aralquil substituído ounão substituído, de preferência, fenil alquil, Z é oxigê-nio, R1 é alquil ou aralquil, de preferência, fenil al-quil, R é um grupo da fórmula (b) , em que R5 e R6, inde-pendentemente um do outro, são H, alquil reto ou ramifi-cado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6 , quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico, contendo de3 a 7 elementos, mais preferivelmente, contendo de 5 a 7elementos, Y é H ou -OR ,R é H ou acil, de preferên-cia, alquil carbonil ou aril carbonil substituído ou nãosubstituído, k é 1, 2 ou 3 e m é 1, 2 ou 3.
Os compostos de hidroxilamina da fórmula (II) ,em que X é oxigênio e Z é =NH, também são novos compos-tos .
Um grupo desses compostos é formado por aquelesem que A alquil substituído ou não substituído, cicloal-quil, aralquil substituído ou não substituído, de prefe-rência, fenil alquil, fenil não substituído ou fenilsubstituído por halo, alquil, haloalquil, alcoxi ou ni-tro, R é um grupo da fórmula (b) , em que R5 e R6, inde-pendentemente um do outro, são H, alquil reto ou ramifi-cado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6, quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico, contendo de3 a 7 elementos, mais preferivelmente, contendo de 5 a 7elementos, Y6 é H ou -OH, kél, 2ou3emél, 2 ou 3.
Um outro grupo desses compostos é formado poraqueles em que A é um grupo da fórmula (a) , em que Y1 éhaloalquil, de preferência, trifluorometil e η é 1, 2 ou3, R' é H e R6
é um grupo da fórmula (b), em que R e R , inde-pendentemente um do outro, são H, alquil reto ou ramifi-cado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6, quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico, contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, contendo de 5 a 7elementos, Y6 é H ou -0H, kél, 2ou3emél, 2 ou 3.
Os novos derivados de hidroxilamina de acordocom a invenção também incluem os compostos cíclicos dafórmula (I""), em que A é fenil não substituído ou fenil substituído por halo ou nitro, ou heteroaril contendo N-,
R1 é H e R" é um grupo τπ-amino - alquil mono ou di-substituído no grupo amino, cuja cadeia de alquil tem de1 a 5 átomos de carbono e os substituintes amino, inde-pendentemente um do outro, podem ser um ou mais alquilreto ou ramificado ou cicloalquil, ou os dois substituin-tes amino, junto com o átomo de N a eles anexado, formamum anel heterocíclico saturado, contendo de 3 a 7 elemen-tos , de preferência, contendo de 5 a 7 elementos ou umderivado de N- quaternário de alquil de C1-4 , com a con-dição de que, quando A é 3-piridil, R" seja diferente de1- piperidinil metil.
4.2 MÉTODO DE AUMENTO DA EXPRESSÃO DE PROTETORES MOLECU-LARES EM CÉLULAS
A presente invenção se refere a um método de in-tensificação de protetores moleculares em células, atra-vés do tratamento das células e dos tecidos com uma quan-tidade efetiva de um derivado de hidroxilamina. Os deri-vados de hidroxilamina, cujas formas tautoméricas são re-presentadas pelas fórmulas (I) ou (II) , podem ser usadospara esse método. As estruturas das fórmulas (I) e (II)são discutidas em detalhes no Parágrafo 4.1.
Em uma concretização não limitadora da invenção,um método de aumento da expressão de protetores molecula-res em células expostas à tensão é proporcionado. Nessemétodo, as células expostas a um tensão fisiológica, queinduz a expressão de protetores moleculares pelas célu-las, são tratadas com uma quantidade efetiva de derivadosde hidroxilamina, cujas formas tautoméricas são represen-tadas pelas fórmulas (I) e (II) , após a ocorrência datensão. Os derivados de hidroxilamina aumentam a expres-são de protetores moleculares nessas células além daquantidade induzida pela tensão fisiológica.
Em outra concretização não limitadora da inven-ção, as células são tratadas com os derivados de hidroxi-lamina antes de que serem expostas a um tensão fisiológi-ca. Os derivados de hidroxilamina aumentam a expressão deprotetores moleculares além da quantidade induzida pelatensão fisiológica.
O termo "protetor molecular", conforme aqui usa-do, se refere a proteínas que auxiliam outras proteínas adobrar em conformações corretas ou ativas, usualmente pormeio de ligação não co-valente às proteínas. Os proteto-res não só auxiliam na correção e na restauração de pro-teínas recentemente sintetizadas, mas também daquelas queforam desnaturadas ou mal dobradas. Os protetores molecu-lares incluem, entre outras, proteínas de choque térmico(hsp) , das quais as hsp 70 e hsp 72 são de especial im-portância em relação com a invenção, bem a proteína deligação de cadeia pesada IgG (Bip) e proteína reguladapor glicose (grp). Exemplos de hsp e grp incluem, mas nãoestão limitados a estas, aquelas pertencentes às seguin-tes classes: hsp 70, hsp 60, hsp 90, grp 94, grp 80 e hsp27.
De preferência, as células eucarióticas que sãotratadas com os derivados de hidroxilamina são as célulasde mamíferos, mais preferivelmente, células humanas. 0termo "célula eucariótica' se refere às células eucarió-ticas que estão in vitro (células que estão fora de umorganismo vivo, por exemplo, em condição de cultura) e invivo (células que estão dentro de um organismo vivo, porexemplo, células que compreendem tecidos e órgãos).
Das células eucarióticas de um organismo vivo,células nervosas, células musculares, células das paredesdos vasos, especialmente células endoteliais, célulasepiteliais e células do sistema imune, podem, de prefe-rência, ser tratadas de acordo com o método da invenção.As células de vegetais, incluindo as células de organis-mos vegetais vivos, também podem ser tratadas, de prefe-rência, de acordo com o método da invenção.
Sob o termo "tensão fisiológica", conforme aquiusado, devem ser compreendidas as condições ou fatoresque afetam a célula, os quais induziriam a "resposta detensão" da célula, por exemplo, indução de síntese deproteínas protetoras. As tensões fisiológicas incluem fa-tores que causam danos às células ou perturbam o equilí-brio homeostático das células. Esses são, por exemplo, astensões metabólicas, oxidativas, mecânicas locais ou ten-sões causadas por hipoxia, isquemia, choque térmico, ma-teriais de radiação ou tóxicos. Uma forma importante detensão metabólica é causada pelo diabetes mellitus.
Outra forma importante de tensões fisiológicasincluem aquelas que levam à formação dos radicais livresou aumentam a quantidade de citocinas no ambiente das cé-lulas. Danos nas células que estão associados com as vá-rias condições patológicas proporcionam exemplos de ten-sões fisiológicas.
Em uma concretização não limitadora da invenção,a tensão fisiológica que induz as células a expressarem oprotetor molecular como uma resposta às tensões fisioló-gicas que levam às doenças cardiovasculares, vasculares,cerebrais, alérgicas, imunes e auto-imunes, infecções porvírus e bacterianas, doenças da pele e das mucosas ou do-enças dos túbulos renais de origem epitelial ou causandocondições a serem tratadas por intervenções cosméticas.
Essas doenças cardiovasculares incluem, maispreferivelmente, aterosclerose provocada por tensão fisi-ológica, doenças coronarianas ou doenças cardiovascularescausadas por hipertonia ou hipertonia pulmonar.
As doenças cerebrais características são, entreoutras, aquelas causadas pela isquemia cerebrovascular,provocada por tensão fisiológica, choque, ferimento trau-mático na cabeça, doenças neurodegenerativas senis, espe-cialmente a demência senil, demência pela AIDS, a demên-cia pelo álcool, a doença de Alzheimer, a doença de Pa-rkinson ou a epilepsia.
As doenças características provocadas por doen-ças da pele e das mucosas são as doenças dermatológicasou doenças ulcerativas do sistema gastrointestinal.
Durante as doenças acima, a tensão fisiológicainduz a expressão de protetores nas células, contudo,esse efeito não é suficiente o bastante para protegercontra os danos às células causadas pelas doenças. 0 tra-tamento com os derivados de hidroxilamina acima que estáassociado com a intensificação de expressão de protetoresou o aumento da atividade dos protetores torna possível aeliminação de desvios estruturais causados pela doença e,desse modo, a regeneração das células.
Em um exemplo não limitador da invenção, a ten-são fisiológica é o choque térmico ou a exposição das cé-lulas à temperatura incomumente alta. Em outro exemplonão limitador da invenção, a tensão fisiológica é o danocelular associado com a isquemia. A lesão isquêmica dascélulas , especialmente das células cerebrais e do múscu-lo do coração, é causada por perturbações cardiovascula-res causadas por oclusão ou ruptura vascular, tal comotrombose coronária ou cerebral ou oclusão vascular, cho-que, embolismo ou espasmo vascular crônico. A isquemiareduz a "resposta à tensão" nas células, resultando emquantidade aumentada de hsp, que, por sua vez, protege ascélulas contra os efeitos prejudiciais da isquemia(Mestril, R. e outros, J. Mol. Cell. Cardiol. 27: 45 (1995).
Através do tratamento dessas células com umaquantidade efetiva de derivados de hidroxilamina naquelascélulas, a expressão de protetores moleculares nas célu-las pode ser aumentada além da quantidade induzida pelacondição isquêmica, bem como a atividade dos protetoresmoleculares pode ser intensificada.
Em relação com essa matéria, quando um órgão éretirado de um animal para transplante, essa remoção éuma tensão fisiológica, causando danos às células quecompreendem aquele órgão, induzindo a expressão de prote-tores. Nesse caso, a administração dos derivados de hi-droxilamina, antes ou após a remoção do órgão, poderiaaumentar a quantidade de protetores produzida pelas célu-las do órgão ou a sua atividade, desse modo, proporcio-nando um efeito citoprotetor.
Os danos às células nervosas, além da isquemia,podem ser induzidos por muitas outras tensões, que indu-zem a produção de protetores moleculares nas células ner-vosas. Além disso, danos neuronais excitotóxicos tambéminduzem a produção de protetores moleculares através das células neuronais e estão incluídos dentro do termo"tensão fisiológica".
Em outro exemplo da invenção, a tensão fisioló-gica é proporcionada pelos mediadores tóxicos da inflama-ção, tais como os radicais oxidativos e as citocinas, tais como, TNF, que são produzidos por macrófagos. É de-monstrado que as células expostas à quantidade aumentadadesses mediadores tóxicos expressam uma quantidade aumen-tada de hsp, que, por sua vez, proporcionam proteção paraessas células contra a toxicidade (Katengwa, S. e outros,Semin. Immun. 3: 49 - 56 (1991). Várias doenças inflama-tórias, incluindo condições inflamatórias pulmonares,tais como, a sindrome da aflição no adulto, induzem a ex-pressão de hsp pelas células, que, por sua vez, exerce umefeito citoprotetor (Jacquier - Salin, M.R. e outros. Ex-perientia 50: 1031 - 1038 (1994). Quando a quantidade deprotetores moleculares nas células é aumentada além da-quela induzida por TNF e espécies reativas ao oxigênio,as células podem ser melhor protegidas contra os fatorescitotóxicos e estar melhor capacitadas a reparar os danos causados por eles.
Os fatores que afetam o estado fisiológico dasmembranas celulares, incluindo a fluidez da membrana ce-lular, também proporcionam exemplos de tensão fisiológi-ca. O aumento da expressão de protetores moleculares nascélulas além daquela induzida pela perturbação do estadofisiológico das membranas celulares podem proporcionarmelhor proteção e também permitir que as células reparemas membranas celulares.
A frase "uma quantidade efetiva dos derivados dehidroxilamina", conforme aqui usada em relação com a in-tensificação da produção de protetores moleculares nascélulas sob tensão fisiológica ou células que, subseqüen-temente, serão expostas à tensão fisiológica, ser referea uma quantidade que aumentará a expressão de protetoresmoleculares além do nível induzido ρ[ela tensão fisioló-gica sozinha. Essa quantidade pode ser prontamente deter-minada por alguém habilitado na técnica. De preferência,para células in vitro, a quantidade efetiva está entre10 6 - 10 3 M. Mais preferivelmente, a quantidade efetivaestá entre 10-6 - 5 x 10-4 M.
Quando da administração a um animal, a quantida-de efetiva varia, dependendo de vários fatores, taiscomo, um modo de administração, mas a determinação dafaixa efetiva está dentro da capacidade de alguém habili-tado na técnica e não requererá experimentação indevida.Por exemplo, quando o derivado de hidroxilamina é admi-nistrado intravenosamente, a quantidade efetiva está, depreferência, entre 0,1 - 10 mg/ kgpc, mais preferivelmen-te, 0,5 - 2,0 mg/ kgpc; e, quando administrado oralmente,a quantidade efetiva está, de preferência, entre 10 - 500mg/ kgpc, mais preferivelmente, entre 50 - 100 mg/ kgpc.Um aumento na expressão de protetores molecula-res nas células pode ser detectado usando-se procedimen-tos de laboratório bem estabelecidos, tais como, o proce-dimento da mancha De Northern ou Oriental.
Um exemplo da técnica da mancha De Western quepode ser usada é aqui apresentado: as células são culti-vadas in vitro a 37° C no meio de Eagle modificado deDulbecco (DMEM), suplementado com soro fetal de vitela a10% (GIBCO) em CO2 a 5%. Os derivados de hidroxilamina,cujas formas tautoméricas são aqui representadas pelasfórmulas (I) e (II), podem ser adicionados à cultura decélulas, por exemplo, 10 M do composto é administradoàs células, 16 horas antes da tensão fisiológica, ou apóso período de tempo que se segue à tensão fisiológica.Contudo, a concentração do derivado de hidroxilamina, bemcomo o tempo de administração daquele compostos, podemser variados, conforme desejado pelo projeto experimen-tal.
Seis horas após o choque térmico, as células sãolavadas duas vezes em solução salina tamponada por fosfa-to (PBS), a seguir, raspadas das placas de cultura emPBS. As células são giradas por 5 min a 1500 rpm e recu-peradas em 100 μΐ de tampão solubilizante modificado(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Ed. Sambrook,Fritsche, Maniatis, Bold Spring Harbor Laboratory Press(1989), contendo 50 mM de Tris- HCl, pH 8,0; 5 mM deEDTA: 150 mM de NaCl; 15 Tritox N-10 0; 1 PMSF; 2 μg/ mlde aprotinina; 1 μg/ ml de quimostatina; 1 μg/ ml depepstatina; e submetidas à onda sônica por 3 χ 20 seg (intervalos de 2 min, ajustagem 8).
A concentração de proteína é, então, determinadade amostras de 5 μΐ através do ensaio de Bradford (Μ. M.Bradford, Anal. Biochem., 72: 248 - 254 (1096) em trêsparalelas. As amostras são ajustadas para uma concentra-ção de proteína de 100 μg/ 30μ1, com a solução tampãoacima e a solução tampão seguinte, de modo que a concen-tração final dos componentes na solução tampão na amostraserá 110 mM de Tris^HCl, pH 6,8; 8,3 mM de mercaptoeta-nol, 3% de SDS, 3% de glicerol e algum azul bromofenol esacudidas em temperatura ambiente por 30 minutos. A amos-tra assim obtida pode, então, ser usada para que se pro-cesse uma eletroforese com gel.
Quando o efeito de intensificação de protetoresdos derivados de hidroxilamina da invenção é examinadopara as células in vivo , uma tensão fisiológica é apli-cada a um anima, por exemplo, isquemia ou diabetes indu-zida por STZ. Em caso de isquemia, a isquemia miocardialpode ser induzida em um animal conforme descrito no Exem-plo 8 e a condição diabética pode ser induzida conformedescrito no Exemplo 10. Um derivado de hidroxilamina dapresente invenção pode ser administrado ao animal antesque ele seja exposto à tensão fisiológica, durante a ten-são ou após. Conforme previamente mencionado, os temposde administração podem ser variados, de acordo com umprojeto experimental.
As etapas seguintes da preparação de proteína detecidos relevantes obtidos dos animais assim tratados sãorealizada em 0 - 4 C. Os tecidos, tais como tecidos dofígado (cerca de 15 - 20 g) são homogeneizados com ummisturador doméstico durante 2 min, em 80 ml de uma solu-ção tampão de lisina, contendo 5 0 mM de Tris - HCl, pH de8,0; 0,5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl; SDS a 1%; Triton X-100 a 1% e 1 - 1 mM de inibidores de protease (PMSF, ben-zamidina, ácido amino capróico). 0 homogenado é, então,centrifugado em 20000 xg por 30 min, em uma centrífugaSorvall RC 28S.
A concentração de proteína da preparação é de-terminada pelo ensaio de Bradford e ajustada para 5 mg/ml. As amostras contendo 1,8 mg de proteína são solubili-zadas antes da eletroforese com gel, com 0,6 ml de tam-pão, contendo 110 mM de Tris - HCl, pH de 6,8; 8,3 mM demercaptoetanol; SDS a 3%; glicerol a 3% e algum azul bro-mofenol e sacudidas em técnica anterior durante 30 min.
As amostras de proteína obtidas das culturas decélulas ou de tecidos de animais, ambas as quais são des-critas acima, são usadas para a eletroforese e subsequen-te imuno-manchamento (ambos os procedimentos são bem co-nhecidos na técnica e descritos em detalhes em MolecularCloning, A Laboratory Manual. Ed. Sambrook, Fitsche, Ma-niatis, Bold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Pro-tein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Mem-brane, 3. Laboratory Manual, Millipore; e U. K. Laemmli,Nature: 227: 680 - 685 (1970).
Por exemplo, a eletroforese pode ser realizadade acordo com Laenurili (U. K. Laemmli, Nature, 227: 680 -685 (1970)) em gel de poliacrilamida a 8 - 18%, em volta-gem constante de 50 V por toda a noite. As proteínas sãotingidas com Azul Brilhante de Coomassie R-250 ou trans-feridas para Immobilone PVDF (Millipore) em correnteconstante (300 mA) por 3 horas em 4 0C em tampão detransferência (10 mM CAPS, Ph 11, metanol a 10%) (ProteinBlotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane,3, Laboratory Manual, Millipore). Após a transferência,locais não específicos da membrana são bloqueados com al-bumina de soro bovino a 2% (BSA) em TPBS (solução salinatamponada com fosfato com Tween 20 a 0,1%) durante a noi-te a 4 °C. A mancha pode, então, ser incubada com um an-ticorpo direcionado como um protetor molecular, por exem-plo, anticorpo monoclonal GRP94 (SPA-850, Stress Gen) di-luído em 1:3000, com anticorpo monoclonal HSP60 (SPA-600,StressGen) com diluição de 1:2700, com anticorpo monoclo-nal HSP72 (C92F34-5, StressGen) diluído em 1:1250, ou comanticorpo monoclonal HSP90 (AC88, StressGen) diluído em1:2000, durante 1 hora, em temperatura ambiente. A se-guir, a membrana é lavada com tampão de TPBS durante umahora, e incubada com anti-rato conjugado com peroxidasede rábano (Sigma, diluição de 1:4000, para grp-94) ou an-ti-camundongo (Sigma, adsorvida com proteínas de soro hu-mano e de ratos, diluição de 1:3000, para Hsp60, HSP72 ouHSP90) , anticorpo secundário por mais 1 hora, respecti-vãmente. Após lavagem sucessiva com TPBS, a membrana édesenvolvida com o sistema de ECL (luminescência químicaintensificada) (Amersham) .
As mudanças no teor de tensão de proteína podemser quantificadas, usando-se um densitômetro Bio-Rad(Modelo 1650) e um Integrador Hewlett - Packard (HP3394a). As séries de diluição são preparadas a partir desolução de proteínas, contendo uma quantidade conhecidade protetor, o processo acima é repetido com as diluiçõese a concentração de protetor das amostras de teste é de-terminada a partir da curva de calibração obtida dos tes-tes de diluição.
A hidrização De Northern é outro procedimentodisponível para determinação do nível de intensificaçãode protetor molecular (através da medição do nível demRNA) pelos derivados de hidroxilamina da invenção. Ascélulas ou tecidos podem ser obtidos conforme descrito emrelação com o procedimento de formação de mancha De Wes-tern. 0 RNA total daquelas células e tecidos pode ser ex-traído usando-se RNAgentes (Promega) de acordo com asinstruções do fabricante (Protocols and Applications Gui-de, 2a edição, 1001, Promega Corporation). As amostras detecido congeladas (cerca de 50 a 100 mg, cada) são homo-geneizadas em 4M de guanidina - tiocianato de desnatura-ção a 1,0; 42 mM de citrato de sódio; 0,83 m de β-mercaptoetanol; Nonidet P-40 a 0,1%, em 4 °C(homogeneização -Brinkman) . Então, 1/10 vol. de 3M deacetato de sódio (pH 4,0) são adicionados e o homogenatoé extraído com fenol ácido (fenol: clorofórmio: isoami-lálcool 25;24:1) durante 10 segundos por vórtice. A amos-tra é incubada em gelo durante 15 minutos e, a seguir,centrifugada (4 C; 20 min, 10.000 xg) . A fase aquosa é,então, transferida para um novo tubo Eppendorf, o proces-so é repetido e a fase aquosa é precipitada em -20 0C du-rante a noite com igual volume de isopropanol. Em seguidaà centrifugação (4 C; 20 min, 10.000 xg) o precipitado élavado duas vezes com etanol a 95% e seco em temperatura
ambiente. 0 RNA é suspenso em água tratada com 20 μΐ depirocarbonato de dietil (DEPC) e o concentrado é medidoem 260 - 280 nm por espectrofotometria. Oito μg de RNAtotal são processados em gel de formaldeído - agarose portransferência capilar, o RNA no gel é manchado em membra-na de náilon de acordo com as instruções do fabricante(Zeta-Probe GT, BioRad).
Em amostras individuais, o teor de mRNA do pro-tetor molecular é comparado com o nível de mRNA do genede hidrogenase de 3-fosfato de gliceraldeído (GAPDH) nasamostras. As provas de cDNA (por exemplo, cDNA de hsp7 0humano de comprimento total, quando o mRNA em teste éhsp70, e fragmento de Apa-Ncol do cDNA de GAPDH de rato)são rotuladas com alfa- P CTP, usando o Kit de RotulaçãoPrimária Aleatória de DNA (USB). Os fragmentos radio-rotulados de DNA são purificados em coluna de Sephadex G-50 (Pharmacia), conforme descrito (Ausubel e outros(eds)): Current Protocols in Molecular Biology: JOHN WI-LWY & SONS: 1987).
As pré-hibridizações são realizadas em 65 °C emtampão de H (0,25 M de Na2HPO4, pH 7,2; SDS a 7%) durante15 minutos. As hibridizações são realizadas durante anoite (65 C; tampão de H) com concentração de prova decDNA rotulada com isótopo de pelo menos IO6 cpm/ ml. Amembrana é então lavada com 20 mM de Na2HPO4; pH 7,2; SDSa 5% (65 C; 2 χ 15 min) e avaliada por auto-radiografia.A mesma membrana é usada para fazer a prova do mRNA dahsp70 e a medição de GAPDH e mRNA, usada como um padrãointerno.
A presente invenção ainda inclui um método detratamento ou prevenção de várias condições patológicas,isto é, doenças associadas com o funcionamento do sistemaprotetor e danos nas membranas de células e organelos ce-lulares através da administração de uma quantidade efeti-va de derivados de hidroxilamina, cujas formas tautoméri-cas são representadas pelas estruturas (I) e (II), paracontrolar as condições patológicas no organismo. Nas con-dições patológicas, a expressão de protetores molecularescaracterística é induzida nas células. A expressão deprotetores moleculares aumentada naquelas células podeauxiliá-las no reparo dos danos causados pelas condiçõespatológicas e, também, na restauração do equilíbrio home-ostático celular.
Essas condições patológicas incluem isquemia,doenças tumorígenas, infecções causadas por microorganis-mos patogênicos, doenças auto-imunes e dermatoses.Conforme aqui usado, "tratamento" se refere auma melhoria na condição clinica do indivíduo e não indi-ca, necessariamente, que uma cura completa é obtida. Umamelhoria se refere a uma duração diminuída da doença ouda gravidade da doença, ou um aperfeiçoamento subjetivona qualidade de vida do indivíduo ou uma sobre vida pro-longada do paciente.
Uma quantidade efetiva de hidroxilamina da in-venção para tratamento se refere a uma quantidade sufici-ente para resultar na melhoria da condição clínica, con-forme descrito acima. Uma quantidade efetiva depende defatores, tais como, a via de administração e pode ser de-terminada, facilmente, por alguém habilitado na técnica.
Os derivados de hidroxilamina da presente invenção podemser administrados parenteralmente ou oralmente, de prefe-rência, oral ou topicamente, e a quantidade efetiva é 10-500 mg/ kgpc. Mais preferivelmente, a quantidade efetivaé 20 - 100 mg/ kgpc.
Através do uso do método de acordo com a presen-te invenção, os tecidos do miocárdio e do cérebro e o rimpodem ser protegidos contra dano ao tecido ou necrosecausados pela isquemia, em que o método compreende a ad-ministração a um indivíduo de uma quantidade efetiva dederivados de hidroxilamina da invenção, para diminuir,prevenir ou reverter o efeito prejudicial da isquemiaprolongada.
A presente invenção inclui o uso de derivados dehidroxilamina, cujas formas tautoméricas são representa-das pelas fórmulas (I) e (II), para fabricar um medica-mento para o tratamento de condições patológicas aquidescritas.
Em um método para a medição do efeito protetor dos derivados de hidroxilamina de teste com animais éusado conforme aqui apresentado. Os ratos são anestesia-dos com pentobarbital de sódio (Nembutal - 60 mg/ k.g depeso corpóreo, i.p.) e ventilados, artificialmente, comar ambiente (2 ml/ 100 g; 54 batidas/ minutos) por meio de traqueotomia. A artéria carótida direita é, então, ca-teterizada e ligada a um transdutor de pressão (BPR-01,Stoelting) para a medição de pressão sangüínea arterialsistêmica (PS) por meio de um pré-amplificador (Hg - 02,Experimetria) . Os derivados de hidroxilamina da invenção são administrados por meio de cânula à veia jugular(i.v.) ou oralmente (ρ. o). A velocidade cardíaca (V. C.)é medida por um cardiotacômetro (VC-01, Experimetria) e oeletrocardiograma é registrado em um registrador (MR-12,Medicor) por meio de eletrodos de agulha de aço subcutâ- neos. O tórax é aberto por uma toracotomia esquerda e ocoração é, então, exteriorizado por meio de uma pressãosuave sobre o lado direito da caixa torácica. Uma com-pressão foi aplicada sob a artéria coronária esquerdaprincipal, conforme descrito por Selye e outros (1960). O coração é, cuidadosamente, recolocado no tórax e o animaldeixado em recuperação. A temperatura retal é monitoradae mantida constante em 37 °C. O protocolo experimental éiniciado com um período de estabilização de 15 minutos.Se a pressão sangüínea sustentada foi menor do que 7 0mmHg ou arritmia foi observada durante esse período, oanimal foi excluído de nova experimentação. A isquemia domiocárdio é, então, induzida com a oclusão coronária du-rante 5 minutos e a reperfusão foi permitida durante 10minutos.
Durante todo o experimento, a pressão sangüínea(PS), a freqüência cardíaca (FC) e o ECG são continuamen-te registrados em um multiscriptor (R61 - 6CH, Medicor*).Os derivados de hidroxilamina são administrados em 5 a 60minutos antes da oclusão por meio de tratamento i. v. oup. 2 As doses do derivado de hidroxilamina podem ser 0,5;0,75; 1,0 mg/ kg i. v. e 100 mg/ kg de peso corpóreo p.o, enquanto a substância de referência Bepridil é dada emuma dose de 1,0 mg/ kg i. v. A duração média da taquicar-dia ventricular (TV) e/ ou da fibrilação ventricular(FV), durante os primeiros 3 minutos de reperfusão é me-dida e analisada.
A presente invenção também inclui um método demanutenção de uma fluidez de membrana celular, quando afluidez da membrana celular é afetada como um resultadode um tensão fisiológica. 0 método compreende o tratamen-to de uma célula ou organelo celular, tendo fluidez demembrana alterada, com uma quantidade efetiva de deriva-dos de hidroxilamina para restabelecer a fluidez da refe-rida membrana. 0 protocolo experimental apresentado emconexão com o Exemplo 9 (anisotropia de fluorescência deDPH de estado estacionário) pode ser usado para determi-nar o efeito de um derivado de hidroxilamina da invençãosobre a fluidez da membrana celular.
Conforme mencionado, a presente invenção incluium método de tratamento de condições patológicas associa-das com a membrana celular ou a membrana do organelo ce-lular. Um exemplo dessa condição patológica é proporcio-nado pelo diabetes mellitus bem como pelas doenças asso-ciadas com danos ao mitocôndrio, tais como ALS (escleroselateral amiotrópica) , doença de Alzheimer, doença de Pa-rkinson, a doença de Huntington (DH), certas cardiomiopa-tias, tais como aquelas de origem tóxica, causadas porálcool ou metais pesados, cardiomiopatia inflamatória oucausada por vírus ou cardiomiopatia auto-imune. Os deri-vados de hidroxilamina, cujas formas tautoméricas são re-presentadas pelas estruturas (i) e (II), podem ser usadosnesse método.
0 método da presente invenção pode ser usado notratamento de doenças tumorígenas, o método compreendendoa administração de uma quantidade efetiva de derivados dehidroxilamina ao organismo tumorígeno, a fim de prevenira formação ou o desenvolvimento de tumores. OS derivadosde hidroxilamina, cujas formas tautoméricas são represen-tadas pelas estruturas (i) e (II), podem ser usados nessemétodo.
4.3 COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E COSMÉTICAS CONTENDO OSDERIVADOS DE HIDROXILAMINA
Como já mencionado, a invenção também se refereao uso de derivados de hidroxilamina das fórmulas gerais(I) e (II), incluindo os seus estereoisômeros opticamenteativos, na preparação de composições farmacêuticas (e,opcionalmente, composições cosméticas) úteis no tratamen-to de doenças cardiovasculares, vasculares, alérgicas,imunes , auto-imunes, doenças causadas por infecção porvirus ou bacteriana, doenças tumorígenas, da pele e damucosa e doenças dos túbulos renais, provocadas por ten-são fisiológica, bem como aquelas condições causadas tam-bém por tensões fisiológicas, que podem ser tratadas porintervenção cosmética, em que as fórmulas (I) e (II) ouseus sais, incluindo os seus estereoisômeros opticamenteativos,
A é um alquil, alquil substituído, aralquil,aralquil substituído na metade aril e/ ou alquil, aril,aril substituído, heteroaril ou grupo heteroaril substi-tuído .
Z é uma ligação co-valente, oxigênio ou =NR3, emque R é selecionado do grupo que consiste de hidrogênio,um alquil, alquil substituído, aril, aril substituído,aralquil ou aralquil substituído na metade aril e/ ou nametade alquil,
R é um alquil ou alquil substituído,X no tautômero da fórmula (I) é halogêneo ou umhidroxi ou amino substituído, um grupo amino mono-substituído e amino di-substituído e
X no tautômero da fórmula (II) é oxigênio, iminoou grupo imino substituído e
R' é hidrogênio, um grupo alquil, alquil substi-tuído, aril, aril substituído, aralquil, aralquil tendometade aril e/ ou alquil substituído, acil ou acil subs-tituído .
e os compostos da fórmula (I) , opcionalmente,contêm estruturas de anéis intramoleculares, formadaspelo acoplamento de X e um substituinte reativo.
Através do uso desses compostos, composiçõespara fines preventivos e curativos podem ser preparadas,as quais, quando da administração ou aplicação em orga-nismo humano ou animal, podem ser úteis na prevenção ouno controle dos danos às células causados pelas doençasacima, assim, aliviando ou eliminando a condição patoló-gica do organismo.
Essas condições podem ser preparadas por métodosconhecidos por si na preparação de composições cosméticase farmacêuticas, através da mistura do material ativo edos veículos e/ ou auxiliares correspondentes. As compo-sições, de um modo geral, contêm 0,5 a 99,5 % em peso docomposto ativo. A quantidade de material ativo na compo-sição é determinada pela natureza e a gravidade da doen-ça, a idade do paciente e o modo de tratamento. Os deri-vados de hidroxilamina das fórmulas (I) e (II) podem serformulados em composições a serem usadas oral e parente-ralmente, bem como, topicamente.
A dose diária do composto ativo é cerca de 10 a500 mg/ kg, de preferência, 20 a 100 mg/ kg, que, especi-almente no caso de composições orais, é distribuída em 2- 3 administrações.Para fins de administração oral, as composiçõessão formuladas em drágeas, granulados, se desejado, solu-ção ou suspensão. As composições parenterais incluem sus-pensões aquosas e soluções estéreis injetáveis, enquanto as formas de administração retal são, entre outras, supo-sitórios, e as formas tópicas incluem pomadas, cremes,emulsões e géis.
Para preparar os tabletes, o ingrediente ativo émisturado com veículos adequados, tais como, gelatina de amido, lactose, estearato de magnésio, talco, goma arábi-ca e silicagel, a mistura é granulada e prensada em ta-bletes .
Na preparação de drágeas, uma mistura similar àacima é preparada a partir do ingrediente ativo e auxili-ares, a mistura é granulada, o granulado é prensado em umnúcleo, que é, então, revestido com açúcar, por exemplo,através do uso de uma solução aquosa, contendo açúcar, depolivinil pirrolidona.
Para a preparação das formas em cápsulas, o in- grediente ativo é misturado com auxiliares, tais como,amido, talco, sílica, celulose microcristalina e a mistu-ra é enchida em cápsulas duras ou moles de gelatina.
Essas composições orais podem ser completadascom aditivos que promovem ou retardam a absorção.
Xaropes ou elixires ou gotas podem ser prepara-dos através do uso, além do ingrediente ativo, de adoçan-tes, metil- ou propil- parabeno e, se desejado, aditivosde gosto, através da mistura da solução aquosa de ingre-diente ativo com os mesmos.
Para administração retal, supositórios podem serpreparados através do uso dos auxiliares adequados, taiscomo manteiga de cacau ou polietileno glicol.
Composições adequadas para administração paren-teral podem ser injeções preparadas através da dissoluçãodo em solução salina isotônica estéril, ou suspensõesaquosas, que podem ser preparadas através do uso de agen-tes dispersantes e umedecedores adequados, tais como,propileno glicol ou butileno glicol.
Os cremes e ungüentos para uso tópico podem serpreparados através do uso de álcoois primários ou secun-dários, tais como, álcool cetilico, álcool estearilico,glicerina, gorduras e óleos naturais, tais como, óleo deoliva, óleo de germe de trigo, lanolina, hidrocarbonetosmais longos, tais como, vaselina, bem como derivados decelulose. Essas composições podem, também, conter preser-vativos, tais como p-hidroxi benzoato de metil.
A composição para uso como cosméticos ou cosmé-ticos médicos pode ser preparada de maneira similar. Depreferência, os componentes lipofílicos são misturados dos componentes solúveis em água são dissolvidos em água,opcionalmente através de ligeiro aquecimento. Se deseja-do, o pH destes últimos é ajustado para o valor adequadoe a emulsão assim obtida é agitada até o resfriamento. 0ingrediente ativo é adicionado à mistura assim obtida, naforma de solução aquosa.
As composições farmacêuticas e cosméticas, quecontêm os novos derivados de hidroxilamina descritos emdetalhes no parágrafo 4.1. na presente especificação, po-dem ser preparadas de acordo com os processos abaixo. Es-sas composições também formam um objeto da invenção.
Uma concretização das composições farmacêuticase cosméticas de acordo com a invenção contém derivados dehidroxilamina de acordo com a fórmula (I) em uma quanti-dade de 0,5 a 99,5% em peso, junto com veículos e auxili-ares, em geral, usados nessas composições, em que:
a) X é halogêneo, de preferência, cloro ou bro-mo ;
Z é uma ligação química e
a1) A é um grupo da fórmula (a) , em que Y éhalo, alcoxi, um grupo nitro ou um grupo haloalquil e η é1, 2 ou 3; ou grupo heteroaril contendo 0-, de preferên-cia, furil, heteroaril contendo S-, de preferência, tie-nil, ou um grupo heteroaromático contendo N-, opcional-mente condensado com um anel de benzeno ou o derivado deN- alquil quaternário de C1-4, ou seu óxido de N, de pre-ferência, piridil, quinolil ou isoquinolil.R é um grupo da fórmula (b), em que R5 e R6, in-dependentemente um do outro, são H, um alquil reto ou ra-mificado, de preferência, um alquil com C1-4, ou cicloal-quil ou R5 e R6, juntamente com o átomo de nitrogênio aeles adjacente, formam um anel heterocíclico saturado com3 a 7 elementos, de preferência, 5 a 7 elementos, Y6 é -OR7 , em que R7 é H ou acil, de preferência, alquil carbo-nil, aril carbonil ou aminoacil substituído ou não subs-tituído, k é 1, 2 ou 3; e m é 1, 2 ou 3, ou um derivadode N- alquil quaternário de C1-4 ou seu óxido de N-, coma ressalva de que, quando A é piridil ou naftil, ou umgrupo da fórmula (a) , em que Y1 é halo ou alcoxi, entãoR7 é outro que não H, ou
a2) A é um grupo da fórmula (c ),
R é um grupo da fórmula (d) ; e os substituintesopcionais Y2 e Y3 , dos quais pelo menos um deve estarpresente na molécula, são oxigênio ou um alquil tendo de1 a 4 átomos de carbono; e k é 1, 2 ou 3; e m é 1, 2 ou 3e quando o composto é um cationte mono- ou bivalente, oanionte é um ou dois ions de haletos, de preferência, io-deto, ou
b) X é NR1 R2 , em que R1 e R2 , independentementeum do outro, são H, alquil reto ou ramificado não substi-tuído ou substituído, aril não substituído ou substituí-do, de preferência, fenil, aralquil substituído ou nãosubstituído, ou R1 e R2 , junto com o átomo de nitrogênioa eles adjacentes, formam um anel heterocíclico, contendode 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, contendo de 5 a7 elementos, que podem conter um ou mais átomos heteroadicionais.
A é aril não substituído ou substituído, de pre-ferência, fenil ou aralquil substituído ou não substitui-do;
Z é oxigênio ou =NR3 , em que R3 é H ou alquilsubstituído ou não substituído; e
R é um grupo da fórmula (b), em que R5 e R6, in-dependentemente um do outro, são H, alquil reto ou rami-ficado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6, quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, Y é H ou -OR ,R é H ou acil,
de preferência, alquil carbonil ou aril carbonil substi-tuído ou não substituído, k é 1, 2ou3emél, 2 ou 3.
c) X é -0Q, em que Q é alquil ou aralquil subs-tituído ou não substituído;
Z é oxigênio e
R é um grupo da fórmula (b), em que R5 e R6, in-dependentemente um do outro, são H, alquil reto ou rami-ficado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ou
R5 e R6 , quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, Y é H ou -OR , em que R é Hou acil, de preferência, alquil carbonil, aril carbonilou amino acil substituído ou não substituído, k é 1, 2 ou3emél, 2 ou 3.
d) A é aril não substituído ou substituído, depreferência, fenil ou um grupo heteroaromático contendoN-, de preferência, piridil ou um grupo heteroaromáticocontendo S-.
Z é uma ligação química,
X é -0Q, em que Q é alquil de C1-4 e
R é um grupo da fórmula (b), em que R5 e R6, in-dependentemente um do outro, são H, alquil reto ou rami-ficado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6, quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterociclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais pref erivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, Y6 é H, kél, 2 ou 3 e m é 1,2 ou 3.
Outro grupo das composições farmacêuticas e cos-méticas de acordo com a invenção inclui aqueles que, jun-to com os veículos farmacêutica e cosmeticamente aceitá-veis e/ ou auxiliares contêm em uma quantidade de cercade 0,5 a 99,5% em peso de um derivado de hidroxilamina dafórmula (I) ou os sais e/ ou os seus estereoisômeros op-ticamente ativos, em que
X é NR1R2, em que R1 e R2, independentemente umdo outro, são H, alquil reto ou ramificado não substituí-do ou substituído, alquil ou cicloalquil de C1- 5 ou R1 eR2, junto com o átomo de nitrogênio a eles adjacentes,formam um anel hetero saturado, contendo de 3 a 7 elemen-tos, mais preferivelmente, contendo de 5 a 7 elementos.
A é um aralquil substituído ou não substituído,de preferência, fenil alquil substituído por um ou maishalo, alquil ou haloalquil, acilamino ou nitro ou um gru-po hetero aromático contendo N-, não substituído ou subs-tituído, que é, opcionalmente, condensado com um anel debenzeno, de preferência, pirrolil, piridil, isoquinolilou quinolil ou um grupo hetero aril contendo S-, de pre-ferência, tineil, em que os grupos heteroaril podem terum ou mais substituintes, de preferência, um ou mais al-quil, mais preferivelmente, alquil de C1-4,Z é uma ligação química eR é um grupo da fórmula (e) , em que R e R , m-
dependentemente um do outro, são H, alquil reto ou rami-ficado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6, quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, que podem conter átomos heteroadicionais e podem ter substituinte(s), de preferência,alquil de C1-4, Y4 é H ou alquil de C1-4 não substituídoou substituído, Y é H, alquil de C1-4 não substituído ousubstituído ou -OR , em que R é H ou acil, k é 1, 2 ou 3e m é 1, 2 ou 3 com a condição de quequando A é fenil não substituído ou fenil subs-tituído por halo ou alcoxi ou fenil alquil substituídopor alcoxi ou um grupo piridil e R ''e H, pelo menos umdentre R e R é outro que não H, e
quando A é fenil não substituído ou fenil subs-tituído por halo ou alcoxi ou fenil alquil substituídopor alcoxi ou um grupo piridil e R e R são H, R é ou-tro que não H.
Outro grupo das composições farmacêuticas e cos-méticas de acordo com a invenção inclui aqueles que, jun-to com veículos e/ ou auxiliares farmacêutica e cosmeti-camente aceitáveis contêm uma quantidade de cerca de 0,5a 99,5 % em peso de um derivado de hidroxilamina da fór-mula (II) ou seus sais e/ ou estereoisômeros opticamenteativos, em que
a) X é oxigênio.
A é alquil reto ou ramificado de Cl-4 , aril nãosaturado ou saturado, de preferência, fenil ou halo- al-quil fenil, aralquil substituído ou não substituído, naf-til ou um grupo heteroaromático contendo N-, de preferên-cia, piridil,
Z é uma ligação química,
R' é H, alquil ou aralquil de C1-4, de preferên-cia, fenil alquil e
R é um grupo da fórmula (b), em que R5 e R6, in-dependentemente um do outro, são H, alquil reto ou rami-ficado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6 , quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, Y6 é H ou -OR7 ,R7 é H, k é 1,2 ou 3 e m é 1, 2 ou 3, com a condição de que, quando A éoutro que não alquil e R1 é H, Y6 seja H, ou
b) X é =NR4 , em que R4 é H, alquil não substitu-ído ou substituído, ou aril não substituído ou substituí-do, de preferência, fenil alquil;
A é um alquil não substituído ou substituído ouaril não substituído ou substituído, de preferência, fe-nil ou fenil substituído, ou aralquil substituído ou nãosubstituído, de preferência, fenil alquil ou cicloalquil,
Z e uma ligação química, oxigênio ou =NR3 , emque R3 é H ou alquil substituído ou não substituído;
R' é alquil substituído ou não substituído ouaril não substituído ou substituído, de preferência, fe-nil ou aralquil substituído ou não substituído, de prefe-rência, fenil alquil; e
R é um grupo da fórmula (b), em que R5 e R6, in-dependentemente um do outro, são H, alquil reto ou rami-ficado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6, quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, Y é H ou -OR ,R é H ou acil,de preferência, alquil carbonil ou aril carbonil substi-tuído ou não substituído, kél, 2 ou 3 e m é 1, 2 ou 3,ou
c) X é oxigênio;
A é um alquil substituído ou não substituído,aralquil substituído ou não substituído, de preferência,fenil alquil;
Zé oxigênio;
R' é alquil ou aralquil, de preferência, fenilalquil;
R é um grupo da fórmula (b), em que R e R , in-dependentemente um do outro, são H, alquil reto ou rami-ficado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6, quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, Y6 é H ou -OR7 ,R7 é H ou acil,de preferência, alquil carbonil ou aril carbonil substi-tuído ou não substituído, kél, 2ou3emél, 2 ou 3;ou
d) X é oxigênio;
Z é =NH; e
dl) A é um alquil substituído ou não substituí-do, cicloalquil, aralquil substituído ou não substituído,de preferência, fenil alquil, fenil não substituído oufenil substituído com halo, haloalquil, alcoxi ou nitro;
R' é alquil ou aralquil, de preferência, fenilalquil; e
R é um grupo da fórmula (b), em que R5 e R6, in-dependentemente um do outro, são H, alquil reto ou rami-ficado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R61 quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, Y6 é H ou -0H, kél, 2 ou 3 em é 1, 2 ou 3; ou
d2) A é um grupo da fórmula (a), em que Y é ha-loalquil, de preferência, trifluorometil e η é 1, 2 ou 3;
R' é H e
R é um grupo da fórmula (b), em que R5 e R6, in-dependentemente um do outro, são H, alquil reto ou rami-ficado, de preferência, alquil de C1-4 ou cicloalquil, ouR5 e R6 , quando tomados junto com o átomo de nitrogênio aeles anexados, formam um anel heterocíclico saturado,contendo de 3 a 7 elementos, mais preferivelmente, con-tendo de 5 a 7 elementos, Y6 é H ou -0H, k é 1, 2 ou 3 em é 1, 2 ou 3.
Outro grupo das composições farmacêuticas e cos-méticas de acordo com a invenção inclui aqueles que, jun-to com os veículos e/ ou auxiliares farmacêutica e cosme-ticamente aceitáveis contêm uma quantidade de cerca de0,5 a 99,5% em peso de um derivado de hidroxilamina dafórmula (I") ou seus sais e/ ou estereoisômeros optica-mente ativos, em que
A é um fenil não substituído ou fenil substituí-do por halo ou nitro ou um grupo heteroaril contendo N-,de preferência, piridil;R' é H e
R" é um grupo ra-amino - alquil, que pode sermono ou di-substituído, em que a cadeia de alquil contémde 1 a átomos de carbono e os amino- substituintes, inde-pendentemente um do outro, são um ou dois alquil ou ci-cloalquil reto ou ramificado, ou em que os dois substi-tuintes amino, junto com o átomo de N- adjacente aos mes-mos, formam um anel heterocíclico, contendo de 3 a 7 ele-mentos, mais preferivelmente, contendo de 5 a 7 elemen-tos, ou o seu derivado de N- alquil quaternário de C1^,com a condição de que
quando A é piridil, R" é outro que não 1-piperidinil metil.
As concretizações da invenção estão ilustradasnos exemplos seguintes em mais detalhes. Deve ser compre-endido, porém, que o escopo de proteção não está limitadoàs concretizações especificas apresentadas nos Exemplos.
5. EXEMPLOS DE PRODUTOS QUÍMICOS E DE COMPOSIÇÃO
Exemplo 1:
Monoidrocloreto de cloreto de N- [2- hidroxi -3- (1- pi-peridinil) propoxi] -2- tiofeno carboximidoil
5,0 g (15,6 mmol) de monoidrocloreto de N-[2-hidróxi-3-(1-piperidinil)propoxil]-2-tiofenocarboximida-mida (Exemplo 44) foram dissolvidos em 19 ml de água, en-tão, 6,1 ml de ácido clorídrico concentrado foram adicio-nados. A solução foi resfriada para -5°C, a seguir, umasolução fria de 4,4 g (63,8 mmol) de nitrito de sódio em2,4 ml de água foi adicionada gota a gota. Por toda a re-ação, a temperatura interna foi mantida em 0°C. Quando aadição foi completada, a mistura foi agitada por mais umahora. Benzeno frio (60 ml) foi adicionado e a mistura foitornada alcalina com adição lenta de uma solução fria de3,2 g (80 mmol) de hidróxido de sódio em 45 ml de água. Afase orgânica foi separada e lavada, sucessivamente, comporções de 20 ml de água até o pH<9 (3-5 vezes). A so-lução orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro,tratada com carvão vegetal, filtrada e evaporada em vácuo(t < 45°C) a fim de proporcionar 2,6 g de óleo. Esse re-síduo foi dissolvido em 5 ml de álcool isopropilico eacidifiçada (pH 2) com álcool isopropilico contendo ácidoclorídrico seco. O produto foi cristalizado a partir den-hexano, para proporcionar um material acinzentado.Rendimento: 2,0 g (38%)Ρ. f. : 115 - 123 °C
Seguindo ο processo descrito no exemplo anteri-or, os seguintes compostos foram preparados:
Exemplo 2
Monoidrocloreto de cloreto de N- [2- hidroxi -3- (1- pi-peridinil) propoxi] -1- isoquinolina carboximidoil
Material de iniciação: Exemplo 46
Rendimento: 48%
P. f. : 168 - 172°C
IR (KBr): 3425, 3128, 2947, 2866, 2650, 2540,1622, 1597, 1556, 1452, 1385, 1364, 1329, 1296, 1281,1240, 1117, 1092, 1024, 1015, 978, 953, 903, 881, 795,743, 718, 658, 559 cm-1.
Exemplo 3:
(Z)-2-butenodioato de cloreto de N-Monoidrocloreto decloreto de N-[2-hidróxi-3-(1-piperidinil) propoxi]-3-quinolina carboximidoil (1:1)
Material de iniciação: Exemplo 42
Nesse caso, o produto final foi isolado no finaldo procedimento de preparação através da dissolução dabase crua em acetona e adição de uma quantidade equiva-lente de ácido maléico,
Rendimento: 67%
P.F.: 159 - 162 °C
IR (KBr): 3427, 3019, 2947, 2886, 2689, 1583,1477, 1450, 1352, 1293, 1221, 1194, 1132, 1072, 1045,939, 919, 872, 833, 754, 650, 557 cm-1.
Exemplo 4:Monoidrocloreto de cloreto de N-[2-hidróxi-3-(1-piperidinil) propoxi]-3-nitro-benzeno carboximidoil
Material de iniciação: Exemplo 40
Rendimento: 5 8%
P. f.: 185 - 189 ºC
Exemplo 5:
Monoidrocloreto de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil)propoxi]-4-nitro-benzeno carboximidoil
Material de iniciação: Exemplo 43
Rendimento: 47%
P. f.: 180 - 182 ºC
IR (KBr): 3331, 2953, 2853, 2735, 2654, 2577,2548, 1605, 1568, 1516, 1456, 1348, 1262, 1165, 1119,1072, 1059, 1007, 960, 933, 862, 849, 754, 719, 690, 673,15 581, 550, 478 cm-1.
Exemplo 6:
Monoidrocloreto de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil)propoxi]-2-nitro-benzeno carboximidoil
Material de iniciação: Exemplo 45
Rendimento: 50%
P . F.: 159 - 162 ºC
IR (KBr): 3298, 2983, 2932, 2746, 1593, 1574,1535, 1445, 1391, 1354, 1317, 1288, 1242, 1198, 1117,1092, 1069, 1020, 968, 947, 914, 852, 793, 756, 708, 577cm -1.
Exemplo 7:
Monoidrocloreto de cloreto de N- [2- hidroxi -3- (1- pi-peridinil) propoxi] -2- furano carboximidoilProcedimento:
l-Cloro-2-hidroxi-3-(1-piperidinil)-propano [J.Org. Chem. 33 (2) p. 523 - 30 (1968)] (3,0 g; 116,9 mmol)foi dissolvido em água (1,8 ml). NaOH sólido (1,19 g;29,8 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada em tem-peratura ambiente durante 1 hora. N- Hidroxi -2- furanocarboximidamida (19,2 g; 15,2 mmol) foi adicionada e amistura foi mantida em agitação em temperatura ambientedurante a noite. HCl concentrado (2,1 ml) foi adicionadopara ajustar o pH para, aproximadamente, 4 e a soluçãofoi evaporada em vácuo até a secura.
0 resíduo (5,4 g) foi dissolvido em cc. de HCl(37 ml) , resfriado para 0 - 5 0C e uma solução aquosa deNaNO2 (5,6 g; 80 mmol em 23 ml de água) foi adicionada,gota a gota, em 30 minutos. A solução foi tornada alcali-na através da adição de solução de 2N de NaOH (102 ml)para um pH = 10 e extraída com acetato de etil (2 χ 130ml) . As fases orgânicas combinadas foram lavadas comágua, secas sobre Na2SÜ4 anidro e evaporadas. 0 resíduo(2,0 g) foi redissolvido em um pequeno volume de acetatode etil (20 ml) e o produto foi precipitado por meio deadição de solução isopropanólica de HCl (3,2 N. 3 ml) . 0precipitado branco obtido foi filtrado, lavado e, final-mente, recristalizado do isopropanol.
Rendimento: 11 %P. F.: 139 - 141 °CIR (KBr) : 3427, 3267, 3094, 2955, 2922, 2964,2745, 1637, 1584, 1479, 1452, 1391, 1319, 1281, 1259,1157, 1117, 1074, 1024, 999, 980, 943, 887, 854, 843,743, 710, 596 cm-1.
Em seguida ao processo descrito no exemplo ante-rior, o seguinte composto foi preparado:
Exemplo 8:
(Z) -2- Butenodioato de cloreto de N- [2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -4- piridina carboximidoil (1: 1)
Nesse caso, o produto final foi isolado no finaldo procedimento de preparação através da dissolução dabase crua em acetona e adição de uma quantidade equiva-lente de ácido maléico.
Rendimento: 25%
P. f.: 165,5 - 169 °C.
Exemplo 9:
Monoidrocloreto de cloreto de N- [3- [dimetil etil) ami-nol -2- hidroxi propoxi -3- trifluoro metilbenzeno car-boximidoil
Procedimento:
50 g (0,245 mol) de m-trifluoro metil - benzami- doxima e 3 3,7 g (0,6 mol) de hidróxido de potássio foramdissolvidas em uma mistura de sulfóxido de dimetil e 170ml de água e a mistura foi resfriada para 0 °C. 48 ml(0,6 mol) de epicloroidrina foram adicionados e a misturada reação foi agitada em 0 ºC durante 5 horas, a seguir, mantida em um refrigerador durante a noite. No dia se-guinte, 250 ml de água foram adicionados e a mistura foiextraída com acetato de etil (4 χ 250 ml). As fases orgâ-nicas combinadas foram lavadas com água, secas, tratadascom carvão vegetal e evaporadas até a secura, a fim deproduzir m-trifluoro metil -N- (2,3- epoxipropoxi)- ben-zamida, como um óleo incolor.
Rendimento: 61 g (96 %)
Ao óleo obtido, 400 ml de 18% de solução de áci-do clorídrico e 60 ml de éter foram adicionados e a mis-tura foi resfriada para -5 °C, durante agitação. 17,4 g(0,25 mol) de nitrito de sódio, dissolvido em 60 ml deágua, foram adicionados, lentamente, em 40 minutos e amistura da reação foi agitada por mais 20 minutos. A mis-tura foi extraída, então, com éter (2 χ 160 ml) e as fa-ses orgânicas combinadas foram lavadas com água duas ve-zes. À solução etereal, 340 ml de 20 % de hidróxido desódio foram adicionados e o sistema bifásico foi submeti-do a refluxo durante 1 hora, durante agitação. As fasesforam, então, separadas, a camada orgânica foi lavada comsalmoura até ficar neutra, secas e evaporadas até a secu-ra, a fim de proporcionar cloreto de m-trifluoro metil -N- (2,3-epoxi propoxi)- benzimidoil, como um óleo inco-Lor.
Rendimento: 30,5 g (45 %)
Uma mistura de 1,19 g (4,2 mmol) de cloreto deN-[(2,3- epoxi) propoxi] -3- trifluorometil - benzenocarboximidoil e 0,89 ml (8,5 mmol) de butilamina- terc.,em 12 ml de álcool isopropílico, foi submetida a refluxodurante 2 horas. 0 solvente foi removido sob pressão re-duzida. O resíduo foi dissolvido em acetato de etil e0,98 ml de solução de cloreto de hidrogênio metanólico(4,3 Ν) foi adicionado e a mistura foi concentrada em umpequeno volume sob vácuo, a seguir, diluída com éter. 0precipitado que se formou foi recuperado, lavado com éterfrio e seco.
Rendimento: 0,48 g (32%)
P. f.: 150 - 153 0C
IR (KBr) : 3423, 3233, 2978, 2880, 2784, 1620,1570, 1479, 1441, 1400, 1383, 1340, 1238, 1167, 1128,1101, 1072, 1038, 982, 930, 897, 804, 787, 714, 694 cm"1.
Em seguida ao processo descrito no exemplo ante-rior, os seguintes compostos foram preparados:
Exemplo 10:
Monoidrocloreto de cloreto de N- [2- hidroxi -3- (1- me-til etil) amino] propoxi] -3- trifluoro metil - benzeno -carboximidoil
Rendimento: 30 %
P. F.: 105 - 108 °C
IR (Kbr): 3358, 2984, 2883, 2804, 1595, 1441,1383, 1335, 1238, 1184, 1171, 1121, 1099, 1074, 1011,995, 947, 906, 891, 798, 779, 696, 681, 567 cm"1.
Exemplo 11:
Monoidrocloreto de cloreto de N-[3-(cicloexil amino)-2-hidroxi propoxi]-3-triflúormetil-benzeno-carboximidoil
Rendimento: 3 5 %
P. F.: 147 - 149,5 °C
IR (KBr): 3381, 2951, 2860, 2820, 1580, 1439,1344, 1246, 1164, 1126, 1099, 1074, 1003, 986, 932, 903,872, 802, 787, 716, 692, 681, 648 cm-1.Exemplo 12:
Monoidrocloreto de cloreto de N-[3-(dietil amino)-2-hidroxi propoxil -3-trifluormetil-benzeno-carboximidoil
Rendimento: 21 %
p.f.: 121 - 128 °C
IR (KBr) : 3425, 3289, 2951, 2667, 1818, 1443,1337, 1238, 1178, 1115, 1078, 1049, 997, 910, 804, 781,696, 683 cm-1.
Exemplo 13:
Monoidrocloreto de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil) propoxi]-3-trifluormetil-benzeno-carboximidoil
Rendimento: 13 %
p.f.: 119 - 123 °C
IR (KBr) : 3366, 2937, 2854, 2737, 2673, 2538,1616, 1570, 1439, 1404, 1337, 1290, 1236, 1199, 1165,1129, 1101, 1074, 1030, 984, 972, 933, 901, 829, 804,788, 717, 699, 685, 646 cm-1.
Exemplo 14:
Cloreto de N- [2- hidroxi -3- (piperidin -1- óxido -1-il) propoxi] -N' -oxi -3- piridina carboximidoil
Procedimento:
A uma solução de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil) propoxil]-3-piridina carboximidoil (5,0 g;17,1 mmol) em clorofórmio (50 ml) ácido m-cloroperbenzóico (7,0 g; 40 mmol) foi adicionado em pe-quenas porções e a mistura foi agitada em temperatura am-biente durante 2 horas. 0 solvente foi removido, o resí-duo foi dissolvido em 80 ml de acetato de etil, extraídocom água, seco e evaporado. O produto oleoso obtido foi,finalmente, cristalizado com acetona a fim de proporcio-nar o produto como um sólido acinzentado.
Rendimento: 2,21 g (6,7 mmol; 40%)p. f.: 140 - 142°C
IR (KBr): 3437, 3071, 2943, 2880, 2590,1801,1578, 1475, 1454, 1433, 1375, 1294, 1259, 1194, 1165,1121, 1088, 1043, 1011, 995, 924, 905, 888, 845, 808,710, 671, 554, 513, 413 cm"1.
Exemplo 15:
Cloreto de N-[2-hidroxi-3~(piperidin-l-óxido-l-il) propo-xil-3-piridina carboximidoil
Procedimento:
A uma solução de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil) propoxil]-3-piridina carboximidoil (2,0 g;6,8 mmol) em clorofórmio (50 ml) ácido m-cloroperbenzóico(1,6 g; com 70 % de pureza; 6,5 mmol) foi adicionado e amistura foi agitada em temperatura ambiente durante 30minutos. A solução foi tornada alcalina com 10% de solu-ção de hidróxido de sódio, a seguir, separada e a camadaorgânica foi lavada com salmoura, seca e evaporada. O re-síduo sólido foi recristalizado com acetato de etil, oprecipitado foi filtrado, lavado e seco, a fim de propor-cionar o produto como um sólido branco.
Rendimento: 1,03 g (48 %)
p.f.: 127 - 130°C
IR (KBr) : 3454, 2988, 2945, 2880, 2585, 1585,1512, 1479, 1443, 1416, 1693, 1350, 1331, 1289, 1183,1134, 1072, 1051, 1030, 997, 95,, 939, 879, 847, 808,702, 519, 419 cm-1.
Exemplo 16:
Diiodeto de cloreto de N-[2-hldroxi-3-(1-metil-l-piperi-dinium-1-il)propoxi]-N-metil-piridinium-3-carboximidoil
Procedimento:
Uma mistura de cloreto de N- [2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (1,0 g;3,4 mmol) e 1,2 ml (20 mmol) de iode to de metil foi sub-metida a refluxo em acetona (10 ml) sob nitrogênio, du-rante 2 horas. 0 precipitado amarelo escuro resultantefoi filtrado e lavado com acetona, a fim de proporcionaro produto cru (1,8 g) , que foi, então, recristalizado de20 ml de etanol.
Rendimento: 1,2 g (60 %)
p.f.: 153 - 157 °C
IR (KBr) : 3462, 3406, 3317, 3040, 2941, 2878,2831, 1829, 1636, 1589, 1504, 1462, 1378, 1350, 1290,1209, 1171, 1121, 1069, 1047, 1030, 1001, 941, 897, 868,818, 706, 673, 635, 589 cm-1.
Exemplo 17:
(Z)-2- Butenodioato de cloreto de N- Γ2- acetoxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (1: 1)
Procedimento:
1,48 g (5, o mmol) de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil) propoxi]- 3-piridina carboximidoil foidissolvido em 5 ml de anidrido acético. A temperatura dareação foi elevada para 40 °C. Após 30 minutos em tempe-ratura ambiente, o solvente foi completamente removido invacuum , o resíduo foi dissolvido em 30 ml de éter dietí-lico, tratado com carvão vegetal, filtrado e o solventefoi removido sob pressão reduzida a fim de proporcionar1,74 g de óleo colorido de laranja.
O resíduo foi dissolvido em 10 ml de acetona euma solução de 0,6 g (5,17 mmol) de ácido maléico em 10ml de acetona foi adicionada. O produto cristalino foiremovido por filtração e lavado com acetona, a fim deproporcionar 1,43 g de material acinzentado. A recrista-lização, com descoloração, de 9 ml de álcool isopropílicoproduziu o composto do título.
Rendimento: 1,22 g (54 %)p.f.: 143 - 144 °C
Exemplo 18:
(Z)-2-Butenodioato de cloreto de (S)-N-Í2-Í2-R(1,1-dimetil etil carbonil amino)-3-fenil propioniloxil]-3-(1-piperidinil) propoxi]-3-piridina carboximidoil (1: 1)Procedimento:
6,7 g (25,5 mmol) de N-(butoxicarbonil-terc.) -D-fenilalanina foram dissolvidos em 50 ml de diclorometa-no. A solução foi resfriada para 0 °C e 4,0 ml de trieti-lamina e, a seguir, 2,5 ml (26 mmol) de cloroformato deetil foram adicionados gota a gota. A mistura foi agitadadurante 20 minutos em 0 °C, a seguir, uma solução de 7,5g (26 mmol) de cloreto de N- [2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil, em 50ml de diclorometano foi adicionada em 30 minutos. A mis-tura da reação foi agitada em temperatura ambiente duran-te 1 hora. A solução foi extraída primeiro com 10% deácido acético (2 χ 100 ml), a seguir, com água, seca comsulfato de sódio anidro e evaporada até a secura. 0 resí-duo (10,7 g) foi dissolvido em 71 ml de acetona e 1,53 g(13 mmol) de ácido maléico foi adicionado. 0 sólido re-sultante foi filtrado e lavado com acetona.
Rendimento: 4,0 g (6,0 mmol: 23 %)P.f.: 146,5 - 148 0C
[a]d = + 21,5 0C (c = 1. MeOH)
IR (KBr) : 3393, 2978, 1744, 1697, 1582, 1518,1468, 1454, 1420, 1381, 1358, 1313, 1290, 1256, 1213,1169, 1126, 1099, 1084, 1045, 1016, 930, 908, 870, 750,690, 575, cm"1.
Em seguida ao processo descrito no exemplo ante-rior, os seguintes compostos foram preparados:
Exemplo 19:
(Z) -2- Butenodioato de cloreto de R-N-[2-[2-(S) - (1,1-dimetil etiloxi carbonilamino) -3- fenil propioniloxil] -
3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoilRendimento: 25 %
Esse composto tem os mesmos dados físicos (P.f.; IR) conforme escrito no Exemplo 18.[a]d = -23,6 ° (c = 1. MeOH)
Exemplo 20(Z)-2- butenodioato de N-[2- benzoiloxi -3-(l- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidamida (1:1)Procedimento:
20,9 g (75,0 irariol) de N- [2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidamida [patente húngara 177.578 (1976)] foram dissolvidos em 300ml de benzeno. A essa solução , 150 ml de uma solução de1 N de hidróxido de sódio foram adicionados, seguido poradição, gota a gota, de 19,5 ml (168 mmol) de cloreto debenzoil . Após a agitação da mistura, intensamente, por 2 horas, 7,1 g (67 mmol) de carbonato de sódio e um outraporção de cloreto de benzoil (9,75 ml; 84 mmol) foi adi-cionada e a agitação foi continuada durante a noite. Asfases foram, então, separadas, a camada orgânica foi ex-traída com uma solução de 1 N de hidróxido de sódio e água, secas e evaporadas até a secura. O resíduo (41 g deóleo) foi dissolvido em 150 ml de acetona e 8,7 g (75mmol) de ácido maléico foram adicionados. O precipitadoobtido foi filtrado, lavado com acetona e seco.
Rendimento: 29,1 g (78 %)p.f.: 194 - 195 ºC
Em seguida ao processo descrito no exemplo ante-rior, o seguinte composto foi preparado:
Exemplo 21:
(Z)-2- butenodioato de N-[2- benzoiloxi -3-(l- piperidi- nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (1:1)
Material de iniciação : a patente norte-americana 5.147.879 (1992)Rendimento: 64 %ρ.f.: 134 - 136 °C
IR (KBr): 2955, 2939, 2517, 1718, 1583, 1477,1452, 1410, 1370, 1354, 1317, 1268, 12069, 1173, 1117,1057, 1043, 998, 968, 939, 903, 870, 748, 723, 714, 652,582 cm-1.
Exemplo 22:
Monoidrocloreto de N-[2- palmitoiloxi -3-(1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidamida
Procedimento:
14,7 g (52,8 mmol) de N- [2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidamida[patente húngara 177.578 (1976)] foram dissolvidos em 160ml de clorofórmio. 7,7 ml (55 mmol) de trietilamina foramadicionados, seguido por adição, gota a gota, de uma so-lução de cloreto de palmitoil (14,7 g: 56,5 mmol) em 85ml de clorofórmio. A mistura foi agitada durante a noiteem temperatura ambiente. No dia seguinte, nova quantidadede 3,8 ml de trietilamina e 7,4 g de cloreto de palmitoilforam adicionados e a agitação foi continuada por mais umdia. A solução foi extraída, então, com água, 5 % de áci-do acético e água, sucessivamente, seca sobre sulfato desódio anidro e evaporada até a secura. O resíduo (28,2 gde óleo) foi dissolvido em acetato de etil e o produtofoi precipitado através da adição de 30 ml de IN de HCl/acetato de etil. 0 precipitado espesso, branco, foi fil-trado, lavado com acetato de etil e seco.
Rendimento: 10,9 g (37 %)
p.f.: 110 - 113 0CEm seguida ao processo descrito no exemplo ante-rior, os seguintes compostos foram preparados:
Exemplo 23
Diidrocloreto de cloreto de N-[2-palmitoiloxi-3-(1-pi-peridinil)propoxi]-3-piridina carboximidoil
Material de iniciação: a patente norte-americana5.147.879 (1992)
Nota: a reação foi realizada por meio de refluxo.Rendimento: 72 %p.f.: 69 - 73,5 °C
IR (KBr) : 3425, 2922, 2853, 2648, 2544, 1742,1632, 1468, 1416, 1377, 1287, 1183, 1113, 1087, 1032,984, 708, 675 cm"1.
Exemplo 24:
(Z)-2- butenodioato de N-[2- furoiloxi -3-(1 - piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidamida (1:1)Nota: o produto foi isolado na forma de sal de maleato.Rendimento: 52 %p.f.: 167 - 171,5 °CExemplo 25:
Monoidrocloreto de N-[2- clorobenzoiloxi -3-(1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidamidaNota: a reação foi realizada por meio de refluxo.Rendimento: 50 %p.f.: 91 - 94 °C
Exemplo 26:
Monoidrocloreto de N-[2- metoxibenzoiloxi -3- (1- piperi-dinil) propoxi] -3- piridina carboximidamidaNota: a reação foi realizada por meio de refluxo.Rendimento: 71 %p.f.: 152 - 155°C
Exemplo 27:
Monoidrocloreto de N-[2- (m- trifluorometil benzoiloxi -3-(l- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidamidaNota: a reação foi realizada por meio de refluxo.Rendimento: 45 %p.f.: 144 - 147°C
Exemplo 28:
(Z)-2- butenodioato de N-[2-(2- tenoiloxi -3-(l- piperi-dinil) propoxi1 -3- piridina carboximidamida (1:1)Nota; a reação foi realizada por meio de refluxo e oproduto foi isolado na forma de sal de maleato.Rendimento: 58 %p. f.: 168 - 176 °C
Exemplo 29:
Monoidrocloreto de N-Γ2- acetoxi -3-(l- piperidinil) pro-poxi] -3- piridina carboximidamidaProcedimento:
2,5 g (9,0 mmol) de N- [2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidamida foramdissolvidos em 27 ml de clorofórmio, 1,6 g (16 mmol) deanidrido acético foi adicionado e agitado em temperaturaambiente durante 1 hora. A mistura da reação foi evapora-da até a secura e dissolvida em álcool isopropilico, con-tendo a quantidade equimolar (9 mmol) de cloreto de hi-drogênio seco. A solução foi resfriada e o sólido foifiltrado. A recristalização de álcool isopropílico pro-porcionou um composto branco, cristalino.Rendimento: 1,9 g (59 %)p.f.: 107 °C
Exemplo 30:
(Z)-2- butenodioato de N-[2-(3- piridina carboniloxi) -3-(1- piperidinil) propoxil -3- piridina carboximidamida(1:1)
Procedimento:
A uma solução de N- [2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidamida (1,68g; 6 mmol) em piridina seca, 1,68 g (7,4 mmol) de anidri-do nicotinico foi adicionado e mantido em temperatura am-biente durante a noite. A mistura foi evaporada, o resí-duo foi dissolvido em 30 ml de acetato de etil, filtrado,o filtrado foi extraído com solução de NaHCC>3 a 10 %,seco e evaporado. O óleo obtido foi dissolvido em 20 mlde acetona e 0,53 g de ácido maléico foi adicionado pararesultar em precipitação. O produto foi filtrado e lavadocom acetona.
Rendimento: 1,84 g (61 %)p.f.: 157 - 160 °C
Exemplo 31:
Diidrocloreto de N-f-3-(l- piperidinil) propoxi] -3- pi-ridina carboximidamida
Procedimento:
2,86 g (51,1 mmol) de hidróxido de potássio fo-ram dissolvidos em 20 ml de etanol abs., então, 6,45 g(47,0 mmol) N-hidroxi -3- piridina carboximidamida e 7,7g (47,7 itimol) de 1-cloro- 3- (1 - piperidinil) - propanoforam adicionados e submetidos a refluxo durante 9 horas.0 sólido foi removido através de filtração e o filtradofoi evaporado. 0 produto cru foi dissolvido em 100 ml declorofórmio, lavado com solução de 1 N de hidróxido desódio, a seguir, três vezes com água. A camada orgânicafoi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e o solventefoi evaporado sob pressão reduzida. 0 resíduo foi dissol-vido em uma pequena quantidade de etanol abs. e álcoolisopropílico, contendo ácido clorídrico seco foi adicio-nado (pH 2) a fim de proporcionar cristais acinzentados.
Rendimento: 4,8 g (38 %)
p.f.: 95 - 100 0C (dec.)
IR (KBr): 3422, 3294, 3107, 2984, 2937, 2870,
2818, 1649, 1616, 1593, 1479, 1462, 1441, 1381, 1309,
1194, 1123, 1094, 1059, 1042, 982, 910, 858, 816, 712,
559 cm-1
Em seguida ao processo descrito no exemplo ante-rior, os seguintes compostos foram preparados;
Exemplo 32:
Monoidrocloreto de Ν-Γ-3-(1- piperidinil) propoxi] -3-trifluorometil - benzeno carboximidamida
Rendimento: 42 %
p.f.: 116 - 119 0C
IR (KBr, base): 3412, 3082, 2949, 2827, 1655,1485, 1447, 1383, 325, 1283, 1174, 1121, 1094, 1072, 986,920, 905, 808, 70, 677, 627 cm-1.Exemplo 33:
Diidrocloreto de N-[-3-(1- piperidinil) propoxi] -3,4-dimetoxi fenil) metano carboximidamidaRendimento: 35 %p.f.: 207 - 209 °C
Exemplo 34:
N-[-2.2-dimetil-(1-piperidinil) propoxi]-3-piridina-carboximidamida
Rendimento: 38 % (óleo)
IR (KBr) : 3323, 2935, 2888, 2785, 1637, 1477,1393, 1360, 1157, 1111, 1057, 995, 943, 860, 814, 789,708, 627 cm"1.
Exemplo 35:
Monoidrocloreto de Ν-[-3-(4- metil -1- piperidinil) pro-poxi 1 -3- piridina carboximidamidaRendimento: 23 %
p.f.: 127 - 130 °C
IR (KBr) : 3387, 2947, 2878, 2802, 1730, 1639,1450, 1389, 1293, 1242, 1194, 1150, 1083, 1015, 964, 933,814, 710 cm"1.
Exemplo 36:
Monoidrocloreto de N-[-3-(1- piperidinil) propoxi] -3-nitro - benzeno carboximidamida
Rendimento: 51 %
p.f.: 158 - 162 °C
Exemplo 37:
Diidrocloreto de N-[-3-(1- piperidinil) propoxi] -benzeno
carboximidamidaRendimento: 64 %
ρ.f.: 207 - 209 °C
Exemplo 38:
N-[2- hidroxi -3- [(1- piperidinil) propoxl] -2,4,6- tri-metll - benzeno carboximidamida
Rendimento: 44 %
P. f. : 199 - 201 °C
IR (KBr) : 3410, 3103, 2943, 2912, 2814, 2791,1634, 1582, 1441, 1383, 1350, 1321, 1304, 1254, 1204,1146, 1111, 1099, 1065, 993, 878, 851, 785, 754, 525cm-1
Exemplo 39:
Monoidrocloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) pro-poxi] -4- acetamino - benzeno carboximidamida
Rendimento: 25 %
p.f.: 133 - 137 °C
Exemplo 40:
Diidrocloreto de N-[2- hidroxi -3-(l- piperidinil) propo-xi] 3- nitro -benzeno carboximidamida
Rendimento: 38 %
p.f.: 190 - 193°C
Exemplo 41:
Monoidrocloreto de N-[2- hidroxi -3-[(1- piperidinil)propoxil -2-(1,5- dimetil) - pirrol carboximidamida
Rendimento: 2o %
p.f.: 144 - 147 °C
IR (KBr, base): 3458, 3369, 2930, 2849, 1622,1587, 1502, 1468, 1437, 1396, 1354, 1323, 1279, 1254,1200, 1157, 1115, 1078, 1042, 988, 962, 930, 870, 856,758, 694, 609 cm-1.
Exemplo 42:
Diidrocloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propo-xi] 3- quinolina carboximidamida
Rendimento: 36 %
p. f. : 210 - 211 °C
Exemplo 43:
Diidrocloreto de N-[2- hidroxi -3-(l- piperidinil) propo-xi] 3- nitro- benzeno carboximidamida
Rendimento: 77 %
p.f.: 184 - 189 °C
Exemplo 44:
Diidrocloreto de N-[2- hidroxi -3-(l- piperidinil) propo-xi] -2- tiofeno carboximidamida
Rendimento: 73 %
p.f.: 157 - 170 °C
IR (KBr): 3280 (b), 2940, 1655, 1420, 1120,1018, 1002, 857, 710, cm-1.
Exemplo 45:
Diidrocloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propo-xi] -2- nitro- benzeno carboximidamida
Rendimento: 47 %
p.f.: 200 - 208 °C
IR (KBr): 3300 (b), 2960, 1670, 1535, 1347,1155, 1020, 1002, 860, 800, 753 cm-1.
Exemplo 46:
Diidrocloreto de N-[2- hidroxi -3-(l- piperidinil) propo-xi] -1- isoquinolina carboximidamida
Rendimento: 5 6%
p. f. : 208 - 216°C
Exemplo 47:
Diidrocloreto de N-[3-[(1,1- dimetil etil) amino] -2- hi-droxi propoxi] -3- trifluorometil- benzeno carboximidami-da
Procedimento:
Uma mistura de 21,0 g (80,8 mmol) de m-trifluorometil -N- (2,3- epoxi propoxi) - benzamidina (Exemplo 9a), 105 ml de butilamina-terc., 210 ml de éter e 84 ml desolução de 4 N de hidróxido de sódio foi submetida a re-fluxo durante 5 horas. As fases foram separadas, a camadade éter foi lavada com salmoura, seca e evaporada até asecura. 0 óleo resultante (25,8 g) foi dissolvido em 250ml de acetona, tratado com carvão vegetal, a seguir, 39ml de solução de 4 N de HCl/ acetato de etil foram adici-onados, durante agitação, resultando em precipitação deum sólido branco, que foi filtrado e lavado com acetona.
Rendimento: 22,8 g (70 %)
p.f.: 186 - 192 0C (dec.)
IR (KBr): 3418, 2984, 2785, 2625, 2527, 2401,1664, 1585, 1487, 1437, 1381, 1329, 1173, 1155, 1130,1078, 905, 874, 820, 692, 642, 594 cm-1.
Exemplo 48:
Monoidrocloreto de N-[2- hidroxi -3- [ (1- piperidinil)propoxi] -N'- butil -3- piridina carboximidamida
Procedimento:a) Preparação de cloreto de N-[2-[(2- tetraidro-piranil) oxi] -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil (21,3 g; 71,4 nimol) de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil foi dissolvido em 500 ml de clorofórmio, acidifi-cado com solução de ácido clorídrico etereal para um pH =3, a seguir, 32,6 ml (0,357 mol) de 3,4- diidro 2H- pira-no foram adicionados. A mistura foi agitada em temperatu-ra ambiente durante 20 horas, lavada três vezes com por-ções de 200 ml de solução de 2 N de hidróxido de sódio equatro vezes com a mesma quantidade de água. A fase orgâ-nica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evapora-da sob pressão reduzida. O resíduo oleoso foi dissolvidoem 600 ml de acetato de etil e lavado quatro vezes comporções de 150 ml de uma solução tampão com um pH = 5. Asolução orgânica foi seca, filtrada e evaporada.
Rendimento: 24,5 g (90%)
b) Uma mistura de 3,7 g (9,68 mmol) de cloretode N-[2-[(2- tetraidropiranil) oxi] -3- (1-piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil e 40 ml (0,41 mol) den- butilamina foi mantida sob refluxo durante 3 horas. Oexcesso de amina foi evaporado in vacuum, proporcionandoóleo marrom escuro, que foi dissolvido em 40 ml de eta-nol, contendo 3,0 g de ácido 4-tolueno sulfônico e a mis-tura foi aquecida em 60° C durante uma hora. O solventefoi removido sob pressão reduzida , o resíduo foi tornadoalcalino (pH 10) com solução de 2 N de hidróxido de só-dio, a seguir, extraído três vezes com clorofórmio. A so-lução orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtradae o solvente foi evaporado in vaccum. 0 resíduo oleosoescuro foi purificado por meio de cromatografia, a fim deproporcionar a base pura, que foi dissolvida em 20 ml deetanol e acidificada com quantidade equivalente de ácidoclorídrico seco, dissolvido em álcool isopropílico, a fimde proporcionar o composto do título como um sólido cris-talino amarelo claro.
Rendimento: 1,22 g (34 %)
p.f.: 120 - 122 °C
IR (KBr, base): 3319, 3293, 3040, 2959, 2928,2854, 2842, 2552, 1612, 1580, 1450 ,1427, 1399, 1333,1315, 1221 ,1196, 1174, 1126, 1103, 1051, 1022, 964, 928,899, 858, 829, 719, 692, 602 cm"1.
Em seguida ao processo descrito no exemplo ante-rior, o seguinte composto foi preparado.
Exemplo 49:
Monoidrocloreto de N-[2- hidroxi -3- Γ f1- piperidinil)propoxil -N'- cicloexil -3- piridina carboximidamidaRendimento: 0,89 g (24 %)
p.f.: 130 - 134 0C
IR (KBr) : 3280, 2935, 2853, 2640, 1720, 1619,1551, 1514, 1452, 1404, 1313, 1236, 1194, 1155, 1124,1111, 1090, 1040, 978, 828, 735, 627 cm"1.
Exemplo 50:
N-[2- hidroxi -3-[(l- piperidinil) propoxil -N'- (1.1-dimetil etil)- benzeno carboximidamida
Procedimento:Em uma solução de 0,92 g (5,2 mmol) de 1-cloro -2- hidroxi -3 - (1- piperidinil) -propano em 2 ml de água0,42 g (10,4 mmol) de hidróxido de sódio foi adicionado eagitado durante uma hora. A essa mistura foi adicionado1,0 g (5,2 mmol) de N- hidroxi -N'- (1,1- dimetil etil) -benzeno carboximidamida dissolvido em 20 ml de etanol esubmetido a refluxo durante 4 horas. 0 solvente foi eva-porado e 50 ml de água foram adicionados e três vezes foiextraído com porções de 50 ml de clorofórmio. A fase or-gânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrado e o sol-vente foi evaporado in vacuum. O resíduo oleoso amarelofoi cristalizado, lentamente, no refrigerador. Os cris-tais foram triturados com éter dietílico e filtrado.
Rendimento: 0,55 g (31 %)
p.f.: 134 - 137 0C
IR (KBr) : 3427, 3254, 2929, 2853, 2814, 1739,1603, 1510, 1445, 1391, 1367, 1302, 1281, 11960, 1140,1117, 10941, 1067, 10366, 993, 963, 922, 841, 789, 716,675 cm-1.
Exemplo 51:
Monoidrocloreto de N-[2- hidroxi -3- Γ(1- piperidinil)propoxil -N', N'- dietil -3- piridina carboximidamidaProcedimento:
0,66 g (16,6 mmol) de hidróxido de sódio foramdissolvidos em 25 ml de etano abs., a seguir, 1,61 g (8,3mmol) de N- hidroxi -N', N'- dietil -3- piridina carboxi-midamida e 1,48 g (8,3 mmol) 1-cloro -2- hidroxi -3- (1-piperidinil) -propano foi adicionado e mantido sob reflu-xo durante 5 horas. 0 solvente foi evaporado e 50 ml deágua foram adicionados e três vezes foi extraído com por-ções de 50 ml de acetato de etil. A camada orgânica foiseca sobre sulfato de sódio, filtrada e o solvente foievaporado in vaccum . 0 resíduo oleoso amarelo foi puri-ficado por cromatografia, a fim de proporcionar a basepura, que foi dissolvida em 20 ml de acetato de etil eacidificada com quantidade equivalente de ácido clorídri-co seco, dissolvido em acetato de etil para dar origem aocomposto do título como um sólido cristalino branco.
Rendimento: 1,3 g (42 %)
p.f.: 113 - 117 °C
Exemplo 52:
Monoidrocloreto de N-[2-hidroxi-3-[(1-piperidinil) propo-xi]-hexa decanoicamida
Procedimento:
1,74 g (10 mmol) de 1-aminooxi -2- hidroxi -3-(1-piperidinil) propano foi dissolvido em 20 ml clorofór-mio e resfriado para 0o . Uma solução de cloreto de pal-mitoil (2,85 g; 10 mmol) em 10 ml de clorofórmio foi adi-cionada, gota a gota, em 10 minutos. Após agitação damistura por 15 minutos, o precipitado branco obtido foifiltrado, lavado com clorofórmio e seco.
Rendimento: 3,2 g (71 %)
p.f.: 147 - 150 °C
IR (KBr): 3242, 3090, 2951, 2916, 2849, 1730,1653, 1520, 1472, 1439, 1371, 1300, 1229, 1169, 1136,1099, 1070, 1009, 993, 962, 928, 858, 760, 719, 602, 471,cm-1
Em seguida ao processo descrito no exemplo ante-rior, os seguintes compostos foram preparados:
Exemplo 53:
N-[3-(1- piperidinil) propoxi] -3- trifluoro metil - ben-zamida
Material de iniciação; EP 365.364 (1990)Rendimento: 69 % (óleo)
IR (KBr) : 3425, 2941, 2864, 2775, 1674, 1614,1566, 1520, 1483, 1441, 1393, 1337, 1319, 1277, 1187,1129, 1072, 922, 914, 750, 698, 650 cm"1.
Exemplo 54:
N-[2-hidroxi-3-[(1-piperidinil) propoxi]naftaleno-1-carboxamida
Rendimento: 54 %p.f.: 104 - 107 0C
IR (KBr) : 3375, 2934, 1641, 1593, 1564, 1439,1340, 1325, 1113, 1026, 941, 810, 779 cm"1.
Exemplo 55:
hidroxi -3-[(l- piperidinil) propoxi] -N'- heptil -uréia
Procedimento:
À solução de 1,2 3 g (7,1 mmol) de 1-aminooxi -2-hidroxi -3- (1-piperidinil) propano foi dissolvido em 20ml clorofórmio. 1,0 g (7,1 mmol) de isocianato de heptilfoi adicionado e a mistura da reação foi agitada durante20 horas. O solvente foi evaporado in vaccum e o resíduofoi purificado por meio de cromatografia, a fim de pro-porcionar óleo puro incolor. Um produto cristalino brancofoi observado através de trituração com éter de petróleo.
Rendimento: 81 %
p.f.: 49 - 51 °C
Em seguida ao processo descrito no exemplo ante-rior, o seguinte composto foi preparado:
Exemplo 56:
N-[2- hidroxi -3- [(1- piperidinil) propoxi] -N'- propil -uréia
Rendimento: 50 % (óleo)
IR (KBr) : 3319, 2934, 2878, 2802, 1666, 1551,1456, 1393, 1308, 1155, 10952, 1040, 993, 889, 793 cm"1.
Exemplo 57:
N- cicloexil -N'-[2- hidroxi -3- [ (1- piperidinil) propo-xi] -uréia
Rendimento: 67 %
P. f.: 108 - 110 °C
IR (KBr) : 3319, 3287, 3188, 2930, 2853, 2797,1637, 1574, 1452, 1354, 1331, 1300, 1101, 1098, 991 cm"1.
Exemplo 58:
N- hexil -N'- Γ2- hidroxi -3- E f1- piperidinil)
propoxi] -uréia
Rendimento: 27 %
P. f.: 50 - 52 °C
IR (KBr) : 3310, 2932, 2858, 2804, 1666, 1551,1454, 1377, 1306, 1092, 1040, 995, 791, 725, 604 cm"1.
Exemplo 59:
N- (3- clorofenil -N'-[2- hidroxi -3- Γ (1- piperidinil)propoxi] -uréiaRendimento: 34 %P. f. : 117 - 118 0C
IR (KBr) : 3250, 2939, 2900, 1670, 1597, 1551,1491, 1429, 1239, 1252, 1119, 972, 775, 718, 700 cm"1.
Exemplo 60:
N- cicloexil -N'-[2- hidroxi -3-[Ν- cicloexil carbamoilN-(1,1- dimetil etil)- amino] propoxi] -uréiaRendimento: 44 %P. f.: 151 - 152 0C
IR (KBr) : 3312, 2932, 2854, 1668, 1616, 1555,1450, 1393, 1364, 1354, 1252, 1220, 1130, 941, 891 cm"1.
Exemplo 61:
N- hexil -N'-[-3-(l- piperidinil) propoxil -uréiaRendimento: 85 % (óleo)
IR (KBr): 3354, 2932, 2856, 2810, 2777, 1666,1543, 1586, 1377, 13058, 1155, 1134, 1076 cm-1.
Exemplo 62:
N- butil-terc. -N'-[2- hidroxi -3- [(1- piperidinil) pro-poxi]-uréiaRendimento: 3 8 %P. f. : 71 - 73 °C
IR (KBr) : 3314, 2945, 2916, 1651, 1555, 1460,1393, 1384, 1335, 1254, 1111, 988, 903, 839, 781 cm-1.
Exemplo 63:
N-(3-nitro-fenil)-N'-[2- hidroxi-3-[(l-piperidinil)propoxil -uréiaRendimento: 54 %Ρ. f.: 137 - 139 0C
IR (KBr) : 3281, 2943, 2818, 1672, 1607, 1560,1529, 1486, 1437, 1354, 1283, 1115, 802,739 cm"1.
Exemplo 64:
5,6-Diidro-5-(1-piperidinil) metil-3-(3-piridil)-4H-1,2,4- oxadiazina
Procedimento:
a) 17,5 g (0,05 mole) de diidrocloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midamida foram dissolvidos em 50 ml de cloreto de tionil,postos em ebulição durante uma hora, a seguir, a misturafoi evaporada até a secura. 0 resíduo foi dissolvido em300 ml de metanol, tratado com carvão vegetal e após afiltração o solvente foi evaporado em pressão reduzida. 0resíduo foi dissolvido na quantidade mínima de etanol erefrigerado para produzir diidrocloreto de N-[2- cloro -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piridina - carboximidami-da como o composto intermediário.
Rendimento: 13,2 g (71 %)
P. f.: 127 - 145 0C
b) 13,2 g (37,7 mmol) de diidrocloreto de N-[2-cloro -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midamida foram adicionados a uma solução de 16,5 g (143,5mmol) de butóxido-terc. de potássio dissolvidos em 150 mlde butano-terc. A mistura foi posta em ebulição durante 6horas, a seguir, evaporada in vacuum. 100 ml de soluçãode hidróxido de sódio a 5 % foram adicionados e a misturafoi extraída três vezes com porções de 300 ml de acetatode etil.
A camada orgânica foi seca sobre sulfato de só-dio, filtrada e evaporada até a secura. 0 resíduo foitriturado com éter dietílico a fim de produzir o compostodo título como cristais brancos.
Rendimento: 3,5 g (38 %)
P. f.: 157,5 - 158 0C
Exemplo 65:
Procedimento:
1,3 ml (15,2 mmol) de epicloroidrina foi adicio-nado a uma solução de 1,6 ml (15,2 mmol) de butilamina-terc. em 8 ml de etanol, durante 10 minutos, com agita-ção, mantendo a temperatura abaixo de 20 0C e permitindoque repousasse durante 3 dias.
Separadamente, 0,8 g (14,3 mmol) de hidróxido depotássio foi dissolvida em uma mistura de 20 ml de etanole 3 ml de água e, nesse solução, 3,42 g (15,2 mmol) desal de potássio de N-hidroxi -3- (trifluorometil) - ben-zamida e a solução anteriormente preparada e epicloroi-drina e butilamina-terc. foi adicionada. A mistura da re-ação foi agitada e posta em ebulição durante 10 horas, aseguir, o solvente foi evaporado. 0 resíduo foi trituradocom 20 ml de diclorometano e 10 ml de água, a fase orgâ-nica foi separada, lavada com 5 ml de água e 5 ml de so-lução saturada de cloreto de sódio, seca sobre sulfato desódio, filtrada e evaporada. O resíduo oleoso foi crista-lizado em uma mistura de acetona - hexano a fim de produ-zir um pó branco como o composto do título.Rendimento: 0,85 g (17,3 %)
Ρ. f. : 156 -158 °C
IR (KBr) 2976, 2858, 1612, 1556, 1379, 1352,1313, 1273, 1165, 1130, 1072, 694 cm-1.
Exemplo 66:
(Z) 2- butenodioato de metil -N-[2- hidroxi -3-(1- pipe-ridinil) propoxi] -3- piridina carboximidato (1:1)
Procedimento:
11,4 g (38,2 mmol) de cloreto de N- [2- hidroxi-3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoilforam dissolvidos em 60 ml de metanol abs., a seguir, 25ml (o,l mole) de solução metanólica a 25 % de metóxido desódio foram adicionados, gota a gota, durante 5 minutos.A mistura da reação foi posta em ebulição durante meiahora e evaporada. O resíduo foi agitado com 210 ml de di-clorometano durante meia hora, o cloreto de sódio foifiltrado e o filtrado foi lavado com 5 0 ml de água, a se-guir, com 5 0 ml de solução saturada de cloreto de sódio,seco sobre sulfato de magnésio e evaporado em pressão re-duzida. O produto cru (9,8 g) foi purificado por meio decromatografia, a fim de produzir o composto do titulocomo um óleo amarelo claro.
Rendimento: 2,9 g (29 %)
Análise elementar para C15h23N3O3
<table>table see original document page 114</column></row><table>Exemplo 67:
Iminocarbonato de dietil -N-[2- hidroxi-3-(1- piperidinil) - propoxi]
Procedimento
Uma mistura de 0,87 g (5 mmol) de 1-aminooxi -2-hidroxi -3- (1- piperidinil) - propano e 1,1 g (5,5 mmol)de ortocarbonato de tetraetil foi agitada em 100 0C du-rante 3 horas, na presença de quantidade catalitica deácido p-tolueno sulfônico. Após a evaporação, o resíduofoi purificado por cromatografia em coluna (Merck Kiesel-gel 60; eluente: clorofórmio/ metanol - cc. NH4OH30:5:0,2) a fim de proporcionar o composto do título comoum óleo amarelo claro.
Rendimento: 27,7 5 (óleo)
13C RMN (d. CDCl3): 154,9 (s, C-N), 76,5 (t, N-OCH2),66, 6 (d, CHOH) , 64,5 (t, CH3CH2), 64,1 (t, CH3CH2), 61,5(t, CHCH2N), 54,8 (t-piperidina), 26,0 (t, piperidina),24,2 (t, piperidina), 14,9 (q, CH3), 14,1 (q, CH3).
Exemplo 68:
N-[3-[(1,1- dimetil etil) amino] -2- hidroxi propoxi] -Q-etil -N'- fenil- isouréia
Procedimento:
18,4 g (0,1 mole) de N-fenil- cloroformimidatode etil (F. Lengfeld e J. Stieglitz: Am. Chem. J. 16. 70(1894) e 16,2 g (0,1 mol) de 1-aminooxi -2- hidroxi -3-[(1,1- dimetil etil) amino] -propano [pat. Alemã 2 651083] foram dissolvidos em 200 ml de tetraidrofurano. 13,9ml (0,1 mol) de trietilamina foram adicionados e a mistu-ra foi agitada em temperatura ambiente durante 10 horas.Hidrocloreto de trietilamina , que se formou, foi filtra-do e o filtrado foi evaporado in vaccum, o resíduo foidissolvido em 200 ml de clorofórmio e lavado com 50 ml deágua. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio,filtrada e evaporada sob pressão reduzida. O resíduo ole-oso cru foi purificado por cromatografia a fim de propor-cionar o composto do título como um óleo amarelo claro.Rendimento: 18,5 g (59,8 %)
Análise elementar para C16H27N3O3
Calculado Encontrado
C% 62,1 62,3
H% 8,8 8,5
N% 13,6 13,7
Exemplo 69:
Ν-[3-(1- piperidinil) -propoxi] -O- fenil isocarboxamidaProcedimento:
3,16 g (20 mmol) de 1-aminooxi -3- (1- piperidi-nil) -propano foram dissolvidos em 50 ml de benzeno. 2,4g (20 mmol) de cianato de fenil foram adicionados e amistura foi agitada em temperatura ambiente durante 12horas. Mais 0,16 g (1,3 mmol) de cianato foi adicionado ea mistura foi agitada por mais 12 horas. Após a evapora-ção, o resíduo foi dissolvido em metanol e a solução foiclarificada por carbono ativado e evaporada. O produtofoi cristalizado a partir de acetato de etil/ álcool etí-lico, a fim de proporcionar material branco.Rendimento: 46,9 %Ρ. f.: 63 - 70 0C (acetato de etil)13C RMN (d, D2O): 152,4, 129,9, 125,8, 119,9, 70,3, 57,4,54,3, 53,2, 23,0, 22,7, 21,0.
Exemplo 70:
N-[2- Hidroxi -3- Cl- piperidinil) propoxi] -N'- pentame-tileno -Q- etil- isouréia
Procedimento:
2,7 g (0,01 mol) de dietil -N- [2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -iminocarbonato (veja no Exem-pio 67) e 0,99 ml (0,01 mol) de piperidina foram dissol-vidos em 40 ml de tetraidrofurano e agitados em técnicaanterior durante 2 horas, a seguir, evaporados até a se-cura. 0 resíduo foi purificado através de cromatografia,a fim de produzir o composto do título como um óleo.
Rendimento: 2,1 g (67,1 %)
Análise elementar para CigH31N3Os
<table>table see original document page 117</column></row><table>
Exemplo 71:
Hidrocloreto de N,N -dimetil -N'-[2- hidroxi -3-(l- pipe-ridinil) - propoxil -N" -fenil - quanidina
Procedimento:
1150 mg (6,58 mmol) de 1-aminooxi -2- hidroxi -3- (1, piperidinil) -propano [pat. Alemã 2 651 083] foramdissolvidos em clorofórmio e 750 mg de Na2CO3 foram adi-cionados, a seguir, uma solução de 1206 mg (6,58 mmol) deΝ,N- dimetil -N'- fenil - cloroformamidina (BR888646/1959/, Bayer, autor: Kühle e Eue L.; CA 57,136961/1962/) em 10 ml de clorofórmio foi adicionada gotaa gota. Após 5 horas, o estado sólido foi filtrado e ofiltrado foi evaporado. Esse resíduo (1800 mg de óleo)foi dissolvido em 10 ml de acetato de etil e o produtofoi precipitado através de adição de 10,46 ml de 0,54 Nde HCl/ acetato de etil. O precipitado amarelo foi fil-trado, lavado e, finalmente, recristalizado a partir deacetona, após acetato de etil.
Rendimento: 28 %
P. f. : 127 - 129 ºC
IR (Kbr) : 3220, 2093, 2840, 2690, 2620, 1608,1580, 1475, 1433, 1375, 1250, 1070, 1050, 1000, 925, 900, 760, 705 cm-1.
Exemplo 72:
N-[3-[(1,1- dimetil etil) aminol -2- hidroxi propoxi] -
N'- fenil -quanidina
Procedimento:
3,1 g (0,01 mol) de N-[3-[(1,1- dimetil etil)amino] -2- hidroxi propoxi] -O- etil -N'- fenil- isouréia(veja no Exmplo 68) foram dissolvidos em 20 ml detetraidrofurano e 200 ml de 25 % de solução de hidróxidode amônio e 0,26 g (5 mmol) de cloreto de amônio foram adicionados e a mistura foi .mantida em temperaturaambiente durante 15 horas. A mistura foi evaporada até asecura e purificada por meio de cromatografia a fim deproduzir o composto do título como um óleo.Rendimento: 1,7 g (60,7 %)
Análise Elementar para C14H24N4O2
<table>table see original document page 119</column></row><table>
Exemplo 73:
Hidrocloreto de N1N -difenil -N'-[2- hidroxi -3-(l- pipe-ridinil) - propoxil -benzeno carboxamidina
Procedimento:
3,55 g (20 mmol) de 3-piperidino -2- hidroxi -1-propano foram dissolvidos em 2,5 ml de água. 0,8 g (20mmol) de NaOH foi adicionado e a mistura foi agitada emtemperatura ambiente durante 1 hora. Então, uma coluçãode 6,49 g (20 mmol) de hidrocloreto de N,N' - difenil -N-hidroxi - benzeno carboxamidina em 60 ml de álcooletilico foi adicionada, gota a gota e mais 0,8 g (20mmol) de NaOH. A suspensão amarelo obtida foi posta emebulição durante 2 horas. Então, o cloreto de sódioprecipitado foi filtrado, lavado com álcool etilico. 0solvente foi evaporado e 40 ml de acetato de etil foramadicionados e duas vezes foi extraído com porções de 40ml de água destilada. A fase orgânica foi seca sobresulfato de sódio, filtrada. 0 produto foi precipitadoatravés da adição de 5,5 ml de 3,67 N de HCl/ acetato deetil. O precipitado foi filtrado, lavado e, finalmente,recristalizado de metano/ éter.
Rendimento: 42 %ρ.f.: 151 - 155 0C (metano/ éter)13C RMN (d, CDCl3): 159,6, 148,0, 140,9, 131,0, 129,7,129,3, 128,9, 128,5, 127,9, 127,5, 64,2, 60,2, 54,5,22,7, 21,9.
Exemplo 74:
N-[3-(1- piperidinil) -propoxi] -N- metil -N'- fenil -O-etil -isocarboxamida
O procedimento para a preparação desse compostoé o mesmo que o escrito no Exemplo 68, usando 1- metilaminooxi -2- hidroxi -3- (1-piperidinil) -propano e etil-N- fenil - cloroformimidato como os materiais de iniciação.
Rendimento: 56 % (óleo)
Análise Elementar para C17H29N3O3
<table>table see original document page 120</column></row><table>
Exemplo 75:
N'-[2- hidroxi -3-(l- piperidinil) - propoxi1 -N- metil -N'-fenil - cfuanidina
O procedimento para a preparação desse compostoé o mesmo que o escrito no Exemplo 72, usando N-[2- hi-droxi -3-(l- piperidinil) propoxi] -N- metil -N'- fenil -O- etil - isouréia (veja o Exemplo 74), como os materiaisde iniciação.
Rendimento: 43 % (óleo)
Análise Elementar para C16H26N4O2Calculado Encontrado
C% 62, 7 62, 2
H% 8,5 8,8
N% 18, 3 18,4
Exemplo 76:
N.N.N' -trimetll- N'- [3- (1- piperidinil) - propoxil -N"-fenil-guanidina
procedimento:
344 mg (2,0 mmol) de 1-metil aminooxi -2-hidroxi -3- (1- piperidinil) -propano foram dissolvidos emclorofórmio e 220 mg de Na2C03 foram adicionados, aseguir, uma solução de 438 mg (2,0 mmol) de hidrocloretode N,N- dimetil -N'- fenil- cloroformamidina em 3 ml declorofórmio foi adicionada, gota a gota. Após 8 horas, oestado sólido foi filtrado e o filtrado foi evaporado.Esse resíduo foi dissolvido em em acetato de etil e oproduto foi extraído através de adição de solução de HCl(pH = 1) à água. A fase aquosa foi tornada alcalina, aseguir, por meio de adição de solução de 2N de NaOH paraum pH = 11 e extraída com acetato de etil. A faseorgânica foi evaporada e nova purificação foi feitaatravés de cromatografia em coluna, a fim de proporcionaro composto do título como um óleo amarelo.
13C RMN (d, CDCl3): 156,6, 150,5, 128,4, 121,4, 120,5,70,0, 55,9, 54,4, 40,6, 39,4, 25,8, 25,6, 24,3.
Exemplo 77:
(Z) 2-butenodioato de cloreto de /R/(+)-N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil)propoxi]-3-piridina carboximidoil (1:1)Procedimento:
2,16 mg (3,26 mmol) de (Z) -2- butenodioato decloreto de (S)-N-[2-[2-(R ) - (1,1- dimetil etiloxicarbonilamino) -3- fenil propioniloxi] -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (1:1)(veja o Exemplo 18) foram suspensos em 40 ml de metanol epostos em ebulição durante 1 hora, a seguir, evaporadosaté a secura. O resíduo foi triturado com 20 ml deacetato de etil, o precipitado foi filtrado, lavado comacetato de etil. Esse produto cru foi recristalizado emálcool isopropilico, a fim de produzir o composto dotítulo.
Rendimento: 1,16 g (85 %)p.f.: 136 - 137 0C[a]D: +5,6 ° (c = 1, MeOH, t= 27 °C)Exemplo 78:
Diidrocloreto de cloreto de N-(3- piperidino -1- propoxi)
-3- piridina carboximidoil
Após o resfriamento até 0 0C uma mistura de 10ml de água destilada e 4,36 ml de ácido clorídrico con-centrado, 2 g (7,62 mmoles) de N- (3- piperidino -1- pro-poxi) -3- piridina carboxamidina (veja o Exemplo 31) éadicionada sob agitação. ^A solução amarela, 2,7 g (3,81mmoles) de nitrito de sódio dissolvido em 10 ml de águasão adicionados, gota a gota, em -5 °C, durante 30 minu-tos. Após agitação, a solução esverdeada em -5 0C durante1,5 horas, o pH da solução é ajustado em 10 através daadição de uma solução de IN de hidróxido de sódio aquososob resfriamento, então, a solução é extraída 3 vezes com40 ml de clorofórmio. A fase orgânica é lavada com 20 mlde água, seca sobre sulfato de sódio e evaporada. 0 resí-duo é purificado por meio de cromatograf ia em coluna(Merck Kieselgel 60: eluente: clorofórmio/ metanol 1:1)para se obter 1,7 g (79,2 %) da base correspondente aocomposto do título.
O hidrocloreto do título é preparado a partir dabase obtida através da adição de um solução etanólica decloreto de hidrogênio, p. f.: 165 - 167 °C.
IR (KBr) : 3015, 2945, 2515, 2088, 1982, 1600,1570, 1437, 1402, 1200, 1060, 988, 912, 808 cm-1.
O material de iniciação acima pode ser preparadocomo segue:
Após a dissolução de 2,86 g (51,06 mmoles) dehidróxido de potássio em 20 ml de etanol abs, 6,45 g(47,0 mmoles) de 3- piridina carboxamida oxima são adici-onados, porção a porção, durante agitação. Após a disso-lução, 7,7 g (47,66 mmoles) de l-(3- cloropropil) piperi-dina, dissolvidos em 5 ml de etanol, são adicionados,gota a gota. Após reação de 9 horas, o cloreto de potás-sio precipitado é filtrado, a solução etanólica é clari-ficada por meio de carbono ativado e evaporada. Após acaptação em 100 ml de clorofórmio, o resíduo de evapora-ção é lavado 3 vezes com 100 ml de solução de 1N hidróxi-do de sódio, cada, a seguir, com 5 0 ml de água. Após aseparação, a fase orgânica é seca sobre sulfato de sódio,filtrada e evaporada. 0 resíduo oleoso se torna cristali-no com o resfriamento. Os cristais são triturados comcerca de 20 ml de éter, filtrados e secos , a fim de pro-porcionar um produto bege em um rendimento de 4,8 g(38,9%).
IR (Kbr): 3422, 3107, 2937, 2870, 2819, 1640,1479, 1391, 1309, 1194, 1123, 1059, 1042, 982, 916 cm"1.
Em seguida ao processo descrito no exemplo ante-rior, o seguinte composto foi preparado:
Exemplo 79:
Hidrocloreto de cloreto de 0-(3- piperidino propil) -3-nitro- benzidroximoil
Rendimento: 5 0 %
P.F.: 173 - 175 0C
IR (KBr): 3420, 2926, 2953, 2649, 2546, 1514,
1591, 1533, 1452, 1354, 1259, 1252, 1049, 994, 733 cm"1.
5.2. EXEMPLOS DE FORMULAÇÕES
Exemplo 1: Tablete
Tablete, contendo 5 0 mg de material ativo, épreparado a partir dos seguintes componentes:Monocloreto de cloreto de N-[2-hidroxi-3-
(1-piperidinil)-propoxi]-2-tiofeno-
carboximidoil 50,0 mg
Amido de milho 10 0,0 mg
Lactose 95,0 mg
Talco 4,5 mg
Estearato de magnésio 0,5 mg
O composto ativo é finamente triturado, mistura-do com os aditivos, a mistura é homogeneizada e granula-da. Os granulados são comprimidos em tabletes.Exemplo 2: Tablete
Tablete, contendo 5 mg de material ativo, é pre-parado a partir dos seguintes componentes:Monocloreto de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil)-propoxi]-2-nitro-benzimidoil 5,O mg
Amido de milho 7 5,0 mg
Lactose 7,5 mg
Silica coloidal 7,5 mg
Estearato de magnésio 5,0 mg
A composição é preparada a partir dos componen-tes acima de acordo com o exemplo 1.Exemplo 3: Tablete
Tablete, contendo 5 mg de material ativo, é pre-
parado a partir dos seguintes componentes:(Z)-2-butenodioato de N-[2-benziloxi-3-(1-piperidinil)-propoxi]-3-
piridina-carboximidamida (1:1) 5,0 mg
Amido de milho 7 5,0 mg
Gelatina 7,5 mg
Celulose microcristalina (Apical) 25,05 mg
Estearato de magnésio 2,5 mg
A composição é preparada a partir dos componen-tes acima de acordo com o exemplo 1.Exemplo 4: Cápsula
Cápsula, contendo 10 mg de material ativo, épreparada a partir dos seguintes componentes:Monoidrocloreto de N-[2-palmitoiloxi-3-(piperidinil)-propoxi]-3-piridina-carboximidamida 10 mg
Lactose 80 mg
Amido de milho 25 mg
Talco 3 mg
Silica coloidal 3 mg
Estearato de magnésio 2 mg
O material ativo é misturado com os aditivos, amistura é homogeneizado e enchida em cápsulas de gelatina.
Exemplo 5: Cápsula
Cápsula, contendo 20 mg de material ativo, épreparada a partir dos seguintes componentes:
Monoidrocloreto de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(piperidinil)-propoxi]-2-tiofeno-carboximidoil 20 mg
Celulose microcristalina (Apical) 99 mg
Silica amorfa 1 mg
O material ativo é misturado com os aditivos, amistura é homogeneizada e enchida em cápsulas de gelatina.
Exemplo 6: Drágeas
Drágea, contendo 25 mg de material ativo, é pre-parada a partir dos seguintes componentes:
Hidrocloreto de N-{3-[(1,1-dimetil-etil)-amino]-2-hidroxi-propoxi}-3-trifluorometil - benzamidina 25 mgCarboximetil celulose 295 mg
Ácido esteárico 20 mg
Ftalato de acetato de celulose 40 mg
O material ativo é misturado com a carboximetilcelulose e o ácido esteárico e a mistura é granulada nasolução de ftalato de acetato de celulose em 200 ml deetanol - acetato de etil. Um núcleo é comprimido a partirdo granulado, o qual é coberto por solução aquosa de po-livinil pirrolidona, contendo 5 % de açúcar.
Exemplo 7: Injeção
Solução de injeção é preparada a partir dos se-guintes componentes:
Cloreto de N-[2-hidroxi-3-piperi-
dinil)-propoxi]-2-nitro-benzimidoil 5,0 g
Solução salina fisiológica estéril 2,0 ml
Exemplo 8: Ungüento
Ungüento é preparado a partir dos seguintes com-ponentes :
Monoidrocloreto de cloreto
N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil)-propoxi]-
2-tiofeno-carboximidoil 7,5 g
Ácido esteárico 18,0 g
Álcool cetil estearílico 15,0 g
Monoestearato de glicerina 4,0 g
Sulfato laurilico de sódio 1,5 g
Benzoato de metil p-hidroxi 0,2 g
Água destilada 150 ml
0 ácido esteárico, o álcool cetil estearílico eo monoestearato de glicerina são fundidos juntos. 0 sul-fato laurílico de sódio e o benzoato de metil -p- hidroxisão dissolvidos em 100 ml de água sob ligeiro aquecimentoe, a seguir, adicionados aos componentes lipofilicos, du-rante agitação até que a temperatura diminuísse para atemperatura ambiente. Subseqüentemente, a solução de com-posto ativo em 5 0 ml de água é adicionada e completamentemisturada.
Exemplo 9: Ungüento
O ungüento é preparado a partir dos seguintescomponentes:
<table>table see original document page 128</column></row><table>
A composição é preparada conforme descrito noExemplo 8.
Exemplo 10: Creme
O creme é preparado a partir dos seguintes com-ponentes :
(Z)-2-butenodioato de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil)-propoxi]-4-piridina-
carboximidoil (1:1) 10,0 g
Vaselina branca 90,0 g
Cera branca 3,0 g
Álcool cetil estearilico 3,0 g
Tetraborato de sódio 4,0 g
Benzoato de metil p-hidroxi 0,2 g
Água destilada 90 ml
A solução dos componentes solúveis em água éadicionada à mistura quente dos componentes lipofilicoscomo no Exemplo 8 e a solução aquosa do composto ativo éadicionada à emulsão final.
EXEMPLO 6:
EFEITO DO MALEATO DE CLORETO DE n-[2- HIDROXI -3-(1- PI-PERIDINIL) PROPOXI] -3- PIRIDINA CARB0XIMID0IL SOBRE AEXPRESSÃO CELULAR DE HSP (EXAMINADO EM NÍVEL TRANSLACIQ-NAL)
6.1 Antecedentes
Os experimentos apresentados neste parágrafo fo-ram conduzidos a fim de determinar se o maleato de clore-to de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- pi-ridina carboximidoil atua para aumentar a expressão deprotetor molecular por uma célula. A acumulação de dife-rentes proteínas de choque térmico subseqüente ao períodode exposição ao choque térmico sozinho e ao choque térmi-co em combinação com a administração de maleato de clore-to de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- pi-ridina carboximidoil foi examinada através da adição de10-5 M de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pi-peridinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil, antes,durante ou imediatamente após o tratamento hipertérmicode células miogênicas do coração (células de H9c2).6.2 Materiais & Métodos
6.2.(a) Condições de Cultura das Células:
A linha de células derivada do coração de ratoembriônico H9c2 foi obtida da Coleção Européia de Cultu-ras de Células de Animais (ECACC) (88092904). As célulasforam mantidas em 37 0C em meio de Eagle modificado deDulbecco (DMEM) suplementado com 10 % de soro fetal de vi-tela em termostato JOUAN C02 (5 % de CO2) .6.2 (b) Condições do choque térmico e do tratamento
com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil:
6.2 O choque térmico foi realizado em 43 0C em ter-
mostato de CO2 para dados intervalos de tempo (20, 40,60, 9- e 120 minutos). As células foram, então, levadasde volta para 37 0C durante 6 horas e as proteínas foramextraídas para SDS-PAGE. Quando maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil foi adicionado antes do choque térmico, 105 M de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pipe-ridinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil foram admi-nistrados durante 16 horas antes da tensão. Em outra sé-rie de experimentos, maleato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoilfoi adicionado em uma concentração de 10 5 M logo após atensão térmica, durante o período de recuperação de 6 ho-ras . Os experimentos foram repetidos três vezes.6.2 (c) Mancha de Western
Para SDS-PAGE, as células foram desenvolvidas emplacas de Petri de 6 cm. A quantidade das células no iní-cio do experimento era 8 χ IO5 e eram ainda subconfluen-tes, quando as proteínas foram extraídas. Após a recupe-ração de 6 horas, as células foram lavadas duas vezes emPBS e, a seguir, raspadas da superfície das placas emPBS. A seguir, as células foram giradas durante 5 minu-tos, e, 1500 rpm e recuperadas em 100 μΐ de tampão solu-bilizante modificado (Molecular Cloning, A Laboratory Ma-nual, Ed. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Bold Spring Har-bor Laboratory Press (1989), contendo 50 mM de Tris-HCL,pH de 8,0; 5 mM de EDTA: 150 mM de NaCl; 15 Tritox N-100;1 PMSF: 2 μg/ ml de aprotinina; 1 μg/ ml de quimostatina;
1 μg/ ml de pepstatina; e submetidas à onda sônica duran-te 3 χ 20 seg ( intervalos de 2 min., ajuste 8).
A concentração de proteína foi determinada apartir de amostras de 5 μΐ por meio do ensaio de Bradford(Μ. M. Bradford. Anal. Biochem. 72: 248 - 254 (1976)) emtrês paralelas. As amostras foram ajustadas para 100 μg/μl com o tampão acima e o tampão seguinte, de modo quea concentração do tampão na amostra será: 110 mM de Tris-HCl, pH de 6,8; 8,3 mM de mercaptoetanol; 3 % de SDS; 3 %de glicerol e um pouco de azul bromofenol e sacudidas emtécnica anterior durante 30 minutos.
A eletroforese foi realizada de acordo com La-emmli (U.K. Laemmli, Naturef 227: 680 - 685 (1970)) emgel de poliacrilamida a 8 - 18 %, em voltagem constantede 50 V durante a noite. As proteínas foram manchadas comAzul Brilhante de Coomassie R-250 ou transferidas para amembrana de Immobilone PVDF (Millipore) em corrente cons-tante (300 mA) durante 3 horas a 4 °C em tampão de trans-ferência (10 mM de CAPS, pH 11; metanol a 10 %) (ProteinBlotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane,3. Laboratory Manual, Millipore). Após a transferência,locais não específicos da membrana foram bloqueados comBSA a 2 % em TPBS (solução salina tamponada com fosfatocom Tween 20 a 0,1 %) durante a noite, a 4 °C. A manchafoi incubada com anticorpo monoclonal de GRP94 (SPA-850,StressGen), diluída com anticorpo monoclonal de HSP60(SPA-600, StressGen) com diluição de 1:2700, com anticor-po monoclonal de HSP72 (C92F34-5, StressGen) com diluiçãode 1:1250 ou com anticorpo monoclonal de HSP90 (AC88,StressGen) com diluição de 1:2000, durante 1 hora, emtemperatura ambiente. A seguir, ela foi lavada com tampãode TBPS durante uma hora e incubada com anticorpo secun-dário de anti-rato (Sigma, diluição de 1:400, para GRP-94) ou anti-camundongo (Sigma, adsorvido com proteínas desoro humano e de ratos, diluição de 1:3000, para HspõO,Hsp72 ou Hsp90) conjugado com peroxidase de rábano, du-rante 1 hora, respectivamente. Após sucessiva lavagem comTPBS, a membrana foi desenvolvida com o sistema de ECL(Amersham).
Uma série de diluição de proteína total foi man-chada e desenvolvida paralelamente com as amostras a cadamomento e uma curva de calibração foi calculada. As mu-danças no teor de proteínas de tensão foram quantifica-das, usando-se um densitômetro Bio-Rad (Modelo 1650) e umIntegrador Hewlett- Packard (HP 3394a) e corrigidas deacordo com a curva de calibração. Quando da realizaçõesdos cálculos, os dados densitométricos da banda de prote-ína dada, em 37 °C, sem tratamento com maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil , foram considerados como 100 % e to-das as outras intensidades foram comparadas com aquelaamostra.
6,2 (d) Análise Estatística
Os dados são relatados como ±SE médio. A compa-ração e o cálculo estatístico foram realizados por umaanálise de variância unidirecional com teste de PosthocNewman-Keuls (Sistema de Cálculo Farmacológico). A signi-ficância estatística foi definida como P < 0,05.
6.3 Resultados
Hsp60: 0 tratamento com maleato de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil) propoxi]-3-piridina carboxi-midoil , realizado a 37 °C, não tem efeito mensurável so-bre o nível dessa hsp. 0 choque térmico em 43 0C sozinho,durante 20 minutos, pode aumentar a quantidade de hsp60quase em duas vezes. Prolongando-se a duração do trata-mento térmico, nenhuma outra elevação pôde ser observadano nível dessa proteína. Quando maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil foi adicionado, em uma concentração de 10 -5M, 16 horas antes da tensão térmica, a quantidade de hsp60 aumentou em cerca de cinco vezes (comparado com ocontrole a 37 °C), mesmo se as amostras expostas ao tra-tamento térmico durante 20 minutos. Esse efeito do malea-to de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) pro-poxi] -3- piridina carboximidoil sobre o nível de hsp60foi evidente também em amostras tratadas pelo calor du-rante 40 e 60 minutos, respectivamente, contudo, começoua declinar, posteriormente. O maleato de cloreto de N-[2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil adicionado durante a fase de recuperação tambémfoi efetivo, embora em um grau significativamente menorentão observado através da adição desse composto, antesda tensão.
Hsp72: A quantidade de hsp72 restante foi umtanto baixa em células de H9c2, o efeito de tratamentosdiferentes sobre o nível de hsp70, porém, foi dramático.Já havia um aumento significativo no choque térmico aos20 minutos e, aos 40 minutos do tratamento térmico , aquantidade era quase 10 vezes maior do que aquela detec-tada em células de controle. O tratamento térmico em du-ração maior não resultou em mudança significativa, compa-rado com as amostras com 40 minutos. A administração demaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil, antes da tensão tér-mica, teve um efeito muito profundo. Aos 60 minutos detensão térmica, o nível de hsp72 aumentou em cerca de 50vezes, quando comparando com as amostras a 37°C, mas umaumento significativo já poderia ser detectado em tensãotérmica com duração de 40 minutos. Essas quantidades al-tamente induzidas de hsp72 foram estáveis em células sub-metidas a choque térmico durante 120 minutos. O maleatode cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi]-3- piridina carboximidoil adicionado durante a fase derecuperação também foi efetivo, embora em um grau menor.
Hsp90: Aos 20 minutos do tratamento térmico, ochoque em alta temperatura, sozinho, foi incapaz de indu-zir o nível elevado de HSP90, contudo, se maleato de clo-reto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3-piridina carboximidoil fosse adicionado antes da tensãotérmica, o nível de Hso9 0 aumentava em cerca de cinco ve-zes. O efeito maior da pré-incubação da droga poderia serobservado seguindo sua combinação com tratamento térmicodurante 60 minutos. Foi interessante notar que, no casode HSP90, o maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil adicio-nado seguindo tratamento a 43°C, durante 60 minutos, foitão efetivo (se não mais) quanto se adicionado antes datensão em alta temperatura. Obviamente, com a incubaçãoem alta temperatura por mais de 90 minutos, o efeito domaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil foi se desvanecendo.
Grp94: A formação da proteína de tensão Grp94foi induzida seguindo um choque térmico de 20 minutos.Esse efeito teve um pico no tratamento térmico por 60 mi-nutos, ao passo que um declínio abrupto já tinha sido de-tectado em caso de amostras de 90 minutos. A capacidadedo maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil para induzir onível de Grp94 era a mais pronunciada no caso, se o com-posto fosse adicionado antes da tensão, mas uma elevaçãosignificativa poderia ser vista, se a pré-adição da droga fosse combinada com um choque térmico longo de 20 minutos(onde houve um aumento de 4 vezes, comparado ao tratamen-to a 43 °C). Por outro lado, a adição do composto durantea recuperação da tensão térmica, durando 40 ou 60 minu-tos, foi quase tão efetiva quanto a administração de ma-leato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil por 16 horas, antesda tensão.
A Figura 2 mostra a análise de mancha de Westernde proteínas de células de H9c2. As provas usadas são:anticorpo de hsp60, mostrado em (1); anticorpo de hsp72,mostrado em (2); anticorpo de hsp90, mostrado (3) e anti-corpo de grp94, mostrado em (4). A faixa (-) representaas células mantidas na ausência de maleato de cloreto deN-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil a 37 0C ; e a faixa (+) representa as célu-las mantidas em sua presença (concentração de IO5 M por16 horas) . O choque térmico a 43 0C foi realizado pelostempos indicados na Figura. O maleato de cloreto de N- [2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil a 10 5 foi adicionado 16 horas antes do trata-mento térmico (faixa (B)) ou durante o período de recupe-ração (faixa (A)).
Uma análise do efeito dos vários tratamentos so-bre a quantidade de hsp diferente em células do coraçãoH9c2 é proporcionada na Figura 1. A quantidade de proteí-nas de tensão em células expostas à tensão térmica (43°C) sozinha é representada por (A) ; a quantidade de pro-teínas de tensão em células tratadas com 10 5 M de malea-to de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) pro-poxi] -3- piridina carboximidoil antes do tratamento tér-mico é representada por (B) ; e a quantidade de proteínasde tensão em células tratadas com 10 M de maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil , durante o período de recupe-ração de seis horas é representada por ©. O eixo horizon-tal representa a duração em tempo do tratamento térmico eo eixo vertical representa a quantidade relativa de pro-teínas de tensão.
O tratamento térmico sozinho induziu todas asespécies de HSPs investigadas nesse estudo. O aumento foio menos pronunciado no caso de hsp60. O nível de hsp60subiu em até cerca de duas vezes após a exposição das cé-lulas a 20 minutos de calor, ao passo que nenhum aumentopôde ser detectado em tratamentos térmicos mais longos. Omaior efeito da tensão térmica pôde ser visto para hsp72,pois sua quantidade aumentou em cerca de 12 vezes. Quandomaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil foi adicionado 16 ho-ras antes do tratamento térmico, o nível de todas as HSPsaumentou ainda mais em até cerca de duas vezes, quandocomparado com aquelas observado mediante a tensão térmi-ca. Ficou claro, também, que o nível de hsp7 2 aumentou emum grau muito maior entre as HSPs através da combinaçãoda tensão térmica e do maleato de cloreto de N-[2- hidro-xi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximi-doil , se comparado, mais uma vez, à indução detectadapara a tensão térmica sozinha. Quando o maleato de clore-to de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- pi-ridina carboximidoil foi administrado durante a fase derecuperação, quase em todos os casos examinados, o teorde hsp(s) aumentou, mas, outra vez, a elevação de hsp7 2foi a mais pronunciada.6.4 Discussão
A análise de mancha de Western revelou um acúmu-lo notável de diferentes classes de HSP examinada após aexposição de células do coração ao choque térmico. A adi-ção de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pipe-ridinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil, antes ouapós a tensão em alta temperatura, multiplicou o efeitodo tratamento térmico mediante a produção de HSPs. Conse-qüentemente, o maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil atuaem sinergia com tensão de temperatura através da induçãode todas as classes de protetores moleculares.EXEMPLO 7:
EFEITO DO MALEATO DE CLORETO DE N- [2- HIDROXI -3-(l- PI-PERIDINIL) -PROPOXI] -3- PIRIDINA CARBOXIMIDOIL SOBRE AEXPRESSÃO CELULAR DE HSP (EXAMINADO EM NÍVEL TRANSCRICIQ-NAL)
7.1 Antecedentes
A breve exposição à isquemia (por exemplo, pormeio de narcose repetida) pode precondicionar o coração eprotegê-lo contra a isquemia letal subseqüente, conformeevidenciado pela incidência diminuída de fibrilação ven-tricular, tamanho do infarto reduzido e melhor recupera-ção da função miocardial regional, durante a reperfusãode coração isquêmico. Tem sido demonstrado que essa pre-condição induz a expressão de HSps, especialmente hsp72.Neste parágrafo, o efeito do maleato de cloreto de N-[2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil sobre a expressão de hsp7 2 é investigado atravésdo exame do acúmulo de mRNA em uma célula em seguida àisquemia e comparando-o com a situação onde a isquemia écombinada com a administração de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil .
7.2 Materiais & Métodos
7.2 (a) Indução de Tensão TérmicaForam realizados experimentos em ratos machos deSPRD. Os animais foram anestesiados com Nembutal em umadose de 60 mg/kg/i.ρ. A temperatura do corpo dos ratosfoi mantida com uma lâmpada infra colocada sobre o abdomee a temperatura retal foi medida. Após um período de 25 -40 minutos, a temperatura dos ratos aumentou para 42,0 -42,2 0C e essa temperatura foi mantida durante 15 minu-tos. Após um período de recuperação (2 horas), amostrasde tecido foram coletadas dos ventrículos esquerdo e di-reito .
7.2 (b) Indução de Isquemia Cardíaca
7.2 Experimentos foram realizados em ratos machos deSPRD. Os animais foram anestesiados com Nembutal em umadose de 60 mg/kg/i.ρ. Após a abertura do tórax e do peri-cárdio, a artéria coronária LAD foi ocludida durante 5minutos e, a seguir, a incidência e a duração da taqui-cardia ventricular e da fibrilação no período de reperfu-são (10 minutos) foram investigadas. Amostras de tecidosforam coletadas dos ventrículos esquerdo e direito.
7.3 (C) Método da Mancha de Northern
O RNA total foi extraído, usando-se um kit deRNAgents (Promega) de acordo com as instruções do fabri-cante (Guia de Protocolos e Aplicações, 2a edição, 1991.Promega Corporation). Resumidamente, as amostras de teci-do congeladas (as amostras de tecido dos ventrículos es-querdo e direito de ratos submetidos à tensão térmica ouà isquemia cardíaca). As amostras de tecido, pesando 50 a100 mg, foram homogeneizadas em 1,0 ml de solução de des-naturação em +4 0C através da homogeneização de Brinkman.Então, 1/10 vol. De 3M de acetato de sódio (pH 4,0) foiadicionado e o homogenado foi extraído com fenol ácido(fenol: clorofórmio: álcool isoamílico 25: 24: 1) durante10 segundos, por meio de vórtice. A amostra foi incubadaem gelo durante 15 minutos e , a seguir, centrifugada ( 4°C; 20 min.; 10.000 xg) . A fase aquosa foi transferidapara um novo tubo de Eppendorf, o processo foi repetido ea fase aquosa foi precipitada em -20 °C, durante a noite.Em seguida à centrifugação (4 °C; 20 min.; 10.000 xg), oprecipitado foi lavado duas vezes com etanol a 95 % eseco em temperatura ambiente. O RNA foi suspenso em 20 μΐde água tratada com DEPC. Oito μg de RNA total foram pro-cessados em gel de agarose - formaldeído por meio detransferência capilar, o RNA no gel foi manchado em mem-brana de náilon, de acordo com as instruções do fabrican-te (Zeta-Probe GT, BioRad).
0 teor de mRNA de hsp72 de amostras individuaisfoi comparado com o nivel de mRNA do nível de gene de de-sidrogenase de 3-fosfato de gliceraldeído (GAPDH) dasprovas correspondentes. As provas de DNA (fragmento deApa-Ncol e cDNA de hsp7 0 humano de comprimento total docDNA de GAPDH de ratos) foram rotuladas com alfa-32P CTP,usando Kit de Rotulação Primária Aleatória de DNA (USB).Fragmentos de DNA rádio-rotulados foram purificados emcoluna de Sephadez G-50 (Pharmacia), conforme descrito(Ausubel e outros (eds)): Current Protocols in MolecularBiology: JOHN WILEY & SONS: 1987).
As pré-hibrizações foram realizadas em 65 °C emtampão de H- (0,25 M de Na2HPO4, pH 7,2, SDS a 7%) duran-te 15 minutos. As hibridizações foram realizadas durantea noite (65 °C; tampão de H-) com concentração de provarotulada como isótopo de pelo menos IO6 cpm/ml. A membra-na foi lavada com 20 mM de Na2HPO4, pH de 7,2, SDS a 5%(65 C; 2 χ 15 min.) e avaliada por meio de auto-radiografia. A mesma membrana foi usada para a prova dehsp70, bem como para a mensuração de GAPDH e mRNA usadocomo padrão interno.7.4 Resultados
A oclusão coronária por 5 minutos foi seguidapor reperfusão, o que provocou taquicardia e fibrilaçãoventricular nos ratos. O pré-tratamento com maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (0,5-; 0,75-; 1,0 mg/kg de pesocorpóreo, i.v., 5 minutos antes da oclusão) reduziu, si-gnificativamente, a duração média da taquicardia ventri-cular e aperfeiçoou a taxa de sobrevida, ao prevenir afibrilação ventricular.
Enquanto todos os animais (n = 6) do grupo decontrole morreram durante a fase de reperfusão, aquelestratados com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (100mg/kg, p.o) não só sobreviveram à reperfusão após os 5minutos de oclusão, mas uma expressão altamente aumentadade gene de hsp7 2 foi detectada em suas preparações domúsculo cardíaco.
A Figura 3 é a análise de mancha de Northern deRNA total isolado dos ventrículos esquerdo do coração dorato, ilustrando os resultados obtidos do experimento. Ocontrole (faixa 1); os tratados pelo calor (faixa 2); osde operação simulada (faixa 3); isquemia (faixa 4); male-ato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) pro-poxi] -3- piridina carboximidoil mais isquemia (faixa 5);
e maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (faixa 6) . 0GADPH foi medido como uma prova interna. Para o choquetérmico, a temperatura retal foi mantida em 42 0C durante15 minutos.
É notado que, na ausência de tensão, a adminis-tração de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pi-peridinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil sozinhafoi incapaz de ativar o gene de hsp7 2.
EXEMPLO 8:
EFEITO PROTETOR DOS DERIVADOS DE HIDROXILAMINA DA INVEN-ÇÃO CONTRA ISQUEMIA CARDÍACARatos machos de Sprague-Dawley (380 - 450 g.b.w.) foram anestesiados com pentobarbital de sódio(Nembutal 60 mg/k.g por peso corpóreo, i.p. ) e ventila-dos, artificialmente, com ar ambiente (2 ml/ 100 g: 54batidas/ minutos) por meio de traqueotomia. A artéria ca-rótida direita foi cateterizada e conecta a um transdutorde pressão (BPR-01, Stoelting) para a mensuração da pres-são sangüínea arterial sistêmica (PS) por meio de um pré-amplificador (Hg-02, Experimetria). Os derivados de hi-droxilamina divulgados no Exemplo 5 foram administradospor meio de cânula venosa à veia jugular (i. v.) e oral-mente (ρ. o) . A velocidade cardíaca (VC) foi medida pormeio de um cardiotacômetro (HR-01. Experimetria). 0 ele-trocardiograma (ECG padrão lead II) foi registrado em umregistrador (MR-12. Medicor) por meio de eletrodos deagulha de aço subcutâneas. O tórax foi aberto por meio deuma toracotomia esquerda e o coração foi exteriorizadoatravés de uma pressão suave sobre o lado direito da cai-xa torácica. Uma sutura de seda 4-0 foi colocada, rapida-mente, sob a artéria coronária esquerda principal, con-forme descrito por Selye e outros (1960). 0 coração foi,cuidadosamente, recolocado no tórax e o animal deixado emrecuperação. A temperatura retal foi monitorada e mantidaconstante em 37 °C. 0 protocolo experimental foi iniciadocom um período de estabilização de 15 minutos, durante oqual a observação de uma pressão sangüínea sustentada me-nor que 70 mmHg e a ocorrência de arritmia levaram à ex-clusão. A isquemia miocardial foi induzida com oclusãocoronária durante 5 minutos e a reperfusão permitida du-rante 10 minutos.
Durante todo o experimento, a PS, a VC e o ECGforam continuamente registrados em um multiscriptor (R61-6CH, Medicor). Os derivados de hidroxilamina, cujas for-mas tautoméricas são representadas pelas estruturas (i) e(II) , foram administrados 5 a 60 minutos antes da oclu-são, após tratamento por via intravenosa e por via oral,respectivamente. As doses dos derivados de hidroxilaminado Exemplo 5 foram 0,5; 0,75; 1,0 mg/kg i.v. e 100 mg/kgde peso corpóreo, via oral, enquanto a substância de re-ferência Bepridil foi dada em uma dose de 1,0 mg/kg, pori.v.
A duração média da taquicardia ventricular (TV)e/ ou fibrilação ventricular (FV), durante os primeiro 3minutos de reperfusão, foi analisada por meio de análiseunidirecional de variância. A incidência de FV foi anali-sada, usando-se um teste do qui-quadrado. As variáveishemodinâmicas foram analisadas usando-se um teste do qui-quadrado. As variáveis hemodinâmicas foram analisadas,usando-se o teste - "t" de Student. O nível crítico dasignificância foi estabelecido em ρ < 0,05. Todos os re-sultados foram expressos como um +S.E.M. médio. As drogasforam administradas i. v. em uma dose de 1 mg/kgpc 5 mi-nutos antes da oclusão.
Os derivados de hidroxilamina que se verificouserem particularmente vantajosos para proteção de um ani-mal contra os danos da isquemia/ reperfusão estão relaci-onados abaixo. Sobrevivência (%) indica o percentual deanimais que sobreviveram aos efeitos de 5 minutos deoclusão coronária.<table>table see original document page 146</column></row><table><table>table see original document page 147</column></row><table>
Além dos compostos acima, também se descobriuque os seguintes compostos também proporcionam resultadosvantajosos:
(Z)-2- butenodioato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (pirrolidin -1- il) -propoxi] -3- piridina - carboxi-midoil (1:1) (norte-americana 5.328.906. Exemplo 12. 1mg/kgpc, i.v. % de sobrevivência : 67);
Hidrocloreto de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(dietil -amino)- propoxi] -3- piridina carboximidoil(1:1) (norte-americana 5.328.906. Exemplo 11. Img/ kgpc,i.v. % de sobrevivência : 62);
(Z)-2- butenodioato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (prop -2- il -amino) -propoxi] -3- piridina - carbo-ximidoil (1:1) (norte-americana 5.328.906. Exemplo 13/4.1mg/ kgpc, i.v. % de sobrevivência : 60);
(Z)-2- butenodioato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (morfolin -1- il) -propoxi] -3- piridina - carboximi-doil (1:1) (norte-americana 5.328.906. Exemplo 12. 1mg/kgpc, i.v. % de sobrevivência : 71);Cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidil)propoxi] -a- (3,4- dimetoxi - fenil )-acetimidoil (norte-americana 5.328.906. Exemplo 14. Img/ kgpc, i.v. % de so-brevivência : 67) ;
(Z)-2- butenodioato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (butil-terc. - amino) -propoxi] -3- piridinacarboximidoil (1:1) (norte-americana 5.328.906. Exemplo13/5. 1mg/ kgpc, i.v. % de sobrevivência : 57);
Hidrocloreto de cloreto de ácido 0- (3-piperidino -2- hidroxi -1- propil)- benzidroximico;(norte-americana 5.147. 879). Exemplo 1. 1mg/ kgpc, i.v.% de sobrevivência : 100) ;
(Z)-2- butenodioato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (1- piperidinil) -propoxi] -3- piridinacarboximidoil (1:1) (norte-americana 5.147.879. Exemplo2. Img/ kgpc, i.v. % de sobrevivência : 100); 20 mg/kgpcp. o, % de sobrevivência: 100);
EXEMPLO 9:
EFEITO DO MALEATO DE CLORETO DE N-Γ2- HIDROXI -3-(l- PI-PERIDINIL) -PROPOXI1 -3- PIRIDINA CARBOXIMIDOIL NO REPARODA MEMBRANA CELULAR E PRESERVAÇÃO DA FLUIDEZ DA MEMBRANA
9.1 ALTERAÇÃO NA FLUIDEZ DA MEMBRANA ASSOCIADA COMDANO CELULAR INDUZIDO POR TENSÃO ATRAVÉS DE PRIVAÇÃO DESORO E EFEITO DO MALEATO DE CLORETO DE N-[2- HIDROXI -3-(1- PIPERIDINIL) -PROPOXI] -3- PIRIDINA CARBOXIMIDOIL NAREVERSÃO DA ALTERNAÇÃO NA FLUIDEZ
9.1 (a) Antecedentes
Uma forma para modelar os eventos patofisiológi-cos causados pela tensão do dano metabólico que acompanhaa diabetes é diminuir o nível de insulina no meio de cul-tura. Uma vez que a insulina é fornecida pelo soro imple-mentado, a privação parcial ou total pareceu ser um ótimoinstrumento para detectar mudanças em diferentes níveisregulatórios da célula.
A privação de soro é um método amplamente usadopara detenção da célula na fase Gl/S, isto é, sincroniza-ção do ciclo da célula (Ashihar, T. Methods of Enzymolo-gy, 58: 248 - 249 (1979)). Tem sido observado que as cé-lulas em cultura são submetidas a processos apoptóticosna ausência de suplementação de soro (Cohen, e outros.,Adv, In Immunolology 50: 50 - 85 (1991) e ela tem sidoestudada como um choque alternativo de inibidores de es-taurosporina ou toposiomerase em células Balb/3T3(Kulkarni, G. V. e outros, J. Cell. Sei. 107: 1169 - 1179(1994) ou choque térmico e privação de glutamina em célu-las de Ehrlich (Rowlands, A . G. e outros Eur. J. Bio-chem. 175: 93 - 99 (1988) para investigar a síntese ini-bida de proteína por meio da fosforilação do fator deiniciação eucariótica (eIF2 alfa). Além disso, há evidên-cias sobre a indução de citoproteção nas células privadasde soro através da administração de HSP72 externa(Johnson, AD. e outros, In Vitro Cell Dev. Biol. Anim.29 A: 807 - 812 (1993)). Aumentos na síntese relativa deHSP72 e HSP72 através de privação de soro (Toye, P e ou-tros, Mol. Biochem. Parasitol. 35, 11 - 10 (1989)) tambémforam mostrados.Prejuízos isquêmicos e hipóxicos do miocárdio eoutros órgãos são mediados por danos e disfunção progres-siva da membrana. Também foi demonstrado que a alteraçãona fluidez da membrana ocorre durante o prejuízo metabó-lico das células cardíacas (Buja L. M. e outros, In vivo5: 233 - 238 (1991)). A fluidez da membrana reflete,principalmente, a orientação e a velocidade do movimentodos lipldios constituintes da membrana e qualquer altera-ção de seu nível influencia, grandemente, a função funda-mental da membrana (Quinn, P. J. e outros. Prog. Biophys.Mole. Ciol. 53: 71 - 103 (1989); Schlame, M e outros. Bi-ochim. Biophys. Acta, 1045: 1-8 (1990)).
Nesse experimento, a investigação foi conduzidaa fim de determinar se mudanças na fluidez da membrana doplasma participam no desenvolvimento no dano celular in-duzido por privação de soro e se a alteração na fluidezinduzida por privação de soro pode ser revertida atravésda administração de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil .9.1 (b) Materiais e Métodos
Experimentos foram realizados usando-se linhasde células do músculo cardíaco de ratos H9c2 e fibrossar-coma de camundongos WEHl divididas em três grupos:
. controle (soro de vitela fetal - FCS a 10 %). privado de soro. tratado com maleato de cloreto de N-[2- hidro-xi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximi-doil (10-5 M) e privado de soro.9.1 (b) (1) Teste de MTT e privação de soro
Foram peneiradas várias linhas de células, con-centrações de droga, tempo de pré-tratamento e privação efoi verificado que as condições mais apropriadas são comosegue: 5 χ 10-4 / ml de células do músculo cardíaco de ra-tos H9c2 (n = 6) e células de fibrossarcoma de camundon-gos WEHI (n = 7) foram colocadas em placas com 24 cavida-des em DMEM FCS a 10 % (meio de Eagle modificado de Dul-becco) e incubadas durante 2 horas em 37 c, 5% de CO2. Omeio foi descartado e substituído por DEMEM FCS a 10 %contendo 10-5 M de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil.Após nova incubação nas circunstâncias acima durante 6horas, as placas foram lavadas intensivamente por PBS e privadas de soro. Às células pré-tratadas foi administra-do maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil até o final doexperimento. Em seguida à 18 horas de definhamento, amaioria das células estavam separadas, isto é, mortas, observadas microscopicamente, em cultura privada de soro,enquanto culturas pré-tratadas com maleato de cloreto deN-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil mostravam quadro similar ao das células decontrole. A viabilidade das células foi medida por teste de MTT baseado no método de Plumb e outros (Câncer Res.49: 4435 - 4444 (1989)). O método do sal de tetrazólio,envolvendo a conversão de MTT (brometo de (3-(4,5- dime-til tiazol -2- il)2,5- difenil tetrazólio) em formazonocolorido por células vivas, serviu como uma medida indi-reta da viabilidade da célula. O MTT também tinha sidoadicionado, diretamente, ao meio, em uma concentração de1 mg/ml. Após 2 horas de incubação a 37 °C no escuro, oflutuante foi removido e 200 μl de 0,005 M de HCl em iso-propanol foram adicionados, imediatamente, às células'. Odiâmetro externo das placas foi lido em 570 nm em umaleitora de placas ELISA (Labsystems Multiskan Biochorma-tic tipo: 348). Experimentos também foram realizados emcada caso pelo menos em triplicatas. A viabilidade rela-tiva das células foi calculada, definindo grupo de con-trole como 100 %.
9.1 (b) (2) Determinação de Anisotropia de Fluorescênciade Estado Constante
Suspensões de células de 1 χ 10 de células/ mlem PBS foram rotuladas pela adição de DPH-PA (ácido 3-[p-(6- Fenil)- 1,3,5- hexatrienil] fenil propiônico) dissol-vido em tetraidrofurano em uma concentração final de 0,1μΜ e incubadas por 10 minutos a 37 °C. A quantidade desolvente orgânico adicionado foi 0,05 % a fim de evitarseu efeito sobre as membranas celulares. A prova de mem-brana DPH-PA foi selecionada devido às propriedades decarga da prova, que permitem ao DPH-PA localizar, predo-minantemente, dentro da laminula externa da membranaplasmática, com a metade difenil - hexatrieno intercaladaentre as porções superiores das cadeias gordurosas deacil (Kitagawa, S e outros. J. Membrane Biol, 119: 221 -227 (1991)). DPH-PA mostra forte intensificação da fluo-rescência mediante ligação aos lipidios, proporcionandoum meio de avaliar a anisotropia da fluorescência comouma função da ordenação de lipidios. As mensurações dafluorescência foram realizadas em 37 °C, usando um espec-trômetro de luminescência formato-T Quanta Master QM(Photon Technology Int. Inc., NJ, USA) equipado com pola-rizadores na excitação e no curso duplo de emissão deluz. Os comprimentos de onda de excitação e emissão foram360 nm (5nm - largura da fenda) e 430 nm (5 nm - largurada fenda), respectivamente. As intensidades de flúores -cência medidas foram corrigidas para a flurorescência defundo e a dispersão da luz da amostra não rotulada. Aanisotropia da fluorescência foi calculada como
rs = (IVV - G. IVH)/(IW + (2 χ GxIVH))
onde IVV e IVH são intensidades observadas medidas compolarizadores paralela e perpendicularmente ao feixe deexcitação verticalmente polarizado, respectivamente. 0fator G iguala IVH/IHH e corrige a inabilidade do instru-mento para transmitir igualmente a luz diferentemente po-larizada e corrige a diferença na sensitividade dos doiscanais de emissão (Kitagawa, S e outros. J. Membrane Bi-ol. 119: 221 - 227 (1991)). IHV e IHH são as intensidadesde fluorescência determinadas em posições vertical e ho-rizontal do polarizador de emissão, quando o polarizadorde excitação é ajustado horizontalmente.
9.1 (b) (3) Análise Estatística
Os dados são relatados como ±SEM médio. A compa-ração e o cálculo estatístico foram realizados por umaanálise unidirecional de variância com teste de PosthocNewman - Keuls (Sistema de Cálculo Farmacológica). A si-gnificância estatística foi definida como P < 0,05.
9.1 (c ) Resultados
9.1 (c ) (1) Privação de soro como um modelo para testaro efeito citoprotetor do maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil
As células de WEHI e H9c2 privadas de soro mos-traram uma viabilidade relativa das células de 74,8 % e50,5 %, respectivamente. No caso de 10 5 M de maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil estar presente no meio de cul-tura, a administração resultou em um sobrevivência quasetotal de WEHI (93%) e uma alta proteção nas células domúsculo cardíaco H9c2 (82,75%). A diminuição da viabili-dade relativa da célula através da privação de soro e suaproteção pelo maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil em ambasas linhas de células foi significativa.
9.1 (c) (2) Efeito do maleato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (1- piperidinil) propoxi1 -3- piridina carboximidoilsobre a fluidez de células de mamíferos privadas de soro
Para examinar o efeito da privação do soro sobrea fluidez da membrana plasmática de células de mamíferos,em cultura, medições da anisotropia de fluorescência fo-ram realizadas usando-se a prova de membrana plasmáticaDPH-PA. As propriedades físicas das membranas plasmáticasdas células foram significativamente alteradas através daprivação de soro. A privação de soro causou uma diminui-ção pronunciada na anisotropia de fluorescência de DPH-PAque é um aumento anormal na fluidez da membrana plasmáti-ca em ambos os modelos de células investigados. Mediantea adição de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil foi ob-servada uma preservação quase completa do estado físicoda membrana. Essas mudanças foram obviamente consistentescom as tendências descritas com relação à viabilidade dascélulas.
9.1 (d) DISCUSSÃO
Ao resultar em prejuízos metabólicos, a privaçãode meio de cultura normal em ambos os tipos de célulasestudadas reduziu sua viabilidade conforme testado com ométodo de MTT. Esse efeito foi quase completamente rever-tido mediante a adição de maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil. A privação de soro induziu, também, alteraçõesdestacadas na fluidez das membranas plasmáticas, que ésabido contribuir para a disfunção da membrana que acom-panha os danos ao miocárdio. Ao contrário, as célulasprivadas de soro, desenvolvidas na presença de maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil foram capazes de preservar (oureter), parcialmente, seu estado físico normal da membra-na plasmática.EXEMPLO 10:
EFEITO DA INSULINA E DO MALEATO DE CLORETO DE N-Γ2- HI-DROXI - 3- Cl- PIPERIDINIL) -PROPOXIl -3- PIRIDINA CARBOXI-MIDOIL SOBRE O NÍVEL DE GRP-94 NO FÍGADO DE RATOS DIABÉ-TICOS STZ.
10.1 Antecedentes
Anóxia, definhamento de glicose e outras condi-ções graves, que afetam, adversamente, a função do retí-culo endoplásmico (RE) induzem a síntese da glicose emclasse regulada de proteínas de tensão (GRPs) (Lin. Η. Y.e outros Mol. Biol. Cell. 4: 1109 - 1119 (1993)). 0 ele-mento 94 kDa de GRPs. GRP-94, 50 % homóloga à proteína detensão 9 0 kDa, é uma proteína de ligação de cálcio Iume-nal do RE. Junto com outras proteínas do RE, a GRP-94 pa-rece funcionar como um protetor molecular (Nigem, S. K. eoutros, J. Biol. Chem. 263: 1744 - 1749)). É suposto queo acúmulo de protetor molecular GRP-94 teria um efeitobenéfico no reparo do dano celular induzido por diabetesSTX em ratos. Conseqüentemente, nos experimentos apresen-tados aqui foram comparados os vários níveis de GRP-94 emfígados de ratos sadios, diabéticos, tratados com maleatode cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi]-3- piridina carboximidoil e tratados com insulina maismaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil .
10.2 Materiais & Métodos
10.2 (a) Substâncias em teste: maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil (BIOREX Ltda)
Insulina (Protofano HM inj.)10.2 (b) Animais: Ratos machos Wistar (VAF mais) (250 -300 g)
Os animais foram abrigados 7 por gaiola em 2 3 -25 0C em 50 - 60 % de umidade relativa com ciclo luz- es-curo de 12/ 12 horas. Livre acesso foi proporcionado àcomida e à água.
10.2 (c) Indução de diabetes: Uma dose única de STZ (45mg/ kg i.v.) foi administrada em estado de jejum.
10.2 (d) Os animais foram divididos nos seguintes grupos:a . Animais sadios
1. Sadios tratados com solução salina durante 1 semana (n= 5)
1. Sadios tratados com solução salina durante 2 semanas(n = 5)
3. Sadios tratados com solução salina durante 4 semanas(n = 5)
4. Tratados com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil du-rante 1 semana (n = 7)
1. Tratados com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil du-rante 2 semanas (n = 7)1. Tratados com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil du-rante 4 semanas (n = 7).b. Animais diabéticos por STZ2. Diabéticos tratados com solução salina durante 1 sema-na (n= 5)
3. Diabéticos tratados com solução salina durante 2 sema-nas (n= 5)
5 4. Diabéticos tratados com solução salina durante 4 sema-nas (n= 5)
5. Diabéticos tratados com maleato de cloreto de N-[2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil durante 1 semana (n = 7)
1. Diabéticos tratados com maleato de cloreto de N-[2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil durante 2 semanas (n = 7)
2. Diabéticos tratados com maleato de cloreto de N-[2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil durante 4 semanas (n = 7)
c. Animais diabéticos por STZ insulinizados
13. Diabéticos tratados com insulina durante 1 semana(n = 7)
14. Diabéticos tratados com insulina durante 2 semanas(n = 7)
15. Diabéticos tratados com insulina durante 4 semanas(n = 7)
d. Animais diabéticos tratados com maleato de cloreto deN-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil e insulinizados
16. Diabéticos tratados com insulina e maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil durante 1 semana (n = 7)
17. Diabéticos tratados com insulina e maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil durante 2 semanas (n = 7)
18. Diabéticos tratados com insulina e maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil durante 4 semanas (n = 7)
Após os tratamentos, o fígado foi removido efoi, imediatamente, congelado em -70 0C em nitrogênio lí-quido .
Tratamento com maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil (onde aplicável): 20 mg/kg/ dia, ρ. o Tratamentocom insulina: duas vezes por dia em uma dose requeridapara manter o nível normal de glicose.10.2 (e) Determinação do nível de GRP-94.
Extração de proteína total solúvel de fígado derato.
Todas as etapas foram realizadas em 0 - 4 C. Osfígados dos ratos (cerca de 15 - 20 g) foram homogeneiza-dos com um misturador doméstico durante 2 minutos em 80ml de uma solução tampão detergente de lisina simples mo-dificada, contendo 50 mM de Tris - HCl pH 8,0. 5 MM deEDTA, 150 mM de NaCl, SDS a 0,1 %, Triton X-100 a 1 % e 1- 1 mM de inibidores de protease (PMSF, benzamidina, áci-do amino capróico). 0 homogenado foi centrifugado em20000 xg por 30 minutos, em uma centrífuga Servile RC28S. A maior parte do flutuante foi congelado a -20 °Ccomo uma amostra de estoque), 1 ml foi usado para a aná-lise.
A concentração de proteína foi determinada peloensaio de Bradford (Guide to Protein Purification,Methods in Enzimilogy, vol. 182, Μ. P. Deutscher (Ed.)Academic Press (1990) em três paralelas e foi ajustadapara 5 mg/ ml.
Eletroforese e Imunomanchamento
Técnicas de laboratório para eletroforese eimunomanchamento são descritas em detalhes em MolecularCloning, A Laboratory Manual, Ed. Sambrook, Fritsche, Ma-niatis, Bold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Pro-tein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Mem-brane, 3, Laboratory Manual, Millipore; e U. K. Laemmli,Nature; 227: 680 - 685 (1970). Cada amostra consistia de1,8 mg de proteína e foi solubilizada para eletroforesepor gel com 0,6 ml de tampão contendo 110 mM de Tris-HClpH de 6,9. 8,3 mM de mercaptoetanol, SDS a 3%, glicerol a3 % e um pouco de azul bromofenol e sacudida em tempera-tura ambiente durante 30 minutos. A eletroforese foi rea-lizada em gel de poliacrilamida a 8 % com 39 μg de prote-ína por faixa, em voltagem constante de 50 V durante anoite. As proteínas foram manchadas com Coomassie Bri-llant Coomassie R-250 ou transferidas para a membrana deImmobilone PVDF (Millipore) em corrente constante (300itiA) durante 3 horas a 4 0C em tampão de transferência (10mM de CAPS, pH 11; metanol a 10 %) . Locais não específi-cos da membrana foram bloqueados com BSA a 2 % em TPBS(solução salina tamponada com fosfato com Tween 20 a 0,1%) durante a noite, a 4 °C. A mancha foi incubada com an-ticorpo monoclonal de GRP94 (SPA-850, StressGen), diluídacom anticorpo monoclonal de HSP60 (SPA-600, StressGen)com diluição de 1:3000, durante 1 hora, em temperaturaambiente. A seguir, ela foi lavada com tampão de TBPS du-rante uma hora e incubada com anticorpo secundário de an-ti-rato conjugado com peroxidase de rábano (Sigma, dilui-ção de 1: 1400), durante 1 hora. Após sucessiva lavagemcom TPBS, a membrana foi desenvolvida com o sistema deECL (Amersham).
Uma série de diluição de proteína total ( 9/1 deamostra) foi manchada e desenvolvida paralelamente com asamostras a cada momento e uma curva de calibração foicalculada. As mudanças no teor de proteínas de tensão fo-ram quantificadas, usando-se um densitômetro Bio-Rad(Modelo 1650) e um Integrador Hewlett- Packard (HP 3394a)e corrigidas de acordo com a curva de calibração.
Análise Estatística
Os dados são relatados como +SEM médio. A compa-ração e o cálculo estatístico foram realizados por umaanálise de variância unidirecional com teste de PosthocNewman-Keuls (Sistema de Cálculo Farmacológico). A signi-ficância estatística foi definida como P < 0,05.
10.3 Resultados
Diminuição significativa do teor relativo deGRP-94 é observada em 1 semana, 2 semanas e 4 semanas emratos diabéticos. Esse efeito em animais diabéticos em 1semana e em 2 semanas poderia ser completamente revertidomediante o tratamento com maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil . A administração de insulina sozinha ou em combi-nação com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pi-peridinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil em amos-tras em 1 semana e em 2 semanas quase dobrou os níveisdessa proteína comparado com o estado do controle.
Em contraste com as descobertas anteriores, otratamento de ratos diabéticos durante 4 semanas por meiode maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil sozinho não re-sultou em alteração significativa na quantidade relativade GRP=94. Além disso, em ambos os grupos insulinizados,independente de se tratados ou não por maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil , foi observada uma recuperação deGRP-94 até o nível de controle.
EXEMPLO 11:
EFEITO DO MALEATO DE CLORETO DE N-[2- HIDROXI -3 - (1- PI-PERIDINIL) -PROPOXI1 -3- PIRIDINA CARBOXIMIDOIL NA PROTE-ÇÃO DE CÉLULAS EPIDÉRMICAS CONTRA DANOS CAUSADOS POR EX-POSIÇÃO AO CALOR E À LUZ ULTRAVIOLETA
11.1 Materiais e Métodos
A linha de células HaCaT é uma linha de célulasde ceratinócitos humanos ancuplóides, espontaneamenteimortalizadas, derivadas de pele de um ser humano adultonormal (Boukamp e outros, J. Cell Biol. 106 : 761 - 771(1988)). HaCaT é uma linha de células com plena capacida-de de diferenciação epidérmica, com ceratinização normale com caracter não tumorogênico. Essa linha de ceratinó-citos que se multiplicam rapidamente também é caracteri-zada pela presença de receptores esteróides. Células deHaCaT (4 χ 105 células por placa de Petri com um diâmetrode 35 mm) foram lançadas e desenvolvidas em DMEM suple-mentado por soro fetal de vitela a 5 % (Gibco, Cat. No.011-6290H) sob uma atmosfera umidificada de CO2 a 5% a 37°C. 24 horas após a colocação nas placas, as culturas fo-ram enxaguadas com PBS e tratadas por calor ou luz.
As culturas confluentes das células foram expos-tas ao calor (42, 44, 46, 47, 48 °C) ou fone de luz ul-travioleta. PUVA 4000 de Waldman foi usada com um espec-tro de energia de saída final entre 320 e 390 nm, compico em 3 65 nm. A saída de energia foi monitorada por umradiômetro IL-1700 equipado com sensor de UVA e UVB.
A morfologia das células foi monitorada usando-se microscópio de contraste de fase (Opton Axioplan Mi-croscope, com objetivos de contraste de fase de Plan -Apochromat Ph) . Os seguintes fatores foram consideradoscomo indicadores de citotoxicidade: (a) densidade reduzi-da de células aderentes; (b) perda de configuração regu-lar de "pedra arredondada" com alargamento de espaços in-tercelulares; (c ) alteração da forma da célula, porexemplo, impedimento da expansão, do intumescimento, doencolhimento picnótico e da fragmentação da célula; e (d)mudanças citoplásmicas, por exemplo, condensação ou va-cuolização. A viabilidade da célula também foi examinada,usando o teste de exclusão de azul tripan.11.2 Resultados
A sensitividade dos ceracinócitos de HaCaT àtensão pelo calor foi determinada pelo exame de sua via-bilidade. Os resultados indicaram que 24 horas após seremexpostas ao alor em uma temperatura de 48 °C, praticamen-te não havia células vivas (2,7 %), comparado com o con-trole (100 %) a 37 °C. A viabilidade dos ceracinócitos deHaCaT 24 horas após uma exposição ao calor de 45 0C de-monstrou ser 59 %. Não houve mudanças morfológicas nasculturas de HACaT 1 hora após a exposição ao calor. 24horas após o tratamento térmico em 46 0C ou temperaturamais alta, separação e mudanças morfológicas significati-vas na célula (p < 0,01) ocorreram, tais como, a perda deconfiguração regular de "pedra arredondada" com o alarga-mento dos espaços intercelulares, intumescimento, enco-lhimento picnótico e vacuolização de ceracinócitos de Ha-CaT . Em seguida à exposição à UV, verificou-se que a re-dução de células viáveis estava diretamente correlaciona-da com a dose de UVA.
pré-condicionamento das células com calor (42 °Cdurante 1 hora) ou maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil(em uma concentração de 5 χ 10 M durante uma hora) do-tou as células de proteção contra uma exposição a um ca-lor de 48 °C. Quando as células foram examinadas 24 horasapós o tratamento a 48 °C, verificou-se que, comparado àscélulas que não foram tratadas, a viabilidade da célulaaumentou em 48 % (quando pré-condicionada com 42 °C) e 84% (com pré-tratamento de maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil . A proteção mais pronunciada (aumento de 140 % naviabilidade) pôde ser observado em caso de um tratamentocombinado (com 42 0C e maleato de cloreto de N-[2- hidro-xi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximi-doil).
O pré-condicionamento pelo calor com 42 °C, masnão com 44 0C e 45 °C, induziu uma redução notável da ci-totoxicidade devido à luz UV. Um tratamento com 42 °Cproporcionou proteção tanto na exposição de 2 quanto nade J/ cm2 . A viabilidade de ceracinócitos HaCaT pré-tratadas aumentou para 132 % (em J/ cm2 ) e 218 % (em 4 J/cm2 ) comparado com as células expostas à UV sem pré-tratamento (100 %) .
EXEMPLO 12:
EFEITO DO MALEATO DE CLORETO DE Ν-Γ2- HIDROXI -3-(l- PI-PERIDINIL) -PROPOXII -3- PIRIDINA CARBOXIMIDOIL NA INDU-CÃO DE EXPRESSÃO DE PROTETORES MOLECULARES EM TECIDOS DE
PELE HUMANA
A luz ultravioleta UVB (290 - 320 nm) é um doscomponentes da luz solar e é conhecida por causar danos àpele. O papel do maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil naredução dos danos causados aos tecidos da pele pela expo-sição à UVB foi investigada, bem como efeito do maleatode cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi]-3- piridina carboximidoil no aumento da expressão deprotetor molecular nos tecidos da pele.
12.1 Materials e Métodos
Tecidos de pele humana foram enxertados em ca-mundongos com imunodeficiência (SCID). 0 protocolo expe-rimental envolveu um tratamento de um grupo de camundon-gos com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pipe-ridinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (5,0 mg/kgi.p.) e o outro com a solução solvente de NaCl (300 μl)durante 7 dias. No oitavo dia, grupos de camundongos fo-ram expostos à luz de UVB (100 mJ/ cm2 ) nas 24 horas sub-seqüentes à exposição, biópsias de pele foram retiradaspara exames histológicos (seções manchadas com hematoxi-lina e eosina) e imuno-histológicos (técnica de imunoflu-orescência indireta com anticorpo monoclonal, mAB).
12.2 Resultados
Em camundongos irradiados com UV, que foram pré-tratados com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil , sinaisclínicos de danos devido à exposição à UV nem puderam serobservados. Em contraste, em um dos animais não tratadosuma reação pustulosa da área transplantada foi encontra-da. Além disso, estudos de imunofluorescência indireta,usando mAB de hsp7 2 mostraram uma mancha linear, intensa,ao longo da zona de membrana de base da pele humana e decamundongos dos animais tratados com maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil. A mesma reação não pôde ser observa-da na pele dos animais não tratados. Além disso, um tiponuclear de mancha de granulócitos estava presente na pús-tula (reação inflamatória da pele) do animal não tratado.
Conseqüentemente, a administração de maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil aos tecidos da pele resultou emformação aumentada de hsp72 em tecidos da pele e propor-cionou proteção contra provenientes da exposição à UV.12.3 A determinação do nível de HSP-70 da pele: análisede mancha de Western de proteínas derivada de UVB e UVB +pele humana tratada com maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil enxertada em camundongos SCID.
Métodos:
a. Extração de proteína solúvel total da pele.
Todas as etapas foram realizadas em temperaturaambiente. A pele (cerca de 9 - 35 mg) foi cortada em pe-daços minúsculos e homogeneizado com pilão de vidro foscoem tubos de Eppendorf durante 2 minutos em (2 μl/ μg depele) de tampão de Laemmli concentrado duas vezes (65 mMde Tris-HCl, pH 6,8; 5 % de β-mercaptoetanol; SDS a 2%;10 % de glicerol; 0,1 % de azul bromofenol; todos essesmateriais eram produtos da Sigma). Então, as amostras fo-ram solubilizadas por mais 60 minutos com agitação contí-nua. Os homogenados foram centrifugados em 10.000 rpm por10 minutos, antes do carregamento no gel.
b. Eletroforese e Imunomanchamento [5, 7, 8]A eletroforese foi realizada em gel de poliacri-lamida a 8 % com 10 ul de amostra por faixa em voltagemconstante (50 V) durante a noite.
As proteinas foram manchadas com Azul BrillantCoomassie R-250 ou transferidas para a membrana de Immo-bilone PVDF (Millipore) em corrente constante (300 mA)durante 3 horas a 4 0C em tampão de transferência (10 mMde CAPS, pH 11; metanol a 10 %) .
Locais não específicos da membrana foram bloque-ados com BSA a 2 % em TPBS (solução salina tamponada comfosfato com Tween 20 a 0,1 %) durante a noite, a 4 °C. Amancha foi incubada com anticorpo monoclonal de HSP-70(SPA-8dc, StressGen), com diluição de 1:1500, durante 1hora, em temperatura ambiente. A seguir, ela foi lavadatrês vezes com tampão de TBPS durante uma hora e incubadacom anticorpo secundário de anti-rato conjugado com pero-xidase de rábano (Sigma, diluição de 1: 1500), durante 1hora.
Após sucessiva lavagem com TPBS (três vezes), amembrana foi desenvolvida com o sistema de ECL (Amer-sham).
EXEMPLO 13:
EFEITO DO MALEATO DE CLORETO DE N- [2- HIDROXI -3-(l- PI-PERIDINIL) -PROPOXII -3- PIRIDINA CARBOXIMIDOIL NA ATIVA-CÃO DE FORMAÇÃO DE HSP E PROTEÇÃO CONTRA FOSFORILACÃO
OXIDATIVA
13.1 AntecedentesTem sido mostrado que a exposição de células deSaccharomyces cerevisae ao choque térmico (5 minutos em42 - 44 °C) resultou em um prejuízo do acoplamento defosforilação oxidativa e sistema de transporte mitocon-drial de elétrons, afetando a capacidade das células parasintetizar ATP (Patriarca e outros, Biochemistry and CellBiology, 70: 207 - 214, 1992). Contudo, quando as célulasforam pré-tratadas com maleato de cloreto de N-[2- hidro-xi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximi-doil por um curto período de tempo a 37 °C antes do cho-que térmico, ele atenuou o prejuízo do acoplamento e pro-tegeu a síntese de ATP mitocondrial. A inibição da sínte-se de proteínas ou RNA citoplásmico durante o choque tér-mico parece impedir essa proteção do acoplamento da fos-forilação oxidativa e do sistema de transporte mitocon-drial de elétrons, que é perturbado quando células sãoexpostas à tensão fisiológica, por exemplo, ao choquetérmico.
Nesta seção, o maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil é administrado às células antes de serem expostasao choque térmico e seu efeito sobre a proteção do aco-plamento da fosforilação oxidativa com o sistema detransporte mitocondrial contra a tensão térmica é exami-nado .
Também foi investigado se a atividade dos fato-res de transcrição de AP-1 e P 1 podem ser modulados pormaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil em células de levedu-ra expostas às várias condições de tensão.
13.2 Materiais & Métodos
O protocolo experimental para a determinação doprejuízo da fosforilação oxidativa e da sínteses de ATPmitocondrial em Saccharomyces cerevisiae é proporcionadoem Patriarca e outros. Biochemistry and Cell Biology, 70:207 - 214, 1992, a referida referência sendo aqui comple-tamente incorporada por referência.
Às células de S. cerevisiae que foram mantidas a25 °C, concentrações variadas de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil foram introduzidas (concentrações entre 10e 100 uM), as células foram, então, incubadas durante umahora a 25 0C na presença de maleato de cloreto de N- [2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil . A temperatura foi, então, aumentada para 42 0Ce as medições oxigráficas foram tomadas conforme descritona referência de Patriarca.
As células tratadas com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil foram testadas para indução concomitante degenes de hsp, usando o procedimento da Mancha de Nor-thern. 0 método de extração, purificação de mRNAs das cé-lulas eucarióticas e análise do RNA assim obtido, usando-se o procedimento da mancha de Northern é bem conhecidona técnica e descrito em Maniatis e Maresca e outros. Ar-chives Medicai Research 24: 247 - 249 (1993), ambas asreferências sendo aqui completamente incorporadas. 0 pro-tocolo da mancha de Northern também é descrito no Exemplo7, apresentado acima. Seqüências de DNA de Hsp26 e hsp70foram usadas como provas.13.3 Resultados13.3.1
A Figura 4 é a análise de mancha de Northern demRNA de hsp26 induzida em S. cerevisiae, ilustrando osresultados obtidos do experimento. A concentração do com-posto químico administrada às células e a duração da in-cubação no compostos são indicadas.
Nas células que foram incubadas na presença demaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)
propoxi] -3- piridina carboximidoil (10 - 100 μΜ) durante5 minutos a 1 hora em 25 °C, a indução de hsp 26 foi ob-servada. Os resultados também parecem indicar que a indu-ção ocorre mesmo após 5 minutos de incubação.
Verificou-se, também, que concentrações entre 10
e 100 μΜ de composto de teste foram efetivas na reduçãodo prejuízo do acoplamento entre a fosforilação oxidativae o sistema de transporte mitocondrial de elétrons, queresulta do choque térmico. A proteção contra o prejuízoda síntese de ATP mitocondrial estava na faixa obtida,quando a termotolerância foi induzida por pré-condi-cionamento das células através de exposição das mesmas àtemperatura intermediária de 37 0C ( proteção de 40 - 60%) .
13.3.2O efeito do álcool benzílico em (a) atividade deciclase de adenilato e (b) o estado físico de membranasde plasma de tiróide bovina é mostrado na Figura 5. 0efeito do álcool benzílico sobre (a) a atividade de ci-clase de adenilato e (b) o estado físico das membranas doplasma de tiróide bovina. A mudança na atividade de ci-clase de adenilato (a) é mostrada para atividade basal(o-o), de enzima estimulada por TSH (-), estimulada por
forscolina (Δ-Δ), estimulada por coleratoxina (V-V) eestimulada por fluoreto (à -à) . As membranas foram incu-badas com as drogas antes da adição de fatores de acopla-mento. o estado físico da membrana foi avaliado em segui-da à anisotropia de Fluorescência de estado constante (b)de diversos fluoróforos incrustados nas membranas: DPH(o-o), 12-AS ( - ) e TMA-DPH (Δ-Δ). As medições foram re-alizadas em 37 °C. A proporção molar de fluoróforo/ Iipi-dio sempre foi 1:500.13.3.3
Os experimentos provaram que o maleato de clore-to de N-[2- hidroxi -3-(1-piperidinil) propoxi]-3- pi-ridina carboximidoil exerce uma influência significativasobre a atividade de AP-I e seu efeito é determinado pe-las condições metabólicas atuais das células. Enquanto omaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil aumenta a atividadede AP-I, se o suprimento de nutrientes for inadequado, emmeio rico ele diminui a atividade do fator. 0 efeito dadroga é mais pronunciado em culturas de cepas recentes,densas . A tendência oposta poderia ser vista para P 1.Sua atividade diminuía, se maleato de cloreto de N-[2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil fosse administrado às células em um meio mínimo.É concebível, que a regulação de P-I fosse eliciada pelasmuitas mudanças na maquinaria anti-tensão das célulascausadas pela ativação de AP-I induzida por maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil. É notado que P-I respondeu atodos os tipos de tensões, mas sua atividade não foi in-fluenciada pelo material em teste. Nossas importantesdescobertas, especialmente com AP-1, poderiam explicarmuitos facetas da atividade in vivo da droga e serão dis-cutidas em detalhes.
O efeito do maleato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil(B) sobre a expressão do gene de hsp na cultura de teci-dos é mostrado na Figura 6. As células de HeLa foramtransfectadas com uma construção de plasmídeo de relató-rio em que o promotor de gene de hsp7 0 humano foi fundidoao gene de relatório de luciferase. O efeito do choquetérmico e/ ou do maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil so-bre o promotor de hsp foi determinado por mensuração daatividade de luciferase em luminômetro e por determinaçãodo nível de proteína de hsp (expresso do gene cromosso-mal) na mancha de Western.As amostras são:
1: nenhum controle de DNA; 2: 10 μg de DNAtransfectado em to, nenhum choque térmico; 3: 10 μg deDNA transfectado em to 60 minutos, choque térmico 24 ho-ras mais tarde; 4: como anterior maleato de cloreto deN-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil (B) em t0; 5: 10 μα de DNA transfectado emto + maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperi-dinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (B) em to; 6:10 μα de DNA transfectado em to 60 minutos de choque tér-mico 24 horas mais tarde maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil (B) adicionado no momento do choque térmico; 7: 10μg de DNA transfectado em t0 60 minutos de choque térmico24 horas mais tarde maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil(B) adicionado em tempo 0 e no momento do choque térmico;8: 10 μα de DNA transfectado em t0 sem choque térmico,maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil (B) adicionado emtempo 0 e 24 horas mais tarde.
EXEMPLO 14:
EFEITO DO MALEATO DE CLORETO DE N-[2- HIDROXI -3-(1- PI-PERIDINIL) -PROPOXI] -3- PIRIDINA CARBOXIMIDOIL NA INDU-CÃO DE PROTETOR MOLECULAR EM CÉLULAS DE TUMORES.
O choque térmico não letal aumenta a sensitivi-dade à lisina mediada por células de NK em 1,5 vezes eaquele choque térmico mais tratamento com maleato de clo-reto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3-piridina carboximidoil tem um efeito sinergistico sobre alisabilidade de células K562. Esse efeito adicional apre-sentado pelo maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil resultouclaramente da expressão elevada da membrana plasmática dehsp7 2, uma vez que estudos de bloqueio com anticorpos invivo (usando Ab monoclonal específico de hsp72) revelaramuma forte inibição de NK-Iisis.
Na Figura 7, o efeito do maleato de cloreto deN-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil (B) sobre os níveis de hsp72 induzidos porchoque térmico é mostrado. O maleato de cloreto de N-[2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil sozinho não aumentou os níveis de hsp72, enquan-to a combinação de choque térmico e tratamento com malea-to de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) pro-poxi] -3- piridina carboximidoil resultou em um aumentosignificativo de expressão de hsp72, comparado com o cho-que térmico sozinho.
14.1 Antecedentes
As proteínas de choque térmico são conhecidaspor estar localizadas no citoplasma, onde elas desempe-nham uma variedade de funções de proteção. Em células detumores, porém, hsp é relatada como sendo expressa tambémna superfície da membrana da célula (Ferrarini. M. e ou-tros. Int. J. Câncer, 51, 613, 619 (1992)). Experimentosparecem indicar que hsp aumentado (por exemplo, hsp7 0) nasuperfície da célula é induzida por exposição das célulasde tumor ao choque térmico não letal e esse aumento secorrelaciona com uma sensitividade aumentada de célulasexterminadores naturais (NK) de CD-3, específicas de IL-2, para as células de tumor. Uma vez que as células NKsão relatadas como participando na infiltração e na mortedas células tumorígenas in vivo (Kurosawa, S. e outros,Eur. J. Immunol. 23: 1029, (1993)), essa sensitividadeaumentada de células NK. Assim, se a expressão de hsppode ser induzida em células tumorígenas, com hsp aumen-tada na superfície da células, ela pode permitir que seatinja melhor as células tumorígenas pelas células NK.Desse modo, se a expressão de hsp pode ser induzida emcélulas tumorígenas, com hsp aumentado na superfície dacélulas, ela pode permitir melhor alvo e morte dessas cé-lulas pelas células NK. Nesta seção, o efeito do maleatode cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi]-3- piridina carboximidoil na indução da expressão dehsp72 em células tumorígenas é examinado.14.2 Materiais & Métodos:
Células K562 humanas, uma linha de células tumo-rígenas miclóides derivada de um paciente com leucemiamielégena crônica em fase de blastócito (ATCC. CCL243),foram usadas (Lozzio, BC, e Lozzio, BB Blood 45: 321,197 5). Células com desenvolvimento exponencial foram tra-tadas com 5 χ 10 5 M de maleato de cloreto de N- [2- hi-droxi -3-(1- piperidinil) propoxi]-3- piridina carboxi-midoil , durante a temperatura não letal (42 °C) por 2horas. Em seguida a um período de recuperação de 16 horasa 37 °C, as células foram testadas quanto ao nível do te-5 or de hsp72 por fluxo- citometria (Mulhoff e outros.,Int. J. Câncer: 61: 272 - 279, (1995). 0 tratamento commaleato de cloreto de N-[2- hidroxi-3-(1- piperidinil)propoxi]-3-piridina carboximidoil resultou em um nívelacentuado de hso72 nas células tumorígenas.
EXEMPLO 15:
INTERAÇÃO DO MALEATO DE CLORETO DE N-Γ2- HIDROXI -3-f1-PIPERIDINIL) -PROPOXII -3- PIRIDINA CARBOXIMIDOIL COMMEMBRANAS DE LIPÍDIOS. UM ESTUDO DE MONOCAMADA.15.1 Antecedentes
0(s) mecanismo(s) pelos quais a tensão (física,patofisiológica, etc) é detectada como um sinal e trans-duzida para o aparelho transcricional é até agora desco-nhecido. Foi suposto que o estado físico da matriz de Ii-pídios da membrana, que determina a estrutura e a funçãodas proteínas ligadas com a membrana, está diretamenteenvolvido na percepção de mudanças de temperatura e que,sob condições de choque térmico (CT), a perturbação daestrutura da membrana causa a transdução de um sinal queinduz a transcrição de genes de CT. Paralelamente com aindução da tolerância de tensão, foi mostrado que o male-ato de cloreto de N-[2-hidroxi-3-(1-piperidinil)pro-poxi]-3-piridina carboximidoil intensifica a eficáciadas células em detectar e assinalar várias condições detensão através da regulação ascendente da expressão dealguns genes de proteção.
É sabido que a técnica da monocamada, usando ca-madas de lipidios mononucleares na interface ar - água éum instrumento efetivo para a verificação da presença deinterações entre as membranas e os agentes ativos dasmembranas. O comportamento do sistema de bicamadas é mui-to similar àquele do sistema de monocamadas em muitos as-pectos (área molecular dos constituintes da membrana,ação de fosfolipase, orientação de proteínas inseridas,etc). Através da medição das mudanças de pressão superfi-cial, causadas pelas moléculas inseridas em monocamadas,torna-se possível conhecer a dimensão molecular da interação.
0 pré-requisito crucial da suposição de que al-gum maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil mediado anteri-ormente, disparando eventos em respostas de tensão quepodem ocorrer na membrana celular, é para proporcionarevidências sobre a interação física direta do maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil com os constituintes da membra-na. 0 objetivo do presente estudo era investigar a inter-ação do maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pipe-ridinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil com as mem-branas, através do suo de diferentes monocamadas de lipi-dios como sistema modelo para as membranas biológicas.
15.2 Materiais e MétodosOs experimentos com as monocamadas foram reali-zados em uma placa de Teflon, com um volume de 6,5 ml euma área de superfície de 8,8 cm2 a 25 °C em um instru-mento de Langmuir - Blodgett KSV3000 (KSV InstrumentsLtda, Helsinki, Finlândia) essencialmente como descrito.Camadas mononucleares de lipídios, consistindo de 1,2-dipalmitol-sn- glicero -3- fosfocolina (DPPC), fosfati-dilglicerol de gema de ovo (EggpG) ou cardiolipina de co-ração bovino (BHCL), foram disseminadas de soluções delipídios em clorofórmio, a fim de proporcionar a desejadapressão superficial inicial em uma subfase de 10 mM defosfato de Na (pH 7,0). A subfase foi agitadas, continua-mente, com uma barra magnética, dissolvida em H2O, foiadicionado embaixo da monocamada através de um orifíciona câmara de Teflon conectada à subfase. Os volumes inje-tados foram sempre < 1% do volume total da subfase. Apressão superficial foi medida pelo método de Wilhelmy,usando uma placa de platina. Os dados sobre o aumento dapressão superficial foram extraídos dos arquivos de dadosbrutos através do uso do software LB5000 do sistema demensuração de Langmuir - Blodget.
15.3 Resultados
A interação de maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil com diferentes fosfolipídeos foi testada atravésda medição do aumento da pressão superficial induzidapela droga de monocamadas de lipídios disseminadas na in-terface ar - água (Figura 8). As monocamadas no presenteestudo foram formadas de DPPC, EggPG e BHCL e a quantida-de de aumento de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil foiadicionada em duas concentrações (10 6M, 10 5M) à subfa-se. A adição da droga embaixo de uma monocamada de lipí-dios resultou em um aumento da pressão sangüínea que eradependente das concentrações de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil na subfase em todos os casos. Havia, porém,uma diferença notável no perfil da pressão sangüínea dasdiferentes monocamadas de lipídios. No caso de DPPC zwi-tteriônicos, a pressão mudou, rapidamente, após a injeçãode maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil , a seguir, elapermaneceu em um nível constante. Através do uso de mono-camadas contendo o BHCL carregado negativamente, o perfilda pressão sangüínea mostrou uma cinética de inserção tí-pica, que a pressão aumentada por cerca de dois minutos,após o que ela alcançou um nível de equilíbrio. Na pre-sença de PG, a cinética de inserção da droga foi similaràquela observada com o BHCL, porém, após alcançar um cer-to valor, a pressão começou na subfase. Uma explicaçãopossível para esse fenômeno é a remoção de maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil - complexos de EggPG da inter-face, uma vez que a diminuição da pressão continuou, mes-mo após alcançar a pressão inicial da monocamada de lipí-dios pura.Para se conhecer melhor a interação específicade maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil com as monocama-das de lipídios, o aumento da pressão superficial induzi-do pela droga foi medido em pressão superficial inicialdiferente (Figura 8). O método de extrapolação para apressão superficial inicial elevada permite o cálculo daspressões de inserção limite para a molécula, em que elanão é mais capaz de inserir na monocamada. As pressõessuperficiais iniciais limitadoras extrapoladas foram 89mN/m e 39 mN/m para BHCL e para DPPC, respectivamente. Nocaso de monocamadas, contendo o BHCL negativamente carre-gado, os aumentos de pressão foram sempre maiores do queaqueles encontrados para o DPPC zwitteriônico através dasugestão da importância de interações eletrostáticas.
As investigações servem à primeira evidência, deque, mediante a administração de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil em concentrações fisiologicamente relevan-tes, ele é capaz de interagir com as membranas de lipí-dios, de maneira específica como um grupo - chave.
Na Figura 8, a interação do maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil (B) e as camadas monomoleculares delipídios é mostrada. Nas setas, o maleato de cloreto deN-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil foi adicionado à subfase nas concentraçõesindicadas. Na Figura 9, o aumento na pressão superficialé apresentado após a injeção de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil (B) embaixo de monocamadas de BHCL ou DPPCem diferentes pressões iniciais. A concentração de malea-to de cloreto de .N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) pro-poxi] -3- piridina carboximidoil na subfase foi 10 μmol.A análise de regressão linear dos dados experimentais re-sultou em coeficientes de correlação de 0,844 e 0,995para monocamadas de BHCL e DPPC, respectivamente.
EXEMPLO 16:
EFEITO PROTETOR DO MALEATO DE CLORETO DE N-Γ2- HIDROXI -3-fl- PIPERIDINIL) -PROPOXI1 ~3~ PIRIDINA CARBOXIMIDOILCONTRA CITÓCINOS CITOTÓXICOS E CICLOEXIMIDA16.1 Antecedentes
A finalidade desses estudos era investigar umapossível ligação entre a produção de citócinos e as mu-danças patofisiológicas contra as quais o maleato de clo-reto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3-piridina carboximidoil parece ser protetor.
Os dados sugerem que o maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil é um agente citoprotetor para as células detecido em cultura tratadas com citócinos citotóxicos. Otratamento com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil au-mentou a taxa de sobrevivência de células de WEHI 164 (eoutras células de mamíferos) tratadas com TNF. Esse efei-to era dependente da concentração , mas não era direta-mente proporcional à concentração da droga. 0 grau deproteção proporcionado proporcionado pelo tratamento commaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil foi variável de expe-rimento para experimento, embora a resistência aumentadadas células tratadas aos citócinos citotóxicos fosse,claramente, uma tendência em todos os experimentos. Aproteção proporcionada pelo tratamento com maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil não era muito grande, porém, emum animal vivo, mesmo esse grau de proteção poderia tersido suficiente para moderar ou impedir os processos pa-tofisiológicos.
16.2 Objetivo do estudo
Os níveis de TNF no soro e a inducibilidade demacrófagos de animais de controle e diabéticos por STZforam medidos. As atividades de TNF no soro induzidas porLPS foram significativamente acentuadas em ratos com dia-betes induzida por STZ ( 6 a 18 semanas de idade) em com-paração com as de ratos não diabéticos, durante o primei-ro mês do diabetes.
16.3 Resultados
A concentração média de TNF no soro (medida porrádio-imuno ensaio) do grupo diabético foi significativa-mente maior (480 ± 96 U/ml) do que em controles sadios(345 ± 48 U/ml) . (Foss e outros, 1992 Braz J. Med. Biol.Res. 25. 239 relatou resultados similares em pacienteshumanos). Dentro do grupo diabético, não houve correlaçãoentre os níveis de TNF no soro e a duração do diabetes.Verificou-se que o TNF biologicamente ativo no soro deanimais diabéticos pelo ensaio da citotoxicidade em célu-las de L929. A diferença entre o RIA e as medições de ci-totoxicidade indica a presença de altos níveis de antago-nistas solúveis de receptor de TNF (uma molécula proteto-ra, anti-inflamatória), sugerindo o envolvimento do TNFem complicações diabéticas.
- maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pi-peridinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil teve umefeito inesperado sobre células de levedura ( e sobre cé-lulas humanas ou animais diplóides, normais, diferentes,em cultura). A influência do maleato de cloreto de N-[2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil foi especialmente impressivo na presença de bai-xa concentração da cicloeximida, antibiótico inibidor docrescimento). As colônias de células de levedura, desen-volvidas na presença do maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil e cicloeximida, não mostraram uma incidência au-mentada de mudanças genéticas (mutações resistentes aosantibióticos) apenas resistência metabólica maior contrao efeito inibidor da cicloeximida sobre a síntese dasproteínas.
De acordo com essas mensurações, os efeitos domaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil podem ser descobertosna atividade aumentada do fator de transcrição de AP-1,que medeia os efeitos dos fatores mitogênicos e os dife-rentes tipos de tensão. Os resultados indicam, também,que o composto de teste acima e os compostos similaresinfluenciam a desintoxicação de AP-I e, possivelmente,outros fatores de transcrição, através da manutenção dosefeitos dos fatores de desenvolvimento e das condiçõesdas tensões metabólicas.
Na Figura 10, a produção de TNF induzida por LPSin vitro de macrófagos isolados de animais diabéticos porSTZ (1) e normais (2). Na Figura 11, o maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil induziu a proteção de ceratinócitoscontra o efeito inibidor do desenvolvimento da cicloexi-mida. Na Figura 12, o maleato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil(B) induziu a proteção das células (células endoteliais)contra os efeitos tóxicos da cicloeximida. Na Figura 13,o maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (B) induziu aproteção de células cervicais humanas HeLa contra o efei-to inibidor do desenvolvimento do antibiótico cicloeximi-da. Na Figura 14, o maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil(B) induziu a proteção das células do músculo cardíacocontra o efeito inibidor do desenvolvimento do antibióti-co cicloeximida. E, na Figura 15, o efeito do maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil maleato de cloreto de N-12- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil (B) sobre a atividade do fator de transcrição dePl em células de levedura AB1380 é demonstrado. A fileira6 representa os valores médios. A fileira 5 está vazia.Na Figura 16, o efeito do maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil sobre a atividade do fator de transcrição de APlem células de levedura JFl. A fileira 11 representa osvalores médios. Na Figura 17, o efeito do maleato de clo-reto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3-piridina carboximidoil (B) sobre a atividade do fator detranscrição Pl em células de levedura AB1380 é demonstra-do. A fileira 6 representa os valores médios. A fileira 5está vazia.
EXEMPLO 17:
EFEITOS CARDIOPROTETORES DO MALEATO DE CLORETO DE N-[2-HIDROXI - 3-(1- PIPERIDINIL) -PROPOXII -3- PIRIDINA CARBO-XIMIDOIL EM CORAÇÕES DE RATOS ISOLADOS
17.1
O objetivo do estudo era investigar o efeitocardioprotetor e antiarrítmico do maleato de cloreto deN-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil em corações de ratos isolados.
17.2 Métodos
Após uma perfusão com trabalho aeróbico de 10minutos, corações (n = 10 em cada grupo) foram submetidosa uma oclusão coronária de 10 minutos, seguida por umareperfusão de 3 minutos, na presença de 0,05; 0,5; 5,0;20,0 e 50 mg/L de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil ,respectivamente.
Nos novos estudos, os ratos foram pré-tratadoscom a dose mais efetiva (20 mg/ kg) de maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil , uma e cinco horas antes do isolamen-to dos corações, respectivamente. Após a excisão dos co-rações, eles foram submetidos ao protocolo de oclusão co-ronária, detalhado acima, enquanto em reperfusão, na pre-sença/ ausência de 20 mg/ 1 de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil .
Em experimentos separados, os efeitos da tensãopelo calor, a isquemia, o maleato de cloreto de N-[2- hi-droxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboxi-midoil e sua combinação foram estudados com relação aoteor de proteína HSP-70 miocardial.. Os corações isoladosforam submetidos à tensão pelo calor (42 °C), isquemianormotérmica global, e perfusão de maleato de cloreto deN-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil , seguida por reperfusão durante 120 e 180minutos, respectivamente.17.3 Resultados
Antes da isquemia, o maleato de cloreto de N-[2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil aumentou o fluxo coronário (FC) com uma relaçãoconcentração - resposta em forma de sino. Outros parâme-tros funcionais cardíacos não foram mudados por concen-trações menores da droga. O maleato de cloreto de N- [2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil em 50 mg/l causou bradicardia significativa, umaredução no fluxo aórtico (FA) e +dP/dtmax e um aumento napressão diastólica final ventricular esquerda (LEVEDP)antes da isquemia. No grupo de controle, a oclusão coro-nária diminuiu acentuadamente FC, FA, +dP/dtmax e aumen-tou LVEDP. 0 maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil alivioua deterioração por isquemia induzida da função cardíacacom uma relação concentração - resposta em forma de sino.A concentração de 20 mg/l de maleato de cloreto de N- [2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil mostrou o efeito anti-isquêmico mais pronuncia-do. A reperfusão após 10 minutos de oclusão coronáriadisparou a fibrilação ventricular (FV) em todos os cora-ções do grupo de controle. Concentrações maiores de male-ato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) pro-poxi] -3- piridina carboximidoil resultaram em um efeitoantiarrítmico dependente da dose.
Após um pré-tratamento de uma hora, o maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil ainda proporcionou o efeitocardioprotetor e potencializou os efeitos agudos do com-posto. Cinco horas após o pré-tratamento, o efeito cardi-oprotetor não foi observável, porém, alguns dos efeitosagudos da perfusão do maleato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoilforam aumentados.
O composto sozinho não aumentou o teor de HSP-70miocardial. 0 teor de HSP-70 estetiocardial foi acentua-damente elevado devido à tensão térmica, porém, a isque-mia resultou em uma elevação suave de HSP-70. Não obstan-te, quando a isquemia foi induzida na presença de 20 mg/lde maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidi-nil) propoxi] -3- piridina carboximidoil , o teor de HSP-70 foi aumentado até, aproximadamente, o mesmo nível,conforme verificado após a tensão térmica.
Foi concluído que o maleato de cloreto de N- [2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil exerce um efeito anti-isquêmico e anti-arrítmico. Verificou-se que a concentração de 20 mg/lproduz acentuado efeito anti-isquêmico e anti-arrítmicono coração de rato isolado. Quando o efeito anti-isquêmico direto da droga desaparece após uma hora, aindaaumenta o grau de proteção proporcionado por tratamentoagudo com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pi-peridinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil . O malea-to de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) pro-poxi] -3- piridina carboximidoil e a tensão térmica, jun-tos, induzem uma síntese rápida do HSP-70 no coração dorato. O maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pipe-ridinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil sozinho nãoafeta a síntese de HSP-70.Nas Figuras 18 - 19, os níveis de proteína hsp,determinados por mancha de Western, são demonstrados apartir de ratos de controle, submetidos ao choque térmi-co, tratados da isquemia, tratados com maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil (B) e tratados de isquemia + maleatode cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi]-3- piridina carboximidoil (isquemia + Β), seguido porrecuperação de 2 (Figura 18) ou 3 horas (Figura 19).
EXEMPLO 18:
MALEATO DE CLORETO DE N-f2-HIDROXI-3-f1-PIPERIDINIL)-PROPOXI1 -3- PIRIDINA CARBOXIMIDOIL PROTETOR - FOMENTADORNA PREVENÇÃO E NO REPARO DE DANOS À PELE; PROTEÇÃO CONTRALUZ ULTRAVIOLETA B EM RATO COM DOENÇA DE IMUNODEFICIÊNCIACOMBINADA GRAVE ENXERTADO COM PELE HUMANA E A CICATRIZA-CÃO ACELERADA DE FERIDA EM RATO DIABÉTICO18.1 Antecedentes
Hsps parecem representar um papel geral na pro-teção fisiológica da pele contra tensão ambiental, Comoprotetores moleculares, elas participam na prevenção e noreparo de danos causados por várias exposições, taiscomo, trauma mecânico, luz, calor e danos químicos, in-fecções, etc. (Ε. V. Maytin, JID 104: 448, 1995). Em con-dições patológicas, tais como diabetes mellitus, a funçãoatenuada de certas hsp tem sido relatada (M. Cherian e E.C. Abraham, Biochem. Biophys. Res. Com. 212: 184, 1995).Uma vez que o maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil demons-trou atuar como um fomentador de proteção (Vigh e outros,em preparação), espera-se que a droga seja capaz de acen-tuar mais os vários mecanismos de proteção e reparo.
A finalidade do presente estudo era testar oefeito da administração sistêmica (i) e tópica (ii) domaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil (i) na proteção con-tra danos à pele induzidos por luz UVB em pele humana en-xertada em diversos camundongos com doença de imunodefi-ciência combinada grave (SCID).
(i) no reparo de processo de cicatrização de fe-rida destruída em ratos diabéticos por STZ.
(ii) camundongos SCID transplantados com pelehumana, tratados por maleato de cloreto de N-[2- hidroxi-3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil(5,0 mg/ kg i.p.) ou veiculo foram expostos à luz EVB(100 mJ/ cm2 ). Após 24 horas, biópsias foram retiradaspara exame histológico e para determinação de hsp72,usando técnicas da mancha de Western e imuno- histológi-cas. 0 pré-tratamento com o maleato de cloreto de N-[2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil impediu o dano à pele induzida por luz UVB de-terminado clinica e histologicamente. O manchamento in-tensivo de hsp7 2 da membrana de base linear pôde ser ob-servado por meio de técnica de imuno- florescência e aquantidade aumentada de hsp72 foi medida por manchamentode Western de amostras de pele tratadas com maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil.
18.2 Métodos
(ii) ratos diabéticos (STZ) com indução por es-treptozotocina com feridas térmicas de espessura parciala total criadas na pele torácica, bilateral, depilada,por meio de prova de eletroaquecimento (3 mm de diâmetro;60 °C; durante 30, 60 e 90 segundos), tratados com apli-cação tópica de creme ou veiculo contendo maleato de clo-reto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3-piridina carboximidoil a 1 %, 2% ou 4%, foram usados paradeterminar a cicatrização da ferida, na forma de compara-ção de auto-controle, de lado a lado. O fechamento da fe-rida foi registrado, fotograficamente, e usando a técnicamicroscópica de epiluminiscência digital. As áreas feri-das foram medidas por planimetria, 48 h e 21 dias após odano pelo calor. O nivel de hsp72 de amostras de biopsiada pele foi determinado usando análise de mancha de Western.
18.3 Resultados
O tratamento com creme contendo maleato de clo-reto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3-piridina carboximidoil a 4% acelerou significativamente(p < 0,01) o fechamento da ferida e elevou o nível dehsp72 em amostras de biópsia de pele, comparado com ocontrole de veículo.
Os resultados levaram à conclusão de que a admi-nistração de maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil propor-ciona proteção contra danos provenientes da exposição àluz UV e tem aplicações terapêuticas potenciais para otratamento clinico de condições com falha na reparação deferidas ou após intervenção cirúrgica.
Nas Figuras 20, 21, 22, o efeito do creme con-tendo maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperi-dinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil (B) é demons-trado sobre a cicatrização da ferida. Nas Figuras 23, 24,25 os resultados são mostrados de acordo com o grau dasferidas.
Na Figura 26, as vistas fotográficas de feridasnão tratadas e tratadas com maleato de cloreto de N- [2-hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-ximidoil (B) são mostradas.
A Figura 27 mostra os níveis de proteína dehsp72 de amostras de feridas de controles tratadas commaleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)propoxi] -3- piridina carboximidoil (B) (1%, 2% e 4%).
Na Figura 28, a avaliação imuno- histoquímica deproteína hsp72, após o tratamento com maleato de cloretode N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] -3- piri-dina carboximidoil (B) é mostrada.
Na Figura 29, os níveis de hsp72 das amostras depele tratadas (B) e não tratadas (Controle) com maleatode cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1-piperidinil) propoxi]-3-piridina carboximidoil de camundongos SCID são de-monstrados .
19. AVALIAÇÃO DO EFEITO ESTIMULATÓRIO DOS DERIVADOS DEHIDROXILAMINA. DE ACORDO COM A INVENÇÃO SOBRE A EXPRESSÃODE HSP72 EM CÉLULAS EXPOSTAS ÀS TENSÕES
a) Condições de Cultura das CélulasDas células aplicadas , os fibroblastos de ca-mundongos 3T3 e L929 foram mantidos em cultura em meioMEM e desenvolveram-se em monocamada, células de leucemiahumana U-937 foram mantidas em meio RPMI-1640, em culturade suspensão, enquanto as células epiteliais humanas HeLaforam mantidas em cultura em meio DMEM e em forma de mo-nocamada. As culturas de células foram mantidas conformedescrito no exemplo 6.2 (a) com a diferença de que as cé-lulas foram mantidas em cultura nos meios de cultura men-cionados ac ima.
b) Condições dos experimentos
Foram realizados experimentos aplicando tensãoantes e após o tratamento com droga. A tensão foi provo-cada pelo calor, por agente químico, tratamento comHgCl2. Os compostos de teste foram aplicados nos trata-mentos na concentração de 10-5 M.
Estudos da citotoxicidade, que foram realizadospor um ensaio de 3 dias e foram avaliados por MTT(Cytotechnology 11: 49 - 58) indicaram que todos os com-postos de teste tinham um efeito inibidor de crescimentoem uma concentração maior do que 10-4 M. Conseqüentemente,a concentração usada em estudos de HSP72 não tinha efeitocitotóxico significativo.
19.1 Experimentos com tensão pelo calor
Esses experimentos foram realizados em célulasde fibroblastos de camundongos 3T3 e L-929 e, além disso,em células de leucemia humanas U-937.
Os experimentos com relação à célula 3T3, apli-cando tensão térmica, foram realizados conforme descritono item 6.2 (c ) do exemplo 6, com a diferença de que atensão foi induzida por uma exposição de 30 minutos a 430C de temperatura e tratamento com os compostos de testefoi realizado 15 minutos antes ou 100 minutos após a ten-são térmica.
A imuno-detecção foi realizada usando-se os an-ticorpos primários SPA 810, específicos de HSP72(StressGene), e anticorpos secundários A9044 (Sigma) con-jugados com peroxidase de rábano . A avaliação densitomé-trica foi realizada por meio de um densitômetro LKB Ul-trascan XL.
Os resultados estão resumidos na Tabela 2 e naTabela 3.Tabela 2
Efeito estimulatório de derivados de hidroxilamina pelainvenção sobre a produção de HSP72 induzida por tensãotérmica em células 3T3, se um tratamento precede a expo-sição à tensão
<table>table see original document page 196</column></row><table>
maleato de cloreto de N-[2- hidro- +++xi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil
5,6- diidro -5-(1- piperidinil) -metil- (3-piridil)- 4H-1,2,4 -oxadiazina
(Z)-2- butenodioato de (3-(3- pi-ridil) -5- [ (1- piperidinil) -metil] -5,6 -diidro- 6H -1,4,2 -dioxazina (1:1)
monoidrocloreto de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) -propoxi] -benzimidoil
monoidrocloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) -propoxi] -N1,N' -dietil -3- piridina - car-boximidamida
hidrocloreto de 3-(3- piridil) -5-dietilamino metil -5,6- diidro-6H- 1,4,2 -dioxazina
hidrocloreto de 3- fenil -5- [ (1-piperidinil) -metil] -5,6- diidro-6H- 1,4,2 -dioxazinacontinuação da tabela 1
(Z)-2- butenodioato de cloreto de +++/R/(+)- N-[2- hidroxi -3- (1- pi-peridinil) -propoxi] -3- piridina- carboximidoil (1:1)
(Z)-2- butenodioato de cloreto de +++N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil)-propoxi] -3- piridina - carboxi-midoil (1:1)
N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) +++-propoxi]- naftaleno -1- carboxa-mida
3-(3- piridil) -5- butilamino-t- - +5,6- diidro -6H- 1,4,2 -dioxazina
N-[2- hidroxi -3- piperidino - +propoxi) - etiluretano
monoidrocloreto de N-[2- palmitoi- +++Ioxi -3-(l- piperidinil) -propoxi]-3- piridina -carboximidamida
N- [2- hidroxi -3- (1- piperidi- +++nil) -propoxi]- N1- propil -uréia
N-(3- cloro - fenil) -N'- [2- hi- +++droxi -3- (1- piperidinil) -propoxi]- N'- propil -uréia
diidrocloreto de cloreto de N-(3- +++piperidino -1- propoxi) -3- piri-dina - carboximidoil
hidrocloreto de cloreto de O-(3- +++dietil amino -propoxi) -3- piridi-na - carboximidoil<table>table see original document page 198</column></row><table>continuação da tabela 1
hidrocloreto de NtN- dimetil -N'- +
N1 - fenil -N"- [3-(1- piperidi-nil)- propoxi] -guanidinaiodeto de 5,6- diidro -3-(4- cloro ++
-fenil) -5- [N- metil - piperidí-nio -1- il] -metil- 4H -1,2,4-oxadiazina
maleato de metil -{N-[3-(l- pipe- 0
ridinil)- propoxi]} -3- piridina-carboximidato
hidrocloreto de N- metil -N-[3-(1- +++piperidinil) -propoxi] -m- triflu-orometil -benzamida
hidrocloreto de N-[3-(1- piperidi- +++
nil) -propoxi] -N'- tetrametileno-3- piridina - carboxamidina
N-[3-(1- piperidinilO -propoxi] - 0
N- metil -N'- (n- hexil) -uréiaTabela 3
Efeito estimulatório de derivados de hidroxilamina pelainvenção sobre a produção de HSP72 induzida por tensãotérmica em células 3T3, se um tratamento segue exposição
à tensão
<table>table see original document page 200</column></row><table><table>table see original document page 201</column></row><table>
Na Tabela, 0 indica que o tratamento alterou em± 20% o nível de hsp72 induzida por tensão nas células,enquanto +, ++, +++ indicam aumento de 21 - 5 0%, 51 -100% e > 100% nos níveis de hsp72, respectivamente, emrelação ao nível do controle exposto à tensão.
Experimentos, usando choque térmico em célulasde fibroblastos de camundongos L-929 e leucemia U-937,foram realizados, similarmente aos descritos acima, masos tratamentos com drogas, nesses testes, sempre precede-ram a tensão térmica. O composto maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil foi testado na concentração de 10 M sobessas condições experimentais.
O tratamento resultou em um aumento de mais de50 % no nível de hsp72 induzido por tensão térmica.
19.2 Experimentos com tensão induzida por agente química
Esses experimentos foram realizados em célulasda leucemia humana U-937 e epiteliais humanas HeLa, usan-do HgCl2 para induzir a resposta à tensão. O tratamentocom droga foi realizado antes que as células fossem ex-postas à tensão. Culturas de teste foram preparadas etratamentos foram realizados como nos experimentos comcélulas 3T3. Após o tratamento com droga, as células fo-ram incubadas a 37 °C durante 15 minutos. Todas as cultu-ras, exceto duas (controle não submetido à tensão) foramexpostas à concentrações de 0,5 μg/ ml de HgCl2 e a incu-bação foi seguida. A quantidade induzida de hsp72 foi me-dida 6 horas após a exposição à tensão. A concentraçãoaplicada de HgCl2 resultou em 15 - 30% de nivel máximo dehsp72.
Em células de HeLa, monoidrato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) -propoxi -benzimidoil emoniidrocloreto de cloreto de N-[3-(1- piperidinil)propoxi] -3- nitro -benzimidoil aumentaram em mais de 20% e em mais de 50%, respectivamente, o nivel de hsp72 in-duzida por tensão.
Em células U-937, o tratamento com maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil intensificou em mais de 20% onível de hsp72 induzida por tensão em relação ao controleexposto à tensão.
19.3 Experimentos em enxertos primários de tecidos
Esses experimentos foram realizados em enxertosde tecido testicular e do baço de ratos, aplicando tensãotérmica, após tratamento com os compostos experimentais.Os experimentos em suspensão de baço foram realizadoscomo segue.
Baços de ratos CFY, pesando 200 g, foram removi-dos, assepticamente, e foram homogeneizados em meio decultura MEM, contendo soro bovino fetal a 10% . A concen-tração da suspensão das células foi ajustada para 50 -200 mg/ 5ml.
Cinco ml de suspensão de células foram colocadosem cada uma das placas de cultura de 6 cm de diâmetro eos enxertos foram incubados durante uma hora em ar umidi-
ficado, contendo CO2 a 5%, a 37 °C, a seguir, as culturasforam tratadas com a concentração de 10-5 M dos compostosde teste. Após mais 15 minutos de incubação a 37 °C, asculturas foram expostas ao choque térmico em 43 °C duran-te 30 minutos em um incubador. A quantidade de hsp72 in-duzida foi medida após mais 6 horas de incubação a 37 °C.
Os resultados estão apresentados na Tabela 4 eníveis acentuados de hsp72 são marcados pela mesma escalaque nas Tabelas 2 e 3.Tabela 4
Efeito estimulatório de derivados de hidroxilamina pelainvenção sobre a expressão de hsp72 induzida por tensãotérmica em enxertos de baços de ratos
<table>table see original document page 204</column></row><table>
Os experimentos em enxerto testicular em ratoforam realizados como segue.
Testículos de ratos CFY, pesando 200 g, foramremovidos em condições estéreis e os túbulos testicularesliberados foram suspensos em meio de cultura MEM contendosoro bovino fetal a 10 % de maneira que cinco ml de sus-pensão continha 50 - 100 mg de tecido. Os enxertos foramincubados em ar umidifiçado, contendo CO2 a 5%, a 37 0Cdurante uma hora, então, as culturas foram tratadas comconcentração de 10 M dos compostos testados. Após umanova incubação durante 15 minutos a 37 °C, os enxertosforam expostos ao choque térmico a 43 0C durante 30 minu-tos. A quantidade de hsp72 induzida foi medida após mais6 horas de incubação a 37 °C.
Os resultados estão resumidos na Tabela 5 e oaumento no nível de hsp7 2 é marcado pela mesma escala quena Tabela 4.
Tabela 5
Efeito estimulatório de derivados de hidroxilamina pelainvenção sobre a expressão de hsp7 2 induzida por tensãotérmica em enxerto testicular ratos
<table>table see original document page 205</column></row><table><table>table see original document page 206</column></row><table><table>table see original document page 207</column></row><table>EXEMPLO 20:
MEDIÇÃO DO NÍVEL DE mRNA HSP NA AORTA TORÁCICA DE RATOSCOM HIPERTENSÃO GENÉTICA
Ratos com hipertensão genética foram divididosem quatro grupos de quatro. Os grupos foram tratados, di-ariamente, oralmente: o primeiro grupo com solução salinafisiológica; o segundo grupo com maleato de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridinacarboximidoil (20 mg/ kg) durante 8 dias; o terceiro gru-po com monoidrocloreto de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] benzimidoil (5 mg/ kg) durante20 dias; e o quarto grupo com monoidrocloreto de cloretode N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -2- tio-feno - carboximidoil (5 mg/ kg) durante 20 dias. Os ani-mais foram sacrificados, as aortas foram isoladas, conge-ladas em nitrogênio líquido e foram armazenadas a -70 0Caté que foram usadas.
b) Exame morfológico da aorta torácica
O exame foi realizado de acordo com os métodospublicados (Br. J. of Pharmacol., 1995: 115, 515 - 420).Um área de 1 mm da aorta torácica foi excisada e fixadaem glutaraldeído a 2,5 % em temperatura ambiente. A pós-fixação foi realizada em tetróxido de ósmio a 1 % duranteuma hora. O tecido foi desidratado em etanol e foi in-crustado em ACM Durcupan. Imagens foram tiradas por ummicroscópio eletrônico Hitachi 7100 e foram avaliadas,qualitativamente.Foi observado que o tratamento com maleato decloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximidoil e monoidrocloreto de cloreto deN-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] benzimidoil emonoidrocloreto de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- pipe-ridinil) propoxi] -2- tiofeno - carboximidoil facilitou aregeneração das células * de aorta em um modo médio e for-te, respectivamente.
C) Mensuracão quantitativa de hsp7 0
Os experimentos foram realizados por meio da re-ação de cadeia de polimerase de transcrição reversa. Oprincipio do método é que, se dois modelos muito simila-res, mas distinguiveis, são amplificados na mesma reaçãode PCR, então a proporção de seus produtos não é mudadadurante o processo. Quando a quantidade inicial de um dosmodelos é conhecida e a quantidade relativa dos produtosé mensurável, então, a quantidade do modelo inicial des-conhecido pode ser calculada. No método mais freqüente-mente usado, o modelo conhecido (competidor) e o modelodesconhecido (alvo) diferem apenas no comprimento, o com-petidor é menor, conseqüentemente, os produtos da PCR sãoseparáveis, baseado em seu tamanho.
O RNA foi isolado dos tecidos por um método deisocianato de guanidínio (Chomczynski P. e Sacci N.: AnalBiochem. 162: 156, 1987). A concentração e a qualidade doácido nucléico foram avaliadas por espectrofotômetro epor eletroforese com gel de agarose na condição de desna-turação (Shambrook J. e outros: Molecular Cloning. A La-boratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press,1989). O RNA isolado foi armazenado a -70 °C.
Um fragmento foi construído a partir de um cDNAde codificação de genes de hsp70 por meio de ligação deuma seqüência interna (ligação - PCR, Riedy MC e outros:Biotechniques 18: 70, 1995). O fragmento foi amplificadopor meio de iniciadores especificamente ligados à parteexterna do construtor (Erlich A : PCR Technology. Princi-pies and Applications for DNA Amplification. StocktonPress, 1989) e, após a mensuração da concentração do pro-duto, ele foi armazenado a -70 °C.
A transcrição reversa foi realizada através decondições padrão, usando 1 μg de amostra/ RNA isolada como iniciador oligo auxiliar dT (dT16) . (Shambrook J e ou- tros, o mesmo que acima).
Quantidade igual de cDNAs, preparadas de amos-tras de RNA, foram misturadas com várias quantidades decompetidor sintético (derivado de 3, 10 diluições seri-ais) e os modelos foram amplificados por reação de cadeiade polimerase. As temperaturas aplicadas durante os ci-clos foram as seguintes: desnaturação (95 °C, 1 min),(purificação (58 °C, 1 min.), síntese (72 °C, 0,5 min.).
Após a amplificação por PCR, os produtos foramseparados em gel de agarose (1 %) e foram manchados por brometo de etídio sob condições padrão. (Sambrook e ou-tros, o mesmo que acima). Os fragmentos de DNA manchadosforam visualizados por translumiador -UV para fotografia.A quantidade dos produtos da PCR foi medida por densito-metria dos negativos das fotos.
Foi observado que o nível de hsp70 na aorta to-
rácica dos ratos tratados com maleato de cloreto de N-[2-
hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carbo-
ximidoil, monoidrocloreto de cloreto de N-[2- hidroxi -3-
(1- piperidinil) propoxi] benzimidoil e monoidrocloreto
de cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi]
-2- tiofeno - carboximidoil era mais de 50% maior do que
as hsp70 nos animais de controle.
EXEMPLO 21:
EXAME DO EFEITO INIBIDOR SOBRE 0 ENVELHECIMENTO DA PELEDO P0R0UINH0 DA INDIA
O efeito inibidor dos compostos, de acordo com ainvenção, sobre o envelhecimento da pele foi examinado emporquinhos da índia. A pele de cinco animais por grupofoi depilada e uma área de 1 cm foi irradiada a partirde uma fonte de UV-B de 100 mJ/cm de intensidade em am-bos os lados. Após a irradiação , um lado da pele foitratado com um creme composto de acordo com o exemplo 10e contendo 5% (p/p) de maleato de cloreto de N-[2- hidro-xi -3- (1- piperidinil) propoxi] -3- piridina carboximi-doil ou monoidrocloreto de cloreto de N-[2- hidroxi -3-(1- piperidinil) propoxi] benzimidoil ou monoidrocloretode cloreto de N-[2- hidroxi -3- (1- piperidinil) propoxi]-2- nitro - benzimidoil, enquanto o outro lado dos ani-mais foi tratado com o mesmo creme, sem o ingredienteativo. Esse foi um experimento auto-controlado.
O tratamento começou imediatamente após a irra-diação e foi realizado duas vezes por dia, durante duassemanas.
A irradiação por UV-B resultou em um grave danoà pele (vesiculas, bolhas, dano ao epitélio e formação deferida), que cicatrizou 4 dias antes e o tamanho da feri-da era significativamente menor, se os animais fossemtratados com compostos de acordo com a invenção. OS com-postos facilitaram a formação do epitélio.
0 experimento mostra que o tratamento aumentou aresistência da pele contra a irradiação UV-B e aperfeiço-ou a regeneração da pele.

Claims (6)

1. Derivados de hidroxilamina, caracterizados pelo fato deapresentarem a fórmula (I)<formula>formula see original document page 213</formula>em que:a) X é cloro; Z é uma ligação química eA é tienila, isoquinolina, quinolina, nitrofenila, furila,trifluormetilfenila, N-oxipiridila, N-metilpiridila ou piridila,;R é um grupo da fórmula (b)<formula>formula see original document page 213</formula>em que R5 e R6, independentemente um do outro, são H, butila, propila,etila, ciclohexila, ou R5 e R61 quando tomados juntos com o átomo denitrogênio a eles adjacentes, formam piperidila, N-oxi-piperidila, ou N-metil-piperidila;Y6 é OH1 OAc1 OC(O)Ph1 OC(O)(CH2)I4Me ou<formula>formula see original document page 213</formula>k é 1; e m é 1,com a condição de que, quando A é piridila, Y6 é outro que não OH1 oub) X é OMe ou OEt;A é piridila, etila, fenila, ou piperidila;Z é oxigênio, uma ligação química, NH ou NMe;R é um grupo da fórmula (b)<formula>formula see original document page 214</formula>em que R5 e R61 independentemente um do outro, são H ou butila, ou R5 eR6, quando tomados junto com o átomo de nitrogênio adjacentes a eles,formam um anel piperidínico;Y6 é H;k é 1 e m é 1.
2. Derivados de hidroxilamina de acordo com a reivindicação 1,caracterizados pelo fato de que A é trifluorometilfenila.
3. O estereoisômero opticamente ativo de um derivado dehidroxilamina como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato dequeX é cloro,Z é ligação química eR é um grupo da fórmula (b)<formula>formula see original document page 214</formula>em que R5 e R6, independentemente um do outro, são H, butila, propila,etila, ou ciclohexila, ou R5 e R6, quando tomados junto com o átomo denitrogênio adjacente a eles, formam piperidila, N-óxi-piperidila ou N-metil-piperidila;Y6 é<formula>formula see original document page 214</formula>k é 1 e m é 1.
4. Composição farmacêutica e, opcionalmente, cosmética, parao tratamento de uma doença associada ao funcionamento do sistemaprotetor ou associada a danos em uma célula ou organelas celulares ouopcionalmente para a prevenção de tal doença, caracterizada pelo fato deconter 0,5 a 99,5% em peso de um derivado de hidroxilamina da fórmula (I)como definido na reivindicação 1.
5. Composição farmacêutica e, opcionalmente, cosmética para otratamento de doenças cardiovasculares, vasculares, cerebrais, alérgicas,imunes, auto-imunes, doenças causadas por infecções viróticas oubacterianas, tumorígenas, da pele ou das mucosas, caracterizada pelo fatode conter 0,5 a 99,5% em peso de um derivado de hidroxilamina da fórmula(I) como definido na reivindicação 1.
6. Composição farmacêutica e, opcionalmente, cosmética para otratamento de doenças cardiovasculares, vasculares, cerebrais, alérgicas,imunes, auto-imunes, doenças causadas por infecções viróticas oubacterianas, tumorígenas, da pele ou das mucosas, caracterizada pelo fatode conter 0,5 a 99,5% em peso de um derivado de hidroxilamina da fórmula (I")<formula>formula see original document page 215</formula>em que A é piridila; R1 é H, e R" é CH2-piperidila.
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