CN1177351A - 用于增强分子伴娘素产生的羟胺衍生物及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种增强细胞分子伴娘素表达和/或提高细胞中分子伴娘素活性的方法,所述方法包括用有效量的某一羟胺衍生物处理处于细胞分子伴娘素表达所诱导的生理应激下的细胞,以增强所述应激。另外,羟胺衍生物可以在细胞处于细胞分子伴娘素表达所诱导的生理应激之前施用给所述细胞。优选的是,施用羟胺衍生物的细胞是真核细胞。所述羟胺衍生物是相应的式(Ⅰ)或(Ⅱ)化合物。本发明还提供了落入式(Ⅰ)或(Ⅱ)范围内的新的羟胺衍生物以及含有所述化合物的药物和/或化妆品组合物。

Description

用于增强分子伴娘素 产生的羟胺衍生物及其制备
1.发明背景
分子伴娘素是一种介导蛋白质折叠的蛋白。它们以共价键形式结合到新合成的或者变性的或错误折叠的蛋白质裸露表面，并帮助它们折叠成正确的构象。分子伴娘素还参与许多分子过程例如蛋白质的合成、蛋白质的移位和DNA复制。
分子伴娘素包括热激蛋白，它是一种当其在细胞中表达明显增强后引起非正常高温(热激)或者引起各种不同生理应激的蛋白质。如通过将细胞简单地暴露于高温下进行预处理时，所述细胞对其他致死温度的耐热性所表明的，分子伴娘素表达的增强可保护细胞抵御高温治疗时的副作用。
生理应激诱导的热激蛋白的表达涉及各种不同的与许多病症有关的病理学病症。如同在热激应答情况下一样，处于此类应激中的细胞中热激蛋白的合成表明，可保护细胞免受生理应激。
与分子伴娘素诱导作用有关的一类病理学病症是局部缺血损伤，组织局部缺血损伤是由于任何可能的血液供应恶化所引起的。例如，长时间冠状动脉闭合可使心肌严重受损，导致心肌坏死并且即使恢复了血流，也不会有复原的可能。对于大脑，显著的损伤经常是由局部缺血造成的，结果导致脑组织坏死。
通过观察发现，在局部缺血过程中，心肌中热激蛋白hsp70的量增加，导致心肌坏死，尽管所述局部缺血的过程很短。在此情况下，同样的热激蛋白，在细胞中提高hsp70的量则会保护同类细胞免受可引起其他坏死的再次出现的局部缺血的影响(DAS.D.K.等人，CardiovascularRes.：578，1993)。这一点也可在对培养的大鼠细胞进行局部缺血试验中观察到(J.Clin.Invest.，93：759-767(1994))。因此，心肌细胞合成的热激蛋白可提供免受局部缺血损伤的保护。
脑组织中的情况也是相类似，其中大脑局部缺血可使脑组织中热激蛋白表达增强。试验也证明，将动物用次致死局部缺血进行预处理，可诱导热激蛋白(hsp70)产生并保护大脑免受随后更严重的局部缺血的影响(Simon等人，Neurosci.Lett.，163：135-137(1993))。
与分子伴娘素诱导作用有关的组织和器官生理应激的另一个实例还涉及炎症疾病。炎症是一种宿主细胞对整个外源性物质的非特异性应答反应，例如因各种细菌和病毒病原体引起的感染，并且它还包括损伤部位白细胞的凝集和活化，结果导致产生并释放出高浓度的活性氧成分和细胞因子。这些细胞因子和活性氧基会攻击所述病原体，但也会损伤宿主组织(Jaquier.Sarlin，Experientia，50：1031-1038/1994/)。可以确信，当免受这些炎症有毒介质而施行保护时，宿主组织会增强分子伴娘素的产生。这样，分子伴娘素的产生会保护宿主细胞免受因活化氧成分引起的损害并且保护细胞免受TNF和其他细胞因子和活性氧基的毒性。在动物试验中已证明，将动物与热激蛋白预接触，结果会增强热激蛋白(hsp70)的表达，结果会显著地降低肺炎的发生。因此，分子伴娘素具有抗炎功能。
上述实例表明，分子伴娘素能保护细胞免受各种生理应激所扰乱的细胞体内稳态平衡以及所引起的对细胞的损伤。分子伴娘素在肿瘤治疗中也已表现出优越性。例如，已有报导，当肿瘤细胞用基因刺穿编码分子伴娘素(65kd hsp)时，可使它们产生肿瘤的能力丧失或降低(PCT申请PCT/GB93/02339)。另外，还有报导，在热激应答中，肿瘤细胞会以提高的量表达分子伴娘素。但是，它们并不存在于细胞质中，而存在于细胞膜表明(Ferrarini.M.等人，Int.J.Cancer，51：613-619/1992/)。细胞表面所存在的分子伴娘素的增多与NK(天然杀伤)细胞对肿瘤细胞的敏感性的增强相关，使得NK细胞能更好寻靶、浸入并杀死肿瘤细胞(Kurosawa.S.等人，Eur.J.Immunol.23：1029/1993/)。
考虑到增强细胞中分子伴娘素的表达所具有的诸多优点，更希望找到一种方法，其可增强这种表达或提高分子伴娘素的活性。
2.发明概述
本发明涉及增强细胞分子伴娘素表达或提高细胞分子伴娘素活性的方法。具体地讲，本发明一个非限定性实施方案是，提供一种方法，所述方法包括在生理应激期间、之前或之后，用有效量的化学化合物处理处于生理应激的细胞，以超出所述生理应激诱导的量增强所述细胞中分子伴娘素的表达，其中所述化学化合物是如式(I)和(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物或其盐，包括其光学活性立体异构体，其中A是烷基、被取代的烷基、芳烷基、在芳基和/或烷基部分被取代的芳烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基，Z是共价键、氧或＝NR3，其中R3选自氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，R是烷基或被取代的烷基，式(I)互变异构体中，X是卤素或被取代的羟基或氨基、一取代的氨基或二取代的氨基，和式(II)互变异构体中，X是氧、亚氨基或被取代的亚氨基，和R′是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、含有被取代的芳基和/或烷基的芳烷基、酰基或被取代的酰基，并且式(I)化合物可任选地含有X与活性取代基偶合形成的分子内环结构。
本发明另一个实施方案是涉及提高处于生理应激中的细胞中分子伴娘素活性的方法，所述方法包括施用有效量的如上定义的式(I)或(II)羟胺衍生物。这样，分子伴娘素活性的提高超出了仅由所述生理应激所诱导的量。在每一种所述方法中，优选的是，施用所述羟胺衍生物的细胞是真核细胞。
根据本发明，用上述定义的所述羟胺衍生物处理真核细胞。
本发明另一个目的是涉及治疗或者可能预防与分子伴娘素系统功能相关的或者与细胞或细胞-细胞器膜损伤有关的疾病的方法，其中为了抑制病理学病症，向宿主生物体施用有效量的式(I)或(II)羟胺衍生物。
本发明还有一个目的是涉及所述式(I)或(II)羟胺衍生物或其盐在制备用于治疗心血管、血管、大脑、肿瘤疾病，皮肤和/或粘膜或者肾小管上皮疾病的药物组合物以及在制备化妆品组合物中的应用。
本发明还涉及具有广泛的生物作用并可用于提高生物体中分子伴娘素水平或者所述分子伴娘素活性以及用于制备可适用于此目的的药物和化妆品组合物的新的羟胺衍生物。
本发明另一个目的是涉及药物和化妆品组合物，所述组合物含有新的羟胺衍生物和此类组合物通常可接受的载体和赋形剂。
本发明的基础在于，至少部分在于，意想不到地发现了具有如上定义结构的羟胺衍生物在用于处理细胞时，能够提高细胞所产生的分子伴娘素的量或者增强其活性。此作用在分子处于可诱导分子伴娘素表达的生理应激条件下特别显著，此时，化学化合物提高细胞分子伴娘素的表达超出了仅由生理应激所诱导的量。考虑到分子伴娘素在细胞中保护自身免受各种疾病的病理学影响所起的作用，这一发现更显重要。这样，当某一化合物能够提高细胞表达分子伴娘素的量或者增强其活性，则此化合物可令所述细胞得到保护以免受疾病的不利影响并可修复它们所造成的损伤。
3.附图简要说明
图1表明经N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理，处于热激的H9c2大鼠心肌细胞中hps水平的变化。图中，此化合物用B表示并在下文中指作化合物B。
图2表明基于密度计评价经蛋白质印迹法分析所得上述试验的试验结果。
图3表明在于转录水平检测化合物B对细胞hsp表达作用过程中所得hsp70 mRNA RNA印迹法分析结果。
图4表明在检测化合物B对hsp活性作用过程中所得对酿酒酵母细胞的hsp26 mRNA RNA印迹法分析结果。
图5表明苄醇对腺甘酸环化活性作用和质膜的作用。
图6表明试验中用荧光酶素报导基因，鼠HeLa细胞hsp基因的表达率。
图7表明化合物B对K562细胞系中hsp72细胞表面表达的影响。
图8表明化合物B与不同质脂膜之间的作用，表明表面压力增大。
图9表明于10mM和100mM浓度下，化合物B对由二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺制备的单层大囊泡的双层(La)T六合体(H11)相转移的作用。
图10是化合物B在血清TNF水平对健康和STZ糖尿病鼠的作用图解。
图11表明化合物B对角质化细胞环己酰亚胺生长抑制作用的影响。
图12表明化合物B对环己酰亚胺对内皮细胞损伤作用的影响。
图13表明化合物B对环己酰亚胺对HeLa细胞系细胞损伤作用的细胞保护作用。
图14表明化合物B对环己酰亚胺对H9c2心肌细胞系生长抑制作用的影响。
图15表明化合物B对AB1380酵母细胞中P1转录因子活性的作用。
图16表明化合物B对JF1酵母细胞中AP1转录因子活性的作用。
图17表明化合物B对AB1380酵母细胞中P1转录因子活性的作用，
图18表明在离体的功能性局部缺血大鼠心脏模型中所得试验结果，其中所述模型用化合物B处理，在局部缺血后2小时经蛋白质印迹法测定。
图19表明在分离出的功能性局部缺血大鼠心脏模型中所得试验结果，其中所述模型用化合物B处理，在局部缺血后3小时经蛋白质印迹法测定。
图20表明STZ糖尿病鼠在热损伤后经含1％化合物B的乳膏处理，伤口愈合情况。
图21表明STZ糖尿病鼠在热损伤后经含2％化合物B的乳膏处理，伤口愈合情况。
图22表明STZ糖尿病鼠在热损伤后经含4％化合物B的乳膏处理，伤口愈合情况。
图23表明STZ糖尿病鼠在热损伤后经含1％化合物B的乳膏处理，伤口愈合情况，只经目测评价。
图24表明STZ糖尿病鼠在热损伤后经含2％化合物B的乳膏处理，伤口愈合情况，只经目测评价。
图25表明STZ糖尿病鼠在热损伤后经含4％化合物B的乳膏处理，伤口愈合情况，只经目测评价。
图26表明用数字落射光显微镜技术在上述试验中制得的对比图像(治疗组和对照组)。
图27表明在用含1、2和4％化合物B的乳膏处理后，经蛋白质印迹法测定上述试验中所得样品的hsp72的水平。
图28表明将SCID鼠用UV-B射线照射并用化合物B处理，经免疫组织化学分析(治疗组和对照组)所测定的hsp72的水平。
图29表明将SCID鼠的皮肤活组织用UV-B射线照射并用化合物B处理，经蛋白质印迹法测定的hsp72的水平。
4.本发明详述4.1本发明羟胺衍生物
式(I)和(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物可用于本发明。在上式中，A是烷基、被取代的烷基、芳烷基、芳基和/或烷基被取代的芳烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基，Z是共价键、氧或＝NR3，其中R3选自氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，R是烷基或被取代的烷基，式(I)互变异构体中，X是卤素或被取代的羟基或氨基、一取代的氨基或二取代的氨基，式(II)互变异构体中，X是氧、亚氨基或被取代的亚氨基，和R′是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、含有被取代的芳基和/或烷基的芳烷基、酰基或被取代的酰基，并且式(I)化合物可任选地含有X与活性取代基偶合形成的分子内环结构。
其中所述“烷基”是指包括短链和长链的直链或支链烷基。
优选的短链烷基中碳原子数典型地是1-8个并且可以是甲基-、乙基-、丙基-、异丙基-、丁基-、异丁基-、仲丁基-、戊基-、叔戊基-、己基-、庚基-和辛基-等，更优选的是1-6个碳原子并且可以是甲基-、乙基-、丙基-、异丙基-、丁基-、异丁基-、仲丁基-、戊基-、叔戊基-和己基-。
优选的长链烷基中碳原子数典型地是9-21个并且可以是壬基-、癸基-、十一烷基-、十二烷基-、十三烷基-、十四烷基-、十五烷基-、十六烷基-、十七烷基-、十八烷基-、十九烷基-、二十烷基-和二十一烷基-等，更优选的是9-17个碳原子并且可以是壬基-、癸基-、十一烷基-、十二烷基-、十三烷基-、十四烷基-、十五烷基-、十六烷基-和十七烷基-。
优选的环烷基是指含有3-8个碳原子的短环烷基链的环烷基并且可以是环丙基-、环丁基-、环戊基-、环己基-、环庚基-和环辛基-等，更优选的是含3-7个碳原子并且可以是环丙基-、环丁基-、环戊基-、环己基-和环庚基-。
被任选取代的芳基或烷基是指含有一或多个下述取代基的芳基或烷基，所述取代基例如氰基-、羟基-、短链烷基(例如甲基-、乙基-、丙基-、异丙基-、丁基-、异丁基-、仲丁基-、戊基-、叔戊基-、己基-、庚基-、辛基-等)、短链烷氧基(例如甲氧基-、乙氧基-、丙氧基-、异丙氧基-、丁氧基-、异丁氧基-、仲丁氧基-、叔丁氧基-、戊氧基-、叔戊氧基-、己氧基-等)、芳基(例如苯基、萘基等)、硝基-、氨基-、一-(短链烷基)-取代的氨基-(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基)-氨基等，二-(短链烷基)-取代的氨基-(例如二甲氨基-、二乙氨基-、二丙氨基-、二异丙氨基-、二丁氨基-、二戊氨基-、二己氨基-等)、一卤代-、二卤代-或三卤代-(短链)-烷基-(例如氯甲基、2，2-二氯乙基、三氟甲基等)或卤原子(例如氟-、氯-、溴-和碘原子)等。
优选的芳烷基是指被一个或多个(被任选取代的)芳基取代的如上定义的短链烷基，并且可以是苄基-、二苯甲基-、三苯甲基-、1-苯基-乙基-、2-苯乙基-、2-二苯甲基-乙基-、3-苯丙基-、1-甲基-2-苯基-乙基-、1-苯基丁基-、4-三苯甲基丁基-、1，1-二甲基-2-苯乙基-、4-苯基丁基-、5-苯基戊基-、6-苯基己基-等，更优选的是被苯基取代的1-4个碳原子的低级烷基并且可以是苄基-、1-苯乙基-、2-苯乙基-和1-甲基-2-苯乙基。优选的芳基可以是苯基-、萘基-、并环戊二烯基-、蒽基-等，更优选的是苯基-和萘基。
优选的3-8元，更优选的是5-8元含N饱和杂环基是指含有1-4个氮原子的饱和杂环基并且可以是吖丙啶基-、氮杂环丁烷基-、噁嗪烷基-(oxaziranyl-)、吡咯烷基-、咪唑烷基-、吡唑烷基-、全氢-三唑基-、全氢-异噁唑基-、哌啶基-、哌嗪基-、全氢-嘧啶基-、全氢-哒嗪基-、吗啉基-、全氢-1H-吖庚因基-等。
优选的杂芳基是指不饱和的、3-8元，更优选的是5-6元含1-4个氮原子的不饱和杂-单环基并且可以是吡咯基-、吡咯啉基-、咪唑基-、吡唑基-、吡啶基-及其N-氧化物、嘧啶基-、吡嗪基-、哒嗪基-、三唑基-、四唑基-、二氢三嗪基-等；或者是指不饱和的、含1-5个氮原子的稠合杂环基并且可以是吲哚基-、异吲哚基-、中氮茚基-、苯并咪唑基-、喹啉基-、异喹啉基-、吲唑基-、苯并三唑基-、四唑并吡啶基-、四唑并哒嗪基-、二氢-三唑并哒嗪基-等；或者是指3-6元，更优选的是5-6元含1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和杂-单环基并且可以是噁唑基-、异噁唑基-、噁二唑基-(例如1，2，4-噁二唑基等)等；或者是指不饱和的、含1-2个氧原子和1-3个氮原子的稠合杂环基并且可以是苯并噁唑基-、苯并噁二唑基-等；或者是指3-8元，更优选的是5-6元含1-2个硫原子和1-3个氮原子的不饱和杂-单环基并且可以是噻唑基-、1，2-噻唑基-、噻唑啉基-、噻二唑基-等；或者是指3-8元，更优选的是5-6元含一个硫原子的不饱和杂-单环基并且可以是噻吩基-；或者是指含一个氧原子的不饱和杂-单环基并且可以是呋喃基-；或者是指不饱和、含1-2个硫原子和1-3个氮原子的稠合杂环基并且可以是苯并噻唑基-、苯并噻二唑基-等。
以其本身存在或者构成酰化基团一部分的优选的“酰基”优选的是指可以是下列所述的酰基：短链链烷酰基-(例如甲酰基-、乙酰基-、丙酰基、丁酰基-等)、短链烷氧基-羰基-(例如甲氧基-羰基-、乙氧基-羰基-、丙氧基-羰基-、丁氧基-羰基-、叔丁氧基-羰基-等)、短链烷基-磺酰基-(例如甲基-磺酰基-、乙基-磺酰基-等)、芳基-磺酰基-(例如苯基-磺酰基-等)、芳甲酰基-(例如苯甲酰基、萘甲酰基等)、芳基-(短链链烷酰基)-(例如苯基-乙酰基-、苯基-丙酰基-等)、环-(短链烷基)-(短链链烷酰基)-(例如环己基-乙酰基等)、芳基-(短链烷氧基)-羰基-(例如苄氧基-羰基-等)、芳基-氨基甲酰基-(例如苯基-氨基甲酰基-、萘基氨基甲酰基-等)、环烷基-氨基甲酰基(例如环己基-氨基甲酰基等)、杂-单环基磺酰基-(例如噻吩基-磺酰基-、呋喃基-磺酰基-等)；并且所述酰基可以被1-3个上述“被任选取代的”取代基任选取代。
优选的ω-氨基-烷基是指在所述烷基链的ω-位含有被取代的氮原子并且其中所述烷基链可被一个或多个取代基，优选的是被一个或两个卤素(例如氯-、溴-、氟-、碘-)、羟基-或酰基化的羟基(其中所述酰基如上述定义)；更优选的是被一个或两个短链烷基(所述“烷基”与上述定义相同)任选取代的短链烷基。所述烷基链的ω-位上的氮原子可被一个或两个短链烷基取代基优选甲基-、乙基-叔丁基-等取代；被环烷基氨基甲酰基-(例如环己基-氨基甲酰基等)取代，更优选的是所述氮原子可以是含1-4个氮原子的饱和杂环基的一部分并且可以是吖丙啶基-、氮杂环丁烷基-、噁嗪烷基-、吡咯烷基-、咪唑烷基-、吡唑烷基-、全氢-三唑基-、全氢-异噁唑基-、哌啶基-、哌嗪基-、全氢-嘧啶基-、全氢-哒嗪基-、吗啉基-、全氢-1H-吖庚因基-等；ω-位上的所述氮原子可被芳基(例如苯基等)取代并且可被短链烷基取代基季铵化或者氧化。
如果需要，所述通式(I)和(II)游离碱可以通过与有机酸反应转变成酸加成盐并且可以是乙酸盐、马来酸盐等；或者通过与无机酸反应转变成酸加成盐并且可以是盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；或者通过与氨基酸反应转变成酸加成盐并且可以是精氨酸盐、谷氨酸盐等。
在所述式(I)羟胺衍生物的非限定性实施方案中，Z是共价键并且X是卤素，优选的是氯或溴。属于这一组中的优选化合物是，其中A(i)芳烷基或者含有被取代芳基的芳烷基，优选苯基烷基或者带有一个或多个取代基，优选烷氧基的苯基烷基；(ii)芳基或者被取代的芳基，优选苯基或被取代的苯基，优选含有一个或多个烷基、卤素、卤代烷基、烷氧基或硝基的被取代的苯基；(iii)萘基；(iv)含氮原子的杂芳基，包括可与苯环稠合的杂芳基，优选吡啶基；(v)含硫原子的杂芳基或者(vi)含氧原子的杂芳基。属于这一组的优选化合物是，其中R(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基。作为(i)-(iv)所述ω-氨基-烷基，特别优选的是含有3-8个碳原子的烷基的基团。
其中Z是共价键并且X是卤素的某些式(I)羟胺衍生物已公开于美国专利5,147,879、5,328,906和5,296,606中。这些化合物可以通过所述美国专利中所述方法制备，优选的是在适宜的氯化氢存在下，将相应的X＝NH2衍生物重氮化制备。所述原料化合物可以经公知方法例如匈牙利专利177,578(1976)中所述方法制得，即在碱存在下将式1偕胺肟(R1＝R2＝H)与例如式2活性衍生物偶合制得，并且通常无需分离或纯化，可将其重氮化。如果需要，所述化合物的末端基团A和R可以进一步被脒基化或衍化。
在所述式(I)羟胺衍生物的另一非限定性实施方案中，Z是共价键并且X是被取代的取代基OQ，其中Q是未被取代的或被取代的烷基或芳烷基。在优选的实施方案中，Q是直链或支链烷基。在这些化合物中，A是芳基或杂芳基，优选的是含氮原子的杂芳基；并且R优选的是(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基。作为(i)-(iv)所述ω-氨基-烷基，特别优选的是含有3-8个碳原子的烷基的基团。
特别的一组其中Z是共价键和X是OQ的式(I)羟胺衍生物是式(I′)化合物。式(I)含有经所述羟基闭合的环。这些化合物为式(I)表示的环状化合物，其中R是-CH2-CH(OH)-R″，R″是直链或支链烷基，或被取代的直链或支链烷基，优选的是在其氨基上被任选取代的并且优选含有C1-5直链或支链烷基链的ω-氨基-烷基。最优选的是，R″是在所述氨基上一或二取代的ω-氨基-烷基，其中所述氨基取代基分别独立地是一或二个直链或支链烷基或环烷基，或者所述两个氨基取代基与它们所连接的氮原子一起形成可含有其他任选杂原子的3-7元，优选5-7元杂环。其中，优选的化合物是其中A是苯基、被取代的苯基、含氮杂芳基、被取代的含氮杂芳基、含硫杂芳基或被取代的含硫杂芳基的化合物。
其中Z为共价键并且X是OQ的式(I)羟胺衍生物已公开于匈牙利专利申请2385/1992中。这些化合物可以用匈牙利专利申请2385/1992中所述方法由相应的上述一组卤素衍生物(其中Z是共价键并且X是卤素的式(I)羟胺衍生物)制得，例如与链烷醇盐反应，或者将碱性环闭合形成式(I′)环状化合物。
在所述式(I)羟胺衍生物的一个非限定性实施方案中，Z是共价键并且X是NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H、直链或支链烷基，被取代的直链或支链烷基、环烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元的饱和环。
上述自然段中所述化合物特别优选的是其中R是(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基的化合物。作为(i)-(iv)所述ω-氨基-烷基，特别优选的是含有3-8个碳原子的烷基的基团。这些化合物中进一步优选的化合物是A是(i)芳烷基或者含有被取代芳基的芳烷基，优选苯基烷基或者带有一个或多个取代基，优选烷氧基的苯基烷基；(ii)芳基或者被取代的芳基，优选苯基或被取代的苯基，优选含有一个或多个烷基、卤素、卤代烷基、烷氧基、硝基或酰氨基的被取代的苯基；(iii)萘基；(iv)含氮原子的杂芳基，包括可与苯环稠合的杂芳基，优选吡啶基；(v)含硫原子的杂芳基或者(vi)含氧原子的杂芳基的化合物。
其中Z是共价键并且X是NR1R2的式(I)羟胺衍生物既有已知的也有新的衍生物。其中X是NH2的化合物公开于匈牙利专利177578(1976)中并且可以在碱存在下，通过将式(I)未被取代的偕胺肟(式I，其中R1＝R2＝H)用式2活性衍生物烷基化合成。
特别是一组其中Z是共价键并且X是NR1R2的式(I)羟胺衍生物是式(I″)化合物。式(I″)化合物表示其中含有经NR1R2闭合的环的环状式(I)化合物。这些化合物可以由其中R2是H和R是CH2-C(OH)-R″，R″是直链或支链烷基或者被取代的直链或支链烷基的式(I)化合物衍生得到。
作为式(I″)化合物优选的是A是(i)芳基或者被取代的芳基，优选苯基或被取代的苯基，优选含有一个或多个烷基、卤素、卤代烷基、烷氧基或硝基的被取代的苯基；(ii)萘基；(iii)含氮原子的杂芳基，包括可与苯环稠合的杂芳基；(iv)含硫原子的杂芳基；和(v)含氧原子的杂芳基的化合物。特别优选的此类化合物是含有R″是(i)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基，或(ii)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基的化合物。(i)和(ii)中ω-氨基-烷基中烷基优选地是含有1-5个碳原子。特别优选的是，带有二取代的氨基的ω-氨基-烷基，其中所述取代基与它们所连接的氮原子一起形成3-7元饱和环，优选5-7元饱和杂环。所述杂环可含有其他一个或多个杂原子。
在ω-氨基-烷基基团中，所述氨基取代基优选的是直链或支链烷基烷基或环烷基。通式(I″)化合物中，R1是氢、未被取代的或被取代的直链或支链烷基、环烷基、未被取代的芳烷基或者所述芳基和/或烷基被取代的芳烷基。
式(I″)化合物可通过将N(4)-C(5)原子间闭环制备。所需开链的衍生物是式(I)化合物，其中Z是共价键，X是＝NR1R2，其中R1如上述式(I″)化合物中相关定义，R2是H和R是式-CH2-CHY5-R″基团，其中Y5表示离去基团，例如卤原子。此类衍生物可由相应的Y5＝OH的化合物用无机卤化剂例如亚硫酰氯或五氯化磷获得。所述卤化反应可以在或者不在惰性溶剂例如苯、氯仿四氢呋喃等中进行，通常是在沸腾下进行。除去过量的试剂后，例如蒸除亚硫酰氯后，可经或者不经分离或纯化，将卤代粗衍生物于叔丁醇中用强碱例如丁醇钾处理，最终经常规方法(萃取、重结晶等)分离和纯化，得到式I″化合物。
在式(I)羟胺衍生物的一个非限定性实施方案中，Z是氧并且X是OQ，其中Q是烷基、被取代的烷基、芳烷基或者带有被取代的芳基和被取代的烷基的芳烷基。Q中，烷基或被取代的烷基优选是含有1-4个碳原子。这些化合物中，优选的是A是烷基或被取代的烷基，优选1-4个碳原子，或芳烷基或者带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基的化合物。这些化合物中，优选的是R是(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基。
其中Z是氧和X是OQ的式(I)羟胺衍生物可于式6的O-取代的羟胺类化合物(例如参见Ger.Off.2,651,083(1976))和式7原酸酯的反应中获得。所述缩合反应通常是在作为溶剂的试剂中，优选在沸腾条件下进行。蒸发后，非正规的是，通过结晶分离出产物，(如果在侧链R上存在有胺功能基)则得到酸加成盐形式的产物。
在所述式(I)羟胺衍生物的一个非限定性实施方案中，Z是氧并且X是NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H、直链或支链烷基，被取代的直链或支链烷基、环烷基，芳基、被取代的芳基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元饱和环，优选5-7元的饱和环。这些化合物中特别优选的是其中R是(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基的化合物。(i)-(iv)所述ω-氨基-烷基中，特别优选的是含有3-8个碳原子的烷基的基团。这些化合物中，优选的化合物是A是(i)烷基或被取代的烷基；(iii)芳烷基或者含有被取代芳基和/或被取代烷基的芳烷基；或者(iv)芳基或被取代的芳基，优选苯基或被取代的苯基。
所述化合物可以按下列所述方法制备，其中所述方法取决于X的种类，即X是未被取代的氨基(NH2)或者被取代的氨基官能度。
(i)其中X是NH2的化合物可以通过将式6羟胺化合物加成到式A-O-CN有机氰酸酯上来完成(例如参见Chem.Ber.98，144(1965))。所述反应优选是在惰性有机溶剂中，通常在室温下进行。所述分离过程通常需要进行色谱分离。(ii)其中X是一取代氨基(例如NHR1)的化合物可在有机碱(例如三乙胺)或无机碱例如碳酸钠存在下，于惰性溶剂如苯、四氢呋喃等中，由已知的式9卤代亚胺酸酯(例如参见Houben-Weil，＂Methoden der OrganischenChemie，＂Band E/4，p.544(1983)和式6化合物，经常规处理和纯化步骤制得。(iii)其中X是二取代氨基的衍生物可通过式5的仲胺与式I(其中Z是氧和X是OQ)(所述衍生物可如上所述制备)反应制得。此胺化反应可在极性有机溶剂例如乙醇中，如果需要，在回流条件下进行。
式(I)羟胺衍生物另一个非限定性实施方案中，Z是＝NR3，其中R3是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基；并且X是NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H、直链或支链烷基、被取代的直链或支链烷基、芳基或被取代的芳基、环烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元饱和环，优选5-7元饱和环。
这些化合物中，进一步优选的是A是烷基、被取代的烷基、芳烷基、带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基、芳基或被取代的芳基的化合物。这一组羟胺衍生物中优选的是R是(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基的化合物。作为(i)-(iv)所述ω-氨基-烷基，优选的是含有3-8个碳原子。
其中Z是NR3并且X是NR1R2的式(I)羟胺衍生物可通过用氨或伯胺或仲胺将相应的属于上述一组化合物的异脲衍生物(相应于其中Z是氧和X是NR1R2的式(I)羟胺衍生物)氨解制得。所述反应优选是在极性溶剂如水或乙醇中用过量的胺进行。另外，在有机或无机碱存在下，将式10卤代甲酰胺(Houben-Weil＂Methoden der Organischen Chemie，＂BandE/4，p.553(1983))与式6化合物反应也可得到此组化合物。所述反应通常在环境温度下，于惰性有机溶剂中进行。
其中R是式(b)基团(其中R7是酰基)的化合物可通过将R7是氢的相应化合物酯化制得。在叔胺或无机碱存在下，优选在惰性溶剂中，用酰氯或酸酐可制得所述烷基或芳基酯。
另一组可用于本发明的羟胺衍生物是以式(I)互变异构体形式表示的式(II)化合物。在式(II)羟胺衍生物的非限定性实施方案中，Z是共价键并且X是氧。属于这一组的优选的化合物是A是(i)烷基、芳烷基或者含有被取代芳基或烷基的芳烷基；(ii)芳基或者被取代的芳基，优选苯基或带有一个或多个取代基的被取代的苯基，优选的取代基包括烷基、卤代烷基或烷氧基；(iii)含氮原子的杂芳基，优选吡啶基；或(iv)含硫原子的杂芳基的化合物。属于这一组的化合物优选的是R是(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基的化合物。(i)-(iv)所述ω-氨基-烷基中，特别优选的是含有3-8个碳原子的烷基的基团。这一组中，优选的化合物是R′是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或带有被取代的芳基或烷基的芳烷基的化合物。
属于这一组的化合物已公开于匈牙利专利申请2385/1992中。在其中所公开的制备方法中，最优选的是，它们可以通过用式11酰氯将式6的O-取代的羟胺衍生物(例如也可参见Ger.Off.2,651,083(1976))酰化获得。用式12化合物代替式6作原料，此方法也可用于制备其中R′不是氢的新的衍生物。
在式(II)羟胺衍生物另一个非限定实施方案中，Z是化学键；X是＝NR4，其中R4是H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基、环烷基；和R′是烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基。这些化合物中，优选的是其中A(i)芳烷基或者带有被取代芳基的芳烷基，优选苯基烷基或者带有一个或多个取代基，优选烷氧基的苯基烷基；(ii)芳基或者被取代的芳基，优选苯基或被取代的苯基，优选含有一个或多个烷基、卤代烷基或硝基的被取代的苯基；(iii)萘基；(iv)含氮原子的杂芳基，优选吡啶基；(v)含硫原子的杂芳基的化合物。属于这一组的优选化合物是，其中R是(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基的化合物。作为(i)-(iv)所述ω-氨基-烷基，特别优选的是含有3-8个碳原子的烷基的基团。
这些化合物既可以用式2化合物将式13的N，N′-二取代的偕胺肟O-烷基化(反应条件参见其中Z是共价键和X是NR1R2的式I化合物的制备)制得，也可以通过用式16的偕卤代亚胺将式12的N，O-二取代羟胺化合物O-酰化制得，所述反应优选在有机或无机酸清除剂存在下，于惰性溶剂中进行。
其中R是式(b)基团(其中R7是酰基)的化合物可通过将R7是氢的相应化合物酯化制得。在叔胺或无机碱存在下，优选在惰性溶剂中，用酰氯或酸酐可制得所述烷基或芳基酯。
在式(II)非限定性实施方案中，Z是氧和X是氧。属于这一组的优选的化合物是A是烷基、被取代的烷基、芳烷基或者带有被取代芳基或烷基的芳烷基的化合物。R优选是(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基。作为(i)-(iv)所述ω-氨基-烷基，特别优选的是含有3-8个碳原子的烷基的基团。这一组中，优选的化合物是R′是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或带有被取代的芳基或烷基的芳烷基的化合物。
属于这一组的化合物已公开于匈牙利专利申请1756/95(1995年6月15日申请)中。他们可以如其中Z是共价键和X是氧的式II化合物的合成所述，用简单的酰氯的相似方法，用式14氯代甲酸酯将式6或式12羟胺酰化制得。所述反应需要在无机或有机碱存在下并可在惰性溶剂例如氯仿中进行。副产物盐可例如用水萃取除去，而所述产物可由有机溶液中分离出。
在式(II)羟胺衍生物另一个非限定性实施方案中，Z是氧；X是＝NR4，其中R4是烷基、被取代的烷基、芳烷基、带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基。在这些化合物中，A优选是烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基，最优选的是未被取代的或被取代的苯基、芳烷基或带有被取代的芳基或烷基的芳烷基，并且R优选是其中在所述烷基链上含有羟基或酰氧基并且在所述胺的氮原子上可任选取代的ω-氨基烷基，其中所述ω氨基烷基的烷基链优选含有3-8个碳原子。在这些化合物中，R′优选是可未被取代的或被取代的烷基、芳基或芳烷基。
其中Z是氧和X是NR1R2的式(I)N-取代的羟胺衍生物类似物可在在有机碱(例如三乙胺)或无机碱例如碳酸钠存在下，于惰性溶剂例如苯、四氢呋喃等中，相似地由式9卤代甲亚胺酸酯和式12化合物，经常规处理和纯化步骤制得。
在式(II)羟胺衍生物的另一种非限定性实施方案中，Z是＝NR3，其中R3选自氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基和带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基；并且X是氧。属于这一组的优选的化合物是A是(i)芳烷基或者带有被取代烷基或芳基的芳烷基；(ii)芳基或者被取代的芳基，优选苯基或被取代的苯基，优选的是，被取代的苯基含有一个或多个烷基、烷氧基、卤素、卤代烷基或硝基基团；(iii)含氮原子的杂芳基；或(iv)烷基或被取代的烷基，直链或支链，优选的是含4-12个碳原子；或(v)环烷基的化合物。属于这一组的化合物优选的是R是(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基的化合物。作为(i)-(iv)所述ω-氨基-烷基，特别优选的是含有3-8个碳原子的烷基的基团。在这些化合物中，R′优选是氢、烷基、被取代的烷基、芳烷基或带有被取代的芳基或烷基的芳烷基、芳基、被取代的芳基、酰基或被取代的酰基。
这些化合物公开于待批准的匈牙利专利申请1756/95中并且可以通过在惰性溶剂中，通常简单地将混合物于室温下搅拌2-24小时，将式6或式12羟胺化合物与式15异氰酸酯反应制得。最后，于蒸除溶剂后，优选的是，经结晶，分离出所述产物。
在式(II)羟胺衍生物的一个非限定性实施方案中，Z是＝NR3，其中R3选自氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基和带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基；并且X是＝NR4，其中R4是H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基和带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基、环烷基；和R′是烷基、被取代的烷基、芳烷基或带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基，或芳基或被取代的芳基。属于这一组的优选的化合物是R3是氢、烷基或被取代的烷基，R4是氢或芳基，A是烷基、被取代的烷基、芳基或被取代的芳基或者芳基和/或烷基可被取代的芳烷基。这些化合物这，优选的是R是(i)ω-氨基-烷基，(ii)带有一或二取代的氨基的ω-氨基-烷基；(iii)带有被取代烷基的ω-氨基-烷基；(iv)带有一或二取代的氨基并且还带有被取代的烷基的ω-氨基-烷基，其中所述烷基的优选的取代基是羟基或酰氧基的化合物。作为(i)-(iv)所述ω-氨基-烷基，特别优选的是含有3-8个碳原子的烷基的基团。
属于这一组的化合物的制备可以通过用伯或仲胺或氨将相应的异脲衍生物(式(I)化合物，其中Z是氧和X是NR4)氨解来完成。所述反应优选在极性溶剂如水或乙醇中，用过量的胺进行。另外，在有机或无机碱存在下，于惰性溶剂中，通常在溶剂的沸点下，将式10卤代甲脒类化合物与式12化合物进行反应。
式(I)羟胺衍生物的一个非限定性实施方案限定了一组新的化合物，其中X是卤素，优选氯或溴；Z是化学键和A是式(a)基团，其中Y1是卤素、烷氧基、硝基或卤代烷基，优选的是，卤代烷基含有1-4个碳原子；和n是1、2或3；或者是可与苯环稠合的含氧杂芳基，优选呋喃基，含硫杂芳基(优选噻吩基)或含氮杂芳基(优选吡啶基、喹啉基或异喹啉基)并且R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选被取代的直链或支链烷基，优选C1-4烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环。Y6是-OR7，其中R7是H或酰基，优选烷基羰基、被取代的烷基羰基、芳基羰基或被取代的芳基羰基，或者氨基酰基或被取代的氨基酰基；k是1、2或3；和m是1、2或3，条件是，当A是吡啶基或萘基，或者其中Y1是卤素或烷氧基的式(a)基团时，R7不是H。这些化合物可任选地含有A是带N-季铵化C1-4烷基的含氮杂芳基或者所述含氮杂芳基的氧化物和/或R是其中末端基团R6和R7形成的环是被N-季铵化和N-氧化的饱和杂环。这些化合物中，优选的是其中A是式(a)基团(其中Y1是三氟甲基)的化合物。这一组式(I)羟胺衍生物还包括所述化合物的光学活性立体异构体，其中X是卤素，A是吡啶基，Z是化学键，和R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元杂环，Y6是-OR7，其中R7是氨基酰基，k是1、2或3和m是1、2或3。
这些新的化合物可以用美国专利5,147,879；5,328,906和5,296,6066中所述相似方法制备。例如：(i)其中R5和R6两者均不是氢的衍生物可以按照美国专利5,147,879；5,328,906和5,296,6066中所述相似方法，在适宜的卤化氢存在下，通过将相应的NH2衍生物(式(I)羟胺衍生物，其中Z是共价键和X是NH2)重氮化制得。所述原料化合物也可以根据例如匈牙利专利177578中所述公知方法，即在碱存在下，通过将式1偕胺肟(其中式1中R1和R2是氢)与例如式2活性衍生物偶合制得，并且通常在无需分离或纯化下进行重氮化。(ii)如果需要R7是H和m是1的化合物，所述合成反应可以通过将式3的环氧烷(oxyrane)与式4胺反应来完成。此方法也可用于合成R5＝H的衍生物。(iii)其中R是式(b)基团，而此基团中R7是酰基的化合物可以通过将相应的R7＝H的衍生物酯化制得。通常在叔胺或无机碱存在下，优选于惰性溶剂中，或者在某些情况下，按Schotten-Bauman法，于两相系统中用含水有机碱，用酰氯或酸酐制得烷基或芳基酯。当制备氨基酰基酯时，可按肽化学领域基本公知的方法，用羧基衍生的N-被保护的氨基酸衍生物(例如活性酯)作试剂制得，此偶合反应还需要有碱(例如三乙胺)存在。产物的分离和纯化可用常规制备方法进行；最终产物经常是适宜的无机或有机酸的盐的形式。当用手性氨基酸作原料时，则所述产物经常是在R基上具有第2个手性中心的非对映体。在分离过程中，通常分离这些非对映体，并可以立体-纯的形式获得所述产物。
新的羟胺衍生物还有下列式(I)化合物，其中Z是化学键、X是卤素，优选氯或溴，A是式(c)基团并且式(d)基团；Y2和Y3两者中的一个，必须有至少一个存在于所述分子中，是氧，或者含有1-4个碳原子的烷基或被取代的烷基；k是1、2或3；和m是1、2或3，Y2和Y3以虚线连接，表示这些取代基可选择性地存在。当所述化合物是一或二价阳离子时，阴离子则为一个或两个卤离子，优选是碘离子。
这些羟胺衍生物可通过将它们的不饱和前体化合物中末端吡啶和/或哌啶基进行化学修饰(即N-氧化或季铵化)制得。对于所述氧化反应，优选的是在惰性溶剂(例如氯仿、二氯甲烷)中使用过酸例如取代的过苯甲酸。当所述分子中存在两个可被氧化基团时，根据所用试剂的量可形成一氧化物或二氧化物。反应结束时，将过量的试剂分解并经蒸发分离出所述产物。季铵化反应可以在适宜溶剂例如丙酮中，优选在所述试剂回流条件下，用烷基卤化物(例如碘甲烷)来完成。通常所述产物不溶于所述介质，因而可经简单地过滤分离出。
属于式(I)羟胺衍生物的另一组新的化合物是下列化合物，其中Z是化学键，A是芳烷基，被取代的芳烷基，优选可带有一或多个烷氧基的苯基烷基，优选的是烷氧基含有1-4个碳原子，苯基，带有一或多个取代基的被取代的苯基，优选的取代基包括烷基，优选含1-4个碳原子的烷基或卤代烷基，卤素，酰氨基或硝基；或者可与苯环稠合的含氮杂芳基，优选吡咯基、吡啶基、异喹啉基或喹啉基，或者含硫杂芳基，优选噻吩基，其中所述杂芳基可被一个或多个烷基，优选含1-4个碳原子的烷基取代；X是-NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H，直链或支链烷基，被取代的直链或支链烷基，优选含1-6个碳原子的烷基，环烷基，或者R1和R2与它们所连接的氢原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环；R是式(e)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基或被取代的直链或支链烷基，优选含1-4个碳原子的烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，其可含有其他杂原子和取代基，所述取代基优选是含1-4个碳原子的烷基；Y4是H或含1-4个碳原子的烷基或被取代的烷基；Y5是H，或含1-4个碳原子的烷基或被取代的烷基，或者是OR7，R7是H或酰基；k是1、2或3；和m是1、2或3，条件是，当A是未被取代的或被卤素或烷氧基取代的苯基；被烷氧基取代苯基烷基，或者吡啶基，并且R7是H时，R1和R2中至少一个不是H，或者当A是未被取代的或被卤素或烷氧基取代的苯基；被烷氧基取代苯基烷基；或吡啶基，并且R1和R2分别是H时，R7不是H。
其中X是NH2衍生物的化合物可如上述相似方法通过将式1相应的中间体化合物(其中式1中R1和R2是H)与式2化合物反应制得。所述烷基化剂(式2)可含有羟基和/或氨基取代基。所述反应需要有无机或有机碱存在，优选的方法是，用醇盐的醇溶液作介质和碱。所述产物通常用适宜的有机或无机酸以盐的形式分离出。
另一组上述新的化合物的特征是这些衍生物中R1和R2中的一个或两个不是H。此类结构的化合物可用下述两种方法制备：(i)按照上段所述相似方法，可将其中已含有所需取代基R1和/或R2的式1偕胺肟与式2活性化合物反应。文献中公知[Chem.Rev.62，155-183(1962)]的式1被取代的偕胺肟可用作原料。(ii)用式5胺取代式(I)化合物(其中Z是共价键和X是卤素)中的卤原子也可获得相似的化合物。当衍生物R基上带有OH取代基(Y4＝OH)时，此羟基必须在进行所述取代反应之前被保护起来，并在所述取代反应之后脱除，而且较有利的是形成式(I′)环状衍生物。对于保护反应，现已证明酰基类保护基例如四氢吡喃基是最令人满意的。所述保护反应可通过将未被保护的化合物与二氢吡喃反应来进行，随后进行卤素/胺置换反应，通常需要在溶剂中例如于乙醇中回流下进行。最后，所述产物的脱保护反应可通过酸处理，例如在例如对甲苯磺酸存在下通过将乙醇溶液沸腾来完成。
如上所述，所述新的化合物组中还包括其中Y5是酰氧基的化合物。它们可以通过将文献中公知的(例如匈牙利专利177578)或者本文所述相应的Y5＝OH的衍生物酰化制得。所述反应可以如其中R7是酰基的类似的卤代衍生物中所述方法(方法(iii))进行。
所述新的式(1)羟胺衍生物还包括下述化合物,其中Z是氧或＝NR3,其中R3是未被取代的或被取代的烷基，X是-NR1R2，R1和R2分别独立地是氢，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基或未被取代的或者被取代的芳烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成可含有一个或多个杂原子的3-7元，优选5-7元饱和杂环。这些化合物中，A是未被取代的或被取代的烷基或未被取代的或被取代的芳烷基和R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选C1-4烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3。
其中Z是氧和X是-OR，其中Q是未被取代的或被取代的烷基或者未被取代的或被取代的芳烷基，A是未被取代的或被取代的烷氧基或者未被取代的或被取代的的芳烷基并且R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选C1-4烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3的化合物也落入式(I)化合物范围内。R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选C1-4烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3。
另一组新的式(I)羟胺衍生物是下述化合物，其中A是未被取代的或被取代的芳基，优选苯基或含氮杂芳基，优选吡啶基或含硫杂芳基，Z是化学键，X是-OQ，其中Q是C1-4烷基和R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选C1-4烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H，k是1、2或3和m是1、2或3。
这些化合物可通过将其中X是卤素的相应的式(I)羟胺衍生物与相应的醇盐，优选在与醇盐相应的醇中，优选在回流条件下反应制备。所述反应混合物可用本领域公知方法处理并且经色谱法或成盐法分离出所述产物。
新的式(II)羟胺衍生物还包括下述化合物，其中X是氧，A是C1-20直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基或卤代苯基，未被取代的或被取代的芳烷基，萘基或含氮杂芳基，优选吡啶基，Z是化学键，R′是H，C1-4烷基或芳烷基，优选苯基烷基，R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选C1-4烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H，k是1、2或3和m是1、2或3，条件是，当A不是烷基并且R′是H时，Y6是H。
其中Z是共价键、氧或＝NR3，其中R3是氢或未被取代的或被取代的烷基，X是＝NR4，其中R4是氢，未被取代的或被取代的烷基或者未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或被取代的或未被取代的芳烷基，优选苯基烷基的新的化合物也落入式(II)化合物范围内。这些化合物中，A是未被取代的或被取代的烷基或者未被取代的或被取代的芳基，优选苯基或被取代的苯基，或者未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，或者环烷基，R′是未被取代的或被取代的烷基或者未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选C1-4烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3。
新的羟胺衍生物还有式(II)化合物，其中X是氧，A是未被取代的或被取代的烷基，未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，Z是氧，R′是烷基或芳烷基，优选苯基烷基，R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选C1-4烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3。
其中X是氧和Z是＝NH的式(II)羟胺衍生物也是新的化合物。
这些化合物中的一组化合物是下述化合物，其中A是未被取代的或被取代的烷基，环烷基，未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，未被取代的苯基或被卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基或硝基取代的苯基，R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选C1-4烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OH，k是1、2或3和m是1、2或3。
这些化合物中的另一组化合物是下述化合物，其中A是式(a)基团，其中Y1是卤代烷基，优选三氟甲基和n是1、2或3，R′是H和R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H、直链或支链烷基，优选C1-4烷基，或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OH，k是1、2或3和m是1、2或3。
本发明所述新的羟胺衍生物还包括式(I″)环状化合物，其中A是未被取代的苯基或者被卤素或硝基取代的苯基，或含氮杂芳基，R1是H和R″是所述氨基被一和二取代的ω-氨基-烷基，所述烷基链含有1-5个碳原子并且氨基取代基分别独立地可以是一个或两个直链或支链烷基或环烷基，或者所述两个氨基取代基与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，或其C1-4烷基N-季铵盐衍生物，条件是，当A是3-吡啶基时，R″不是1-哌啶基甲基。4.2增强细胞中分子伴娘素表达的方法
本发明涉及一种通过用有效量的羟胺衍生物处理细胞和组织以增强细胞中分子伴娘素表达的方法。式(I)或(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物可用于此方法。式(I)和(II)的结构已在第4.1节中详细讨论过。
本发明一非限定性实施方案是提供一种可增强处于应激中的细胞分子伴娘素表达的方法。在此方法中，在出现应激后，用有效量的式(I)和(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物处理处于生理应激中的细胞，所述生理应激可诱导细胞的分子伴娘素表达。在这些细胞中，所述羟胺衍生物所增强的分子伴娘素表达超出了生理应激所诱导的量。
在本发明另一个非限定性实施方案中，在所述细胞处于生理应激之前，用羟胺衍生物处理。所述羟胺衍生物所增强的分子伴娘素的表达超出了生理应激诱导的量。
本文所用术语“分子伴娘素”是指辅助其他蛋白质折叠成正确的或活性构象的蛋白质，通常通过非共价键结合到所述蛋白质上。分子伴娘素不仅有助于新合成的蛋白质的校正和修复，而且还有助于对变性或错误折叠蛋白质的校正和修复。分子伴娘素包括热激蛋白(hsp)，其中与本发明关系特别密切的是hsp70和hsp72，以及Ig重链结合蛋白(BiP)和葡萄糖调节蛋白(grp)。hsp和grp的实例包括，但不仅限于，下列各类蛋白：hsp70、hsp60、hsp90、grp94、grp80和hsp27。
优选的是，用所示羟胺衍生物处理的真核细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。术语“真核细胞”是指体外(脱离活生物体的细胞，例如在培养条件下)和体内(在活生物体内的细胞，例如组织和器官细胞)两种真核细胞。
优选的是，可用本发明方法处理的真核细胞有活生物体、神经元、肌肉细胞，血管壁细胞，特别是内皮细胞、上皮细胞以及免疫系统细胞。优选的是，用本发明方法也可以处理植物细胞，包括活植物生物体细胞。
本文所用“生理应激”是指可影响诱导细胞“应激应答”的细胞的条件或因素，例如可以理解的是，分子伴娘素蛋白合成的诱导。生理应激包括可致细胞损伤的因素或者破坏细胞体内稳态平衡的因素，例如代谢、氧化、局部机理性应激或者由缺氧、局部缺血、热激、放射或有毒物质引起的应激。代谢应激中的一种重要形式是由糖尿病引起的应激。
另一种生理应激的重要表现形式包括可引起游离基形成或者提高细胞环境中细胞因子数量的应激。与各种病理性病症有关的细胞损伤是生理应激的具体实例。
在本发明一个非限定性实施方案中，作为对生理应激的应答，可诱导细胞表达分子伴娘素的所述生理应激可引起心血管、血管、大脑、过敏性、免疫、自身免疫性疾病，病毒和细菌感染，皮肤和粘膜疾病或者源于上皮的肾小管疾病或整容手术治疗所引起的病症。
最优选的是，此类心血管疾病包括由生理应激引起的动脉粥样硬化，因压力过高或肺压力过高引起的冠状动脉疾病或心血管疾病。
典型的大脑疾病有因生理应激引起的脑血管局部缺血疾病，休克，外伤所致的脑损伤，老年性神经变性疾病，特别是老年性痴呆、AZDS痴呆、酒精性痴呆、早老性痴呆、帕金森病或癫痫。
因皮肤或粘膜疾病引起的疾病典型地有肠胃系统皮肤病或溃疡。
在上述疾病发病过程中，所述生理应激可诱导细胞分子伴娘素表达，但是，这种作用不足以保护细胞免受所述疾病引起的细胞损伤。用与增强分子伴娘素表达或提高分子伴娘素活性有关的上述羟胺衍生物进行治疗，使得有可能消除所述疾病引起的结构性偏差并因此达到细胞再生的目的。
在本发明另一个非限定性实施方案中，所述生理应激是指热激或使分子处于非正常高温下。在本发明另一个非限定性实施方案中，所述生理应激是指因局部缺血引起的细胞损伤。特别是，心肌和脑细胞局部缺血性细胞损伤是因血管闭合或过激引起的心血管疾病所致，例如冠状动脉或大脑血栓形成或血管闭合，休克，栓塞或慢性血管痉挛。局部缺血可诱导细胞“应激应答”，导致hsp的量增加，随后保护细胞免受局部缺血的损害(Mestril，R.等人，J.Mol.Cell.Cardiol.，27：445(1995))。
用对这些细胞有效量的羟胺衍生物处理这些细胞，可以以超出局部缺血条件下诱导的量增强细胞中分子伴娘素的表达并且可以提高分子伴娘素的活性。
至此，当由动物体取出器官用于移植时，此种离体过程是一种生理应激，其可对包含于所述器官中的细胞造成损害，因而诱导分子伴娘素表达。在此情况下，可在器官离体之前或之后施用所述羟胺衍生物，则可以增大所述器官中细胞产生分子伴娘素的量或增强其活性，从而达到细胞保护作用。
除了局部缺血以外，其他许多应激也可以引起神经元损伤，，其在神经元细胞中诱导产生分子伴娘素。另外，兴奋毒性神经元损伤也可诱导神经元细胞产生分子伴娘素并且兴奋毒性神经元损伤也包括在术语“生理应激”中。
在本发明另一个实例中，生理应激还可由炎症毒性介质引起，例如氧化基和细胞因子如TNF，其由巨噬细胞产生。细胞接触这些毒性介质的量增大，表现出表达hsp的量增加，从而保护这些细胞免受所述毒性的侵害(Kantengwa，S.等人，Semin.Immun.3：49-56(1991)。各种炎症疾病包括肺炎例如成人呼吸窘迫综合症，可诱导细胞hsp表达，从而实现细胞保护作用(Jacquier-Salin，M.R.等人，Experientia 50：1031-1033(1994))。当细胞中分子伴娘素的量增大到超出TNF和活性氧成分诱导的量时，细胞对这些细胞毒性因子可以得到较好的保护并且能够修复因这些因子造成的损伤。
可影响细胞膜生理状态的因素包括细胞膜流变性，也是生理应激的一个实例。在这些细胞中，分子伴娘素表达的增强超出了因扰乱细胞膜生理状态而诱导的量，则可获得更好的保护并且还可令细胞修复细胞膜。
在论及提高处于生理应激下的细胞产生分子伴娘素，或者细胞随后处于生理应激时，本文所用术语“有效量的所述羟胺衍生物”是指以超出仅由生理应激诱导的水平提高分子伴娘素表达的量。此量可由本领域技术人员很容易地确定。优选的是，对于体外细胞，所述有效量是10-6-10-3M，更优选的是，所述有效量是10-6-5×10-4M。
当给动物施用时，所述有效量可根据许多因素例如用药途径等而变化，但确定有效量的范围属于本领域技术人员的常识范围并且无需进行试验。例如，当静脉内施用所述羟胺衍生物时，所述有效量优选是0.1-10mg/kgbw，更优选的是0.5-2.0mg/kgbw；而当口服用药时，所述有效量的优选是10-500mg/kgbw，更优选的是50-100mg/kgbw。
细胞中分子伴娘素表达的增强可以用已建立起来的实验室方法检测，例如RNA印迹法和蛋白质印迹法。
可用于本文中的蛋白质印迹技术的一个实例是：于5％CO2下，在补充有10％牛胎血清(GIBCO)的Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)中，于37℃下体外培养细胞。向所述细胞培养基中加入如式(I)和(II)所示互变异构体形式的羟胺衍生物，例如在所述生理应激之前16小时，或者生理应激后的一段时间内，向细胞中施用10-5M所述化合物。但是，所述羟胺衍生物的浓度以及施用化合物的时间可以根据试验设计的需要而变化。
热激后6小时，将细胞用磷酸盐-缓冲生理盐水溶液(PBS)洗涤两次，然后刮去于PBS中的培养皿表层。于1500rpm下，将细胞离心分离5分钟并溶于100μl 50mM Tris-HCl，pH8.0；5mM EDTA；150mM NaCl；15TritoxN-100；1PMSF；2μg/ml抑肽酶；1μg/ml抑糜朊酶素；1μg/ml胃蛋白酶抑制素的经修饰的增溶缓冲液(Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Ed.Sambrook，Fritsche，Maniatis，Bold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))中并用超声波处理3×20秒(间隔2分钟，设定8)。
然后用Bradford试验(M.M.Bradford，Anal.Biochem.，72：248-254(1976))测定三个平行样品中5μl样品的蛋白质浓度。用上述缓冲液将样品样品调至蛋白质浓度为100μg/30μl并用另一个缓冲液调节，以使所述样品中缓冲液中的各组分最终浓度达到：110mM Tris-HClpH6.8，8.3mM乙硫醇，3％SDS，3％甘油和一些溴代苯酚蓝，并于室温下振摇30分钟。然后可用如此获得的样品跑凝胶电泳。
当对体内细胞中本发明羟胺衍生物的分子伴娘素增强作用进行检测时，可向动物施行一个生理应激例如局部缺血或糖尿病引起的STZ。在局部缺血情况下，可如实施例8所述诱导心肌缺血，而糖尿病病症可如实施例10所述诱导。所述本发明羟胺衍生物可于所述动物处于生理应激之前、所述应激期间或之后，施用给所述动物。如上所述，用药时间可根据试验设计而变化。
在由所述动物所获得的相应组织制得蛋白质制剂后，于0-4℃进行处理。在80ml含有50mM Tris-HCl，pH8.0，5mM EDTA，150mMNaCl，0.1％SDS，1％Triton X-100H 1-1mM蛋白酶抑制素(PMSF，苯甲脒，氨基-己酸)的溶解缓冲液中，将组织例如肝脏组织(约15-20g)用家用混合器匀化2分钟。然后于Sorvall RC285离心机中将组织匀浆以20000×g离心30分钟。
用所述Bradford试验测定所述制剂中蛋白质浓度并调至5mg/μl。在进行凝胶电泳之前，将含有1.8mg蛋白质的样品用0.6ml含有110mMTris-HCl pH6.8，8.3mM乙硫醇，3％SDS，3％甘油和一些溴代苯酚蓝的缓冲液溶解，并于室温下振摇30分钟。
如上所述，由细胞培养基或由动物组织获得的蛋白质样品两者均可用于电泳和随后的免疫印迹法(所述两种方法均是本领域公知的并详细描述于Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Ed.Sambrook. Fritsche. Maniatis. Bold Spring Harbor Laboratory Press(1989)：Protein BlottingProtocols for the Immobilon-P Transfer Membrane. 3. Laboratory Manual. Millipore：and U.K.Laemmli.Nature：227：680-685(1970).
例如，按照Laemmli所述(U.K.Laemmli，Nature，227：680-685(1970))，在50V恒定电压下，于8-18％聚丙烯酰胺凝胶上，进行电泳过夜。蛋白质可用Coomassic Brilliant Blue R-250染色，或者于转移缓冲液(10mMCAPS，pH11，10％甲醇)中，在4℃恒定电流(300mA)下转移到ImmobilonePVDF(微孔)上，进行3小时。(Protein Blotting Protocols for theImmobilon-P Transfer Membrane，3 Laboratory Manual，Millipore)转移后，于TPBS(含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲生理盐水)中，将所述膜的非特异性部位于4℃下用2％牛血清蛋白(BSA)阻断过夜。然后将所述印迹与作为分子伴娘素直接抗体例如以1∶3000稀释的GRP94单克隆抗体(SPA-850，StressGen)、以1∶2700稀释的HSP60单克隆抗体(SPA-600，StressGen)、以1∶1250稀释的HSP72单克隆抗体(C92F34-5，StressGen)或以1∶2000稀释的HSP90单克隆抗体(AC88，StressGen)于室温下一起孵育1小时，然后将所述膜用TPBS缓中液洗涤1小时，并再分别与同抗-大鼠(Sigma，1∶4000稀释液，对grp-94)或抗-小鼠(Sigma，用人或大鼠血清蛋白吸收，1∶3000稀释液，对Hsp60、HSP72或HSP90)次生抗体结合的辣根过氧化物酶一起孵育1小时。在用TPBS充分洗涤后，将所述膜制成ECL(增强的化学发光)系统(Amersham)。
用Bio-Rad光密度计(1650型)和Hewlett-Packard Integrator(HP3394A)可定量地测得所述应激蛋白的含量变化。由含已知量分子伴娘素的蛋白质溶液制备系列稀释液，用所述稀释液重复上述过程并由稀释液试验所得的校准曲线测定所试验样品中分子伴娘素的含量。
Northen杂交是适于测定本发明羟胺衍生物增强分子伴娘素水平(通过测定mRNA的水平)另一种试验方法。如蛋白质印迹法中所述，可获得所述细胞或组织。按照生产说明书(ProtocoIs and Applications Guide，第2版，1991，Bomega Corporation)，所述细胞和组织中的所有RNA可用RNAgents(Promega)萃取。于4℃下，将冷冻的组织样品(分别约为50-100mg)于含4M胍-硫代异氰酸盐；42mM柠檬酸钠；0.83mβ-乙硫醇；0.1％Nonidet P-40)的1.0变性剂中匀化(Brinkman-匀化)。然后以1/10体积比加入3M乙酸钠(pH4.0)并将组织匀浆于涡流搅拌下用酸性苯酚(苯酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1)萃取10秒。将样品于冰上孵育15分钟，然后离心(4℃，20分钟，10,000×g)。将水相转移至一新的Eppendorf-管中，重复所述步骤，并将水相于-20℃下等体积的异丙醇形成沉淀。离心(4℃，20分钟，10,000×g)后，沉淀用95％乙醇洗涤两次并于室温下干燥。将RNA悬浮于20μl焦碳酸二乙酯(diethyl-pyrocarbonate)(DEPC)处理的水中并用分光光度计于260-280nm下测定浓度。用毛细管转移器将总共8μgRNA跑过甲醛-琼脂糖凝胶，安所述制备说明书(Zeta-Probe GT，BroRad)将所述凝胶上的RNA印迹到尼龙膜上。
在每一样品中，将分子伴娘素mRNA含量与样品中的甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶(GAPDH)基因的mRNA水平进行对比。将cDNA探针(例如当所探查的mRNA是hsp70时，探针是全长人hsp70 cDNA和鼠GAPDH cDNA的APa-Ncol片断)利用Random Prime DNA标记盒(USB)用α-32P CTP进行标记。将放射性标记的DNA片断如Current Protocols in MolecularBiology：JOHN WILEY & SONS(1987)中所述(Ausubel等人(编辑)于Sephadex G-50(Pharmacia)柱上进行纯化。
于65℃H-缓冲液(0.25M Na2HPO4，pH7.2，7％SDS)中进行预杂交15分钟。用浓度至少为106cpm/ml的同位素标记的cDNA探针进行杂交过夜(65℃；H-缓冲液)。然后，将膜用20mM Na2HSO4，pH7.2，5％SDS(65℃；2×15分钟)洗涤并用自体放射照相术进行评价。用相同的膜进行hps70mRNA和GAPDH探针并用mRNA测定结果作内标。
本发明进一步包括一种治疗或预防各种病理性病症的方法，所述方法是给需要控制病理性病症的有机体施用有效量的如式(I)和(II)所示互变异构体形式的羟胺衍生物，所述病理性病症例如有与分子伴娘素系统功能有关的疾病以及细胞膜和细胞-细胞器损伤。在病理性病症条件下，典型地是在细胞中诱导分子伴娘素的表达。在这些细胞中，被增强了的分子伴娘素表达可有助于修复因所述病理性病症所引起的损伤并且还可以恢复细胞体内稳态平衡。
此类病理性病症包括局部缺血、肿瘤疾病、病源性微生物引起的感染、自身免疫疾病和皮肤病。
本文所述“治疗”是指使受治疗者获得在临床上所讲的改善，并不一定是指达到完全痊愈。改善是指缩短了病期或者减轻了疾病的严重程度，或者使受治疗者的生命质量主观上得到改善或延长了患者的存活期。
本发明羟胺衍生物用于治疗的有效量是指足以达到上述临床条件下改善的量。有效量取决于多种因素力传是用药途径并且可以很容易地由本领域技术人员确定。本发明羟胺衍生物可经非肠道或口服用药，优选口服或局部用药，并且有效量是10-500mg/kgbw，更优选的是，有效量是20-l00mg/kgbw。
当利用本发明治疗方法时，可保护心肌、脑组织和肾脏免受组织损伤或因局部缺血引起的坏死，其中所述方法包括给受治疗者施用有效量的本发明羟胺衍生物，以减轻、防止或恢复因延时局部缺血造成的损害。
本发明还包括式(I)和(II)所示互变异构体形式的羟胺衍生物在生产用于治疗本发明所述病理性病症的药物上的应用。
在用于测定所述羟胺衍生物的保护作用的方法中，如本文所述进行动物试验。将鼠用戊巴比妥钠麻醉(Nembutal 60mg/kg体重，i.p.)并经气管切开术用室内空气进行人工换气(2ml/100g；54搏击/分钟)。然后在右颈动脉内插入导管并与压力转换器(BPR-01，Strelting)相连，以通过预放大器(Hg-02，Experimetria)检测动脉系统血压(BP)。通过颈静脉(i.v.)导管或口服(p.o.)施用本发明羟胺衍生物。用心率计(HR-01，Experimertria)测定心率(HR)。用皮下钢针电极在记录仪(MR-12，Medicor)上记录心电图(ECg标准铅II电极)。经左胸廓切开术打开胸腔，然后通过轻压右侧肋骨骨架使心脏外置，如Selye等人所述(1960)，在左侧主冠状动脉下放置一压迫器，将心脏小心地放回到胸腔并将动物盖上。监测直肠温度并保持在37℃。所述试验从15分钟稳定期开始。若证实血压低于70mmHg或者在此期间观察到心率不齐时，则在进一步试验中将所述动物排除。然后通过冠状动脉闭合5分钟诱导心肌局部缺血并再灌注10分钟。
在试验全过程中，用多功能记录仪(R61-6CH，Medicor*)记录血压(BP)、心率(HR)和EKG。在闭合前5-60分钟，经静脉或口服治疗施用羟胺衍生物，所述羟胺衍生物的剂量可以是0.5；0.75；1.0mg/kg i.v.和100mg/kg体重p.o.，而参照物环苯吡乙胺的剂量为1.0mg/kg i.v.。测定并分析再灌注后第一个3分钟内的心室性心搏过速(VT)和/或心室纤维性颤动(VF)的平均时间。
本发明还包括一种当生理应激影响细胞膜流变性时，保护细胞膜流变性的方法，所述方法包括用有效量的羟胺衍生物治疗膜的流变性已发生变化的细胞或细胞-细胞器，以恢复所述膜的流变性。实施例9中所述试验方法(稳态DPH荧光各向异性)可用于测定本发明羟胺衍生物对细胞膜流变性的影响。
本发明包括一种治疗与细胞膜或细胞-细胞器膜有关的病理性病症的方法，此类病理性病症的实例有糖尿病以及与线粒体损伤有关的疾病，力软是ALS(肌萎缩性侧索硬化)、早老性痴呆、帕金森病亨廷顿舞蹈病(HD)、某些心肌病例如因中毒、酒精或重金属引起的疾病，炎症或病毒性心肌病或自身免疫性心肌病。在此方法中可使用结构式(I)和(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物。
本发明所述方法还可用于肿瘤疾病的治疗。所述方法包括向肿瘤体内施用有效量的羟胺衍生物，以防止肿瘤的形成或生长。在此方法中可使用式(I)和(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物。4.3.含羟胺衍生物的药物和化妆品组合物
如上所述，本发明还涉及通式(I)和(II)羟胺衍生物包括其光学活性立体异构体在制备用于治疗下述疾病的药物组合物(以及任选的化妆品组合物)中的应用，所述疾病有心血管疾病、血管疾病、过敏性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病，因病毒或细菌感染引起的疾病，肿瘤、皮肤和粘液疾病及因生理应激反应引起的肾小管疾病以及因生理应激反应引起的、可以化妆品形式进行治疗的病症，其中式(I)和(II)或其盐包括其光学活性立体异构体，A是烷基、被取代的烷基、芳烷基、芳基和/或烷基被取代的芳烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基，Z是共价键、氧或＝NR3，其中R3选自氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，R是烷基或被取代的烷基，式(I)互变异构体中，X是卤素或被取代的羟基或氨基、一取代的氨基或二取代的氨基，和式(II)互变异构体中，X是氧、亚氨基或被取代的亚氨基，和R′是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、含有被取代的芳基和/或烷基的芳烷基、酰基或被取代的酰基，并且式(I)化合物可任选地含有X与活性取代基偶合形成的分子内环结构。
利用这些化合物，可制备用于预防和治疗两种目的的组合物，当它们可以施用或使用到人或动物器官，用于预防或控制因上述疾病引起的细胞损伤，因而缓解或消除所述器官的病症。
所述组合物可以用化妆品和药物组合物制备领域本身公知的方法制备，即将所述活性物质与相应的载体和/或赋形剂混合制备。所述组合物通常含有0.5-99.5％重量比的活性化合物。所述组合物中活性物质的量取决于疾病的种类和严重程度、患者的年龄以及治疗方式。所述式(I)和(II)羟胺衍生物可配制成经口服和非肠道以及局部使用的组合物。
所述活性化合物的日剂量约为10-500mg/kg，优选20-100mg/kg，特别是在口服组合物情况下，其可分为2-3次施用。
当口服施用时，所述组合物可配制成糖锭剂、颗粒剂，如果需要，也可配制成溶液剂或悬浮剂。非肠道施用的组合物包括水悬浮剂和无菌注射液，直肠施用的组合物形式其中有栓剂，局部施用的组合物形式包括软膏剂、霜剂、乳剂和凝胶剂。
当制备片剂时，可将活性成分与适宜的载体例如淀粉、明胶、乳糖、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯胶和硅胶混合，将混合物制粒并压制成片剂。
在制备糖锭剂时，可由活性成分和赋形剂制备上述相似的混合物，将混合物制粒，将颗粒压制成药核，然后用例如含蔗糖聚乙烯吡咯烷酮水溶液将其用蔗糖包衣。
在制备胶囊剂时，可将活性成分与赋形剂例如淀粉、滑石、硅胶、微晶纤维素混合，并将混合物填充到硬或软明胶胶囊中。
这些口服组合物可用促进或减缓吸收的添加剂制得。
除了所述活性成分以外，糖浆剂或酏剂和滴剂可通过与所述活性成分的水溶液混合，用甜味剂、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯以及如果需要，还可用调味剂制得。
当直肠施用时，栓剂可用适宜的赋形剂例如可可脂或聚乙二醇制得。
适于非肠道施用的组合物可以是注射液，其可通过将所述活性成分溶于无菌等渗生理盐水溶液中制得，或者是悬浮液，其可以通过用适宜的分散剂和润湿剂例如丙二醇或丁二醇制得。
适于局部使用的霜剂和软膏剂可用伯或仲醇例如十六烷醇、十八烷醇、甘油、天然脂肪和油例如橄榄油、白胚芽油、羊毛脂、长链脂肪烃例如凡士林以及纤维素衍生物制得。这些组合物也可以含有防腐剂例如对羟基苯甲酸甲酯。
以化妆品或药物化妆品形式使用的组合物也可用相似的方法制得。优选的是，将疏水性组分进行混合，并将水溶性组分溶于水，可供选择的是可进行略微加热。如果需要，将后者的pH值调至适当的数值并将如此获得的乳剂进行搅拌，直至冷却。将所述活性成分加入到所述混合物的混合物中，如此制得水溶液形式的组合物。
含有本发明4.1.中所述羟胺衍生物的药物和化妆品组合物可按照上述方法制得。这些组合物也是本发明的一个目的。
本发明所述药物和化妆品组合物的一个实施方案是含有用于此组合物中的0.5-99.5％本发明式(I)羟胺衍生物和载体和赋形剂，其中
a)X是卤素，优选氯或溴，
Z是化学键，和
a1)A是式(a)基团，其中Y1是卤素，烷氧基，卤代烷基或硝基并且n是1、2或3，或者含氧杂芳基，优选呋喃基，含硫杂芳基，优选噻吩基，或与苯环任选稠合的含氮杂芳基，或其N-C1-4烷基季铵盐衍生物或N-氧化物，优选吡啶基、喹啉基或异喹啉基。
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基、芳基羰基或氨酰基，k是1、2或3，或其N-C1-4烷基季铵盐衍生物或N-氧化物，条件是，当A是吡啶基或萘基或者其中Y1是卤素或烷氧基的式(a)基团时，R7不是H，或者
a2)A是式(c)基团，
R是式(d)基团并且至少有一个必须存在于分子中的光学活性取代基Y2和Y3是氧或C1-4烷基，和k是1、2或3并且m是1、2或3，以及当所述化合物是一或二价阳离子时，阴离子是一或两个卤化物离子，优选碘化物，或者
b)X是-NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，未被取代的或被取代的芳烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元可含有一个或多个其他杂原子的杂环，
A是未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者未被取代的或被取代的芳烷基，
Z是氧或＝NR3，其中R3是H或未被取代的或被取代的烷基，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3，或者
c)X是-OQ，其中Q是未被取代的或被取代的烷基或芳烷基，
Z是氧，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基、芳基羰基或氨酰基，k是1、2或3和m是1、2或3，或者
d)A是未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者含氮杂芳基，优选吡啶基，或者含硫杂芳基，
Z是化学键，
X是-OQ，其中Q是C1-4烷基，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H，k是1、2或3和m是1、2或3。
本发明另一组药物和化妆品组合物包括含有约0.5-99.5％重量比式(I)羟胺衍生物或其盐和/或其光学活性立体异构体和药物上和化妆品上可接受的载体和/或赋形剂的组合物，其中
X是-NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，优选C1-6烷基或者环烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，
A是未被取代的或被取代的芳烷基，优选被一个或多个烷氧基，优选C1-4烷氧基取代的苯基烷基，未被取代的苯基或被一个或多个卤素、烷基或卤代烷基、酰氨基或硝基取代的苯基，或者未被取代的或被取代的可与苯环任选稠合的含氮杂芳基，优选吡咯基、吡啶基、异喹啉基或喹啉基，或者含硫杂芳基，优选噻吩基，其中所述杂芳基可含有一个或多个取代基，优选一个或多个烷基，优选C1-4烷基，
Z是化学键，和
R是式(e)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元可含有其他杂原子的并且可含有一个或多个取代基优选C1-4烷基的饱和杂环，Y4是H或未被取代的或被取代的C1-4烷基，Y5是H，未被取代的或被取代的C1-4烷基或-OR7，其中R7是H或酰基，k是1、2或3和m是1、2或3，条件是，
当A是未被取代的苯基或者被卤素或烷氧基取代的苯基或者被烷氧基取代的苯基烷基或者吡啶基并且R7是H时，R1和R2中的至少一个不是H，和
当A是未被取代的苯基或者被卤素或烷氧基取代的苯基或者被烷氧基取代的苯基烷基或者吡啶基并且R1和R2两者均是H时，R7不是H。
本发明另一组药物和化妆品组合物包括含有约0.5-99.5％重量比式(II)羟胺衍生物或其盐和/或其光学活性立体异构体和药物上和化妆品上可接受的载体和/或赋形剂的组合物，其中
a)X是氧，
A是C1-20直链或支链烷基，不饱和或饱和芳基，优选苯基或卤代烷基-苯基，未被取代的或被取代的芳烷基，萘基或含氮杂芳基，优选吡啶基，
Z是化学键，
R′是H，C1-4烷基或芳烷基，优选苯基烷基，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H，k是1、2或3和m是1、2或3，条件是，当A不是烷基并且R′是H时，Y6是H，或者
b)X是＝NR4，其中R4是H，未被取代的或被取代的烷基或者未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者未被取代的或被取代的芳基，优选苯基烷基，
A是未被取代的或被取代的烷基或者未被取代的或被取代的芳基，优选苯基或被取代的苯基，或者未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，或者环烷基，
Z是化学键，氧或＝NR3，其中R3是H或未被取代的或被取代的烷基，
R′是未被取代的或被取代的烷基或者未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3，或者
c)X是氧，
A是未被取代的或被取代的烷基，未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，
Z是氧，
R′是烷基或芳烷基，优选苯基烷基，
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3，或者
d)X是氧，
Z是＝NH，和
d1)A是未被取代的或被取代的烷基，环烷基，未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，未被取代的苯基或被卤素、卤代烷基烷氧基或硝基取代的苯基，
R′是烷基或芳烷基，优选苯基烷基，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或OH，k是1、2或3和m是1、2或3，或者
d2)A是式(a)基团，其中Y1是卤代烷基，优选三氟甲基并且n是1、2或3，
R′是H，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或OH，k是1、2或3和m是1、2或3。
本发明另一组药物和化妆品组合物包括含有约0.5-99.5％重量比式(I″)羟胺衍生物或其盐和/或其光学活性立体异构体和药物上和化妆品上可接受的载体和/或赋形剂的组合物，其中
A是未被取代的苯基或被卤素或硝基取代的苯基或者含氮杂芳基，优选吡啶基，
R1是H，和
R″是可被一或二取代的ω-氨基烷基，其中所述烷基链含有1至多个碳原子并且所述氨基-取代基分别独立地是一或两个直链或支链烷基或环烷基，或者其中两个氨基-取代基与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元杂环或其N-C1-4烷基季铵盐衍生物，条件是，
当A是吡啶基时，R″不是1-哌啶甲基。
本发明实施方案将作为下列实施例中更详细地阐明。但是，可以理解的是，本发明的保护范围并不受实施例中所述具体实施方案的限制。5.化学物质和组合物实施例实施例1：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-2-噻吩偕氯代亚胺一盐酸盐
将5.0g(15.6mmol)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-2-噻吩亚胺酰胺一盐酸盐(实施例44)溶于19ml水中，然后加入6.1ml浓盐酸。将溶液冷却至-5℃，然后滴加4.4g(63.8mmol)亚硝酸钠的2.4ml水的冷溶液，始终保持反应内温在0℃。加完后，将混合物再搅拌1小时。加入冷苯(60ml)并通过缓慢地加入3.2g(80mmol)氢氧化钠的45ml水的冷溶液使混合物呈碱性。分出有机相并依次用每份20ml水洗涤，直至pH＜9(3-5次)。有机溶液用无水硫酸钠干燥，用活性碳处理，过滤并真空蒸发(t＜45℃)，得到2.6g油状物。将此残余物溶于5ml异丙醇并用含无水氯化氢的异丙醇溶液酸化(pH2)，产物于正己烷中析晶，得到灰白色产物。产率：2.0g(38％)Mp.：115-123℃
按照上述实施例中所述方法，制得下列化合物：实施例2：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-1-异喹啉偕氯代亚胺一盐酸盐原料：实施例46产率：48％Mp：168-172℃IR(KBr)：3425，3128，2947，2866，2650，2540，1622，1597，1556，1452，1385，
     1364，1329，1296，1281，1240，1117，1092，1024，1015，978，953，
     903，881，795，743，718，658，559cm-1实施例3：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-异喹啉偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)原料：实施例42
此时，在最后处理步骤中，通过将粗品碱溶于丙酮并加入等量的马来酸，分离出最终产物。产率：67％Mp.：159-162℃IR(KBr)：3427，3019，2947，2886，2689，1583，1477，1450，1352，1293，1221，
     1194，1132，1072，1045，939，919，872，833，754，650，557cm-1实施例4：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-硝基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐原料：实施例40产率：58％Mp.：185-189℃实施例5：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-4-硝基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐原料：实施例43产率：47％Mp.：180-182℃IR(KBr)：3331，2953，2853，2735，2654，2577，2548，1605，1568，1516，1456，
     1348，1261，1165。1119，1072，1059，1007，960，933，862，849，
     754，719，690，673，627，581，550，478cm-1实施例6：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-2-硝基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐原料：实施例45产率：50％Mp.：159-162℃IR(KBr)：3298，2983，2932，2746，1593，1574，1535，1445，1391，1354，1317，
     1288，1242，1198，1117，1092，1069，1020，968，947，914，852，
     793，756，708，577cm-1实施例7：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-2-呋喃偕氯代亚胺一盐酸盐步骤：
将1-氯-2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙烷[J.Org.Chem.33(2)p.523-30(1968)](3.0g，116.9mmol)溶于水(1.8ml)，加入NaOH(1.19g，29.8mmol)并将混合物于室温下搅拌1小时。加入N-羟基-2-呋喃亚胺酰胺(1.92g，15.2mmol)并将混合物于室温下搅拌过夜。加入浓盐酸(2.1ml)，将pH调至约4并将溶液真空蒸发至干。
将残余物(5.4g)溶于浓HCl(37ml)，冷却至0-5℃并于30分钟内滴加NaNO2(5.6g，80mmol)的23ml水溶液。通过加入2N NaOH溶液(102ml)将溶液碱化至pH＝10，并用乙酸乙酯(2×130ml)萃取。合并的有机相用水洗涤，无水Na2SO4干燥并蒸发。将残余物(2.0g)再溶于少量乙酸乙酯(20ml)，通过加入HCl的异丙醇溶液(3.2N，3ml)使产物沉淀。将所生成的白色沉淀过滤，洗涤并最终于异丙醇中重结晶。产率：11％Mp.：139-141℃IR(KBr)：3427，3267，3094，2955，2922，2964，2745，1637，1584，1479，1452，
     1391，1319，1281，1259，1157，1117，1074，1024，999，980，943，
     887，854，843，743，710，596cm-1
按照上述实施例中所述方法，制得下列化合物：实施例8：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-4-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)
此时，在最后处理步骤中，通过将粗品碱溶于丙酮并加入等量的马来酸，分离出最终产物。产率：25％Mp.：165.5-169℃实施例9：N-[3-[(1，1-二甲基乙基)氨基]-2-羟基丙氧基]-3-三氟甲基苯偕氯代亚胺一盐酸盐步骤：a)将50g(0.245mol)间-三氟甲基-苄胺肟和33.7g(0.6mol)氢氧化钾溶于二甲亚砜和170ml水的混合物中，并将混合物冷却至0℃，加入48ml(0.6mol)表氯醇，并将反应混合物于0℃下搅拌5小时，然后于冰箱中保存过夜。第二天，加入250ml水并将混合物用乙酸乙酯(4×250ml)萃取。合并的有机相用水洗涤，干燥，用活性碳处理并蒸发至干，得到无色油状间-三氟甲基-N-(2，3-环氧丙氧基)-苄脒。产率：61g(96％)(b)向所得油状物中加入400ml 18％盐酸溶液和60ml乙醚，并将混合物冷却至-5℃，同时进行搅拌。将17.4g(0.25mol)亚硝酸钠溶于60ml水并于40分钟内缓慢加入，将反应混合物再搅拌20分钟。混合物用乙醚(2×160ml)萃取并将合并的有机相用水洗涤两次。向乙醚溶液中加入340ml 20％氢氧化钠并将两相系统回流1小时，同时进行搅拌。然后分相，有机层用盐水洗涤，直至中性，干燥并蒸发至干，得到无色油状间-三氟甲基-N-(2，3-环氧丙氧基)-苯偕氯代亚胺。(c)将1.19g(4.2mmol)N-[(2，3-环氧)丙氧基]-3-三氟甲基-苯偕氯代亚胺和0.89ml(8.5mmol)叔丁基胺于12ml异丙醇中的混合物回流2小时。减压蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯并加入0.98ml氯化氢的甲醇溶液(4.3N)，减压下将混合物浓缩至较小体积，然后用乙醚稀释。回收所生成的沉淀，用冷乙醚洗涤并干燥。产率：0.48g(32％)Mp.：150-153℃IR(KBr)：3423，3233，2978，2880，2784，1620，1570，1479，1441，1400，1383，
     1340，1238，1167，1128，1101，1072，1038，982，930，897，804，
     787，714，694cm-1
按照上述实施例中所述方法，制得下列化合物：实施例10：N-[2-羟基-3-[(1-甲基乙基)氨基]丙氧基]-3-三氟甲基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐产率：30％Mp.：105-108℃IR(KBr)：3358，2984，2883，2804，1595，1441，1383，1335，1238，1184，1171，
     1121，1099，1074，1011，995，947，906，891，798，779，696，681，
     567cm-1实施例11：N-[3-(环己基氨基)-2-羟基丙氧基]-3-三氟甲基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐产率：35％Mp.：147-149.5℃IR(KBr)：3381，2951，2860，2820，1580，1439，1344，1246，1161，1126，1099，
     1074，1003，986，932，903，872，802，787，716，692，681，648cm-1实施例12：N-[3-(二乙氨基)-2-羟基丙氧基]-3-三氟甲基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐产率：21％Mp.：121-128℃IR(KBr)：3425，3289，2951，2667，1818，1443，1337，1238，1178，1115，1078，
     1049，997，910，804，781，696，683cm-1实施例13：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-三氟甲基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐产率：13％Mp.：119-123℃IR(KBr)：3366，2937，2854，2737，2673，2538，1616，1570，1439，1404，1337，
     1290，1236，1199，1165，1129，1101，1074，1030，984，972，933，
     901，829，804，788，717，699，685，646cm-1实施例14：N-[2-羟基-3-(哌啶-1-氧化物-1-基)丙氧基]-N′-氧-3-吡啶偕氯代亚胺步骤：
向N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(5.0g；17.1mmol)的氯仿(50ml)溶液中分批加入间氯过苯甲酸(7.0g；40mmol)并将混合物于室温下搅拌2小时。蒸除溶剂，残余物溶于80ml乙酸乙酯，用水萃取，干燥并蒸发。最后，将所得油状产物于丙酮中结晶，得到灰白色固体状所述产物。产率2.21g(6.7mmol；40％)Mp.：140-142℃IR(KBr)：3437，3071，2943，2880，2590，1801，1578，1475，1454，1433，1375，
     1294，1259，1194，1165，1121，1088，1043，1011，995，924，905，
     888，845，808，710，671，554，513，413cm-1实施例15：N-[2-羟基-3-(哌啶-1-氧化物-1-基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺步骤：
向N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(2.0g；6.8mmol)的氯仿(20ml)溶液中加入间氯过苯甲酸(1.6g，纯度为70％；6.5mmol)并将混合物于室温下搅拌30分钟。溶液用10％氢氧化钠溶液调至碱性，然后分相，有机层用盐水洗涤，干燥并蒸发。所述固体残余物于乙酸乙酯中重结晶，滤出沉淀，洗涤并干燥，得到白色固体状所述产物。产率：1.03g(48％)Mp.：127-130℃IR(KBr)：3454，2988，2945，2880，2585，1585，1512，1479，1443，1416，1393，
     1350，1331，1289，1183，1134，1072，1051，1030，997，953，939，
     879，847，808，702，519，417cm-1实施例16：N′-[2-羟基-3-(1-甲基-哌啶鎓-1-基)丙氧基]-N-甲基-吡啶鎓-3-偕氯代亚胺二碘化物步骤：
氮气氛下，将N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(1.0g；3.4mmol)和1.2ml(20mmol)碘甲烷的混合物于丙酮(10ml)中回流2小时。滤出所得暗黄色沉淀并用丙酮洗涤，然后将所得粗产物(1.8g)于20ml乙醇中结晶。产率：1.2g(60％)Mp.：153-157℃IR(KBr)：3462，3406，3317，3040，2941，2878，2831，1729，1636，1589，1504，
     1462，1378，1350，1290，1209，1171，1121，1069，1047，1030，1001，
     941，897，868，818，706，673，635，589cm-1实施例17：N-[2-乙酰氧基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)步骤：
将1.48g(5.0mmol)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶-偕氯代亚胺溶于5ml乙酸酐中，将反应温度升至40℃。于室温30分钟后，真空下全部除去溶剂，残余物溶于30ml乙醚，用活性碳处理，过滤并减压除去溶剂，得到1.74g桔黄色油状物。
将残余物溶于10ml丙酮并加入0.6g(5.17mmol)马来酸的10ml丙酮溶液。滤出结晶产物并用丙酮洗涤，得到1.43g灰白色产物。经重结晶，脱色，由9ml异丙醇中得到所述标题化合物。产率：1.22g(54％)Mp.：143-144℃实施例18：(S)-N-[2-[2-R-(1，1-二甲基乙氧羰基氨基)-3-苯基丙酰氧基]-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)步骤：
将6.7g(25.5mmol)N-(叔丁氧羰基)-D-苯丙氨酸溶于50ml二氯甲烷中，将溶液冷至0℃并滴加4.0ml三乙胺，然后滴加2.5ml(26mmol)氯代甲酸乙酯。将混合物于0℃下搅拌20分钟，然后于30分钟内加入7.5g(26mmol)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺的50ml二氯甲烷溶液。将反应混合物于室温下搅拌1小时，溶液先用10％乙酸(2×100ml)萃取，然后用水萃取，用无水硫酸钠干燥并蒸发至干。残余物(10.7g)溶于71ml丙酮并加入1.53g(13mmol)马来酸。将所得固体滤出并用丙酮洗涤。产率：4.0g(6.0mmol；23％)Mp.：146.5-148℃[α]D＝+21.5°(c＝1，MeOH)IR(KBr)：3393，2978，1744，1697，1582，1518，1468，1454，1420，1381，1358，
     1313，1290，1256，1213，1169，1126，1099，1084，1045，1016，930，
     908，870，750，690，575cm-1
按照上述实施例中所述方法可制得下列化合物：实施例19：(R)-N-[2-[2-(S)-(1，1-二甲基乙氧羰基氨基)-3-苯基丙酰氧基]-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)产率：25％此化合物的物理数据(Mp.；IR)如实施例18所述。[α]D＝-23.6°(c＝1，MeOH)实施例20：N-[2-苯甲酰氧基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)步骤：
将20.9g(75.0mmol)N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-3-吡啶-亚胺酰胺〔匈牙利专利177,578(1976)〕溶于300ml苯中。向该溶液中加入150ml 1N NaOH溶液，接着滴加19.5ml(168mmol)苯甲酰氯。强烈搅拌该混合物2小时后，加入7.1g(67mmol)碳酸钠和另1份苯甲酰氯(9.75ml；84mmol)，搅拌过夜。然后使各相分离，有机层用1N NaOH溶液和水萃取，干燥并蒸发至干。残余物(41g油状物)溶于150ml丙酮，再加入8.7g(75mmol)马来酸。将得到的沉淀物过滤，用丙酮洗涤，并干燥。产率：29.1g(78％)Mp：194-195℃
按照上述实施例中所述方法，可制得下列化合物：实施例21：
N-〔2-苯甲酰氧基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)原料：美国专利5,147,879(1992)产率：64％Mp.：134-136℃IR(KBr)：2955，2939，2517，1718，1583，1477，1452，1410，1370，1354，1317，
     1268，1209，1173，1117，1057，1043，998，968，939，903，870，748，
     723，714，652，582cm-1实施例22：
N-〔2-棕榈酰氧基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕3-吡啶亚胺酰胺一盐酸盐
将14.7g(52.8mmol)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶-亚胺酰胺[匈牙利专利177,578(1976)]溶于160ml氯仿，加入7.7ml(55mmol)三乙胺，随后滴加棕榈酰氯(14.7g；56.5mmol)的85ml氯仿溶液。将混合物于室温下搅拌过夜，第二天，再加入3.8ml三乙胺和7.4g棕榈酰氯并再搅拌1天。溶液依次用水、5％乙酸和水萃取，用无水硫酸钠干燥并蒸发至干。
将残余物(28.2g油状物)溶于乙酸乙酯，通过加入30ml 1N HCl/乙酸乙酯使产物沉淀。滤出粘稠的白色沉淀，用乙酸乙酯洗涤并干燥。产率：10.9g(37％)Mp.：110-113℃
按照上述实施例中所述方法可制得下列化合物：实施例23：N-[2-棕榈酰氧基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺二盐酸盐原料：美国专利5,147,879(1992)注：所述反应于回流下进行。产率：72％Mp.：69-73.5℃IR(KBr)：3425，2922，2853，2648，2544，1742，1632，1468，1416，1377，1287，
     1183，1113，1087，1032，984，708，675cm-1实施例24：N-[2-(2-糠酰氧基)-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)注：所述产物以马来酸盐的形式分离出。产率：52％Mp.：167-171.5℃实施例25：N-[2-(邻-氯代苯甲酰氧基)-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺一盐酸盐注：所述反应于回流下进行。产率：50％Mp.：91-94℃实施例26：N-[2-(对-甲氧基苯甲酰氧基)-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺一盐酸盐注：所述反应于回流下进行。产率：71％Mp.：152-155℃实施例27：N-[2-(对-三氟甲基苯甲酰氧基)-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺一盐酸盐注：所述反应于回流下进行。产率：45％Mp.：144-147℃实施例28：N-[2-(2-噻吩甲酰氧基)-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)注：所述反应于回流下进行，而所述产物以马来酸盐的形式分离出。产率：58％Mp.：168-176℃实施例29：N-[2-乙酰氧基-3-[(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺一盐酸盐步骤：
将2.5g(9.0mmol)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺溶于27ml氯仿中，加入1.6g(16mmol)乙酸酐并于室温下搅拌1小时。将反应混合物蒸发至干，并溶于含有等摩尔量(9mmol)无水氯化氢的异丙醇中。将溶液冷却并滤出固体，于异丙醇中重结晶，得到白色结晶化合物。产率：1.9g(59％)Mp.：107℃实施例30：N-[2-(3-吡啶甲酰氧基)-3-(1-哌啶基)丙氧基-3-吡啶亚胺酰胺-(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)步骤：
向N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺(1.68g；6mmol)无水吡啶溶液中加入1.68g(7.4mmol)3-吡啶甲酸酐并于室温下静置过夜。将混合物蒸发，残余物溶于30ml乙酸乙酯，过滤，滤液用10％NaHCO3溶液萃取，干燥并蒸发。将所得油状物溶于20ml丙酮并加入0.53g马来酸，生成沉淀。滤出产物并用丙酮洗涤。产率：1.84g(61％)Mp.：157-160℃实施例31：N-[3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺二盐酸盐步骤：
将2.86g(51.1mmol)氢氧化钾溶于20ml无水乙醇中，然后加入6.45g(47.0mmol)N-羟基-3-吡啶亚胺酰胺和7.7g(47.7mmol)1-氯-3-(1-哌啶基)-丙烷并回流9小时。滤除固体并将滤液蒸发。粗产物溶于100ml氯仿，用1N氢氧化钠溶液洗涤，然后用水洗涤三次。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并于减压下蒸除溶剂。所得残余物溶于少量无水乙醇并加入含有无水氯化氢的异丙醇(pH2)，得到灰白色结晶。产率：4.8g(38％)Mp.：95-100℃(dec.)IR(KBr，base)：3422，3294，3107，2984，2937，2870，2818，1649，1616，1593，
           1479，1462，1441，1381，1309，1194，1123，1094，1059，1042，
           982，910，858，816，712，559cm-1
按照上述实施例中所述方法可制得下列化合物：实施例32：N-[3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-三氟甲基-苯亚胺酰胺一盐酸盐产率：42％Mp.：116-119℃IR(KBr，base)：3412，3082，2949，2874，2827，1655，1485，1447，1383，325，
           1283，1171，1121，1094，1072，986，920，905，808，700，677，
           627cm-1实施例33：N-[3-(1-哌啶基)丙氧基]-(3，4-二甲氧基苯基)甲亚胺酰胺二盐酸盐产率：35％Mp.：207-209℃实施例34：N-[2，2-二甲基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺产率：38％(oil)IR(KBr)：3323，2935，2888，2785，1637，1477，1393，1360，1157，1111，1057，
     995，943，860，814，789，708，627cm-1实施例35：N-[3-(4-甲基-1-哌嗪基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺一盐酸盐产率：23％Mp.：127-130℃IR(KBr)：3387，2947，2878，2802，1730，1639，1450，1389，1283，1242，1194，
     1150，1083，1015，964，933，814，710cm-1实施例36：N-[3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-硝基-苯亚胺酰胺一盐酸盐产率：51％Mp.：158-162℃实施例37：N-[3-(1-哌啶基)丙氧基]-苯亚胺酰胺二盐酸盐产率：64％Mp.：207-209℃实施例38：N-[2-羟基-3-[(1-哌啶基)丙氧基]-2，4，6-三甲基-苯亚胺酰胺产率：44％Mp.：199-201℃IR(KBr)：3410，3103，2943，2912，2814，2791，1634，1582，1441，1383，1350，
     1321，1304，1254，1204，1146，1111，1099，1065，993，878，851，
     785，754，525cm-1实施例39：N-[2-羟基-3-[(1-哌啶基)丙氧基]-4-乙酰氨基-苯亚胺酰胺一盐酸盐产率：25％Mp.：133-137℃实施例40：N-[2-羟基-3-[(1-哌啶基)丙氧基]-3-硝基-苯亚胺酰胺二盐酸盐产率：38％Mp.：190-193℃实施例41：N-[2-羟基-3-[(1-哌啶基)丙氧基]-2-(1，5-二甲基)-吡咯亚胺酰胺一盐酸盐产率：20％Mp.：144-147℃IR(KBr)：3458，3369，2930，2849，1622，1587，1502，1468，1437，1396，1354，
     1323，1279，1254，1200，1157，1115，1078，1042，988，962，930，
     870，856，758，737，694，609cm-1实施例42：N-[2-羟基-3-[(1-哌啶基)丙氧基]-3-喹啉亚胺酰胺二盐酸盐产率：36％Mp.：210-211℃实施例43：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-4-硝基-苯亚胺酰胺二盐酸盐产率：77％Mp.：184-189℃实施例44：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-2-噻吩亚胺酰胺二盐酸盐产率：73％Mp.：157-170℃IR(KBr)：3280(b)，2940，1655，1420，1120，1018，1002，857，710cm-1实施例45：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-2-硝基-苯亚胺酰胺二盐酸盐产率：47％Mp.：200-208℃IR(KBr)：3300(b)，2960，1670，1535，1347，1155，1020，1002，860，800，753cm-1实施例46：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-1-异喹啉亚胺酰胺二盐酸盐产率：56％Mp.：208-216℃实施例47：N-[3-[(1，1-二甲基乙基)氨基]-2-羟基丙氧基]-3-三氟甲基-苯亚胺酰胺二盐酸盐步骤：
将21.0g(80.8mmol)间-三氟甲基-N-(2，3-环氧丙氧基)-苄脒(实施例9/a)、105ml叔丁基胺、210ml乙醚和84ml 4N氢氧化钠溶液的混合物回流小时。分相，将乙醚层用盐水洗涤，干燥并蒸发至干。所得油状物(25.8g)溶于250ml丙酮，用活性碳处理，然后加入39ml 4N HCl/乙酸乙酯，同时进行搅拌，生成白色固体沉淀，将其过滤并用丙酮洗涤。产率：22.8g(70％)Mp.：186-192℃IR(KBr)：3418，2984，2785，2625，2527，2401，1664，1585，1487，1437，1381，
     1329，1173，1155，1130，1078，905，874，820，692，642，594cm-1实施例48：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-N′-丁基-3-吡啶亚胺酰胺一盐酸盐步骤：
a)(21.3g，71.4mmol)的制备，将N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺溶于500ml氯仿中，用氯化氢的乙醚溶液酸化至pH＝3，然后加入32.6ml(0.357mol)3，4-二氢-2H-吡喃。混合物于室温下搅拌20小时，每次用200ml 2N氢氧化钠溶液洗涤三次并用同量的水洗涤四次。有机相用硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发。将油状残余物溶于600ml乙酸乙酯并每次用150ml pH＝5的缓冲液洗涤四次，将有机溶液干燥，过滤并蒸发。
b)将3.7g(9.68mmol)N-[2-[(2-四氢吡喃基)氧]-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺和40ml(0.41mol)正丁基胺的混合物回流3小时。真空下蒸除过量的胺，得到深褐色油状物，将其溶于40ml含有3.0g 4-甲苯磺酸的乙醇中并将混合物加热至60℃1小时。减压蒸除溶剂，残余物用2N氢氧化钠溶液碱化(pH10)，然后用氯仿萃取三次。有机溶液用硫酸钠干燥，过滤并真空蒸除溶剂。将黑色油状残余物经色谱法纯化，得到纯碱，将其溶于20ml乙醇并用溶于异丙醇中的等量的无水氯化氢酸化，得到浅黄色结晶固体状所述标题化合物。产率：1.22g(34％)Mp.：120-122℃IR(Kbr，base)：3319，3293，3040，2959，2928，2854，2842，2552，1612，1580，
           1450，1427，1399，1333，1315，1221，1196，1171，1126，1103，
           1051，1022，964，928，899，858，829，719，692，602cm-1
按照上述实施例中所述方法可制得下列化合物：实施例49：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-N′-环己基-3-吡啶亚胺酰胺一盐酸盐产率：0.89g(24％)Mp.：130-134℃IR(KBr)：3280，2935，2853，2640，1720，1619，1551，1514，1452，1404，1313，
     1236，1194，1155，1124，1111，1090，1040，978，828，735，627cm-1实施例50：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-N′-(1，1-二甲基乙基)-苯亚胺酰胺步骤：
向0.92g(5.2mmol)的1-氯-2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙烷的2ml水溶液中加入0.42g(10.4mmol)氢氧化钠并搅拌1小时。向此混合物中加入溶于20ml乙醇中的1.0g(5.2mmol)N-羟基-N′-(1，1-二甲基乙基)-苯亚胺酰胺并回流4小时。蒸除溶剂，加入50ml水并每次用50ml氯仿萃取三次。有机相用硫酸钠干燥，过滤并真空蒸除溶剂。令黄色油状残余物于冰箱中缓慢析晶，结晶用乙醚研制并过滤。产率：0.55g(31％)Mp.：134-137℃IR(KBr)：3427，3254，2929，2853，2814，1739，1603，1510，1445，1391，1367，
     1302，1281，1190，1140，1117，1094，1067，1036，993，963，922，
     841，789，716，675cm-1实施例51：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-N′，N′-二乙基-3-吡啶亚胺酰胺一盐酸盐方法：
将0.66g(16.6mmol)氢氧化钠溶于25ml无水乙醇中，然后加入1.61g(8.3mmol)N-羟基-N′，N′-二乙基-3-吡啶亚胺酰胺和1.48g(8.3mmol)1-氯-2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙烷并回流5小时。蒸除溶剂，加入50ml水，每次用50ml乙酸乙酯萃取三次。有机层用硫酸钠干燥，过滤并真空蒸除溶剂。黄色油状残余物经色谱法纯化，得到纯碱，将其溶于20ml乙酸乙酯并用溶于乙酸乙酯中的等量无水氯化氢酸化，得到白色结晶固体状所述标题化合物。产率：1.3g(42％)Mp.：113-117℃实施例52：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-十六烷酰胺一盐酸盐步骤：
将1.74g(10mmol)1-氨基氧基(aminooxy)-2-羟基-3-(1-哌啶基)丙烷溶于20ml氯仿并冷却至0℃。于10分钟内滴加棕榈酰氯(2.85g；10mmol)的10ml氯仿溶液，将混合物搅拌15分钟后，将所得白色沉淀过滤，用氯仿洗涤并干燥。产率：3.2g(71％)Mp.：147-150℃IR(KBr)：3242，3090，2951，2916，2849，1730，1653，1520，1472，1439，1371，
     1300，1229，1169，1136，1099，1070，1009，993，962，928，858，
     760，719，602，471cm-1
按照上述实施例中所述方法制得下列化合物：实施例53：N-[3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺原料：EP363,364(1990)产率：69％(oil)IR(KBr)：3425，2941，2864，2775，1674，1614，1566，1520，1483，1441，1393，
     1337，1319，1277，1187，1129，1072，922，914，750，698，650cm-1实施例54：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]萘-1-甲酰胺产率：54％Mp.：104-107℃IR(KBr)：3375，2934，1641，1593，1564，1439，1340，1325，1113，1026，941，
     810，779cm-1实施例55：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-N′-庚基-脲步骤：
向溶于20ml氯仿中的1.23g(7.1mmol)1-氨基氧基-2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙烷溶液中加入1.0g(7.1mmol)异氰酸庚基酯并将反应混合物搅拌20小时。真空下蒸除溶剂，残余物经色谱法纯化，得到纯的无色油状物。用石油醚研制，得到白色结晶产物。产率：81％Mp.：49-51℃
按照上述实施例中所述方法可制得下列化合物：实施例56：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-N′-丙基-脲产率：50％(oil)IR(KBr)：3319，2934，2878，2802，1666，1551，1456，1393，1308，1155，1092，
     1040，993，889，793cm-1实施例57：N-环己基-N′-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-脲产率：67％Mp.：108-110℃IR(KBr)：3319，3287，3188，2930，2853，2797，1637，1574，1452，1354，1331，
     1300，1101，1098，991cm-1实施例58：N-己基-N′-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-脲产率：27％Mp.：50-52℃IR(KBr)：3310，2932，2858，2804，1666，1551，1454，1377，1306，1092，1040，
     995，791，725，604cm-1实施例59：N-(3-氯苯基)-N′-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-脲产率：34％Mp.：117-118℃IR(KBr)：3250，2939，2900，1670，1597，1551，1491，1429，1329，1252，1119，
     972，775，718，700cm-1实施例60：N-环己基-N′-[2-羟基-3-[N-环己基氨基甲酰基-N-(1，1-二甲基乙基)氨基]丙氧基]-脲产率：44％Mp.：151-152℃IR(KBr)：3312，2932，2854，1668，1616，1555，1450，1393，1364，1354，1252，
     1220，1130，941，891cm-1实施例61：N-己基-N′-[3-(1-哌啶基)丙氧基]-脲产率：85％(oil)IR(KBr)：3354，2932，2856，2810，2777，1666，1543，1486，1377，1308，1155，
     1134，1076cm-1实施例62：N-叔丁基-N′-[(2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基)]-脲产率：38％Mp.：71-73℃IR(KBr)：3314，2945，2916，1651，1555，1460，1393，1384，1335，1254，1111，
     988，903，839，781cm-1实施例63：N-(3-硝基-苯基)-N′-[(2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基)]-脲产率：54％Mp.：137-139℃IR(KBr)：3281，2943，2818，1672，1607，1560，1529，1486，1437，1354，1283，
     1115，802，739cm-1实施例64：5，6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1，2，4-噁二嗪步骤：
a)将17.5(0.05mol)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺二盐酸盐溶于50ml亚硫酰氯中，沸腾1小时，然后将混合物蒸发至干。残余物溶于300ml甲醇，用活性碳处理并于过滤后，减压蒸除溶剂。将残余物溶于最少量的乙醇并冷冻，得到N-[2-氯-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶-亚胺酰胺二盐酸盐中间体化合物结晶。产率：13.2g(71％)Mp.：127-145℃
(b)将13.2g(35.7mmol)N-[2-氯-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酰胺二盐酸盐加入到16.5g(143.5mmol)叔丁醇钾的150ml-叔丁醇溶液中。将混合物沸腾6小时，然后真空下蒸发。加入100ml 5％氢氧化钠溶液，混合物每次用300ml乙酸乙酯萃取三次。
有机层用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干。残余物用乙醚研制，得到白色结晶状所述标题化合物。产率：3.5g(38％)Mp.：157.5-158℃实施例65：N-[3-[(1，1-二甲基乙基)氨基]-2-羟基丙氧基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺步骤：
于10分钟内搅拌下，将1.3ml(15.2mmol)表氯醇加入到1.6ml(15.2mmol)叔丁基胺的8ml乙醇溶液中，保持温度低于20℃并令其静置3天。
另外，将0.8g(14.3mmol)氢氧化钾溶于20ml乙醇和3ml水的混合物中并向此溶液中加入3.42g(15.2mmol)N-羟基-3-(三氟甲基)-苯甲酰胺钾盐和上述制得的表氯醇和叔丁基胺溶液。将反应混合物搅拌并沸腾10小时，然后蒸除溶剂。残余物用20mL二氯甲烷和5ml水研制，分出有机相，用5ml水和5ml饱和氯化钠溶液洗涤，硫酸钠干燥，过滤并蒸发。油状残余物于丙酮-己烷混合物中结晶，得到白色粉末状所述标题化合物。产率：0.85g(17.3％)Mp.：156-158℃IR(KBr)：2976，2858，1612，1556，1379，1352，1313，1273，1165，1130，1072，
     694cm-1实施例66：甲基-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶亚胺酸酯(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)
将11.4g(38.2mmol)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺溶于60ml无水甲醇中，然后于5分钟内滴加25ml(0.1mol)25％甲醇钠的甲醇溶液。将反应混合物沸腾半小时并蒸发。残余物与210ml二氯甲烷一起搅拌半小时，滤除氯化钠，滤液用50ml水，然后用50ml饱和氯化钠溶液洗涤，用硫酸镁干燥并减压蒸发。粗产物(9.8g)经色谱法纯化，得到浅黄色油状所述标题化合物。产率：2.9g(29％)元素分析C15H23N3O3
         计算值    实测值
C％    61.4      61.2
H％    79.0      79.1
N％    14.3      14.5实施例67：二乙基-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-亚氨基碳酸酯步骤：
在催化量的对甲苯磺酸存在下，将0.87g(5mmol)1-氨基氧基-2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙烷和1.1g(5.5mmol)原碳酸四乙酯的混合物于100℃下搅拌3小时。蒸发后，残余物经色谱法(Merck Kieselgel60；洗脱剂：氯仿/甲醇-cc.NH4OH 30∶5∶0.2)纯化，得到浅黄色油状所述标题化合物。产率：27.7％(oil)13C-NMR(d，CDCl3)：154.9(s，C＝N)，76.5(t，N-OCH2)，66.6(d，CHOH)，64.5(t，CH3CH2)，64.1(t，CH3CH2)，61.5(t，CHCH2N)，54.8(t，哌啶)，26.0(t，哌啶)，24.2(t，哌啶)，14.9(q，CH3)，14.1(q，CH3)实施例68：N-[3-[(1，1-二甲基乙基)氨基]-2-羟基丙氧基]-O-乙基-N′-苯基-异脲步骤：
将18.4g(0.1mol)N-苯基-氯代甲亚胺酸乙酯(F.Lengfeld和J.Stieglitz：Am.Chem.J.16，70(1894))和16.2g(0.1mol)1-氨基氧基-2-羟基-3-[(1，1-二甲基乙基)氨基]-丙烷[Ger.Off.2651083]溶于200ml四氢呋喃，加入13.9ml(0.1mol)三乙胺并将混合物于室温下搅拌10小时。将生成的三乙胺盐酸盐过滤并将滤液真空蒸发，残余物溶于200ml氯仿并用50ml水洗涤。有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发。油状粗残余物经色谱法纯化，得到浅黄色所述标题化合物。产率：18.5g(59.8％)元素分析C16H27N3O3
         计算值    实测值
C％    62.1      62.3
H％    8.8       8.5
N％    13.6      13.7实施例69：N-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-O-苯基异甲酰胺步骤：
将3.16g(20mmol)1-氨基氧基-3-(1-哌啶基)-丙烷溶于50ml苯中，加入2.4g(20mmol)氰酸苯酯并将混合物于室温下搅拌12小时。进一步加入0.16g(1.3mmol)氰酸酯并将混合物再搅拌12小时。蒸发后，将残余物溶于甲醇，加入活性碳使溶液澄清并蒸发。产物于乙酸乙酯/乙醇中结晶，得到白色产物。产率：46.9％Mp.：63-70℃(乙酸乙酯)13CNMR(d，D2O)：152.4；129.9；125.8；119.9；70.3；57.4；54.3；53.2；23.0；22.7；21.0实施例70：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-N′-戊亚甲基-O-乙基-异脲步骤：
将2.7g(0.0lmol)二乙基-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-亚氨基碳酸酯(参见实施例67)和0.99ml(0.01mol)哌啶溶于40ml四氢呋喃中并于室温下搅拌2小时，然后蒸发至干。残余物经色谱法纯化，得到油状所述标题化合物。产率：2.1g(67.1％)元素分析C16H31N3O3
         计算值    实测值
C％    61.3      61.1
H％    10.0      9.8
N％    13.4      13.6实施例71：N，N-二甲基-N′-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-N″-苯基-胍盐酸盐步骤：
将1150mg(6.58mmol)1-氨基氧基-2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙烷(Ger.Off.2，651，083)溶于氯仿并加入750mg Na2CO3，然后滴加1206mg(6.58mmol)N，N-二甲基-N′-苯基-氯代甲脒(BR 888646/1959/，Bayer.auth.：Kuhle and Eue L.：CA57，136961/1962/)的10ml氯仿溶液。5小时后，将固体过滤并将滤液蒸发。残余物溶于10ml乙酸乙酯，产物通过加入10.46ml 0.54N HCl/乙酸乙酯沉淀。将黄色沉淀过滤，洗涤，最后于乙酸乙酯中重结晶后，于丙酮中重结晶。产率：28％Mp.：127-129℃IR(KBr)：3220，2093，2840，2690，2620，1608，1580，1475，1433，1375，1250，
     1070，1050，1000，925，900，760，705cm-1实施例72：N-[3-[(1，1-二甲基乙基)氨基]-2-羟基丙氧基]-N′-苯基-胍步骤
将3.1g(0.01mol)N-[3-[(1，1-二甲基乙基)氨基]-2-羟基丙氧基]-O-乙基-N′-苯基-异脲(参见实施例68)溶于20ml四氢呋喃中并加入200ml 25％氢氧化铵溶液和0.26g(5mmol)氯化铵，将混合物于室温下静置15小时。将混合物蒸发至干并经色谱法纯化，得到油状所述标题化合物。产率：1.7g(60.7％)元素分析C14H24N4O2
         计算值    实测值
C％    60.0      60.2
H％    8.6       8.9
N％    20.0      19.8实施例73：N，N′-二苯基-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-苯甲脒盐酸盐步骤：
将3.55g(20mmol)3-哌啶子基-2-羟基-1-丙烷溶于2.5ml水，加入0.8g(20mmol)NaOH并将混合物于室温下搅拌1小时。然后滴加N，N′-二苯基-N-羟基-苯甲脒盐酸盐的60ml乙醇溶液并再加入0.8g(20mmol)NaOH。将所得黄色悬浮液沸腾2小时，然后滤出沉淀出的氯化钠，用乙醇洗涤。蒸除溶剂，加入40ml乙酸乙酯，每次用40ml蒸馏水萃取两次。有机相用硫酸钠干燥，过滤。产物通过加入5.5ml 3.67N HCl/乙酸乙酯沉淀，滤出沉淀，洗涤，最后于甲醇/乙醚中重结晶。产率：42％Mp.：151-155℃(甲醇/乙醚)13CNMR(d，CDCl3)：159.6，148.0，140.9，131.0，129.7，129.3，128.9，128.5，127.9，127.5，64.2，60.2，54.5，22.7，21.9实施例74：N-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-N-甲基-N′-苯基-O-乙基-异甲酰胺
用1-甲氨基氧基-2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙烷和乙基-N-苯基-氯代甲亚胺酸酯作原料，按实施例68所述相同的方法制得所述化合物。产率：56％元素分析C17H29N3O3
          计算值   实测值
C％    66,4     66,2
H％    9,5      8,9
N％    13,7     13,9实施例75：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-N-甲基-N′-苯基-胍
用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-N-甲基-N′-苯基-O-乙基-异脲(参见实施例74)作原料，按实施例72所述相同的方法制得所述化合物。产率：43％(油状物)元素分析C16H26N4O2
         计算值    实测值
C％    62.7      62.2
H％    8.5       8.8
N％    18.3      18.4实施例76N，N，N′-三甲基-N′-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]N″-苯基-胍步骤：
将344mg(2.0mmol)1-甲氨基氧基-2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙烷溶于氯仿并加入220mg Na2CO3，然后滴加438mg(2.0mmol)N，N-二甲基-N′-苯基-氯代甲脒盐酸盐的3ml氯仿溶液。8小时后，将固体过滤并将滤液蒸发。将残余物溶于乙酸乙酯，通过向水中加入HCl溶液(pH＝1)萃取产物。水相通过加入2N NaOH溶液碱化至pH＝11，并用乙酸乙酯萃取。将有机相蒸发并进一步经柱色谱法纯化，得到黄色油状所述标题化合物。产率：10％(油状物)13C-NMR(d，CDCl3)：156.6，150.5，128.4，121.4，120.5，70.0，55.9，54.4，40.6，39.4，25.8，25.6，24.3实施例77：/R/(+)-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)步骤：
将2.16g(3.26mmol)(S)-N-[2-[2-(R)-(1，1-二甲基乙氧羰基氨基)-3-苯基丙酰氧基]-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)(参见实施例18)悬浮于40ml甲醇中并沸腾1小时，然后蒸发至干。残余物用20ml乙酸乙酯研制，将沉淀过滤，用乙酸乙酯洗涤。将此粗产物于异丙醇中重结晶，得到所述标题化合物。产率：1.16g(85％)Mp.：136-137℃[α]D：+5.6°(c＝1，MeOH，t＝27℃)实施例78：N-(3-哌啶子基-1-丙氧基)-3-吡啶偕氯代亚胺二盐酸盐
在将10ml蒸馏水和4.36ml浓盐酸的混合物冷却至0℃后，于搅拌下加入2g(7.62mmol)N-(3-哌啶子基-1-丙氧基)-3-吡啶甲脒(参见实施例31)。于-5℃下30分钟内，向黄色溶液中滴加溶于10ml水中的2.7g(3.81mmol)亚硝酸钠。将绿色溶液于-5℃下搅拌1.5小时后，冷却下通过加入1N氢氧化钠水溶液将溶液的pH调至10，然后溶液用40ml氯仿萃取三次。有机相用20ml水洗涤，硫酸钠干燥并蒸发。残余物经柱色谱法(Merck Kieselgel60：洗脱剂：氯仿/甲醇1∶1)纯化，得到1.7g(79.2％)所述标题化合物的相应的碱。
通过加入氯化氢的乙醇溶液，由所述碱制得所述标题化合物盐酸盐，m.p.：165-167℃。IR(KBr)：3015，2945，2617，2515，2088，1982，1600，1570，1437，1402，1200，
     1060，988，912，808cm-1
上述原料可如下所述制备：
将2.86g(51.06mmol)氢氧化钾溶于20ml无水乙醇后，搅拌下分批加入6.45g(47.0mmol)3-吡啶偕胺肟。溶解后，滴加溶于5ml乙醇中的7.7g(47.66mmol)1-(3-氯丙基)哌啶。反应小时后，将沉淀出的氯化钾过滤，通过加入活性碳使乙醇溶液澄清并蒸发。溶于100ml氯仿后，蒸发后的残余物每次用100ml 1N盐酸洗涤三次，然后用50ml水洗涤。分相后，有机相用硫酸钠干燥，过滤并蒸发。油状残余物经冷却变成结晶。将结晶用约20ml乙醚研制，过滤并干燥，得到4.8g(38.9％)米黄色产物。IR(KBr)：3422，3107，2937，2870，2819，1640，1479，1391，1309，1194，1123，
     1059，1042，982，916cm-1
按照上述实施例中所述方法可制得下列化合物：实施例79：O-(3-哌啶子基丙基)-3-硝基-苯偕氯代亚胺盐酸盐产率：50％Mp.：173-175℃IR(KBr)：3420，2926，2953，2649，2546，1514，1591，1533，1452，1354，1259，
     1252，1049，994，733cm-15.2.制剂实施例实施例1：片剂
含50mg活性成分的片剂可用下列组分制备：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-2-噻吩-偕氯代亚胺一盐酸盐                                50.0mg玉米淀粉                                   100.0mg乳糖                                        95.0mg滑石                                         4.5mg硬脂酸镁                                     0.5mg
将活性化合物研磨精细，与所述添加剂混合，将混合物均化并制成颗粒。将颗粒压制成片剂。实施例2：片剂
含5mg活性成分的片剂可用下列组分制备：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-2-硝基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐                              5.0mg玉米淀粉                                   75.0mg乳糖                                        7.5mg胶体二氧化硅                                7.5mg硬脂酸镁                                    5.0mg
按照实施例1所述方法，由上述组分制得所述组合物。实施例3：片剂
含5mg活性成分的片剂可用下列组分制备：N-[2-苄氧基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶-亚胺酰胺-(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)                 5.0mg玉米淀粉                                   75.0mg明胶                                        7.5mg微晶纤维素(Apical)                        25.05mg硬脂酸镁                                    2.5mg
按照实施例1所述方法，由上述组分制得所述组合物。实施例4：胶囊剂
含10mg活性成分的胶囊剂可用下列组分制备：N-[2-棕榈酰氧基-3-(哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶-亚胺酰胺一盐酸盐                             10mg乳糖                                       80mg玉米淀粉                                   25mg滑石                                        3mg胶体二氧化硅                                3mg硬脂酸镁                                    2mg
将活性化合物与所述添加剂混合，将混合物均化并装填到明胶胶囊中。实施例5：胶囊剂
含20mg活性成分的胶囊剂可用下列组分制备：N-[2-羟基-3-(哌啶基)-丙氧基]-2-噻吩-偕氯代亚胺一盐酸盐                                   20mg微晶纤维素(Apical)                           99mg无定型氧化硅                                  1mg
将活性化合物与所述添加剂混合，将混合物均化并装填到明胶胶囊中。实施例6：糖锭剂
含25mg活性成分的糖锭剂用下列组分制备：N-{3-[(1，1-二甲基-乙基)-氨基]-2-羟基-丙氧基}-3-三氟甲基-苄脒盐酸盐                        25mg羧甲基纤维素                                295mg硬脂酸                                       20mg乙酸邻苯二甲酸纤维素                         40mg
将活性成分与羧甲基纤维素和硬脂酸混合，将混合物于乙酸邻苯二甲酸纤维素的200ml乙醇-乙酸乙酯溶液中制粒。将用含5％蔗糖的聚乙烯吡咯烷酮水溶液包衣的颗粒制得的药核压制成锭剂。实施例7：注射剂
用下列组分制备注射液：N-[2-羟基-3-哌啶基)-丙氧基]-2-硝基-苯偕氯代亚胺                                    5.0g无菌生理盐水溶液                            2.0ml实施例8：软膏剂
用下列组分制备软膏剂：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-2-噻吩-偕氯代亚胺一盐酸盐                            7.5g硬脂酸                                      18.0g鲸蜡基十八烷醇                              15.0g甘油一硬脂酸酯                              4.0g十二烷基硫酸钠                              1.5g对羟基苯甲酸甲酯                            0.2g蒸馏水                                      150ml
将硬脂酸、鲸蜡基十八烷醇和甘油一硬脂酸酯一起熔融。在略微加热下将十二烷基硫酸钠和对羟基苯甲酸甲酯溶于100ml水中，然后于搅拌下加入到亲脂性组分中，直至温度降至室温。随后，加入活性成分的50水溶液并充分混合。实施例9：软膏剂
用下列组分制备软膏剂：N-[2-羟基-3-哌啶基-丙氧基]-2-硝基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐                              7.0g多乙氧基醚                                  4.0g液体石蜡                                    4.0g鲸蜡基十八烷醇                              12.0g白凡士林                                    20.0g甘油一硬脂酸酯                              4.0g对羟基苯甲酸甲酯                            0.2g乙醇                                        1.8g蒸馏水                                      150ml
如实施例8所述制备所述组合物。实施例10：乳膏剂
用下列组分制备乳膏剂：N-[2-羟基-3-哌啶基-丙氧基]-4-吡啶-偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)                  10.0g白凡士林                                    90.0g白蜡                                        3.0g鲸蜡基十八烷醇                              3.0g四硼酸钠                                    4.0g对羟基苯甲酸甲酯                            0.2g蒸馏水                                      90ml
如实施例8所述，将水溶性组分的溶液加入到温热的疏水性组分的混合物中，并向最终的乳液中加入所述活性化合物的水溶液。实施例6：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对细胞HSP表达的影响(在翻译水平上检测)6.1背景
本节中进行所述试验的目的在于测定N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对细胞分子伴娘素的表达是否有影响。在将心肌细胞H9c2细胞高温处理之前、期间或处理之后马上加入10-5MN-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐，测定仅处于热激下以及处于热激并加入了N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的情况下不同热激蛋白序列的累积情况。6.2材料和方法6.2(a)细胞培养条件：
由European Collection of Animal cell Cultures(ECACC)(88092904)获得由大鼠心肌衍生的细胞系H9c2。在37℃下，JOUAN CO2恒温器(5％CO2)中，将所述细胞保存于补充有10％牛胎血清(GIBCO)的Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)中。6.2(b)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理和热激条件：
于43℃下，CO2恒温器中，以一定的时间间隔(20、40、60、90和120分钟)进行热激。然后令细胞再回至37℃6小时并萃取蛋白质以进行SDS-PAGE。在热激之前加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐，在所述应激之前16小时施用10-5MN-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐。在另一组试验中，在热激之后6小时恢复期期间内以10-5M的浓度加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐，所述试验重复三次。6.2(c)蛋白质印迹法
为了进行SDS-PAGE，令细胞在6cm培养皿中生长。试验开始时，细胞数为8×105并当进行蛋白质萃取时，仍进行次铺满培养。6小时后，将回收的细胞在PBS中洗涤两次，然后刮去于PBS中的培养皿表层。将细胞于1500rpm下离心5分钟并溶于100μl含有50mMTris-HCl，pH8.O；5MM EDTA；150mM NaCl；15Tritox N-100；1PMSF；2μg/ml抑肽酶；1μg/ml抑糜朊酶素；1μg/ml胃蛋白酶抑制剂的经修饰的增溶缓冲液中(Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Ed.Sambrook，Fritsche，Maniatis，Bold Spring HarborLaboratoryPress(1989))；并用超声波处理3×20秒(间隔2分钟，设定8)。
用Bradford试验(M.M.Bradford，Anal.Biochem.，72：248-254(1976))测定三个平行样品中5μl样品中的蛋白质浓度。用上述缓冲液将样品调至蛋白质浓度为100μg/30μl并用另一个缓冲液调节，以使所述样品中缓冲液浓度达到：110mM Tris-HCl Ph6.8，8.3mM乙硫醇，3％SDS，3％甘油和一些溴代苯酚蓝，并于室温下振摇30分钟。
按照Laemmli(U.K.Laemmli，Nature，227：680-685(1970))所述，在50V恒定电压下，于两个8-18％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳过夜。蛋白质用Coomassie Brilliant Blue R-250染色或者于转移缓冲液(10mMCAPS，pH11，10％甲醇)中，在4℃恒定电流(300mA)下转移到ImmobilonePVDF膜(微孔)上，进行3小时(Protein Blotting Protocols for theImmobilon-P Transfer Membrane，3.Laboratory Manual.Millipore)。转移后，于TPBS(含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲生理盐水)中，将所述膜的非特异性部位于4℃下用2％BSA阻断过夜。于室温下，将所述印迹与1∶3000稀释的GRP94单克隆抗体(SPA-850，StressGen)、以1∶2700稀释的HSP60单克隆抗体(SPA-600，StressGen)、以1∶1250稀释的HSP72单克隆抗体(C92F34-5，StressGen)或以1∶2000稀释的HSP90单克隆抗体(Ac88，StressGen)一起孵育1小时。然后将其用TPS缓冲液洗涤1小时并再分别与同抗-大鼠(Sigma，1∶4000稀释液，对GRP-94)或抗-小鼠(Sigma，用人或大鼠血清蛋白吸收，1∶3000稀释液，对Hsp60、HSP72或HSP90)次生抗体结合的辣根过氧化物酶一起孵育1小时。在用TPBS充分洗涤后，将所述膜制成ECL系统(Amersham)。
将总蛋白系列稀释液印迹并每次用相同的样品制成平行样品，并计算标准曲线。用Bio-Rad光密度计(1650型)和Hewlett-PackardIntegrator(HP3394A)定量地测定应激蛋白含量变化并根据标准曲线进行校正。计算时，将37℃下无N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐时所得蛋白质带的光密度记上的数值记作100％，并将所有的其他样品的强度与所述样品进行比较。6.2(d)统计学分析
数据用平均±SE表示。利用Posthoc Newman-Keuls试验(Pharmacological Calculation System)经过方差单向分析进行统计学比较和计算。统计意义定义为p＜0.05。6.3结果
Hsp60：于37℃下用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理，在此hsp的水平没有可测得的影响。仅于43℃下进行热激，持续20分钟，可将hsp60的量几乎提高两倍。通过延长热激时间，没能观测到此蛋白质水平的进一步升高。当在热激前16小时以10-5M的浓度加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐时，hsp60的量升高约5倍(与37℃对照比较)，尽管样品仅进行了20分钟热处理。N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对hsp60水平的影响也可以通过将样品分别热处理40和60分钟观测到，但此后则开始下降。尽管降至一明显降低的范围，但通过在应激前加入此化合物进行观察发现，在恢复相期间加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐也是有效的。
Hsp72：戏剧性的是，与对hsp70水平的处理作用不同，在H9c2细胞中剩余的hsp72的量相当低。在20分钟热激和40分钟热激处理时，则有明显提高，其量几乎超出对照细胞中所检测出的10倍。与40分钟时的样品相比，延长热处理时间，结果没有明显变化。在热激之前施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐可取得十分重大的作用。与37℃样品相比，60分钟热激时，hsp72水平提高约50倍，但显著的提高则是在热激持续40分钟时已检测到。热激120分钟，细胞中hsp的高诱导量达到稳定。尽管水平较低，但在恢复相期间加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐也是有效的。
Hsp90：20分钟热处理时，仅用高温热激不能诱导HSP90水平升高。但是，如果在热激前加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐，则HSP90水平将升高约5倍。与60分钟热处理相结合，可观测到预孵育前药物的最大作用。令人感兴趣的是，对于HSP90，于43℃进行60分钟处理后，加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐与高温应激之前加入一样有效(如果不是更强的话)。显然，高温下孵育时间长过90分钟，则N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的作用将消失。
Grp94；在20分钟热激后，会诱导生成应激蛋白Grp94。此作用在热处理60分钟时达到最高峰，而对90分钟样品已观测到锐减。在应激之前加入所述化合物的情况下，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐诱导Grp94的能力达到最显著，但如果将预先加入所述药物与20分钟热激热激相结合，可以看到显著地升高(此时与43℃处理相比，升高4倍)。相反地，在热激持续40-60分钟开始的恢复期内加入所述化合物，几乎与应激前16小时施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐一样有效。
图2表明了H9c2细胞蛋白质的蛋白质印迹分析。所用探针是：hsp60抗体，如(1)所示；hsp72抗体，如(2)所示；hsp90抗体，如(3)所示和grp94抗体，如(4)所示。Lane(-)表示在无N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐存在下处于37℃下的细胞，而Lane(+)表示在有所述化合物(浓度为10-5M，16小时)存在下的细胞。43℃热激所进行的时间如图中所示。在所述热处理之前16小时(lane(B))或者在所述恢复期内(lane(A))加入10-5M的N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐。
在H9c2心肌细胞中，对不同hsp量进行各种处理的结果总述如图1所示。仅处于热激(43℃)下的细胞中热激蛋白的量用(A)表示，在热处理前用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理，细胞中应激蛋白的量用(B)表示；在6小时恢复期内用10-5MN-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理，细胞中应激蛋白的量用(C)表示。横坐标表示热处理期间的时间，而纵坐标表示应激蛋白的相对量。
在此试验中，对仅用热处理诱导的所有类型的HSP进行研究，对于hsp60，增长不明显。在将细胞与热接触20分钟后，hsp60的水平增至约2倍，而再长时间的热处理，则可观测到没有进一步的增长。对于hsp72，可观测到最大的热激作用，其量会增至约12倍。当在热处理前16小时加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐时，HSP的水平与应激时所观测到相比会增加至少两倍。显然，在将热激和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐结合的情况下，如果再同仅用热激所观测到诱导作用相比，hsp72的水平在HSP中增长程度较大。当在恢复相期间施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐时，几乎在所有情况下进行检测，hsp的量均得到增长，但hsp72的增长最明显。6.4讨论
蛋白质印迹分析表明，在将心肌细胞进行热激后，观测到不同类型的HSP的显著积累。在高温应激之前或者之后加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐，对于HSP的产生会增于热处理作用。因此，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐可与温度应激协同作用诱导所有种类的分子伴娘素的生成。实施例7：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐细胞表达HSP的影响(在转录水平进行检测)7.1背景
令心脏短暂地处于局部缺血状态(例如通过重复震动)可进行预处理并保护其随后不出现致死性局部缺血，表现为心室纤维性颤动范围减小，梗塞程度减弱并且局部缺血的心脏在再灌注期间内局部缺血心肌功能得到较好地恢复。此预处理已说明了对HSP，特别是hsp72表达的诱导。在本节中，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对hsp72表达的影响通过测定局部缺血后细胞中mRNA的累积情况进行研究并将其与施用了N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的局部缺血的情况进行比较。7.2材料和方法7.2(a)热激的诱导
试验在SPRD雄性大鼠上进行。以60mg/kg/i.p.的剂量用戊巴比妥钠将动物麻醉。在腹部上方放置一盏红外线灯以维持大鼠的体温并测定直肠温度。25-40分钟后，大鼠温度降至42.0-42.2℃并将此温度保持15分钟，恢复期(2小时)后，由左和右心室取组织样品。7.2(b)心脏局部缺血的诱导
试验在SPRD雄性大鼠上进行，以60mg/kg/i.p.的剂量用戊巴比妥钠将动物麻醉，将胸腔和心包打开后，将LAD冠状动脉闭合5分钟，然后研究再灌注期间(10分钟)内心室性心搏过速和心室纤维性震颤的范围和时间。由左和右心室取组织样品。7.3(c)RNA印迹分析法
按照生产说明书(Protocols and Applications Guide，第2版，1991，Bomega Corporation)，用RNAgents盒(Promega)萃取所有的RNA。简言之，将冷冻的组织样品(所述组织样品取自进行了热激或心肌局部缺血的大鼠左或右心室)，重约50-100mg的组织样品于+4℃经Brinkman-匀化在1.0ml变性剂中进行匀化。然后以1/10体积比加入3M乙酸钠(pH4.0)并将组织匀浆于涡流搅拌下用酸性苯酚(苯酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1)萃取10秒。将样品于冰上孵育15分钟，然后离心(4℃，20分钟，10,000×g)。将水相转移至一新的Eppendorf-管中，重复所述步骤，并将水溶液于-20℃下沉淀过夜。离心(4℃，20分钟，10,000×g)后，沉淀用95％乙醇洗涤两次并于室温下干燥。将RNA悬浮于20μlDEPC-处理的水中。用毛细管转移器将总共8μg RNA跑过甲醛-琼脂糖凝胶，按所述制备说明书(Zeta-Probe GT，BroRad)将所述凝胶上的RNA印迹到尼龙膜上。
将每一样品中hsp72 mRNA的含量与相应的探针中甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶(GAPDH)基因的mRNA水平进行对比。将DNA探针(全长人hsp70cDNA和鼠GAPDH cDNA的Apa-Ncol片断)利用Random Prime DNA标记盒(USB)用α-32P CTP进行标记。将放射性标记的DNA片断如CurrentProtocols in Molecular Biology：JOHN WILEY & SONS(1987)中所述(Ausubel等人(编辑)于Sephadex G-50(Pharmacia)柱上进行纯化。
于65℃H-缓冲液(0.25M Na2HPO4，pH7.2，7％SDS)中进行预杂交15分钟。用浓度至少为106cpm/ml的同位素标记的探针进行杂交过夜(65℃；H-缓冲液)。然后，将膜用20mM Na2HSO4，pH7.2，5％SDS(65℃；2×15分钟)洗涤并用自体放射照相术进行评价。将同样的膜用于hps70探针以及用于GAPDH的测定并用mRNA作内标。7.4结果
将冠状动脉闭合5分钟，然后进行再灌注，引起大鼠心室性心搏过速和心室纤维性震颤。用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐预处理(闭合前5分钟施用0.5-，0.75-，1.0mg/kg体重i.v.)，可明显降低心室性心搏过速的平均时间并通过防止心室纤维性震颤改善存活率。
用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理(100mg/kg p.o.)，不仅使动物在5分钟闭合后再灌注中存活下来，而且通过对它们2的心肌制剂进行检测发现hsp72基因的表达明显增强。而在再灌注期间，所有对照组中的动物(n＝6)均死亡。
图3是由大鼠左心室分离出的所有RNA的RNA印迹分析结果，用以说明试验所得结果。对照(第一条)；热处理(第二条)；假处理(第三条)；局部缺血(第四条)；N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐加局部缺血(第五条)；和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(第六条)。用测得的GADPH作内探针。热激时，直肠温度在42℃下保持15分钟。
制得注意的是，在没有应激的情况下，仅施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐不能激活hsp72基因。实施例8：本发明羟胺衍生物对心肌局部缺血的保护作用
将雄性Sprague-Dawley鼠(380-450g，bw)用戊巴比妥钠麻醉(Nembutal 60mg/kg体重，i.p.)并经气管切开术用室内空气进行人工换气(2ml/100g；54搏击/分钟)。然后在右颈动脉内插入导管并与压力转换器(BPR-01，Stoelting)相连，通过预放大器(Hg-02，Experimetria)检测动脉系统血压(BP)。通过颈静脉(i.v.)导管或口服(p.o.)施用实施例5所述羟胺衍生物。用心率计(HR-01，Experimertria)测定心率(HR)。用皮下钢针电极在记录仪(MR-12，Medicor)上记录心电图(ECG标准铅II电极)。经左胸廓切开术打开胸腔，然后通过轻压右侧肋骨骨架使心脏外置，如Selye等人所述(1960)，在左侧主冠状动脉下放置一压迫器，将心脏小心地放回到胸腔并将动物盖上。监测直肠温度并保持在37℃。所述试验从15分钟稳定期开始，此期间观察证实血压低于70mmHg或者发生心率者则被排除。然后通过冠状动脉闭合5分钟诱导心肌局部缺血并再灌注10分钟。
在试验全过程中，用多功能记录仪(R61-6CH，Medicor)记录BP、HR和ECG。在闭合前5-60分钟，分别经静脉或口服治疗施用式(I)和(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物，所述实施例5中羟胺衍生物的剂量为0.5；0.75；1.0mg/kg i.v.和100mg/kg体重p.o.，而参照物环苯吡乙胺的剂量为1.0mg/kg i.v.。
用方差单向分析法分析再灌注后第一个3分钟内的心室性心搏过速(VT)和/或心室纤维性颤动(VF)的平均时间。用卡方试验分析VF的发生率。用卡方试验分析血液动力学变化。用Student＂t＂-试验分析血液动力学变化。将临界显著水平设定为p＜0.05。所有结果表示为平均±S.E.M.。在闭合前5分钟以1mg/kgbw的剂量施用药物。
对保护动物免受局部缺血/再灌注损伤特别有利的所述羟胺衍生物如下所示。存活率(％)表示在5分钟冠状动脉闭合情况下所存活的动物百分比。
号 存活率(％)
实施例77i.v.1mg/kgbw 67
实施例78    ″ 100
实施例8     ″ 100
实施例13    ″ 60
实施例9     ″ 100
实施例10    ″ 67
实施例5     ″ 80
实施例6     ″ 100
实施例79    ″ 100
实施例1     ″ 100
实施例16    ″ 67
实施例65    ″ 78
实施例54    ″ 80
实施例20    ″ 100
实施例22    ″ 100
实施例47    ″ 100
实施例39    ″ 60
实施例51    ″ 75
实施例64    ″ 100
实施例56    ″ 67
实施例57    ″ 67
实施例58    ″ 100
实施例59    ″ 86
实施例60    ″ 60
实施例61    ″ 83
实施例55    ″ 80
实施例66    ″ 57
实施例62    ″ 57
实施例63    ″ 50
实施例4     ″ 50
对照(未处理过)n＝24 10
除了上述化合物以外，下列化合物也可取得较好的结果：N-[2-羟基-3-(吡咯烷-1-基)-丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)(U.S.5,328,906，实施例12，1mg/kgbw i.v，存活率％：67)；N-[2-羟基-3-(二乙基-氨基)-丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺盐酸盐(1∶1)(U.S.5,328,906，实施例11，1mg/kgbw i.v.，存活率％：62)；N-[2-羟基-3-丙-2-基-氨基)-丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)(U.S.5,328,906，实施例13/4，1mg/kgbw i.v，存活率％：60)；N-[2-羟基-3-(吗啉-1-基)-丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)(U.S.5,328,906，实施例12，1mg/kgbw i.v.，存活率％：71)；N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-α-(3，4-二甲氧基-苯基)-乙偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)(U.S.5,328,906，实施例14，1mg/kgbw i.v.，存活率％：67)；N-[2-羟基-3-(叔丁基-氨基)-丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)(U.S.5,328,906，实施例13/5，1mg/kgbw i.v.，存活率％：57)；O-(3-哌啶子基-2-羟基-1-丙氧基)-苯偕氯代亚胺盐酸盐(U.S.5,147,879，实施例1，1mg/kgbw i.v.，存活率％：100)；N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)(U.S.5,147,879，实施例2，1mg/kgbw i.v.，存活率％：100；20mg/kgbwp.o.，存活率％：100)；实施例9：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对细胞膜修复以及保持膜的流变性方面的影响9.1与因血清缺乏应激引起的细胞损伤有关的细胞膜流变性变化以及N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对恢复流变性变化的影响9.1(a)背景
一种模拟与糖尿病相伴随的代谢损害应激引起的生理活动的方法是降低培养基中胰岛素的水平。由于胰岛素是由补充血清提供的，因此其部分或完全缺乏似乎是测定细胞对不同调节水平上的变化的最佳方法。
血清缺乏被广泛地用于使细胞停止在G1/S相，即细胞循环同步化方法(Ashihara，T.Methods of Enzymology，58：248-249(1979))。现已观测到，在血清补充不足的情况下，培养的细胞会进行自然死亡过程(Cohen等人Adv.In Immunology 50：50-85(1991))并已对Balb/3T3细胞中星状孢菌素(staurosporin)或拓朴异构酶抑制剂的选择性休克(Kulkarni，G.V.等人，J.Cell.Sci.107：1169-1179(1994))或Ehrlich细胞中热激和谷氨酸缺乏(Rowlands，A.G.等人，Eur.J.Biochwm.175：93-99(1988))情况下，对真核细胞起始因子(elF2α)磷酸化合成的被抑制的蛋白进行了研究，而且，有证据表明，通过施用外源性HSP72可诱导血清缺乏情况下细胞的细胞保护作用(Johnson，A.D.等人，In Vitro Cell Dev，Biol.Anim.29A：807-812(1993))。并且还表明，血清的缺乏使得HSP82和HSP72的合成相对增强(Toye，P.等人，Mol.Biochem.Parasitol，35，11-10(1989))。
通过进行性膜机能障碍和损伤介导心肌和其他器官的局部缺血和缺氧损伤。还表明，在心肌细胞代谢损害过程中发生了膜流变性变化(Buja L.M.等人，In vivo 5：233-238(1991))。膜的流变性主要反映了构成膜的脂质运动定位和速率，而其水平的任何改变将会极大地影响膜的基本功能(Quinn，P.J.等人，Prog.Biophys.Molec.Biol.53：71-103(1989)；Schlame，M.等人，Biochim.Biophys.Acta.1045：1-8(1990))。
在此试验中，主要测定在参与了血清缺乏引起的细胞损伤过程中的细胞浆膜的流变性是否发生了变化以及通过施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐是否可以使血清缺乏引起的流变性变化回复。
9.1(b)原料和方法
用WEH1小鼠细微肉瘤和H9c2大鼠心肌细胞系进行试验，并分成下列三组：
·对照组(10％FCS牛胎血清)
·血清缺乏组
·用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理的并且血清缺乏的组。
9.1(b)(1)血清缺乏和MTT试验
我们已筛选了各种细胞系、药物浓度、预处理和缺乏时间并且我们已发现了下列最适宜条件：将5×10-4/ml H9c2大鼠心肌细胞(n＝6)和WEHI小鼠纤维肉瘤细胞(n＝7)置于装有10％FCS DMEM(Dulbecco修饰的Eaglet培养基)的24孔培养皿中并于37℃、5％CO2下孵育2小时。除去培养基并替换成10-5MN-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的10％FCS DMEM溶液。在上述环境下进一步孵育6小时后，将培养皿用PBS充分洗涤并使血清缺乏。向预处理过的细胞施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐，直至试验结束。饥饿18小时后，使大部分细胞分开，即使其死亡，显微镜下观察血清缺乏的培养基，表明用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐预处理过的培养基的图像与对照组细胞相似。通过以Plumb等人的方法(Cancer Res.49：4435-4444(1989))为基础的MTT试验测定细胞的生存力。所述四唑鎓盐法涉及活细胞将MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)转化成有色的甲月替，其可作为细胞生存力的间接测定结果。以1mg/ml的浓度向所述培养基中加入MTT，于暗室中37℃下孵育2小时后，除去上清液，并向所述细胞中立即加入200μl 0.05MHCl的异丙醇溶液。于570nm下，ELISA平板读数器(Labsystems MultiskanBiochromatic type：348)上读取所述培养基的O.D.值，试验在每种情况下至少同样进行三次。将对照组定义为100％，计算细胞的相对生存力。
9.1(b)(2)稳定态荧光各向异性的测定
通过加入溶于四氢呋喃中的最终浓度为0.1μM的DPH-PA(3-[对-(6-苯基)-1，3，5-己三烯(hexatrienyl)]苯基丙酸将1×105细胞/ml悬浮于PBS中的细胞标记并于37℃下孵育10分钟。有机溶剂的加入量为0.05％，以避免其对细胞膜的影响。选择膜探针DPH-PA是因为所述探针的电荷特性，它能使DPH-PA主要集中于所述细胞浆膜的外子叶中，同时二苯基-己三烯部分嵌入脂族酰基链的上部之间(Kitagawa，S.等人，J.MembraneBiol.119：221-227(1991))。DPH-PA与脂质结合具有强荧光增强作用，因而能提供一种评价作为脂质指令作用的荧光各向异性的方法。在37℃下，用在激发和两个发射光路中装有偏振器的Quanta Master QM-1 T-甲酸酯分光光度计(Photon Technology Int.Inc.，NJ，USA)进行荧光测定。激发和发射波长分别为360nm(缝宽5nm)和430nm(缝宽5nm)。将所测定的荧光密度用背景荧光和未标记的样品发射光进行校正。所述荧光各向异性如下计算rs＝(IVV-G.IVH)/(IVV+(2×G×IVH))其中IVV和IVH分别为用偏振器对垂直偏振化的激发光束在水平和垂直方向上测定的密度。因子G等于IVH/IHH并可校正所述一起，使其不能同样地传播不同的偏振化光并且校对所述两个发射通道敏感度上的区别(Kitagawa，S.等人，J.Membrane Biol.119：221-227(1991))。IHV和IHH是当激发偏振器水平放置时于发射偏振器的垂直和水平位置策的的荧光密度。
9.1(b)(3)
数据用平均值±SEM表示。统计学比较和计算用Posthoc Newnan-Keuls试验经方差单向分析进行(Pharmacological Calculatiion System)。统计学意义定义为p＜0.05。
9.1(c)结果
9.1(c)(1)用血清缺乏模型对N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的细胞保护作用进行试验
血清缺乏的WEH1和H9c2细胞已表明其相对的细胞生存力分别为74.8％和50.5％。若在所述培养基中有10-5MN-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐存在，结果几乎所有的WEHI均存活了(93％)并且对H9c2心肌细胞得到较高的保护(82.75％)。血清缺乏可降低细胞相对生存力，而N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐在两种细胞系中对细胞施行了显著的保护。
9.1(c)(2)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对血清缺乏下的哺乳动物细胞流变性的影响
为了测定血清缺乏对培养的哺乳动物细胞浆膜流变性的影响，我们已经通过利用细胞浆膜探针DPH-PA完成了对荧光各向异性的测定。所述细胞浆膜的无理特性因血清缺乏而明显改变。血清缺乏导致在所研究的两种细胞模型中DPH-PA的荧光各向异性显著降低，亦即细胞浆膜流变性异常地升高。通过加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐发现，所述膜的无理状态几乎完全得到保持。显然，这些变化与细胞生存力中所述的倾向是一致的。
9.1(d)讨论
如用MTT法进行试验发现，由于代谢损害，在所研究的两种类型的细胞中正常培养基的缺乏，使得他们的生存力降低，而通过加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐，此作用几乎完全被回复。血清缺乏还会引起细胞浆膜流变性显著变化，已知这与心肌损伤所伴随的膜机能障碍有关。相反地，血清缺乏的细胞在N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐存在下生长，则能部分地保存(或保持)正常细胞浆膜的无理状态。实施例10：胰岛素和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对患STA糖尿病的大鼠肝脏中GRP-94水平的影响10.1背景
缺氧、葡萄糖饥饿以及其他几种反向地影响内质网(ER)功能的症状会诱导可调节葡萄糖的一类应激蛋白(GRP)的合成(Lin，H.Y.等人，Mol.biol.Cell.4：1109-1119(1993))。GRP中的一员94kDa，GRP-94，与90kDa应激蛋白有50％同源性，并且它是一种ER的通道钙-结合蛋白。与其他ER蛋白一起，GRP具有分子伴娘素的功能(Nigem，S.K.等人，J.Bio.Chem.263：1744-1749(1994))。可以假定，分子伴娘素GRP-94的聚积应当对大鼠STZ糖尿病引起的细胞损伤的修复有积极作用。因此，在上述试验中，我们将各种由健康的、患糖尿病的用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗的以及用胰岛素和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗的大鼠的肝脏中不同的GRP-94水平进行比较。10.2材料和方法10.2(a)试验物：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(BIOREX Ltd.)胰岛素(Protophane HM inj.)10.2(b)动物：Crl(VAF plus)Wistar雄性鼠(250-300g)
于相对湿度为50-60％，23-25℃，昼-夜循环12/12小时条件下，将每只笼子中放置7只动物，并提供进食和饮水的自由通道。10.2(c)糖尿病的诱发：在绝食状态下施用单一剂量的STZ(45mg/kgi.v.)。10.2(d)将动物分成如下各组：a健康动物1、用生理盐水治疗1周的健康动物(n＝5)2、用生理盐水治疗2周的健康动物(n＝5)3、用生理盐水治疗4周的健康动物(n＝5)4、用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗1周的健康动物(n＝7)5、用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗2周的健康动物(n＝7)6、用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗4周的健康动物(n＝7)b患STZ-糖尿病的动物7、用生理盐水治疗1周的患糖尿病动物(n＝5)8、用生理盐水治疗2周的患糖尿病动物(n＝5)9、用生理盐水治疗4周的患糖尿病动物(n＝5)10、用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗1周的患糖尿病动物(n＝7)11、用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗2周的患糖尿病动物(n＝7)12、用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗4周的患糖尿病动物(n＝7)c用胰岛素治疗的患STZ-糖尿病动物13、用胰岛素治疗1周的患糖尿病动物(n＝7)14、用胰岛素治疗2周的患糖尿病动物(n＝7)15、用胰岛素治疗4周的患糖尿病动物(n＝7)d用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐和胰岛素治疗的患糖尿病动物16、用胰岛素和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗1周的患糖尿病动物(n＝7)17、用胰岛素和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗2周的患糖尿病动物(n＝7)18、用胰岛素和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗4周的患糖尿病动物(n＝7)
治疗后，取出肝脏并立即于-70℃液氮中冷冻。N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗(无论哪种情况均适用)：20mg/kg/天，p.o.。胰岛素治疗：一日两次维持正常葡萄糖水平所需的剂量。10.2(e)GRP-94水平测定
由大鼠肝脏中萃取所有的可溶性蛋白
所有步骤均在0-4℃下进行。将大鼠肝脏(约15-20g)用家用混合器于80ml含50mM Tris-HCl pH8.0.5mM EDTA，150mM NaCl，0.1％SDS，1％Triton X-100和1-1mM蛋白酶抑制剂(PMSF、苄脒、氨基-己酸)的被修饰的单一去污剂溶胞缓冲液中匀化2分钟。于Servile RC 28S离心机中将所述组织匀浆于2000×g下离心30分钟。将大部分上清液冷冻至-20℃，成为贮存样品。用1ml进行分析。
用调至5mg/ml的三个平行样品经Bradford试验(Guide to proteinPurification，Methods in Enzimology，vol.182，M.P.Deutscher(Ed.)，Academic Press(1990))测定蛋白质浓度。
电泳和蛋白质印迹法
Molecu-lar Cloning，A Laboratory Manual.Ed.Sambrook，Fritsche，Maniatis，Bold Spring Harbor Labo-ratory Press(1989)；Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane，3.Laboratory Manual，Millipore；and U.K.Laemmli，Nature：227：680-685(1970).中详细描述了电泳和蛋白质印迹法试验室方法。将每一含有1.8mg蛋白质的样品用0.6ml含有110mM Tris-HCl pH6.8，8.3mM乙硫醇，3％SDS，3％甘油和某些溴代苯酚蓝的缓冲液溶解并于室温下振摇30分钟，用于凝胶电泳。在50V恒定电压下，每一条带用30μg蛋白质于8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳过夜。蛋白质可以用Coomassie Brilliant Blue R-250染色，或者于转移缓冲液(10mM CAPS，pH11，10％甲醇)中，在4℃、恒定电流(300mA)下转移到Immobilne PVDF膜(微孔)上，进行3小时。于40℃下将所述膜的非特异性部位用2％BSA的TPBS溶液(含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲生理盐水)阻断过夜。在室温下将印迹与1∶3000稀释的GRP-94单克隆抗体(SPA-850，StressGen)一起孵育1小时，然后将其用TPBS缓冲液再洗涤1小时并与同抗-大鼠次生抗体(Sigma，1∶4000稀释)结合的辣根过氧化物酶一起孵育1小时。在用TPBS充分洗涤后，将所述膜制成ECL系统(Amersham)。
将总蛋白(9/1样品)系列稀释液进行印迹并每次制成平行样品，计算标准曲线。用Bio-Rad光密度计(1650型)和Hewlett-Packard Integrator(11P3394A)定量地测定所述应激蛋白含量变化并根据标准曲线进行校正。
统计学分析
数据用平均值±SEM表示。利用Posthoc Newman-Keuls试验(Pharmacological Calculation System)经过方差单向分析进行统计学比较和计算。统计学意义定义为p＜0.05。10.3结果
对患糖尿病的大鼠进行观察，1周、2周和4周时，GRP-94的相对含量明显降低，但用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗，对患糖尿病动物的此作用在1周和2周内可以完全被恢复，仅施用胰岛素或者与N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐一起施用，1周和2周的样品中，此蛋白质水平几乎是对照的两倍。
与上述结果相反，对患糖尿病的大鼠仅用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗周，结果GRP-94的相对量没有明显改变。而且，在两个用胰岛素治疗组中，不论用或者不用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐治疗，我们发现，GRP-94水平均恢复到对照水平。实施例11：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对保护表皮细胞免受热或紫外线处理引起的损害的作用11.1材料和方法
HaCaT细胞系是一种取自正常成人皮肤的本能地不致致死的ancuploid人角质化细胞系(Boukamp等人，J.Cell Biol.106：761-771(1988))。HaCaT是一种具有完全表皮分化能力、正常角质化和nontumorogen特征的细胞系，此种具有高ditharnol敏感性的快速繁殖的角质化细胞系的特征还在于存在甾类受体。将HaCaT细胞(每个直径为35mm的Petri培养皿中4×105个细胞)接种并在37℃潮湿的5％CO2气氛下于补充有5％牛胎血清的DMEM(Gibco，Cat.No.011-6290H)中生长。培养24小时后，培养基用PBS清洗并用热或光处理。
将融合的细胞培养基用热(42、44、46、47、48℃)或紫外线(UVA1、2、4、6J/cm2)处理。热处理用循环水浴来完成。紫外光源用最终输出能量谱在320-390nm，峰值为360nm的Waidmann PUVA4000。用装有UVA和UVB传感器的IV-1700放射量计监控所述能量输出。
用相对比显微镜观察对所述细胞的形态进行检测。下列因素被认为是细胞毒性指标：(a)粘连细胞密度降低；(b)随分子间距离的增大，有规律的“鹅卵石”模式减少；(c)细胞形状发生变化，例如被妨碍的细胞伸长、膨胀、收缩、破碎；和(d)细胞质变化，例如变稠或有空泡形成。用Trypan-蓝排阻试验也可测定细胞的生存力。11.2结果
HaCaT角质化细胞对热激的敏感性可通过考察其生存能力检测到。结果表明，于48℃温度下，热处理24小时后，于37℃对照(100％)相比，实际上已没有存活的细胞存在(2.7％)。HaCaT角质化细胞在45℃热处理后24小时的生存能力证实为59％。HaCaT培养基在热处理1小时后，细胞形状没有发生变化。于46℃或更高温度下热处理后24小时，发生了显著的(p＜0.01)细胞分离和细胞形态变化，例如随着细胞间距的增大，有规律的“鹅卵石”模式减少，HaCaT角质化细胞膨胀、收缩并且有空泡形成。UV处理后发现，存活细胞减少量直接与UVA的剂量有关。
用热(42℃，1小时)或N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(浓度为5×105M，1小时)预处理所述细胞，可保持所述细胞免受48℃热处理的损害。当对48℃处理后24小时的细胞进行检测时发现，与未经处理的细胞相比，所述细胞的生存能力增至48％(当用42℃预处理时)和84％(用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐预处理)。在结合处理(42℃和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐)的情况下，可观测到最显著的保护作用(生存能力升高140％)。
用42℃，但不是44℃和45℃进行热处理，可使得紫外光引起的细胞毒性明显降低。用42℃处理，可取得对2和4J/cm2下的保护。与未经预处理的UV处理的细胞(100％)相比，处理的HaCaT角质化细胞的生存能力提高至132％(于2J/cm2)和215％(于4J/cm2)。实施例12：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对在人皮肤组织中诱导分子伴娘素表达的作用
紫外的UVB光(290-320nm)是目光中的一种组成成分并且已知它会引起皮肤损伤。我们对N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐在减轻UVB照射后皮肤组织损害所引起的作用以及N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐在提高皮肤组织中分子伴娘素表达上的作用进行了研究。12.1材料和方法
将人皮肤组织移植到有免疫缺陷的(SCID)小鼠身上。所述试验方法包括将一组小时用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(5.0mg/kg i.p.)而另一组用溶剂的NaCl溶液(300μl)处理7天，在第8天时，将两组小时用UVB光(100J/cm2)照射24小时，照射后，取皮肤活组织，进行组织化学(切片用苏木精和曙红染色)和免疫组织化学检查(用单克隆抗体mAB的间接免疫荧光技术)。12.2结果
对于用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐预处理的经UV照射的小鼠，没能观察到因UV照射所引起的损伤临床症状。相反地，在一只未经处理的小鼠身上，我们发现了移植浓疱反应。另外，用mAB hsp72进行间接免疫荧光研究发现，在沿人和用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理的小鼠劈的经基膜区域有较强的线性染色，而此同一反应则在未经处理的动物皮肤上没能观察到，而且，在未经处理的动物的浓疱(皮肤炎症反应)上还存在有染色清晰的粒细胞。
因此，向皮肤组织中施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐，结果会增强皮肤组织中hsp72的生成并且可提供保护以不受UV照射的损伤。12.3皮肤中HSP-70水平的测定：对取自移植到SCID小鼠身上的用UVB和UVB+N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理的人皮肤中的蛋白质进行蛋白质印迹分析。
方法：
a.由皮肤中萃取所有的可溶性蛋白
所有步骤均在室温下进行。将皮肤(约9-35mg)切成小块并于Eppendorf管中，在浓缩两次的Laemmli缓冲液(65mM Tris-HClpH6.8，5mM β-乙硫醇，2％SDS，10％甘油，0.1％溴代苯酚蓝；所有材料均是Sigma的产品)中用冷冻了的玻璃棒匀化2分钟。然后将样品在继续振摇下再溶解60分钟。在加到凝胶上之前，将所述组织匀浆于1000rpm下离心10分钟。
b.电泳和蛋白质印迹法[5，7，8]
在50V恒定电压下，每一条带用10μg样品于8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳过夜。蛋白质可以用Coomassie Brilliant Blue R-250染色，或者于转移缓中液(10mM CAPS，pH11，10％甲醇)中，在4℃、恒定电流(300mA)下转移到Immobilne PVDF膜(微孔)上，进行3小时。于4℃下将所述膜的非特异性部位用2％BSA的TPBS溶液(含0.1％Tween20的磷酸盐缓冲生理盐水)阻断过夜。在室温下将印迹与1∶1500稀释的HSP-70单克隆抗体(SPA-8dc，StressGen)一起孵育1小时，然后将其用TPBS缓冲液再洗涤三次，1小时，并与同抗-大鼠次生抗体(Sigma，1∶1500稀释)结合的辣根过氧化物酶一起孵育1小时。
在用TPBS充分洗涤(三次)后，将所述膜制成ECL系统(Amersham)。实施例13：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐在激活HSP形成和保护氧化磷酸化中的作用
13.1背景
已知将酿酒酵母细胞进行热处理(42-44℃下5分钟)，结果会导致对氧化磷酸化和线粒体电子传输系统的联结损害，从而影响所述细胞合成ATP的能力(Patriarca等人，Biochemistry and Cell Biology，70：207-214，1992)。但是，所述细胞在热激前于37℃下较短的期间内用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐预处理，结果减轻了所述的联结损害而且保护了线粒体ATP的合成。在热激期间，细胞质RNA或对称合成的抑制显然会阻止对这种线粒体活性的保护。因此，hsp其中的一个作用似乎是当细胞处于生理应激例如热激时，起到对氧化磷酸化作用和线粒体电子传输系统联结的保护作用。
在本节中，热激前向细胞中施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐并对其保护氧化磷酸化与线粒体传输系统的联结免受热激的作用进行考察。
还需要研究的是，酵母细胞在处于各种应激条件下，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐是否可以调节AP-1和P1转录因子的活性。
13.2材料和方法
用于测定酿酒酵母细胞氧化磷酸化和线粒体ATP合成损害的试验方法如Patriarca等人于Biochemistry and Cell Biology，70：207-214，1992中所述，所述文献作为本文的参考文献。
向保持在25℃下的酿酒酵母细胞中引入各种浓度的N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(浓度介于10-100μM之间)，然后将细胞在N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐存在下于25℃下孵育1小时。然后将温度升至42℃并如Patriarca的参考文献中所述进行氧谱(oxygraph)测定。
用RNA印迹法，对用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理的细胞进行hsp基因伴行性诱导作用试验。由真核细胞中萃取、纯化mRNA以及用RNA印迹法对所获得的RNA进行分析的方法是本领域公知的并且公开于Maniatis和Maresca等人的Archives MedicalResearch 24：247-249(1993)，这两篇文献作为本文的参考文献。所述RNA印迹法在上述实施例7中也已有所描述。将Hsp26和hsp70 DNA序列用作探针。
13.3结果
13.3.1
图4是对酿酒酵母细胞中诱导的hsp26 mRNA的RNA印迹分析，表明试验所得结果，其中给出了给所述细胞施用的化学化合物的浓度和在所述化合物中的孵育时间。
将所述细胞在N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(10-100μl)存在下于25℃下孵育5分钟至1小时，可观测到对hsp26的诱导作用。所述结果还表明，在孵育5分钟后就可以发生所述诱导作用。
我们还发现，浓度介于10或100μM之间的试验化合物对于减轻因热激引起的氧化磷酸化和线粒体电子传输系统间的联结损害是有效的。当将所述细胞处于中介温度37℃对其进行预处理时，也可在一定范围内获得对线粒体ATP合成的保护作用(40％-60％保护)。
13.3.2
苄醇对(a)腺苷酸环化酶活性和(b)牛甲状腺质膜物理状态的作用如图5中所示的苄醇对(a)腺苷酸环化酶活性和(b)牛甲状腺质膜物理状态的作用。腺苷酸环化酶(a)活性变化用基础(o-o)、TSH-激活的(-)、二萜衍生物-激活的(△-△)、霍乱毒素-激活的(-)和氧化物-激活的(◇-◇)酶活性表示。在加入偶合因子之前，将质膜与药物一起孵育，根据嵌入所述质膜中的可观测到的荧光基团的稳态荧光各向异性对所述质膜的物理状况进行评价：DPH(o-o)、12-AS(-)和TMA-DPH(△-△)。在37℃下进行测定，荧光基团/脂质摩尔比通常为1∶500。
试验证明，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对AP-1活性具有显著作用并且其作用可通过所述细胞的实际代谢条件得到测定。如果提供的营养物质适宜的话，则N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐可提高AP-1的活性，在富养培养基中，其可降低所述因子的活性。在致密后期对数培养基(dense late logculture)中，所述药物的作用最明显。对P1则可观测到相反的作用。若在最低培养基中向细胞施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐，则会降低其活性。可以想象的是，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐诱导AP-1激活从而引起细胞抗-应激机能的较大程度的变化，引起P-1调节作用降低。应当注意的是，P-1可对所有类型的应激产生应答，但其活性不会受到所试验物质的影响。我们的许多重要发现，特别是对于AP-1，可以对所述药物的体内活性的许多问题作出解释，而下文还将作更详细的讨论。
图6说明了N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)对在组织培养基中hsp基因表达的影响。将HeLa细胞用报导质粒结构转染，其中将人hsP70基因的启动子融合到荧光素酶报导基因中。热激和/或N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对hsp启动子的作用可以通过在发光仪中测定荧光素酶的活性来确定并且可以通过根据蛋白质印迹测定hsp蛋白水平(染色体基因表达的)来确定。
样品为：
1：无DNA对照；2：t0时10μg被转染的DNA，无热激；3：t0 60分钟时10μg被转染的DNA，24小时后热激；4：如上所述+t0时N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐；5：t0时10μg被转染的DNA+t0时N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐；6：t0 60分钟时10μg被转染的DNA，24小时后热激，热激时加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐；7：t0 60分钟时10μg被转染的DNA，24小时后热激，在时间为0和热激时加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐；8：t0时10μg被转染的DNA，无热激，在时间为0和之后24小时时加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐。实施例14：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐在肿瘤细胞中的诱导分子伴娘素表达作用
非致死热激可将NK细胞介导的溶胞作用的敏感性提高1.5倍并且经热激结合用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理对K562细胞的溶胞性(lisability)具有协同作用，这增强的作用是由于N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐显著地增强了质膜中hsp72的表达所致，因为体内抗体阻断作用的研究(用hsp72特异性单克隆Ab)揭示了一种对NK-溶胞的较强抑制作用。
图7表明了N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对热激诱导的hsp72水平的影响。单独使用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐不能提高hsp72的水平，而将热激和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理相结合，结果与单独热激相比，会显著增强hsp72的表达。14.1背景
已知热激蛋白位于细胞质中，它们具有各种不同的分子伴娘素功能。但有报道认为，在肿瘤细胞中，细胞膜表面也会表达hsp(Ferrarini，M.等人，Int.J.Cancer，51，613619(1992))。试验似乎说明，细胞表面hsp的增强是因为肿瘤细胞受到非致死热激所引起，而这种增强则与IL-2特异性、CD-3天然杀伤细胞(NK)对肿瘤细胞的敏感性提高有关，有报导认为，由于NK细胞参与了体内浸入并杀死细胞过程(Kurosawa，S.等人，Eur.J.Immunol，23：1029(1993))，因此，NK细胞对肿瘤细胞的敏感性的提高会更有利于NK细胞对肿瘤细胞寻靶作用。因而，如果在肿瘤细胞中诱导hsp表达，同时增多细胞表达的hsp，则可更有利于NK细胞寻靶并杀死这些细胞。本节中，将对N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对在肿瘤细胞中hsp72的表达的诱导作用进行考察。14.2材料和方法
利用人K562细胞，一种取自患有慢性骨髓性白血病的患者的处于分裂相的mycloid肿瘤细胞系(ATTCC，CCL243)(Lozzio，BC an Lozzio，BBBlood 45：321，1975)。将呈指数生长的细胞在处于非致死温度(42℃)2小时期间用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理，于37℃16小时恢复期后，通过流动-血细胞计数对细胞进行hsp72含量水平试验(Multhoff等人，Int.J.Cancer：61，272-279，(1995))。用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理，结果提高了肿瘤细胞中hsp72的水平。实施例15：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐与脂质膜之间的相互作用，单层试验15.1背景
以信号形式对应激(物理、病理生理应激等)机理进行检测并传导到转录仪上迄今为止不为人知。假定，脂质基质膜的物理状态，七可测定与膜结合的蛋白质的结构和功能，直接涉及对温度变化的知觉并且在热激(HR)条件下，膜结构的紊乱可尤其信号传导，从而诱导HS基因的转录。与应激耐量的诱导相似，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐表现出可增强测定细胞的功效并通过调整默写分子伴娘素基因表达，以信号形式发出各种应激。
已知，用单分子脂质层于空气-水界面层展开单层技术是验证膜和膜活性剂之间是否存在相互作用的一种有效方法。在许多方面，双层系统与各自单层系统极为相似(膜组成的分子面积、磷脂酶的作用。所嵌入的蛋白质的定位等)。通过测定因分子嵌入单层而引起的表面压力变化，从而有可能认识分子间相互作用的程度。
在所述细胞膜中可能会发生某些N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐在应激应答中会较早地诱导触发行为，这种假设成立的决定性先决条件是有N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐与膜结构直接的相互间发生物理作用的证据。本试验的目的在于通过用不同的脂质单层作生物膜的模型系统来考察N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐与膜之间的相互作用。15.2材料和方法
在KSV3000 Langmuir-Blodgett仪器(KSV Instruments Ltd.Helsinki，Finland)上，于25℃体积为6.5ml而表面积为8.5cm2的Teflon培养皿中进行单层试验。将由1，2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、蛋黄磷脂酰甘油(EggpG)或牛心脂(BHCL)构成的单分子脂质层于脂质的氯仿溶液中扩展开，在10mM Na-磷酸盐(PH7.0)的下相(subphase)上得到所需起始表面压力。将下相继续用磁棒搅拌。通过Teflon室中与下相相连的一个小孔在所述单层的下面加入溶于水中的N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐。注射量通常为小于总下相体积的1％。用铂板经Wilhelmy法测定表面压力。利用Langmuir-Blodget测量系统的LB5000软件由原始数据中筛选出表明压力增高的数据。15.3结果
通过测定药物在空气-水界面扩展开的脂质单层上所引起的表面压力的增大对N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐与不同磷脂之间的相互作用进行试验(图8)。本试验中已发现，所述单层由DPPC、EggPG和BHCL构成并且向所述下相中加入两种浓度(10-6M，10-5M)增长量的N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐。在脂质单层下加入药物，结果会引起表面压力增大，这取决于在所有情况下下相中N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的浓度。但是，对于不同的脂质单层，其表面压力存在显著区别。在两性离子DPPC情况下，注射N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐后，压力会迅速变化，然后保持在一恒定水平。当用含负电荷BHCL单层时，表面压力表现为一种典型的插入动力学，即压力升高约2分钟后，其达到一平衡水平。在PG存在下，所述药物的插入动力学与BHCL情况下观测到的相似，但是，当达到某一数值后，压力开始下降。压力下降的速度取决于所述下相中所述药物的浓度。对于这种现象，一种可能的解释是，由于即使达到纯脂质单层的起始压力以后，压力继续降低，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐-EggPG复合物由所述界面脱离下来。
为了对N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐与脂质单层之间的特异性相互作用得到更进一步的认识，则在不同起始压力下，对所述药物引起的表面压力的增大进行测定(图8)。对起始表面压力高低的推断方法是分子的限制嵌入压力的评价，此时不再能嵌入所述单层中。所述推断的限制起始表面压力对BHCL和BPPC来讲分别为89mN/m和39mN/m。对于含有负电荷的BHCL单层，压力的增长通常大于两性离子DPPC情况下所获得的结果。表明，静电间的相互作用更为重要。
我们的试验首先表明，当以生理上相应的浓度施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐时，其可以头端基团特异性方式与脂质膜相互作用。
图8表明了N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)和单层脂质层之间的相互作用。箭头表示以所述浓度向所述下相中加入N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐。图9表明在不同起始压力下，在BHCL或DPPC单层的下面注射N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐后，表面压力的增长情况。所述下相中N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的浓度为10μmol。试验数据用线性回归分析，结果对于BHCL和DPPC单层来讲，相关系数分别为0.844和0.995。实施例16：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对细胞毒素细胞因子和环己酰亚胺的保护作用16.1背景
本试验的目的是研究细胞因子的产生与病理生理变化之间可能存在的关系，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐似乎对此具有保护作用。
试验数据表明，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐是用细胞毒素细胞因子处理的组织培养细胞的细胞保护剂。用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理，提高了用TNF处理的WEHI164(及其他哺乳动物)细胞的存活率。此作用以来于浓度，但与药物浓度之间没有直接的比例关系。尽管在所有试验中均明显表明，经处理的细胞对细胞毒素细胞因子具有提高的耐受力，但N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理所能提供的保护程度则随试验的不同而不同。尽管N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理所提供的保护并不很强，但是对于活动物来讲，这样的保护程度对于调节或防止病理生理过程已经足够了。16.2试验目的
对血清TNF水平和STZ糖尿病患者和对照动物的巨噬细胞的诱导性进行测定。在患糖尿病的第一个月中，与未患糖尿病的大鼠相比，STZ-引起的患糖尿病鼠(6-18周龄)PS-诱导的血清TNF活性明显增强。16.3结果
患糖尿病一组的平均血清TNF浓度(经发射免疫测定)明显高于(480±96/ml)健康对照组(345±48U/ml)。(Foss等人也于1992Braz.J.Med.Biol.Res，25，239中报导了人患者身上得到的相似结果)。对于患糖尿病组，血清TNF水平与患糖尿病的时间没有关系。我们在对L929细胞进行的细胞毒性试验中，在患糖尿病的动物的血清中没有发现具有生物活性的TNF。RIA和细胞毒性检测之间的不同表明，存在有较高水平的可溶性TNF受体拮抗剂(保护、抗炎分子)，表明糖尿病并发症与TNF有关。
N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对酵母细胞(以及对不同的、培养的、正常的、二倍体动物或人细胞)具有意想不到的增生作用。在低浓度生长抑制剂抗生素环己酰亚胺存在下，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的作用给人留下深刻印象。在N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐和环己酰亚胺存在下生长的酵母细胞克隆没有表现出基因变化发生率的提高，只是对环己酰亚胺对蛋白质合成的抑制作用的代谢耐受力更强了。
因此对N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的作用的测定结果表明，其增强了AP-1转录因子的活性，并可介导促有丝分裂因子和不同类型应激这两种作用。所述结果还表明，上述试验化合物和类似化合物可影响AP-1以及其他可能的转录因子的解毒性(detixity)，从而保持了生长因子和代谢应激的作用。
图10是由STZ患糖尿病(1)和正常(2)动物身上分离出的巨噬细胞中体外LPS诱导的TNF的形成情况，图11表明N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐所诱导的对角质化细胞的保护作用以免受环己酰亚胺的生长抑制作用，图12表明N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)所诱导的对细胞(表皮细胞)的保护作用以免受环己酰亚胺的毒性作用，图13表明N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)所诱导的对人颈HeLa细胞的保护作用以免受环己酰亚胺的生长抑制作用，图14表明N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)所诱导的对心肌细胞的保护作用以免受环己酰亚胺的生长抑制作用，图15表明在AB1380酵母细胞中，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)对P1转录因子活性的影响，第6行表示平均值，第5行是空缺，图16表明在JF1酵母细胞中，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对P1转录因子活性的影响，第11行表示平均值，图17表明在AB1380酵母细胞中，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对P1转录因子活性的影响，第6行表示平均值，第5行为空缺。实施例17：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐对离体大鼠心脏的心脏保护作用17.1
本试验的目的是对离体但仍处于工作状态下的大鼠心脏中N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的心脏保护作用和抗心率不齐的作用进行研究。17.2方法
在有氧工作灌注10分钟后，将心脏(每组中n＝10)进行10分钟冠状动脉闭合，3分钟后，在分别为0.05、0.5、5.0、20.0和50mg/LN-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐存在下进行再灌注。
在另一项试验中，分别在将心脏离体之前1和5小时时，将大鼠用更有效剂量(20mg/kg)的N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐预处理。在分离出心脏后，将其进行上述冠状动脉闭合，而灌注是在有/没有20mg/1N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐存在下进行。
在不同试验中，对热激、局部缺血、N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐以及它们间的相互组合下对心肌中HSP-70对比含量的影响进行研究。将离体心脏进行15分钟热激(42℃)，完全处于正常体温下进行局部缺血和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐灌注，分别与120分钟和180分钟后进行再灌注。17.3结果
在局部缺血之前，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐以铃形浓度-应答关系提高冠状动脉血流(CF)，而降低浓度的药物不会引起其他心脏功能参数的改变。在局部缺血前，50mg/L的N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐会明显引起心动过缓、主动脉血流(AF)和+dP/dtmax降低以及左心室舒张末期压力(LVEDP)升高。在对照组中，冠状动脉闭合可明显降低CF、AF、+dP/dtmax并升高LVEDP。N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐可以铃形浓度-应答关系减轻因局部缺血所引起的心脏功能噁化。浓度为20mg/L的N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐表现出最显著的抗局部缺血作用。在再灌注10分钟后，对于所有对照组的心脏，冠状动脉闭合可引起心室纤维性震颤(VF)。较高浓度的N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐，结果会呆滞剂量-依赖性抗心率不齐作用。
预处理后1小时，用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐仍会取得心脏保护作用并且可增强所述化合物的急性作用。预处理后5小时，不能观测到心脏保护作用，但是，提高了一些灌注N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的急性作用。
单独的所述化合物不能提高心肌中HSP-70的含量，热激可明显提高胸廓(Stetgocardial)中HSP-70的含量，而局部缺血会略微提高HSP-70的含量。然而，当在20mg/1N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐存在下进行局部缺血诱导时，HSP-70的含量大体会升至热激后所观测的水平。
总之，N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐具有抗局部缺血和抗心率不齐的作用。对离体大鼠心脏，浓度为20mg/l时，会通式产生显著的抗局部缺血和抗心率不齐的作用。尽管1小时后，所述药物直接抗局部缺血的作用不明显，但通过N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的急性处理，其仍会提高保护程度。N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐与局部缺血应激可一起诱导大鼠心脏中HSP-70快速合成。单独的N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐则不能影响HSP-70的合成。
图18-19表明了由对照、热激、局部缺血处理、N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理(B)和局部缺血+N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理(局部缺血+B)的大鼠在2(图18)和3小时(图19)恢复期后经蛋白质印迹法测定的hsp蛋白质水平。实施例18：分子伴娘素-增强剂N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐在防止和修复皮肤损伤中的作用：对移植到患严重复合性免疫缺陷疾病的小鼠身上的人皮肤对紫外光B的保护作用以及加速患糖尿病的大鼠伤口愈合作用18.1背景
显然，HsP在对处于环境应激下的皮肤进行生理保护作用过程中起着一定的作用。作为分子伴娘素，它们参与了防止和修复因各种接触引起的损伤，例如机械性外伤、光、热和化学损伤、感染等(E.V.Maytin，JID104：448，1995)。在病理条件下，例如糖尿病减弱了某些hsp的功能，这方面也有过报道(M.Cherian andE.C.Abraham，Biochem.Biophys.Res.Com.212：184，1995)。由于N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐已表现出可以作为分子伴娘素-增强剂(Vigh等人，于制备例中)，因此，我们希望所述药物能够增强几乎各种保护和修复机能。
本试验的目的在于对系统(i)和局部性(ii)施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐时，(i)其对因UVB光所引起的移植到患严重免疫缺陷疾病(SCID)小鼠身上的人皮肤的皮肤损伤的保护作用进行研究，(ii)对其加速患SZT-糖尿病大鼠的破坏性伤口愈合过程进行研究。
(i)将用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(5.0mg/kg i.p.)或赋形剂处理的移植了人皮肤的SCID小鼠用UVB光(100mJ/cm2)处理。24小时后，取皮肤活组织进行组织化学分析并用免疫组织化学和蛋白质印迹法对hsP72进行测定。临床和组织化学观测表明，用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐预处理可防止UVB光引起的皮肤损伤。对于用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理的样品，经免疫荧光技术可以观测到线性基膜中增强的hsp染色，并且经蛋白质印迹法测定，hsp72的量被提高了。18.2方法
(ii)用电击探头(直径3mm；60℃30、60和90秒)在链脲佐菌素诱导的糖尿病(STZ)大鼠的胸廓两侧去毛皮肤上形成轻度至重度灼伤，通过局部施用含1％、2％或4％N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的乳膏或赋形剂进行处理，用于测定半对照形式下的伤口愈合情况，并进行相互对比。通过照相并利用数字落射光显微镜技术记录伤口愈合情况。在热损伤后第48小时和第21天，经面积计测定伤口面积。用蛋白质印迹分析测定皮肤活组织样品中hsp72水平。18.3结果
与赋形剂对照相比，用含4％N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的乳膏处理，可明显(p＜0.01)加速伤口闭合并可提高皮肤活组织样品中hsp72的水平。
所得结果表明，施用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐可对UV照射引起的损伤提供保护并可有效地适用于在伤口修复中或外科手术中某些损伤性病症的临床治疗。
图20、21、22表明了含1％、2％、4％N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)的乳膏对伤口愈合的作用，图23、24、25表明了依伤口严重程度所得结果。
图26表明未经处理的和用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)处理的伤口照片。
图27表明由对照、N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)处理的伤口的二氧基样品(dioxy specimen)中hsp72蛋白质水平。
图28表明N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)处理后，hsp72蛋白质的免疫组织化学评价。
图29表明N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(B)处理的和未经处理的(对照)SCID小鼠皮肤样品中hsp72水平。实施例19：对本发明羟胺衍生物对处于应激下的细胞HSP72表达激活作用的评价
a)组织培养条件
将所应用的细胞，3T3和L929鼠成纤维细胞于MEM培养基中培养并以单层形式生长，将U937人白血病细胞置于RPMI-1640培养基中，于悬浮培养基中，而HeLa人上皮细胞于DMEM培养基中并以单层形式培养。细胞培养基如实施例6.2(a)所述，所不同的是细胞是在上述培养基中培养。
b)试验条件
通过在所述药物处理之前和之后施行应激了进行试验。乙氧基可以由热、化学试剂、HgCl2处理引发。试验化合物以10-5M浓度施用。
通过进行3次试验，对细胞毒性进行研究并经MTT评价(Cytotechnology 11：49-58)，表明在浓度大于10-4M时，所有试验化合物均具有50％生长抑制作用，因而，在HSP72试验中，所用浓度不会有明显的细胞毒性作用。19.1热激试验
所述试验用3T3和L-929鼠成纤维细胞以及U-937人白血病细胞进行。
对3T3细胞进行热激的试验如实施例6中6.2(c)中所述，不同之处在于应激于43℃温度下诱导30分钟并且在热激15分钟前或热激后100分钟时用试验化合物处理。
用HSP72特异性的SPA810(StressGene)初级和与A9044(Sigma)结合的辣根过氧化物酶次生抗体进行免疫测定。用LKB Ultrascan XL光密度计进行光密度评价。
结果如表2和3所示。
                         表2
在应激前处理的情况下，本发明羟胺衍生物对3T3细胞中热激诱
              导的HSP72生成的激活作用化合物                            相对于处于应激的对照
                              HSP72水平N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-      +++3-吡啶偕氯代亚胺-马来酸盐5，6-二氢-5-(1-哌啶基)-甲基-(3-吡    +++啶基)-4H-1，2，4-噁二嗪3-(3-吡啶基)-5-[(1-哌啶基)-甲基]-     ++5，6-二氢-6H-1，4，2-二噁嗪-(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-          +苯偕氯代亚胺一盐酸盐N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-N’             +++，N’-二乙基-3-吡啶偕氯代亚胺一盐酸盐3-(3-吡啶基)-5-二乙氨基甲基-5，6-        +二氢-6H-1，4，2-二噁嗪盐酸盐3-苯基-5-[(1-哌嗪基)-甲基]-5，6-二      ++氢-6H-1，4，2-二噁吣盐酸盐/R/-(+)-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙      +++氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺-(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)(-)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧         +++基]-3-吡啶偕氯代亚胺-(Z)-2-丁烯二酸盐(1∶1)N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-        +++萘-1-甲酰胺3-(3-吡啶基)-5-叔丁基氨基-5，6-二        +氢-6H-1，4，2-二噁嗪N-(2-羟基-3-哌啶子基-丙氧基)-氨          +基甲酸乙酯N-[2-棕榈酰氧基-3-(1-哌啶基)-丙        +++氧基]-3-吡啶-甲亚胺酰胺一盐酸盐N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-N’             +++-丙基-脲N-(3-氯-苯基)-N’-[2-羟基-3-(1-哌      +++啶基)-丙氧基]-脲N-(3-哌啶子基-1-丙氧基)-3-吡啶-        +++偕氯代亚胺二盐酸盐O-(3-二乙氨基-丙氧基)-3-吡啶-偕      +++氯代亚胺盐酸盐O-(3-哌啶子基-丙基)-3-硝基-苯偕      +++氯代亚胺盐酸盐1-{[3-(叔丁基氨基)-2-羟基-丙氧       +++基]-亚氨基}-1-(间-三氟甲基-苯基)-乙烷乙酸盐N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-        0氨基甲酸苄酯N-[2-羟基-3-(1-甲基-哌啶鎓-1-        +++基)-丙氧基]-N-甲基-吡啶鎓-3-偕氯代亚胺二碘化物N-己基-N’-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-     ++脲N-环己基-N’-[2-乙酰氧基-3-(1-哌       0啶基)-丙氧基]-脲盐酸盐N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-      +++2-硝基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-      +++3-喹啉甲亚胺酰胺二盐酸盐N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-        0N，N’-二苯基-苄脒N，N-二甲基-N’-[2-羟基-3-(1-哌啶      0基)-丙氧基]-N”-苯基-胍N，N-二甲基-N’-苯基-N”-[3-(1-哌     ++啶基)-丙氧基]-胍盐酸盐N-甲基-N-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-        +苯甲酰胺盐酸盐5，6-二氢-3-(4-氯-苯基)-5-[N-甲基-    ++哌啶鎓-1-基]-甲基-4H--1，2，4-噁二嗪碘化物甲基-{N-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]}-       03-亚氨酸酯马来酸盐N-甲基-N-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-     +++间-三氟甲基-苯甲酰胺盐酸盐N-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-N’-四亚    +++甲基-3-吡啶-脒盐酸盐N-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-N-甲基-       0N’-(正-己基)-脲
                     表3
在应激后处理的情况下，本发明羟胺衍生物对3T3细胞中热激诱
           导的HSP72生成的激活作用化合物                               相对于处于应激的
                                 对照HSP72水平N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-        03-吡啶偕氯代亚胺-马来酸盐N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-        02-硝基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐5，6-二氢-5-(1-哌啶基)-甲基-3-(3-      0吡啶基)-4H-1，2，4-噁二嗪O-(3-哌啶子基-丙基)-3-硝基-苯偕        +氯代亚胺盐酸盐N-[2-棕榈酰氧基-3-(1-哌啶基)-丙        +氧基]-3-吡啶-甲亚胺酰胺一盐酸盐N-己基-N’-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-    +++脲N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-     ++萘-1-甲酰胺N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-4-    ++吡啶偕氯代亚胺-(Z)-丁烯二酸盐(1∶1)N-[2-羟基-3-(1-甲基-哌啶鎓-1-      +++基)-丙氧基]-N-甲基-吡啶鎓-3-偕氯代亚胺二碘化物N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-    +++3-喹啉甲亚胺酰胺二盐酸盐
表中，相对于处于应激的对照水平，0表示经处理应激诱导的细胞中hsp72水平改变±20％，而+，++，+++分别表示hsp72水平升高21-50％，51-100％和＞100％。
用热激U-937白血病细胞和L-929鼠成纤维细胞进行试验，与上述所进行的试验相似，但在这些试验中，通常药物处理先于热激。在试验条件下，试验化合物N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐的浓度为10-5M。
处理结果，可将热激中所诱导的hsp72水平提高50％多。19.2化学试剂诱导的应激试验
此试验用HgCl2对HeLa、人上皮细胞和U-937、人白血病细胞诱导应激应答来进行。在细胞处于应激之前，进行药物处理。如有关3T3细胞的试验中所制备试验培养物并进行处理。药物处理后，将细胞于37℃下孵育15分钟，除了两个培养物(无应激对照)以外，将所有培养物与浓度为0.5μg/ml的HgCl2接触，然后进行孵育。应激后6小时，测定hsp72的诱导量。HgCl2的施用浓度结果导致hsp72水平最大升高15-30％。
对于用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基-氨基苄基氯一盐酸盐和N-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-硝基-氨基苄基氯一盐酸盐处理的HeLa细胞，所述应激所诱导的hsp72水平分别提高了20％多和50％多。
相对于应激对照，对于用N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐处理的U-937细胞，所述应激所诱导的hsp72水平提高了20％多。
                 表4
      本发明羟胺衍生物对大鼠脾移植物中
        热激诱导的hsp72表达的激活作用化合物                               相对于处于应激的
                                 对照hsp72水平N-{3-[(1，1-二甲基-乙基)-氨基]-2-      +羟基-丙氧基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-N     +++’-庚基-脲N-(3-氯-苯基)-N’-[2-羟基-3-(1-哌    +++啶基)-丙氧基]-脲5，6-二氢-5-(1-哌啶基)-甲基-3-(3-      0吡啶基)-4H-1，2，4-噁二嗪对大鼠丸移植物所进行的试验如下所述进行。
在无菌条件下取200g CFY大鼠的睾丸并将释放后的睾丸管悬浮于含有MEM培养基的10％牛胎血清中，按此方法得到5ml含50-100mg的组织悬浮液。将所述移植物于37℃下含潮湿空气的5％CO2中孵育1小时，然后培养物用浓度为10-5M的所述试验化合物进行处理。于37℃下孵育15分钟后，将移植物于43℃下热激30分钟。在37℃下孵育6小时后，测定所诱导的hsp72的量。
结果如表5所示，被提高的hsp72水平按表4中所述相同标准评定。
                表5本发明羟胺衍生物对大鼠睾丸移植物中热激诱导的hsp72表达的激活作用化合物                               相对于处于应激的
                                 对照hsp72水平N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-      +++3-吡啶偕氯代亚胺-马来酸盐5，6-二氢-5-(1-哌啶基)-甲基-3-(3-     ++吡啶基)-4H-1，2，4-噁二嗪N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-      +++苯偕氯代亚胺一盐酸盐N-{3-[(1，1-二甲基-乙基)-氨基]-2-      0羟基-丙氧基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺N-[2-苄氧基-3-(1-哌啶基)-丙氧         ++基]-3-吡啶偕氯代亚胺-(Z)-丁烯二酸盐(1∶1)3-(3-吡啶基)-5-二乙氨基甲基-          ++5，6-二氢-6H-1，4，2-二噁嗪盐酸盐N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-4-       0乙酰氨基苄脒一盐酸盐3-(3-吡啶基)-5-叔丁基氨基-5，6-        0二氢-6H-1，4，2-二噁嗪N-[2-棕榈酰氧基-3-(1-哌啶基)-丙        0氧基]-3-吡啶-甲亚胺酰胺一盐酸盐N-己基-N’-[3-(1-哌啶基)-丙氧         ++基]-脲N-(3-哌啶子基-1-丙氧基)-3-吡啶-       ++偕氯代亚胺二盐酸盐O-(3-二乙氨基-丙氧基)-3-吡啶-偕        0氯代亚胺盐酸盐O-(3-哌啶子基-丙基)-3-硝基-苯偕       ++氯代亚胺盐酸盐1-{[3-(叔丁基氨基)-2-羟基-丙氧         +基]-亚氨基}-1-(间-三氟甲基-苯基)-乙烷乙酸盐N-{3-[1，1-二甲基-乙基)-氨基]-2-       +羟基-丙氧基}-3-三氟甲基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐N-[3-(二乙氨基)-2-羟基-丙氧基]-        +3-三氟甲基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐N-[2-棕榈酰氧基-3-(1-哌啶基)-丙      +++氧基]-3-吡啶-偕氯代亚胺二盐酸盐N-环己基-N’-[3-(1-哌啶基)-丙氧        0基]-脲N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-        +3-硝基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-       ++2-硝基-苯偕氯代亚胺一盐酸盐N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-       ++N’-庚基-脲N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-      +++1-异喹啉偕氯代亚胺二盐酸盐N-甲基-N-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-        +苯甲酰胺盐酸盐5，6-二氢-3-(4-氯-苯基)-5-[N-甲基      +-哌啶鎓-1-基]-甲基-4H--1，2，4-噁二嗪碘化物N-[3-(1-哌啶基)-丙氧基]-噻吩-2-       ++偕氯代亚胺-盐酸盐实施例20：对患有遗传性高血压的大鼠胸主动脉中HSP mRNA水平的测定
将患有遗传性高血压的大鼠分成四组，每组4只。每组每日进行口服处理，第一组用生理盐水处理，第二组用N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐(20mg/kg)处理8天，第三组用N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-3-苯偕氯代亚胺一盐酸盐(5mg/kg)处理20天，第四组N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-2-噻吩一偕氯代亚胺一盐酸盐(5，g/kg)处理20天。将动物处死，分离出主动脉，在液氮中迅速冷冻并于-70℃下贮存，直至使用。b)胸主动脉形态学试验
所述试验按照公开的方法(Br.J.of Pharmacol.，1995；115，515-420)进行。切取面积1mm2的胸主动脉并于室温下固定于2.5％戊二醛中。后固定术(post fixation)于1％四氧化锇中进行1小时。将组织于乙醇中脱水并嵌入到Durcupan ACM中。用Hitachi 7100电子显微镜照相并进行定性评价。
发现，用N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐以及N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-3-苯偕氯代亚胺一盐酸盐和N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-2-噻吩-偕氯代亚胺一盐酸盐处理，可分别以中等程度和较强程度促进主动脉的细胞再生。c)hsp70的定量测定
试验通过定量的反转录聚合酶链反应进行，所述方法的原理是如果两者十分相似，但在相同的PCR反应中，可识别模板被放大，则在所述过程中它们的产物比不变。当已知某一模板的起始量时，其产物的相对量是可以测定的，则可计算出未知的起始模板的量。在最常用的方法中，已知模板(竞争物)和未知模板(靶)的唯一区别是长度不同，竞争物较短，因而根据其大小，则可分离出PCR产物。
用胍鎓-异氰酸盐的方法(Chomczynki P.和SaccI N.：AnalBiochem，162：156，1987)由组织中分离出RNA。在变性条件下用分光度计和琼脂糖凝胶电泳测定核算浓度及其量(Shambrook J等人：MolecularCloning.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbour Laboratory Press，1989)。将分离出的RNA于-70℃下贮存。
通过剪接掉内序列，由hsP70构建片段(PCR-splicing，Riedy MC等人：Biotechniques 18：70，1995)，通过将引物特异性结合到所述结构的外部，将所述片段扩增(Erhch A.：PCR Technology，Principles andApplications for DNA Amplification，Stockton Presss，1989)并在测定所述产物浓度后，将其于-70℃下贮存。
用1μg带有辅助寡dT(dT16)引物的分离出的RNA/样品经常规方法进行反转录(Shambrook J.等人，如上所述)。
将由RNA样品制备的等量cDNA与各种不同量的合成竞争物(由3，10次连续稀释获得)混合并通过聚合酶链反应将模板扩增。环合过程中，所述温度如下：变性(95℃，1分钟)，退火(58℃，1分钟)，合成(72℃，0.5分钟)。
PCR扩增后，于琼脂糖凝胶(1％)上分离出产物，并在常规条件下用溴乙锭染色(Shambrook J.等人，如上所述)。用UV-透明仪摄像，对染色的DNA片段造影。用光密度计由照片的背面测定PCR产物。
发现，用N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐、N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-3-苯偕氯代亚胺一盐酸盐、N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-2-噻吩-偕氯代亚胺一盐酸盐处理的大鼠胸主动脉中，hsp-70水平与对照动物中的hsp-70水平相比高50％多。实施例21：对豚鼠皮肤老化抑制作用的测定
在豚鼠身上测定本发明化合物对皮肤老化的抑制作用。将每组中5只动物的皮肤去毛并用强度为100mJ/cm2的UV-B光源对面积为1cm2的皮肤从两侧进行照射。照射后，将一侧皮肤用本发明实施例10的含5％(w/v)N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-3-吡啶偕氯代亚胺马来酸盐或N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-3-苯偕氯代亚胺一盐酸盐或N-〔2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基〕-2-噻吩-偕氯代亚胺一盐酸盐的乳膏处理，而所述动物的另一侧用不含所述活性成份的相同乳膏处理。此为半对照试验。
照射后，立即开始处理并每日进行两次，共进行两周。
UV-B照射可引起严重的皮肤损伤(水疱、大水疱、上皮损伤以及形成伤口)，如果将所述动物用本发明化合物处理，则可提前4天愈合，而伤口的面积也会明显减小。所述化合物可促进上皮的形成。
试验表明，所述处理可提高皮肤对UV-B照射的耐受力并可促进皮肤再生。
Figure A9619230501261
Figure A9619230501271

Claims (64)

1.一种增强真核细胞分子伴娘素表达的方法，所述方法包括：用有效量的化学化合物处理处于生理应激下的真核细胞，以超出所述生理应激所诱导的量增强细胞的分子伴娘素表达，其中所述化学化合物是式(I)和(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物或其盐和/或其任何一种光学活性立体异构体，其中A是烷基、被取代的烷基、芳烷基、在芳基和/或烷基部分被取代的芳烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基，Z是共价键、氧或＝NR3，其中R3选自氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或在芳基和/或烷基部分被取代的芳烷基，R是烷基或被取代的烷基，式(I)互变异构体中，X是卤素或被取代的羟基或氨基、一取代的氨基或二取代的氨基，和式(II)互变异构体中，X是氧、亚氨基或被取代的亚氨基，和R′是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、含有被取代的芳基和/或烷基的芳烷基、酰基或被取代的酰基，并且式(I)化合物可任选地含有X与活性取代基偶合形成的分子内环结构。
2.根据权利要求1的方法，其中在所述生理应激之前处理所述细胞。
3.根据权利要求1的方法，其中在所述生理应激之后处理所述细胞。
4.一种提高处于生理应激下的真核细胞中分子伴娘素活性的方法，所述方法包括：用有效量化学化合物处理所述细胞，以超出所述生理应激所诱导的量提高所述细胞中分子伴娘素的活性，其中所述化学化合物是式(I)和(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物或其盐和/或其光学活性立体异构体，其中A是烷基、被取代的烷基、芳烷基、在芳基和/或烷基部分被取代的芳烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基，Z是共价键、氧或＝NR3，其中R3选自氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或在芳基和/或烷基部分被取代的芳烷基，R是烷基或被取代的烷基，式(I)互变异构体中，X是卤素或被取代的羟基或氨基、一取代的氨基或二取代的氨基，和式(II)互变异构体中，X是氧、亚氨基或被取代的亚氨基，和R′是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、含有被取代的芳基和/或烷基的芳烷基、酰基或被取代的酰基，并且式(I)化合物可任选地含有X与活性取代基偶合形成的分子内环结构。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求的方法，其中处于所述生理应激下的真核细胞是哺乳动物细胞。
6.根据权利要求5的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述细胞是活生物体细胞。
8.根据权利要求1-7中任一权利要求的方法，其中所述细胞是神经元细胞、肌肉细胞、血管壁细胞，特别是内皮细胞、上皮细胞或免疫系统细胞。
9.根据权利要求1-4中任一权利要求的方法，其中处于应激下的所述真核细胞是植物细胞。
10.根据权利要求9的方法，其中所述植物细胞是活生物体细胞。
11.根据权利要求1-8中任一权利要求的方法，其中所述生理应激是代谢、氧化、局部机理性应激或者由缺氧、局部缺血、热激、放射或有毒物质引起的应激。
12.根据权利要求11的方法，其中所述应激是由糖尿病引起的应激。
13.根据权利要求1-8中任一权利要求的方法，其中所述生理应激可使活性游离基增多或者使细胞环境中细胞因子数量增多。
14.根据权利要求1-8中任一权利要求的方法，其中所述生理应激可引起心血管、血管、大脑、过敏性、免疫、自身免疫性疾病，病毒或细菌病源性疾病，肿瘤，皮肤和/或粘膜疾病或者肾小管上皮疾病或整容手术治疗所引起的病症。
15.根据权利要求14的方法，其中所述心血管疾病是因生理应激引起的动脉粥样硬化，冠状动脉疾病、压力过高症或肺压力过高症。
16.根据权利要求14的方法，其中所述大脑疾病是因生理应激引起的脑血管局部缺血疾病，休克，外伤所致的脑损伤，老年性神经变性疾病，特别是老年性痴呆、AIDS痴呆、酒精性痴呆、早老性痴呆、帕金森病或癫痫。
17.根据权利要求14的方法，其中所述皮肤和/或粘膜疾病是因生理应激所引起的肠胃系统皮肤病或溃疡。
18.根据权利要求1-17中任一权利要求的方法，其中所述分子伴娘素是热激蛋白(hsp)。
19.根据权利要求18的方法，其中所述hsp是hsp70或hsp72。
20.一种治疗与所述分子伴娘素系统相关的或者与细胞或细胞器膜损伤有关的疾病，或者可选择地是预防这些疾病的方法，所述方法包括：给宿主施用有效量的化学化合物以改善生物体的病理性病症，其中所述化学化合物是式(I)和(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物或其盐和/或其光学活性立体异构体，其中A是烷基、被取代的烷基、芳烷基、芳基和/或烷基被取代的芳烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基，Z是共价键、氧或＝NR3，其中R3选自氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，R是烷基或被取代的烷基，式(I)互变异构体中，X是卤素或被取代的羟基或氨基、一取代的氨基或二取代的氨基，和式(II)互变异构体中，X是氧、亚氨基或被取代的亚氨基，和R′是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、含有被取代的芳基和/或烷基的芳烷基、酰基或被取代的酰基，并且式(I)化合物可任选地含有X与活性取代基偶合形成的分子内环结构。
21.根据权利要求20的方法，其中所述病理性病症是局部缺血、肿瘤疾病、病源性微生物引起的感染、自身免疫疾病和皮肤病。
22.权利要求20所述方法用于保护心肌、脑器官和肾免受因局部缺血引起的组织损伤和/或坏死。
23.根据权利要求20-22中任一权利要求的方法，其中所述宿主是人体器官。
24.化学化合物在制备用于治疗下述疾病的药物组合物，或者可选择地是在制备化妆品组合物中的应用，所述疾病有脑病、过敏性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病，因病毒或细菌感染引起的疾病、皮肤和/或粘液疾病及肾小管上皮疾病，其中所述化学化合物是式(I)和(II)所示的互变异构体形式的羟胺衍生物或其盐和/或其光学活性立体异构体，A是烷基、被取代的烷基、芳烷基、芳基和/或烷基被取代的芳烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基或被取代的杂芳基，Z是共价键、氧或＝NR3，其中R3选自氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，R是烷基或被取代的烷基，式(I)互变异构体中，X是卤素或被取代的羟基或氨基、一取代的氨基或二取代的氨基，和式(II)互变异构体中，X是氧、亚氨基或被取代的亚氨基，和R′是氢、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、含有被取代的芳基和/或烷基的芳烷基、酰基或被取代的酰基，并且式(I)化合物可任选地含有X与活性取代基偶合形成的分子内环结构。
25.根据权利要求1-3中任一权利要求的方法以及权利要求24的应用，其中使用如下定义的式(I)羟胺衍生物，其中
R是烷基或被取代的烷基，和
(a)Z是共价键和X是卤素；
(b)Z是共价键和X是被取代的羟基-OQ，其中Q是烷烃，并且所述化合物可任选地含有X与活性取代基R偶合形成的分子内环结构；
(c)Z是共价键和X是NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H、直链或支链烷基、被取代的直链或支链烷基、环烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元饱和环，并且所述化合物可任选地含有X与活性取代基R偶合形成的分子内环结构；
(d)Z是氧和X是被取代的羟基-OQ，其中Q是烷烃；
(e)Z是氧和X是-NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H、直链或支链烷基、被取代的直链或支链烷基、环烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元饱和环；
(f)Z是＝NR3，其中R3是H、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基或者带有被取代的芳基或被取代的烷基的芳烷基，和X是-NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H、直链或支链烷基、被取代的直链或支链烷基、环烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元饱和环。
26.根据权利要求25的方法，其中R是在氨基和/或烷基上可被任选取代的ω-氨基-烷基并且所述烷基链优选含有3-8个碳原子，并是可被羟基或酰氧基取代的直链或支链烷基。
27.根据权利要求25或26的方法，其中R是在所述氨基上被一或二取代的ω-氨基-烷基，其中所述氨基取代基分别独立地是一个或两个直链或支链烷基或环烷基，或者所述两个氨基取代基与它们所连接的氮原子一起形成可含有一个或多个其他杂原子的3-7元，优选5-7元饱和杂环。
28.根据权利要求25-27中任一权利要求的方法，其中Z是化学键和X是卤素，优选氯或溴，并且A是芳烷基，芳基和/或烷基被取代的芳烷基，芳基，被取代的芳基或杂芳基。
29.根据权利要求28的方法，其中A是未被取代的或可带有一或多个取代基，优选烷氧基的被取代的苯基烷基，苯基，被卤素、烷基、烷氧基或卤代烷基或硝基取代的苯基，萘基，或可与苯环稠合的含氮杂芳基，优选吡啶基，或含硫或含氧杂芳基。
30.根据权利要求25-27中任一权利要求的方法，其中Z是化学键和X是式-OQ被取代的羟基，其中Q是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，芳烷基或在芳基和/或烷基上被取代的芳烷基和A是杂芳基，优选含氮杂芳基。
31.根据权利要求1-23中任一权利要求的方法或权利要求24的应用，其中所述式(I)羟胺衍生物，其中
R″是烷基或被取代的烷基，和
A是未被取代的或被取代的芳基或杂芳基。
32.根据权利要求31的方法，其中R″是在所述氨基和/或烷基上可被取代的ω-氨基-烷基，并且所述烷基链优选含有1-5个碳原子。
33.根据权利要求31或32的方法，其中R″是在所述氨基上被一或二取代的ω-氨基-烷基，其中所述氨基取代基分别独立地是一个或两个直链或支链烷基或环烷基，或者所述两个氨基取代基与它们所连接的氮原子一起形成可含有一个或多个其他杂原子的3-7元，优选5-7元饱和杂环。
34.根据权利要求25-27中任一权利要求的方法，其中
Z是化学键，
X是-NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，环烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和环，和
A是芳烷基，芳基和/或烷基被取代的芳烷基，未被取代的或被取代的芳基或杂芳基。
35.根据权利要求34的方法，其中A是苯基烷基，在苯基上可带有一或多个取代基，优选烷氧基的苯基烷基，苯基，被一个或多个烷基、卤素、烷氧基、卤代烷基、硝基或酰氨基取代的苯基，萘基，或可与苯环稠合的含氮杂芳基，优选吡啶基，或含硫或含氧杂芳基。
36.根据权利要求1-23中任一权利要求的方法或权利要求24的应用，其中式(I″)羟胺衍生物，其中
R″是烷基或被取代的烷基，
A是未被取代的或被取代的芳基或杂芳基，和
R1是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，环烷基，芳烷基，或芳基和/或烷基被取代的芳烷基。
37.根据权利要求36的方法，其中R″是在所述氨基和/或烷基上可被取代的ω-氨基-烷基，并且所述烷基链优选含有1-5个碳原子。
38.根据权利要求36或37的方法，其中R″是在所述氨基上被一或二取代的ω-氨基-烷基，其中所述氨基取代基分别独立地是一个或两个直链或支链烷基或环烷基，或者所述两个氨基取代基与它们所连接的氮原子一起形成可含有一个或多个其他杂原子的3-7元，优选5-7元饱和杂环。
39.根据权利要求34的方法，其中A是苯基，被一个或多个烷基、卤素、烷氧基、卤代烷基或硝基取代的苯基，萘基，或可与苯环稠合的含氮杂芳基，或含硫或含氧杂芳基。
40.根据权利要求25-27中任一权利要求的方法，其中
Z是氧，
X是-OQ，其中Q是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，优选C1-4烷基，芳烷基，或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，
A是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，芳烷基，或芳基和/或烷基被取代的芳烷基。
41.根据权利要求25-27中任一权利要求的方法，其中
Z是氧，
X是-NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，环烷基或未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和环，和
A是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，芳烷基，或芳基和/或烷基被取代的芳烷基。
42.根据权利要求25-27中任一权利要求中的方法，其中
Z是＝NR3，其中R3是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，芳烷基或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，
X是-NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，环烷基或未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和环，和A是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，芳烷基，或芳基和/或烷基被取代的芳烷基。
43.根据权利要求1-23中任一权利要求中的方法和权利要求24的应用，其中所述式(II)羟胺衍生物，其中
R是烷基或被取代的烷基，和
a)Z是化学键和X是氧，或
b)Z是化学键和X是＝NR4，其中R4是H或未被取代的或被取代的烷基或环烷基，
c)Z是氧和X是氧，
d)Z是氧和X是＝NR4，其中R4是未被取代的或被取代的烷基，芳烷基或芳基；或杂芳基，
e)Z是＝NR3，其中R3是H，未被取代的或被取代的烷基，芳基，芳烷基，和X是氧，
f)Z是＝NR4，其中R3是H或未被取代的或被取代的烷基，芳基或芳烷基和X是＝NR4，其中R3是H或未被取代的或被取代的烷基或芳烷基或环烷基。
44.根据权利要求43的方法，其中R是在所述氨基和/或烷基上可被取代的ω-氨基-烷基，并且所述烷基链优选含有3-8个碳原子，并且是可被羟基或酰氧基取代的直链或支链烷基。
45.根据权利要求43或44的方法，其中R是在所述氨基上被一或二取代的ω-氨基-烷基，其中所述氨基取代基分别独立地是一个或两个直链或支链烷基或环烷基，或者所述两个氨基取代基与它们所连接的氮原子一起形成可含有一个或多个其他杂原子的3-7元，优选5-7元饱和杂环。
46.根据权利要求43-45中任一权利要求的方法，其中
Z是化学键，
X是氧，和
R′是H、未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，芳烷基，或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，和
A是未被取代的或被取代的芳基或芳烷基；或杂芳基。
47.根据权利要求46的方法，其中A是苯基，被一个或多个烷基、卤代烷基或烷氧基取代的苯基，芳烷基，芳基和/或烷基被取代的芳烷基或含氮杂芳基或含硫杂芳基。
48.根据权利要求43-45中任一权利要求的方法，其中
Z是化学键，X是＝NR4，其中R4是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，芳烷基，芳基和/或烷基被取代的芳烷基，或环烷基，和
R′是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，芳烷基，芳基和/或烷基被取代的芳烷基，和
A是芳烷基，芳基和/或烷基被取代的芳烷基，未被取代的或被取代的芳基或杂芳基。
49.根据权利要求48的方法，其中A是苯基烷基，苯环上被一个或多个烷氧基取代的苯基烷基，苯基，被一个或多个烷基、卤代烷基或硝基取代的苯基，萘基含含氮杂芳基，优选吡啶基，或含硫杂芳基。
50.根据权利要求43-45中任一权利要求中的方法，其中Z是氧，X是氧，R′是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，芳烷基或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，和
A是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，芳烷基，或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，
51.根据权利要求43-45中任一权利要求中的方法，其中Z是氧和X是＝NR4，其中R4是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，芳烷基，芳基和/或烷基被取代的芳烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或未被取代的或被取代的杂芳基，和R′是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，芳烷基或芳基和/或烷基被取代的芳烷基。
52.根据权利要求43-45中任一权利要求中的方法，其中Z是＝NR3，其中R3是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，芳烷基或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，X是氧和R′是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，芳烷基或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，或酰基，A是未被取代的或被取代的烷基，芳烷基，芳基或杂芳基或环烷基。
53.根据权利要求52的方法，其中A是未被取代的或被取代的直链或支链含有4-12个碳原子的烷基，环烷基，未被取代的或被取代的苯基烷基，苯基，被一个或多个卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基或硝基取代的苯基或含氮杂环基。
54.根据权利要求43-45中任一权利要求中的方法，其中
Z是＝NR3，其中R3是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，芳烷基，或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，
X是＝NR4，其中R4是H，未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，芳烷基，或芳基和/或烷基被取代的芳烷基或环烷基，优选H或烷基，和
R′是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，芳烷基，或芳基和/或烷基被取代的芳烷基，和
A是未被取代的或被取代的直链或支链烷基，或未被取代的或被取代的芳基，优选苯基或被取代的苯基。
55.式(I)化合物，其中
a)X是卤素，优选氯或溴，
Z是化学键，和
a1)A是式(a)基团，其中Y1是卤素，烷氧基，卤代烷基或硝基并且n是1、2或3，
或者含氧杂芳基，优选呋喃基，含硫杂芳基，优选噻吩基，或可与苯环稠合的含氮杂芳基，或其N-C1-4烷基季铵盐衍生物或N-氧化物，优选吡啶基、喹啉基或异喹啉基，
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基、芳基羰基或氨酰基，k是1、2或3和m是1、2或3，或其N-C1-4烷基季铵盐衍生物或N-氧化物，条件是，
当A是吡啶基或萘基或者其中Y1是卤素或烷氧基的式(a)基团时，R7不是H，或者
a2)A是式(c)基团，
R是式(d)基团并且至少有一个必须存在于分子中的光学活性取代基Y2和Y3是氧或C1-4烷基，k是1、2或3和m是1、2或3，以及当所述化合物是一或二价阳离子时，阴离子是一或两个卤化物离子，优选碘化物，或者
b)X是-NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H或未被取代的或被取代的直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，未被取代的或被取代的芳烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元可含有一个或多个其他杂原子的饱和杂环，
A是未被取代的或被取代的烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者未被取代的或被取代的芳烷基，
Z是氧或＝NR3，其中R3是H或未被取代的或被取代的烷基，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3，或者
c)X是-OQ，其中Q是未被取代的或被取代的烷基或芳烷基，
Z是氧，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3，或者
d)A是未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者含氮杂芳基，优选吡啶基，或者含硫杂芳基，
Z是化学键，
X是-OQ，其中Q是C1-4烷基，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H，k是1、2或3和m是1、2或3。
56.权利要求55的羟胺衍生物，其中A是式(a)基团和Y1是C11-4卤代烷基，优选三氟甲基。
57.权利要求55羟胺衍生物的光学活性立体异构体，其中
X是卤素，Z是化学键，和R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是-OR7，其中R7是氨酰基，k是1、2或3和m是1、2或3。
58.式(I)羟胺衍生物，其中
X是-NR1R2，其中R1和R2分别独立地是H或未被取代的或被取代的直链或支链烷基，优选C1-6烷基或者环烷基，或者R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，
A是未被取代的或被取代的芳烷基，优选被一个或多个烷氧基，优选C1-4烷氧基取代的苯基烷基，苯基，被一个或多个卤素、烷基或卤代烷基，优选C1-4烷基或卤代烷基，或酰氨基或硝基取代的苯基，或者未被取代的或被取代的可与苯环稠合的含氮杂芳基，优选吡咯基、吡啶基、异喹啉基或喹啉基，或者含硫杂芳基，优选噻吩基，其中所述杂原子可带有一个或多个烷基取代基，优选C1-4烷基，
Z是化学键，和
R是式(e)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元可含有其他杂原子的并且可任选地含有一个或多个取代基优选C1-4烷基的饱和杂环，Y4是H或未被取代的或被取代的C1-4烷基，Y5是H或未被取代的或被取代的C1-4烷基或-OR7，其中R7是H或酰基，k是1、2或3和m是1、2或3，条件是，
当A是苯基，被卤素或烷氧基取代的苯基或者被烷氧基取代的苯基烷基或者吡啶基并且R7是H时，R1和R2中的至少一个不是H，和
当A是苯基，被卤素或烷氧基取代的苯基或者被烷氧基取代的苯基烷基或者吡啶基并且R1和R2两者均是H时，R7不是H。
59.式(II)羟胺衍生物，其中
a)X是氧，
A是C1-20直链或支链烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基或卤代苯基，未被取代的或被取代的芳烷基，萘基或含氮杂芳基，优选吡啶基，
Z是化学键，
R′是H，C1-4烷基或芳烷基，优选苯基烷基，
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H，k是1、2或3和m是1、2或3，条件是，
当A不是烷基并且R1是H时，Y6是H，或者
b)X是＝NR4，其中R4是H，未被取代的或被取代的烷基，未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者未被取代的或被取代的芳基，优选苯基烷基，
A是未被取代的或被取代的芳基，优选苯基或被取代的苯基，或者未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，或者环烷基，
Z是化学键，氧或＝NR3，其中R3是H或未被取代的或被取代的烷基，
R′是未被取代的或被取代的烷基或者未被取代的或被取代的芳基，优选苯基，或者未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3，或者
c)X是氧，
A是未被取代的或被取代的烷基，未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，
Z是氧，
R′是烷基或芳烷基，优选苯基烷基，
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或-OR7，其中R7是H或酰基，优选未被取代的或被取代的烷基羰基或芳基羰基，k是1、2或3和m是1、2或3，或者
d)X是氧，
Z是＝NH，和
d1)A是未被取代的或被取代的烷基，环烷基，未被取代的或被取代的芳烷基，优选苯基烷基，苯基或被卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基或硝基取代的苯基，
R′是烷基或芳烷基，优选苯基烷基，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或OH，k是1、2或3和m是1、2或3，或者
d2)A是式(a)基团，其中Y1是卤代烷基，优选三氟甲基并且n是1、2或3，
R′是H，和
R是式(b)基团，其中R5和R6分别独立地是H，直链或支链烷基，优选C1-4烷基或环烷基，或者R5和R6与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元饱和杂环，Y6是H或OR7，其中R7是H，k是1、2或3和m是1、2或3。
60.式(I″)羟胺衍生物，其中
A是苯基或被卤素或硝基取代的苯基或者含氮杂芳基，优选吡啶基，
R1是H，和
R″是氨基可任选地被一或二取代的ω-氨基烷基，其中所述烷基链优选含有1-5个碳原子并且所述氨基取代基分别独立地是一或两个直链或支链烷基或环烷基，或者所述两个氨基取代基与它们所连接的氮原子一起形成3-7元，优选5-7元杂环，或其N-C1-4烷基季铵盐衍生物或其N-氧化物，条件是，
当A是3-吡啶基时，R″不是1-哌啶基-甲基。
61.用于治疗心血管疾病、血管疾病、脑病、过敏性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病，因病毒或细菌感染引起的疾病，肿瘤、皮肤或粘液疾病的药物和任选的化妆品组合物，其中所述组合物含有0.5-99.5％重量比的所述(I)羟胺衍生物(其中A、Z、X和R如权利要求55定义)和药物上和/或化妆品上可接受的载体和赋形剂。
62.用于治疗心血管疾病、血管疾病、脑病、过敏性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病，因病毒或细菌感染引起的疾病，肿瘤、皮肤或粘液疾病的药物和任选的化妆品组合物，其中所述组合物含有0.5-99.5％重量比的所述(I)羟胺衍生物(其中A、Z、X和R如权利要求58定义)和药物上和/或化妆品上可接受的载体和赋形剂。
63.用于治疗心血管疾病、血管疾病、脑病、过敏性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病，因病毒或细菌感染引起的疾病，肿瘤、皮肤或粘液疾病的药物和任选的化妆品组合物，其中所述组合物含有0.5-99.5％重量比的所述(I)羟胺衍生物(其中A、Z、X和R如权利要求59定义)和药物上和/或化妆品上可接受的载体和赋形剂。
64.用于治疗心血管疾病、血管疾病、脑病、过敏性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病，因病毒或细菌感染引起的疾病，肿瘤、皮肤或粘液疾病的药物和任选的化妆品组合物，其中所述组合物含有0.5-99.5％重量比的所述(I)羟胺衍生物(其中A、Z、X和R如权利要求60定义)和药物上和/或化妆品上可接受的载体和赋形剂。
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