CN103733069A - 筛选伴侣蛋白调节物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及筛选参与诱导神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病的蛋白聚集的伴侣蛋白调节物的方法，通过所述方法筛选的伴侣蛋白调节物用于预防和治疗神经退行性疾病的用途。根据本发明，提供了新的负伴侣蛋白调节物，且可使用负调节物作为靶更迅速和方便地筛选伴侣蛋白调节物。而且，通过使用所述筛选的物质，神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病可被有效地预防或治疗而无需担心由于作为去除蛋白聚集体的现有方法的自我吞噬造成的细胞死亡。

Description

筛选伴侣蛋白调节物的方法
发明领域
本发明涉及筛选参与诱导神经退行性疾病诸如阿耳茨海默病（Alzheimer’s disease）、帕金森病（Parkinson’s disease）和亨廷顿病（Huntington’s disease）的蛋白聚集的伴侣蛋白（chaperonin）调节物的方法，以及由此筛选的伴侣蛋白调节物用于预防和治疗神经退行性疾病的用途。
发明背景
神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病、帕金森病或亨廷顿病的代表性症状包括特定蛋白的聚集。蛋白聚集体(aggregate)抑制作为细胞中蛋白分解设施的蛋白酶体的作用，并抑制转运蛋白的转移。并且，它与其它转录因子聚集在一起并隔离（isolate）它们以改变基因转录。而且，它干扰线粒体的作用，从而诱导氧化应激以诱导细胞死亡。特别地，由于以上作用，它可对通过突触的神经信号转导造成副作用，并且它可诱导神经元死亡以造成脑功能的衰退。
最近，许多神经退行性疾病研究集中在使用自我吞噬去除已经形成的聚集体。有研究结果表明蛋白聚集体的特异性去除。然而，已知当细胞中存在能量不平衡时，自我吞噬通过分解其细胞器获得能量，且如果未正确达到控制，自我吞噬可引起细胞死亡。
公开内容
技术问题
因此，提供用于筛选控制伴侣蛋白的作用以通过抑制蛋白聚集起始来维持正确蛋白折叠的新的调节物的方法是本发明的目的。
问题的解决方案
作为研究的结果，发明人确定牛痘-相关激酶2（vaccinia-related kinase2，VRK2）与分子伴侣之一伴侣蛋白的量和/或稳定性相关，并特别发现VRK2依赖于酶活性降解伴侣蛋白。在伴侣蛋白的降解过程中，泛素连接酶COP1复合体与VRK2相互作用。因此，确认这两种物质可充当筛选伴侣蛋白调节物的重要的靶，并完成了本发明。筛选的伴侣蛋白调节物可以是预防或治疗神经退行性疾病的有效活性成分。
因此，本发明的一个实施方案提供了筛选伴侣蛋白调节物的方法，其包含1）制备候选物质和VRK2；2）测量VRK2的表达量或激酶活性；以及3）用候选物质处理VRK2并测量VRK2的表达量或激酶活性的变化。
优选地，VRK2可以是来源于所有真核细胞包括人类的VRK2，且例如，它可具有登录号BAA19109的氨基酸序列。并且，优选地，它可由登录号AB000450的核苷酸序列编码。
优选地，伴侣蛋白可以是伴侣蛋白TRiC/CCT，更优选地，可以是CCT4（登录号NM_009837）。
伴侣蛋白的调节可以优选地增加或降低伴侣蛋白的量和/或稳定性。
候选物质未特别限制，它可包括可以增加或降低VRK2的表达量和/或酶活性的所有物质，且优选地，它可以是各种合成或天然物质，包括多肽、多核苷酸（反义RNA、siRNA等等）和化合物。
VRK2可以是野生型的，或者可被适当修饰以增加活性。例如，修饰的VRK2可以被适当的标签修饰，其中标签可以是GST、His、Flag、EGFP、DsRed1等等，且优选地，GST可在VRK2的N末端加标签。
在伴侣蛋白调节物是增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质的情况下，方法可优选在步骤3）之后还包括，4-1）如果与未处理的对照相比，VRK2的表达量或激酶活性降低，则鉴定候选物质为增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质。
VRK2的表达量或激酶活性可通过生物实验中通常使用的方法来测量，没有特定限制。例如，激酶活性的存在或程度可通过体外激酶试验来确认，但不限于此。
VRK2对应于负伴侣蛋白调节物，并通过以下实施例1确认负调节是基于VRK2的酶活性。因此，与处理前的表达量或酶活性相比，如果当候选物质被处理时VRK2的表达量或酶活性降低，则处理的候选物质可被判断为增加伴侣蛋白的量和/或稳定性的物质。
根据以上方法增加伴侣蛋白的量和/或稳定性的物质可优选是由单链siVRK2(D-004684-06,Dharmacon)(SEQ ID NO:1)和其互补链组成的双链siVRK2。
相反，在伴侣蛋白调节物是降低伴侣蛋白的量或稳定性的物质的情况下，方法可优选在步骤3）后还包括，4-2）如果与未处理的对照相比，VRK2的表达量或激酶活性升高，则鉴定候选物质为降低伴侣蛋白的量或稳定性的物质。
同时，因为VRK2对伴侣蛋白的作用，即，通过与泛素连接酶COP1复合体的相互作用执行伴侣蛋白的降解，COP1也可充当筛选伴侣蛋白调节物的重要靶。并且，因为VRK2特别与RBX1相互作用，RBX1是COP1复合体的组分，RBX也可以是重要的靶。
因此，本发明的另一个实施方案提供了筛选伴侣蛋白调节物的方法，其包含1）制备候选物质和COP1；2）测量COP1的表达量或酶活性；以及3）用候选物质处理COP1并测量COP1的表达量或酶活性的变化。
优选的伴侣蛋白和伴侣蛋白的调节可与以上解释的相同。
候选物质未特别限制，它可包括可以增加或降低COP1的表达量和/或酶活性的所有物质，且优选地，它可以是各种合成或天然物质，包括多肽、多核苷酸（反义RNA、siRNA等等）和化合物。
COP1可以是野生型的，或者它可以被适当修饰以增加活性。例如，修饰的COP1可以用适当的标签修饰，其中标签可以是GST、His、Flag、EGFP、DsRed1等等，且优选地，GST可在COP1的N末端加标签。
例如，COP1可具有登录号BC094728的核苷酸序列。并且，RBX1可具有登录号AF140598的核苷酸序列。
在伴侣蛋白调节物是增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质的情况下，方法可优选在步骤3）后还包括，4-1）如果与未处理的对照相比，COP1的表达量或激酶活性降低，则鉴定候选物质为增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质。
因为COP1像以上解释的VRK2一样对应于负伴侣蛋白调节物，如果与候选物质处理前的表达量或酶活性相比，COP1的表达量或酶活性降低，则处理的候选物质可被鉴定为增加伴侣蛋白的量和/或稳定性的物质（实施例4）。
COP1的表达量或酶活性（作为E3连接酶的活性）可通过本领域通常使用的方法来测量，没有特定限制。
根据伴侣蛋白调节物的筛选方法增加伴侣蛋白的量和/或稳定性的物质可优选是选自由以下组成的组中的一种或多种：由单链siCOP1(D-007049-01,Dharmacon)(SEQ ID NO:2)和其互补链组成的双链siCOP1，和由单链siRBX1(Dharmacon)(SEQ ID NO:3)和其互补链组成的双链siRBX1。
相反，在伴侣蛋白调节物是降低伴侣蛋白的量或稳定性的物质的情况下，方法可优选在步骤3）后还包括，4-2）如果与未处理的对照相比，COP1的表达量或酶活性升高，则鉴定候选物质为降低伴侣蛋白的量或稳定性的物质。
同时，因为VRK2和COP1的相互作用可通过VRK2和COP1之间的结合来实现，本发明的又另一个实施方案提供了筛选伴侣蛋白调节物的方法，其包含1）制备候选物质、VRK2和COP1；2）测定VRK2和COP1之间的结合；以及3）用候选物质处理VRK2和COP1并测定VRK2和COP1之间的结合。
候选物质未特别限制，它可包括可以预期抑制或促进VRK2和COP1之间相互作用的任何物质，并且它可以优选地是各种合成或天然物质，包括多肽、多核苷酸（反义RNA、siRNA等等）和化合物。
在伴侣蛋白调节物是增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质的情况下，方法可优选在步骤3）后还包括，4）如果VRK2和COP1之间的结合被候选物质处理抑制，则鉴定候选物质为增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质。
因为伴侣蛋白通过抑制蛋白聚集，例如亨廷顿（huntingtin）蛋白的异常聚集，维持蛋白的正确折叠，增加伴侣蛋白的量和/或稳定性的物质可对通过蛋白聚集发生的神经退行性疾病的预防或治疗是有用的。
因此，本发明的又另一个实施方案提供了用于预防或治疗神经退行性疾病的组合物，所述组合物包含由伴侣蛋白调节物的以上筛选方法筛选的调节物，特别是增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质，作为活性成分。
并且，本发明的又另一个实施方案提供了用于预防或治疗神经退行性疾病的方法，所述方法包含根据以上筛选方法筛选增加伴侣蛋白的量和/或稳定性的物质；以及以有效量向需要预防或治疗神经退行性疾病的受试者施用筛选的调节物。
优选地，需要预防或治疗神经退行性疾病的受试者可以是哺乳动物包括人类。
神经退行性疾病可以是阿尔茨海默病、帕金森病或亨廷顿病，优选亨廷顿病，但不限于此。
用于预防或治疗神经退行性疾病的组合物可优选包括基于组合物的总重量0.0001wt%到99.9wt%，优选0.001wt%到50wt%的增加伴侣蛋白的量或寿命的物质。
优选地，预防或治疗神经退行性疾病的组合物和方法可还包括制备和施用药学组合物通常使用的适当的载体、赋形剂和稀释剂等等，根据物质被制备成适当的剂型，通过适合于每种剂型的施用途径被提供。根据调节物的种类，本领域的普通技术人员可容易地选择适当的剂型和施用途径。
载体、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁等等。
可根据普通方法通过口服或胃肠外途径施用药物组合物，且例如，对于口服施用，它可以以粉末、颗粒、片剂、混悬液、乳液、糖浆等等的形式使用，且对于胃肠外施用，它可通过静脉内、肌内、皮下注射等等被施用，但所有可能的施用途径都可被应用，没有限制。
优选的施用量可以是适合于受试者和/或疾病的治疗或预防的量，并且它可根据各种因素包括受试者的年龄、性别、一般健康状态和体重、疾病的种类和严重性、剂型的种类、组合物中包含的其它成分的种类和含量、组合物的分泌率、施用途径和时间段等等被控制，并且它可由本领域普通技术人员适当地选择。
有益效果
根据本发明，提供了新的负伴侣蛋白调节物，并且可使用负调节物作为靶更迅速和方便地筛选伴侣蛋白调节物。而且，通过使用筛选的物质，可有效预防或治疗神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病、帕金森病或亨廷顿病等等而无需顾虑由于作为去除蛋白聚集的现有方法的自我吞噬造成的细胞死亡。
附图简述
图1a到图1c显示根据实施例1测定VRK2对亨廷顿蛋白聚集和亨廷顿蛋白聚集诱导的方面的作用的结果。
图2a到图2c显示根据实施例2测定VRK2和伴侣蛋白的相互作用的结果。
图3a到图3d显示根据实施例3测定由VRK2诱导的亨廷顿蛋白聚集对伴侣蛋白的稳定性的作用的结果。
图4a到图4c显示根据实施例4研究参与VRK2的亨廷顿蛋白聚集诱导的生物因子的结果。
图5a到图5c显示根据实施例5，VRK2的表达量降低对伴侣蛋白（抑制亨廷顿蛋白聚集）的作用。
发明模式
以下，将参考优选实施例详细解释本发明。然而，下列实施例仅仅用于阐述本发明，且本发明的范围不限于此。
实施例1.亨廷顿蛋白聚集诱导实验
1.1HEK293T细胞系中的亨廷顿蛋白聚集诱导实验
1）实验方法
为了确认VRK2是否可以控制作为神经退行性疾病的主要症状的蛋白聚集，在人类胚胎肾细胞系HEK293T（韩国细胞系库，Korean Cell LineBank）单独或与VRK1（与VRK2相同的蛋白激酶家族，AB000449）或VRK2（AB000450）一起过表达亨廷顿蛋白，以测定对聚集方面和亨廷顿蛋白聚集的作用。
在亨廷顿基因的外显子1上存在多聚谷氨酰胺链（polyglutaminetract），且在本实验中，使用了具有103个谷氨酰胺的克隆以容易地诱导聚集。亨廷顿病的症状的程度和疾病发病的时间与亨廷顿基因外显子1的多聚谷氨酰胺链中的谷氨酰胺的数目相关，具体地，当数目等于或小于25时，它被称为野生型，且当数目等于或大于25时，它被称为突变型，并且据观察，当谷氨酰胺的数目增加时，症状的程度恶化并且疾病发病的时间提前。
具体地，根据生产商推荐的量，使用转染试剂METAFECTENE(Biontex)，连接GFP（绿色荧光蛋白）的具有形成蛋白聚集体的103个谷氨酰胺的亨廷顿（Htt）蛋白基因表达载体Htt-exon1-GFP-pcDNA3.1载体（HTTQ103–GFP–pcDNA3.1）（获自Judith Frydman，斯坦福大学，CA），被单独地或与分别连接RFP（红色荧光蛋白）的DsRed1-C1-VRK1或DsRed1-C1-VRK2一起转染进入HEK293T细胞系，以在含有DMEM/高葡萄糖（Hyclone-cat.#SH30243.01）、10%（v/v）FBS（Hyclone）和1%（v/v）青霉素-链霉素（welgene，韩国）的培养基中在37℃、5%CO2下培养24小时过表达，且然后，过表达的VRK1、VRK2、HTTQ103–GFP蛋白的聚集方面通过荧光显微镜（Carl Zeiss，德国）观察并显示于图1a。对于DsRed1-C1-VRK1或DsRed1-C1-VRK2的制备，购买了pDsRed1-C1(BDBiosciences,San Jose,CA)并分别克隆了VRK1(AB000449)和VRK2(AB000450)。
2）实验结果
如图1a所示，每个蛋白的聚集方面都展现了密集的形状和强荧光强度，并且已确认亨廷顿蛋白仅当与VRK2一起过表达时才展现聚集体的增加。具体地，如图1a上面部分所示，在VRK2-过表达细胞中观察到Htt-Q103聚集体形成（绿点），且相反，如图1a下面部分所示，已确认在VRK1-过表达细胞中，Htt-Q103蛋白未聚集并遍及整个细胞存在。
基于图1a的荧光显微镜图像，在表达HttQ103-GFP的细胞中，具有聚集体的细胞的数目通过目测计数，并定量以显示在图1a的右面（n=3；载体代表用于转化VRK1和VRK2的DsRed1-C1模拟载体，包括Htt-exon1-GFP-pcDNA3.1载体）。
因此，确认Htt-Q103蛋白聚集诱导和聚集体增加是VRK2蛋白特异的，而与VRK1无关。
1.2在SK-N-BE(2)C细胞系中的亨廷顿蛋白聚集诱导实验
1）实验方法
因为在实施例1.1中已确认VRK2具有亨廷顿蛋白聚集诱导的功能，为了检验该功能是否与VRK2的酶活性有关，VRK2-KD(K61A)（其中AB000450序列中编码第61个氨基酸的AAA（赖氨酸）核苷酸序列经受使用GCA核苷酸序列以编码丙氨酸的基于PCR的SDM（定点诱变）的序列），其中作为VRK2的氨基酸序列中第61个氨基酸序列的Lys被用Ala点突变以诱导催化死亡（KD），被用作对照并与VRK2（登录号AB000450）相比。
并且，为了确认VRK2是否在其它种类的细胞系中发挥诱导蛋白聚集的功能，使用与实施例1.1同样的方法，比较了在人类胚胎肾细胞系HEK293T和人类成神经细胞瘤细胞系SK-N-BE(2)C（ATCC(美国典型培养物保藏中心)，ATCC号：CRL-2268TM）中的亨廷顿蛋白聚集诱导的方面，并将其显示于图1b。
通过以下克隆VRK2和VRK2-KD(K61A)：使用从HeLa细胞系（韩国细胞系库）获得的cDNA通过PCR（1.95℃，5分钟，2.95℃，1分钟，3.52℃，1分钟，4.72℃，3分钟30秒，5.72℃，7分钟，6.4℃，10分钟(2到4被重复进行35个循环)）扩增VRK2和VRK2-KD(K61A)各自的编码DNA序列，使用Sal1和BamH1限制酶(DCC-Bionet，韩国)在pFlag-CMV2载体(Sigma,St Louis,MO)和扩增的VRK2和VRK2-KD(K61A)基因处形成粘端，并使用T4 DNA连接酶（Roche,Mannheim,Germany）连接它们，以制备pFlag-CMV2-VRK2和pFlag-CMV2-VRK2-KD(K61A)质粒DNA。（见Kwon,S.Y.,Y.J.Choi,T.H.Kang,K.H.Lee,S.S.Cha,G.H.Kim,H.S.Lee,K.T.Kim,and K.J.Kim.,2005.Highly efflcient Proteinexpression and purification using bacterial hemoglobin fusion vector.Plasmid53:274-82）。用于PCR的引物如下所示。
<使用的引物>
VRK2正向引物：5’-ACGCGTCGACATGCCACCAAAAAGAAATG-3’(SEQ ID NO:4)
VRK2反向引物：5’-AAGGATCCTCAGAGAAAAAATAAAGC-3’(SEQ ID NO:5)
K61A正向引物：5’-GCAAGACATGTAGTAGCAGTGGAATATCAAGAA-3’(SEQ ID NO:6)
K61A反向引物：5’-TTCTTGATATTCCACTGCTACTACATGTCTTGC-3’(SEQ ID NO:7)
使用Htt-exon1-GFP-pcDNA3.1载体（获自Judith Frydman，斯坦福大学，CA）和Metafectine（Biontex）将制备的pFlag-CMV2-VRK2和pFlag-CMV2-VRK2-KD(K61A)质粒DNA转化入HEK293T细胞系(韩国细胞系库)和SK-N-BE(2)细胞系（ATCC（美国典型培养物保藏中心），ATCC号：CRL-2268TM）。并且，每60mm培养皿，将6μg DNA和18μl Metafectine（脂类）分别与300μl无血清培养液(DMEM(Hyclone))混合并允许静置5分钟，将两种溶液混合并允许在室温静置30分钟，且然后，直接逐滴滴至细胞。转化后24小时，使用荧光显微镜（Carl Zeiss，德国）观察每个细胞内的蛋白聚集并将结果显示于图1b。
并且，通过过滤器陷阱分析（Filter trap assay）（Nature Cell Biology,2006,第8卷:1155-62）检查了聚集的蛋白的量并将其显示于图1c。具体地，每种以上蛋白过表达的细胞(HEK293T)在0.5%(v/v)Triton X-100PBS中裂解，再次溶解于1%(w/v)SDS-PBS，并在95℃煮沸5分钟。且然后，使用斑点转印仪（dot blotter）(Bio-Rad,Hercules,CA)将细胞裂解产物转移至具有0.2μm孔的硝酸纤维膜，膜使用5%（w/v）的脱脂牛奶溶液包被，且然后，使用GFP蛋白抗体(抗绿色荧光蛋白(GFP)(B-2,sc-9996)(Santa Cruz,CA))和二抗（抗小鼠HRP轭合抗体（KPL））进行了颜色形成以检查剩余的聚集的蛋白。
2）实验结果
如1b所示，确认在神经元SK-N-BE(2)C细胞系以及HEK293T细胞系中，当亨廷顿蛋白与VRK2过表达时，亨廷顿蛋白聚集（图1b中的绿点）被诱导。并且，当没有VRK2蛋白的酶活性的VRK2-KD过表达时，如图1a所示的由于VRK2蛋白引起的Htt-exon1-GFP聚集体的增加是不显著的，因此确认VRK2诱导亨廷顿蛋白聚集的功能依赖于VRK2激酶活性。
这在以下详细解释。
在显示HEK293T细胞的实验结果的图1b的上面3个图像中，来自左边的第一个图像显示了通过Htt-exon1-GFP与pFlag-CMV2模拟载体一起表达所获得的结果，其被用作对照。表示为绿点的聚集体意味着Htt-exon1-GFP蛋白的自发诱导的聚集。第二个图像显示了通过Htt-exon1-GFP蛋白与催化活性的VRK2蛋白一起表达所获得的结果，并与对照相比，确认表示为绿点的聚集体的数目显著增加。这表明Htt-exon1-GFP的聚集由VRK2诱导。第三个图像显示在Htt-exon1-GFP蛋白与没有酶活性的VRK2蛋白一起表达的细胞中获得的结果，并确认与对照相比，表示为绿点的聚集体的数目没有显著差别。因此，VRK2酶活性对于Htt-exon1-GFP聚集的诱导是重要的。
图1b底部的3个图像在SK-N-BE(2)C细胞中获得，并显示了与在HEK293T细胞中获得的同样的外观。因此，确认通过VRK2的Htt-exon1-GFP聚集的增加等同地发生于神经元。特别是，考虑到神经退行性疾病的大部分症状发生于神经元，实验结果表明疾病的症状可被VRK2等同地诱导。
并且，如图1c所示，通过使用过滤器陷阱分析(Nature Cell Biology,2006,第8卷:1155-62)检查聚集的蛋白的结果也确认了聚集的蛋白的量依赖于VRK2的激酶活性。具体地，在细胞过表达VRK2的情况下，由于蛋白聚集，观察到未能够穿过膜并保留的蛋白。
实施例2.测定VRK2和伴侣蛋白之间的相互作用
1）实验方法
为检查VRK2与伴侣蛋白（TRiC/CCT）之间的相互作用，通过GST下拉试验和免疫沉淀试验确认了VRK2与伴侣蛋白的每个亚基（CCT1-8）结合的程度，并显示于图2a和图2b(见Kang,T.H.和K.T.Kim.,2006.Negative regulation of ERK activity by VRK3-mediated activation of VHRphosphatase.Nat Cell Biol8:863-9；
Figure BDA0000466587210000111
Kwon,S.Y.,Y.J.Choi,T.H.Kang,K.H.Lee,S.S.Cha,G.H.Kim,H.S.Lee,K.T.Kim和K.J.Kim.,2005.Highlyefficient Protein expression and purification using bacterial hemoglobin fusionvector.Plasmid53:274-82，参考文献在此处通过引用被并入)。
本实验中使用的材料分别是GST抗体(SantaCruz)、谷胱甘肽琼脂糖4B(GE healthcare)、Flag抗体(Sigma)、HA抗体(Roche)、实施例1.2中制备的pFlag-CMV2-VRK2、pGEX-4T3-VRK2、pProEx-HTa-CCTn(CCTn代表CCT1～CCT8;CCT1(NM_013686)、CCT2(NM_007636)、CCT3(NM_009836)、CCT4(NM_009837)、CCT5(NM_007636)、CCT6(NM_009838)、CCT7(NM_007638)、CCT8(NM_009840))和pcDNA3.1-HA-CCT4，并且通过VRK2(AB000450)和CCTn基于大肠杆菌的克隆在pGEX-4T-3载体和pProEx-Hta载体(Amersham,Piscataway,NJ)中分别制备了pGEX-4T3-VRK2和pProEx-HTa-CCTn。
并且，通过CCT4基于大肠杆菌的克隆在通过以下合成的载体中制备pcDNA3.1-HA-CCT4：使用Kpn1和EcoR1限制性酶（DCC-Bionet）切割pcDNA3.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)载体，合成HA表位（5’-ATGGCCTCCTACCCTTATGATGTGCCAGATTATGCCTCTCCC-3’:SEQ ID NO:8)并用同样的限制性酶切割，且然后用T4 DNA连接酶（Roche）连接。限制性酶反应在37℃进行16小时，且连接反应在16℃进行16小时。
为了通过免疫细胞化学实验确认在细胞中的位置，使用荧光显微镜(Carl Zeiss,德国)进行了观察，并将结果显示于图2c中。
具体地，当HEK293T细胞（韩国细胞系库）在盖玻片中生长大约50%-60%时，通过与实施例1同样的方法转化pFlag-CMV2-VRK2和pcDNA3.1-HA-CCT4，且于24小时后，将细胞在4%(w/v)多聚甲醛中固定15分钟，并用PBS洗涤三次。且然后，Flag(sigma)和HA(Roche)抗体被稀释到1:1000并在4℃温育过夜，且然后，用PBS洗涤三次。Alexa488(绿色，invitrogen)、Alexa594(红色，invitrogen)被稀释到1:1000，在室温温育1小时，用PBS洗涤三次，且然后，用Hoechst(5μg/ml)(Sigma)在室温下染色10分钟，用PBS洗涤三次，封固到载玻片上以使用荧光显微镜(Carlzeiss)获得图像。
2）实验结果
如图2a和图2b所示，确认VRK2和伴侣蛋白，特别是CCT4在确认两种分子之间的结合程度的实验诸如GST下拉试验和免疫沉淀（IP）试验中强烈结合。
图2a显示了8个图像，确认伴侣蛋白被VRK2下拉，其中在每个图像中，从左边第一个代表5%的输入，即，使用的伴侣蛋白，第二个代表被VRK2下拉的伴侣蛋白的量，且第三个是对VRK2蛋白的对照（试验组）并代表被GST蛋白下拉的伴侣蛋白的量。因为它用6x组氨酸加标签，使用His抗体（Santa Cruz）确认伴侣蛋白下拉的量，并确认在伴侣蛋白的8个亚基中，尤其是CCT4最强结合并被下拉。
图2b的顶部图像显示在裂解产物中被VRK2下拉的CCT4蛋白的量。从左边的第一条泳道代表5%的输入，即，在免疫沉淀中使用的裂解产物。第二条泳道代表在仅HA-加标签的CCT4过表达的细胞中被Flag抗体下拉的CCT4蛋白的量。第三条泳道代表在Flag-加标签的VRK2和HA-加标签的CCT4过表达的细胞中使用Flag抗体下拉VRK2时下拉的CCT4蛋白的量。使用HA抗体确认了CCT4蛋白的量。如图2b顶部所示，伴侣蛋白CCT4被VRK2下拉，并因此，可见VRK2和CCT4在细胞中相互作用。并且，从底部图像中，确认在免疫沉淀中使用的VRK2蛋白的量和抗体(轻链)的量是等同的。
并且，通过免疫细胞化学确认在细胞中的位置的实验也显示两种蛋白占据同样的位置并且有机会互相结合（图2c）。在图2c中，从左起，红色代表VRK2蛋白的位置，绿色代表CCT4蛋白的位置，蓝色代表细胞核，并显示VRK2主要分布在细胞核周围的细胞器中（ER和线粒体），且CCT4遍及细胞质。如此，显示VRK2和CCT4占据同样的空间并且它们可以相互作用。因此，确认实施例1中表明的VRK2的亨廷顿蛋白聚集诱导功能与VRK2和伴侣蛋白（尤其是CCT4）之间的相互作用相关。
实施例3.VRK2对伴侣蛋白的量和稳定性的作用的测定
1）实验方法
为测定依赖于VRK2的激酶活性的亨廷顿蛋白聚集诱导功能对于伴侣蛋白的量和稳定性的作用，进行了下列实验。
a.GST-VRK2、GST-VRK2-KD蛋白的制备
首先，为了控制VRK2的酶活性，进行了SDM（定点诱变）以构建其中第61个赖氨酸残基被丙氨酸取代的克隆。它被指定为VRK2-KD，并且将VRK2和VRK2-KD克隆入pGEX-4T-3载体(Amersham,Piscataway,NJ)以获得GST-VRK2、GST-VRK2-KD蛋白(Kang,T.H.和K.T.Kim.,2006.Negative regulation of ERK activity by VRK3-mediated activation of VHRphosphatase.Nat Cell Biol8:863-9)。通过体外激酶试验确认了GST-VRK2-KD蛋白无酶活性。具体地，1μg蛋白、缓冲液(20mM Tris-HClpH7.5、5mM MgCl2、0.5mM二硫苏糖醇、150mM KCl)和32P-γ-ATP被混合并在30℃培养30分钟，且然后，进行SDS-PAGE，并使用X射线胶片获得了影像结果并将其显示于图3a。
b.根据VRK2的酶活性观察CCT4的量的变化
通过与实施例1.2同样的方法将具有酶活性的VRK2基因和无酶活性的VRK2-KD基因克隆入pFlag-CMV2载体，并使用metafectene将其转化入HEK293T细胞。在24小时后，使用胰蛋白酶(welgene)从培养皿收获细胞，并且将细胞以1500rpm离心1分钟30秒以收集细胞。使用RIPA缓冲液(50mM Tris/HCl pH8、150mM NaCl、1%(v/v)NP-40、0.5%(w/v)脱氧胆酸钠、0.1%(w/v)SDS)将收集的细胞在4℃裂解30分钟。且然后，将其以15000rpm离心30分钟以获得上清液，用Bradford法定量上清液，并进行SDS PAGE。并且，为了观察伴侣蛋白对VRK2的聚泛素化（polyubiquitination），将1μg CCT4抗体(abcam)与裂解产物混合，并进行免疫沉淀。且然后，将它们转移至硝酸纤维素膜(Pall Corporation)，将膜用5%（w/v）脱脂牛奶包被，并将Flag(Sigma)、CCT4(abcam)、泛素(SantaCruz)、GAPDH(Santa Cruz)抗体在4℃温育过夜。且然后，用洗涤缓冲液(具有0.05%(v/v)吐温20的TBS)洗涤三次共10分钟。并且，将结合HRP（辣根过氧化物酶）的二抗（抗小鼠HRP-轭合的抗体（KPL））在室温温育1小时，并用洗涤缓冲液洗涤3次共10分钟。且然后，通过使用ECL（增强化学发光）溶液的颜色反应将它在x-射线胶片上显色，且量被确认并显示于图3b。通过flag抗体（sigma）确认了VRK2蛋白的量，并且GAPDH蛋白被用作加样对照。
c.根据VRK2的酶活性观察CCT4稳定性的变化
通过Bradford法进行定量，并通过与步骤b同样的方法执行SDSPAGE，除了用各自50μg/ml的翻译抑制剂环己酰胺((CHX),Calbiochem)处理VRK2-和VRK2-KD-过表达的HEK2935细胞，且然后，在0、4、8小时，用胰蛋白酶（welgene）从培养皿收获细胞，并以1500rpm离心1分钟30秒以收集细胞。并且，排除免疫沉淀，且以与步骤b同样的方式进行后续过程，在X射线胶片上进行显色，并将结果显示于图3c。如此，因为新合成的蛋白通过使用翻译抑制剂CHX被抑制，可确认已经存在蛋白的稳定性。
d.分级分离（Fractionation）和蛋白印迹实验
使用配备Superdex200凝胶-过滤柱(GE healthcare)的FPLC设备(Bio-Rad)分级分离VRKS-过表达的HEK293T细胞抽提物。且然后，对每一级分进行蛋白印迹（见BMC Cell biol,2002,3;30)(使用的材料：CCT4抗体(abcam)、HSP70抗体(santa cruz))。
2）实验结果
如图3a到图3d所示，确认如实施例1所确认的由于VRK2酶活性诱导亨廷顿蛋白聚集的功能影响伴侣蛋白的稳定性。
首先，参考图3a，顶部图像显示VRK2的自磷酸化，这意味着激酶的酶活性。相反，确认在VRK2-KD中自磷酸化消失。供参考，底部图像显示通过用考马斯亮蓝G250（Bio-Rad)对使用的蛋白的定量被很好地实现。
在图3b中，顶部的3个图像代表细胞中每种蛋白的量，且底部图像显示在CCT4上加标签的泛素蛋白的分布。如底部图像所示，如果VRK2酶活性存在，作为蛋白降解信号的聚泛素化标记在伴侣蛋白中增加，并且当VRK2酶活性消失时该现象降低很多。相似地，在顶部图像中确认当具有VRK2酶活性的蛋白过表达时，细胞中伴侣蛋白（CCT4）的量降低，并因此，可见VRK2酶活性对于伴侣蛋白量的降低是重要的。
同时，参考显示翻译抑制剂CHX处理的结果的图3c，顶部图像代表伴侣蛋白在VRK2-VRK2-KD-过表达的细胞中的寿命，且底部图像代表作为加样对照的GAPDH蛋白的量。确认伴侣蛋白的寿命依赖于VRK2蛋白的酶活性而降低，这与图3b显示的结果一致。
具体地，如果具有VRK2酶活性的蛋白的量增加，标记有蛋白降解信号聚泛素化的伴侣蛋白（CCT4）的量则增加，并因此，伴侣蛋白（CCT4）的量和稳定性都降低（图3b和图3c）。
参考图3d，显示蛋白大小从左到右降低。因为伴侣蛋白包括2个结合的复合体，每个由8个作用的亚基构成，复合体大小非常大。然而，当VRK2蛋白过表达时，确认在复合体出现的级分中伴侣蛋白的量降低。这意味着复合体的形成由于VRK2引起的CCT4蛋白量的降低被抑制。也就是说，表明因为伴侣蛋白的亚基之一CCT4的量被VRK2降低，伴侣蛋白无法形成复合体并且单体的量相对增加，并因此，伴侣蛋白的功能降低（图3d）。
实施例4.与VRK2对伴侣蛋白的稳定性的作用相关的生物因子的鉴定
1）实验方法
为了鉴定与如实施例3所证实的由于VRK2引起的伴侣蛋白稳定性的降低相关的生物因子，进行了下列实验。本实验和接下来的实施例5中所使用的每种蛋白的siRNA的序列如下。
-VRK2的siRNA(siVRK2)(SEQ ID NO:1):GCAAGGUUCUGGAUGAUAUUU(D-004684-06,Dharmacon)
-COP1的siRNA(siCOP1)(SEQ ID NO:2):GAAAUGACCUGCAAUUCGA(D-007049-01,Dharmacon)
-RBX1的siRNA(siRBX1)(SEQ ID NO:3):GACUUUCCCUGCUGUUACCUAA(Dharmacon)
a.确认COP1对于VRK2控制伴侣蛋白的量的作用
为了确认泛素连接酶COP1的作用是否影响VRK2控制伴侣蛋白的量，使用微穿孔仪（invitrogen）将在实施例1.2中使用的pFlag-CMV-VRK2和COP1的siRNA转化入HEK293T细胞系（韩国细胞系库）。具体地，将2μg pFlag-CMV-VRK2和2μl siRNA(siCOP1,D-007049-01)(20μM)与1.0x106细胞相混合，并进行电穿孔。
通过电穿孔进行转染后24小时，使用胰蛋白酶（welgene）从培养皿收获细胞，并在1500rpm离心1分30秒。以如实施例3.1）b同样的方式进行通过Bradford法定量、进行SDS PAGE和通过使用ECL（增强化学发光）溶液的颜色反应在x射线胶片上显色以确认量的后续过程，并将结果显示于图4a。且然后，使用GST-加标签的RBX1(登录号AF140598)和SUMO-加标签的VRK2，执行GST-下拉试验，并将结果显示于图4b(见Kang,T.H.和K.T.Kim.,2006.Negative regulation of ERK activity byVRK3-mediated activation of VHR phosphatase.Nat Cell Biol8:863-9)。
b.确认COP1对于VRK2降低伴侣蛋白的稳定性的作用
使用微穿孔仪（invitrogen）将COP1和VRK2的siRNA转染入HeLa细胞系（韩国细胞系库）。
具体地，将2μl siRNA(20μM)与1.0x106细胞混合，并进行了电穿孔。在通过电穿孔转染后24小时，用50μg/ml翻译抑制剂CHX处理它们，并在0、4、8、12小时后，使用胰蛋白酶（welgene）从培养皿收获细胞，并在1500rpm离心1分30秒以收集细胞。
以如实施例3.1）b同样的方式进行通过Bradford法定量、进行SDSPAGE和通过使用ECL（增强化学发光）溶液的颜色反应在x射线胶片上显色以确认量的后续过程，并将结果显示于图4c。
2）实验结果
如图4a到图4c所显示，确认泛素连接酶COP1（登录号BC094728）参与伴侣蛋白降解机制。
图4a的每个图像显示当控制VRK2和COP1的量时细胞中蛋白的量。如图3b中所确认的，当VRK2的量增加时伴侣蛋白的量降低，并且即使VRK2的量增加，当泛素连接酶COP1的量降低时，伴侣蛋白的量不降低。因此，可见COP1泛素连接酶作用于VRK2作用的伴侣蛋白降解机制。也就是说，确认如果COP1的表达量降低，VRK2对于CCT4的量的降低的作用被抑制（图4a）。参考图4b，确认COP1泛素连接酶的组成型成分之一的RBX1，在GST-下拉试验中和VRK2被一起下拉，并因此，确认VRK2与COP1泛素连接酶的组成型成分之一的RBX1（登录号AF140598）相互作用。
参考图4c，当被认为在伴侣蛋白降解机制中起重要作用的VRK2和COP1二者的表达量降低时，伴侣蛋白的稳定性与对照相比升高。因此，可见VRK2激酶和COP1泛素连接酶作用于伴侣蛋白降解过程。
如所解释的，确认与如实施例3所确认的通过VRK2降低伴侣蛋白稳定性有关的生物因子是COP1，特别是作为COP1复合体的组成型成分的RBX1，并因此，确认如果COP1的表达被COP1的siRNA抑制，VRK2对于伴侣蛋白的量和/或稳定性的降低的作用可被抑制。
实施例5.VRK2的表达量的降低对于伴侣蛋白的作用的测定
1）实验方法
VRK2的表达量的降低对于伴侣蛋白的作用，即，亨廷顿蛋白聚集体的量的变化被测定并显示于图5a到图5c。
为实现这个目的，通过与实施例1同样的方法在HeLa细胞系（韩国细胞系库）诱导亨廷顿蛋白的过表达。且然后，为了去除细胞中的VRK2蛋白，从Dharmacon(USA)获得了靶向VRK2的mRNA的siRNA（sdiVRK2)和对照siRNA(siCont)，并用于有效性验证和细胞中VRK2表达量的降低。
具体地，在24孔板上，将2.5μl Dharma FECT1(siRNA转染试剂)和2.5μl5μM siVRK2分别与47.5μl无血清培养溶液(DMEM/高葡萄糖(Hyclone))相混合，并在5分钟后，将两种溶液混合，允许在室温静置20分钟，并直接逐滴滴至细胞以转染siVRK2(D-004684-06,Dharmacon)。在1、2、3天后，将细胞滴在胰蛋白酶(welgene)上并在1500rpm离心1分30秒以获得细胞。且然后，使用TRI试剂（Molecular Research Center)提取总RNA，并使用逆转录酶（Promega）获得cDNA（见Nucleic Acid Res，2010,38(20):7068-78)。
将获得的cDNA和VRK2(登录号AB000450)和GAPDH(登录号NM_002046)引物(10pM)1μl混合并进行PCR。
<使用的引物>
-VRK2RT引物
正向引物：5’-TTTAGCATATGATGAAAAGCCAAACTATCA-3’(SEQID NO:9)
反向引物：5’-TGAGACTCTTGATATTTCTGTCTTCTCCTT-3’(SEQ IDNO:10)
-GAPDH RT引物
正向引物：5’-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGACCAC-3’(SEQID NO:11)，
反向引物：5’-CCACCACTGACACGTTGGCAGTGGGGACAC-3’(SEQID NO:12)
-PCR条件：1.95℃10分钟，2.95℃15秒，3.60℃1分钟，2到3步进行40个循环。
PCR产物在1.5%(w/v)琼脂糖凝胶中电泳，且然后通过UV透照器（UVP）观察，并将结果显示于图5a。
接下来，当HeLa细胞系在盖玻片上生长大约5%-60%时，使用以上解释的转染方法将siRNA(siVRK2,siCont)和实施例1中的Htt-exon1-GFP(HttQ103-GFP)转染入HeLa细胞系。在1、2、3天后，细胞在4%(w/v)多聚甲醛中固定15分钟，并用PBS洗涤三次。且然后，将细胞用Hoechst(5μg/ml)(Sigma)在室温下染色10分钟，用PBS洗涤三次，封固到载玻片上，并使用荧光显微镜(Carl zeiss)获得图像（图5b），并将获得的结果定量并显示于图5c。
2）实验结果
如图5所示，确认当实施例2中阐明为伴侣蛋白调节物的VRK2的表达量通过使用siRNA被降低时，伴侣蛋白的功能提高，并因此，亨廷顿蛋白聚集体的量被降低。
如图5a所示，靶向VRK2的mRNA的siVRK2(Dharmacon,美国)被用来去除细胞中的VRK2蛋白，并且作为结果，未检出VRK2的表达。
并且，如图5b所示，作为使用荧光显微镜观察实验组(其中VRK2蛋白形成使用siVRK2被抑制的细胞)和对照（其中VRK2蛋白形成未被抑制的细胞）的亨廷顿蛋白聚集的结果，在VRK2蛋白形成被抑制的细胞中，亨廷顿蛋白未聚集并遍及整个细胞，并因此，确认亨廷顿蛋白聚集降低很多。
更具体地，参考将具有聚集体的细胞的数目显示为图表的图5c，在第1天，具有聚集体的细胞与总细胞的百分比（%）对于对照是大约4%，且对于试验组是仅大约1%，并因此，具有聚集体的细胞比率在对照中高大约4倍，并因此，可见当VRK2蛋白降低时亨廷顿蛋白聚集显著降低。并且，在第3天，试验组显示具有聚集体的细胞比率低于大约4%，这是对照组在第1天检测的比率，而对照则显示大约17%的比率，这大了大约4倍，并因此，确认效果上的差异随着时间变得更大。
如所解释的，可见VRK2和/或COP1(特别是RBX1)充当参与诱导神经退行性疾病的蛋白聚集的伴侣蛋白的有效负调节物。因此，本发明对于治疗或预防神经退行性疾病可以是非常有用的。
Figure IDA0000466587310000011
Figure IDA0000466587310000021
Figure IDA0000466587310000031
Figure IDA0000466587310000041

Claims (16)

1.一种筛选伴侣蛋白调节物的方法，所述方法包含
1）制备候选物质和VRK2；
2）测定VRK2的表达量或激酶活性；以及
3）用所述候选物质处理所述VRK2并测定VRK2的表达量或激酶活性的变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述伴侣蛋白调节物增加伴侣蛋白的量或稳定性，以及
所述方法在步骤3）后还包含，
4-1）如果与未处理的对照相比，VRK2的表达量或激酶活性降低，则鉴定所述候选物质为增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述伴侣蛋白调节物降低伴侣蛋白的量或稳定性，以及
所述方法在步骤3）后还包含，
4-2）如果与未处理的对照相比，VRK2的表达量或激酶活性增加，则鉴定所述候选物质为降低伴侣蛋白的量或稳定性的物质。
4.一种用于预防或治疗神经退行性疾病的组合物，所述组合物包含由权利要求2所述的方法筛选的增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的预防或治疗神经退行性疾病的组合物，其中增加伴侣蛋白的量或稳定性的所述物质是由单链siVRK2(SEQ ID NO:1)和其互补链组成的双链siVRK2。
6.根据权利要求4所述的预防或治疗神经退行性疾病的组合物，其中所述组合物包含基于所述组合物的总重量，0.0001wt%到99.9wt%的增加伴侣蛋白的量或稳定性的所述物质。
7.根据权利要求4所述的预防或治疗神经退行性疾病的组合物，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、或亨廷顿病。
8.一种筛选伴侣蛋白调节物的方法，所述方法包含
1）制备候选物质和COP1；
2）测定COP1的表达量或酶活性；以及
3）用所述候选物质处理所述COP1并测定COP1的表达量或酶活性的变化。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述伴侣蛋白调节物增加伴侣蛋白调节物的量或稳定性，以及
所述方法在步骤3）后还包含，
4-1）如果与未处理的对照相比，COP1的表达量或酶活性降低，则鉴定所述候选物质为增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述伴侣蛋白调节物降低伴侣蛋白调节物的量或稳定性，以及
所述方法在步骤3）后还包含，
4-2）如果与未处理的对照相比，COP1的表达量或酶活性增加，则鉴定所述候选物质为降低伴侣蛋白的量或稳定性的物质。
11.一种用于预防或治疗神经退行性疾病的组合物，所述组合物包含由权利要求9所述的方法筛选的增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质作为活性成分。
12.根据权利要求11所述的预防或治疗神经退行性疾病的组合物，其中增加伴侣蛋白的量或稳定性的所述物质是选自由以下组成的组中的一种或多种：由单链siCOP1(SEQ ID NO:2)和其互补链组成的双链siCOP1，和由单链siRBX1(SEQ ID NO:3)和其互补链组成的双链siRBX1。
13.根据权利要求11所述的预防或治疗神经退行性疾病的组合物，其中所述组合物包含基于所述组合物的总重量，0.0001wt%到99.9wt%的增加伴侣蛋白的量或稳定性的所述物质。
14.根据权利要求11所述的预防或治疗神经退行性疾病的组合物，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、或亨廷顿病。
15.一种筛选伴侣蛋白调节物的方法，所述方法包含
1）制备候选物质、VRK2、和COP1；
2）测定所述VRK2和COP1之间的结合；以及
3）用所述候选物质处理所述VRK2和COP1并测定所述VRK2和COP1之间的结合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述伴侣蛋白调节物增加伴侣蛋白的量或稳定性，以及
所述方法在步骤3）后还包含，
4）如果所述VRK2和COP1之间的结合被所述候选物质的处理抑制，则鉴定所述候选物质为增加伴侣蛋白的量或稳定性的物质。
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