CN112166326A - Pbmc样本中的hsp70蛋白水平作为疾病的生物标记物 - Google Patents

Abstract

本文公开了基于鉴定PBMC样本中降低的Hsp70水平的方法，所述降低的Hsp70水平作为表现出降低的Hsp70水平的疾病的生物标记物，例如溶酶体贮积病、神经退行性疾病和肌肉疾病。

Description

PBMC样本中的HSP70蛋白水平作为疾病的生物标记物

技术领域

本发明涉及以下发现：热休克蛋白70(Hsp70)在溶酶体贮积病NPC的外周血单核细胞(PBMC)患者样本中显著降低，因此先前观察到在病理上受累的疾病组织(包括脑和肝组织)中所观察到的降低的Hsp70水平直接转化为PBMC样本中较低的Hsp70蛋白水平，从而提供了一种简单的Hsp70水平检测手段。

背景技术

Hsp70蛋白是最广泛研究的热休克蛋白(HSP)家族之一，在所有真核细胞中合成。Hsp70蛋白具有广谱的伴侣功能，并提供许多细胞内过程的正常过程。此外，它们还参与细胞对应激的耐受；特别是，它们防止蛋白的聚集，并有助于消除应激条件下受损的蛋白。

Hsp70蛋白是由应激和热休克所诱导的，许多报道都证明了Hsp70的表达与疾病或其他应激和运动状况之间的相关性。例如，在心血管疾病(急性心肌梗死后的心力衰竭、外周动脉疾病)、癌症患者(例如小细胞肺癌、胆管癌、头颈癌、胰腺癌)、先兆子痫和病理妊娠、妊娠糖尿病、多囊卵巢综合征、炎症、哮喘和体弱的老年患者中发现了Hsp70(血浆或血清)循环水平提高。发现这种提高的Hsp70循环水平可预测疾病进展和不利的临床结果。

在某些病理状况下，蛋白质量控制机制不足以防止错误折叠的蛋白积聚。Hsp70充当分子伴侣并保护神经元免受蛋白聚集和毒性的影响。各种神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和遗传性多聚谷氨酰胺(PolyQ)病(例如，亨廷顿氏病(HD)；1、2、3、6、7和17型脊髓小脑共济失调(SCA)；脊髓延髓肌萎缩症(SBMA)；齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩(dentatorubral pallidoluysian atrophy)(DRPLA))，中的常见特征是错误折叠的蛋白在脑(内部和外部神经元)中的积聚和沉积，以及中枢神经系统(CNS)中选择性的神经元损失。对于所有这些构象/错误折叠疾病，错误折叠的蛋白被认为是常见的治疗靶标，并且许多研究集中在HSP的神经保护作用上。

世界范围内神经退行性疾病的发病率很高。随着神经退行性疾病不成比例地影响老年个体，与疾病相关的发病率随着寿命的普遍延长而提高。了解导致神经退行性病变的潜在机制是确定预防和治疗方法的关键。研究人员已经观察到在各种脑病模型中，预处理、过度表达或药物诱导的HSP的保护作用。实验数据表明，操纵细胞应激反应(包括提供Hsp70)可能在神经退行性疾病进展过程中提供对脑的保护策略。

溶酶体贮积病(LSD)是一组罕见的疾病，其特征在于溶酶体区室中物质的积聚和由此造成的不稳定，对受影响的个体造成毁灭性影响。归因于缺乏分解代谢物质所涉及的酶，物质在溶酶体区室中积聚。

如果可能的话，大多数LSD患者最初都通过酶测定来筛查，这是进行明确诊断的最有效方法。在某些已知引起疾病的突变的家族中，以及在某些遗传隔离群中，可以进行突变分析。由于可能存在许多不同的突变，因此有时需要对编码特定受影响蛋白/酶的基因进行测序，以确认诊断。当存在已知的遗传风险因素时，出生前诊断可能会有用。

LSD包括尼曼皮克病，包括A、B和C型。从历史上看，通过对培养的皮肤成纤维细胞进行酯化研究和非律平(filipin)染色，从组织病理学角度对C型尼曼皮克病(NPC)进行诊断，在这种可靠但昂贵且困难的确定性研究之前，大多数患者接受不同测试的组合。这些测试可能包括：壳丙糖苷酶的测量、进行白细胞酶研究以排除其他溶酶体贮积病以及骨髓穿刺和肝活检标本的荧光和电子显微镜检查。由于非律平染色测试的困难，目前进行最广泛且可接受的确定性诊断测试是NPC1和NPC2基因的测序。尤其是当相关的基因包含在适合患者的多基因盘(panel)当中时(所述患者具有特定的疾病表型，例如新生儿胆汁淤积性黄疸)，下一代测序仪使这一操作变得更为容易，但这种方法也不是没有局限性。在10％的患者中只能鉴定出一个致病突变，而在某些患者中，可以鉴定出临床意义不确定的新突变。

已证明，在C型尼曼皮克病(NPC)小鼠模型(Npc1^-/-)脑和肝脏中的Hsp70水平低于野生型小鼠器官中的Hsp70水平(Kirkegaard，T.等人2016)。

因此，许多疾病表现为在受影响组织中(例如CNS和PNS的神经元以及患病个体的器官中)降低的Hsp70水平。

发明内容

许多疾病表现为降低的Hsp70水平，并且将降低的Hsp70水平的这一发现作为辅助鉴定所述疾病的通用生物标记物或者替代地作为鉴定患者亚群的通用生物标记物(所述患者亚群患有共表现为降低的Hsp70水平的疾病)将是非常有用的。

该发现可用于诊断患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者的方法，而不论这种降低的Hsp70的病理后果和症状如何，或者替代地该发现可用于鉴定或诊断患有共表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者亚群。其还可用于监测患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体中疾病进展和疗法功效的方法。

因此，除了测量Hsp70水平外，通常还单独、同时或随后进行进一步的水平的诊断，以确定表现为或共表现为降低的Hsp70水平的特定的疾病。正确的诊断对于实现正确的治疗方案至关重要，包括已批准且特异于给定病理学的治疗方案，并且提供了用于测试与Hsp70补充和诱导疗法的联合治疗的可能性。

在C型尼曼皮克病小鼠模型的脑组织和肝组织样本中已证明了降低的Hsp70水平。然而，在组织如脑组织和肝组织样本中发现的生物标记物在诊断NPC方面则认为不适用，更不用说任何其他表现为降低的Hsp70水平的疾病了。因此，有必要采用其他手段来鉴定表现为降低的Hsp70水平的疾病。

本发明人惊奇地发现，与健康对照相比，尤其是来自患有C型尼曼皮克病的患者的外周血单核细胞(PBMC)样本含有实质上降低或减少的热休克蛋白70(Hsp70)水平。

通过简单地抽取血液样本并执行几个简单的PBMC分开与分离步骤，可以轻松地从个体获得PBMC样本。因此，新的观察表明，在病理上受累的疾病组织(包括脑和肝组织)中观察到的低Hsp70水平直接转化为PBMC样本中的低水平Hsp70蛋白，这为检测Hsp70水平提供了一种简单、容易且灵巧的方式。

本公开的一个方面提供一种检测外周血单核细胞(PBMC)样本中Hsp70的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供PBMC样本，和

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，和

c)任选地，定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平。

在本公开的另一个方面中，提供了一种诊断个体中表现为降低的Hsp70水平的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述个体的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，和

d)任选地，分类或确定个体是否患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在本公开的另一个方面中，提供了一种选择患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述患者的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，和

d)分类或确定所述个体是否具有降低的Hsp70水平。

在本公开的另一个方面中，提供了一种监测患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体中疾病进展的方法，所述方法包括以下步骤：

i.在两个或更多个后续时间点，提供一个或多个来自所述个体的PBMC样本，

ii.检测每个所述PBMC样本中的Hsp70，

iii.定量或确定每个所述PBMC样本中的Hsp70水平。

在本公开的另一个方面中，提供了一种监测患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体中用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法功效的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在实施、维持、降低或提高疗法之前、期间和/或之后，提供来自所述个体的一个或多个PBMC样本，

b)检测所述一个或多个PBMC样本的每个样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述一个或多个PBMC样本的每个样本中的Hsp70水平。

在一个实施方案中，所述表现为降低的Hsp70水平的疾病选自：溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良和炎性肌肉病症。

附图说明

图1.第一次和第二次临床研究回访时，定量分离自患有C型尼曼皮克病(NPC)个体的PBMC样本中，或者来自健康个体(对照)的PBMC样本中的Hsp70蛋白水平。如通过ELISA确定的，与从健康对照获得的PBMC样本相比，从NPC患者获得的PBMC样本中的Hsp70水平显著降低。

图2.NPC严重程度评分(NPCCSS)与获自患有C型尼曼皮克病个体的PBMC样本中的Hsp70水平的比较。未观察到Hsp70水平与NPCCSS之间的相关性。

图3.第一次和第二次回访时，获自患有C型尼曼皮克病个体的PBMC样本中的Hsp70水平的比较。在第一次临床研究回访后6到14个月，进行第二次临床研究回访。在临床研究回访1和2之间的时间内，未观察到Hsp70水平的变化。

图4.阿莫氯醇(arimoclomol)治疗(包括治疗前)的NPC患者中的HSP70水平。

图5.在用阿莫氯醇治疗的NPC患者中的HSP70水平。

具体实施方式

本发明基于以下发现：与对照相比，来自患有C型尼曼皮克病、溶酶体贮积病的患者外周血单核细胞(PBMC)样本中Hsp70的水平下降，其中所述C型尼曼皮克病和溶酶体贮积病在病理上受累的疾病组织(包括脑和肝组织)中表现为降低的Hsp70水平。

Hsp70蛋白参与了广泛的细胞过程，包括蛋白折叠和不稳定细胞蛋白的降解以及其他细胞保护作用。因此，Hsp70在细胞稳态和多种表现为降低的Hsp70水平疾病(包括溶酶体贮积病、神经退行性疾病以及一些神经肌肉和肌肉疾病)中起着多种重要作用。

LSD是一组罕见的遗传性代谢病症，其由溶酶体功能缺陷所致，溶酶体功能缺陷是缺乏脂质、糖脂、糖蛋白或粘多糖的代谢或转运所需的单一溶酶体蛋白或酶的后果。尽管每种病症都是由引起缺乏蛋白活性的不同基因突变引起的，但它们都具有共同的生化特征–所有溶酶体病症均源于溶酶体内物质的异常积聚。溶酶体贮积病主要影响儿童，并且他们往往在年幼时和难以预测的年龄死亡，许多死于出生后的几个月或几年之内。许多其他儿童在遭受了多年的其特定疾病的各种症状后死于该疾病。

C型尼曼皮克病(NPC)是神经鞘脂贮积症型的毁灭性溶酶体贮积病，由NPC1或NPC2基因中的突变引起，导致溶酶体区室功能失调和胆固醇、鞘氨醇和鞘糖脂在多个组织异常积聚。鉴定血液样本中的生物标记物以跟踪疾病的进展主要集中在胆固醇及其衍生物上。

NPC在脑和肝组织中也表现为降低的Hsp70水平，并且现在发明人已经确定该发现转化为NPC患者外周血单核细胞(PBMC)样本中降低的Hsp70水平。

患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者可受益于提高Hsp70水平。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者的方法，所述个体可受益于提高Hsp70水平。

在一个实施方案中，提高Hsp70水平包括通过增加Hsp70基因表达来提高Hsp70的细胞内浓度。

在一个实施方案中，提高Hsp70水平包括通过施用Hsp70或其功能片段或变体来提高Hsp70的细胞内浓度。

热休克蛋白70家族

Hsp70蛋白参与了广泛的细胞过程，包括蛋白折叠和不稳定细胞蛋白的降解以及起到其他细胞保护作用。在这些过程中，Hsp70的共同功能似乎是结合部分折叠的多肽中的短疏水片段，从而促进正确的折叠并防止聚集。在真核生物中，Hsp70分子伴侣在体内与不同种类的蛋白相互作用，这些不同种类的蛋白可调节其功能周期的关键步骤；其中包括J结构域家族蛋白Hsp40。此外，还确定了其他伙伴蛋白，其中一些将Hsp70连接至其他分子伴侣系统(例如Hsp90系统)。

人Hsp70家族的成员

归因于分子伴侣的一些重要功能包括将蛋白导入细胞区室，蛋白在胞质溶胶、内质网和线粒体中折叠，防止蛋白聚集和错误折叠的蛋白重新折叠。目前，人Hsp70家族包括15个由不同基因编码的成员。Hsp70基因和蛋白在本文中通过其基因座名称来指代。提及Hsp70时通常是指两个主要的可诱导Hsp70家族成员，其基因座名称分别为HSPA1A和HSPA1B，但从文中可以明显看出，它通常也可以指代整个Hsp70家族。

HspA1A和HspA1B

从基因座HSPA1A和HSPA1B转录的基因是两个热/应激可诱导的Hsp70基因，并且有关人Hsp70的大多数文献都提到了这两个基因编码的蛋白。这些基因产生的蛋白由641个氨基酸组成，彼此具有99％的同源性，并且是第一个被克隆和表征的人Hsp70家族成员。这些基因在MHC-III类复合物中在6p21.3处连接，无内含子，并且包含带有HSE的启动子区域，从而使它们能够结合HSF并诱导转录，以响应各种细胞攻击。

HspA1L和HspA2

因为雄性生殖细胞强烈偏爱其表达，因此两个Hsp70家族成员被称为“沙文(chauvinist)基因”。hspA1L基因是组成型表达的无内含子Hsp70家族成员，位于6号染色体上同一MHC-III类复合物中HSPA1A基因座远端4kb。在热休克前后，其均少量表达，但其表达方式有利于小鼠、大鼠和人的睾丸，其中641个氨基酸(aa)蛋白与HspA1A同源性为90％。hspA2基因最初是从小鼠基因组文库中分离出来的，但后来在人体各种组织(包括骨骼肌、卵巢、小肠、结肠、脑、胎盘和肾脏)中低水平组成型表达，但在睾丸中高表达。其表达或者缺乏与人精子发生异常有关，并且雄性hspA2^(-/-)小鼠是不育的。该基因位于14号染色体上，产生了一个与HspA1A具有84％同源性的639aa蛋白，有两篇论文提出了不同的基因座位置-14q24.1与14q22，因此确切的位置尚待讨论。

HspA6和HspA7

hspA6和hspA7基因是Hsp70家族的热诱导成员，在小鼠中没有明显的对应物。它们在其启动子位点含有HSE，并且基因是无内含子的。它们共定位在1号染色体上，并且核苷酸序列彼此94％同源。但是，只有HspA6起作用，因为hspA7基因带有一个单核苷酸插入，从而在+1324处产生过早的终止密码子。HspA6蛋白长643个氨基酸，并且与HspA1A和HspA1B具有77％的同源性。

HspA5和HspA9

hspA5和hspA9基因是Hsp70家族的两个区室特异性成员。655个氨基酸的HspA5蛋白位于内质网(ER)中，并且有助于在该区室中折叠和转运新合成的蛋白。该蛋白与HspA1A有64％的同源性，该基因位于9q34。679aa的HspA9蛋白位于线粒体中，其中在蛋白跨过线粒体膜转运后，它有助于蛋白折叠。HspA9位于5q31.1，该蛋白与HspA1A具有52％同源性。

HspA8

称为Hsc70的同源Hsp70成员由11q24处名为hspA8的基因编码，产生了与HspA1A具有86％同源性的646aa蛋白，并在所有组织和细胞系中组成型表达。该蛋白在其细胞功能上类似于Hsp70，可在正常情况下提供所需的伴侣，但也被认为在脱除网格蛋白包被的囊泡以及分子伴侣介导的自噬中起作用。HspA3和HspA4、HspA4L、HspA12A和HspA14将不在本文进一步讨论。

表1：人Hsp70基因家族的列表。根据基因座名称、本文使用的名称、染色体位置(位置)、与HspA1A的氨基酸同源性以及文献中经常出现的替代名称列出基因。

涉及Hsp70生物标记物的方法

发明人已经发现，与健康对照相比，Hsp70水平尤其在获自患有疾病的患者的PBMC样本中显著更低，所述疾病已知在病理上受累的疾病组织(包括脑和肝组织)中表现为降低的Hsp70水平。通过Hsp70疗法可以缓解表现为降低的Hsp70水平的疾病，因此，本公开为选择可能受益于Hsp70疗法治疗的患者提供了方法。

此处的“降低的”水平可以与降低的或更低的水平互换使用。与对照相比(如健康的个体)，或者与不同的时间点相比(例如，第一次回访/样本与之后的回访/样本相比较)，Hsp70水平可以降低或更低。

本发明的方法允许容易且灵巧地检测PBMC样本中的所述Hsp70水平，并允许将PBMC中的Hsp70用作生物标记物，以提供可靠且容易的工具来鉴定表现为降低的Hsp70水平的疾病。

本发明的方法包括检测和定量获自个体的PBMC样本中的Hsp70。

因此，检测和定量PBMC样本中的Hsp70可用于诊断或鉴定患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者的方法。

因此，与健康对照中检测到的量相比，来自个体的PBMC样本中Hsp70量的降低指示着表现为降低的Hsp70水平的疾病；或指示着患者适合Hsp70疗法。

本发明的方法也可以用于监测患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体或患者中疾病进展的方法。

本发明的方法还可以用于监测患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体或患者中治疗功效的方法。

检测Hsp70的方法

本公开的一个方面提供一种检测PBMC样本中Hsp70的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，和

c)任选地，定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平。

在一个实施方案中，检测和/或定量Hsp70是指检测和定量Hsp70蛋白。

在一个实施方案中，检测和/或定量Hsp70是指检测和定量HspA1A和HspA1B之一或两者。

在一个实施方案中，检测和/或定量Hsp70是指检测和定量HspA1A和HspA1B之一或两者，而没有或几乎没有检测HspA5和/或HspA8。

在一个实施方案中，检测和/或定量Hsp70包括检测天然存在的Hsp70和天然存在的Hsp70变体，例如天然存在的HspA1A和/或HspA1B以及天然存在的HspA1A和/或HspA1B变体。天然存在的HspA1A和/或HspA1B变体是技术人员已知的。

在一个实施方案中，所述Hsp70选自HspA1A(SEQ ID NO：1和2)和HspA1B(SEQ IDNO：4和5)，或其功能片段或变体。在SEQ ID NO：2中，去除了SEQ ID NO：1的起始甲硫氨酸(位置1处的M)。在SEQ ID NO：5中，去除了SEQ ID NO：4的起始甲硫氨酸(位置1处的M)。在体内，这通过翻译后加工进行。

在一个实施方案中，检测PBMC样本中的Hsp70的所述方法是体外方法。

在一个实施方案中，定量是指确定PBMC样本中存在的所述Hsp70蛋白的水平。

在一个实施方案中，检测和/或定量PBMC样本中的Hsp70水平。在一个实施方案中，所述PBMC样本获自或可获自个体。在一个实施方案中，所述个体患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。在一个实施方案中，所述个体患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有选自以下的溶酶体贮积病：脂质贮积病(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病，及其在本文其他地方所述的任何亚型(包括例如尼曼皮克病)。在一个实施方案中，所述个体患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良或炎性肌肉病症，如本文其他地方所述。PBMC样本在本文其他地方进一步详细公开。

因此，在一个实施方案中，本公开提供了检测PBMC样本中Hsp70的方法，其包括以下步骤：

a)提供PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，和

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平。

还公开了一种检测PBMC样本中的HspA1A和/或HspA1B的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的HspA1A和/或HspA1B，以及

c)任选地，定量或确定所述PBMC样本中的HspA1A和/或HspA1B水平。

在一个实施方案中，检测和任选地定量PBMC样本中的Hsp70的所述方法包括检测和任选地定量：

i)HspA1A，

ii)HspA1B，或

iii)HspA1A和HspA1B。

在一个实施方案中，本发明检测和任选定量HspA1A和/或HspA1B的方法不排除检测其他Hsp70蛋白。

因此，在一个实施方案中，本公开提供了一种检测PBMC样本中Hsp70的方法，包括以下步骤：

a)提供PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，和

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，

其中所述PBMC样本是从个体获得的，所述个体患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病，包括溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良或炎性肌肉病症，如本文其他地方所述。

本文还公开了一种在实施、维持、降低或提高疗法之前、期间和/或之后检测和任选定量来自个体或患者的PBMC样本中Hsp70的方法，所述个体或患者患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，所述个体患有选自以下的溶酶体贮积病：脂质贮积病(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病，及其在本文其他地方所述的任何亚型(包括例如尼曼皮克病)。在一个实施方案中，所述个体患有神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良或炎性肌肉病症，如本文其他地方所述。

在一个实施方案中，所述疗法包括用于诱导Hsp70水平和/或活性的疗法，例如能够诱导Hsp70表达和/或Hsp70活性的生物活性剂。在一个实施方案中，所述疗法包括用于治疗疾病的疗法，所述疾病表现为降低的Hsp70水平，例如有效治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的生物活性剂。疗法和生物活性剂在本文其他地方公开。

在一个实施方案中，所述检测和任选地定量来自个体的PBMC样本中Hsp70的方法包括：

i)在实施、维持、降低或提高疗法之前，从患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体获得一个或多个PBMC样本；

ii)在疗法期间，从患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体获得一个或多个PBMC样本；和/或

iii)在实施、维持、降低或提高疗法之后，从患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体获得一个或多个PBMC样本；和/或

iv)在实施、维持、降低或提高疗法之前、期间和/或之后，从患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体获得一个或多个PBMC样本。

本文还公开了一种在后续时间点检测和任选定量来自患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体的PBMC样本中Hsp70的方法，以监测疾病进展。

本文还公开了一种检测和任选地定量来自疑似患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体的PBMC样本中Hsp70的方法，以诊断所述疾病。

本文中其他地方公开了提供PBMC样本的方法、PBMC样本的性质以及检测Hsp70和定量Hsp70的手段。

Hsp70的检测和定量

本文公开的方法包括检测PBMC样本中Hsp70的一个或多个步骤，包括以下步骤：

a)提供来自个体的一个或多个PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，和

c)任选地，定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平。

可以在DNA水平、RNA/mRNA水平和/或蛋白水平检测根据本公开的PBMC中的Hsp70。在一个优选的实施方案中，在蛋白水平检测Hsp70。

Hsp70的检测和定量可以通过本领域已知的几种方法来进行，并且可以包括一个或多个步骤。Hsp70的检测和定量可以通过技术人员已知的任何方法进行。

在一个实施方案中，通过使PBMC样本经历一个或多个检测和/或定量步骤来进行检测所述PBMC样本中的Hsp70的步骤b)。

在一个实施方案中，通过光谱法或抗体依赖性方法进行Hsp70蛋白的检测和定量。

在一个实施方案中，通过选自以下的方法进行Hsp70蛋白的检测和定量：酶联免疫吸附测定(ELISA)、western印迹、蛋白免疫沉淀、免疫电泳、蛋白免疫染色、高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱(LC/MS)。

在一个实施方案中，使用质谱法进行Hsp70蛋白的检测和定量。在一个实施方案中，使用质谱法对干血斑(DBS)样本中的Hsp70蛋白进行检测和定量。

干血斑测试(DBS)是一种生物采样的形式，对于本领域技术人员来说是众所周知的，其中血液样本(例如每斑70μL全血)在滤纸上点样(blot)并干燥。干燥的样本可以容易地运送到分析实验室，并使用各种方法进行分析，例如本文所述的方法，例如质谱法。在一个实施方案中，从浸泡在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的血斑中提取总蛋白。在一个实施方案中，将该蛋白进一步进行胰蛋白酶消化、纯化并通过质谱进行分析。

在一个实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行Hsp70蛋白的检测和定量。

在一个实施方案中，检测所述PBMC样本中的Hsp70的步骤b)和/或任选地定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平的步骤c)包括以下一个或多个步骤：

i)裂解PBMC样本，和/或

ii)将裂解的PBMC样本中存在的Hsp70蛋白固定，和/或

iii)一抗与所述固定的Hsp70蛋白结合，和/或

iv)二抗与iii)的一抗结合，和/或

v)链霉亲和素缀合物与二抗结合，以提供链霉亲和素缀合物，和/或

vi)对结合至Hsp70蛋白的一抗进行可视化，和/或

vii)对二抗进行可视化。

在一个实施方案中，iii)的一抗与生物素分子共价结合，以允许链霉亲和素缀合物与所述二抗结合。

在一个实施方案中，所述一抗、所述二抗或v)的所述链霉亲和素缀合物与酶或荧光探针共价结合。

步骤vi)和vii)中，通过比色检测、化学发光检测、放射性检测、电化学检测或荧光检测，对结合至Hsp70的一抗进行可视化，或对结合至一抗的二抗进行可视化。在一个实施方案中，可视化包括通过酶转化一个或多个底物，所述酶共价结合至所述结合至Hsp70的一抗、所述结合至一抗的二抗或所述结合至一抗的链霉亲和素缀合物。

在一个实施方案中，共价结合至所述结合至Hsp70的一抗、所述结合至一抗的二抗或所述结合至一抗的链霉亲和素缀合物的酶是辣根过氧化物酶(HRP)。在一个实施方案中，所述底物选自过氧化氢、鲁米诺、四甲基联苯胺。

在一个实施方案中，检测所述PBMC样本中的Hsp70的步骤b)和/或任选地定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平的步骤c)进一步包括在裂解、固定、结合和可视化步骤之间的洗涤步骤。

ELISA通常适合于测量样本中给定蛋白的存在和/或量。因此，ELISA适用于测量PBMC样本中Hsp70的存在和/或量。

在一个实施方案中，检测所述PBMC样本中的Hsp70的步骤b)和/或任选地定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平的步骤c)包括直接检测Hsp70(例如通过ELISA)的一个或多个步骤。

在一个实施方案中，使用校准的标准品来定量PBMC样本中存在的Hsp70。

在一个实施方案中，用于定量的校准的标准品以不同的浓度使用。

在一个实施方案中，通过选自Northern印迹、核糖核酸酶保护测定(RPA)和实时聚合酶链反应(RT-PCR)的方法进行Hsp70 mRNA的检测和定量。

诊断方法

本公开的一个方面提供了一种诊断个体中表现为降低的Hsp70水平的疾病的方法，所述方法包括检测从个体获得或可从个体获得的PBMC样本中Hsp70的步骤。

在一个实施方案中，所述用于诊断表现为降低的Hsp70水平的疾病的方法还包括定量或确定PBMC样本中存在的Hsp70水平的步骤。

在一个实施方案中，PBMC样本中存在的Hsp70水平指示个体是否患有(或正罹患)表现为降低的Hsp70水平的疾病，或指示个体是否可能患有或处于患有(或正罹患)表现为降低的Hsp70水平的疾病的风险中。

例如，基于例如家族史或基于存在指示LSD的症状，当个体疑似患有或罹患表现为降低的Hsp70水平的疾病时，所述方法可以用于确认疑似的诊断。除了已知的诊断疾病(所述疾病表现为降低的Hsp70水平)的方法外，还可以使用这些方法。

因此，本公开的一个方面提供一种诊断个体中表现为降低的Hsp70水平的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述个体的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，和

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平。

在一个实施方案中，PBMC样本中存在的Hsp70水平指示个体是否患有(或正罹患)表现为降低的Hsp70水平的疾病，或指示个体是否可能患有或处于患有(或正罹患)表现为降低的Hsp70水平的疾病的风险中。

还公开了一种诊断个体中表现为降低的Hsp70水平的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述个体的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，和

d)分类或确定所述个体是否患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，所述PBMC样本获自或可获自个体。

在一个实施方案中，公开了一种诊断个体中表现为降低的Hsp70水平的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述个体的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，和

d)分类或确定所述个体是否患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病，

其中所述疾病是本文其他地方所述的溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良或炎性肌肉病症。

在一个实施方案中，所述溶酶体贮积病选自：脂质贮积病(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病，及其在本文其他地方所述的任何亚型。在一个实施方案中，所述溶酶体贮积病是尼曼皮克病，例如NPC。

在一个实施方案中，所述诊断表现为降低的Hsp70水平的疾病的方法包括检测和定量或确定选自以下的水平：

i)HspA1A，

ii)HspA1B，或

iii)HspA1A和HspA1B。

在一个实施方案中，分类或确定所述个体是否患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的步骤d)是这样的步骤：分类或确定所述个体患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

除非另有说明，否则本文中提及“所述样本”或“样本”是指来自患有或疑似患有疾病的个体的PBMC样本，所述疾病表现为降低的Hsp70水平。相反，来自健康对照的样本将被称为来自健康对照或对照样本的PBMC样本。

在一个实施方案中，分类或确定所述个体患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的所述步骤d)包括相较于从健康对照获得或可获得PBMC样本中的水平，确定PBMC样本中的Hsp70水平。在本文中，健康对照是指没有患有或没有疑似患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体。优选地，健康对照也没有表现出任何其他明显的疾病。在一个实施方案中，健康对照可以是任何年龄的。在一个实施方案中，健康对照是年龄匹配的对照。在一个实施方案中，健康对照为30岁以下，例如29岁以下，例如28岁以下，例如27岁以下，例如26岁以下，例如25岁以下，例如24岁以下，例如23岁以下，例如22岁以下，例如21岁以下，例如20岁以下，例如19岁以下，例如18岁以下。在一个实施方案中，健康对照在20岁以下。在一个实施方案中，健康对照介于约4至约18岁之间。在一个实施方案中，健康对照介于约2至约4岁之间。

在一个实施方案中，与健康对照中的水平相比，PBMC样本中降低的Hsp70水平指示所述个体患有、可能患有或处于患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的风险中。

在一个实施方案中，PBMC样本中的Hsp70水平与健康对照中的水平相当或相等，指示所述个体没有患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，PBMC样本中的Hsp70水平高于健康对照中的水平，指示所述个体没有患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，当存在选自以下的情况时，所述个体可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病：

i)与健康对照中的水平相比，所述PBMC样本中的Hsp70水平降低或检测不到；

ii)与健康对照中的水平相比，所述PBMC样本中的HspA1A水平降低或检测不到；

iii)与健康对照中的水平相比，所述PBMC样本中的HspA1B水平降低或检测不到；和/或

iv)与健康对照中的水平相比，所述PBMC样本中的HspA1A和HspA1B水平降低或检测不到。

在一个实施方案中，当PBMC样本中的Hsp70水平比健康对照中的水平低1至1000倍时，例如比健康对照中的水平低1至2倍、2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至11倍、11至12倍、12至13倍、13至14倍、14至15倍、15至16倍、16至17倍、17至18倍、18至19倍、19至20倍、20至25倍、25至30倍、30至35倍、35至40倍、40至45倍、45至50倍、50至75倍、75至100倍、100至150倍、150至200倍、200至250倍、250至300倍、300至400倍、400至500倍、500至750倍、750至1000倍、或检测不到，则所述个体可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，当PBMC样本中的HspA1A和/或HspA1B水平比健康对照中的水平低1至1000倍时，例如比健康对照中的水平低1至2倍、2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至11倍、11至12倍、12至13倍、13至14倍、14至15倍、15至16倍、16至17倍、17至18倍、18至19倍、19至20倍、20至25倍、25至30倍、30至35倍、35至40倍、40至45倍、45至50倍、50至75倍、75至100倍、100至150倍、150至200倍、200至250倍、250至300倍、300至400倍、400至500倍、500至750倍、750至1000倍、或检测不到，则所述个体可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，“检测不到”是指没有观察到信号，例如没有信号超过基线噪声。在一个实施方案中，“检测不到”是指Hsp70水平在PBMC样本中检测不到。

在一个实施方案中，分类或确定所述个体是否患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的所述步骤d)包括确定所述PBMC样本中Hsp70的量是否低于预定义的截止值或检测不到。

当Hsp70的量低于上述截止值时，所述个体患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。当Hsp70的量等于或高于上述截止值时，则所述个体没有患有或不太可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，分类或确定所述个体没有患有或不太可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病所述步骤d)包括确定所述PBMC样本中Hsp70的量是否等于或高于预定义的截止值。

所述截止值是基于健康对照中的值确定的，并且与患有表现为降低的Hsp70水平的疾病个体中的值进行比较。

在一个实施方案中，所述截止值是与患有LSD(如尼曼皮克病，如C型尼曼皮克病)的患者的值相比较，基于健康对照中的值而确定的。

5000pg/mL PBMC的Hsp70截止值意味着5000pg/mL或更少的Hsp70值指示着所述个体患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，当所述PBMC样本中Hsp70的量为7500pg/mL或更少，例如7000pg/m或更少，例如6500pg/mL或更少，例如6000pg/mL或更少，例如5500pg/mL或更少，例如5000pg/mL或更少，例如4500pg/mL或更少，例如4000pg/mL或更少，例如3500pg/mL或更少，例如3000pg/mL或更少，例如2500pg/mL或更少，例如2000pg/mL或更少，例如1500pg/mL或更少，例如1000pg/mL PBMC或更少时，则所述个体患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，当所述PBMC样本中HspA1A和/或HspA1B的量为7500pg/mL或更少，例如7000pg/m或更少，例如6500pg/mL或更少，例如6000pg/mL或更少，例如5500pg/mL或更少，例如5000pg/mL或更少，例如4500pg/mL或更少，例如4000pg/mL或更少，例如3500pg/mL或更少，例如3000pg/mL或更少，例如2500pg/mL或更少，例如2000pg/mL或更少，例如1500pg/mL或更少，例如1000pg/mL PBMC或更少时，则所述个体患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

相反，当所述PBMC样本中的Hsp70的量高于5000pg/mL时，例如高于5500pg/mL，例如高于6000pg/mL，例如高于6500pg/mL，例如高于7000pg/mL，例如高于7500pg/mL，例如高于8000pg/mL，例如高于8500pg/mL，例如高于9000pg/mL，例如高于9500pg/mL，例如高于10000pg/mL，例如高于10500pg/mL，例如高于11000pg/mL，例如高于11500pg/mL，例如高于12000pg/mL，例如高于12500pg/mL PBMC，将个体分类为没有患有或不太可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，当所述PBMC样本中的HspA1A和/或HspA1B的量高于5000pg/mL时，例如高于5500pg/mL，例如高于6000pg/mL，例如高于6500pg/mL，例如高于7000pg/mL，例如高于7500pg/mL，例如高于8000pg/mL，例如高于8500pg/mL，例如高于9000pg/mL，例如高于9500pg/mL，例如高于10000pg/mL，例如高于10500pg/mL，例如高于11000pg/mL，例如高于11500pg/mL，例如高于12000pg/mL，例如高于12500pg/mL PBMC，将个体分类为没有患有或不太可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

此外，当所述PBMC样本中Hsp70的量检测不到时，个体被分类为患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

可以使用本领域中其他已知的方法，或通过重复本文公开的诊断方法来确认或告知(infirmed)诊断。

在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括基于受试者是否患有表现为降低的Hsp70水平的疾病或处于患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的风险中，来实施、维持、降低、提高或不实施疗法。

在一个实施方案中，诊断个体中表现为降低的Hsp70水平的疾病的方法包括以下步骤：e)向被诊断为患有所述表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者施用用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法。

诊断和治疗方法

本公开的一个方面还提供一种诊断和治疗个体中表现为降低的Hsp70水平的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述个体的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，

d)分类或确定所述个体是否患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病，和

e)向所述个体施用用于治疗所述表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法。

在一个实施方案中，向所述个体施用用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法的步骤e)包括向所述个体施用有效量的生物活性剂，其中所述生物活性剂对于表现为降低的Hsp70水平的疾病有效。

本公开的一个方面还提供一种治疗患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体的方法，所述方法包括：通过包括以下步骤的方法，向所述个体施用用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法，其中所述个体被诊断为患有所述表现为降低的Hsp70水平的疾病：

a)提供来自所述个体的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，

d)分类或确定所述个体是否患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

本文其他地方公开了用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法和用于此目的的生物活性剂，并且包括在上述与降低的Hsp70水平有关疾病的治疗方法和疗法中。

在一个实施方案中，诊断和治疗个体中表现为降低的Hsp70水平的疾病的所述方法包括诊断和治疗选自以下的疾病：溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良或炎性肌肉病症，如本文其他地方所述。

在一个实施方案中，所述溶酶体贮积病选自：脂质贮积病(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病，及其在本文其他地方所述的任何亚型。在一个实施方案中，所述溶酶体贮积病是尼曼皮克病，例如NPC。

选择患者的方法

本发明的方法允许检测PBMC样本中的Hsp70，并诊断或鉴定患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体。

大量疾病表现为降低的Hsp70水平，这是许多生物学、分子和病理学变化之一。容易地鉴定出患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者或患有共表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者亚群(例如表现为或共表现为显著或明显降低的Hsp70水平)是非常有用的。

鉴定患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者，或患有共表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者亚群适用于选择对生物活性剂有反应或可能有反应的患者，所述生物活性剂提高热休克蛋白(包括Hsp70)的细胞内浓度和/或活性。

因此，一个方面提供一种选择患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述患者的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，和

d)分类或确定所述患者是否具有降低的Hsp70水平。

在一个实施方案中，所述检测和定量或确定Hsp70水平包括检测和定量或确定选自以下的水平：

i)HspA1A，

ii)HspA1B，或

iii)HspA1A和HspA1B。

在一个实施方案中，分类或确定患者是否具有降低的Hsp70水平的步骤包括与对照相比，分类或确定患者是否具有降低的Hsp70水平，如本文其他地方所述。

在一个实施方案中，与健康对照中的水平相比，当确定PBMC样本中的Hsp70(例如HspA1A和/或HspA1A)的水平降低或检测不到时，患者具有降低的Hsp70水平。

在一个实施方案中，分类或确定患者是否具有降低的Hsp70水平的步骤包括鉴定具有降低的Hsp70水平的患者的步骤。

在一个实施方案中，分类或确定患者是否具有降低的Hsp70水平的所述步骤d)包括确定与从健康对照获得或可获得的PBMC样本中的水平相比，PBMC样本中的Hsp70水平。在本上下文中，健康对照是没有患有或没有疑似患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体。优选地，健康对照也没有表现其他任何明显的疾病。

在一个实施方案中，分类或确定患者是否具有降低的Hsp70水平的所述步骤d)包括与患有相同潜在疾病但没有伴随降低的Hsp70水平的患者中获得的PBMC样本中的水平相比，确定PBMC样本中的Hsp70水平。

在一个实施方案中，提供了一种选择具有降低的Hsp70水平的患者的方法，其中所述患者患有潜在疾病，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述患者的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，和

d)与表现为相同潜在疾病的其他患者相比，分类或确定患者是否具有降低的Hsp70水平。

在一个实施方案中，提供了一种选择或鉴定患有选自以下疾病的患者的方法：溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良和炎性肌肉病症，其具有降低的Hsp70水平，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述患者的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，和

d)分类或确定患者是否具有降低的Hsp70水平。

在一个实施方案中，提供了一种选择或鉴定具有降低的Hsp70水平、患有尼曼皮克病(例如NPC)的患者的方法所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述患者的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，和

d)分类或确定患者是否具有降低的Hsp70水平。

在一个实施方案中，当PBMC样本中的Hsp70水平(在一个实施方案中为HspA1A和/或HspA1B)比健康对照中的水平低1至1000倍时，例如比健康对照中的水平低1至2倍、2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至11倍、11至12倍、12至13倍、13至14倍、14至15倍、15至16倍、16至17倍、17至18倍、18至19倍、19至20倍、20至25倍、25至30倍、30至35倍、35至40倍、40至45倍、45至50倍、50至75倍、75至100倍、100至150倍、150至200倍、200至250倍、250至300倍、300至400倍、400至500倍、500至750倍、750至1000倍或检测不到，则患者具有降低的Hsp70水平。

在一个实施方案中，分类或确定患者是否具有降低的Hsp70水平的所述步骤d)包括确定所述PBMC样本中的Hsp70(在一个实施方案中为HspA1A和/或HspA1B)的量是否低于预定的截止值，或检测不到。

当Hsp70的量低于所述截止值，则患者具有降低的Hsp70水平，并且可能或更可能对Hsp70疗法产生反应，所述疗法包括提高热休克蛋白(包括Hsp70)的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂。当Hsp70的量等于或高于所述截止值时，则患者没有降低的Hsp70水平，且不大可能或不可能对Hsp70疗法有反应，所述疗法包括提高热休克蛋白(包括Hsp70)的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂。

在一个实施方案中，当所述PBMC样本中的Hsp70(在一个实施方案中为HspA1A和/或HspA1B)的量为7500pg/mL或更少，例如7000pg/m或更少，例如6500pg/mL或更少，例如6000pg/mL或更少，例如5500pg/mL或更少，例如5000pg/mL或更少，例如4500pg/mL或更少，例如4000pg/mL或更少，例如3500pg/mL或更少，例如3000pg/mL或更少，例如2500pg/mL或更少，例如2000pg/mL或更少，例如1500pg/mL或更少，例如1000pg/mL PBMC或更少时，则表现出降低的Hsp70水平的患者可能或更可能对Hsp70疗法产生反应。

相反，在一个实施方案中，当所述PBMC样本中Hsp70(在一个实施方案中为HspA1A和/或HspA1B)的量为高于5000pg/mL时，例如高于5500pg/mL，例如高于6000pg/mL，例如高于6500pg/mL，例如高于7000pg/mL，例如高于7500pg/mL，例如高于8000pg/mL，例如高于8500pg/mL，例如高于9000pg/mL，例如高于9500pg/mL，例如高于10000pg/mL，例如高于10500pg/mL，例如高于11000pg/mL，例如高于11500pg/mL，例如高于12000pg/mL，例如高于12500pg/mL PBMC时，则患者不太可能或不可能对Hsp70疗法产生反应。

在一个实施方案中，鉴定具有降低的Hsp70水平的患者的步骤包括确定所述患者有资格向其施用用于治疗所述疾病的疗法的步骤，所述疾病表现为降低的Hsp70水平，例如Hsp70疗法，其包括提高热休克蛋白(包括Hsp70)的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂。

在一个实施方案中，选择患者的所述方法进一步包括向个体施用用于治疗所述表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法的步骤e)。

在一个实施方案中，所述向个体施用用于治疗所述表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法包括施用提高热休克蛋白(包括Hsp70)的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂，例如如本文其他地方所述的Hsp70诱导剂或Hsp70蛋白。

监测疾病进展

本文公开的方法也可用于监测表现为降低的Hsp70水平的疾病的疾病进展。

因此，一个方面提供一种监测患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体中疾病进展的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在两个或更多个后续时间点，提供一个或多个来自所述个体的PBMC样本，

b)检测每个所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定每个所述PBMC样本中的Hsp70水平。

在一个实施方案中，检测Hsp70包括检测HspA1A和/或HspA1B。

在一个实施方案中，每个PBMC样品中存在的Hsp70水平指示疾病的进展或疾病的缓解。

应理解，提供来自个体的一个或多个PBMC样本的步骤a)，检测所述PBMC样本中的Hsp70的步骤b)，以及定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平的步骤c)各自根据本公开和本文其他地方所述进行。

在一个实施方案中，监测疾病进展的所述方法包括进一步的步骤d)：确定所述表现为降低的Hsp70水平的疾病是进展中还是缓解中。

在一个实施方案中，所述步骤d)包括确定较早时间(例如t＝0)在PBMC样本中存在的Hsp70水平，以及确定较晚时间(例如t>0)在PBMC样本中存在的Hsp70水平。

在一个实施方案中，在t＝0(较早时间)获取第一样本，并且在t＞0的一个或多个较晚时间点获取一个或多个后续的样本(后续样本)。在一个实施方案中，以一定间隔连续获取PBMC样本。

在一个实施方案中，一个或多个后续样本包括在t＝0和在t＝0之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个时间点获取的PBMC样本。

在一个实施方案中，在t＝1天，t＝2天，t＝3天，t＝4天，t＝5天，t＝6天，t＝7天，t＝14天，t＝3周，t＝4周，t＝5周，t＝6周，t＝7周，t＝8周，t＝1个月，t＝2个月，t＝3个月，t＝4个月，t＝5个月，t＝6个月，t＝7个月，t＝8个月，t＝9个月，t＝10个月，t＝11个月，t＝12个月，t＝13个月，t＝14个月，t＝15个月，t＝16个月，t＝17个月，t＝18个月，t＝20个月，t＝22个月和/或t＝24个月的一个或多个获取一个或多个后续样本。

在一个实施方案中，以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月和/或12个月的间隔获取一个或多个后续样本。1个月的间隔意味着每1个月获取一次后续的样本。

在一个实施方案中，Hsp70水平随时间的降低指示疾病的进展。

在一个实施方案中，Hsp70水平随时间的提高指示疾病的缓解。

在一个实施方案中，所述方法包括确定在后续的一个或多个样本中Hsp70水平是否较低，其指示疾病的进展；和/或确定在后续的一个或多个样本中Hsp70水平是否较高，其指示疾病的缓解。

在一个实施方案中，在t＝0和在t>0的一个或多个时间点测量的Hsp70水平随时间的1至1000倍的降低指示疾病的进展；例如1至2倍、2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至11倍、11至12倍、12至13倍、13至14倍、14至15倍、15至16倍、16至17倍、17至18倍、18至19倍、19至20倍、20至25倍、25至30倍、30至35倍、35至40倍、40至45倍、45至50倍、50至60倍、60至70倍、70至80倍、80至90倍、90至100倍、100至150倍、150至200倍、200至250倍、250至300倍、300至400倍、400至500倍、500至600倍、600至700倍、700至800倍的降低，例如Hsp70水平的900至1000倍的降低。

在一个实施方案中，在t＝0和在t>0的一个或多个时间点测量的Hsp70水平随时间的1至1000倍的提高，指示疾病的缓解；例如1至2倍、2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至11倍、11至12倍、12至13倍、13至14倍、14至15倍、15至16倍、16至17倍、17至18倍、18至19倍、19至20倍、20至25倍、25至30倍、30至35倍、35至40倍、40至45倍、45至50倍、50至60倍、60至70倍、70至80倍、80至90倍、90至100倍、100至150倍、150至200倍、200至250倍、250至300倍、300至400倍、400至500倍、500至600倍、600至700倍、700至800倍的提高，例如Hsp70水平的900至1000倍的提高。

在一个实施方案中，在t＝0和t＝6个月(约)时，Hsp70水平随时间的500至20000pg/mL PBMC的降低指示着疾病的进展，例如500至750pg/mL，例如750至1000pg/mL，例如1000至1500pg/mL，例如1500至2000pg/mL，例如2000至3000pg/mL，例如3000至4000pg/mL，例如4000至5000pg/mL，例如5000至7500pg/mL，例如7500至10000pg/mL，例如10000至12500pg/mL，例如12500至15000pg/mL，例如15000至20000pg/mL PBMC。

在一个实施方案中，所述监测患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体中疾病进展的方法包括监测个体中的疾病进展，所述个体患有选自以下的疾病：溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良或炎性肌肉病症，如本文其他地方所述。

在一个实施方案中，所述溶酶体贮积病选自：脂质贮积病(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病，及其在本文其他地方所述的任何亚型。在一个实施方案中，所述溶酶体贮积病是尼曼皮克病，例如NPC。

监测疗法的功效

本文公开的方法也可用于监测治疗或潜在治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的功效。

因此，本公开的一个方面提供一种监测用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法在患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体中的功效的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在实施、维持、降低或提高疗法之前、期间和/或之后，提供来自所述个体的一个或多个PBMC样本，

b)检测所述一个或多个PBMC样本的每个样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述一个或多个PBMC样本的每个样本中的Hsp70水平。

在一个实施方案中，检测Hsp70包括检测HspA1A和/或HspA1B。

在一个实施方案中，每个PBMC样本中存在的Hsp70的水平指示疗法对表现为降低的Hsp70水平的疾病的功效。

应理解，提供来自个体的一个或多个PBMC样本的步骤a)，检测所述PBMC样本中的Hsp70的步骤b)，以及定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平的步骤c)各自根据本公开和本文其他地方所述进行。

在一个实施方案中，所述监测用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法功效的方法包括进一步的步骤d)：监测疗法对表现为降低的Hsp70水平的疾病的功效。

在一个实施方案中，所述步骤d)包括在实施、维持、降低或提高疗法之前确定PBMC样本中存在的Hsp70水平。

在一个实施方案中，所述步骤d)包括在疗法期间确定PBMC样本中存在的Hsp70水平。

在一个实施方案中，所述步骤d)包括在实施、维持、降低或提高疗法之后确定PBMC样本中存在的Hsp70水平。

在一个实施方案中，所述步骤d)包括以下一项或多项：i)在实施、维持、降低或提高疗法之前确定PBMC样本中存在的Hsp70水平；ii)在疗法期间确定PBMC样本中存在的Hsp70水平，并且iii)在实施、维持、降低或提高疗法之后确定PBMC样本中存在的Hsp70水平。

在一个实施方案中，在实施、维持、降低或提高疗法之后，Hsp70水平的提高表明该疗法是有效的。

在一个实施方案中，在实施、维持、降低或提高疗法之后，Hsp70水平的降低表明该疗法无效。

在一个实施方案中，所述方法包括确定在实施、维持、降低或提高疗法之后Hsp70水平是否更高的一个或多个步骤，其指示该疗法是有效的；和/或确定在实施、维持、降低或提高疗法之后Hsp70水平是否更低的一个或多个步骤，其指示该疗法是无效的。

在一个实施方案中，在实施、维持、降低或提高疗法之后，Hsp70水平1至1000倍的提高指示该疗法是有效的；例如1至2倍、2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至11倍、11至12倍、12至13倍、13至14倍、14至15倍、15至16倍、16至17倍、17至18倍、18至19倍、19至20倍、20至25倍、25至30倍、30至35倍、35至40倍、40至45倍、45至50倍、50至60倍、60至70倍、70至80倍、80至90倍、90至100倍、100至150倍、150至200倍、200至250倍、250至300倍、300至400倍、400至500倍、500至600倍、600至700倍、700至800倍的提高，例如900至1000倍。

在一个实施方案中，在实施、维持、降低或提高疗法之后，Hsp70水平1至1000倍的降低，指示该疗法是无效的；例如1至2倍、2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至11倍、11至12倍、12至13倍、13至14倍、14至15倍、15至16倍、16至17倍、17至18倍、18至19倍、19至20倍、20至25倍、25至30倍、30至35倍、35至40倍、40至45倍、45至50倍、50至60倍、60至70倍、70至80倍、80至90倍、90至100倍、100至150倍、150至200倍、200至250倍、250至300倍、300至400倍、400至500倍、500至600倍、600至700倍、700至800倍的降低，例如900至1000倍。

在一个实施方案中，所述监测个体中用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法的功效的方法包括监测所述用于治疗患有疾病的个体的疗法的功效，其中所述个体患有表现为降低的Hsp70水平的疾病，所述疾病选自：溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良或炎性肌肉病症，如本文其他地方所述。

在一个实施方案中，所述溶酶体贮积病选自：脂质贮积病(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病，及其在本文其他地方所述的任何亚型。在一个实施方案中，所述溶酶体贮积病是尼曼皮克病，例如NPC。

本文其他地方公开了治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法和用于此目的的生物活性剂，并且包括在上述监测疗法功效的方法中。

样品

本文公开的方法包括提供来自个体的外周血单核细胞(PBMC)样本。

应当理解，本公开的样本是从个体(优选人)获得或可获得的。在一个实施方案中，所述PBMC样本获自或可获自个体。

外周血单核细胞(PBMC)是任何具有圆形核的外周血细胞；这些细胞由淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)、单核细胞和树突细胞组成。相反，红细胞和血小板没有核，而粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)则具有多叶核。

因此，在一个实施方案中，PBMC样本是包括具有圆形核的外周血单核细胞的样本。在一个实施方案中，PBMC样本是包含淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)、单核细胞和/或树突细胞的样本。

在一个实施方案中，来自本文定义的个体的PBMC样本是主要包含PBMC的样本。在一个实施方案中，PBMC样本是包含从全血中提取的PBMC的样本。在一个实施方案中，PBMC样本是包含全血的PBMC成分或基本上由其组成的样本。

可以使用ficoll(一种分离血液层的亲水性多糖)和梯度离心从全血中提取PBMC，这将使血液分离成血浆顶层，然后是PBMC层和多形核细胞(例如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)和红细胞的底部级分。可以通过裂解红细胞进一步分离多形核细胞。有时在较稠密的和PBMC级分中都发现嗜碱性粒细胞。

当抽取外周全血用于人体免疫系统研究时，通常会通过密度梯度离心法对其进行处理以去除红细胞。最常见地，该方法使用Ficoll Paque(高分子量蔗糖聚合物溶液)。Ficoll将全血分为密度在1.077g/ml之上和之下的两个级分。

外周血单核细胞(PBMC)是保留在Ficoll层(通常称为血沉棕黄层)的密度较小的上部界面处的免疫细胞群，并且是使用Ficoll分级分离方法收集的细胞。通常在该分级分离过程中除去红细胞(红血细胞)和多形核细胞(PMN)(包括嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)，因为其密度大于1.077g/ml。然而，嗜碱性粒细胞的密度可以比1.077g/ml更高或更低，并且因此在密度较小的PBMC级分中可少量存在。

PBMC的典型组成包括占PBMC的70-90％的淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)，占PBMC的10-30％的单核细胞，而树突状细胞很少，仅占PBMC的1-2％。在一些实施方案中，淋巴细胞群体中细胞类型的频率可包括70-85％CD3+T细胞(PBMC的45-70％)、5-20％B细胞(最多PBMC的15％)和5-20％NK细胞(最多PBMC的15％)。

CD3+部分(compartment)由CD4(占PBMC的25-60％)和CD8 T细胞(占PBMC的5-30％)组成，比例约为2：1。CD4和CD8 T细胞都可以进一步分为未经免疫的亚型、经历抗原的中枢记忆、效应记忆和效应亚型，其以静止或激活状态存在。可以使用多个标记物将这些鉴定为具有不同相似性的部分，并且因此使用不同标记物报告的频率可能会有所不同。

CD4 T细胞被称为辅助T细胞，并且可以根据特定细胞因子、表面标记物或转录因子的表达谱进一步分为各种功能亚型。这些包括调节性T细胞、TH1、TH2和TH17细胞，以及其他描述的亚群(例如TH9、滤泡辅助细胞和TR1类型)。已经证明，细胞毒性CD8 T细胞部分在标记物的表达和功能上极为不同，并可能包含大约200种功能表型。

循环B细胞包括过渡型、未经免疫型和记忆型亚型以及成浆细胞，所有这些均可在外周血中的不同群中找到。循环树突细胞包括浆细胞样树突细胞以及骨髓来源的树突细胞。循环单核细胞已被描述为经典单核细胞或非经典CD16+促炎性单核细胞，它们占外周血中单核细胞的比例高达10％，并且与经典单核细胞相比具有独特的功能。

在一个实施方案中，本文公开的方法的提供来自个体的一个或多个PBMC样本的步骤a)包括以下一个或多个步骤：

i)提供全血样本，以及

ii)将全血分为其亚成分，以获得PBMC样本。

在一个实施方案中，对所述全血样本进行离心和/或ficoll分离以获得PBMC样本。

来自个体的样本

在一个实施方案中，本文提供的PBMC样本来自个体，所述个体患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，患有、处于患病风险、疑似患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的所述个体是这样的个体，其患有、处于患病风险、疑似患有或可能患有选自以下的疾病：溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良或炎性肌肉病症，如本文其他地方所述。在一个实施方案中，所述溶酶体贮积病选自：脂质贮积病(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病，及其在本文其他地方所述的任何亚型。在一个实施方案中，所述溶酶体贮积病是尼曼皮克病，例如NPC。

在一个实施方案中，PBMC样本获自或可获自个体，所述个体患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，样品是从个体中获得的，所述个体与一般人群相比患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。增加的患有或发展表现为降低的Hsp70水平的疾病的风险可基于家族史评估、症状评估和/或表现为降低的Hsp70水平的疾病的其他诊断测试结果。

在一个实施方案中，样品是从个体中获得的，所述个体有一个或多个家庭成员被诊断患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，样品是从个体中获得的，所述个体有兄弟姐妹、父母、堂兄弟姐妹、叔伯舅和/或姑姨患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，样品是从个体中获得的，所述个体有兄弟姐妹患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，样品是从个体中获得的，所述个体有发展为表现为降低的Hsp70水平的疾病的倾向。

在一个实施方案中，样品是从个体中获得的，所述个体的一个或多个家庭成员有表现为降低的Hsp70水平的疾病遗传倾向。

在一个实施方案中，如本文其他地方所述，“表现为降低的Hsp70水平的疾病”包括溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良和炎性肌肉病症。

在一个实施方案中，样品是从个体中获得的，所述个体的一个或多个家庭成员具有NPC1基因和/或NPC2基因中的突变。

在一个实施方案中，样品是从个体中获得的，所述个体具有一种或多种与疾病相关的症状，所述疾病表现为降低的Hsp70水平；例如，指示疾病的一种或多种症状，所述疾病表现为降低的Hsp70水平。

在一个实施方案中，样品是从个体中获得的，所述个体具有一种或多种与LSD有关的症状；例如，一种或多种指示LSD的症状。

尽管疾病的体征和症状各不相同，但每种情况下都会出现LSD的症状，因为蛋白缺乏抑制每个身体细胞中存在的溶酶体执行其正常功能的能力。

在一个实施方案中，样品是从个体中获得的，所述个体具有一种或多种与尼曼皮克病(例如C型尼曼皮克病)有关的症状；在一个实施方案中，症状选自：垂直凝视麻痹、肝脏肿大、脾脏肿大和/或黄疸、运动技能的逐步丧失、进食困难、学习障碍和癫痫发作。

LSD和NPC的其他症状包括智力和神经系统功能恶化、进行性视力衰竭(视神经萎缩)、神经系统障碍、精神退化、肝和/或脾脏肿大(肝脾肿大)、身体退化、进行性肌无力、肌张力减弱(张力过低)、运动迟缓、进食问题、呼吸困难和全身无力(嗜睡)。

表现为降低的Hsp70水平的疾病

Hsp70在细胞稳态和表现为降低的Hsp70水平的多种疾病中起着多种重要作用，包括溶酶体贮积病、神经退行性疾病以及一些神经肌肉和肌肉疾病。

在一个实施方案中，本文通篇所指的表现为降低的Hsp70水平的疾病选自：溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良和炎性肌肉病症。

溶酶体贮积病

本公开的一个方面涉及检测PBMC样本中Hsp70的方法，所述PBMC样本是从患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有溶酶体贮积病的个体获得的或可获得的；诊断个体中溶酶体贮积病的方法；监测个体中溶酶体贮积病的疾病进展的方法；监测患有溶酶体贮积病的个体中疗法功效的方法，所述疗法用于治疗溶酶体贮积病；以及选择患有疾病的个体的方法，所述疾病表现为降低的Hsp70水平。

在本文中提及的溶酶体贮积病是指涵盖技术人员已知的每种和任何溶酶体贮积病。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病选自：脂质贮积病(或脂沉积)(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病。

在本公开的一个实施方案中，如上文中所详细概述的，提供了一种诊断个体中的溶酶体贮积病的方法，其中所述LSD选自：脂质贮积病(或脂沉积)(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病；以及本文所述的LSD的任何亚型。

在本公开的一个实施方案中，如上文中所详细概述的，提供了监测患有溶酶体贮积病的个体中疾病进展的方法，其中所述LSD选自：脂质贮积病(或脂沉积)(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病；以及本文所述的LSD的任何亚型。

在本公开的一个实施方案中，如上文中所详细概述的，提供了监测患有溶酶体贮积病的个体中的疗法功效的方法，所述疗法用于治疗溶酶体贮积病，其中所述LSD选自：脂质贮积病(或脂沉积)(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病；以及本文所述的LSD的任何亚型。

在本公开的一个实施方案中，如上文中所详细概述的，提供了一种选择患有溶酶体贮积病的个体的方法，其中所述LSD选自：脂质贮积病(或脂沉积)(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病；以及本文所述的LSD的任何亚型。

神经鞘脂贮积症是一组异质性的遗传性鞘脂代谢病症，其主要影响中枢神经系统。这些病症主要发生在儿科人群中，并且疾病过程的退行性性质的通常特征在于：神经元(灰质)的发散性和进行性累及，伴有精神运动性阻抑和肌阵挛或纤维束(白质)伴有虚弱和痉挛状态。累积的鞘脂包括神经节苷脂(神经节苷脂沉积症)、糖脂/神经酰胺(法布里病、克拉伯病)、葡糖脑苷脂(戈谢病)、鞘磷脂(尼曼皮克病)和硫苷脂(脑白质营养不良症(leukodystrohies)；MLD)。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是神经鞘脂贮积症。在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是神经鞘脂贮积症，其选自：神经节苷脂沉积症和脑白质营养不良症。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是神经节苷脂沉积症，其选自桑德霍夫病(Sandhoff disease)(或II型GM2神经节苷脂沉积症)、经典的婴儿桑德霍夫病、青少年桑德霍夫病、成年/迟发性桑德霍夫病、泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)(或I型GM2神经节苷脂沉积症)、婴儿泰-萨克斯病、青少年泰-萨克斯病、成年/迟发性泰-萨克斯病、GM2-神经节苷脂沉积症AB变体、GM1神经节苷脂沉积症、早期婴儿GM1神经节苷脂沉积症、晚期婴儿GM1神经节苷脂沉积症、成人GM1神经节苷脂沉积症、GM3神经节苷脂沉积症和粘脂贮积病IV。

在一个实施方案中，本文所公开的溶酶体贮积病选自尼曼皮克病、法伯病(Farberdisease)、克拉伯病、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病(I型粘脂贮积病)、包括异染色体脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)(晚期婴儿、青少年和成年型)的硫脂累积病(sulfatidosis)和鞘脂缺乏症(saposin-deficiency)和多发性硫酸酯酶缺乏症(奥斯汀病)。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是戈谢病，包括I型(非神经病类型)、II型(急性婴儿神经病性戈谢病)和III型(慢性神经病性形式)戈谢病。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是尼曼皮克病，包括A型尼曼皮克病、B型尼曼皮克病和C型尼曼皮克病。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是C型尼曼皮克病。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是选自以下的脂沉积：脑腱胆固醇沉积症(cerebrotendinous cholesterosis)、沃尔曼氏病(溶酶体酸性脂肪酶缺乏症)、胆固醇酯贮积病和神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinosis)(NCL)。在一个实施方案中，所述神经元蜡样脂褐质沉积症选自：Batten病(斯皮尔梅伊尔·沃格特病)、比-江二氏病、库夫斯病和Santavuori-Haltia病。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是粘多糖累积病，其选自：I型粘多糖累积病、II型粘多糖累积病、III型粘多糖累积病、IV型粘多糖累积病、VI型粘多糖累积病、VII型粘多糖累积病、VIII型粘多糖累积病和IX型粘多糖累积病。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是粘多糖累积病，其选自：胡尔勒综合征、胡-谢二氏综合征和谢伊综合征(I型)；亨特综合征(II型)；桑菲列普综合征A、B、C或D(III型)；经典莫尔基奥综合征或莫尔基奥样综合征(IV型)；轻度或重度马-兰二氏综合征(VI型)；DiFerrante综合征或斯莱综合征(VII型)；和透明质酸酶缺乏症(IX型)。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是选自以下的粘脂贮积病：II型粘脂贮积病(I细胞疾病)、III型粘脂贮积病(假胡尔勒多处营养不良)和IV型粘脂贮积病(粘脂素(mucolipidin)1缺乏症)。

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是选自以下的糖原贮积病：心糖原贮积病、Andersen病、科里病(Forbes病)、Hers病、麦克阿尔德病、庞贝病、Tauri病(Tarui病)、冯基尔克病、II型庞贝病和IIb型达能病

在一个实施方案中，本文公开的溶酶体贮积病是糖蛋白代谢异常，其选自：天冬氨酰葡糖胺尿症、岩藻糖苷贮积病、甘露糖苷贮积病、α-甘露糖苷贮积病、I型α-甘露糖苷贮积病、II型α-甘露糖苷贮积病、β-甘露糖苷贮积病、II型唾液酸贮积病(I型粘脂贮积病)和半乳糖苷唾液酸贮积病。

神经退行性疾病

本公开的一个方面涉及一种检测PBMC样本中Hsp70的方法，所述PBMC样本是从患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有神经退行性疾病的个体获得的或可获得的。

神经退行性疾病是老龄社会中越来越多的残疾原因。神经变性是功能障碍的缓慢进展，与中枢神经系统(CNS)的神经元和轴突连接丧失有关，是神经系统疾病(如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病(PD)和亨廷顿氏病(HD))的主要病理特征。这种损失导致受影响区域的总体萎缩，包括颞叶和顶叶以及额皮质和扣带回部分的退化。

许多神经退行性疾病是由基因突变引起的，其中大多数位于完全不相关的基因中。在许多不同的疾病中，突变的基因都有共同的特征：CAG核苷酸三联体重复(编码谷氨酰胺)。CAG重复会产生多聚谷氨酰胺(polyQ)链(tract)，显示多聚谷氨酰胺链的疾病已知有：多聚谷氨酰胺病(polyQ疾病)。这些疾病包括：亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、DRPLA(齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩(dentatorubropallidoluysian atrophy))和SBMA(脊髓延髓肌萎缩症或肯尼迪病)。

在一个实施方案中，本文公开的神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS；Lou Gehrig病)、多发性硬化症以及多聚谷氨酰胺病，包括脊髓小脑共济失调(1型脊髓小脑共济失调、2型脊髓小脑共济失调、3型脊髓小脑共济失调(又称马查多-约瑟夫病)、6型脊髓小脑共济失调、7型脊髓小脑共济失调和17型脊髓小脑共济失调)、DRPLA(齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩)和SBMA(脊髓延髓肌萎缩症或肯尼迪病)。

肌肉疾病

本公开的一个方面涉及检测PBMC样本中Hsp70的方法，所述PBMC样本是从患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有肌肉疾病的个体获得的或可获得，所述肌肉疾病例如选自以下：神经肌肉病症、肌营养不良和炎性肌肉病症。

神经肌肉病症

神经肌肉病症影响控制你随意肌的神经。随意肌是你可以控制的肌肉，例如你手臂和腿中的肌肉。你的神经细胞(也称为神经元)发送控制这些肌肉的信息。当神经元变得不健康或死亡时，你的神经系统与肌肉之间的交流就会中断。结果，你的肌肉变弱并废弃。虚弱会导致抽搐、痉挛、疼和痛以及关节和运动问题。有时它还会影响心脏功能和你的呼吸能力。中枢神经肌肉病症的一些示例包括脑血管意外、帕金森氏病、多发性硬化症、亨廷顿氏病和克罗伊茨费尔特-雅各布病。脊髓性肌萎缩症是下运动神经元的疾病，而肌萎缩性侧索硬化症是混合的上下运动神经元病况。

在一个实施方案中，神经肌肉病症是中枢神经肌肉病症。

在一个实施方案中，神经肌肉病症选自：肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、重症肌无力、脊髓性肌萎缩症(SMA)、伴有1型呼吸窘迫的脊髓性肌萎缩症(SMARD1；又称1型远侧脊髓性肌萎缩症(DSMA1))、先天性肌无力综合征(CMS)、先天性肌病、痉挛性束缚综合征、肌营养不良、遗传性痉挛性截瘫、包涵体肌炎、神经性肌强直(NMT，又称艾萨克综合征、Isaacs-Merton综合征)、线粒体肌病、郎-爱二氏肌无力综合征(LEMS)、营养不良性肌强直、周围神经病变、脊髓延髓肌萎缩症(SBMA或肯尼迪病)、僵硬人综合征和格林-巴雷综合征。

在一个实施方案中，脊髓性肌萎缩症(SMA)选自：SMA1(婴儿韦德尼格-霍夫曼病)、0型SMA(或严重型婴儿SMA)、SMA2(中度，杜波维兹病)、SMA3(青少年，Kugelberg-Welander病)和SMA4(成人发作型)。

在一个实施方案中，先天性肌无力综合征(CMS)选自：突触前CMS、突触CMS和突触后CMS。

在一个实施方案中，先天性肌病选自：线状体肌病、肌管肌病、中枢核疾病或中枢核肌病、先天性纤维型失调和圆柱螺旋肌病。

在一个实施方案中，庞贝病选自婴儿形式和迟发性形式。

在一个实施方案中，遗传性痉挛性截瘫选自：MASA综合征、比利牛斯-梅尔茨巴赫病、施特吕姆佩耳病、伴有运动神经元病(motor neuronopathy)的白内障、矮小和骨骼异常、Troyer综合征、MAST综合征、阿-荷-杜综合征、Lison综合征、痉挛性共济失调2、SPOAN综合征、Martsolf综合征或Warburg Micro综合征、Kufor-Rakeb综合征、MEGDEL综合征和Harel-Yoon综合征。

在一个实施方案中，所述包涵体肌炎选自：散发性包涵体肌炎(sIBM)和遗传性包涵体肌炎(hIBM)，其中所述hIBM包括IBM2、IBM3和伴有早发性帕哲病和额颞叶痴呆症的包涵体肌病(IBMPFD)。

在一个实施方案中，神经性肌强直(NMT)选自慢性、单相和复发性缓解。

在一个实施方案中，线粒体肌病选自：凯恩斯-赛尔综合征(KSS)、肌阵挛性癫痫和破碎红纤维(ragged-red fiber，MERRF)、线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样综合征(MELAS)和慢性进行性外眼肌麻痹(CPEO)。

在一个实施方案中，营养不良性肌强直是1型营养不良性肌强直(DM1)或2型营养不良性肌强直(DM2)。

在一个实施方案中，周围神经病选自：单神经病、多发性神经病、多发性单神经炎(或多发性多神经炎)、自主神经病和神经炎。

在一个实施方案中，格林-巴雷综合征选自：急性炎性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP)、急性运动性轴突神经病(AMAN)、急性运动和感觉轴突性神经病(AMSAN)、咽-颈-臂(pharyngeal-cervical-brachial)变异和勒·费希尔综合征。

肌营养不良

肌营养不良(MD)是一类肌肉疾病，随着时间的推移，这些疾病会导致骨骼肌的不断衰弱和衰竭。这些疾病的不同之处在于主要受影响的肌肉、无力程度、恶化的速度以及症状何时开始。许多人最终将无法走路。某些类型也与其他器官的问题有关。肌营养不良有九种主要类别，其中包含超过三十种特定类型。

在一个实施方案中，肌营养不良选自：杜兴氏肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良、先天性肌营养不良、远端肌营养不良、埃-德肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、营养不良性肌强直和眼咽肌营养不良。

炎性肌肉病症

在一个实施方案中，炎性肌肉病症选自：炎症性肌病(炎性肌肉疾病或肌炎)、特发性炎性肌病、多发性肌炎(PM)、皮肌炎(DM)、包涵体肌炎(sIBM和hIBM)、风湿性多肌痛(或“肌肉风湿病”)和横纹肌溶解症。

治疗方法

根据本公开，提供了向被诊断患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者施用疗法的方法，所述疗法用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病。

在一个实施方案中，向被诊断患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者施用疗法(所述疗法用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病)的步骤e)包括向所述个体施用有效量的生物活性剂。

用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法和用于此目的的生物活性剂包括已知的用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法。

“生物活性剂”(即，生物活性物质/试剂)是任何提供在体内或体外证明的某些药理作用(通常是有益的作用)的试剂、药物、物质、化合物、物质组合物或混合物。如本文所用，该术语还包括在个体中产生局部或全身作用的任何生理或药理活性物质。

Hsp70和Hsp诱导剂

在一个实施方案中，向被诊断患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者施用疗法(所述疗法用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病)的步骤e)包括施用有效量的提高热休克蛋白(例如Hsp70)的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂。

在一个实施方案中，用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法是提高一种或多种热休克蛋白(包括Hsp70和共-分子伴侣)细胞内浓度(或水平)和/或活性的生物活性剂；并且包括Hsp70本身或其功能片段或变体、技术人员已知的任何热休克蛋白诱导剂和任何Hsp70诱导剂。

提高一种或多种热休克蛋白(包括Hsp70)细胞内浓度和/或活性的生物活性剂和提高Hsp70细胞内浓度和/或活性的生物活性剂在本文中可以与“Hsp70诱导剂”互换使用。

Hsp70诱导剂可以在有或没有伴随应激的情况下增加Hsp70基因表达和蛋白表达。直接Hsp70诱导剂是一种在没有伴随应激时可以自身增加Hsp70基因表达和蛋白表达的化合物。间接Hsp70诱导剂或Hsp70共诱导剂是一种在没有伴随(轻度)应激的情况下不能增加Hsp70基因表达和蛋白表达的化合物，但应激诱导的Hsp70水平提高由于诱导剂的存在会进一步提高或增强。

由此可见，生物活性剂可以直接或间接提高热休克蛋白(例如Hsp70)的细胞内浓度和/或活性。

在一个实施方案中，生物活性剂是Hsp70蛋白或其功能片段或其变体。在一个实施方案中，所述Hsp70蛋白选自HSPA1A和HSPA1B，或其功能片段或变体。在一个实施方案中，Hsp70的所述功能片段或变体与Hsp70(例如与HSPA1A和HSPA1B中的任一个)具有至少75％的序列同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。

在另一个实施方案中，生物活性剂是热休克蛋白(包括Hsp70)的诱导剂。

在一个实施方案中，热休克蛋白(包括Hsp70)的诱导剂是Hsp70、Hsp40、Hsp72和Hsp90以及共-分子伴侣中一种或多种的诱导剂。

在一个实施方案中，热休克蛋白的诱导剂是至少Hsp70的诱导剂。

在一个实施方案中，热休克蛋白的诱导剂是Hsp70的诱导剂。

提及Hsp70的诱导剂或诱导Hsp70，意味着至少Hsp70被诱导，并且不排除其他蛋白和效应物(例如其他热休克蛋白)的共诱导。Hsp70的诱导剂同等地指Hsp70诱导剂和共-诱导剂，以及直接和间接Hsp70诱导剂。

在一个实施方案中，生物活性剂包含Hsp70或其功能片段或其变体和热休克蛋白(包括Hsp70)的诱导剂的组合。

在一个实施方案中，生物活性剂激活热休克反应。在一个实施方案中，生物活性剂提高一种或多种热休克蛋白(包括Hsp70)的细胞内浓度和/或活性。在一个实施方案中，生物活性剂提高Hsp70的细胞内浓度(或水平)和/或活性。在一个实施方案中，生物活性剂提高Hsp70的细胞内浓度(或水平)。在一个实施方案中，生物活性剂是一种或多种热休克蛋白(包括Hsp70)的诱导剂。在一个实施方案中，生物活性剂是Hsp70的诱导剂。

热休克蛋白的小分子诱导剂

在一个实施方案中，生物活性剂是热休克蛋白(包括Hsp70)的小分子诱导剂，例如Hsp70的小分子诱导剂。

在一个实施方案中，一种或多种热休克蛋白(包括Hsp70)的小分子诱导剂是能够例如通过增加Hsp70基因表达来提高尤其是Hsp70的细胞内浓度(或水平)的化合物。

在一个实施方案中，生物活性剂能够通过增加Hsp70基因表达来提高Hsp70的细胞内浓度(或水平)。在一个实施方案中，生物活性剂能够通过增加Hsp70基因表达来提高Hsp70的细胞内浓度(或水平)，其中所述生物活性剂是羟胺衍生物，例如羟胺衍生物小分子。

这样的羟胺衍生物的示例包括阿莫氯醇(arimoclomol)、艾沙那定(iroxanadine)、氯吡哌醇(bimoclomol)、BGP-15、其立体异构体及其酸加成盐。

阿莫氯醇：

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰(carboximidoyl)氯(阿莫氯醇)、其立体异构体及其酸加成盐。阿莫氯醇进一步描述于例如WO 00/50403。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯(阿莫氯醇)、其光学活性(+)或(-)对映异构体、任何比例的对映异构体的混合物和外消旋化合物，此外由上述任何一种化合物与无机酸或有机酸形成的酸加成盐，其构成本公开的目的。N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯的所有可能的几何异构体形式都属于本发明的范围。术语“N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯的立体异构体”是指该化合物的所有可能的光学和几何异构体。

如果需要，通过已知方法，可以将N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯或其光学活性对映异构体之一与无机酸或有机酸转化成酸加成盐。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯的外消旋物。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯的光学活性立体异构体。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯的对映异构体。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自(+)-R-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯和(-)-(S)-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯的酸加成盐。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯柠檬酸盐(BRX-345)和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯马来酸盐(BRX-220)。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自(+)-R-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯柠檬酸盐；(-)-S-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯柠檬酸盐；(+)-R-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯马来酸盐；和(-)-S-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-吡啶-1-氧化物-3-甲亚胺酰氯马来酸盐。

BGP-15：

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶甲酰亚胺酰胺(pyridinecarboximidamide)二盐酸盐(BGP-15)、其立体异构体及其酸加成盐。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶甲酰亚胺酰胺二盐酸盐(BGP-15)，其光学活性(+)或(-)对映异构体、任何比例的对映异构体的混合物和外消旋化合物，此外由上述任何一种化合物与无机酸或有机酸形成的酸加成盐，其构成本公开的目的。N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶甲酰亚胺酰胺二盐酸盐的所有可能的几何异构体形式都属于本公开的范围。术语“N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)丙氧基]-3-吡啶甲酰亚胺酰胺二盐酸盐的立体异构体”是指该化合物的所有可能的光学和几何异构体。

艾沙那定：

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自：5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪(艾沙那定)、其立体异构体及其酸加成盐。艾沙那定进一步描述于例如WO97/16439和WO00/35914。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自：5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪(艾沙那定)、其光学活性(+)或(-)对映异构体、任何比例的对映异构体的混合物和外消旋化合物，此外由上述任何一种化合物与无机酸或有机酸形成的酸加成盐，其构成本公开的目的。5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪的所有可能的几何异构体形式都属于本发明的范围。术语“5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪的立体异构体”是指该化合物的所有可能的光学和几何异构体。

如果需要，通过已知方法，可以将5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪或其光学活性对映异构体之一与无机酸或有机酸转化成酸加成盐。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪的外消旋物。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪的光学活性立体异构体。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪的对映异构体。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自(+)-5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪和(-)-5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪的酸加成盐。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪柠檬酸盐和5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪马来酸盐。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自(+)-5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪柠檬酸盐；(-)-5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪柠檬酸盐；(+)-5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪马来酸盐；和(-)-5,6-二氢-5-(1-哌啶基)甲基-3-(3-吡啶基)-4H-1,2,4-噁二嗪马来酸盐。

氯吡哌醇：

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯(氯吡哌醇(bimoclomol)、其立体异构体及其酸加成盐。氯吡哌醇进一步描述于例如WO1997/16439。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自：N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯(氯吡哌醇)、其光学活性(+)或(-)对映异构体、任何比例的对映异构体的混合物和外消旋化合物，此外由上述任何一种化合物与无机酸或有机酸形成的酸加成盐，其构成本公开的目的。N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯的所有可能的几何异构体形式都属于本发明的范围。术语“N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯的立体异构体”是指该化合物的所有可能的光学和几何异构体。

如果需要，通过已知方法，可以将N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯或其光学活性对映异构体之一与无机酸或有机酸转化成酸加成盐。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯的外消旋物。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯的光学活性立体异构体。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯的对映异构体。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自(+)-R-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯和(-)-(S)-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂是N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯的酸加成盐。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯柠檬酸盐和N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯马来酸盐。

在一个实施方案中，Hsp70的小分子诱导剂选自(+)-R-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯柠檬酸盐；(-)-S-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯柠檬酸盐；(+)-R-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯马来酸盐；和(-)-S-N-[2-羟基-3-(1-哌啶基)-丙氧基]-3-吡啶甲亚胺酰氯马来酸盐。

已显示许多化合物可诱导(或共诱导)HSP，包括Hsp70。在一个实施方案中，Hsp70的诱导剂选自：膜相互作用化合物，例如烷基溶血磷脂(alkyllysophospholipid)依地福新(edelfosine)(ET-18-OCH3或1-十八烷基-2-甲基-rac-甘油基-3-磷酸胆碱)；抗炎药，包括环氧合酶1/2抑制剂(如塞来昔布(celecoxib)和罗非昔布(rofecoxib))，以及NSAID(如，乙酰水杨酸、水杨酸钠和吲哚美辛(indomethacin))；地塞米松；前列腺素PGA1、PGj2和2-环戊烯-1-酮；过氧化物酶增殖剂激活的受体γ激动剂；微管蛋白相互作用的抗癌药(包括长春新碱和紫杉醇)；胰岛素增敏剂吡格列酮；抗肿瘤药(如卡铂、阿霉素、氟达拉滨、异环磷酰胺和阿糖胞苷)；Hsp90抑制剂(包括格尔德霉素、17-AAG、17-DMAG、根赤壳菌素(radicicol)、除莠霉素A和花生四烯酸)；蛋白酶体抑制剂(例如MG132、乳胞素(lactacystin)、硼替佐米、卡非佐米和奥普佐米)；丝氨酸蛋白酶抑制剂(如DCIC、TLCK和TPCK)；组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)(包括SAHA/伏林司他、贝林司他/PXD101、LB-205、LBH589(帕比司他(Panobinostat))、FK-228、CI-994、曲古抑菌素A(TSA)和PCI-34051)；抗溃疡药(包括香叶基香叶基丙酮(GGA)、瑞巴派特、甘珀酸和聚普瑞锌(L-肌肽锌))；重金属(锌和锡)；可卡因；尼古丁；乙醇；α-肾上腺素能激动剂；环戊烯酮前列腺素；L型Ca++通道阻断剂(例如L型Ca++通道阻断剂)，它也抑制兰尼碱受体(例如拉西地平)；兰尼碱受体拮抗剂，例如DHBP(1,1'-二庚基-4,4'-联吡啶)；以及植物药，包括芍药苷、甘草苷、南蛇藤素、二氢南蛇藤素、二氢南蛇藤素二乙酸盐/酯和姜黄素。

在一个实施方案中，Hsp70的诱导剂是蛋白酶体抑制剂。在一个实施方案中，蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米、卡非佐米、奥普佐米、MG132和乳胞素。

在一个实施方案中，Hsp70的诱导剂是HDAC抑制剂。在一个实施方案中，HDACi选自SAHA/伏林司他、贝林司他/PXD101、LB-205、LBH589(帕比司他(Panobinostat))、FK-228、CI-994、曲古抑菌素A(TSA)和PCI-34051。

在一个实施方案中，Hsp70的诱导剂是膜流化剂(fluidizer)。膜流化剂的治疗也可以称为脂质疗法。在一个实施方案中，Hsp70的诱导剂是膜流化剂，其选自：苯甲醇、庚醇、AL721、二十二碳六烯酸、脂族醇、油醇、二甲基氨基乙醇、A2C、法尼醇和麻醉剂，例如利多卡因、罗哌卡因、布比卡因和甲哌卡因，以及本领域技术人员其他已知的。

LSD的其他治疗

除了上述用Hsp或Hsp诱导剂进行的治疗外，LSD还可通过下文所述的其他方式进行治疗。这样的治疗可以与用Hsp和/或Hsp诱导剂的治疗联合应用。

LSD的根本原因是特定的溶酶体酶无法有效分解代谢特定的溶酶体物质，例如脂质。因此，使用酶替代疗法(ERT)，通过向患者提供重组酶来应用于一部分这些疾病，包括戈谢病和法布里病。ERT仅对已产生重组酶的特定疾病类型有效。

在一个实施方案中，向诊断为患有所述溶酶体贮积病的患者施用用于治疗溶酶体贮积病的疗法的步骤e)包括施用有效量的酶替代疗法(ERT)。

在一个实施方案中，向诊断为患有所述溶酶体贮积病的患者施用用于治疗溶酶体贮积病的疗法的步骤e)包括施用底物降低疗法(SRT)。

在一个实施方案中，向诊断为患有所述溶酶体贮积病的患者施用用于治疗溶酶体贮积病的疗法的步骤e)包括施用选自以下的疗法：止痛药；皮质类固醇；移植(例如骨髓移植、脐带血移植或干细胞移植)；以及对症疗法和支持疗法，例如物理疗法。

在一个实施方案中，本发明方法中的LSD是尼曼皮克病，并且用于治疗尼曼皮克病的疗法选自：热休克蛋白(包括Hsp70)的小分子诱导剂，例如阿莫氯醇；氨溴索和美格鲁特(Miglustat)。

在一个实施方案中，本发明方法中的LSD是戈谢病，并且用于治疗戈谢病的疗法选自：酶替代疗法，包括静脉内重组葡糖神经酰胺酶和

(注射用伊米苷酶(imiglucerase))；美格鲁特(Miglustat)；氨溴索；骨髓移植；外科手术；输血；关节置换手术；抗生素；抗癫痫药；二磷酸盐/酯和肝移植。

在另一个实施方案中，本发明方法中的LSD是法布里病，并且用于治疗法布里病的疗法选自：酶替代疗法，包括

(阿加糖酶β)和Replagal(阿加糖酶α)。

序列

SEQ ID NO：1：智人热休克70kDa蛋白1A(HSPA1A_HUMAN)的蛋白序列(NM_005345.5/UniProtKB-P0DMV8)：

SEQ ID NO：2：去除SEQ ID NO：1的起始蛋氨酸(位置1的M)，以产生640个氨基酸长的序列(位置2-641)：

SEQ ID NO：3：智人热休克70kDa蛋白1A(HSPA1A)的核酸(DNA)序列(NM_005345.5)：

SEQ ID NO：4：智人热休克70kDa蛋白1B(HSPA1B_HUMAN)的蛋白序列(NM_005346.4/UniProtKB-P0DMV9)：

SEQ ID NO：5：去除SEQ ID NO：4的起始蛋氨酸(位置1的M)，以产生640个氨基酸长的序列(位置2-641)：

SEQ ID NO：6：智人热休克70kDa蛋白1B(HSPA1B)的核酸(DNA)序列(NM_005346.4)：

实施例

实施例1：确定PBMC样本中的Hsp70水平

将分离自健康个体的PBMC样本中的Hsp70蛋白的水平与来自患有C型尼曼皮克病个体的PBMC样本中的Hsp70水平进行了比较。

介绍

C型尼曼皮克病(NPC)是一种罕见的毁灭性神经退行性疾病，由NPC1(95％的病例)或NPC2基因中的突变引起。尽管NPC1是溶酶体/胞内体膜蛋白，但NPC2是可溶性的结合胆固醇的溶酶体蛋白，并且它们一起在溶酶体生物发生中起基础作用。NPC疾病的特征是溶酶体区室扩大、功能失调以及多种组织的细胞内胆固醇和鞘糖脂(GSL)的异常积聚，从而引起疾病的病理(Platt，2014)。

Hsp70是一种进化上保守的蛋白，通过与溶酶体蛋白的直接(directed)相互作用来稳定溶酶体(T Kirkegaard等，2010)。因此，Hsp70疗法被认为是NPC的潜在治疗方法。相应地，施用Hsp70或阿莫氯醇(一种众所周知的热休克反应诱导剂)可降低溶酶体区室的大小，并逆转突变型NPC1小鼠的神经元以及内脏病理(Thomas Kirkegaard等，2016)。此外，在NPC1小鼠的脑和肝中发现内源性Hsp70水平降低。

在开始使用阿莫氯醇进行安慰剂对照研究之前，开始了一项针对NPC患者的前瞻性非干预性临床研究。患者年龄在2至18岁之间，被诊断出患有NPC，具有至少一种神经系统症状，并且在协助下能够保持行走能力的患者入选。患者维持标准疗法。在纳入(回访1)和前瞻性观察6至14个月之后(回访2)评估所有数据。疾病严重程度是使用NPC严重程度评分(Yanjanin等，2010)确定的，其中评分越高与疾病越严重相关。

为了更好地了解疾病病理，我们着手确定未经治疗的患者中的Hsp70。但是，脑和肝脏都不是适合NPC患者的基质(matrix)。在规划临床研究时，刚刚发表了一篇描述PBMC中经典NPC病理学的论文(Te Vruchte等，2014)。因此，我们发现PBMC是确定NPC患者中Hsp70的相关基质。

方法

样品采集：

将全血样本收集在临床研究地点的6mL EDTA试管中，并将其运送到中央实验室进行样本制备。

临床研究样本(n＝26)获自2至18岁、诊断为NPC且具有至少一种神经系统症状并在协助下能够保持行走能力的C型尼曼皮克病个体(NPC患者)。在研究期间将患者维持标准疗法。在第一次临床研究回访(纳入)和第二次临床研究回访(第一次回访后6到14个月)中收集样本。

对照样本(n＝19)获自20至30岁的健康受试者。使用与临床研究样本相同的收集和分离方法处理这些样本。

NPC严重程度评分：

在第一次和第二次临床研究回访中，使用NPC严重程度评分(NPCCSS)(Yanjanin等，2010)确定NPC患者的疾病严重程度，其中评分越高与疾病越重相关。

PBMC分离：

通过在室温下离心从全血中分离血浆。在PBS中恢复血体积，并通过使用Histopaque^TM的密度梯度离心分离PBMC。通过流式细胞术确定有活力的PBMC细胞计数。等分1mio。产生PBMC并将其冷冻保存在-70℃下。

人PBMC中Hsp70的确定：

使用人/小鼠/大鼠总HSP70

IC ELISA试剂盒(R&D Systems)对Hsp70进行定量。在对临床研究样本进行分析之前，该分析方法已证明适合确定人PBMC样本中的Hsp70。用人/小鼠/大鼠总HSP70

IC ELISA试剂盒检测HspA1A和HspA1B的水平，而没有HspA5和HspA8的交叉反应性。

结果

PBMC样本中Hsp70的定量显示，与健康对照的PBMC样本相比，来自NPC患者的PBMC样本中Hsp70的表达明显降低。健康对照样本显示Hsp70的平均值为12000pg/mL，而从NPC患者分离的PBMC样本中Hsp70的平均浓度为1800pg/mL(图1)。从NPC患者分离的PBMC样本中Hsp70的表达与NPC严重程度评分(NPCCSS)没有相关性(图2)。此外，从临床研究回访1到回访2的时间内，未观察到Hsp70水平的变化(图3)。

结论

该实施例表明，与健康对照相比，患有C型尼曼皮克患者的外周血单核细胞(PBMC)中Hsp70蛋白的表达明显降低。此外，Hsp70的低水平与NPC患者的疾病严重程度无关。

实施例2：阿莫氯醇增加NPC患者的Hsp70

材料与方法

如实施例1所述进行材料和方法。

结果

测量外周血单核细胞(PBMC)匀浆中的Hsp70浓度。Hsp70是在一项观察性研究中确定的(图4和图5)，在筛选(治疗前)时确定，然后在6-14个月后再次确定(基线)。使用阿莫氯醇(Clinicaltrials.gov标识符NCT02612129)治疗患者12个月。对12例阿莫氯醇患者，通过Wilcoxon符号(signed)秩检验采用基线和12个月数据点，对Hsp70水平进行了分析，比较了治疗12个月前后的Hsp70水平。

表2：回收数据的统计学分析

结论

与健康对照相比，NPC患者的Hsp70血液水平降低了，并且随着疾病进展(从治疗前到基线)保持稳定。该实施例证实了与基线相比，用阿莫氯醇治疗12个月显著提高了Hsp70的PBMC水平。这证明Hsp70的PBMC水平是用于阿莫氯醇疗法的药效标记物。

参考文献

Kirkegaard,T.,Gray,J.,Priestman,D.A.,Wallom,K.,Atkins,J.,Olsen,O.D.,…Platt,F.M.(2016).Heat shock protein-based therapy as a potentialcandidate for treating the sphingolipidoses.Science Translational Medicine,8(355),355ra118.https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aad9823

Kirkegaard,T.,Roth,A.G.,Petersen,N.H.T.,Mahalka,A.K.,Olsen,O.D.,Moilanen,I.,…

M.(2010).Hsp70 stabilizes lysosomes and revertsNiemann-Pick disease-associated lysosomal pathology.Nature,463(7280),549–53.https://doi.org/10.1038/nature08710

Platt,F.M.(2014).Sphingolipid lysosomal storage disorders.Nature,510(7503),68–75.https://doi.org/10.1038/nature13476

Te Vruchte,D.,Speak,A.O.,Wallom,K.L.,Al Eisa,N.,Smith,D.A.,Hendriksz,C.J.,…Platt,F.M.(2014).Relative acidic compartment volume as a lysosomalstorage disorder-associated biomarker.The Journal of Clinical Investigation,1–9.https://doi.org/10.1172/JCI72835

Yanjanin,N.M.,Vélez,J.I.,Sc,M.,Gropman,A.,King,K.,Au,D.,…Porter,F.D.(2010).Linear Clinical Progression,Independent of Age of Onset,in Niemann-Pick Disease,type C.American Journal Of Medical Genetics Part BNeuropsychiatric Genetics,(1),132–140.https://doi.org/10.1002/ajmg.b.30969.Linear。

Claims (53)

1.一种检测外周血单核细胞(PBMC)样本中Hsp70的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供PBMC样本，和

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，以及

c)任选地，定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平。

2.一种诊断个体中表现为降低的Hsp70水平的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述个体的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，和

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平。

3.根据权利要求2所述的方法，还包括以下步骤：

i.分类或确定所述个体是否患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

4.一种选择患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述患者的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的Hsp70水平，和

d)分类或确定所述个体是否具有降低的Hsp70水平。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其是体外方法。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括检测和任选地定量或确定选自以下的Hsp70：

i.HspA1A，

ii.HspA1B，或

iii.HspA1A和HspA1B。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PBMC样本从个体获得或可从个体获得。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体患有、疑似患有、处于患病风险或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体有一个或多个家庭成员被诊断患有表现为降低的Hsp70水平的疾病；例如兄弟姐妹、父母、堂兄弟姐妹、叔伯舅和/或姑姨中的一个或多个被诊断患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体有一个或多个家庭成员对表现为降低的Hsp70水平的疾病具有遗传易感性。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体具有一种或多种与表现为降低的Hsp70水平的疾病有关的症状或指示表现为降低的Hsp70水平的疾病的症状。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤d)包括：与健康对照的PBMC样本中的水平相比，确定所述PBMC样本中的Hsp70水平。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

i.与健康对照中的水平相比，所述PBMC样本中的Hsp70水平降低或检测不到指示所述个体患有疾病、可能患有疾病或处于患有疾病的风险中，其中所述疾病表现为降低的Hsp70水平；和/或

ii.与健康对照中的水平相比，所述PBMC样本中的HspA1A水平降低或检测不到指示所述个体患有疾病、可能患有疾病或处于患有疾病的风险中，其中所述疾病表现为降低的Hsp70水平；和/或

iii.与健康对照中的水平相比，所述PBMC样本中的HspA1B水平降低或检测不到指示所述个体患有疾病、可能患有疾病或处于患有疾病的风险中，其中所述疾病表现为降低的Hsp70水平；和/或

iv.所述样本中的Hsp70、HspA1A和/或HspA1B水平与健康对照中的水平比得上、相等或更高指示所述个体未患有疾病，其中所述疾病表现为降低的Hsp70水平。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当存在选自以下的情况时，所述个体可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病：

i.所述PBMC样本中的Hsp70水平比健康对照中的水平低1至1000倍，例如比健康对照中的水平低1至2倍、2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至11倍、11至12倍、12至13倍、13至14倍、14至15倍、15至16倍、16至17倍、17至18倍、18至19倍、19至20倍、20至25倍、25至30倍、30至35倍、35至40倍、40至45倍、45至50倍、50至75倍、75至100倍、100至150倍、150至200倍、200至250倍、250至300倍、300至400倍、400至500倍、500至750倍、750至1000倍，或检测不到，和/或

ii.所述PBMC样本中的HspA1A和/或HspA1B水平比健康对照中的水平低1至1000倍，例如比健康对照中的水平低1至2倍、2至3倍、3至4倍、4至5倍、5至6倍、6至7倍、7至8倍、8至9倍、9至10倍、10至11倍、11至12倍、12至13倍、13至14倍、14至15倍、15至16倍、16至17倍、17至18倍、18至19倍、19至20倍、20至25倍、25至30倍、30至35倍、35至40倍、40至45倍、45至50倍、50至75倍、75至100倍、100至150倍、150至200倍、200至250倍、250至300倍、300至400倍、400至500倍、500至750倍、750至1000倍，或检测不到。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，分类或确定个体是否患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的所述步骤d)包括：

i.确定所述PBMC样本中Hsp70的量是否低于预定义的截止值或检测不到；和/或

ii.确定所述PBMC样本中HspA1A和/或HspA1B的量是否低于预定义的截止值或检测不到。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中当所述PBMC样本中Hsp70的量为7500pg/mL或更少，例如7000pg/m或更少，例如6500pg/mL或更少，例如6000pg/mL或更少，例如5500pg/mL或更少，例如5000pg/mL或更少，例如4500pg/mL或更少，例如4000pg/mL或更少，例如3500pg/mL或更少，例如3000pg/mL或更少，例如2500pg/mL或更少，例如2000pg/mL或更少，例如1500pg/mL或更少，例如1000pg/mL PBMC或更少时，所述个体患有或可能患有表现为降低的Hsp70水平的疾病。

17.根据权利要求4至12中任一项所述的方法，其中，所述分类或确定所述患者是否具有降低的Hsp70水平的步骤包括鉴定具有降低的Hsp70水平的患者的步骤。

18.根据权利要求4至12和17中任一项所述的方法，其中，所述分类或确定所述患者是否具有降低的Hsp70水平的步骤包括：相较于从表现为相同潜在疾病但未伴有降低的Hsp70水平的患者获得或可获得的PBMC样本中的水平，确定所述PBMC样本中的Hsp70水平。

19.根据权利要求4至12和17至18中任一项所述的方法，其中，所述分类或确定所述患者是否具有降低的Hsp70水平的步骤d)包括：

i.确定所述PBMC样本中Hsp70的量是否低于预定义的截止值或检测不到；和/或

ii.确定所述PBMC样本中HspA1A和/或HspA1B的量是否低于预定义的截止值或检测不到。

20.根据权利要求4至12和17至19中任一项所述的方法，其中当Hsp70的量低于所述截止值时，所述患者可能或更可能对Hsp70疗法有反应，所述Hsp70疗法包括提高热休克蛋白包括Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂。

21.根据权利要求4至12和17至20中任一项所述的方法，其中当所述PBMC样本中Hsp70(例如HspA1A和/或HspA1B)的量为7500pg/mL或更少，例如7000pg/mL或更少，例如6500pg/mL或更少，例如6000pg/mL或更少，例如5500pg/mL或更少，例如5000pg/mL或更少，例如4500pg/mL或更少，例如4000pg/mL或更少，例如3500pg/mL或更少，例如3000pg/mL或更少，例如2500pg/mL或更少，例如2000pg/mL或更少，例如1500pg/mL或更少，例如1000pg/mLPBMC或更少时，表现为降低的Hsp70水平的患者可能或更可能对Hsp70疗法有反应。

22.根据权利要求4至12和17至21中任一项所述的方法，还包括确定所述患者是否有资格向其施用治疗表现为降低的Hsp70水平的所述疾病的疗法的步骤，例如Hsp70疗法，其包括提高热休克蛋白包括Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括以下步骤：

i.施用治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中提供来自个体的PBMC样本的步骤a)包括以下的一个或多个步骤：

i.提供来自个体的全血样本，以及

ii.将全血分成其亚成分以获得PBMC样本。

25.一种监测患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体中疾病进展的方法，所述方法包括以下步骤：

i.在两个或更多个后续时间点提供来自所述个体的一个或多个PBMC样本，

ii.检测每个所述PBMC样本中的Hsp70，

iii.定量或确定每个所述PBMC样本中的Hsp70水平。

26.根据权利要求25所述的方法，其中在t＝0时获得第一PBMC样本，并且在t＞0的一个或多个后续时间点获得一个或多个后续PBMC样本。

27.根据权利要求25至26中任一项所述的方法，其中以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月和/或12个月的间隔获得一个或多个后续样本。

28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，所述方法还包括步骤d)：确定所述表现为降低的Hsp70水平的疾病是进展中还是缓解中。

29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中：

a)Hsp70水平随时间的降低指示所述疾病的进展；和/或

b)Hsp70水平随时间的提高指示所述疾病的缓解。

30.一种监测患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体中用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法功效的方法，，所述方法包括以下步骤：

a)在实施、维持、降低或提高疗法之前、期间和/或之后，提供来自所述个体的一个或多个PBMC样本，

b)检测所述一个或多个PBMC样本的每个样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述一个或多个PBMC样本的每个样本中的Hsp70水平。

31.根据权利要求30所述的方法，其中

i.在实施、维持、降低或提高疗法之前，从患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体获得一个或多个PBMC样本；

ii.在疗法期间，从患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体获得一个或多个PBMC样本；和/或

iii.在实施、维持、降低或提高疗法之后，从患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体获得一个或多个PBMC样本；和/或

iv.在实施、维持、降低或提高疗法之前、期间和/或之后，从患有表现为降低的Hsp70水平的疾病的个体获得一个或多个PBMC样本。

32.根据权利要求30至31中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤d)：监测疗法对表现为降低的Hsp70水平的疾病的功效。

33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中：

a)在实施、维持、降低或提高疗法之后，Hsp70水平的提高指示所述疗法有效；和/或

b)在实施、维持、降低或提高疗法之后，Hsp70水平的降低指示所述疗法无效。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测Hsp70包括检测Hsp70蛋白或RNA，例如Hsp70蛋白。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测和定量所述Hsp70。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中定量或确定样本中的Hsp70水平的步骤c)包括以下一个或多个步骤：

i.针对校准的标准品进行归一化，以及

ii.定量所述PBMC样本中的Hsp70。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于治疗表现为降低的Hsp70水平的疾病的疗法是提高热休克蛋白包括Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述提高热休克蛋白包括Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂选自：Hsp70蛋白或其功能片段或变体、热休克蛋白诱导剂和Hsp70诱导剂或共同诱导剂。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述提高热休克蛋白包括Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂是能够通过增加Hsp70基因表达而提高细胞内浓度(或水平)的小分子羟胺衍生物。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述提高热休克蛋白包括Hsp70的细胞内浓度和/或活性的生物活性剂选自：阿莫氯酚、艾沙那定、氯吡哌醇、BGP-15、其立体异构体及其酸加成盐。

41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表现为降低的Hsp70水平的疾病是溶酶体贮积病、神经退行性疾病、神经肌肉病症、肌营养不良和炎性肌肉病症。

42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表现为降低的Hsp70水平的疾病是溶酶体贮积病。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述溶酶体贮积病选自：脂质贮积病(包括神经鞘脂贮积症)；粘多糖累积病；糖原贮积病；糖蛋白代谢异常(糖蛋白贮积病)；和粘脂贮积病。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述溶酶体贮积病是神经鞘脂贮积症。

45.根据权利要求42所述的方法，其中所述溶酶体贮积病选自：尼曼皮克病(包括A、B和C型)、法伯病、克拉伯病、法布里病、戈谢病、唾液酸贮积病(I型粘脂贮积病)、包括异染色体脑白质营养不良(晚期婴儿、青少年和成年型)的硫脂累积病、鞘脂缺乏症、多发性硫酸酯酶缺乏症(奥斯汀病)、戈谢病(包括I型、II型和III型、脑腱胆固醇沉积症、沃尔曼氏病(溶酶体酸性脂肪酶缺乏症)、胆固醇酯贮积病、神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL，包括Batten病(斯皮尔梅伊尔·沃格特病)、比-江二氏病、库夫斯病、Santavuori-Haltia病)、粘多糖累积病(I型、II型、III型、IV型、VI型、VII型、VIII型和IX型)、粘脂贮积病(II型、III型和IV型)、心糖原贮积病、Andersen病、科里病(Forbes病)、Hers病、麦克阿尔德病、庞贝病、Tauri病(Tarui病)、冯基尔克病、II型庞贝病、IIb型达能病、天冬氨酰葡糖胺尿症、岩藻糖苷贮积病、甘露糖苷贮积病、α-甘露糖苷贮积病、I型α-甘露糖苷贮积病、II型α-甘露糖苷贮积病、β-甘露糖苷贮积病、II型唾液酸贮积病(I型粘脂贮积病)和半乳糖苷唾液酸贮积病。

46.根据权利要求42所述的方法，其中所述溶酶体贮积病是尼曼皮克病，例如C型尼曼皮克病。

47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表现为降低的Hsp70水平的疾病是神经退行性疾病。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性疾病选自：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化症、亨廷顿氏病、多聚谷氨酰胺病和脊髓小脑共济失调(包括1型脊髓小脑共济失调、2型脊髓小脑共济失调、3型脊髓小脑共济失调(又称马查多-约瑟夫病)、6型脊髓小脑共济失调、7型脊髓小脑共济失调和17型脊髓小脑共济失调)、DRPLA(齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩)和SBMA(脊髓延髓肌萎缩症或肯尼迪病)。

49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表现为降低的Hsp70水平的疾病选自：神经肌肉病症、肌营养不良和炎性肌肉病症。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述神经肌肉病症选自：肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、重症肌无力、脊髓性肌萎缩症(SMA)、伴有1型呼吸窘迫的脊髓性肌萎缩症(SMARD1；又称1型远侧脊髓性肌萎缩症(DSMA1))、先天性肌无力综合征(CMS)、先天性肌病、痉挛性束缚综合征、肌营养不良、遗传性痉挛性截瘫、包涵体肌炎、神经性肌强直(NMT，又称艾萨克综合征、Isaacs-Merton综合征)、线粒体肌病、郎-爱二氏肌无力综合征(LEMS)、营养不良性肌强直、周围神经病变、脊髓延髓肌萎缩症(SBMA或肯尼迪病)、僵硬人综合征和格林-巴雷综合征。

51.根据权利要求49所述的方法，其中所述肌营养不良选自：杜兴氏肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良、先天性肌营养不良、远端肌营养不良、埃-德肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、营养不良性肌强直和眼咽肌营养不良。

52.根据权利要求49所述的方法，其中所述炎性肌肉病症选自：炎症性肌病(炎性肌肉疾病或肌炎)、特发性炎性肌病、多发性肌炎(PM)、皮肌炎(DM)、包涵体肌炎(sIBM和hIBM)、风湿性多肌痛(或“肌肉风湿病”)和横纹肌溶解症。

53.一种调整小分子羟胺衍生物剂量的方法，所述小分子羟胺衍生物能够通过增加Hsp70基因表达而提高个体中Hsp70的细胞内浓度(或水平)，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述个体的PBMC样本，

b)检测所述PBMC样本中的Hsp70，

c)定量或确定所述PBMC样本中的第一Hsp70水平，

d)以第一剂量施用所述小分子羟胺衍生物，

e)重复步骤a)至c)，以鉴定所述PBMC样本中的第二Hsp70水平，

f)比较所述第一Hsp70水平和所述第二Hsp70水平，并且

g)任选地，基于所述比较，调整所述小分子羟胺衍生物的剂量。

Images