JP2014525756A - シャペロニンタンパク質の調節物質探索方法 - Google Patents

Abstract

【課題】アルツハイマー病、パーキンソン病、そしてハンチントン病のような退行性脳神経疾患を誘導するタンパク質凝集に関与するシャペロニン（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）タンパク質の調節物質探索方法、及びこれにより探索されたシャペロニンタンパク質の調節物質の退行性脳神経疾患の予防または治療用途を提供する。
【解決手段】本発明によりシャペロニンタンパク質の新規な陰性調節因子が提供され、前記陰性調節因子をターゲットにしてシャペロニンタンパク質の調節物質をより迅速で簡便に探索することができる。さらに、前記探索された物質を用いることによって既存のタンパク質凝集体除去方法である自己消化作用による細胞死の恐れなくアルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病などのような退行性脳神経疾患を効果的に予防または治療可能である。
【選択図】図１ａ

Description

本発明はアルツハイマー病、パーキンソン病、そしてハンチントン病のような退行性脳神経疾患を誘導するタンパク質凝集に関与するシャペロニン（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）タンパク質の調節物質探索方法、及びこれにより探索されたシャペロニンタンパク質の調節物質の退行性脳神経疾患の予防または治療用途に関する。

アルツハイマー病、パーキンソン病、そしてハンチントン病のような退行性脳神経疾患の代表的症状は特定タンパク質の凝集現象である。タンパク質凝集体は細胞内でタンパク質分解装置であるプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）の作用を抑制し、輸送タンパク質の移動を阻害する。そして他の転写調節タンパク質と共に凝集しながらこれらを隔離して遺伝子転写を変えることもある。また、ミトコンドリアの作用を妨害することによって酸化的ストレスを誘発して細胞死を誘導することもある。特に、神経細胞では前記のような作用によってシナプスを通じた神経信号伝達の副作用を起こすだけでなく神経細胞死滅を誘導して脳機能低下を招く。

最近、このようなタンパク質凝集による退行性神経疾患を治療するために研究が進められているが、そのうちの既に形成された凝集体を除去する研究方法として細胞内部に存在する自己貪食者である自己消化作用（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ）を用いる方法がある。自己消化作用の場合、最近、多くの研究結果が発表されており、特にタンパク質凝集体を特異的に除去する場合もあることを示唆した研究結果もある。しかし、このような自己消化作用の場合、一般に細胞内エネルギー不均衡がある時に自分自身の細胞器官を分解することによってエネルギーを得ると知られており、これの調節がよく行われない場合、自己消化作用による細胞死が発生することがあるという問題点がある。

本発明は前記従来の技術の問題点を解決するために案出されたものであって、タンパク質の凝集現象を予め阻害することによって正しいタンパク質折りたたみ現象を維持させるシャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）タンパク質の作用を調節する新規な調節物質の探索方法を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、本発明者らが研究した結果、シャペロンタンパク質のうちのシャペロニンタンパク質の量及び／または寿命に関連する因子がワクシニア−関連キナーゼ２（ｖａｃｃｉｎｉａ−ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ２、ＶＲＫ２）であるということを同定し、具体的に前記ＶＲＫ２は酵素活性に依存的にシャペロニンタンパク質を分解する作用を果たし、このようなシャペロニンタンパク質分解過程にユビキチン連結酵素であるＣＯＰ１複合体が前記ＶＲＫ２と相互作用をするという点を明らかにした。したがって前記２種類の物質はシャペロニンタンパク質の調節物質を探索することにおいて重要なターゲットとして作用し得るのを確認し本発明を完成した。これによって探索されたシャペロニンタンパク質の調節物質は退行性脳神経疾患の予防または治療のための効果的な有効成分になり得る。

したがって、本発明の一実施形態は、１）候補物質、及びＶＲＫ２を準備する段階；２）前記ＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性を測定する段階；及び３）前記候補物質とＶＲＫ２を共に処理時、ＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性の変化を測定する段階を含むシャペロニンタンパク質の調節物質探索方法を提供する。
好ましくは、前記ＶＲＫ２は人間をはじめとする全ての真核生物に由来するものであり得、例えば寄託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）ＢＡＡ１９１０９のアミノ酸配列を有するものであり得る。また好ましくは、寄託番号ＡＢ０００４５０の塩基配列によって暗号化されるものであり得る。
好ましくは、前記シャペロニンタンパク質はシャペロニンＴｒｉｃ／ＣＣＴであり得、さらに好ましくはＣＣＴ４（寄託番号ＮＭ_００９８３７）であり得る。

前記シャペロニンタンパク質の調節は好ましくはシャペロニンタンパク質の量及び／または寿命を増加または減少させることであり得る。
前記候補物質は特に制限がなく、ＶＲＫ２の発現量及び／または酵素活性の増加または減少活性を有すると予想される全ての物質であり得、好ましくはポリペプチド、ポリヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、及び化合物を含む各種合成または天然物質であり得る。
前記ＶＲＫ２は野生型形態であり得、より活性を高めるために適切に変形したものであり得る。例えば、前記変形したＶＲＫ２は適切なタグ（ｔａｇ）に変形したものであり得、前記タグはＧＳＴ、Ｈｉｓ、Ｆｌａｇ、ＥＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ１などであり得、好ましくはＶＲＫ２のＮ−末端にＧＳＴがタギングされたものであり得る。

前記シャペロニンタンパク質の調節物質がシャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させるものである場合、好ましくは前記段階３）以後に、４−１）前記候補物質処理によるＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性が前記候補物質を処理しない場合のＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性に比べて減少した場合、前記候補物質を前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質と判断する段階をさらに含むことができる。
前記ＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性の測定は特別な制限なく当業界で使用される通常の方法を用いて行うことができる。例えば、前記リン酸化酵素活性の有無乃至程度の変化はインビトロキナーゼアッセイ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ）を通じて確認できるが、これに制限されない。
前記ＶＲＫ２はシャペロニンタンパク質に対する陰性調節因子に該当し、このような陰性調節作用は前記ＶＲＫ２の酵素活性に基づいたことであるのを後述する実施例１で確認した。したがって、前記候補物質処理時に処理前と比較してＶＲＫ２の発現量が減少するか酵素活性が減少する場合、前記処理された候補物質はシャペロニンタンパク質の量及び／または寿命を増加させる物質と判断できる。
前記方法によるシャペロニンタンパク質の量及び／または寿命を増加させる物質は、好ましくはｓｉＶＲＫ２（Ｄ−００４６８４−０６、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びその相補的配列からなるｓｉＶＲＫ２二重鎖であり得る。

これとは反対に、前記シャペロニンタンパク質の調節物質が前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を減少させるものである場合、好ましくは前記段階３）以後に、４−２）前記候補物質処理によるＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性が前記候補物質を処理しない場合のＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性に比べて増加した場合、前記候補物質を前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を減少させる物質と判断する段階をさらに含むことができる。

一方、前記ＶＲＫ２はシャペロニンタンパク質に対する作用、即ち、シャペロニンタンパク質の分解作用を遂行することにおいてユビキチン連結酵素であるＣＯＰ１複合体と相互作用をするので、ＣＯＰ１もシャペロニンタンパク質の調節物質を探索することにおいて重要なターゲットとして作用できる。また、ＶＲＫ２は特にＣＯＰ１の複合体構成要素であるＲＢＸ１と相互作用をするので、前記ＣＯＰ１の構成要素であるＲＢＸも重要なターゲットになり得る。
したがって、本発明の他の一実施形態は、１）候補物質、及びＣＯＰ１を準備する段階；２）前記ＣＯＰ１の発現量または酵素活性を測定する段階；及び３）前記候補物質とＣＯＰ１を共に処理時、ＣＯＰ１の発現量または酵素活性の変化を測定する段階を含むシャペロニンタンパク質の調節物質探索方法を提供する。

好ましいシャペロニンタンパク質及び前記シャペロニンタンパク質の調節に関連しては前述したことと同様に適用することができる。
前記候補物質は特に制限がなく、ＣＯＰ１の発現量及び／または酵素活性の増加または減少活性を有すると予想される全ての物質であり得、好ましくはポリペプチド、ポリヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、及び化合物を含む各種合成または天然物質であり得る。
前記ＣＯＰ１は野生型形態であり得、より活性を高めるために適切に変形したものであり得る。例えば、前記変形したＣＯＰ１は適切なタグ（ｔａｇ）に変形したものであり得、前記タグはＧＳＴ、Ｈｉｓ、Ｆｌａｇ、ＥＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ１などであり得、好ましくはＣＯＰ１のＮ−末端にＧＳＴがタギングされたものであり得る。
例えば、前記ＣＯＰ１は寄託番号ＢＣ０９４７２８の塩基配列を有するものであり得る。また、前記ＲＢＸ１は寄託番号ＡＦ１４０５９８の塩基配列を有するものであり得る。

前記シャペロニンタンパク質の調節物質がシャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させるものである場合、好ましくは前記段階３）以後に、４−１）前記候補物質処理によるＣＯＰ１の発現量または酵素活性が前記候補物質を処理しない場合のＣＯＰ１の発現量または酵素活性に比べて減少した場合、前記候補物質を前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質と判断する段階をさらに含むことができる。
前記ＣＯＰ１は前述のＶＲＫ２と同様にシャペロニンタンパク質に対する陰性調節因子に該当するので、前記候補物質処理時に処理前と比較してＣＯＰ１の発現量が減少するか酵素活性が減少する場合、前記処理された候補物質はシャペロニンタンパク質の量及び／または寿命を増加させる物質と判断できる（実施例４参照）。
前記ＣＯＰ１の発現量または酵素活性（Ｅ３連結酵素としての活性）の測定は特別な制限なく当業界で使用される通常の方法を用いて行うことができる。
前記シャペロニンタンパク質の調節物質探索方法によるシャペロニンタンパク質の量及び／または寿命を増加させる物質は、好ましくはｓｉＣＯＰ１（Ｄ−００７０４９−０１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びその相補的配列からなるｓｉＣＯＰ１二重鎖、及びｓｉＲＢＸ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びその相補的配列からなるｓｉＲＢＸ１二重鎖からなる群より選択された１種以上であり得る。

これとは反対に、前記シャペロニンタンパク質の調節物質が前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を減少させるものである場合、好ましくは前記段階３）以後に、４−２）前記候補物質処理によるＣＯＰ１の発現量または酵素活性が前記候補物質を処理しない場合のＣＯＰ１の発現量または酵素活性に比べて増加した場合、前記候補物質を前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を減少させる物質と判断する段階をさらに含むことができる。

一方、前記ＶＲＫ２とＣＯＰ１間の相互作用は前記ＶＲＫ２及びＣＯＰ１の結合形成を通じて行うことができるので、本発明の他の一実施形態は１）候補物質、ＶＲＫ２、及びＣＯＰ１を準備する段階；２）前記ＶＲＫ２及び前記ＣＯＰ１間結合有無を測定する段階；及び３）前記候補物質、ＶＲＫ２、及びＣＯＰ１を共に処理時、前記ＶＲＫ２及び前記ＣＯＰ１間結合形成有無を測定する段階；を含むシャペロニンタンパク質の調節物質探索方法を提供する。

前記候補物質は特に制限がなく、ＶＲＫ２とＣＯＰ１間の結合形成を阻害または促進する活性を有すると予想される全ての物質であり得、好ましくはポリペプチド、ポリヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、及び化合物を含む各種合成または天然物質であり得る。
前記シャペロニンタンパク質の調節物質がシャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させるものである場合、好ましくは前記段階２）以後に、３）前記候補物質処理によって前記ＶＲＫ２及び前記ＣＯＰ１間結合形成が抑制される場合、前記候補物質を前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質と判断する段階をさらに含むことができる。

前記シャペロニンタンパク質はタンパク質の凝集現象、例えばハンチンチンタンパク質の非正常的な凝集現象を阻害することによって正しいタンパク質折りたたみ現象を維持させる作用をするので、前記シャペロニンタンパク質の量及び／または寿命を増加させる物質はタンパク質の凝集現象によって発生する退行性脳神経疾患の予防または治療のために有用に用いることができる。
したがって、本発明のまた他の一実施形態は前記シャペロニンタンパク質の調節物質の探索方法によって探索された調節物質、特にシャペロニンタンパク質の量及び／または寿命を増加させる物質を有効性分として含む退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物を提供する。

また、本発明のまた他の一実施形態は前記探索方法によってシャペロニンタンパク質の量及び／または寿命を増加させる物質を探索する段階；及び前記段階を通じて探索された調節物質を退行性脳神経疾患の予防または治療を必要とする対象に治療学的有効量で投与する段階を含む退行性脳神経疾患の予防または治療方法を提供する。
好ましくは、前記退行性脳神経疾患の予防または治療を必要とする対象は人間を含む哺乳類であり得る。
前記退行性脳神経疾患は例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病などであり得、好ましくはハンチントン病であり得るが、これに制限されるのではない。

前記退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物は好ましくは前記調節物質を全体組成物の総重量を基準に０．０００１乃至９９．９重量％、さらに好ましくは０．００１乃至５０重量％含むことができる。
好ましくは、前記退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物及び前記退行性脳神経疾患の予防または治療方法は医薬組成物製造及び投与のために通常使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤などをさらに含んで各物質別に適切な剤形を有するように製造でき、また各剤形別に適した投与経路を通じて提供することができる。調節物質の種類別に適した剤形及び投与経路については当業者が適切に選択して実施できる。
前記担体、賦形剤及び希釈剤は例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートなどであり得る。

前記医薬組成物はそれぞれ通常の方法によって経口または非経口で投与でき、例えば経口投与時には散剤、顆粒剤、錠剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップなどの剤形で使用でき、非経口投与時には静脈、筋肉、皮下注射などで投与できるが、これに制限されず可能な全ての方式の投与経路が適用できる。
好ましい投与量は投与対象及び／または疾患の治療または予防に適した含量であり得、これは投与対象の年齢、性別、一般健康状態及び体重、病気の種類及び重症度、剤形の種類、組成物に含有されている他の成分の種類及び含量、組成物の分泌率、投与経路及び期間などをはじめとする多様な因子によって調節でき、当業者によって適切に選択され得る。

本発明によってシャペロニンタンパク質の新規な陰性調節因子が提供され、前記陰性調節因子をターゲットにしてシャペロニンタンパク質の調節物質をより迅速かつ簡便に探索することができる。さらに、前記探索された物質を用いることによって既存のタンパク質凝集体除去方法である自己消化作用による細胞死の恐れなくアルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病などのような退行性脳神経疾患を効果的に予防または治療可能である。

本発明の実施例１によってＶＲＫ２のハンチンチンタンパク質凝集誘導様相及びハンチンチンタンパク質の凝集に対する影響を測定した結果を示したものである。 本発明の実施例１によってＶＲＫ２のハンチンチンタンパク質凝集誘導様相及びハンチンチンタンパク質の凝集に対する影響を測定した結果を示したものである。 本発明の実施例１によってＶＲＫ２のハンチンチンタンパク質凝集誘導様相及びハンチンチンタンパク質の凝集に対する影響を測定した結果を示したものである。 本発明の実施例２によってＶＲＫ２とシャペロニンタンパク質間の相互作用を測定した結果を示したものである。 本発明の実施例２によってＶＲＫ２とシャペロニンタンパク質間の相互作用を測定した結果を示したものである。 本発明の実施例２によってＶＲＫ２とシャペロニンタンパク質間の相互作用を測定した結果を示したものである。 本発明の実施例３によってＶＲＫ２によって誘導されたハンチンチンタンパク質凝集現象のシャペロニンタンパク質の寿命に対する影響を測定した結果を示したものである。 本発明の実施例３によってＶＲＫ２によって誘導されたハンチンチンタンパク質凝集現象のシャペロニンタンパク質の寿命に対する影響を測定した結果を示したものである。 本発明の実施例３によってＶＲＫ２によって誘導されたハンチンチンタンパク質凝集現象のシャペロニンタンパク質の寿命に対する影響を測定した結果を示したものである。 本発明の実施例３によってＶＲＫ２によって誘導されたハンチンチンタンパク質凝集現象のシャペロニンタンパク質の寿命に対する影響を測定した結果を示したものである。 本発明の実施例４によってＶＲＫ２のハンチンチンタンパク質凝集誘導作用に関与する生体因子を究明した結果を示したものである。 本発明の実施例４によってＶＲＫ２のハンチンチンタンパク質凝集誘導作用に関与する生体因子を究明した結果を示したものである。 本発明の実施例４によってＶＲＫ２のハンチンチンタンパク質凝集誘導作用に関与する生体因子を究明した結果を示したものである。 本発明の実施例５によってＶＲＫ２の発現量減少によるシャペロニンタンパク質に対する影響（ハンチンチンタンパク質凝集現象の阻害）を示したものである。 本発明の実施例５によってＶＲＫ２の発現量減少によるシャペロニンタンパク質に対する影響（ハンチンチンタンパク質凝集現象の阻害）を示したものである。 本発明の実施例５によってＶＲＫ２の発現量減少によるシャペロニンタンパク質に対する影響（ハンチンチンタンパク質凝集現象の阻害）を示したものである。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲がこれに限定されるのではない。

［実施例］
実施例１．ハンチンチンタンパク質の凝集誘導実験
１．１．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株内のハンチンチンタンパク質の凝集誘導実験
１）実験方法
ＶＲＫ２が退行性脳神経疾患の主要症状であるタンパク質凝集現象を調節可能であるかを確認するために、ハンチンチンタンパク質を単独で、またはＶＲＫ１（ＶＲＫ２のようなタンパク質リン酸化酵素ファミリー、ＡＢ０００４４９）またはＶＲＫ２（ＡＢ０００４５０）と共にヒト胚伸長細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（韓国細胞株銀行）で過剰発現させてそれぞれの凝集様相及びハンチンチンタンパク質の凝集に対する影響を測定した。

ハンチンチン遺伝子のｅｘｏｎ１にはポリグルタミン領域（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｔｒａｃｔ）が存在し、本実験ではグルタミン個数が１０３個であるクローンを用いて凝集現象がより容易に誘導されるようにした。ハンチントン病の症状の程度と発病時期は前記ハンチンチン遺伝子ｅｘｏｎ１のポリグルタミン領域に存在するグルタミン数と関連があり、特にその数が２５個以下である時を野生型と言い、２５個以上である時から突然変異型と言うが、グルタミンの数が長くなるほど症状の程度は悪化し、発病時期は早められる現象を観察することができる。

具体的に、形質注入試薬であるメタフェクテン（ＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ）（Ｂｉｏｎｔｅｘ）を製造会社の勧奨量によって使用し、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）で連結されたタンパク質凝集体を形成するグルタミン個数が１０３個であるハンチンチン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ，Ｈｔｔ）タンパク質の遺伝子発現ベクターＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰ−ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ＨＴＴＱ１０３−ＧＦＰ−ｐｃＤＮＡ３．１）（スタンフォード大学、カリフォルニア州のジュディスフリードマンから入手）を単独で、またはそれぞれＲＦＰ（ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）で連結されたＤｓＲｅｄ１−Ｃ１−ＶＲＫ１またはＤｓＲｅｄ１−Ｃ１−ＶＲＫ２と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞株内部に注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）してＤＭＥＭ／ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｈｙｃｌｏｎｅ−ｃａｔ．＃ＳＨ３０２４３．０１）に１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）と１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン（ウェルジン、韓国）から構成された培養溶液で３７℃に５％ＣＯ_２で２４時間過剰発現させた後、過剰発現されたＶＲＫ１、ＶＲＫ２、ＨＴＴＱ１０３−ＧＦＰタンパク質の凝集様相を蛍光顕微鏡（カールツァイス、ドイツ）で観察して図１ａに示した。前記ＤｓＲｅｄ１−Ｃ１−ＶＲＫ１またはＤｓＲｅｄ１−Ｃ１−ＶＲＫ２はｐＤｓＲｅｄ１−Ｃ１（ＢＤバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州）を購入してＶＲＫ１（ＡＢ０００４４９）とＶＲＫ２（ＡＢ０００４５０）をそれぞれクローニングして製造した。

２）実験結果
図１ａに示されているように、それぞれのタンパク質の凝集様相は密集した形態と強い蛍光強さを示し、また前記ハンチンチンタンパク質はＶＲＫ２と共に過剰発現させた時にのみ凝集体増加現象が現れるのを確認することができた。
具体的に、図１ａの上段に示されているように、特にＶＲＫ２が過剰発現された細胞でＨＴＴＱ１０３の凝集体形成（緑色のスポット）が観察され、反面図１ａの下段に示されているように、ＶＲＫ１が過剰発現された細胞ではＨＴＴＱ１０３タンパク質が凝集せず細胞全般にわたって分散して存在しているのを確認することができた。
図１ａの蛍光顕微鏡イメージに基づいてＨｔｔＱ１０３−ＧＦＰが発現した細胞中に凝集体を有している細胞の数を直接目で数えて定量化して図１ａの右側に示した（ｎ＝３；ベクターはＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰ−ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを含んでＶＲＫ１及びＶＲＫ２を形質転換させるために使用したＤｓＲｅｄ１−Ｃ１モックベクター（ｍｏｃｋ ｖｅｃｔｏｒ）を示す）。
したがって、このようなＨＴＴＱ１０３タンパク質の凝集誘導及び凝集体増加現象はＶＲＫ２タンパク質の固有の作用であり、ＶＲＫ１タンパク質とは関連がないのを確認することができた。

１．２．ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞株内のハンチンチンタンパク質の凝集誘導実験
１）実験方法
前記実施例１．１でＶＲＫ２がハンチンチンタンパク質の凝集誘導機能を有するのを確認したところ、前記機能がＶＲＫ２の酵素活性と関連があるかを実験するために、対照群としてＶＲＫ２のアミノ酸配列の中の６１番目アミノ酸配列であるリシン（Ｌｙｓ）をアラニン（Ａｌａ）で置換（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）してリン酸化酵素不活性（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｅａｄ（ＫＤ））状態を誘導したＶＲＫ２−ＫＤ（Ｋ６１Ａ）（寄託番号ＡＢ０００４５０の配列の中の６１番目アミノ酸をコーディングするＡＡＡ（ｌｙｓｉｎｅ）ヌクレオチド配列を、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）をコーディングするようにＧＣＡヌクレオチド配列にＰＣＲ基盤ＳＤＭ（Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）された配列）を使用してＶＲＫ２（寄託番号ＡＢ０００４５０）と比較した。

また、他の種類の細胞株内でもＶＲＫ２がこのようなタンパク質凝集誘導機能を果たすかを確認するために、前記実施例１．１と同様な方法を用いて前記ヒト胚伸長細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞株及びヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞株（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２２６８^ＴＭ）内のそれぞれのハンチンチンタンパク質の凝集誘導様相を比較して図１ｂに示した。

ＶＲＫ２とＶＲＫ２−ＫＤ（Ｋ６１Ａ）クローンは、先ずＨｅＬａ細胞株（韓国細胞株銀行）から得た全体ｃＤＮＡを用いて前述のＶＲＫ２とＶＲＫ２−ＫＤ（Ｋ６１Ａ）それぞれのコーディングＤＮＡ配列をＰＣＲ（１．９５℃、５分、２．９５℃、１分、３．５２℃、１分、４．７２℃、３分３０秒、５．７２℃、７分、６．４℃、１０分（２番〜４番３５サイクルで反復遂行））で増幅させた後、ｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２ベクター（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）と前記増幅されたＶＲＫ２及びＶＲＫ２−ＫＤ（Ｋ６１Ａ）遺伝子をＳａｌ１とＢａｍＨ１制限酵素（ＤＣＣ−バイオネット（ＤＣＣ−Ｂｉｏｎｅｔ）、韓国）を用いて粘着性末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）を形成させ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ロシュ、マンハイム、ドイツ）を用いて接合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することによってクローニングしてｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２−ＶＲＫ２及びｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２−ＶＲＫ２−ＫＤ（Ｋ６１Ａ）プラスミドＤＮＡを製造して使用した（Ｋｗｏｎ，Ｓ．Ｙ．， Ｙ．Ｊ．Ｃｈｏｉ， Ｔ．Ｈ．Ｋａｎｇ， Ｋ．Ｈ．Ｌｅｅ， Ｓ．Ｓ．Ｃｈａ， Ｇ．Ｈ．Ｋｉｍ， Ｈ．Ｓ．Ｌｅｅ， Ｋ．Ｔ．Ｋｉｍ， ａｎｄ Ｋ．Ｊ．Ｋｉｍ．， ２００５． Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｌｃｉｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ． Ｐｌａｓｍｉｄ ５３：２７４−８２参照）。前記ＰＣＲに使用されたプライマーは以下の通りである。

＜使用されたプライマー＞
ＶＲＫ２正方向：５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＶＲＫ２逆方向：５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｋ６１Ａ正方向：５’−ＧＣＡＡＧＡＣＡＴＧＴＡＧＴＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＡＡＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｋ６１Ａ逆方向：５’−ＴＴＣＴＴＧＡＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＴＣＴＴＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）

製造されたｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２−ＶＲＫ２及びｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２−ＶＲＫ２−ＫＤ（Ｋ６１Ａ）プラスミドＤＮＡをＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰ−ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（スタンフォード大学、カリフォルニア州のジュディスフリードマンから入手）と共にメタフェクテン（Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ）（Ｂｉｏｎｔｅｘ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（韓国細胞株銀行）及びＳＫ−Ｎ−ＢＥ２細胞株（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２２６８^ＴＭ）に形質転換をさせた。この時に使用されたメタフェクテンの量は培養皿の大きさ６０ｍｍディッシュ基準にＤＮＡ６μｇにメタフェクテン（ｌｉｐｉｄ）１８μｌをそれぞれ無血清培養液（ＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））３００μｌに混合して５分間放置し、この二つの溶液を混合して３０分間常温に放置した後、細胞に直接一滴ずつ滴下する。形質転換させた後２４時間に各細胞内のタンパク質凝集現象を蛍光顕微鏡（カールツァイス、ドイツ）で観察してその結果を図１ｂに示した。

また、凝集タンパク質の量をフィルタートラップアッセイ（Ｆｉｌｔｅｒ ｔｒａｐ ａｓｓａｙ）（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００６， Ｖｏｌ．８：１１５５−６２）で調査して図１ｃに示した。具体的に前記それぞれのタンパク質が過剰発現された細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を０．５％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のＰＢＳで粉砕した後、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＢＳに再び溶かした後、９５℃で５分間沸かした。その後、各細胞が粉砕された抽出液（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を０．２μｍ大きさの孔を有するニトロセルロース膜にドットブロッター（ｄｏｔ ｂｌｏｔｔｅｒ）（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて移動させた後、５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳液で膜をコーティングした後、ＧＦＰタンパク質に対する抗体（抗−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｂ−２，ｓｃ−９９９６）（サンタクルーズ、カリフォルニア州））と２次抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＫＰＬ））を用いて発色させて残っている凝集タンパク質を調査した。

２）実験結果
図１ｂに示されているように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株だけでなく神経細胞であるＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞株内でもハンチンチンタンパク質をＶＲＫ２と共に過剰発現時にハンチンチンタンパク質の凝集（図１ｂの緑色点）が誘導されるのを確認することができ、図１ａで示されたＶＲＫ２タンパク質によるＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰの凝集体増加現象がＶＲＫ２タンパク質の酵素活性を除去したＶＲＫ２−ＫＤの過剰発現時には微小であったと示され、ＶＲＫ２のハンチンチンタンパク質凝集誘導機能はＶＲＫ２のリン酸化酵素活性に依存的であるのを確認することができた。
具体的に見てみると次の通りである。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で実験した結果を示した図１ｂの上段の３つのイメージのうち、一番目のイメージはＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰと共にｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２モックベクター（ｍｏｃｋ ｖｅｃｔｏｒ）が発現したイメージであって、本実験では対照群として使用された。緑色の点で示される凝集体はＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰタンパク質が自発的に誘導される凝集現象を意味する。二番目のイメージはＶＲＫ２の酵素活性が生きているタンパク質と共にＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰタンパク質が発現している細胞から得られた結果であり、緑色の点で示される凝集体の数が対照群と比較して有意に増加したのを確認することができた。これはＶＲＫ２によってＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰの凝集現象が誘導されたことを示唆する。三番目のイメージはＶＲＫ２の酵素活性が現れないタンパク質と共にＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰタンパク質が発現している細胞から得られた結果であり、緑色の点で示される凝集体の数が対照群と比較して大きな差がないのを確認することができた。これにより、ＶＲＫ２の酵素活性がなければ、Ｈｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰの凝集現象を誘導することができないのが分かった。

図１ｂの下段の３つのイメージはＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞から得られたイメージであって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られた結果と同様な様相を示した。これによって、ＶＲＫ２によるＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰの凝集体増加現象は神経細胞でも同様に起こるのを確認することができた。特に、退行性神経疾患で大部分の症状が神経細胞で起こる点を考慮する時、本実験結果はＶＲＫ２が同様に疾病の症状を誘導することができるのを示唆する。

また、図１ｃに示されているように、フィルタートラップアッセイ（Ｆｉｌｔｅｒ ｔｒａｐ ａｓｓａｙ）（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００６， Ｖｏｌ．８：１１５５−６２）を用いて凝集タンパク質を調査した結果を通じても凝集タンパク質の量がＶＲＫ２のリン酸化酵素活性に依存的に示されるのを確認することができた。具体的に、ＶＲＫ２が過剰発現された細胞の場合、タンパク質凝集現象が起こることによって膜を通過せずかかって残っているタンパク質が観察された。

実施例２．ＶＲＫ２とシャペロニンタンパク質間相互作用の測定
１）実験方法
ＶＲＫ２とシャペロニンタンパク質（Ｔｒｉｃ／ＣＣＴ）間の相互作用を調べるために、シャペロニンタンパク質の各小単位体（ＣＣＴ１〜８）に対するＶＲＫ２の結合程度をＧＳＴプルダウンアッセイ（ＧＳＴ ｐｕｌｌｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）及び免疫沈降反応（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を通じて確認してそれぞれ図２ａ及び図２ｂに示した（Ｋａｎｇ，Ｔ．Ｈ． ａｎｄ Ｋ．Ｔ．Ｋｉｍ．， ２００６．Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ＶＲＫ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＨＲ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：８６３−９；及びＫｗｏｎ，Ｓ．Ｙ．， Ｙ．Ｊ．Ｃｈｏｉ， Ｔ．Ｈ．Ｋａｎｇ， Ｋ．Ｈ．Ｌｅｅ， Ｓ．Ｓ．Ｃｈａ， Ｇ．Ｈ．Ｋｉｍ， Ｈ．Ｓ．Ｌｅｅ， Ｋ．Ｔ．Ｋｉｍ， ａｎｄ Ｋ．Ｊ．Ｋｉｍ．， ２００５． Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ． Ｐｌａｓｍｉｄ ５３：２７４−８２参照、上記文献は全て本明細書に参照として含まれる）。

本実験に使用された物質はそれぞれＧＳＴ抗体（サンタクルーズ社）、グルタチオンセファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ）（ＧＥヘルスケア）、Ｆｌａｇ抗体（シグマ）、ＨＡ抗体（ロシュ）、実施例１．２で製造されたｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２−ＶＲＫ２、ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＶＲＫ２、ｐＰｒｏＥｘ−ＨＴａ−ＣＣＴｎ（ＣＣＴｎはＣＣＴ１〜ＣＣＴ８であり、それぞれＣＣＴ１（ＮＭ_０１３６８６）、ＣＣＴ２（ＮＭ_００７６３６）、ＣＣＴ３（ＮＭ_００９８３６）、ＣＣＴ４（ＮＭ_００９８３７）、ＣＣＴ５（ＮＭ_００７６３６）、ＣＣＴ６（ＮＭ_００９８３８）、ＣＣＴ７（ＮＭ_００７６３８）、ＣＣＴ８（ＮＭ_００９８４０））、及びｐｃＤＮＡ３．１−ＨＡ−ＣＣＴ４であり、前記ｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＶＲＫ２及びｐＰｒｏＥｘ−ＨＴａ−ＣＣＴｎは、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクターとｐＰｒｏＥｘ−ＨＴａベクターをそれぞれ購入（アマシャム、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）してＶＲＫ２（ＡＢ０００４５０）及びＣＣＴｎをそれぞれ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）基盤クローニングして製造した。
また、前記ｐｃＤＮＡ３．１−ＨＡ−ＣＣＴ４はｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）ベクターをＫｐｎ１とＥｃｏＲ１（ＤＣＣ−Ｂｉｏｎｅｔ）制限酵素で切断し、ＨＡエピトープ（５’−ＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＴＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＣＴＣＣＣ−３’：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を合成して同一の制限酵素で切断した後、これをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ロシュ）で連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）して変形させたベクターにＣＣＴ４を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）基盤クローニングして製造した。制限酵素反応は３７℃で１６時間処理し、連結反応は１６℃で１６時間処理した。

また、前記免疫沈降反応実験を通じた細胞内位置を確認するために、蛍光顕微鏡（カールツァイス、ドイツ）で観察してその結果を図２ｃに示した。
具体的に、カバースリップ（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）の上にＨＥＫ２９３Ｔ細胞（韓国細胞株銀行）が５０−６０％程度成長した時、前記実施例１と同様な方法でｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２−ＶＲＫ２とｐｃＤＮＡ３．１−ＨＡ−ＣＣＴ４を形質転換させ、２４時間後に、細胞を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で１５分間固定した後、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、Ｆｌａｇ（シグマ）とＨＡ（ロシュ）抗体を１：１０００で希釈して４℃で一晩培養した後、ＰＢＳで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ４８８（緑、インビトロジェン）、Ａｌｅｘａ５９４（赤、インビトロジェン）を１：１０００で希釈して常温で１時間培養し、ＰＢＳで３回洗浄した後にＨｏｅｃｈｓｔ（５μｇ／ｍｌ）（シグマ）染色を常温で１０分間行ってＰＢＳで３回洗浄した後、スライドガラス（ｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ）にマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）して蛍光顕微鏡（カールツァイス）でイメージを得た。

２）実験結果
図２ａ及び図２ｂに示されているように、ＶＲＫ２とシャペロニンタンパク質、特にＣＣＴ４はＧＳＴプルダウンアッセイ（ＧＳＴ ｐｕｌｌｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）及び免疫沈降反応（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ＩＰ） ａｓｓａｙ）のような二つの分子の結合程度を確認する実験で全て強く結合しているのを確認することができた。
図２ａの８個のイメージはＶＲＫ２によって引き出されるシャペロニンタンパク質を確認することができるイメージ結果であって、各イメージごとに、左側から一番目はインプット（ｉｎｐｕｔ）、つまり、使用したシャペロニンタンパク質の５％を意味する。二番目はＶＲＫ２タンパク質によって引き出されたシャペロニンタンパク質の量を意味し、三番目はＶＲＫ２タンパク質（実験群）に対する対照群としてＧＳＴタンパク質によって引き出されたシャペロニンタンパク質の量を意味する。引き出されたシャペロニンタンパク質の量は６ｘヒスチジンがタギングされているのでＨｉｓ抗体（サンタクルーズ社）を用いて確認し、シャペロニン８個のサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）の中の特にＣＣＴ４が最も強く結合されて引き出されたのを確認することができた。

図２ｂの上段のイメージは細胞自己分解物（ｌｙｓａｔｅｓ）でＶＲＫ２によって引き出されるＣＣＴ４タンパク質の量を意味する。左側から一番目のレーン（ｌａｎｅ）はインプット（ｉｎｐｕｔ）、即ち、免疫沈降（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）時に用いた細胞自己分解物に対して５％の量を意味する。二番目のレーン（ｌａｎｅ）はＨＡがタギングされたＣＣＴ４のみが過剰発現された細胞でＦｌａｇ抗体（Ｆｌａｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）によって引き出されたＣＣＴ４タンパク質の量を意味する。三番目のレーン（ｌａｎｅ）はＦｌａｇがタギングされたＶＲＫ２とＨＡがタギングされたＣＣＴ４が過剰発現された細胞でＦｌａｇ抗体（Ｆｌａｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いてＶＲＫ２を引張った時に引き出されたＣＣＴ４タンパク質の量を意味する。ＣＣＴ４タンパク質の量はＨＡ抗体（ＨＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いて確認した。図２ｂの上段に示されているように、シャペロニンタンパク質ＣＣＴ４がＶＲＫ２によって引き出されたのを確認することができ、これによりＶＲＫ２とＣＣＴ４が細胞内で相互作用することが分かった。また下段のイメージでＶＲＫ２タンパク質の量及び免疫沈降実験時使用された抗体（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）の量が同一であるのを確認することができる。

また、免疫沈降反応実験を通じた細胞内の位置を確認する実験でも二つのタンパク質が同じ位置を占有していて互いに結合できる機会が存在するのを示した（図２ｃ）。図２ｃの左側からそれぞれ赤色はＶＲＫ２タンパク質の位置を、緑色はＣＣＴ４タンパク質の位置を、青色は核の位置を示し、ＶＲＫ２は核周囲の細胞小器官（ＥＲ及びミトコンドリア）に集中して分布するのを示し、ＣＣＴ４は細胞質に分散して存在するのを示す。このようにＶＲＫ２及びＣＣＴ４タンパク質は同じ空間を占有しながら相互作用する可能性を示し、したがって前記実施例１で提示したＶＲＫ２のハンチンチンタンパク質凝集誘導機能がＶＲＫ２とシャペロニンタンパク質（特にＣＣＴ４）間に起こる相互作用と関連があるのを確認することができた。

実施例３．シャペロニンタンパク質の量及び寿命に対するＶＲＫ２の影響測定
１）実験方法
ＶＲＫ２のリン酸化酵素活性に依存的に起こるハンチンチンタンパク質凝集誘導作用のシャペロニンタンパク質の量及び寿命に対する影響を測定するために、以下のような実験を行った。

ａ．ＧＳＴ−ＶＲＫ２、ＧＳＴ−ＶＲＫ２−ＫＤタンパク質製造
先ず、ＶＲＫ２の酵素活性を調節するためにＳＤＭ（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を行って６１番リシン（ｌｙｓｉｎｅ）残基がアラニン（ａｌａｎｉｎ）で置換されたクローン（ｃｌｏｎｅ）を製作した。これをＶＲＫ２−ＫＤと命名し、ＶＲＫ２とＶＲＫ２−ＫＤをｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクター（アマシャム、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）にクローニングしてＧＳＴ−ＶＲＫ２、ＧＳＴ−ＶＲＫ２−ＫＤタンパク質を得た（Ｋａｎｇ，Ｔ．Ｈ． ａｎｄ Ｋ．Ｔ．Ｋｉｍ．， ２００６． Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ＶＲＫ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＨＲ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：８６３−９）。ＧＳＴ−ＶＲＫ２−ＫＤタンパク質の酵素不活性はインビトロキナーゼアッセイ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ）を行って確認した。具体的にタンパク質１μｇとバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１５０ｍＭ ＫＣｌ）、そして^３２Ｐ−γ−ＡＴＰを混合して３０℃で３０分間培養した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行しｘ線フィルム（ｘ−ｒａｙ ｆｉｌｍ）を用いてイメージ結果を得て図３ａに示した。

ｂ．ＶＲＫ２の酵素活性によるＣＣＴ４の量変化観察
前記実施例１．２と同様な方法でｐＦｌａｇ−ＣＭＶ２ベクターに酵素活性があるＶＲＫ２遺伝子と酵素活性がないＶＲＫ２−ＫＤ遺伝子をクローニングし、これをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にメタフェクテン（ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ）を用いて形質転換させた。２４時間後に細胞を培養皿からトリプシン（ウェルジン）を用いて剥ぎ取った後、細胞を１５００ｒｐｍで１分３０秒間遠心分離機を用いて集めた。集められた細胞はＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）で４℃で３０分間分解（ｌｙｓｉｓ）させた。その後、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上層液を得て、これをブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を通じて定量後、ＳＤＳ ＰＡＧＥを行った。また、ＶＲＫ２に対するシャペロニンタンパク質のポリユビキチン現象を観察するために、前記細胞自己分解物（ｌｙｓａｔｅｓ）にＣＣＴ４抗体（アブカム）１μｇを混合して免疫沈降実験を行った。この後に、ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させた後、これを５％（ｗ／ｖ）スキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）で膜をコーティングした後、Ｆｌａｇ（シグマ）、ＣＣＴ４（アブカム）、ユビキチン（サンタクルーズ社）ＧＡＰＤＨ（サンタクルーズ社）抗体を４℃で一晩培養した。その後、ウォッシングバッファー（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０ ｗｉｔｈ ＴＢＳ）で１０分間３回洗浄した。そして、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された２次抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＫＰＬ））を常温で１時間培養した後、ウォッシングバッファーで１０分間３回洗浄した。その後、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）溶液を用いた発色反応を通じてｘ線フィルム（ｘ−ｒａｙ ｆｉｌｍ）に現像し、その量を確認して図３ｂに示した。ＶＲＫ２タンパク質の量はｆｌａｇ抗体（シグマ）で確認し、ＧＡＰＤＨタンパク質はローディングコントロールとして使用された。

ｃ．ＶＲＫ２の酵素活性によるＣＣＴ４の寿命変化観察
翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）阻害剤であるシクロヘキサミド（Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｍｉｄｅ（ＣＨＸ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）をＶＲＫ２とＶＲＫ２−ＫＤが過剰発現されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞にそれぞれ５０μｇ／ｍｌで処理した後、０時間、４時間、８時間ごとに細胞をそれぞれ培養皿からトリプシン（ウェルジン）で剥ぎ取って１５００ｒｐｍで１分３０秒間遠心分離機を用いて集めたこと以外には、前記ｂと同様な方法でブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を通じて定量後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。また、免疫沈降実験は除きその後の過程はまた前記ｂと同様な方法で行ってｘ線フィルム（ｘ−ｒａｙ ｆｉｌｍ）に現象後、その結果を図３ｃに示した。このように、翻訳阻害剤であるＣＨＸを用いることによって新しく合成されるタンパク質が抑制されるので既に存在するタンパク質の寿命を確認することができる。

ｄ．分画及びウェスタンブロッティング実験
ＶＲＫ２を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の抽出物（ｅｘｔｒａｃｔｓ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア）が装着されたＦＰＬＣ装置（バイオラッド）を用いて分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を分けた。その後、各分画に対してウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った（ＢＭＣ Ｃｅｌｌｂｉｏｌ、２００２、３；３０参照）（使用物質：ＣＣＴ４抗体（アブカム）、ＨＳＰ７０抗体（サンタクルーズ社））。

２）実験結果
図３ａ乃至図３ｄに示されているように、前記実施例１で確認されたＶＲＫ２酵素活性によるハンチンチンタンパク質凝集誘導機能はシャペロニンタンパク質の寿命に影響を与えるという事実を確認することができた。

先ず、図３ａに示す通り、上段のイメージはＶＲＫ２の自己リン酸化（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）現象を反映し、これはリン酸化酵素の酵素活性があることを意味する。反面、ＶＲＫ２−ＫＤは自己リン酸化現象が無くなったのを確認することができた。参考として下段のイメージはクマシーブリリアントブルーＧ２５０（バイオラッド）を用いた染色法を用いて使用したタンパク質の定量がよく行われたことを示す。

図３ｂの上段の３つのイメージは細胞内に存在する各タンパク質の量を意味し、下段のイメージはＣＣＴ４にタギングされたユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）タンパク質の分布を示す。下段のイメージに示されているように、ＶＲＫ２の酵素活性がある場合、シャペロニンタンパク質にタンパク質分解信号であるポリユビキチンの標識が増えるのを確認することができ、このような現象はＶＲＫ２の酵素活性が無くなった時、多く減少するのを確認することができた。これと同様に、上段のイメージでも細胞内のシャペロニンタンパク質（ＣＣＴ４）の量はＶＲＫ２の酵素活性を有するタンパク質が過剰発現された時に減少するのを確認することができ、これによってＶＲＫ２の酵素活性がシャペロニンタンパク質の量の減少において重要であることが分かった。

一方、翻訳阻害剤であるＣＨＸを処理した結果である図３ｃに示す通り、上段のイメージはＶＲＫ２、ＶＲＫ２−ＫＤが過剰発現された細胞でのシャペロニンタンパク質の寿命を示し、下のイメージはそれに対するローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨタンパク質の量を意味し、図３ｂに示された結果と同様に、シャペロニンタンパク質の寿命はＶＲＫ２タンパク質の酵素活性に依存的に減少するのを確認することができた。

具体的に、ＶＲＫ２酵素活性があるタンパク質の量を増やせば、タンパク質分解信号であるポリユビキチンが標識されたシャペロニン（ＣＣＴ４）の量が増えながらそれによってシャペロニンタンパク質（ＣＣＴ４）の量と寿命が両方とも減る現象を示す（図３ｂ及び図３ｃ）。

図３ｄに示す通り、左側から右側に行くほどタンパク質の大きさが小さくなることを示す。シャペロニンタンパク質は８個の小単位体から構成された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）２つが結合して作用するので、その大きさは非常に大きい。しかし、ＶＲＫ２タンパク質を過剰発現させた時、このような複合体が現れる分画でのシャペロニンタンパク質の量が減少するのを確認することができる。これはＶＲＫ２によって減ったＣＣＴ４タンパク質の量のために複合体形成が阻害されたことを意味する。つまり、ＶＲＫ２によって前記シャペロニンタンパク質の小単位体の一つであるＣＣＴ４の量が減りながらシャペロニンが複合体を形成せず相対的に単一体の量が増えることを示し、これによりシャペロニンタンパク質の機能が低下することを示唆している（図３ｄ）。

実施例４．ＶＲＫ２がシャペロニンタンパク質の寿命に対して及ぼす影響に関連する生体因子の究明
１）実験方法
前記実施例３で確認されたＶＲＫ２によるシャペロニンタンパク質の寿命減少に関与する生体因子を究明するために、次のような実験をした。本実験及び後述する実施例５に使用された各タンパク質に対するｓｉＲＮＡの配列は以下の通りである。
−ＶＲＫ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＶＲＫ２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
：ＧＣＡＡＧＧＵＵＣＵＧＧＡＵＧＡＵＡＵＵＵ（Ｄ−００４６８４−０６、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）
−ＣＯＰ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＰ１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
：ＧＡＡＡＵＧＡＣＣＵＧＣＡＡＵＵＣＧＡ（Ｄ−００７０４９−０１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）
−ＲＢＸ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＢＸ１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
：ＧＡＣＵＵＵＣＣＣＵＧＣＵＧＵＵＡＣＣＵＡＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）

ａ．ＶＲＫ２によるシャペロニンタンパク質の量調節に対するＣＯＰ１の役割確認
ユビキチン連結酵素の一つであるＣＯＰ１の役割がＶＲＫ２によるシャペロニンタンパク質の量調節に及ぶか確認するために、実施例１．２で使用されたｐＦｌａｇ−ＣＭＶ−ＶＲＫ２及びＣＯＰ１に対するｓｉＲＮＡと共にマイクロポレータ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（インビトロジェン社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（韓国細胞株銀行）に形質転換させた。詳しくは、細胞１．０ｘ１０^６個に２μｇのｐＦｌａｇ−ＣＭＶ−ＶＲＫ２と２μｌのｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＰ１、Ｄ−００７０４９−０１）２０μＭを混合して電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を行った。
前記電気穿孔を通じた形質転換後、２４時間後に培養皿からトリプシン（ウェルジン）を用いて細胞を剥ぎ取って１５００ｒｐｍで１分３０秒間遠心分離機を用いて集めた。その後のブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を通じて定量後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行する過程及びＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）溶液を用いた発色反応を通じてｘ線フィルム（ｘ−ｒａｙ ｆｉｌｍ）に現像してその量を確認する過程は前記実施例３．１）ｂと同様に行って図４ａに示した。その後、ＧＳＴがタギングされたＲＢＸ１（寄託番号ＡＦ１４０５９８）とＳＵＭＯがタギングされたＶＲＫ２を用いてＧＳＴプルダウンアッセイ（ＧＳＴ−ｐｕｌｌｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）を行って図４ｂに示した（Ｋａｎｇ，Ｔ．Ｈ． ａｎｄ Ｋ．Ｔ．Ｋｉｍ．， ２００６． Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ＶＲＫ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＨＲ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：８６３−９参照）。

ｂ．ＶＲＫ２によるシャペロニンタンパク質の寿命調節に対するＣＯＰ１の役割確認
ＶＲＫ２とＣＯＰ１に対するｓｉＲＮＡを遺伝子伝達システムであるマイクロポレータ（インビトロジェン）でＨｅＬａ細胞株（韓国細胞株銀行）に形質転換させた。
具体的に、細胞１．０ｘ１０^６個に２μｌのｓｉＲＮＡ（２０μＭ）を混合して電気穿孔法を行った。前記電気穿孔法を通じた形質転換後、２４時間後に翻訳阻害剤であるＣＨＸを５０μｇ／ｍｌで処理し、これから０時間、４時間、８時間、１２時間後に細胞を培養皿からトリプシン（ウェルジン）で剥ぎ取って１５００ｒｐｍで１分３０秒間遠心分離機を用いて集めた。
その後のブラッドフォードアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を通じて定量後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行する過程及びＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）溶液を用いた発色反応を通じてｘ線フィルム（ｘ−ｒａｙ ｆｉｌｍ）に現像してその量を確認する過程は前記実施例３．１）ｂと同様に行って図４ｃに示した。

２）実験結果
図４ａ乃至図４ｃに示されているように、ユビキチン連結酵素の一つであるＣＯＰ１（寄託番号ＢＣ０９４７２８）がシャペロニンタンパク質分解メカニズムに関与するのを確認することができた。

図４ａのそれぞれのイメージはＶＲＫ２とＣＯＰ１タンパク質の量を調節した時の細胞内のタンパク質の量を示す。図３ｂで確認した通り、シャペロニンタンパク質の量はＶＲＫ２タンパク質の量を増やした時に減少し、このようにＶＲＫ２タンパク質の量を増加させた場合にも細胞内のユビキチン連結酵素であるＣＯＰ１のタンパク質の量を減少させた時にはシャペロニンのタンパク質の量が減少していないのを確認することができた。これによってＶＲＫ２が作用するシャペロニンタンパク質分解メカニズムにＣＯＰ１ユビキチン連結酵素が作用することが分かる。つまり、ＣＯＰ１の発現量を減少させた場合、ＶＲＫ２のＣＣＴ４の量の減少に対する影響が抑制されたのを確認することができた（図４ａ）。また図４ｂに示す通り、ＣＯＰ１ユビキチン連結酵素の構成要素の一つであるＲＢＸ１とＶＲＫ２タンパク質がＧＳＴプルダウンアッセイ時に共に引き出されるのを確認することができ、したがってＶＲＫ２は特にＣＯＰ１の複合体構成要素であるＲＢＸ１（寄託番号ＡＦ１４０５９８）と相互作用するのを確認することができた。

図４ｃではシャペロニンタンパク質分解メカニズムに重要な役割を果たすと考えられるＶＲＫ２とＣＯＰ１のタンパク質発現量を細胞で全て低くした時にシャペロニンタンパク質の寿命が対照群に比べて増加するのを確認することができた。したがって、シャペロニンタンパク質分解過程にＶＲＫ２リン酸化酵素とＣＯＰ１ユビキチン連結酵素が作用することが分かる。

このように、前記実施例３で確認されたＶＲＫ２によるシャペロニンタンパク質の寿命減少に関与する生体因子はＣＯＰ１、特に前記ＣＯＰ１の複合体構成要素であるＲＢＸ１であるのを確認することができ、したがって前記ＣＯＰ１の発現をＣＯＰ１に対するｓｉＲＮＡによって阻害させた場合、ＶＲＫ２のシャペロニンタンパク質の寿命及び／または減少に対する影響が抑制できるのを確認することができた。

実施例５．ＶＲＫ２の発現量減少によるシャペロニンタンパク質に対する影響測定
１）実験方法
ＶＲＫ２の発現量を減少させた場合のシャペロニンタンパク質に対する影響、即ち、ハンチンチンタンパク質の凝集体量の変化を測定して図５ａ乃至図５ｃに示した。
このために、先ず実施例１に記載された方法と同様な方法でＨｅＬａ細胞株（韓国細胞株銀行）内にハンチンチンタンパク質の過剰発現を誘導した。その後、細胞内のＶＲＫ２タンパク質を除去するために、ＶＲＫ２のｍＲＮＡを標的化するｓｉＲＮＡ（ｓｉＶＲＫ２）及び対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔ）をＤｈａｒｍａｃｏｎ（ＵＳＡ）で入手して効率検証及び細胞内ＶＲＫ２の発現量減少に使用した。

具体的に、２４ウェルプレート（２４ｗｅｌｌｓ ｐｌａｔｅ）基準に２．５μｌのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（ｓｉＲＮＡ形質注入試薬）と２．５μｌの５μＭ ｓｉＶＲＫ２を無血清培養液（ＤＭＥＭ／ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））４７．５μｌにそれぞれ混合し、５分後にこの二つの溶液を混合した後、常温に２０分間放置し、細胞に直接一滴ずつ滴下してｓｉＶＲＫ２（Ｄ−００４６８４−０６、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を形質転換させた。その後、１日、２日、３日目に細胞をトリプシン（ウェルジン）で剥ぎ取り１５００ｒｐｍに１分３０秒間遠心分離して細胞を得た。その後、ＴＲＩ試薬（ＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて全体ＲＮＡを抽出し逆転写酵素（プロメガ）を用いてｃＤＮＡを得た（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，２０１０，３８（２０）：７０６８−７８参照）。
前記得られたｃＤＮＡとＶＲＫ２（寄託番号ＡＢ０００４５０）、ＧＡＰＤＨ（寄託番号ＮＭ_００２０４６）に対するプライマー（１０ｐＭ）１μｌを共に混合してＰＣＲを行った。

＜使用されたプライマー＞
−ＶＲＫ２ＲＴプライマー
正方向：５’−ＴＴＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＣＴＡＴＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
逆方向：５’−ＴＧＡＧＡＣＴＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
−ＧＡＰＤＨ ＲＴプライマー
正方向：５’−ＣＴＴＴＧＧＴＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
逆方向：５’−ＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＣＧＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＣＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
−ＰＣＲ条件：１．９５℃１０分、２．９５℃１５秒、３．６０℃１分で、２番乃至３番ステップを４０サイクルで遂行。

その後、ＰＣＲ産物を１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルに電気泳動した後、紫外線照射器（ＵＶ ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ、ＵＶＰ）を通じて観察して図５ａに示した。
その次に、カバースリップ（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）の上にＨｅＬａ細胞株が５−６０％程度成長した時、前述の形質転換方法を用いてｓｉＲＮＡ（ｓｉＶＲＫ２、ｓｉＣｏｎｔ）と実施例１のＨｔｔ−ｅｘｏｎ１−ＧＦＰ（ＨｔｔＱ１０３−ＧＦＰ）をＨｅＬａ細胞株に形質転換させた。その後、１日、２日、３日に細胞を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で１５分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ（５μｇ／ｍｌ）（シグマ）染色を常温で１０分間行い、ＰＢＳで３回洗浄した後、スライドガラス（ｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ）にマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）して蛍光顕微鏡（カールツァイス）でイメージを得て（図５ｂ）、前記得られた結果を定量化して図５ｃに示した。

２）実験結果
図５に示されているように、前記実施例２を通じて明らかにしたシャペロニンタンパク質の調節因子であるＶＲＫ２の発現量をｓｉＲＮＡを用いて低くした時、シャペロニンタンパク質の機能が向上しハンチンチンタンパク質凝集体の量が減るのを確認することができた。

先ず、図５ａに示されているように、ＶＲＫ２のｍＲＮＡを標的化するｓｉＶＲＫ２（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＵＳＡ）を細胞内のＶＲＫ２タンパク質を除去するために用いた結果、ＶＲＫ２の発現が測定されないのを確認することができた。

また、図５ｂで確認できるように、実験群（ｓｉＶＲＫ２を用いてＶＲＫ２タンパク質形成を抑制した細胞）と対照群（ＶＲＫ２タンパク質形成が抑制されない細胞）のハンチンチンタンパク質凝集様相を蛍光顕微鏡で観察した時、ＶＲＫ２タンパク質形成を抑制した細胞ではハンチンチンタンパク質が凝集せず細胞全体に分散して存在し、ハンチンチンタンパク質の凝集が非常に減少したのを確認することができた。

より具体的に凝集現象を示す細胞の数を目で数えてグラフで示した図５ｃを見れば、凝集現象を示す細胞の全体細胞数に対する比率（％）が処理１日目対照群の場合は約４％と示された反面、実験群は約１％程度に過ぎず、対照群で凝集現象を示す細胞の比率が約４倍程度高く示され、ＶＲＫ２タンパク質減少によりハンチンチンタンパク質の凝集が顕著に減少することが分かり、３日目には実験群が前記１日目の対照群で測定された細胞数である約４％にも至らない比率を示す反面、対照群の場合は約１７％に達する比率を示して約４倍を超過するのが確認でき、時間が経過するに従って効果の差が次第に大きくなるのを確認することができた。

このように、ＶＲＫ２及び／またはＣＯＰ１（特にＲＢＸ１）は退行性脳神経疾患を誘導するタンパク質凝集に関与するシャペロニンタンパク質の効果的な陰性調節者として作用できるのが分かる。従って、本発明は退行性脳神経疾患に対する効果的な予防または治療のために非常に有用に用いることができる。

本発明はアルツハイマー氏病、パーキンソン氏病、そしてハンチントン氏病のような退行性脳神経疾患を誘導するタンパク質凝集に関与するシャペロニン（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）タンパク質の調節物質探索方法、及びこれにより探索されたシャペロニンタンパク質の調節物質の退行性脳神経疾患の予防または治療用途に関する。

アルツハイマー氏病、パーキンソン氏病、そしてハンチントン氏病のような退行性脳神経疾患の代表的症状は特定タンパク質の凝集現象である。タンパク質凝集体は細胞内でタンパク質分解装置であるプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）の作用を抑制し、輸送タンパク質の移動を阻害する。そして他の転写調節タンパク質と共に凝集しながらこれらを隔離して遺伝子転写を変えることもある。また、ミトコンドリアの作用を妨害することによって酸化的ストレスを誘発して細胞死を誘導することもある。特に、神経細胞では前記のような作用によってシナプスを通じた神経信号伝達の副作用を起こすだけでなく神経細胞死滅を誘導して脳機能低下を招く。

また、本発明のまた他の一実施形態は前記探索方法によってシャペロニンタンパク質の量及び／または寿命を増加させる物質を探索する段階；及び前記段階を通じて探索された調節物質を退行性脳神経疾患の予防または治療を必要とする対象に治療学的有効量で投与する段階を含む退行性脳神経疾患の予防または治療方法を提供する。
好ましくは、前記退行性脳神経疾患の予防または治療を必要とする対象は人間を含む哺乳類であり得る。
前記退行性脳神経疾患は例えば、アルツハイマー氏病、パーキンソン氏病、またはハンチントン氏病などであり得、好ましくはハンチントン氏病であり得るが、これに制限されるのではない。

本発明によってシャペロニンタンパク質の新規な陰性調節因子が提供され、前記陰性調節因子をターゲットにしてシャペロニンタンパク質の調節物質をより迅速かつ簡便に探索することができる。さらに、前記探索された物質を用いることによって既存のタンパク質凝集体除去方法である自己消化作用による細胞死の恐れなくアルツハイマー氏病、パーキンソン氏病、またはハンチントン氏病などのような退行性脳神経疾患を効果的に予防または治療可能である。

ハンチンチン遺伝子のｅｘｏｎ１にはポリグルタミン領域（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｔｒａｃｔ）が存在し、本実験ではグルタミン個数が１０３個であるクローンを用いて凝集現象がより容易に誘導されるようにした。ハンチントン氏病の症状の程度と発病時期は前記ハンチンチン遺伝子ｅｘｏｎ１のポリグルタミン領域に存在するグルタミン数と関連があり、特にその数が２５個以下である時を野生型と言い、２５個以上である時から突然変異型と言うが、グルタミンの数が長くなるほど症状の程度は悪化し、発病時期は早められる現象を観察することができる。

Claims (16)

1. １）候補物質、及びＶＲＫ２を準備する段階；
   ２）前記ＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性を測定する段階；及び
   ３）前記候補物質とＶＲＫ２を共に処理時、ＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性の変化を測定する段階
   を含むシャペロニンタンパク質の調節物質探索方法。
2. 前記シャペロニンタンパク質の調節物質はシャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させるものであり、前記段階３）以後に、
   ４−１）前記候補物質処理によるＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性が前記候補物質を処理しない場合のＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性に比べて減少した場合、前記候補物質を前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質と判断する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記シャペロニンタンパク質の調節物質は前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を減少させるものであり、前記段階３）以後に、
   ４−２）前記候補物質処理によるＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性が前記候補物質を処理しない場合のＶＲＫ２の発現量またはリン酸化酵素活性に比べて増加した場合、前記候補物質を前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を減少させる物質と判断する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 請求項２の方法によって探索された前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質を有効性分として含む退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物。
5. 前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質は、ｓｉＶＲＫ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びその相補的配列からなるｓｉＶＲＫ２二重鎖である、請求項４に記載の退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物。
6. 前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質を前記全体組成物の総重量を基準に０．０００１乃至９９．９重量％で含む、請求項４に記載の退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物。
7. 前記退行性脳神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病である、請求項４に記載の退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物。
8. １）候補物質、及びＣＯＰ１を準備する段階；
   ２）前記ＣＯＰ１の発現量または酵素活性を測定する段階；及び
   ３）前記候補物質とＣＯＰ１を共に処理時、ＣＯＰ１の発現量または酵素活性の変化を測定する段階
   を含むシャペロニンタンパク質の調節物質探索方法。
9. 前記シャペロニンタンパク質の調節物質は前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させるものであり、前記段階３）以後に、
   ４−１）前記候補物質処理によるＣＯＰ１の発現量または酵素活性が前記候補物質を処理しない場合のＣＯＰ１の発現量または酵素活性に比べて減少した場合、前記候補物質を前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質と判断する段階をさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記シャペロニンタンパク質の調節物質は前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を減少させるものであり、前記段階３）以後に、
    ４−２）前記候補物質処理によるＣＯＰ１の発現量または酵素活性が前記候補物質を処理しない場合のＣＯＰ１の発現量または酵素活性に比べて増加した場合、前記候補物質を前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を減少させる物質と判断する段階をさらに含む、請求項８に記載の方法。
11. 請求項９の方法によって探索された前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質を有効性分として含む退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物。
12. 前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質は、
    ｓｉＣＯＰ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びその相補的配列からなるｓｉＣＯＰ１二重鎖、及びｓｉＲＢＸ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びその相補的配列からなるｓｉＲＢＸ１二重鎖からなる群より選択された１種以上である、請求項１１に記載の退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物。
13. 前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質を前記全体組成物の総重量を基準に０．０００１乃至９９．９重量％で含む、請求項１１に記載の退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物。
14. 前記退行性脳神経疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、またはハンチントン病である、請求項１１に記載の退行性脳神経疾患の予防または治療用組成物。
15. １）候補物質、ＶＲＫ２、及びＣＯＰ１を準備する段階；
    ２）前記ＶＲＫ２及び前記ＣＯＰ１間結合有無を測定する段階；及び
    ３）前記候補物質、ＶＲＫ２、及びＣＯＰ１を共に処理時、前記ＶＲＫ２及び前記ＣＯＰ１間結合形成有無を測定する段階；
    を含むシャペロニンタンパク質の調節物質探索方法。
16. 前記シャペロニンタンパク質の調節物質はシャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させるものであり、前記段階３）以後に、
    ４）前記候補物質処理によって前記ＶＲＫ２及び前記ＣＯＰ１間結合形成が抑制される場合、前記候補物質を前記シャペロニンタンパク質の量または寿命を増加させる物質と判断する段階をさらに含む、請求項１５に記載の方法。