KR101275264B1 - 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법 - Google Patents

샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알츠하이머씨병, 파킨슨씨병, 그리고 헌팅톤씨병과 같은 퇴행성 뇌신경질환을 유도하는 단백질 응집에 관여하는 샤프로닌(Chaperonin) 단백질의 조절물질 탐색방법, 및 이에 따라 탐색된 샤프로닌 단백질의 조절물질의 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따라 샤프로닌 단백질의 신규한 음성 조절인자가 제공되며, 상기 음성 조절인자를 타겟으로 하여 샤프로닌 단백질의 조절 물질을 보다 신속하고 간편하게 탐색할 수 있다. 나아가 상기 탐색된 물질을 이용함으로써 기존의 단백질 응집체 제거방법인 자가소화작용에 따른 세포사의 우려 없이 알츠하이머씨병, 파킨슨씨병, 또는 헌팅톤씨병 등과 같은 퇴행성 뇌신경 질환을 효과적으로 예방 또는 치료 가능하다.

Description

샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법 {Method of screening for chaperonin modulator}
본 발명은 알츠하이머씨병, 파킨슨씨병, 그리고 헌팅톤씨병과 같은 퇴행성 뇌신경질환을 유도하는 단백질 응집에 관여하는 샤프로닌(Chaperonin) 단백질의 조절물질 탐색방법, 및 이에 따라 탐색된 샤프로닌 단백질의 조절물질의 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
알츠하이머씨병, 파킨슨씨병, 그리고 헌팅톤씨병과 같은 퇴행성 뇌신경질환에서의 대표적 증상은 특정 단백질의 응집현상이다. 단백질 응집체는 세포 안에서 단백질 분해 장치인 proteasome의 작용을 억제하고, 수송 단백질의 이동을 저해한다. 그리고 다른 전사조절 단백질들과 함께 응집되면서 이들을 격리하여 유전자 전사를 바꾸기도 한다. 또한 미토콘드리아의 작용을 방해함으로써 산화적 스트레스를 유발하여 세포사를 유도하기도 한다. 특히, 신경세포에서는 위와 같은 작용들로 인해 시냅스를 통한 신경신호전달의 부작용을 일으킬 뿐만 아니라 신경세포사멸을 유도하여 뇌 기능 저하를 초래하게 만든다.
최근 이런 단백질 응집으로 인한 퇴행성 신경질환을 치료하기 위해 연구가 진행되고 있는데, 그 중 이미 형성된 응집체를 제거하는 연구방법으로서 세포 내부에 존재하는 자가 탐식자인 자가소화작용(Autophagy)를 이용하는 방법이 있다.
자가소화작용의 경우 최근 많은 연구결과가 발표되고 있으며, 특히 단백질 응집체를 특이적으로 제거하는 경우도 있음을 시사한 연구결과도 있다. 하지만, 이러한 자가소화작용의 경우 일반적으로 세포 내 에너지 불균형이 있을 때에 자기 자신의 세포기관을 분해함으로써 에너지를 얻는 것으로 알려져 있으며, 이것의 조절이 잘 되지 않을 경우 자가소화작용에 의한 세포사가 발생할 수 있다는 문제점이 있다.
이에 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 단백질의 응집 현상을 애초에 저해함으로써 올바른 단백질 접힘 현상을 유지시켜주는 샤프론(chaperone) 단백질의 작용을 조절해 주는 신규한 조절물질의 탐색방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들이 연구한 결과 샤프론 단백질 중 샤프로닌 단백질의 양 및/또는 수명에 관련된 인자가 백시니아-관련 카이네이즈 2(vaccinia-related kinase 2, VRK2)라는 것을 동정하였으며, 구체적으로 상기 VRK2는 효소 활성에 의존적으로 샤프로닌 단백질을 분해하는 작용을 하고 이러한 샤프로닌 단백질 분해과정에 유비퀴틴 연결효소인 COP1 복합체가 상기 VRK2와 상호작용을 한다는 점을 밝혔다. 따라서 상기 두 가지 물질들은 샤프로닌 단백질의 조절 물질을 탐색하는데 있어서 중요한 타겟으로서 작용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. 이를 통해 탐색된 샤프로닌 단백질의 조절 물질은 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료를 위한 효과적인 유효성분이 될 수 있다.
따라서 본 발명의 일 구현예는 1) 후보 물질, 및 VRK2를 준비하는 단계; 2) 상기 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성을 측정하는 단계; 및 3) 상기 후보 물질과 VRK2를 함께 처리시 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 VRK2는 인간을 비롯한 모든 진핵생물로부터 기원하는 것일 수 있으며, 예컨대 accession number BAA19109의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한 바람직하게는 accession number AB000450의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 샤프로닌 단백질은 샤프로닌 Tric/CCT일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 CCT4(accession number NM_009837)일 수 있다.
상기 샤프로닌 단백질의 조절은 바람직하게는 샤프로닌 단백질의 양 및/또는 수명을 증가 또는 감소시키는 것일 수 있다.
상기 후보 물질은 특별히 제한이 없고, VRK2의 발현량 및/또는 효소활성의 증가 또는 감소 활성을 가질 것으로 예상되는 모든 물질일 수 있으며, 바람직하게는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드(안티센스 RNA, siRNA 등), 및 화합물을 포함하는 각종 합성 또는 천연 물질일 수 있다.
상기 VRK2는 야생형 형태일 수 있으며, 보다 활성을 높이기 위하여 적절하게 변형된 것일 수도 있다. 예컨대, 상기 변형된 VRK2은 적절한 택(tag)으로 변형된 것일 수 있으며, 상기 택은 GST, His, Flag, EGFP, DsRed1 등일 수 있으며, 바람직하게는 VRK2의 N-말단에 GST가 태깅된 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 후보 물질 및 VRK2는 이를 포함하는 시료의 형태로 준비될 수 있으며, 상기 VRK2는 이를 암호화하는 염기서열이 발현 가능하도록 연결된 발현벡터 또는 상기 VRK2를 발현하는 세포로서 포함될 수 있다. 또한 상기 세포는 바람직하게는 상기 발현벡터로 형질전환된 세포이거나 또는 VRK2를 발현하는 특성을 가진 야생형의 세포일 수 있으며, 사용 가능한 발현벡터 또는 세포는 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
상기 샤프로닌 단백질의 조절 물질이 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 것일 경우, 바람직하게는 상기 단계 3) 이후에, 4-1) 상기 후보 물질 처리에 의한 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성에 비하여 감소한 경우, 상기 후보물질을 샤프로닌 단백질의 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성의 측정은 특별한 제한 없이 당업계에서 사용되는 통상의 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 예컨대 상기 인산화 효소 활성의 유무 내지 정도의 변화는 in vitro kinase assay를 통하여 확인할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 VRK2는 샤프로닌 단백질에 대한 음성 조절인자에 해당하며, 이러한 음성 조절 작용은 상기 VRK2의 효소 활성에 근거한 것임을 후술할 실시예 1에서 확인하였다. 따라서, 상기 후보 물질 처리시 처리 전과 비교하여 VRK2의 발현량이 감소하거나 효소 활성이 감소할 경우, 상기 처리된 후보 물질은 샤프로닌 단백질의 양 및/또는 수명을 증가시키는 물질로 판단할 수 있다.
상기 방법에 따른 샤프로닌 단백질의 양 및/또는 수명을 증가시키는 물질은, 바람직하게는 siVRK2(D-004684-06, Dharmacon)(SEQ ID NO: 1) 및 이의 상보적 서열로 이루어진 siVRK2 이중가닥일 수 있다.
이와 반대로 상기 샤프로닌 단백질의 조절 물질이 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 감소시키는 것일 경우, 바람직하게는 상기 단계 3) 이후에, 4-2) 상기 후보 물질 처리에 의한 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성에 비하여 증가한 경우, 상기 후보물질을 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 감소시키는 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
한편, 상기 VRK2는 샤프로닌 단백질에 대한 작용, 즉 샤프로닌 단백질의 분해작용을 수행함에 있어 유비퀴틴 연결효소인 COP1 복합체와 상호작용을 하므로, COP1 또한 샤프로닌 단백질의 조절 물질을 탐색하는데 있어서 중요한 타겟으로서 작용할 수 있다. 또한 VRK2는 특히 COP1의 복합체 구성요소인 RBX1과 상호작용을 하므로, 상기 COP1의 구성요소인 RBX 또한 중요한 타겟이 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 일 구현예는 1) 후보 물질, 및 COP1을 준비하는 단계; 2) 상기 COP1의 발현량 또는 효소 활성을 측정하는 단계; 및 3) 상기 후보 물질과 COP1을 함께 처리시 COP1의 발현량 또는 효소 활성의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법을 제공한다.
바람직한 샤프로닌 단백질 및 상기 샤프로닌 단백질의 조절과 관련하여서는 상술한 바와 동일하게 적용될 수 있다.
상기 후보 물질은 특별히 제한이 없고, COP1의 발현량 및/또는 효소활성의 증가 또는 감소 활성을 가질 것으로 예상되는 모든 물질일 수 있으며, 바람직하게는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드(안티센스 RNA, siRNA 등), 및 화합물을 포함하는 각종 합성 또는 천연 물질일 수 있다.
상기 COP1는 야생형 형태일 수 있으며, 보다 활성을 높이기 위하여 적절하게 변형된 것일 수도 있다. 예컨대, 상기 변형된 COP1은 적절한 택(tag)으로 변형된 것일 수 있으며, 상기 택은 GST, His, Flag, EGFP, DsRed1 등일 수 있으며, 바람직하게는 COP1의 N-말단에 GST가 태깅된 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 후보 물질 및 COP1은 이를 포함하는 시료의 형태로 준비될 수 있으며, 상기 COP1은 이를 암호화하는 염기서열이 발현 가능하도록 연결된 발현벡터 또는 상기 COP1을 발현하는 세포로서 포함될 수 있다. 또한 상기 세포는 바람직하게는 상기 발현벡터로 형질전환된 세포이거나 또는 COP1을 발현하는 특성을 가진 야생형의 세포일 수 있으며, 사용 가능한 발현벡터 또는 세포는 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
예컨대 상기 COP1는 바람직하게는 accession number AAH94728의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 또한 바람직하게는 accession number BC094728의 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 상기 RBX1은 바람직하게는 accession number AAD29715의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 또한 바람직하게는 accession number AF140598의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
상기 샤프로닌 단백질의 조절 물질이 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 것일 경우, 바람직하게는 상기 단계 3) 이후에, 4-1) 상기 후보 물질 처리에 의한 COP1의 발현량 또는 효소 활성이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 COP1의 발현량 또는 효소 활성에 비하여 감소한 경우, 상기 후보물질을 샤프로닌 단백질의 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 COP1은 상술한 VRK2와 마찬가지로 샤프로닌 단백질에 대한 음성 조절인자에 해당하므로, 상기 후보 물질 처리시 처리 전과 비교하여 COP1의 발현량이 감소하거나 효소 활성이 감소할 경우, 상기 처리된 후보 물질은 샤프로닌 단백질의 양 및/또는 수명을 증가시키는 물질로 판단할 수 있다(실시예 4 참조).
상기 COP1의 발현량 또는 효소 활성(E3 연결효소로서의 활성)의 측정은 특별한 제한 없이 당업계에서 사용되는 통상의 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.
상기 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법에 따른 샤프로닌 단백질의 양 및/또는 수명을 증가시키는 물질은, 바람직하게는 siCOP1(D-007049-01, Dharmacon)(SEQ ID NO: 2) 및 이의 상보적 서열로 이루어진 siCOP1 이중가닥, 및 siRBX1 (Dharmacon) (SEQ ID NO: 3) 및 이의 상보적 서열로 이루어진 siRBX1 이중가닥으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
이와 반대로 상기 샤프로닌 단백질의 조절 물질이 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 감소시키는 것일 경우, 바람직하게는 상기 단계 3) 이후에, 4-2) 상기 후보 물질 처리에 의한 COP1의 발현량 또는 효소 활성이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 COP1의 발현량 또는 효소 활성에 비하여 증가한 경우, 상기 후보물질을 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 감소시키는 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
한편, 상기 VRK2와 COP1간의 상호작용은 상기 VRK2 및 COP1의 결합형성을 통하여 이루어질 수 있으므로, 본 발명의 다른 일 구현예는 1) 후보 물질, VRK2, 및 COP1을 준비하는 단계; 및 2) 상기 후보 물질, VRK2, 및 COP1을 함께 처리시, 상기 VRK2 및 상기 COP1간 결합 형성 여부를 측정하는 단계; 를 포함하는 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법을 제공한다.
상기 후보 물질은 특별히 제한이 없고, VRK2와 COP1간의 결합 형성을 저해 또는 촉진하는 활성을 가질 것으로 예상되는 모든 물질일 수 있으며, 바람직하게는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드(안티센스 RNA, siRNA 등), 및 화합물을 포함하는 각종 합성 또는 천연 물질일 수 있다.
상기 샤프로닌 단백질의 조절 물질이 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 것일 경우, 바람직하게는 상기 단계 2) 이후에, 3) 상기 후보물질 처리에 의하여 상기 VRK2 및 상기 COP1간 결합 형성이 억제되는 경우, 상기 후보물질을 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 샤프로닌 단백질은 단백질의 응집 현상, 예컨대 헌팅틴 단백질의 비정상적인 응집 현상을 저해함으로써 올바른 단백질 접힘 현상을 유지시켜주는 작용을 하므로, 상기 샤프로닌 단백질의 양 및/또는 수명을 증가시키는 물질은 단백질의 응집현상으로 인해 발생하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 샤프로닌 단백질의 조절 물질(샤프로닌 단백질의 양 및/또는 수명을 증가시키는 물질)의 탐색 방법에 의해 탐색된 조절 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 퇴행성 뇌신경 질환은 예컨대, 알츠하이머씨병, 파킨슨씨병, 또는 헌팅톤씨병 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 헌팅톤씨병이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 바람직하게는 상기 조절 물질을 전체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제 등을 더욱 포함할 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제는 예컨대 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 등이 될 수 있다.
상기 의약 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 사용될 수 있으며, 바람직한 투여량은 투여대상 및/또는 질환의 치료 또는 예방에 적합한 함량이 될 수 있으며, 이는 투여대상의 연령, 성별, 일반 건강 상태 및 체중, 질병의 종류 및 중증도, 제형의 종류, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 조성물의 분비율, 투여경로 및 기간 등을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따라 샤프로닌 단백질의 신규한 음성 조절인자가 제공되며, 상기 음성 조절인자를 타겟으로 하여 샤프로닌 단백질의 조절 물질을 보다 신속하고 간편하게 탐색할 수 있다. 나아가 상기 탐색된 물질을 이용함으로써 기존의 단백질 응집체 제거방법인 자가소화작용에 따른 세포사의 우려 없이 알츠하이머씨병, 파킨슨씨병, 또는 헌팅톤씨병 등과 같은 퇴행성 뇌신경 질환을 효과적으로 예방 또는 치료 가능하다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 실시예 1에 따라 VRK2의 헌팅틴 단백질 응집 유도 양상 및 헌팅틴 단백질의 응집에 대한 영향을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 실시예 2에 따라 VRK2와 샤프로닌 단백질간의 상호작용을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3d는 본 발명의 실시예 3에 따라 VRK2로 인해 유도된 헌팅틴 단백질 응집현상의 샤프로닌 단백질의 수명에 대한 영향을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 실시예 4에 따라 VRK2의 헌팅틴 단백질 응집유도작용에 관여하는 생체인자를 규명한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 실시예 5에 따라 VRK2의 발현량 감소에 따른 샤프로닌 단백질에 대한 영향(헌팅틴 단백질 응집현상의 저해)을 나타낸 것이다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 헌팅틴 단백질의 응집 유도 실험
1.1. HEK293T 세포주 내 헌팅틴 단백질의 응집 유도 실험
1) 실험방법
VRK2가 퇴행성 뇌신경질환의 주요 증상인 단백질 응집현상을 조절 가능한지를 확인하기 위해, 헌팅틴 단백질을 단독으로, 또는 VRK1(VRK2와 같은 단백질 인산화효소 family, AB000449) 또는 VRK2(AB000450)와 함께 인간배아 신장 세포주인 HEK293T 세포주(한국세포주은행)에서 과발현시켜 각각의 응집양상 및 헌팅틴 단백질의 응집에 대한 영향을 측정하였다.
헌팅틴 유전자의 exon1에는 폴리글루타민 영역(polyglutamine tract)이 존재하는데, 본 실험에서는 글루타민 개수가 103개인 클론을 사용하여 보다 응집현상이 쉽게 유도되도록 하였다. 헌팅톤씨병의 증상의 정도와 발명 시기는 상기 헌팅틴 유전자 exon1의 폴리글루타민 영역에 존재하는 글루타민 수와 관련이 있으며, 특히 그 수가 25개 이하일 때를 야생형이라 하고, 25개 이상일 때부터 돌연변이형이라 하는데, 글루타민의 수가 길어질수록 증상의 정도는 악화되며, 발병 시기는 앞당겨지는 현상을 관찰할 수 있다.
구체적으로, 형질주입 시약인 METAFECTENE(Biontex)을 제조사의 권장량에 따라 사용하여, GFP(green fluorescent protein)로 연결된 단백질 응집체를 형성하는 글루타민 개수가 103개인 헌팅틴(Huntingtin, Htt) 단백질의 유전자 발현벡터 Htt-exon1-GFP-pcDNA3.1 vector(HTTQ103-GFP-pcDNA3.1)(Stanford university, CA의 Judith Frydman으로부터 입수)를 단독으로, 또는 각각 RFP(red fluorescent protein)로 연결된 DsRed1-C1-VRK1 또는 DsRed1-C1-VRK2와 함께 HEK293T 세포주 내부에 주입(transfection) 하여 DMEM/high glucose (Hyclone - cat. #SH30243.01)에 10% (v/v) FBS (Hyclone)와 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신(welgene, Korea)으로 구성된 배양용액에서 37℃에 5% CO2 로 24시간 동안 과발현 시킨 후, 과발현된 VRK1, VRK2, HTTQ103-GFP 단백질의 응집양상을 형광현미경(Carl Zweiss, Germany)으로 관찰하여 도 1a에 나타냈다. 상기 DsRed1-C1-VRK1 또는 DsRed1-C1-VRK2는 pDsRed1-C1 (BD Biosciences, San Jose, CA)을 구매하여 VRK1 (AB000449)과 VRK2 (AB000450)을 각각 클로닝하여 제조하였다.
2) 실험결과
도 1a에 나타난 바와 같이, 각각의 단백질의 응집 양상은 밀집된 형태와 강한 형광세기를 나타냈으며, 또한 상기 헌팅틴 단백질은 VRK2와 함께 과발현시켰을 때에만 응집체 증가현상이 나타남을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 도 1a의 상단에 나타난 바와 같이, 특히 VRK2가 과발현된 세포에서 HTTQ103의 응집체 형성(녹색의 스팟)이 관찰되었으며, 반면에 도 1a 하단에 나타난 바와 같이, VRK1이 과발현된 세포에서는 HTTQ103 단백질이 응집되지 않고 세포 전반에 걸쳐 퍼져서 존재하고 있음을 확인할 수 있었다.
도 1a의 형광현미경 이미지를 바탕으로 HttQ103-GFP가 발현된 세포 중에 응집체를 가지고 있는 세포의 수를 직접 눈으로 세어 정량화하여 도 1a의 우측에 나타내었다(n=3; vector는 Htt-exon1-GFP-pcDNA3.1 vector를 포함하여 VRK1 및 VRK2를 형질전환시키기 위해 사용한 DsRed1-C1 mock vector를 나타냄).
따라서, 이러한 HTTQ103 단백질의 응집 유도 및 응집체 증가현상은 VRK2 단백질의 고유한 작용이며, VRK1 단백질과는 관련이 없음을 확인할 수 있었다.
1.2. SK -N- BE (2)C 세포주 내 헌팅틴 단백질의 응집 유도 실험
1) 실험방법
상기 실시예 1.1에서 VRK2가 헌팅틴 단백질의 응집 유도 기능이 있음을 확인한 바, 상기 기능이 VRK2의 효소활성과 관련이 있는지를 실험하기 위해, 대조군으로서 VRK2의 아미노산 서열 중 61번째 아미노산 서열인 리신(Lys)을 알라닌(Ala)으로 치환(point mutation)하여 인산화 효소 불활성(katalytic dead(KD)) 상태를 유도한 VRK2-KD(K61A)(AB000450의 서열 중 61번째 아미노산을 코딩하는 AAA (lysine) 뉴클레오타이드 서열을, 알라닌(alanine)을 코딩하도록 GCA 뉴클레오타이드 서열로 PCR 기반 SDM(Site Direct Mutagenesis)된 서열)를 사용하여 VRK2(Accession AB000450)와 비교하였다.
또한 다른 종류의 세포주 내에서도 VRK2가 이와 같은 단백질 응집 유도 기능을 하는지를 확인하기 위해, 상기 실시예 1.1과 동일한 방법을 사용하여 상기 인간배아 신장 세포주인 HEK293T 세포주 및 인간 신경아세포종 세포주인 SK-N-BE(2)C 세포주(ATCC(American Type Culture Collection), ATCC number: CRL-2268™) 내 각각 헌팅틴 단백질의 응집 유도 양상을 비교하여 도 1b에 나타냈다.
VRK2와 VRK2-KD(K61A) 클론은, 우선 HeLa 세포주(한국세포주은행)로부터 얻은 전체 cDNA을 이용하여 상술한 VRK2와 VRK2-KD(K61A) 각각의 코딩 DNA 서열을 PCR(1. 95℃, 5분, 2. 95℃, 1분, 3. 52℃, 1분, 4. 72℃, 3분 30초, 5. 72℃, 7분, 6. 4℃, 10분(2번~4번 35 사이클로 반복 수행))로 증폭시킨 후, pFlag-CMV2 벡터(Sigma, St Louis, MO)와 상기 증폭된 VRK2 및 VRK2-KD(K61A) 유전자를 Sal1과 BamH1 제한효소(DCC-Bionet, Korea)를 이용하여 점착성 말단(sticky end)을 형성시키고, T4 DNA 리가아제(Roche, Mannheim, Germany) 를 이용하여 접합(ligation)함으로써 클로닝하여 pFlag-CMV2-VRK2 및 pFlag-CMV2-VRK2-KD(K61A) 플라스미드 DNA를 제조하여 사용하였다(Kwon, S. Y.,Y. J. Choi, T. H. Kang, K. H. Lee, S. S. Cha, G. H. Kim, H. S. Lee, K. T. Kim, and K. J. Kim., 2005. Highly efflcient Protein expression and purification using bacterial hemoglobin fusion vector. Plasmid 53: 274-82 참조). 상기 PCR에 사용된 프라이머는 아래와 같다.
<사용된 프라이머>
VRK2 정방향 : 5’-ACGCGTCGACATGCCACCAAAAAGAAATG-3’(SEQ ID NO: 4)
VRK2 역방향 : 5’-AAGGATCCTCAGAGAAAAAATAAAGC-3’(SEQ ID NO: 5)
K61A 정방향 : 5’-GCAAGACATGTAGTAGCAGTGGAATATCAAGAA-3’(SEQ ID NO: 6)
K61A 역방향 : 5’-TTCTTGATATTCCACTGCTACTACATGTCTTGC-3’(SEQ ID NO: 7)
제조된 pFlag-CMV2-VRK2 및 pFlag-CMV2-VRK2-KD(K61A) 플라스미드 DNA를 Htt-exon1-GFP-pcDNA3.1 vector(Stanford university, CA의 Judith Frydman으로부터 입수)와 함께 메타펙틴(Metafectine)(Biontex)을 이용하여 HEK293T 세포주(한국세포주은행) 및 SK-N-BE(2) 세포주(ATCC (American Type Culture Collection), ATCC number: CRL-2268™)에 형질전환을 시켰다. 이 때 사용된 Metafectine의 양은 배양접시 크기 60mm dish 기준으로 DNA 6ug에 Metafectene (lipid) 18ul을 각각 무혈청 배양액(DMEM (Hyclone)) 300ul에 섞어 5분간 두고 이 두 용액을 섞어서 30분간 상온에 방치한 후 세포에 직접 한 방울씩 떨어뜨려 준다. 형질전환 시킨 후 24시간에 각 세포들 내 단백질 응집현상을 형광현미경(Carl Zweiss, Germany)으로 관찰하여 그 결과를 도 1b에 나타냈다.
또한 응집단백질의 양을 Filter trap assay(Nature Cell Biology, 2006, Vol. 8 :1155-62)로 조사하여 도 1c에 나타냈다. 구체적으로 상기 각각의 단백질이 과발현된 세포(HEK293T)를 0.5% (v/v)의 Triton X-100의 PBS에서 분쇄한 후 1%(w/v) SDS-PBS에 다시 녹인 후 95℃에서 5분간 끓여주었다. 이후 각 세포가 분쇄된 추출액(cell lysate)을 0.2μm 크기의 구멍을 가진 니트로셀룰로오스 막에 dot blotter (Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 이동시킨 후, 5%(w/v) 탈지분유액으로 막을 코팅한 후 GFP단백질에 대한 항체(anti-green gluorescence protein(GFP)(B-2,sc-9996)(Santa Cruz, CA))와 2차 항체(anti-mouse HRP-conjugated antibody (KPL))를 이용하여 발색시켜 남아있는 응집 단백질을 조사하였다.
2) 실험결과
도 1b에 나타난 바와 같이, HEK293T 세포주뿐만 아니라 신경세포인 SK-N-BE(2)C 세포주 내에서도 헌팅틴 단백질을 VRK2와 함께 과발현시 헌팅틴 단백질의 응집(도 1b의 녹색 점)이 유도됨을 확인할 수 있었으며, 도 1a에서 보여진 VRK2 단백질에 의한 Htt-exon1-GFP의 응집체 증가 현상이 VRK2 단백질의 효소활성을 없앤 VRK2-KD의 과발현시에는 미미한 것으로 나타나 VRK2의 헌팅틴 단백질 응집 유도 기능은 VRK2의 인산화 효소활성에 의존적임을 확인할 수 있었다.
구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
HEK293T 세포에서 실험한 결과를 나타낸 도 1b의 상단의 3개의 이미지 중, 첫 번째 이미지는 Htt-exon1-GFP와 함께 pFlag-CMV2 목 벡터(mock vector)가 발현된 이미지로서 본 실험에서는 대조군으로 사용되었다. 녹색의 점으로 보이는 응집체는 Htt-exon1-GFP 단백질이 자발적으로 유도되는 응집현상을 의미한다. 두 번째 이미지는 VRK2의 효소활성이 살아있는 단백질과 함께 Htt-exon1-GFP 단백질이 발현되어 있는 세포에서 얻은 결과이며, 녹색의 점으로 나타나는 응집체의 수가 대조군과 비교해 유의성 있게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이는 VRK2에 의해 Htt-exon1-GFP의 응집현상이 유도되었음을 시사한다. 세 번째 이미지는 VRK2의 효소활성이 나타나지 않은 단백질과 함께 Htt-exon1-GFP 단백질이 발현되어 있는 세포에서 얻은 결과이며, 녹색의 점으로 나타나는 응집체의 수가 대조군과 비교해 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 이에 따라 VRK2의 효소활성이 없으면, Htt-exon1-GFP의 응집현상을 유도할 수 없음을 알 수 있었다.
도 1b 하단의 3개의 이미지는 SK-N-BE(2)C cell에서 얻은 이미지로서, HEK293T 세포에서 얻은 결과와 동일한 양상을 나타냈다. 이를 통해, VRK2에 의한 Htt-exon1-GFP의 응집체 증가 현상은 신경세포에서도 동일하게 일어남을 확인할 수 있었다. 특히, 퇴행성 신경질환에서 대부분의 증상이 신경세포에서 일어나는 점을 고려할 때, 본 실험결과는 VRK2가 동일하게 질병의 증상을 유도할 수 있음을 시사한다.
또한 도 1c에 나타난 바와 같이, Filter trap assay(Nature Cell Biology, 2006, Vol. 8 :1155-62)을 이용하여 응집단백질을 조사한 결과를 통해서도 응집 단백질의 양이 VRK2의 인산화 효소활성에 의존적으로 나타남을 확인할 수 있었다. 구체적으로, VRK2가 과발현된 세포의 경우, 단백질 응집현상이 일어남에 따라 막을 통과하지 못하고 걸려서 남아있는 단백질이 관찰되었다.
실시예 2. VRK2 와 샤프로닌 단백질간 상호작용 측정
1) 실험방법
VRK2와 샤프로닌 단백질(Tric/CCT)간의 상호작용을 알아보기 위하여, 샤프로닌 단백질의 각 소단위체(CCT1~8)에 대한 VRK2의 결합 정도를 GST pulldown assay 및 면역침강반응(Immunoprecipitation assay)을 통해 확인하여 각각 도 2a 및 도 2b에 나타냈다(Kang, T. H. and K. T. Kim., 2006. Negative regulation of ERK activity by VRK3-mediated activation of VHR phosphatase. Nat Cell Biol 8: 863-9; 및 Kwon, S. Y.,Y. J. Choi, T. H. Kang, K. H. Lee, S. S. Cha, G. H. Kim, H. S. Lee, K. T. Kim, and K. J. Kim., 2005. Highly efflcient Protein exPression and purification using bacterial hemoglobin fusion vector. Plasmid 53: 274-82 참조, 상기 문헌은 모두 본 명세서에 참조로서 포함됨).
본 실험에 사용된 물질은 각각 GST 항체(SantaCruz), 글루타치온 세파로오스 4B(Glutathione sepharose 4B)(GE healthcare), Flag 항체(sigma), HA 항체(Roche), 실시예 1.2에서 제조된 pFlag-CMV2-VRK2, pGEX-4T3-VRK2, pProEx-HTa-CCTn(CCTn은 CCT1~CCT8이며, 각각 CCT1(NM_013686), CCT2(NM_007636), CCT3(NM_009836), CCT4(NM_009837), CCT5(NM_007636), CCT6 (NM_009838), CCT7(NM_007638), CCT8(NM_009840)), 및 pcDNA3.1-HA-CCT4이며, 상기 pGEX-4T3-VRK2 및 pProEx-HTa-CCTn는, pGEX-4T-3 벡터와 pProEx-HTa 벡터를 각각 구입(Amersham, Piscataway, NJ)하여 VRK2(AB000450) 및 CCTn을 각각 E.coli 기반 클로닝하여 제조하였다.
또한 상기 pcDNA3.1-HA-CCT4는 pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA) 벡터를 Kpn1과 EcoR1(DCC-Bionet) 제한효소로 자르고 HA epitope(5’-ATGGCCTCCTACCCTTATGATGTGCCAGATTATGCCTCTCCC-3’: SEQ ID NO: 8)을 합성하여 동일한 제한효소로 자른 후, 이를 T4 DNA 리가아제(Roche)로 연결(ligation) 하여 변형시킨 벡터에 CCT4를 E.coli 기반 클로닝하여 제조하였다. 제한효소 반응은 37℃ 에서 16시간 처리하고, 연결 반응은 16℃에서 16시간 처리하였다.
또한 상기 면역침강반응 실험을 통한 세포 내 위치를 확인하기 위해, 형광현미경(Carl Zweiss, Germany)으로 관찰하여 그 결과를 도 2c에 나타냈다.
구체적으로, 커버슬립(coverslip) 위에 HEK293T cell (한국세포주은행)이 50-60% 정도 자랐을 때, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 pFlag-CMV2-VRK2와 pcDNA3.1-HA-CCT4을 형질전환 시키고, 24시간 후에 세포를 4% (w/v) 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 15분간 고정 시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. 그 뒤, Flag (sigma)과 HA (Roche) 항체를 1:1000으로 희석하여 4℃에서 밤새 배양한 후, PBS로 3회 세척하였다. Alexa488 (Green, invitrogen), Alexa594 (Red, invitrogen)를 1:1000으로 희석하여 상온에서 1시간 배양하고, PBS로 3회 세척한 뒤에 Hoechst (5ug/ml)(Sigma) 염색을 상온에서 10분간 수행하고 PBS로 3회 세척한 뒤 슬라이드 글래스(slide glass)에 마운팅(mounting) 하여 형광현미경 (Carl zeiss)으로 이미지를 얻었다.
2) 실험결과
도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, VRK2와 샤프로닌 단백질, 특히 CCT4는 GST pulldown assay 및 면역침강반응(Immunoprecipitation(IP) assay)과 같은 두 분자의 결합정도를 확인하는 실험에서 모두 강하게 결합하고 있음을 확인할 수 있었다.
도 2a의 8개의 이미지는 VRK2에 끌려 나오는 샤프로닌 단백질을 확인할 수 있는 이미지 결과로서, 각 이미지마다 좌측부터 첫 번째는 input, 즉 사용한 샤프로닌 단백질의 5%를 의미한다. 두 번째는 VRK2 단백질에 끌려 나온 샤프로닌 단백질의 양을 의미하고, 세 번째는 VRK2 단백질(실험군)에 대한 대조군으로서 GST 단백질에 끌려 나온 샤프로닌 단백질의 양을 의미한다. 끌려 나온 샤프로닌 단백질의 양은 6x Histidine이 태깅되어 있으므로 His Anibody (Santa Cruz)를 이용하여 확인하였으며, 샤프로닌 8개의 subunit 중 특히 CCT4가 가장 강하게 결합되어 끌려 나온 것을 확인할 수 있었다.
도 2b의 상단의 이미지는 세포 자가분해물(lysates)에서 VRK2에 의해 끌려 나오는 CCT4 단백질 양을 의미한다. 좌측부터 첫 번째 lane은 input, 즉 면역침강(Immunoprecipitation) 시 사용한 세포 자가분해물에 대해 5%의 양을 의미한다. 두 번째 lane은 HA가 태깅된 CCT4만이 과발현된 세포에서 Flag antibody에 의해 끌려 나온 CCT4 단백질 양을 의미한다. 세 번째 lane은 Flag이 태깅된 VRK2와 HA가 태깅된 CCT4가 과발현된 세포에서 Flag antibody을 이용하여 VRK2를 끌어 당겼을 때 끌려 나온 CCT4 단백질 양을 의미한다. CCT4 단백질 양은 HA antibody를 이용하여 확인하였다. 도 2b의 상단에 나타난 바와 같이, 샤프로닌 단백질 CCT4가 VRK2에 의해 끌려 나온 것을 볼 수 있으며, 이에 따라 VRK2와 CCT4가 세포 안에서 상호작용 함을 알 수 있었다. 또한 하단의 이미지에서 VRK2 단백질 양 및 면역침강 실험 시 사용 된 항체(light chain)의 양이 동일함을 확인할 수 있다.
또한 면역침강반응 실험을 통한 세포 내 위치를 확인하는 실험에서도 두 단백질이 같은 위치를 점유하고 있어 서로 결합할 수 있는 기회가 존재함을 나타냈다(도 2c). 도 2c의 좌측부터 각각 빨간색은 VRK2 단백질의 위치를, 녹색은 CCT4 단백질의 위치를, 파란색은 핵의 위치를 나타내며, VRK2는 핵 주위의 세포소기관 (ER 및 mitochondria)에 집중되어 분포함을 보여주고, CCT4는 세포질에 퍼져 존재함을 보여준다. 이처럼 VRK2 및 CCT4 단백질은 같은 공간을 점유하며 상호작용할 가능성을 보여주며, 따라서 상기 실시예 1에서 제시한 VRK2의 헌팅틴 단백질 응집 유도 기능이 VRK2와 샤프로닌 단백질(특히 CCT4) 간에 일어나는 상호작용과 관련이 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 샤프로닌 단백질의 양 및 수명에 대한 VRK2 의 영향 측정
1) 실험방법
VRK2의 인산화 효소 활성에 의존적으로 일어나는 헌팅틴 단백질 응집 유도 작용의 샤프로닌 단백질의 양 및 수명에 대한 영향을 측정하기 위해, 아래와 같은 실험을 하였다.
a. GST-VRK2, GST-VRK2-KD 단백질 제조
우선 VRK2의 효소활성을 조절하기 위해 SDM (Site-directed mutagenesis)를 수행하여 61번 리신(lysine) 잔기가 알라닌(alanin)으로 치환된 클론(clone)을 제작하였다. 이를 VRK2-KD로 명명하고, VRK2와 VRK2-KD를 pGEX-4T-3 벡터(Amersham, Piscataway, NJ) 에 클로닝하여 GST-VRK2, GST-VRK2-KD 단백질을 얻었다(Kang, T. H. and K. T. Kim., 2006. Negative regulation of ERK activity by VRK3-mediated activation of VHR phosphatase. Nat Cell Biol 8: 863-9). GST-VRK2-KD 단백질의 효소 불활성은 in vitro kinase assay를 수행하여 확인하였다. 구체적으로 단백질 1ug과 buffer (20mM Tris-HCl pH7.5, 5mM MgCl2, 0.5mM dithiothreitol, 150mM KCl), 그리고 32P-γ-ATP를 섞고 30℃에서 30분간 배양한 후, SDS-PAGE를 수행하고 x-ray film을 이용하여 이미지 결과를 얻어 도 3a에 나타냈다.
b. VRK2의 효소활성에 따른 CCT4의 양 변화 관찰
상기 실시예 1.2와 동일한 방법으로 pFlag-CMV2 vector에 효소활성이 있는 VRK2 유전자와 효소활성이 없는 VRK2-KD 유전자를 클로닝하고 이를 HEK293T 세포에 metafectene을 이용하여 형질전환시켰다. 24시간 뒤에 세포를 배양접시에서 Trypsin (welgene)을 이용하여 떼어낸 후, 세포를 1500 rpm에서 1분 30초간 원심분리기를 이용하여 모았다. 모아진 세포는 RIPA buffer (50mM Tris/HCl pH 8, 150mM NaCl, 1% (v/v) NP-40, 0.5% (w/v) sodium Deoxycholate, 0.1% (w/v) SDS)로 4℃에서 30분간 분해(lysis)시켰다. 이후 15000rpm에 30분간 원심분리하여 상층액을 얻고, 이를 Bradford assay를 통해 정량 후 SDS PAGE를 수행하였다. 또한 VRK2에 대한 샤프로닌 단백질의 폴리유비퀴틴 현상을 관찰하기 위해, 위의 세포 자가분해물(lysates)에 CCT4 항체(abcam) 1ug을 섞고 면역침강 실험을 수행하였다. 이 후에 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane, Pall Corporation)에 이동(transfer)시킨 후, 이를 5% (w/v) skim milk로 막을 코팅한 후 Flag (Sigma), CCT4 (abcam), Ubiquitin (Santa Cruz) GAPDH (Santa Cruz) 항체를 4℃에서 밤새 배양하였다. 그 후 워싱 버퍼(0.05% (v/v) Tween 20 with TBS)로 10분간 3번 세척하였다. 그리고 HRP (Horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(anti-mouse HRP-conjugated antibody (KPL))를 상온에서 1시간 배양한 후 워싱 버퍼로 10분간 3번 세척하였다. 그 후 ECL (enhanced chemiluminescence) solution을 이용한 발색반응을 통해 x-ray film에 현상하고 그 양을 확인하여 도 3b에 나타냈다. VRK2 단백질 양은 flag 항체 (sigma)로 확인하였고, GAPDH 단백질은 loading control로서 사용되었다.
c. VRK2의 효소 활성에 따른 CCT4의 수명 변화 관찰
번역(translation) 저해제인 사이클로헥사마이드(Cyclohexamide(CHX), Calbiochem)을 VRK2와 VRK2-KD가 과발현된 HEK293T세포에 각각 50ug/ml로 처리한 후 0시간, 4시간, 8시간째에 세포를 각각 배양접시에서 Trypsin (welgene)으로 떼어내어 1500 rpm에서 1분 30초간 원심분리기를 이용하여 모은 것 외에는, 상기 b와 동일한 방법으로 Bradford assay를 통해 정량 후 SDS PAGE를 수행하였다. 또한 면역침강 실험은 제외하되 이후의 과정은 역시 상기 b와 동일한 방법으로 수행하여 x-ray film에 현상 후 그 결과를 도 3c에 나타냈다. 이와 같이, 번역 저해제인 CHX를 사용함으로써 새롭게 합성되는 단백질이 억제되므로 기존에 존재하는 단백질의 수명을 확인할 수 있다.
d. 분획 및 웨스턴 블랏 실험
VRK2를 과발현 시킨 HEK293T cell의 추출물(extracts)을 Superdex200 gel-filtration column (GE healthcare)이 장착된 FPLC 장치(Bio-Rad)을 이용하여 분획(fraction)을 나누었다. 이후 각 분획에 대해 웨스턴 블랏(western blotting)을 수행하였다(BMC Cell biol,2002, 3; 30 참조)(사용물질: CCT4 항체(abcam), HSP70 항체(santa cruz)).
2) 실험결과
도 3a 내지 도 3d에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 확인된 VRK2 효소활성에 의한 헌팅틴 단백질 응집 유도 기능은 샤프로닌 단백질 수명에 영향을 미친다는 사실을 확인할 수 있었다.
우선 도 3a를 보면 상단의 이미지는 VRK2의 자기인산화(autophosphorylation) 현상을 반영하며, 이는 인산화효소의 효소활성이 있음을 의미한다. 반면, VRK2-KD는 자기인산화 현상이 사라진 것을 확인할 수 있었다. 참고로 하단의 이미지는 coomassie Brilliant Blue G250 (Bio-Rad)를 이용한 염색법을 이용하여 사용한 단백질의 정량이 잘 됐음을 나타낸다.
도 3b의 상단의 3개 이미지는 세포 내에 존재하는 각 단백질의 양을 의미하며, 하단의 이미지는 CCT4에 태깅된 유비퀴틴(ubiquitin) 단백질의 분포를 보여준다. 하단의 이미지에 나타난 바와 같이, VRK2의 효소활성이 있을 경우, 샤프로닌 단백질에 단백질 분해신호인 폴리유비퀴틴의 표지가 늘어남을 확인할 수 있었으며, 이러한 현상은 VRK2의 효소활성이 사라졌을 때, 많이 감소함을 확인할 수 있었다. 이와 비슷하게 상단의 이미지에서도 세포 내 샤프로닌 단백질(CCT4)의 양은 VRK2의 효소활성이 있는 단백질이 과발현 됐을 때 감소함을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 VRK2의 효소활성이 샤프로닌 단백질의 양 감소에 있어 중요함을 알 수 있었다.
한편, 번역 저해제인 CHX를 처리한 결과인 도 3c를 보면, 상단의 이미지는 VRK2, VRK2-KD가 과발현된 세포에서의 샤프로닌 단백질의 수명을 나타내고, 밑의 이미지는 그에 대한 loading control로서 GAPDH 단백질의 양을 의미하며, 도 3b에 나타난 결과와 일치하게, 샤프로닌 단백질의 수명은 VRK2 단백질의 효소활성에 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다.
구체적으로 VRK2 효소활성이 있는 단백질 양을 늘려주면 단백질 분해신호인 폴리유비퀴틴이 표지된 샤프로닌(CCT4)의 양이 늘어나면서 그로 인해 샤프로닌 단백질(CCT4)의 양과 수명이 모두 줄어드는 현상을 보여준다(도 3b 및 도 3c).
도 3d를 보면, 좌측부터 우측으로 갈수록 단백질의 크기가 작아짐을 나타낸다. 샤프로닌 단백질은 8개의 소단위체로 구성된 복합체(complex) 2개가 결합되어 작용하므로 그 크기는 매우 크다. 그런데 VRK2 단백질를 과발현 시켰을 시, 이런 복합체가 나타나는 분획에서의 샤프로닌 단백질 양이 감소함을 확인할 수 있다. 이는 VRK2에 의해 줄어든 CCT4 단백질 양 때문에 복합체 형성이 저해되었음을 의미한다. 즉, VRK2에 의해 상기 샤프로닌 단백질의 소단위체 중 하나인 CCT4의 양이 줄어들면서 샤프로닌이 복합체를 형성하지 못하고 상대적으로 단일체의 양이 늘어남을 보여주며 이에 따라 샤프로닌 단백질의 기능이 저하됨을 시사하고 있다(도 3d).
실시예 4. VRK2 가 샤프로닌 단백질의 수명에 대해 미치는 영향과 관련된 생체인자의 규명
1) 실험방법
상기 실시예 3에서 확인된 VRK2에 의한 샤프로닌 단백질의 수명 감소에 관여하는 생체인자를 규명하기 위해, 다음과 같은 실험을 하였다. 본 실험 및 후술할 실시예 5에 사용된 각 단백질에 대한 siRNA의 서열은 아래와 같다.
- VRK2에 대한 siRNA(siVRK2) (SEQ ID NO: 1)
: GCAAGGUUCUGGAUGAUAUUU (D-004684-06, Dharmacon)
- COP1에 대한 siRNA(siCOP1) (SEQ ID NO: 2)
: GAAAUGACCUGCAAUUCGA (D-007049-01, Dharmacon)
- RBX1에 대한 siRNA(siRBX1) (SEQ ID NO: 3)
: GACUUUCCCUGCUGUUACCUAA (Dharmacon)
a. VRK2에 의한 샤프로닌 단백질의 양 조절에 대한 COP1의 역할 확인
유비퀴틴 연결효소 중의 하나인 COP1의 역할이 VRK2에 의한 샤프로닌 단백질의 양 조절에 미치는지 확인하기 위해, 실시예 1.2에서 사용된 pFlag-CMV-VRK2 및 COP1에 대한 siRNA를 함께 마이크로포레이터(Microporator, invitrogen)를 이용하여 HEK293T 세포주(한국세포주은행)에 형질전환 시켰다. 자세히는 세포 1.0 x 106개에 2ug의 pFlag-CMV-VRK2와 2ul의 siRNA(siCOP1, D-007049-01) 20uM를 섞어서 전기천공법(electroporation)을 수행하였다. 상기 전기천공을 통한 형질전환 후 24 뒤에 배양접시에서 Trypsin (welgene)을 이용하여 세포를 떼어내어 1500 rpm에서 1분 30초간 원심분리기를 이용하여 모았다. 이후의 Bradford assay를 통해 정량 후 SDS PAGE를 수행하는 과정 및 ECL (enhanced chemiluminescence) solution을 이용한 발색반응을 통해 x-ray film에 현상하여 그 양을 확인하는 과정은 상기 실시예 3.1) b와 동일하게 수행하여 도 4a에 나타냈다. 이후, GST가 태깅된 RBX1(Accession no. AF140598)과 SUMO가 태깅된 VRK2를 이용하여 GST-pulldown assay를 수행하여 도 4b에 나타냈다(Kang, T. H. and K. T. Kim., 2006. Negative regulation of ERK activity by VRK3-mediated activation of VHR phosphatase. Nat Cell Biol 8: 863-9 참조).
b. VRK2에 의한 샤프로닌 단백질의 수명 조절에 대한 COP1의 역할 확인
VRK2와 COP1에 대한 siRNA를 유전자전달시스템인 microporator (invitrogen)로 HeLa 세포주(한국세포주은행)에 형질전환 시켰다.
구체적으로 세포 1.0 x 106개에 2ul의 siRNA (20uM)를 섞어서 전기천공법을 수행하였다. 상기 전기천공을 통한 형질전환 후 24시간 뒤에 번역 저해제인 CHX를 50ug/ml로 처리하고 이로부터 0시간, 4시간, 8시간, 12시간 후에 세포를 배양접시에서 Trypsin (welgene)으로 떼어내어 1500 rpm에서 1분 30초간 원심분리기를 이용하여 모았다.
이후의 Bradford assay를 통해 정량 후 SDS PAGE를 수행하는 과정 및 ECL (enhanced chemiluminescence) solution을 이용한 발색반응을 통해 x-ray film에 현상하여 그 양을 확인하는 과정은 상기 실시예 3.1) b와 동일하게 수행하여 도 4c에 나타냈다.
2) 실험결과
도 4a 내지 도 4c에 나타난 바와 같이, 유비퀴틴 연결효소 중 하나인 COP1 (Accession BC094728)이 샤프로닌 단백질 분해메커니즘에 관여함을 확인할 수 있었다.
도 4a의 각각의 이미지는 VRK2와 COP1 단백질의 양을 조절하였을 때의 세포 내 단백질 양을 나타낸다. 도 3b 에서 확인한 바와 같이, 샤프로닌 단백질 양은 VRK2 단백질 양을 늘렸을 때 감소하는데, 이렇게 VRK2 단백질 양을 증가시킨 경우에도 세포 내 유비퀴틴 연결효소인 COP1의 단백질 양을 감소시켰을 때에는 샤프로닌의 단백질 양이 감소하지 않았음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 VRK2가 작용하는 샤프로닌 단백질 분해 메커니즘에 COP1 유비퀴틴 연결효소가 작용함을 알 수 있다. 즉 COP1의 발현량을 감소시킨 경우, VRK2의 CCT4 양의 감소에 대한 영향이 억제되었음을 확인할 수 있었다(도 4a). 또한 도 4b를 보면, COP1 유비퀴틴 연결효소의 구성요소 중 하나인 RBX1과 VRK2 단백질이 GST-pulldown assay시 함께 끌려 나오는 것을 확인할 수 있으며, 따라서 VRK2는 특히 COP1의 복합체 구성요소인 RBX1(Accession no. AF140598)과 상호작용함을 확인할 수 있었다.
도 4c에서는 샤프로닌 단백질 분해 메커니즘에 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 VRK2와 COP1의 단백질 발현량을 세포에서 모두 낮췄을 시에 샤프로닌 단백질의 수명이 대조군에 비해 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서, 샤프로닌 단백질 분해과정에 VRK2 인산화효소와 COP1 유비퀴틴 연결효소가 작용함을 알 수 있다.
이처럼, 상기 실시예 3에서 확인된 VRK2에 의한 샤프로닌 단백질의 수명 감소에 관여하는 생체인자는 COP1, 특히 상기 COP1의 복합체 구성요소인 RBX1 임을 확인할 수 있었으며, 따라서 상기 COP1의 발현을 COP1에 대한 siRNA에 의해 저해시킨 경우, VRK2의 샤프로닌 단백질의 수명 및/또는 감소에 대한 영향을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. VRK2 의 발현량 감소에 따른 샤프로닌 단백질에 대한 영향 측정
1) 실험방법
VRK2의 발현량을 감소시킨 경우의 샤프로닌 단백질에 대한 영향 즉, 헌팅틴 단백질의 응집체 양의 변화를 측정하여 도 5a 내지 도 5c에 나타내었다.
이를 위해, 우선 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 HeLa 세포주 (한국세포주은행) 내에 헌팅틴 단백질의 과발현을 유도하였다. 이후, 세포 내 VRK2 단백질을 없애기 위해, VRK2의 mRNA를 표적화하는 siRNA(siVRK2) 및 대조군 siRNA(siCont)를 Dharmacon(USA)에서 입수하여 효율 검증 및 세포 내 VRK2의 발현량 감소에 사용하였다.
구체적으로 24wells plate 기준으로 Dharma FECT1 (siRNA 형질주입 시약) 2.5ul와 5uM siVRK2 2.5ul를 무혈청 배양액(DMEM/high glucose (Hyclone)) 47.5ul에 각각 섞고, 5분 뒤에 이 두 용액을 섞은 후 상온에 20분간 두고 세포에 직접 한 방울씩 떨어뜨려 siVRK2(D-004684-06, Dharmacon)를 형질전환시켰다. 이후 1일, 2일, 3일 째에 세포를 trypsin (welgene)으로 떨어뜨리고 1500rpm에 1분 30초간 원심분리하여 세포를 얻었다. 이후 TRI reagent (Molecular Research Center)를 이용하여 전체 RNA를 추출하고 역전사효소(Promega)를 이용하여 cDNA를 얻었다(Nucleic Acid Res, 2010, 38(20): 7068-78 참조).
상기 얻어진 cDNA와 VRK2 (Accession AB000450), GAPDH (Accession NM_002046)에 대한 primers (10pM) 1ul을 같이 섞고 PCR을 수행하였다.
<사용된 프라이머>
- VRK2 RT 프라이머
정방향 : 5’-TTTAGCATATGATGAAAAGCCAAACTATCA-3’(SEQ ID NO: 9)
역방향 : 5’-TGAGACTCTTGATATTTCTGTCTTCTCCTT-3’(SEQ ID NO: 10)
- GAPDH RT 프라이머
정방향 : 5’-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGACCAC-3’(SEQ ID NO: 11),
역방향 : 5’-CCACCACTGACACGTTGGCAGTGGGGACAC-3’(SEQ ID NO: 12)
- PCR 조건 : 1. 95℃ 10 분, 2. 95℃ 15 초, 3. 60℃ 1 분 에서, 2번 내지 3번 스텝을 40 사이클로 수행함.
이후 PCR 산물을 1.5% (w/v) agarose gel에 전기영동 한 뒤 자외선 조사기(UV transilluminator, UVP)를 통해 관찰하여 도 5a에 나타냈다.
다음으로 커버슬립(coverslip) 위에 HeLa 세포주가 5-60% 정도 자랐을 때, 상술한 형질전환 방법을 이용하여 siRNA(siVRK2, siCont)와 실시예 1의 Htt-exon1-GFP(HttQ103-GFP)을 HeLa 세포주에 형질전환 시켰다. 그 후 1일, 2일, 3일에 세포를 4% (w/v) 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 15분간 고정 시키고 PBS로 3회 세척하였다. 그 뒤 Hoechst (5ug/ml)(Sigma) 염색을 상온에서 10분간 수행하고 PBS로 3회 세척한 뒤 슬라이드 글래스(slide glass)에 마운팅(mounting) 하여 형광현미경 (Carl zeiss)으로 이미지를 얻었으며(도 5b), 상기 얻어진 결과를 정량화하여 도 5c에 나타냈다.
2) 실험결과
도 5에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2를 통해 밝힌 샤프로닌 단백질의 조절인자인 VRK2의 발현량을 siRNA을 이용하여 낮췄을 때, 샤프로닌 단백질의 기능이 향상되어 헌팅틴 단백질 응집체의 양이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
우선 도 5a에 나타난 바와 같이, VRK2의 mRNA를 표적화하는 siVRK2(Dharmacon,　USA)를 세포 내의 VRK2 단백질을 없애기 위하여 사용한 결과 VRK2의 발현이 측정되지 않음을 확인할 수 있었다.
또한 도 5b에서 확인할 수 있듯이, 실험군(siVKR2를 이용하여 VRK2 단백질 형성을 억제한 세포)와 대조군(VRK2 단백질 형성이 억제되지 않은 세포)의 헌팅틴 단백질 응집 양상을 형광현미경으로 관찰하였을 때, VRK2 단백질 형성을 억제한 세포에서는 헌팅틴 단백질이 응집되지 않고 세포 전체에 퍼져서 존재하여, 헌팅틴 단백질의 응집이 매우 감소하였음을 확인할 수 있었다.
보다 구체적으로 응집 현상을 보이는 세포의 수를 눈으로 세어서 그래프로 나타낸 도 5c를 보면, 응집현상을 보이는 세포의 전체 세포 수에 대한 비율(%)이 처리 1일째 대조군의 경우 약 4%로 나타난 반면, 실험군은 약 1% 정도에 불과하여 대조군에서 응집 현상을 보이는 세포의 비율이 약 4배 정도 높게 나타나 VRK2 단백질 감소에 따라 헌팅틴 단백질의 응집이 현저히 감소됨을 알 수 있었으며, 3일째에는 실험군이 상기 1일째의 대조군에서 측정된 세포수인 약 4%에도 못 미치는 비율을 나타낸 반면, 대조군의 경우 약 17%에 달하는 비율을 나타내 약 4배를 초과하는 것을 확인할 수 있어 시간이 흐름에 따라 효과 차이가 점차 커지는 것을 확인할 수 있었다.
이와 같이, VKR2 및/또는 COP1(특히 RBX1)은 퇴행성 뇌신경질환을 유도하는 단백질 응집에 관여하는 샤프로닌 단백질의 효과적인 음성 조절자로서 작용할 수 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명은 퇴행성 뇌신경질환에 대한 효과적인 예방 또는 치료를 위해 매우 유용하게 이용될 수 있다.
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Claims (16)

1) 후보 물질, 및 VRK2를 준비하는 단계;
2) 상기 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성을 측정하는 단계; 및
3) 상기 후보 물질과 VRK2를 함께 처리시 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성의 변화를 측정하는 단계
를 포함하는 CCT4의 조절 물질 탐색 방법.
제1항에 있어서,
상기 CCT4의 조절 물질은 CCT4의 양 또는 수명을 증가시키는 것이며, 상기 단계 3) 이후에,
4-1) 상기 후보 물질 처리에 의한 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성에 비하여 감소한 경우, 상기 후보물질을 CCT4의 양 또는 수명을 증가시키는 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 CCT4의 조절 물질은 상기 CCT4의 양 또는 수명을 감소시키는 것이며, 상기 단계 3) 이후에,
4-2) 상기 후보 물질 처리에 의한 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 VRK2의 발현량 또는 인산화 효소 활성에 비하여 증가한 경우, 상기 후보물질을 상기 CCT4의 양 또는 수명을 감소시키는 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제2항의 방법에 의해 탐색된 상기 CCT4의 양 또는 수명을 증가시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 CCT4의 양 또는 수명을 증가시키는 물질은, siVRK2 (SEQ ID NO: 1) 및 이의 상보적 서열로 이루어진 siVRK2 이중가닥인, 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 CCT4의 양 또는 수명을 증가시키는 물질을 상기 전체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%로 포함하는 것인, 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌신경 질환은 알츠하이머씨병, 파킨슨씨병, 또는 헌팅톤씨병인 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
1) 후보 물질, 및 COP1을 준비하는 단계;
2) 상기 COP1의 발현량 또는 효소 활성을 측정하는 단계; 및
3) 상기 후보 물질과 COP1을 함께 처리시 COP1의 발현량 또는 효소 활성의 변화를 측정하는 단계
를 포함하는 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법.
제8항에 있어서,
상기 샤프로닌 단백질의 조절 물질은 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 것이며, 상기 단계 3) 이후에,
4-1) 상기 후보 물질 처리에 의한 COP1의 발현량 또는 효소 활성이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 COP1의 발현량 또는 효소 활성에 비하여 감소한 경우, 상기 후보물질을 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제8항에 있어서,
상기 샤프로닌 단백질의 조절 물질은 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 감소시키는 것이며, 상기 단계 3) 이후에,
4-2) 상기 후보 물질 처리에 의한 COP1의 발현량 또는 효소 활성이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 경우의 COP1의 발현량 또는 효소 활성에 비하여 증가한 경우, 상기 후보물질을 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 감소시키는 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제9항의 방법에 의해 탐색된 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제11항에 있어서,
상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 물질은
siCOP1 (SEQ ID NO: 2) 및 이의 상보적 서열로 이루어진 siCOP1 이중가닥, 및 siRBX1 (SEQ ID NO: 3) 및 이의 상보적 서열로 이루어진 siRBX1 이중가닥으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제11항에 있어서,
상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 물질을 상기 전체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%로 포함하는 것인, 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제11항에 있어서,
상기 퇴행성 뇌신경 질환은 알츠하이머씨병, 파킨슨씨병, 또는 헌팅톤씨병인 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
1) 후보 물질, VRK2, 및 COP1을 준비하는 단계;
2) 상기 VRK2 및 상기 COP1간 결합 여부를 측정하는 단계; 및
3) 상기 후보 물질, VRK2, 및 COP1을 함께 처리시, 상기 VRK2 및 상기 COP1간 결합 형성 여부를 측정하는 단계;
를 포함하는 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법.
제15항에 있어서,
상기 샤프로닌 단백질의 조절 물질은 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 것이며, 상기 단계 3) 이후에,
4) 상기 후보물질 처리에 의하여 상기 VRK2 및 상기 COP1간 결합 형성이 억제되는 경우, 상기 후보물질을 상기 샤프로닌 단백질의 양 또는 수명을 증가시키는 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
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